PL238787B1 - 5’-Hydroksy-2’-metoksyflawon i sposób wytwarzania 5’-hydroksy- 2’-metoksyflawonu - Google Patents

Abstract

Wynalazek dotyczy 5'-hydroksy-2'-metoksyflawonu i sposobu wytwarzania 5'-hydroksy-2'-metoksyflawonu o wzorze 2. W wyniku działania układu enzymatycznego zawartego w komórkach szczepu Beauveria bassiana KCh J1, następuje O-demetylacja. Uzyskany w ten sposób produkt wydziela się z wodnej kultury mikroorganizmu, znanym sposobem, przez ekstrakcję rozpuszczalnikiem organicznym niemieszającym się z wodą (octan etylu).

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest 5’-hydroksy-2’-metoksyflawon i sposób wytwarzania 5’-hydroksy-2’-metoksyflawonu.

Metoda, według wynalazku może znaleźć zastosowanie w przemyśle farmaceutycznym do wytwarzania składników preparatów poprawiających funkcjonowanie przewodu pokarmowego.

Flawony są syntezowane przez rośliny i stanowią składnik naszej diety o wysokim potencjale antyoksydacyjnym oraz zdolności do modulowania wielu układów enzymatycznych związanych z wieloma chorobami (Mughal E.U., Ayaz M., Hussain Z., Hasan A., Sadiq A., Riaz M., Malik A., Hussain S., Choudhary M l. 2006. Synthesis and antibacterial activity of substituted flavones, 4-thioflavones and 4-iminoflavones. Bioorg. Med. Chem. 14: 4704-4711). Różne naturalne, półsyntetyczne i syntetyczne flawony zostały scharakteryzowane pod kątem szeregu działań terapeutycznych, takich jak działania przeciwzapalne, przeciwestrogenowe, przeciwdrobnoustrojowe (Cushnie T.P.T., Lamb A.J. 2005. Antimicrobialactivity of flavonoids. Int. J. Antimicrol. Agents 26: 343-35), przeciwalergiczne, przeciwutleniające, przeciwnowotworowe czy też cytotoksyczne (Havsteen B. 1983. Flavonoids, a class of natural products of high pharmacological potency. Biochem. Pharmacol. 32: 1141-1148; Aregawi M., Williams R., Dye C., Cibulskis R., Otten M. 2008. World Malaria 2008, World Health Organization (WHO): Geneva). 2’,5’-dimetoksyflawon był wyizolowany z kultury tkankowej rośliny leczniczej Primula veris, z której wykonuje się preparaty wykrztuśne (Jaromir Budzianowski, Maria Morozowska, Maria Wesołowska. Lipophilic flavones of Primula veris L. from field cultivation and in vitro cultures. Phytochemistry 66 (2005) 1033-1039).

2'-metoksyflawon jest aktywnym czynnikiem wywołującym apoptozę indukowaną przez TRAIL w ludzkich białaczkowych komórkach MOLT-4 (BenjawanWudtiwai, BungornSripanidkulchai, PrachyaKongtawelert, RatanaBanjerdpongchai. Methoxyflavone derivatives modulate the effect of TRAIL-induced apoptosis in human leukemic cell lines. Journal of Hematology & Oncology 2011,4:52). 2’-metoksy-5’-halogenoflawony wykazują aktywność odwrotnych agonistów kluczowego receptora sygnałowego US28 ludzkiego wirusa cytomegalii (AnaKralj, Mai- ThaoNguyen, NuskaTschammer, NicoletteOcampo, QuintoGesiotto, Markus R. Heinrich, Otto Phanstiel, Development of Flavonoid-BasedlnverseAgonists of the KeySignaling Receptor US28 of Human Cytomegalovirus. J Med Chem. 2013 Jun 27;56(12): 5019-32).

W literaturze nie ma doniesień dotyczących uzyskania 5’-hydroksy-2’-metoksyflawonu.

Szczep Beauveria bassiana KCh J1 był wcześniej ujawniony w literaturze (Kozłowska E, Urbaniak M, Hoc N, Grzeszczuk J, Dymarska M, Stępień Ł, Plaskowska E, Kostrzewa-Susłow E, Janeczko T. (2018) Cascadebiotransformation of dehydroepiandrosterone (DHEA) by Beauveriaspecies. ScientificReports, 8:13449).

Istota wynalazku polega na tym, że do podłoża odpowiedniego dla grzybów strzępkowych wprowadza się szczep Beauveria bassiana KCh J1. Po upływie co najmniej 48 godzin do hodowli wprowadza się substrat, którym jest 2’,5'-dimetoksyflawon wzorze 1, rozpuszczony w rozpuszczalniku organicznym mieszającym się z wodą. Transformację prowadzi się w temperaturze od 20 do 30 stopni Celsjusza, przy ciągłym wstrząsaniu, co najmniej 1 dobę. Kolejno produkt ekstrahuje się rozpuszczalnikiem organicznym niemieszającym się z wodą i oczyszcza chromatograficznie. Produkt znajduje się we frakcjach o niższej polarności.

W wyniku regioselektywnej O-demetylacji otrzymuje się 5-hydroksy-2’-metoksyflawon, a reakcję prowadzi się w wodnej kulturze szczepu Beauveria bassiana KCh J1.

Korzystnie jest, gdy stosunek masy dodawanego substratu do objętości hodowli wynosi 0,2 g : 1 L.

Korzystnie także jest, gdy proces prowadzi się w temperaturze 25 stopni Celsjusza.

Dodatkowo, korzystnie jest, gdy transformację prowadzi się przez 3 dni.

Postępując zgodnie z wynalazkiem, w wyniku działania układu enzymatycznego zawartego w komórkach szczepu Beauveria bassiana KCh J1, następuje regioselektywna O-demetylacja w substracie. Uzyskany w ten sposób produkt wydziela się z wodnej kultury mikroorganizmu, znanym sposobem, przez ekstrakcję rozpuszczalnikiem organicznym niemieszającym się z wodą (octan etylu).

Zasadniczą zaletą wynalazku jest otrzymanie 5’-hydroksy-2’-metoksyflawonu, z wydajnością izolowaną na poziomie 50% (konwersją według HPLC - 80%),w temperaturze pokojowej i przy pH naturalnym dla szczepu.

PL 238 787 B1

Wynalazek jest bliżej objaśniony na przykładzie wykonania.

P r z y k ł a d. Do kolby Erlenmajera o pojemności 2000 cm³, w której znajduje się 500 cm³ sterylnej pożywki zawierającej 5 g aminobaku i 15 g glukozy, wprowadza się szczep Beauveria bassiana KCh J1. Po 72 godzinach jego wzrostu dodaje się 100 mg 2',5'-dimetoksyflawonu o wzorze 1, rozpuszczonego w 2 cm³ dimetylosulfotlenku (DMSO). Transformację prowadzi się w 25 stopniach Celsjusza przy ciągłym wstrząsaniu przez 3 dni. Następnie mieszaninę poreakcyjną ekstrahuje się trzykrotnie octanem etylu, osusza bezwodnym siarczanem magnezu i odparowuje rozpuszczalnik. Otrzymany ekstrakt oczyszcza się chromatograficznie, używając jako eluentu mieszaniny heksan i aceton 9:1. Produkt znajduje się we frakcjach o niższej polarności.

Uzyskany produkt charakteryzuje się następującymi danymi spektralnymi ¹H NMR (600 MHz) (DMSO) δ (ppm): 3.84 (s, 3H, C-2’-OCH3), 6.94 (s, 1H, H-3), 6.97 (dd, 1H, J = 8.9, 3.0 Hz, H-4’), 7.09 (d, 1H, J = 9.0 Hz, H-3’), 7.32 (d, 1H, J = 3.0 Hz, H-6’), 7.50 (ddd, J = 8.0, 7.1, 0.8 Hz, H-6), 7.71 (d, 1H, J = 8.2 Hz, H-8), 7.83 (ddd, 1H, J = 8.6, 7.2, 1.7 Hz, H-7), 8.05 (dd, 1H, J = 7.9, 1.4 Hz, H-5).

¹³C NMR (151 MHz, DMSO) δ = 56,33 (C-2’-OCH3), 111.57 (C-3), 114.07 (C-3’), 115.01 (C-6’), 118.43 (C-8), 119.36 (C-4’), 120.29 (C-1’), 123.13 (C-4a), 124.77 (C-5), 125.42 (C-6), 134.33 (C-7), 150.80 (C-2’), 151.12 (C-5’), 155.89 (C-8a), 160.53 C-2), 177.16 (C-4).

Claims (6)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. 5’-Hydroksy-2’-metoksyflawon o wzorze 2.
2. 2. Sposób wytwarzania 5’-hydroksy-2’-metoksyflawonu, znamienny tym, że do podłoża odpowiedniego dla grzybów strzępkowych wprowadza się szczep Beauveria bassiana KCh J1, następnie po upływie co najmniej 48 godzin do hodowli wprowadza się substrat, którym jest 2’,5’-dimetoksyflawon o wzorze 1, rozpuszczony w rozpuszczalniku organicznym mieszającym się z wodą, transformację prowadzi się w temperaturze od 20 do 30 stopni Celsjusza, przy ciągłym wstrząsaniu, co najmniej 1 dobę, po czym produkt ekstrahuje się rozpuszczalnikiem organicznym niemieszającym się z wodą i oczyszcza chromatograficznie, produkt znajduje się we frakcji o niższej polarności.
3. 3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że stosunek masy dodawanego substratu do objętości hodowli wynosi 0,2 g : 1 L.
4. 4. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że proces prowadzi się w temperaturze 25 stopni Celsjusza.
5. 5. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że transformację prowadzi się przez 3 dni.
6. 6. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że mieszaninę poreakcyjną oczyszcza się, używając jako eluentu mieszaniny heksan aceton 9:1.