PL237333B1 - 8-hydroksy-7-O-β-D-(4’’-O-metyloglukopiranozylo)-flawon i sposób wytwarzania 8-hydroksy-7-O-β-D-(4’’-O-metyloglukopiranozylo)- flawonu - Google Patents

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest związek o nazwie: 8-hydroksy-7-O-ß-D-(4-O-metyloglukopiramozylo)-flawon, o wzorze 2 oraz sposób wytwarzania tego związku. Sposób ten polega na tym, że do podłoża odpowiedniego dla grzybów strzępkowych wprowadza się szczep Isaria fumosorosea KCH J2. Po upływie co najmniej 72 godzin do hodowli wprowadza się substrat, którym jest 7-hydroksyflawon o wzorze 1, rozpuszczony w rozpuszczalniku organicznym mieszającym się z wodą. Transformację prowadzi się w temperaturze od 20 do 30 stopni Celsjusza, przy ciągłym wstrząsaniu co najmniej 96 godzin. Kolejno produkt ekstrahuje się rozpuszczalnikiem organicznym niemieszającym się z wodą i oczyszcza chromatograficznie."

Description

Przedmiotem .wynalazku jest 8-hydroksy-7-O-β- D-(4- O-metyloglukopiranozylo)-flawon i sposób wytwarzania 8-hydroksy-7-O-β- D-(4-O-metyloglukopiranozyIo)-flawonu o wzorze 2, przedstawionym na rysunku.

Związek ten może znaleźć zastosowanie jako antyoksydant w przemyśle spożywczym oraz jako składnik środków farmaceutycznych i kosmetycznych, a także dodatek do pasz.

Roślinne flawonoidy mają dobrze poznaną aktywność przeciwutleniającą, dzięki której chronią organizm przed zewnętrznymi zanieczyszczeniami. Nikotyna jest jednym z tych czynników, które zwiększają stres oksydacyjny nerek, będąc ważnym czynnikiem w patogenezie uszkodzenia nabłonka nerek u osób palących. Badania prowadzone na liniach komórkowych nerek wykazały, że 7-hydroksyflawon przeciwdziała cytotoksycznej aktywności nikotyny (Sengupta B, Sahihi M, Dehkhodaei M, Kelly D, Arany I. Differential roles of 3-Hydroxyflavone and 7-Hydroxyflavone against nicotine-induced oxidative stress in rat renal proximal tubule cells. PLoS One. 2017, 12(6), 1-16). AKR1B10 jest NADPH-zależną reduktazą odgrywająca znaczącą rolę w szeregu fizjologicznych reakcji takich, jak biotransformacje prokancerogenów i leków. Coraz większa liczba dowodów wskazuje na istotną rolę tego enzymu w rozwoju kilku rodzajów nowotworów (np. piersi i wątroby), w przypadku których AKR1B10 jest silnie nadekspresjonowany. AKR1B10 jest uważany za cel terapeutyczny w leczeniu tych chorób, a silne i specyficzne inhibitory mogą być obiecującymi środkami terapeutycznymi. Opisano kilka inhibitorów AKR1B10, ale obszar naturalnych produktów roślinnych jest zbadany jedynie w niewielkim stopniu. W badaniach prowadzonych przez czeskich naukowców 7-hydroksyflawon był jednym z najsilniejszych inhibitorów AKR1B10 spośród 40 polifenoli (Zemanova L, Hofman J, Novotna E, Musilek K, Lundova T, Havrankova J, et al. Flavones Inhibit the Activity of AKR1B10, a Promising Therapeutic Target for Cancer Treatment. J Nat Prod. 2015, 78(11), 2666-74).

Flawonoidy w roślinach występują wyłącznie w połączeniu z jednostkami cukrowymi. Glikozylacja skutkuje wzrostem rozpuszczalności cząsteczki flawonoidu w wodzie i wzrostem jego stabilności. Dzięki temu zwiększa się przyswajalność przyjmowanych z pokarmem związków (J. Xiao, T.S. Muzashvili, M.l. Georgiev, Biotechnology Advances, 2014, 32, 1145-1156, Plaza, M.; Pozzo, T; Liu, J.; Gulshan Ara, K. Z.; Turner, G.; Nordberg Karlsson, E. Substituent effects on in vitro antioxidizing properties, stability, and solubility in flavonoids. J. Agric. Food Chem. 2014, 62, 3321-3333).

Uważa się, że glikozydy flawonoidowe przed absorpcją w układzie pokarmowym muszą zostać poddane hydrolizie przez mikroflorę jelitową do odpowiednich aglikonów. Dowiedziono jednak, że częściowa absorpcja połączeń cukrowych flawonoidów również jest możliwa.

Cząsteczka glukozy przyłączona w pozycji 3 kwercetyny (3,5,7,3’,4’-pentahydroksyflawon) zwiększała absorpcję tego glukozydu w jelicie cienkim do 52%, w porównaniu z 24% absorpcją aglikonu kwercetyny i 17% rutynozydu kwercetyny (Heim, K. E.; Tagliaferro, A. R.; Bobilya, D. J. Flavonoid antioxidants: Chemistry, metabolism and structure-activity relationships. J. Nutr. Biochem. 2002, 13,

572-584, Hollman, P. C.; Bijsman, M. N.; van Gameren, Y; Cnossen, E. R; de Vries, J. H.; Katan, M. B. The sugar moiety is a major determinant of the absorption of dietary flavonoid glycosides in man. Free Radie. Res. 1999, 31, 563-573).

W dostępnej literaturze brak jest informacji na temat otrzymywania 8-hydroksy-7-O-β-D-(4”-O -metyloglukopiranozylo)-flawonu na drodze syntezy chemicznej i biotransformacji.

W ostatnich latach w leczeniu i prewencji chorób coraz większe znaczenie zyskują związki pochodzenia naturalnego i ich odpowiedniki uzyskane na drodze biotransformacji. Dlatego istotne jest poszukiwanie nowych sposobów wytwarzania związków aktywnych biologicznie, które mogą być wykorzystane w przemyśle farmaceutycznym, ale też kosmetycznym i spożywczym.

Istota wynalazku polega na tym, że do podłoża odpowiedniego dla grzybów strzępkowych wprowadza się szczep Isaria fumosorosea KCH J2. Po upływie co najmniej 72 godzin do hodowli wprowadza się substrat, którym jest 7-hydroksyflawon o wzorze 1, rozpuszczony w rozpuszczalniku organicznym mieszającym się z wodą. Transformację prowadzi się w temperaturze od 20 do 30 stopni Celsjusza, przy ciągłym wstrząsaniu co najmniej 96 godzin. Kolejno produkt ekstrahuje się rozpuszczalnikiem organicznym niemieszającym się z wodą i oczyszcza chromatograficznie.

Korzystnie jest, gdy stosunek masy dodawanego substratu do objętości hodowli wynosi 0,1 mg : 1 mL.

Korzystnie także jest, gdy proces prowadzi się w temperaturze 25 stopni Celsjusza.

Dodatkowo, korzystnie jest, gdy transformację; prowadzi się przez 168 godzin.

PL 237 333 Β1

Postępując zgodnie z wynalazkiem, w wyniku działania układu enzymatycznego zawartego w komórkach szczepu Isaria fumosorosea KCH J2, następuje przyłączenie 4-metoksy-/?-D-glukozy przy C-7 i hydroksylacja przy C-8. Uzyskany w ten sposób produkt wydziela się z wodnej kultury mikroorganizmu, znanym sposobem, przez ekstrakcję rozpuszczalnikiem organicznym niemieszającym się z wodą (octan etylu).

Zasadniczą zaletą wynalazku jest otrzymanie 8-hydroksy-7-O-/?-D-(4”-O-metyloglukopiranozylo)-flawonu w temperaturze pokojowej i przy pH naturalnym dla szczepu wykorzystując mikroorganizm niebędący patogenem ludzkim.

Wykorzystanie biotransformacji, zamiast syntezy chemicznej, umożliwia, w sposób przyjazny dla środowiska, uzyskanie związków o wyższej biodostępności i aktywności biologicznej, niż użyte substraty (E. Kostrzewa-Susłow, J. Dmochowska-Gładysz, J. Oszmiański, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 2007, 49 (1-4), 113-117, W. A. Loughlin, Bioresource Technology, 2000, 74, 49-62).

Wynalazek jest bliżej objaśniony na przykładzie wykonania.

Przykład. Do kolby Erlenmajera o pojemności 2000 cm³, w której znajduje się 500 cm³ sterylnej pożywki zawierającej 10 g aminobaku i 30 g glukozy, wprowadza się szczep Isaria fumosorosea KCH J2 ujawniony w zgłoszeniu patentowym o numerze P.416996. Po 96 godzinach jego wzrostu dodaje się 50 mg 7-hydroksyflawonu o wzorze 1, rozpuszczonego w 1 cm³ tetrahydrofuranu. Transformację prowadzi się w 25 stopniach Celsjusza przy ciągłym wstrząsaniu przez 7 dni. Następnie mieszaninę poreakcyjną ekstrahuje się trzykrotnie octanem etylu, osusza bezwodnym siarczanem magnezu i odparowuje rozpuszczalnik. Otrzymany ekstrakt oczyszcza się chromatograficznie, używając jako eluentu mieszaniny chloroformu i metanolu w stosunku 9:1.

Na tej drodze otrzymuje się 6,6 mg 8-hydroksy-7-O-/?-D-(4-O-metyloglukopiranozylo)-flawonu (wydajność 7%). Stopień konwersji substratu według HPLC >99%.

Uzyskany produkt charakteryzuje się następującymi danymi spektralnymi.

Opis sygnałów pochodzących z widma ¹H NMR (600 MHz, Aceton-de)

Sygnały pochodzące od szkieletu flawonoidowego	Sygnały pochodzące od jednostki cukrowej
δ [ppm]	J [Hz]	H	δ [ppm]	J[Hz)	H
6,85 (s)	-	H-3	4,92 (d)	6,7	1C
7,86 (d)	8,6	H-5	3,65 (m)	-	2C
7,05 (d)	9.0	H-6	3,72 (t)	6,2	3C
8,37 (d)	7,9	H-2'	3,16 (m)	-	4C
7,64 (m)	-	H-3’	3,42 (m)	-	5C
7,64 (m)	*	H-4'	3,87 (m) 3,81 (m)		6C
7,64 (m)	*	H-5'	3,62	-	och3
8,37 (d)	7,9	H-6'

Zastrzeżenia patentowe

Claims (5)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. 8-hydroksy-7-O-/?-D-(4”-O-metyloglukopiranozylo)-flawon o wzorze 2.
2. 2. Sposób wytwarzania 8-hydroksy-7-O-/?-D-(4”-O-metyloglukopiranozylo)-flawonu znamienny tym, że do podłoża odpowiedniego dla grzybów strzępkowych wprowadza się szczep Isaria fumosorosea KCH J2, następnie po upływie co najmniej 72 godzin do hodowli wprowadza się

   PL 237 333 Β1 substrat, którym jest 7-hydroksyflawon o wzorze 1, rozpuszczony w rozpuszczalniku organicznym mieszającym się z wodą, transformację prowadzi się w temperaturze od 20 do 30 stopni Celsjusza, przy ciągłym wstrząsaniu, co najmniej 96 godzin, po czym produkt ekstrahuje się rozpuszczalnikiem organicznym niemieszającym się z wodą i oczyszcza chromatograficznie.
3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosunek masy dodawanego substratu do objętości hodowli wynosi 0,1 mg : 1 mL.
4. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że proces prowadzi się w temperaturze 25 stopni Celsjusza.
5. 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że transformację prowadzi się przez 168 godzin.