CN104931598B - 一种神经生长因子制剂中神经生长因子含量的测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种神经生长因子制剂中神经生长因子含量的测定方法。该方法使用超高效液相色谱法中的凝胶色谱法测定神经生长因子的含量，所述凝胶色谱条件为：凝胶色谱柱为分子量检测范围为1000～80000道尔顿、孔径为125～200埃的UPLC分子筛色谱柱；流动相为pH值6.5～7.2，浓度为0.1～0.5M的磷酸盐缓冲液，其中含5～20体积％有机相；柱温为30～50℃；所述流动相的流速为0.1～0.5ml/min；检测器采用钛流通池，检测波长为205～280nm。本发明的神经生长因子制剂中神经生长因子含量的测定方法可以对制剂中的NGF进行准确定量。
Description
技术领域
本发明涉及一种神经生长因子制剂中神经生长因子含量的测定方法，尤其涉及一种使用超高效液相色谱法中的凝胶色谱法测定神经生长因子制剂中神经生长因子含量的方法。
背景技术
神经生长因子(NGF)是神经系统最主要的活性成分之一，它能维持交感神经和感觉神经细胞的生存，具有神经元营养和促突起生长双重生物学功能，对中枢及周围神经元的发育、分化、生长、再生和功能特性的表达均具有重要的调控作用，对保护神经系统的正常功能具有重要作用。
目前，国内生产、销售的各种NGF制剂均为冻干粉针剂型，并使用人血清白蛋白作为稳定剂，而一些携带来源于供血者血液中不易检测的病毒的人血清白蛋白会给生产的制剂带来污染，在患者用药的同时导致严重的传染性疾病，鉴于此种问题时有发生，已经开发出使用氨基酸的混合物作为稳定剂，替代人血清白蛋白，有效避免了人血清白蛋白导致的血液制品污染，并且降低了生产成本。
同时，含有使用人血清白蛋白作为稳定剂的NGF制剂，由于制剂中NGF的含量较低，而人血清白蛋白与NGF均为蛋白质，且在制剂中的浓度明显高于NGF，因而严重影响了NGF的准确定量。目前常用于生物制品中蛋白质含量测定的方法如Lowry法、紫外吸收法、Bradford法、酶联免疫吸附(ELISA)、SDS-PAGE法等均不能有效排除这种干扰，而且无法准确定量。公开号为CN1566941的专利中公开了一种测定制剂中神经生长因子含量的方法，该方法在检定时，虽然能够较准确地测定制剂中NGF的含量，但是该方法仍难以使NGF与白蛋白达到完全分离，也难以准确测定出有效成分NGF的含量，不利于产品质量控制。
有鉴于此，需要一种能够有效测定制剂中NGF含量的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种可以测定神经生长因子制剂中神经生长因子含量的方法。
除非特别指明，本发明中的“去白蛋白神经生长因子制剂”指“不含人血白蛋白的神经生长因子制剂，如含有稳定剂为氨基酸的神经生长因子制剂。
本发明的神经生长因子制剂中神经生长因子含量的测定方法为使用超高效液相色谱法中的凝胶色谱法测定神经生长因子含量，所述凝胶色谱法的色谱条件为：
凝胶色谱柱为分子量检测范围为1000～80000道尔顿、孔径为125-200埃的UPLC分子筛色谱柱；
流动相为pH值6.5～7.2，浓度为0.1～0.5M的磷酸盐缓冲液，所述流动相中有机相的含量为5～20体积％，所述有机相为乙腈、甲醇或异丙醇，优选为乙腈；所述流动相中有机相的含量优选为15体积％；
柱温为30～50℃；
所述流动相的流速为0.1～0.5ml/min，所述流速优选为0.1～0.3ml/min；
该检测器采用钛流通池，检测波长为205～280nm；优选地，所述检测波长为205～220nm；所述检测器优选为紫外检测器。
在本发明的较佳实施方案中，所述流速为0.2ml/min。
在本发明的较佳实施方案中，所述凝胶色谱柱选自Waters UPLC SEC，1.7μm，4.6×150mm，该色谱柱的分子量范围在1000～80000道尔顿、孔径为125埃。
在本发明的较佳实施方案中，流动相pH值为7.0，柱温为40℃。
在本发明的较佳实施方案中，检测波长为214nm。
在本发明的较佳实施方案中，凝胶色谱法的进样量为2μl。
在本发明的较佳实施方案中，所述制剂包括含人血白蛋白的神经生长因子制剂和去白蛋白神经生长因子制剂。
在本发明的较佳实施方案中，所述神经生长因子的含量通过外标法测定。
本发明相比较之前的测定方法，能够将NGF与辅料完全分开；并且检测时间缩短了4倍，溶剂使用量减小了3倍，样品量减小了10倍，适合于获得量较少的样品测定；同时，采用机器自动调整配比，进行pH值的调节，自动化程度高，减少了人为误差；最重要的是，有效排除了制剂中包含人血白蛋白在内的辅料的干扰，经过方法学验证，回收率均在95％～105％之间，回收率合格，而且重复性良好，可以对制剂中的NGF进行准确定量。
附图说明
图1表示流动相专属性图谱，
图2表示NGF对照专属性图谱，
图3表示含人血白蛋白NGF制剂空白辅料专属性图谱，
图4表示含人血白蛋白NGF制剂专属性图谱，
图5表示去白蛋白NGF制剂样品空白辅料专属性图谱，
图6表示去白蛋白NGF制剂样品专属性图谱，
图7表示流速为0.1ml/min的含人血白蛋白NGF制剂样品图谱，
图8表示流速为0.1ml/min时测定的去白蛋白神经生长因子制剂样品图谱，
图9表示流速为0.5ml/min时测定的含人血白蛋白NGF制剂样品图谱，
图10表示流速为0.5ml/min时测定的去白蛋白NGF制剂样品图谱，
图11表示采用普通流通池测定的含人血白蛋白NGF制剂样品图谱，
图12表示采用普通流通池测定的去白蛋白NGF制剂样品图谱。
图13表示甲醇：0.1M PBS＝20:80，pH＝6.5为流动相、柱温为50℃时测定的含人血白蛋白NGF制剂样品图谱。
图14表示异丙醇：0.5M PBS＝5:95，pH＝7.2为流动相、柱温为30℃时测定的含人血白蛋白NGF制剂样品图谱。
图15表示检测波长为205nm时测定的含人血白蛋白NGF制剂样品图谱。
图16表示检测波长为214nm时测定的含人血白蛋白NGF制剂样品图谱。
图17表示检测波长为220nm时测定的含人血白蛋白NGF制剂样品图谱。
图18表示检测波长为280nm时测定的含人血白蛋白NGF制剂样品图谱。
具体实施方式
由于现有方法均不能有效排除这种干扰，难以将NGF与人血白蛋白达到完全分离，也难以准确测定出有效成分NGF的含量，不利于产品质量控制。因此，本发明的发明人开发了UPLC凝胶色谱法，并惊奇地发现通过使用钛流通池，能够将NGF和辅料完全分开，有效排除人血白蛋白的干扰，从而达到了准确测定NGF含量的目的；并且现有方法中每个样品的走样时间需要约20分钟，而UPLC-SEC可以在5分钟内实现完全分离，大大节约了时间，节省了溶剂使用量。
本发明的神经生长因子制剂中神经生长因子含量的测定方法为使用超高效液相色谱法中的凝胶色谱法测定神经生长因子，色谱条件为：
(1)凝胶色谱柱：分子量检测范围为1000～80000道尔顿、孔径为125-200埃的UPLC分子筛色谱柱；
(2)流动相：pH值为6.5～7.2，浓度为0.1～0.5M的磷酸盐缓冲液，含5～20体积％有机相，所述有机相为乙腈、甲醇或异丙醇，含有该有机相的流动相能够保证峰形好，优选地当使用乙腈时，还能保证压力低。
(3)柱温：40℃；流速：0.1～0.5ml/min；检测波长：205～280nm；检测器：采用钛流通池；流速优选为0.1～0.3ml/min，更优选地为0.2ml/min，该流速下能够使NGF和辅料完全分离，从而更准确地测定制剂中NGF的含量。检测波长优选为205～220nm，更优选地214nm，该波长经方法耐用性验证，在检测波长214±5nm范围内进行NGF含量检测时，对NGF含量测定值无影响。
所述凝胶色谱柱选自Waters UPLC SEC，1.7μm，4.6×150mm，该色谱柱的分子量范围在1000～80000道尔顿、孔径为125埃。
通过实验，获得本发明的较佳实施方案，其中流动相pH值为7.0，流速为0.2ml/min，检测波长为214nm，进样量为2μl。
使用超高效液相色谱法中的凝胶色谱法对制剂中NGF含量进行测定，其基本原理是通过流经色谱柱的各种物质的分子量差异将其分离，分子量越大，保留时间越短。由于每种物质在一定条件下具有特定的保留时间，因此可通过色谱图上的保留时间获知目的峰的位置和相关参数，并通过峰面积计算所得到的目标物质的含量。
而且Waters ACQUITY UPLC H-Class Bio系统通过生物兼容的流路设计，使用完全惰性的无金属样品流路、非不锈钢溶剂传输通路，可保持大分子的完整和移动，从而拥有更高的样品回收率而无样品残留。通过流通针式进样针设计、四元溶剂输送系统和AutoBlend PlusTM技术，该系统显著提高了生物大分子分析的耐用性和分析性能，还提高了生产效率，改善了重现性，并且最大程度抑制非特异性表面相互作用以及对仪器的腐蚀，即使在高盐的条件下，系统也能可靠和长时间地工作，并延长系统的使用寿命。
以上凝胶色谱法可以使用外标法对制剂进行测定。包含如下步骤：
在线性范围内选择合适的浓度配制对照溶液和样品溶液，在选定的色谱条件下进行测定，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，即得。
以下实施例中的试剂，除非特别说明均为分析纯级(乙腈为色谱纯)，且可从正规渠道商购获得；
除非特别指明，以下实施例中的NGF原液，购自舒泰神(北京)生物制药股份有限公司，批号：Y120701，浓度：0.50mg/ml；人血白蛋白购自成都蓉生药业有限责任公司；甘露醇购自山东华鲁制药有限公司；含人血白蛋白NGF制剂购自舒泰神(北京)生物制药股份有限公司，商品名苏肽生；氨基酸购自湖北八峰药化；磷酸氢二钠购自国药集团化学试剂有限公司；去白蛋白NGF制剂由实验室自制，具体处方组成见公开号为CN1552440A的专利中的实施例13。
实施例1：外标法测定含人血白蛋白NGF的制剂中NGF含量
一、色谱条件：
仪器：Waters ACQUITY H-Class Bio超高效液相色谱仪；
凝胶色谱柱：Waters UPLC SEC BEH125，125埃(1.7μm)，4.6×150mm；
检测器：紫外检测器，该检测器采用钛流通池；
流动相：乙腈：0.25M磷酸盐缓冲液＝15:85，pH值为7.0，流速：0.2ml/min；柱温：40℃；波长：214nm；进样量为2μl。
二、实验步骤：
1、对照图谱的测定
取浓度已知的NGF原液，加流动相配制成50μg/ml的溶液，作为NGF对照溶液；另外分别取流动相、及NGF制剂中相应的辅料溶液(含0.1体积％人血白蛋白、5.0体积％甘露醇)作为空白对照，各2μl依次通过上述方法检测，以确定辅料中各成分的色谱峰位置。结果如图1所示，流动相不产生吸收峰，对NGF含量检测无干扰；如图2所示，NGF只有单一的色谱峰，图3为空白对照色谱峰，该制剂中的辅料峰出现在NGF峰之前，保留时间与NGF对照不同，可排除辅料物质的干扰。
2、含人血白蛋白NGF制剂中NGF的测定
取浓度已知的NGF原液，加流动相配制成50μg/ml的溶液，作为NGF对照溶液，配制2个平行的样品，即为对照1和对照2；另取含有人血白蛋白的神经生长因子制剂，加流动相配制成50μg/ml的待测溶液，取2μl注入液相色谱仪，按上述检测方法检测，在214nm处检测，记录色谱图，如图4所示；获取保留时间、峰面积等参数，按外标法以峰面积计算，即得NGF含量。重复检测6次，结果见表1。
表1含人血白蛋白制剂中NGF含量重复性结果
上述实验结果表明：该方法的重复性良好，测定多份样品的含量准确可靠。
另外，选取样品1的检测结果，从峰表结果可以看出其分离度为3.38，说明NGF和辅料分离良好。
3、精密度试验
取含有人血白蛋白的神经生长因子制剂，加流动相配制成50μg/ml的待测溶液，取2μl注入液相色谱仪，连续进样6次，在214nm处检测，记录色谱图，获取保留时间、峰面积等参数，计算RSD值，结果见表2。
表2含人血白蛋白NGF制剂中NGF含量进样精密度结果
上述实验结果表明：该方法的进样精密度良好。
实施例2：外标法测定去白蛋白神经生长因子制剂中NGF含量
一、色谱条件：
同实施例1。
二、实验步骤：
1.对照图谱的测定
实验步骤同实施例1，取去白蛋白NGF制剂中相应的辅料溶液(含10mg/ml氨基酸、5体积％甘露醇、50mM磷酸氢二钠)2μl作为空白对照，通过上述方法检测，以确定辅料中各成分的色谱峰位置。结果如图5所示，制剂的辅料峰保留时间远超过NGF对照保留时间，也可排除辅料物质的干扰。
2.去白蛋白NGF制剂
取浓度已知的NGF原液，加流动相配制成50μg/ml的溶液，作为NGF对照溶液，配制2个平行的样品，即为对照1和对照2；另取去白蛋白NGF制剂，加流动相配制成50μg/ml的待测溶液，取2μl注入液相色谱仪，按实施例1的检测方法检测，在214nm处检测，记录色谱图，如图6；获取保留时间、峰面积等参数，按外标法以峰面积计算，即得NGF含量。重复检测6次，结果见表3。
表3去白蛋白NGF制剂中NGF含量检测结果
上述实验结果表明：该方法的重复性良好，测定多份样品的含量准确可靠。
3.精密度试验
取去白蛋白NGF制剂，加流动相配制成50μg/ml的待测溶液，取2μl注入液相色谱仪，按实施例1的检测方法检测，连续进样6次，在214nm处检测，记录色谱图，获取保留时间、峰面积等参数，计算RSD值。结果见表4。
表4去白蛋白NGF制剂中NGF含量进样精密度结果
上述实验结果表明：该方法的进样精密度良好。
实施例3：外标法测定制剂中NGF含量的回收率试验
一、色谱条件：
同实施例1。
二、实验步骤：
1、对照溶液的制备：取浓度已知的NGF原液(具体出处同实施例1)，加流动相配制成50μg/ml的溶液，作为NGF对照溶液，配制2份，摇匀，待用。
2、样品溶液的制备：取含人血白蛋白(0.1体积％)和甘露醇(5.0体积％)的辅料溶液及含氨基酸(10mg/ml)和甘露醇(5体积％)的辅料溶液各10ml和NGF原液适量，分别配制含人血白蛋白和去白蛋白的NGF溶液，其中NGF浓度分别为40、50、60μg/ml，每个浓度分别配制3份，摇匀，待用。
3、将上述的对照溶液和样品溶液，每份精密量取2μl注入液相色谱仪，按实施例1的检测方法进行检测，记录色谱图，采用外标法进行计算，得出NGF的含量，根据加入量，计算回收率，结果见表5。
表5NGF制剂回收率实验结果
上述实验结果表明：该方法回收率合格，可以准确测定NGF含量。
实施例4：不同流速对NGF制剂中NGF与辅料分离度的影响
一、样品配制
(1)含人血白蛋白NGF制剂样品：取含人血白蛋白NGF制剂样品一支，加入0.6ml流动相，摇匀，滤过。
(2)去白蛋白NGF制剂样品：取去白蛋白NGF制剂样品一支，加入0.6ml流动相，摇匀，滤过。
二、色谱条件：
仪器：Waters ACQUITY H-Class Bio超高效液相色谱仪；
凝胶色谱柱：Waters UPLC SEC BEH125，125埃(1.7μm)，4.6×150mm；
检测器：紫外检测器，该检测器采用钛流通池；
流动相：乙腈：0.25M磷酸盐缓冲液＝15:85，pH值为7.0，流速：0.1ml/min和0.5ml/min；柱温：40℃；波长：214nm；进样量为2μl。
三、实验步骤：
将上述两个样品分别在0.1ml/min和0.5ml/min取2μl注入液相色谱仪，按实施例1的检测方法，在214nm处检测，记录色谱图，如图7～10；获取保留时间、峰面积、分离度等参数，考察在不同流速下NGF与辅料的分离度是否符合要求。结果见表6。
表6不同流速下NGF与辅料的分离度考察结果
从上述结果可以看出，虽然在0.1ml/min和0.5ml/min的流速下，也能够将NGF和辅料分开，但是在流速0.1ml/min下，其保留时间为10.747，远大于实施例1中在流速0.2ml/min下的保留时间5.353；而在流速0.5ml/min下，其分离度为2.97，比实施例1中在流速0.2ml/min下的分离度3.38要差，更进一步说明在流速0.2ml/min下的检测方法为最优检测方法。
实施例5：采用普通流通池对NGF制剂中NGF与辅料分离度的影响
一、样品配制
(1)含人血白蛋白NGF制剂样品：取含人血白蛋白NGF制剂样品一支，加入0.6ml流动相，摇匀，滤过。
(2)去白蛋白NGF制剂样品：取去白蛋白NGF制剂样品一支，加入0.6ml流动相，摇匀，滤过。
二、色谱条件：
仪器：Waters ACQUITY H-Class Bio超高效液相色谱仪；
凝胶色谱柱：Waters UPLC SEC BEH125，125埃(1.7μm)，4.6×150mm；
检测器：紫外检测器，该检测器采用普通流通池；
流动相：乙腈：0.25M磷酸盐缓冲液＝15:85，pH值为7.0，流速：0.25ml/min；柱温：30℃；波长：214nm；进样量为2μl。
三、实验步骤：
将上述两个样品分别取2μl注入液相色谱仪，按实施例1的检测方法，在214nm处检测，记录色谱图，如图11～12；获取保留时间、峰面积、分离度等参数，考察在不同流速下NGF与辅料的分离度是否符合要求。结果见表7。
表7普通流通池测定的NGF与辅料的分离度考察结果
从上述结果及图11可以看出，相比钛流通池，普通流通池测定的NGF与辅料无法基线分离，会使NGF含量的测定不准确。
实施例6-7：不同色谱条件下对NGF制剂中NGF含量测定的影响
一、样品配制
同实施例1。
二、色谱条件
同实施例1，不同的条件如下表8：
表8NGF含量测定不同色谱条件
| 有机相 | 磷酸盐缓冲液浓度 | 有机相与磷酸盐缓冲液的比例 | pH值 | 柱温 | |
| 实施例6 | 甲醇 | 0.1M | 20：80 | 6.5 | 50℃ |
| 实施例7 | 异丙醇 | 0.5M | 5：95 | 7.2 | 30℃ |
三、实验步骤：
将对照溶液与人血白蛋白NGF制剂样品分别取2μl注入液相色谱仪，按实施例1的检测方法，在214nm处检测，记录色谱图，如图13～14；获取保留时间、峰面积等参数，按外标法以峰面积计算，即得NGF含量。重复检测2次，结果见表9～10，与实施例1的色谱条件下NGF与辅料的分离度考察相比较结果见表11。
表9实施例6含人血白蛋白NGF制剂中NGF含量结果
| 序号 | 对照1 | 对照2 | 样品1 | 样品2 |
| 保留时间 | 5.0187 | 5.186 | 5.186 | 5.0184 |
| 峰面积 | 34804 | 34736 | 34057 | 34245 |
| 含量(％) | — | — | 97.95 | 98.49 |
表10实施例7含人血白蛋白NGF制剂中NGF含量结果
| 序号 | 对照1 | 对照2 | 样品1 | 样品2 |
| 保留时间 | 5.251 | 5.250 | 5.250 | 5.249 |
| 峰面积 | 195875 | 194443 | 190147 | 191026 |
| 含量(％) | — | — | 97.43 | 97.88 |
表11不同测定条件下NGF与辅料的分离度考察结果
| 样品 | 保留时间 | 峰面积 | 分离度 | 对称因子 | 理论塔板数 |
| 实施例1 | 5.353 | 159890 | 3.38 | 1.25 | 9242 |
| 实施例6 | 5.186 | 34057 | 3.23 | 1.07 | 13088 |
| 实施例7 | 5.250 | 190147 | 3.33 | 1.40 | 10843 |
从上述结果及图可以看出，盐浓度的增加，NGF峰响应值增大，但是在本发明选定的流动相比例、有机相种类、柱温、pH值的范围内，NGF峰相对保留时间变化不大，测定的NGF含量无明显差异，说明在本发明的流动相比例有机相种类、柱温、pH值范围内选定色谱条件检测NGF含量，不会影响NGF含量测定的准确性。其中在实施例1的条件下进行NGF含量测定时，NGF与辅料峰的分离度最大，辅料峰对NGF的含量测定影响最小，测定结果更准确。
实施例8：不同检测波长对NGF制剂中NGF含量测定的影响
一、样品配制
同实施例1。
二、色谱条件：
仪器：Waters ACQUITY H-Class Bio超高效液相色谱仪；
凝胶色谱柱：Waters UPLC SEC BEH125，125埃(1.7μm)，4.6×150mm；
检测器：紫外检测器，该检测器采用钛流通池；
流动相：乙腈：0.25M磷酸盐缓冲液＝15:85，pH值为7.0，流速：0.2ml/min；柱温：40℃；进样量为2μl。
三、实验步骤：
将对照溶液与人血白蛋白NGF制剂样品分别取2μl注入液相色谱仪，在205nm、214nm、220nm、280nm处检测，记录色谱图，如图15～18；获取保留时间、峰面积、分离度等参数，按外标法以峰面积计算，即得NGF含量。重复检测2次，结果见表12。
表12不同波长下测定的NGF含量测定结果
从上述结果及图可以看出，检测波长为205nm、214nm、208nm时测定的NGF含量无明显差异，故在检测波长为205～280nm范围内进行NGF含量测定时基本不会影响NGF含量测定的准确性。
上述三个检测波长条件中，检测波长的最优选择为214nm，因经方法耐用性验证，在检测波长在214±5nm范围内进行NGF含量检测时，对NGF含量测定值均无影响。与检测波长为214nm时的检测结果相比，当检测波长为280nm时，峰响应值相对较小，波动会大一些，相对而言测定的NGF含量的准确度不如检测波长为214nm时；与检测波长为214nm时的检测结果相比，当检测波长为205nm时，由于是末端吸收，峰响应值相对较大，且在末端吸收处，其余物质也可能在NGF出峰位置有吸收，相对而言测定的NGF含量的准确度不如检测波长为214nm时。
Claims (18)
1.一种神经生长因子制剂中神经生长因子含量的测定方法，所述方法使用超高效液相色谱法中的凝胶色谱法测定神经生长因子的含量，所述凝胶色谱法的条件为：
凝胶色谱柱为分子量检测范围为1000～80000道尔顿、孔径为125～200埃的UPLC分子筛色谱柱；
流动相为pH值6.5～7.2，浓度为0.1～0.5M的磷酸盐缓冲液，所述流动相中有机相的含量为5～20体积％；所述有机相为乙腈、甲醇或异丙醇；
柱温为30～50℃；
所述流动相的流速为0.1～0.5ml/min；
检测器采用钛流通池，检测波长为205～280nm。
2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述流速为0.1～0.3ml/min。
3.根据权利要求2所述的测定方法，其特征在于，所述流速为0.2ml/min。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的测定方法，其特征在于，所述凝胶色谱柱为Waters UPLC SEC，1.7μm，4.6×150mm，分子量范围在1000～80000道尔顿、孔径为125埃。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的测定方法，其特征在于，所述流动相中有机相的含量为15体积％。
6.根据权利要求4所述的测定方法，其特征在于，所述流动相中有机相的含量为15体积％。
7.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述有机相为乙腈。
8.根据权利要求1至3及6中任一项所述的测定方法，其特征在于，所述流动相pH值为7.0，所述柱温为40℃。
9.根据权利要求4所述的测定方法，其特征在于，所述流动相pH值为7.0，所述柱温为40℃。
10.根据权利要求5所述的测定方法，其特征在于，所述流动相pH值为7.0，所述柱温为40℃。
11.根据权利要求1至3、6、7、9、10中任一项所述的测定方法，其特征在于，所述检测器为紫外检测器，所述检测波长为205～220nm。
12.根据权利要求4所述的测定方法，其特征在于，所述检测器为紫外检测器，所述检测波长为205～220nm。
13.根据权利要求5所述的测定方法，其特征在于，所述检测器为紫外检测器，所述检测波长为205～220nm。
14.根据权利要求8所述的测定方法，其特征在于，所述检测器为紫外检测器，所述检测波长为205～220nm。
15.根据权利要求11所述的测定方法，其特征在于，所述检测波长为214nm。
16.根据权利要求12至14中任一项所述的测定方法，其特征在于，所述检测波长为214nm。
17.根据权利要求1至3中任一项所述的测定方法，其特征在于，所述凝胶色谱法的进样量为2μl。
18.根据权利要求1至3中任一项所述的测定方法，其特征在于，所述制剂包括含人血白蛋白的神经生长因子制剂和去白蛋白神经生长因子制剂。
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