DE2630596A1

DE2630596A1 - An traegerstoffe knuepfbare beta- glykosidderivate, verfahren zu deren herstellung und verwendung derselben als kuenstliche antigene oder immunabsorbantien

Info

Publication number: DE2630596A1
Application number: DE19762630596
Authority: DE
Inventors: Donald A Baker; David R Bundle; Raymond U Lemieux
Original assignee: Canadian Patents and Development Ltd
Current assignee: Canadian Patents and Development Ltd
Priority date: 1975-07-08
Filing date: 1976-07-07
Publication date: 1977-01-20
Also published as: NL176568B; NL176568C; FR2332998A1; GB1544908A; FR2332998B1; CA1083566A; NL7607562A; US4238473A; US4137401A; DE2630596C2

Description

MÜLLER-BORE · GROENING · DEUFEL · SCHÖN · HERTEl/ DR. WOLFGANG MÜLLER-BORE

fj OQ(\O (PATENTANWAUTVON 1927-1975)

\J C^yjC HANS W. GROENING₁ DIPL.-ING.

DR. PAUL DEUFEL, DIPL.-CHEM. DR. ALFRED SCHÖN, DIPL.-CHEM. WERNER HERTEL, DIPL.-PHYS.

r7. JUU

CANADIAN PATENTS AND DEVELOPMENT LIMIi
Ottawa, Ontario, Canada

An Trägerstoffe knüpfbare ß-Glykosidderivate, Verfahren zu deren Herstellung und Verwendung derselben als künstliche
Antigene oder Immunoabsorbantien

609883/1379

MÜNCHEN 80 · SIEBERTSTR. 4 · POSTFACH 860720 · KABEL·: ItTTEBOPAT · TEL. (089) 47 1079 · TELEX 5-22659

An. Trägerstoffe knüpf bare ß-Glykosidderivate, Verfahren zu deren Herstellung und Verwendung derselben als künstliche Antigene oder Immunoabsorbantien

Es ist bekannt, daß Kohlehydratverbindungen des verschiedensten Typs die Antigendeterminantien (oder —bestimmungssubstanzen) für sehr zahlreiche Stoffe sind. Es wurde ferner gezeigt, daß es möglich ist, vergleichsweise kleine Moleküle (Haptene), die selbst keine Antigenwirkung aufweisen, an einen geeigneten hochmolekularen Trägerstoff zu knüpfen unter Erzielung eines Antigens, das, wenn es einem Tier unter geeigneten Bedingungen verabreicht wird, zur Produktion von Antikörpern führt, die eine Spezifität für das Hapten besitzen. So konnten Goebel und Avery zeigen (vgl. z. B. J. Exp. Med., ^O, 521 (1929), ibid JjO, 533 (1929) und ibid 6±, 29 (1936)) ι daß für Kohlehydratverbindungen spezifische Antikörper in Versuchstieren erzeugt werden durch Immunisierung der Tiere mit künstlichen Antigenen, die durch Kupplung von p-Aminophenyl- oder p-Aminobenzylglycosiden an Pr/otein hergestellt worden waren. Aus der CA-PS 966 778 ist bekannt, daß Opiumalkaloide, die über eine Carboxy-niedrigalkyl-Bindungsgruppe covalent an ein Proteinmolekül gebunden sind, Antigene darstellen und daß diese bei Verabreichung an Tiere zur Produktion von Antikörpern führen, die spezifisch für das Alkaloid sind. In beiden Fällen müssen die Haptene an einen Trägerstoff gebunden sein, bevor sie eine Antigenwirkung entfalten.

Bisher bestanden zwei ernsthafte Probleme, die die Herstellung künstlicher Kohlehydratantigene behinderten. Das erste Problem war die Schwierigkeit, das Antigendeterminans zu gewinnen, da diese Materialien sehr oft nur in geringen Mengen aus natürlichen Quellen zugänglich sind. Ein Beispiel hierfür ist das

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Lewis-a-trisaccharid-Antigendeterminans 2-Acetamido-2-deoxy-4-O-(a-L-fucopyranosyl)-3-O-(ß-D-galactopyranosyl)-D-glucopyranose. Bisher stand zur Synthese einer derart komplexen Verbindung kein Verfahren zur Verfügung und zur Gewinnung dieser Verbindung war es daher notwendig, diese aus einer seltenen natürlichen Quelle, z. B. Ovarialcystenflüssigkeit, zu isolieren. Aus einer einzelnen Ovarialcyste konnten z. B, 2,4 g "dialysierbare Produkte" gewonnen werden (vgl. V. P. Rege et al, Nature (London), 204. 740 (1964)). Nach umfangreichen Manipulationen konnten etwa 10 mg des Lewis-a-trisaccharid-Antigendeterminans aus diesem Material isoliert werfen. Ahnlichen Schwierigkeiten sah' man sich gegenüber bei der iGewinnung des Antigendeterminants anderer menschlicher Blutgruppen. An diesem Punkt setzte die zweite Hauptschwierigkeit ein, nämlich eine geeignete Punktionalisierung des Kohlehydrat-Antigendeterminans in solcher Weise, daß es zur Herstellung von monospezifischen künstlichen Antigenen und Immunoabsorbantien verwendbar ist.

Viel Findigkeit und Arbeit wurde in die Ausarbeitung von Verfahren zur Bindung von Zuckern an Trägerpolymerisate investiert, doch haben alle bisher bekannt gewordenen Methoden einige schwerwiegende Nachteile. So haben z. B. Kabat und Mitarbeiter (vgl. J. Immunol., ^jL, 858 (1966)) das reduzierende Saccharid zu Aldonsäure oxidiert, die anschließend an Proteinaminogruppen mit Hilfe eines gemischten Anhydrids gebunden wurde. Diese Verfahrensweise resultiert jedoch unvermeidlich in einer Zerstörung des endständigen Saccharide.

Die Umwandlung des endständigen Saccharide in i-(m-Nitrophenyl)-flavazol mit nachfolgender Reduktion zum Amin, Diazotierung und Kupplung an das Protein wurde von Westphal und Mitarbeitern (vgl. Eur. J. Immunol., 2» 1°6 (1971)) angewandt. Davon abgesehen, daß das endständige Saccharid zerstört wird, erfordert dieses Verfahren, daß die 2- und 3-Stellungen dieses Saccharide

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unsubstituiert sind. Außerdem wird eine neue und stark antigene Verbindung in unmittelbarer Nachbarschaft zum Kohlehydrat-Hapten eingeführt und ferner sind einige Zucker empfindlich gegenüber den zur Diazotierung angewandten Bedingungen. Die beiden letztgenannten Schwierigkeiten beschränken auch das oben angegebene Verfahren von Goebel und Avery.

Aufgabe der Erfindung ist die Schaffung eines Verfahrens zur chemischen Synthese von Kohlehydrat-Antigendeterminantien in einer Form, die zur Bindung an Trägermoleküle oder feste Trägerstoffe geeignet ist, sowie ferner die Verwendung der erhaltenen Verfahrensprodukte zur Gewinnung künstlicher Kohlehydrat-Antigene, zur Gewinnung von für das Kohlehydrat-Hapten des künstlichen Antigens spezifischen Antiseren, und zur Gewinnung von Immunoabsorbantien (Affinitätsabsorbantien), die zur selektiven Absorption von Antikörpern befähigt sind, die entweder gegen das künstliche Antigen oder gegen natürliche Antigene mit der selben endständigen Oligosaccharidstruktur wie das Antigendeterminans gebildet sind.

Besonders hervorzuheben sind in diesem Zusammenhang de niedri-. gen Oligosaccharid-Antigendeterminantien der menschlichen Blutgruppen, z. B. Lewis-a, Lewis-b, B und H(O).

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung einer ß-Glycosylplus Brückenbildungsarm-Verbindung ist dadurch gekennzeichnet, daß man einen aktivierten Zucker (a) bestehend aus einem GIycosylhalogenid, einem 1,2-ortho-Acylderivat eines Zuckers oder einem 1,2-Oxazolinderivat eines Zuckers, umsetzt mit

einer Monohydroxycarbonsäure (b) der allgemeinen Formel I

HO-R- GOOR¹ (I)

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worin R einen aliphatischen Kohlenwasserstoffrest mit 3 bis Kohlenstoffatomen und R¹ eine Schutzgruppe für die Säure "bedeuten, unter Bildung eines ß-G-lycosids der allgemeinen Formel II

Zucker -2~> O - R - GOOR' (II)

und das erhaltene ß-Glycosid isoliert, und ggf. 1 bis 3 weitere Zucker an die Zuckerkomponente entweder in der α- oder in der ß-anomeren Konfiguration glykosidisch bindet unter Bildung eines Disaccharide der allgemeinen Formel III

Disaccharid -£-»· 0 - R - GOOR' (III)

eines Trisaccharids der allgemeinen Formel IV

Trisaccharid ~£L> 0 - R - GOOR' (IV)

oder eines Tetrasaccharids der allgemeinen Formel V

Tetrasaccharid JL* 0 - R - COOR' (V)

und die erhaltenen Hapten-Verbindungen isoliert und ggf. an ein lösliches Träger-Makromolekül oder an einen unlöslichen Trägerstoff bindet unter Bildung eines künstlichen Antigens oder Immunoabsorbans.

Die Herstellungsweise von Antigen-Determinantien der Formeln III, IV und V aus Verbindungen der Formel II ist in den folgenden Schemen I, II und III unter Bezugnahme auf die unten angegebenen Beispiele schematisch wiedergegeben.

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Schema 1 CBn -Benzyl) 263059-B

HO

COOC₂H₅

Cs)

OCCH₁)COOCH,

6O98S3/I3?i

a IT Uc^Acäf_yl

Acc ._oftc^ \₀^ν-ο_χ

NHAc

^HU OH

Bsp.

\/0Λ

0(CH₁)^CGOCH₃

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HO

f HO OH

HO OH

rs t

-J

ί . YZ Ί ι _c=A^ryi 263059b·

CCCH₂)^CCCcH: NHAc

C3)

p. 9

0(CH₂LCOOCH=

OCCH₁)XOOCH₃

NHAc

HO OH

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263059;·. -Jg- 9

Zur näheren Erläuterung der Erfindung wird im folgenden die Synthese der Antigendeterminantien für die menschlichen Blutgruppen Lewis-a, Lewis-b, B und H(O) "beschrieben, doch muß hervorgehoben werden, daß die gleiche Verfahrensweise auch auf andere Kohlehydratantigene anwendbar ist. Das Gesamtverfahren beginnt mit der Bindung eines geeigneten Zuckers (z. B. 2-Acetamido-2-deoxy-D-glucose (D-GIcNAc) für die Lewis-a, Lewis-b und H(O)-Determinantien und D-Galactose (D-GaI) für das B-Determinans) über eine ß-glycosidische Bindung an eine geschützte Monohydroxycarbonsäure der allgemeinen Formel I

HO-R- COOR¹ (I)

Die Bindung erfolgt nach für die Synthese von ß-Glycosiden in der Kohlehydratchemie wohl bekannten Methoden und sie kann nach ß-Glycosidierungsmethoden erfolgen, z. B. solchen vom Typ des Koenigs-Knorr-Helferich-Verfahrens unter Verwendung von 0-acetylierten a-Glycosylhalogenidderivaten des Zuckers (vgl, z. B. 0. Th. Schmidt, Methods in Carbohydrate Chemistry, I, 349 (1962), P. Z. Allen, Methods in Carbohydrate Chemistry, I, 372 (1962), E. A. Talley, Methods in Carbohydrate Chemistry, II, 337 (1963) und H. M. Flowers, Methods in Carbohydrate Chemistry, VI, 474 (1972)), oder im Falle von D-Galactose mit Hilfe eines 0-acetylierten 1,2-orthoacylesterderivats (vgl. z. B. N. K. Kochetkov und A. F. Bochkov, Methods in Carbohydrate Chemistry, VI, 480 (1972)), und im Falle von D-Glucosamin mit Hilfe eines O-acetylierten 1,2-Oxazolinderivats (vgl. z. B. S. E. Zurabayan, T. S. Antonenko und Ya. Khorlin, Carbohydrate Research, JJj₁, (1970)) und in jedem der letzteren Fälle unter Verwendung eines geeigneten Säurekatalysators zur Förderung der Reaktion. Auf diese Weise werden Verbindungen der allgemeinen Formel II gewonnen.

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Zucker ——> O - R - COOR» (II)

Das Aglycon (-0-R-OOOR¹) in den Verbindungen der Formel II wird nach folgenden Gesichtspunkten ausgewählt. Die Gruppe R¹ besteht aus niederen Alkylresten, z, B. aus Methyl, Äthyl, n-Propyl, Isopropyl oder η-Butyl, wobei der Methylrest etwas bevorzugt wird aus Gründen der Wirtschaftlichkeit und einer in der Regel vorteilhafteren Reaktivität der Methoxycarbonylgruppe gegenüber anderen Alkoxycarbonylgruppen. Der Rest -R- bewirkt eine physikalische Trennung und stellt einen Brückenbildungsarm dar zwischen dem Antigendeterminans und dem Träger- oder Halterungsmittel. Dieser Rest sollte inert sein gegenüber den für die Weiterverarbeitung der Kohlehy— dratverbindungen verwendeten chemischen Reaktionen und ist daher in wirksamer Weise beschränkt auf Strukturen, bei denen es sich entweder um Kohlehydrat- oder Ätherreste handelt. Bevorzugt werden Reste der Formel

-0-G_nH_2n-COOR'

worin η = 3 bis 17 bedeutet und die Kohlenstoffkette normal ist. Besonders vorteilhaft sind Reste der angegebenen Formel, in der η im Bereich von 8 bis 10 liegt, und zwar nicht nur im Hinblick auf die leichte Verfügbarkeit der diesem Rest zugrunde liegenden Hydroxysäure, sondern auch deswegen, weil diese inerte und praktisch keine Besonderheit aufweisende aliphatische Kette als ein internes Hilfsmittel zu wirken scheint. So werden z. B. höhere Antikörperwerte erhalten bei Verwendung von Brückenbil dungs armen der angegebenen bevorzugten Kohlenstoff kettenlänge als mit solchen einer kürzeren Kettenlänge. In den meisten unten angegebenen Beispielen werden Verbindungen mit -R- gleich -CgH.. g- verwendet, da mit diesen sehr gehaltvolle Antiseren reproduzierbar erzielt werden konnten.

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->er-

Die ß-Glycosidderivate entsprechen der Formel

(Zucker)^—-—* O-R-OOR» worin bedeuten:

R einen aliphatischen Kohlenwasserstoffrest mit 3 bis 17

Kohlenstoffatomen,
R" einen Rest der Formeln -H, -OH, -NH₂, -NHNH₂, -N₃,

-O-Alkyl oder O-Aryl, und
η = 1 Ms 4

Die Verbindung der Formel (Zucker)·» O-R-COOR¹, worin R¹ eine Schutzgruppe bedeutet, ist überführbar in eine Verbindung der Formel (Zucker)_n —S-* O-R-COR", worin R^M eine andere Bedeutung als diejenige einer Schutzgruppe haben kann. Die ursprüngliche Schutzgruppe -OR¹, z. B, der entsprechende Methyl-, Äthyl-, Propyl- oder Butylester, kann durch andere R"-Gruppen ersetzt werden entweder zur Bildung eines anderen Haptens für einen bestimmten Anwendungszweck oder zur Erleichterung der Kupplung an einen Träger oder Halterungsstoff.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern. Temperaturangaben bedeuten ⁰C,

Die folgenden Beispiele 1 bis 4 erläutern die Herstellung von Verbindungen der Formel II. In allen Fällen wurden die erhaltenen Strukturen durch moderne Methoden der chemischen Analyse bestätigt, z. B. durch Kohlenstoff-13- und Proton-Magnetische Kernresonanzspektren (CMR bzw. PMR), Elementaranalyse und in vielen Fällen durch Hochauflösungs-Massenspektrometrie.

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Beispiel 1

Herstellung des Antigendeterminans 8-Methoxyearbonyloctyl—ß-D-galactopyranosid (1)

8-Methoxycarbonyl-i-octanol (21,4 g, 0,115 Mol) und trockenes Quecksilber(II)cyanid (3O₉ 3 g> 0,119 Mol) wurden in einem 1 : 1—Gemisch aus trockenem destilliertem Benzol-Nitromethan (85O ml) gelöst. Die Lösung wurde gerührt und 200 ml des Lösungsmittels wurden abdestilliert. Es wurden Lösungsmittelgemisch (200 ml) und Calciumsulfat (40 g) zugesetzt und danach wurde 2,3>4»6-Tetra-0-acetyl-ce-D-galactosylbromid (38₉7 S₉ 0,094 Mol) zugegeben. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 36 Stunden lang gerührt und danach 2 Stunden lang auf 70 ° erhitzt. Nach dem Abkühlen wurde die Lösung filtriert und das Filtrat wurde in Vakuum eingedampft unter Erzielung eines gelben Sirups. Der erhaltene Sirup wurde in destilliertem Äthylacetat (500 ml) gelöst und die erhaltene Lösung wurde mit einer wäßrigen Lösung von Natrium-odid (1O fo Qt/Or, 500 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde sodann nacheinander mit einer gesättigten Lösung von Natriumthi ο sulfat (200 ml) und Wasser (2 χ 250 ml) gewaschen· Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet und anschließend nach Filtration im Vakuum eingedampft. Der erhaltene Sirup (etwa 50 g) wurde, nachdem er unter hohem Vakuum über Nacht getrocknet worden war, in trockenem destilliertem Methanol (200 ml) gelöst und die erhaltene Lösung wurde mit 200 ml methanolischem Natriummethoxid (15Ο mg Natrium) versetzt. Nach 24 Stunden langem Rühren bei Raumtemperatur wurde ein saures Harz (das zuvor mehrere Male in Methanol gewaschen worden war) zugegeben und es wurde gerührt ₉ bis der pH-Wert neutral war» Nach Filtration wurde die Lösung eingedampft und der erhaltene wachsartige Rückstand wurde bei Raumtemperatur in 100 ml H₂O gelöst. Die erhaltene Lösung wurde mit Äther (2 χ 40 ml) extrahiert und danach in den Kühlschrank gestellt. Beim Stehenlassen erfolgte Kristalli-

S098 8 3/137Q

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sation. Die gebildeten weißen Kristalle wurden abfiltriert ■und getrocknet. Gewicht des Verfahrensprodukts = 13»5 g

(41 #), F β 104 - 105°, [α]|⁵ = -13,4° (c = 1; 95 1° Äthanol).

Beispiel 2

Herstellung des Antigendeterminans 8-Äthoxycarbonyloctyl—2-acetainido-2-deoxy-ß-glucopyranosid (2)

Quecksilber(ll)cyanid (31»8 g» 126nMol) und wasserfreies Calciumsulfat wurden zu einer Lösung aus 8-Äthoxycarbonyl— 1-octahol (25 g, 124 mMol) in 100 ml trockenem Benzol zugegeben. Das Gemisch wurde vor Feuchtigkeit geschützt, während es 1 Stunde lang bei Raumtemperatur gerührt wurde vor der Zugabe von 2-Acetamido-3_r4,6-tri-0-acetyl-2-deoxy-a-D-glucopyranosylchlorid (25 g, 68 mMol). Das erhaltene Gemisch wurde 4 Tage lang bei Raumtemperatur kräftig gerührt. Dichlormethan (4OO ml) wurde sodann zugegeben, die Feststoffe wurden durch Filtration entfernt und das Filtrat wurde nacheinander mit 10 ^iger wäßriger Natriumchloridlösung (50 ml), einmal mit gesättigter wäßriger Natriumbicarbonatlösung (25 ml) und zweimal mit Wasser (50 ml) gewaschen. In jedem Falle wurde die wäßrige Schicht mit wenig Dichlormethan zurückextrahiert. Nach dem Trocknen über Magnesiumsulfat wurden die Lösungsmittel entfernt, wobei ein Sirup zurückblieb, der aus einem Gemisch von Diäthyläther und η-Hexan kristallisierte. Die Ausbeute an rohem 8-Äthoxycarbonyloctyl-2-acetamido-3,4,6-tri-0-acetyl-2-deoxy-ß-D-glucopyranosid betrug 28,9 g (80 fo) . Eine umkristallisierte Probe zeigte die Charakteristika F = 112°, [a]^° = -12,2° (c = 2,4; Chloroform). Eine i8-stündige De-O-Acetylierung dieser Verbindung mit Triäthylamin (27 ml) in Methanol (500 ml) bei 0-5° ergab nach Verdampfung des Lösungsmittels die Verbindung (2) in Form eines chromatographisch homogenen Pulvers, das einer Kristallisation widerstand und deshalb als dessen Hydrazidderi-

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vat von F = 200 bis 201°, [a]^⁶ = -22,5° (c = 1, Wasser) charakterisiert wurde, welches durch Behandlung von (2) mit einer 85 ^igen Lösung von Hydrazinhydrat hergestellt wurde.

Wahlweise Ausführungsform des Verfahrens zur Herstellung des Antigendeterminans (2)

Ein Gemisch aus p-Toluolsulfonsäure (1O mg), 8-Äthoxycarbonyl-1-octanol (lg), 2-Methyl-4,5-(3_f4,6-triacetyl-2-deoxy-a-D-glucopyrano)-A -oxazolin (1 g) wurde in 10 ml eines 1:1-Gemisches aus Benzol und ITitromethan gelöst und 3 Stunden lang auf Rückfluß temperatur erhitzt. Die übliche Aufarbeitung ergab 8-Äthoxycarbonyloctyl-2~acetamido-3,4,6-tri~0~acetyl-2-deoxy-ß-D-glucopyranosid (1,28 g, 79 i°). Die Be-0-acetylierung wie in Beispiel 2 beschrieben ergab das angestrebte Antigen— determinans in 90 ^iger Ausbeute.

Beispiel 3

Herstellung des Antigendeterminans 8~Methoxycarbonyloct.Yl-2-acetagLLdo-2-deoxy~ß-D-glucopyranosid (3)

Die Herstellung dieser Verbindung (3) erfolgte wie in Beispiel 6 besehrieben.

Beispiel 4

Herstellung des Antigendeterminans 5-MethoxycarbonylT3entyl-2-acetamido—2-deoxy-ß--D-glucopyranosid ( 4)

Die Kondensation von 2-Acetamido-3»4,6-tri-O—acetyl—2-deoxya-D-glucopyranosylchlorid mit 5-Äthoxycarbonyl-1-pentanol unter den gleichen Bedingungen, wie sie in Beispiel 2 beschrie-

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u -

ben werden, ergab in 74 $iger Ausbeute 5-Äthoxycarbonylpen— tyl-2-acetamido-3, 4»ö-tri-O-acetyl^-deoxy-ß-D-glucopyraaiosid von F= 101 - 102°, [a]^⁵ = -16,8° (c = 1,06, Chloroform). Eine De-O-acetylierung dieser Verbindung unter Verwendung von Natriummethoxid ergab nach Kristallisation die Verbindung (4) in 92 ^iger Ausbeute, F = 154 - 155° (schmilzt und verfestigt sich wieder), schmilzt erneut bei 167°» L^a]^ = -25j5° (c = 1,1, Wasser).

Erfindungsgemäß werden die Verbindungen der allgemeinen Formel II in komplizierter aufgebaute Antigendeterminantien überführt durch Einführung zusätzlicher Zucker in geeignet blockierte Derivate der Formel II nach in der Xohlehydratehemie bekannten Synthesemethoden. Auf diese Weise werden Verbindungen der Formel III

Disaccharid -^->- O-E-COOE¹ (HI)

erhalten, in denen eine Disaccharidkomponente vorliegt im Gegensatz zu den in Verbindungen der Formel II vorliegenden Mono saccharideinheiten·

Die Beispiele 5₉ β und 7 erläutern die Herstellung von ¥erbindungen der allgemeinen Formel IH₀

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- Vr-

Beispiel 5

Herstellung des Antigendeterminans 8-Methoxycarbonyloctyl-2-0~ (q-L-fucopyranosylj-ß-D-galactopyranosid (5)

Zu einer farblosen Lösung von 6,6 g α,α-Dimethoxytoluol (0,043 Mol) in 60 ml destilliertem Acetonitril wurde p-Toluolsulfonsäure (0,285 g, umkristallisiert) zugegeben. Die Lösung wurde sofort gelb und wurde sogleich mit 8-Methoxycarbonyloctyl-ß-D-galactopyranosid (1O g, 0,028 Mol) versetzt. Die gelbe Farbe verschwand innerhalb von 5 Minuten und das Lösen erfolgte in 30 Minuten. Die von Feuchtigkeit geschützte Lösung wurde 44 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Zu diesem Zeitpunkt war durch Dünnschichtchromatographie kein Ausgangsmaterial mehr feststellbar und das neue Produkt 8-Methoxycarbonyloctyl-4f6-0—benzyliden-ß-D-galactopyranosid lag vor. Das Vorliegen des isomeren 3»4-0-Benzylidenanalogen dieser Verbindung konnte durch DünnschichtChromatographie nicht festgestellt werden.

Es wurden einige Tropfen Triäthylamin zugegeben (pH etwa 7) und das Lösungsmittel wurde verdampft. Zum zurückgebliebenen Sirup wurde Toluol zugesetzt und danach im Vakuum verdampft und diese Operation wurde noch einmal wiederholt. Der erhaltene weiße wachsartige Feststoff wurde über Nacht mit (destilliertem) Hexan gerührt zur Entfernung einer Substanz, die als rasch wandernder ÜV-absorbierender Fleck nachweisbar war, und es wurde ein sehr feines Pulver erhalten. Nach Abfiltration wurde der Feststoff in Di chlorine than (500 ml, destilliert) gelöst und die erhaltene Lösung wurde mit einer gesättigten Natriumbicarbonatlösung (IOO ml) und anschließend mit Wasser (3OO ml) gewaschen. Nach dem Trocknen über Natriumsulfat wurde die organische Phase zur Trockene verdampft, wobei das reine 4,6-Benzylidenderivat erhalten wurde. Das Produkt, gelöst in Methanol, wurde in einen n-Pentan enthaltenden Exsiccator gestellt

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zur Kristallisation. Die Ausbeute an umkristallisiertem Produkt betrug 83 fo, F = 127 - 128°, [α]^⁵ = -33° (c = 1, OhIoroform)·

Ein Teil der erhaltenen Benzylidenverbindung (7 g> 0,016 Mol) wurde in 4OO ml trockenem destilliertem Dichlormethan, das 10 ml Pyridin (destilliert) enthielt, gelöst. Die erhaltene Lösung wurde auf -40° gekühlt und mit 2 ml (0,017 Mol) destilliertem BenzoylChlorid tropfenweise versetzt. Nach 2 Stunden Aufrechterhaltung dieser Temperatur zeigte eine Untersuchung mit DünnschichtChromatographie das Vorliegen von nur einem Produkt, nämlich S-Methoxycarbonyloctyl^-O-benzoyl-4,6-»0—benzyliden-ß-D-galactopyranosid· Es wurden Eisstückchen zugegeben und die Lösung wurde in ein Gemisch aus Wasser und Eis (300 ml), das kräftig gerührt wurde, geschüttet. Die organische Phase wurde abgetrennt und die wäßrige Phase zurückextrahiert mit Dichlormethan (2 χ 100 ml). Die vereinigte organische Phase wurde mit einer gesättigten Natriumbicarbonatlösung (200 ml) und danach mit Wasser ( 2 χ 300 ml) gewaschen. Nach dem Trocknen über Natriumsulfat wurde die organische Phase zur Trockene eingedampft. Das verbleibende Pyridin wurde mit Toluol mitverdampft im Vakuum, wobei 8,7 g (IOO fo) des gewünschten blockierten Galactopyranosids erhalten wurden. Die Umkristallisation wurde bewirkt durch Lösen des Sirups in 2-Propanol und die Lösung wurde in einen Exsiccator, der n-Pentan enthielt, gestellt. Die Ausbeute war quantitativ, F = 96 - 97°, [α]|⁵ = +60,5° (c = 1, Chloroform)·

Das erhaltene, selektiv blockierte Galactopyranosid (4g, 7,38 mMol) wurde in einem Gemisch aus gereinigtem Dichlormethan (1O ml) und destilliertem Ν,Ν-Dimethylformamid (0,62 ml), das 1,6 g (10,7 mMol) Tetraäthylammoniumbromid und 7,8 g Diisopropyläthylamin enthielt, gelöst. Zu der erhaltenen Lösung wurde Tri-O-benzyl-a-L-fucosylbromid (frisch hergestellt aus 20,8 mMol Tri-0—benzyl~1-p-nitrobenzoyl-a-L-fucopyranose)

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«ι e
- W-

zugegeben, worauf 2 g Molekularsiebmaterial von 4 ■& zugesetzt wurden. Nach 48 Stunden wurde das Reaktionsgemisch mit Dichlormethan (40 ml) verdünnt und die Feststoffe wurden durch Filtration entfernt. Das Filtrat wurde mit Wasser gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Fach Filtration wurde die Lösung im Vakuum eingedampft zu einem schwach gelben Sirup. Dieser Sirup wurde in Äther-Äthylacetat (3 ' 2) gelöst und in eine Aluminiumoxidsäule eingebracht. Die Produkte wurden mit dem gleichen Lösungsmittelsystem rasch eluiert und nach Verdampfen der Lösungsmittel in Form eines schwach gelben Sirups erhalten. Dieser Sirup wurde in Hexan-Äthylacetat (8 : 2) gelöst und auf eine mit Silicagel (200 g) gefüllte Säule aufgebracht. Die Elution erfolgte unter Verwendung des gleichen Lösungsmittelgemisches. Zwei rasch wandernde Flecken wurden zuerst eluiert und danach die gewünschte Verbindung. Das Gewicht betrug (nach dem Trocknen unter Hochvakuum) 6,1 g (86 <fo).

De-O-benzoylierung mit methanolischem Natriummethoxid ergab 8-Methoxycarbonyloctyl-4,6-0-benzyliden-2-0-(tri-O-benzyl-oc-L-fucopyranosyl)-ß-D-galactopyranosid in 80 ^iger Ausbeute, F = 104 - 105°, [a]J5⁵ = -54° (c = 1, Chloroform). Hydrierung über 5 f° Palladium auf Aktivkohle ergab die angestrebte Verbindung (5) in. Form eines Sirups, der in der DünnschichtChromatographie homogen war und in Form seines Hydrazidderivats charakterisiert wurde; F = 178° (Äthanol-Äther), [a]^⁸ = -87,4° (c = 1,02, Wasser).

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Beispiel 6

Herstellung des Antigendeterminans 8-Methoxycarbonylootyl-2-acetamido-2-deoxy-4-0-(a-L-fucopyrattosyl)-ß-D-glucopyranoBid

Natrium (18 mg) wurde zu trockenem Methanol (40 ml) zugegeben und nach beendeter Reaktion wurde 8-Äthoxycarbonyloctyl-2-acetamido-3 ,4, 6-tri-0-acetyl-2-deoxy-ß-D-glucopyranosid (1,06 g, 2 mMol) zugesetzt. Die Lösung wurde 24 Stunden lang bei Raumtemperatur gehalten vor der Deionisierung unter Verwendung eines sauren Harzes, Nach Entfernung des Lösungsmittels blieben 753 mg des De-O-acetylierten Produktes zurück, das nicht charakterisiert, sondern direkt zur Herstellung der gewünschten Verbindung verwendet wurde. Das im Vakuum über Phosphorpentoxid getrocknete Material wurde in Dimethylformamid (5 ml) das α,α-Dimethoxytoluol (2 ml) und p-Toluolsulfonsäure (25 mg) enthielt, gelöst· Fach 1,5 Stunden langem Erhitzen auf 40° wurde die Lösung gekühlt und mit Triäthylamin versetzt, um die Säure zu neutralisieren. Nach Entfernung des Lösungsmittels wurde Toluol (5 ml) zugegeben und durch Verdampfen entfernt. Diese Prozedur wurde zweimal wiederholt und der erhaltene Rückstand wurde sodann mit Hexan (10 ml) trituriert. Der Feststoff wurde gesammelt und in Dichlormethan (25 ml) gelöst. Die erhaltene Lösung wurde dreimal mit Wasser (5 ml) gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und eingedampft zu einem Rückstand, der aus Äthanol-Petroläther kristallisierte. Die Ausbeute an 8-Methoxycarbonyloctyl-2-acetamido-4,6-0-benzyliden-2-deoxy-ß-D-glucopyranosid betrug 481 mg (50 #), F = 219°. Umkristallisation ergab eine analysenreine Probe von F β 221°, [a]|⁵ = -56° (c = 1,3, Dimethylformamid).

Die erhaltene Verbindung wurde 24 Stunden lang acetyliert unter Verwendung eines 1 : 1-Gemisches aus Essigsäureanhydrid und Pyridin. Das erhaltene Produkt wurde in üblicher Weise

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isoliert und de-O-benzylidiniert durch 25 Minuten lange Behandlung mit 50 folger Essigsäure bei 100 unter Erzielung von 2-Acetamido-3-0-acetyl-2-deoxy-ß-D-glucopyranosid, P = 122 - 123°, [aljj⁰ = "47,3° (c = 1,1, Chloroform).

Die 6-Stellung der erhaltenen Verbindung wurde selektiv benzoyliert in 88 folger Ausbeute durch Behandlung mit 1,1 Äquivalenten N-Benzoylimidazol. Ein Gemisch aus dem erhaltenen 6-Benzoat 8-Methoxycarbonyloctyl—2-acetamido-3-0-acetyl-ß-O-benzoyl^-deoxy-ß-D-glucopyranosid, F = 105°, [a]^² = -42,0° (c = 1, Chloroform) (1,55 g, 2,9 mMol), Tetraäthylammoniumbromid (63Ο mg, 3 mMol), Diisopropyläthylamin (450 mg) und Dimethylformamid (4 ml) in Dichlormethan (20 ml) wurde zu 2,3,4-Tri-O-benzyl-a-L-fucopyranos.ylbromid zugegeben, das frisch bereitet worden war aus 3,38 g (5,8 mMol) 2,3,4-Iri-0-benzyl-1-0-p-nitrobenzoyl-ß-L-fucopyranose. Die Lösung wurde bei Raumtemperatur 3 Tage lang gerührt, wonach eine Untersuchung mit DünnschichtChromatographie zeigte, daß kein Ausgangsmaterial mehr vorlag. Es wurde Di chlorine than (15Ο ml) zugesetzt und die Lösung wurde in üblicher Weise mit V/asser und wäßriger Natriumbicarbonatlösung gewaschen vor Entfernung des Lösungsmittels.

Das erhaltene sirupöse Produkt wurde direkt zur Herstellung von 8-Methoxycarbonyloctyl-2-acetamido-4-0-(2,3,4-tri-O-benzyl-a-L-fucopyranosyl)-2-deoxy-ß-D-glucopyranosid verwendet. Das rohe Disaccharid (3,78 g) wurde in 50 ml trockenem Methanol gelöst, worauf 5 ml 0,2 N-Natriummethoxid in Methanol zugegeben wurden. Nach 24 Stunden bei Raumtemperatur wurde die Lösung unter Verwendung des sauren Harzes deionisiert. Nach Entfernung des Lösungsmittels blieb ein Öl zurück, das in Dichlormethan (IOO ml) gelöst wurde. Die Lösung wurde mit Wasser gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet vor dem Eindampfen zu einem Rückstand (1,01 g, 85 $> Ausbeute) aus dem vollständig blockierten Disaccharid. Die Reinigung erfolgte

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durch Umkristallisation aus Äthylacetat-Hexan, F = 145 - 146 , [α]25 ₌ _33,β° (c = 1,2, Chloroform).

3 Tage lange Hydrierung dieser Verbindung in Äthanol über 5 fo Palladium auf Aktivkohle bei 3,52 kg/cm und 70° ergab nach Entfernung des Lösungsmittels und Katalysators Verbindung (6)"in Form eines amorphen Peststoffs, [a]^ = -95,5° (c = 1,0, Wasser), in 97 $iger Ausbeute.

Beispiel 7

Herstellung des Antigendeterminans S-Äthoxycarbonyloctyl·-^- acetamido-2"-deoxy-3-Q-(ß-D-igalactopyranosyl)-ß--D--glucopy;rano _i sid

Verbindung (2) (6,3 g» 15,5 mMol) wurde zu einer gerührten Lösung von wasserfreiem Zinkchlorid (7>0 g) in frisch destilliertem Benzaldehyd (100 ml), die mit wasserfreiem Calciumsulfat (14 g) versetzt war, zugegeben. Nach 20 Stunden bei Raumtemperatur wurde der Feststoff durch Filtration entfernt. Die Zugabe von Hexan (500 ml) zum FiItrat bewirkte die Ausfällung eines gummiartigen Niederschlags, der mehrere Male mit Hexan trituriert wurde. Der Rückstand wurde sodann mit Pyridin (7 ml) trituriert vor der Zugabe von Dichlormethan (300 ml). Die erhaltene Lösung wurde zweimal mit Wasser (25 ml), zweimal mit gesättigter wäßriger Natriumbicarbonatlösung (25 ml) und zweimal erneut mit Wasser (25 ml) gewaschen. Nach dem Trocknen über Natriumsulfat wurde das Lösungsmittel entfernt, wobei ein Rückstand zurückblieb, der aus Äthanol kristallisierte (4,68 g, 61 fo Ausbeute), F = 210 - 220°. Der Schmelzpunkt blieb unverändert nach Umkristallisation aus wäßrigem Methanol, [a]J5⁴ = -55,5° (c = 1,3, Chloroform)·

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2630536

Eine Lösung aus der erhaltenen Verbindung (12,1 g, 24,5 mMol) und Quecksilber(II)cyanid (7,35 g, 30 mMol) in 1600 ml eines 1 : 1-Gemisches aus Benzol und Nitromethan wurde bei Atmosphärendruck destilliert zur Entfernung von 100 ml Lösungsmittel· Nach Abkühlung wurden Calciumsulfat (40 g) und Tetra-O-acetyla-D-galactopyranosylbromid (12,3 g, 29,6 mMol) zugegeben und die Temperatur wurde sodann 20 Stunden lang bei 50° gehalten. Tetra-O-acetyl-galactosylbromid (10 g, 24,4 mMol), Quecksilber(ll)cyanid (6,15 g) und Calciumsulfat (10 g) wurden sodann zugesetzt und das Gemisch wurde weitere 20 Stunden lang bei 50° gerührt· Eine Untersuchung mit Dünnschichtchromatographie zeigte die Abwesenheit des Monosaccharidalkohols an. Die Feststoffe wurden durch Filtration entfernt undmit Di chlorine than (800 ml) gewaschen· Die kombinierten Filtrate wurden zweimal mit 30 $iger wäßriger Kaliumjodidlösung (50 ml), zweimal mit gesättigter wäßriger Natriumbicarbonatlösung (50 ml) und danach zweimal mit Wasser (50 ml) gewaschen. Fach dem. Trocknen über Natriumsulfat wurde das Lösungsmittel entfernt, wobei ein Sirup zurückblieb. Der erhaltene Sirup wurde in einer geringen Menge heißem Äthanol gelöst, worauf Diäthyläther zugesetzt wurde bis fast zum Auftreten einer Trübung. Die Zugabe von Petroläther bewirkte die Ausfällung eines Feststoffs, der aus Äthylacetat-Hexan kristallisiert wurde (17,1 g, 85 95,F = 108 - 10g°). Umkristallisation aus Äthylacetat-Diäthyläther ergab ein reines Produkt, F = 110 - 111°, [a]^⁷ = -8,2° (c = 1,4, Chloroform). Die Entfernung der Hydroxyl-Schutzgruppen in der in den vorausgehenden Beispielen beschriebenen Weise ergab Verbindung (7) in 82 $iger Ausbeute in Form eines weißen Feststoffs, F = 207 - 208°. Umkristallisation aus Methanol erhöhte den Schmelzpunkt auf 211 bis 212°, O]^⁷ = -22° (c = 1, Wasser).

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Geeignet blockierte Derivate der Verbindungen der Formel III, wie sie durch die angegebenen Verbindungen (5)» (6) und (7) repräsentiert werden, dienen zur chemischen Synthese von Verbindungen der Formel IV

Trisaccharide ——> O-R-COOR» (IV)

Bei diesen Verbindungen mit endständigen Trisaccharideinheiten handelt es sich um wichtige menschliche Blutgruppen-Anti- gene. Die folgenden Beispiele 8, 9 und 10 erläutern die Herstellung der Antigendeterminantien für die Lewis-a-, 0(H)- bzw. B-Blutgruppen des Menschen.

Beispiel 8

Herstellung des Antigendeterminans 8-Methoxycarbonyloctyl-2-acetamido-2-deox.v-4-o--(<x-Ii-fucopyranosyl)-3-0-(ß-D-galactopyranosyl)-ß-D-^lucopyranosid (8)

8-Äthoxycarbonyloctyl-2-acetamido-3-0-(tetra-0-acetyl-ß-D-galactopyranosyl)-4,6-0-benzyliden-2-deoxy-ß-D-glucopyranosid (7,65 g) (vgl. Beispiel 7) wurde de-O-benzylidiniert unter Verwendung von wäßriger Essigsäure unter Bedingungen ähnlich denjenigen wie sie in Beispiel 6 angewandt wurden, wobei 5,6 g (81 $>) eines Produkts von F = 153,5°, La]-J⁶ = +9,6° (c = 1,4, Chloroform) erhalten wurden. Ein Anteil dieses Produktes (1,47 g, 2 mMol) wurde in 6-Stellung selektiv acetyliert unter Verwendung von N-Acetylimidazol (2,2 mMol) wobei 1,10 g (71 f°) 8-Äthoxycarbonyloctyl-2-acetamido-6-0-acetyl-3-0-(tetra-0-acetyl-ß-D-galactopyranosyl)-2-deoxy-ß-D-glucopyranosid in Form eines in der DünnschichtChromatographie homogenen Sirups von [«!j) = +6,2° (c = 1, Chloroform) erhalten wurden.

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2 6 3 υ ο :ί ο

Ein Gemisch aus der erhaltenen Verbindung (3,0 g, 3,86 mMol), Tetraäthylammoniumbromid (84Ο mg, 4 mffiol), Diisopropyläthylamin (600 mg, 4,64 mMol), Dichlormethan (25 ml) und Dimethylformamid (5 ml) wurde zu Tri-0-benzyl-fucosylbromid (2,56 g, 5,15 mMol), gelöst in Dichlormethan (5 ml) zugegeben, worauf Dimethylformamid (1 ml) zugesetzt und die erhaltene Lösung weitere 3 Tage lang gerührt wurde. Dann wurde Dichlormethan (300 ml) zugegeben und das Produkt wurde in üblicher Weise isoliert. Die Reinigung erfolgte durch Chromatographie an einer Silicagel-Säule (75 x 3,5 cm). Die Entwicklung erfolgte zuerst mit einem 1 : 1-Gemisch aus Äthylacetat-Hexan (3OO ml) und danach mit dem gleichen Lösungsmittel, dem 5 f° Äthanol zugesetzt worden waren. Die erste Bande, die kurz nach Wechsel des Lösungsmittels auftrat, entsprach dem blockierten Trisaccharid, das als ein in der Dünnschichtchromatographie homogener Sirup anfiel (4,36 g, 94 #), [a]^² = -54° (c = 1,1, Chloroform). Die Entfernung der Hydroxylschutzgruppen nach Methoden ähnlich denjenigen, wie sie oben beschrieben sind, ergab das gewünschte Antigendeterminans (8) in Form eines amorphen Peststoffs, [α]]}⁵ = -73,5° (c = 1, Wasser).

Beispiel 9

Herstellung des Antigendeterminans S-Methoxycarbonyloctyl-^- acetamido-2-deoxy-3-0-( 2-0-[ oc-L-fucopyranosyll-ß-D-galactopyranosyl)-ß-D-glucopyranosid (9)

Eine Lösung von 8-Methoxycarbonyloctyl-2-acetamido-4,6-0-benzyliden-2-deoxy-ß-D-glucopyranosid (48Ο mg, 1 mMol), (vgl. Beispiel 6) und Quecksilber(II)cyanid (304 mg, 1,2 mMol) in 50 ml eines 1 : 1-Gemisches von Benzol und Nitromethan wurde bei Atmosphärendruck destilliert zur Entfernung von 10 ml Lösungsmittel. Nach Abkühlung wurden pulverisiertes Calciumsulfat (1,5 g) und das Bromid (hergestellt aus 9OO mg 3,4,6-Tri-

609883/1379 ORIGINAL INSPECTED

263059B

O-benzyl-1^-di-O-p-nitrobenzoyl-ß-D-galactopyranose) in 5 ml eines 1 : 1-Gemisches aus Benzol und Nitromethan zugesetzt, worauf die Temperatur 36 Stunden lang bei 40 gehalten wurde. Zu diesem Zeitpunkt zeigte eine Untersuchung mit Dünnschichtchromatographie, daß kein Bromid mehr vorlag. Das Reaktionsgemisch wurde mit Dichlormethan (25 ml) verdünnt und danaii filtriert, und der Filterkuchen wurde mit Dichlormethan (3 χ 10 ml) gewaschen. Das vereinigte Filtrat und die Waschflüssigkeiten wurden mit Dichlormethan auf 200 ml aufgefüllt und danach mit 30 $iger wäßriger Kaiiumjodidlösung (1O ml), gesättigter Natriumbicarbonatlösung (10 ml) und Wasser (2 χ 10 ml) gewaschen. Nach dem Trocknen über Natriumsulfat wurde das Lösungsmittel entfernt unter Zurücklassung eines Sirups, der in einer kleinen Menge Dichlormethan .gelöst und auf eine mit Silicagel D-O (65 g) gepackte Säule aufgebracht wurde. Die Säule wurde zunächst mit einem Gemisch aus Benzol-Äthylacetat (4 : 1) entwickelt und danach wurde das Produkt mit einem 2 : 1-Gemisch aus Benzol-lthylacetat eluiert. Die Entfernung des Lösungsmittels ergab 550 mg (52 fo) des blockierten Disaccharide, das aus Äthanol kristallisiert wurde, F = 152 - 153°, [α]24 - +42,0° (c = 1,1, Chloroform).

Das erhaltene Disaccharid (4OO mg) wurde in 40 ml wasserfreiem Methanol, das 12 mg Natrium enthielt, suspendiert und das Reaktionsgemisch wurde 24 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Die erhaltene Lösung wurde deionisiert mit saurem Harz und der nach Verdampfen des Lösungsmittels erhaltene Rückstand wurde in Benzol gelöst und auf eine Säule mit 4 g Silicagel D-O aufgebracht. Nach Waschen der Säule mit Benzol zur Entfernung des Methyl-p-nitrobenzoats wurde das Produkt mit Benzol-Äthylacetat (2 : 1) eluiert. Nach Verdampfen des Elutionsmittels wurden 260 mg (78 fo) der de-O-p-nitrobenzoylierten Verbindung in Form eines in der Dünnschichtchromatographie homogenen Sirups erhalten.

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ORfGlNAL INSPECTED

263059H

Zu einem G-emisch aus der erhaltenen Verbindung (1,03 g, 1,13 mMol), Tetraäthylammoniumbromid (317 mg, 1,5 mMol), Diisopropyläthylamin (194 mg, 1,5 mMol), Molekularsiebmaterialien von 4 & (1 g), Dichlormethan (8 ml) und Dimethylformamid (0,6 ml) wurde 2,3,4-Tri-O-benzyl-a-L-fucopyranosylbromid, das frisch bereitet war aus 2,3,4-Tri-0-benzyl-1-0-p-nitrobenzoyl-ß-L-fucopyranose, (1,459 g, 2,5 mMol) in Di chlorine than (2 ml) zugegeben. Nach 4 Tagen zeigte eine Untersuchung mit DünnschichtChromatographie, daß kein Ausgangsmaterial mehr vorlag, und es wurden 200 /ul Methanol zugegeben und nach 2 Stunden wurde das Re akti ons gemisch mit 25 ml Dichlormethan verdünnt und filtriert. Das FiItrat wurde auf 100 ml mit Dichlormethan aufgefüllt und in üblicher ?/eise mit Wasser und gesättigter wäßriger ÜTatriumdicarbonatlösung gewaschen vor Entfernung des Lösungsmittels. Die Chromatographie des Rohprodukts auf Silicagel D-O unter Verwendung von Äthylacetat-Hexan (1 : 1) als Elutionsmittel ergab das vollständig blockierte Trisaccharid -(1,116 g, 74 i° der Theorie) in Form eines in der Dünnschichtchromatographie (Benzol-Äthylacetat 2:1) homogenen Sirups.

Die erhaltene Verbindung (890 mg) wurde in 9 ml Dichlormethan, das 1,0 ml 90 $ige Trifluoressigsäure enthielt, gelöst und die erhaltene Lösung wurde bei Raumtemperatur 10 Minuten stehen gelassen. Das Reaktionsgemisch wurde sodann mit Toluol (10 ml) und Yfesser (0,5 ml) verdünnt und die Lösungsmittel wurden verdampft. Chromatographie des Rohprodukts an Silicagel ergab nach Kristallisation aus Äthylacetat-Pentan 530 mg (64 $ der theoretischen Ausbeute) des de-O-benzylidinierten Trisaccharids, F = 125 - 126°, [a]|⁴ = -37,4° (c = 1,1, Chloroform).

Zu einer Lösung dieser Verbindung (452 mg) in Äthanol (7 ml) wurden 300 mg 5 ^iges Palladium auf Aktivkohle zugegeben und das Gemisch wurde unter einer Wasserstoffatmosphäre von 7,03 kg/cm 36 Stunden lang geschüttelt. Der Katalysator wurde sodann durch

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ORIGINAL INSPECTED

- 263059b

Filtration entfernt -und mit drei 10 ml-Anteilen von heißem Äthanol gewaschen. Das kombinierte Filtrat und die Waschflüssigkeiten wurden verdampft und das erhaltene Produkt wurde in einer kleinen Menge Wasser gelöst und gefriergetrocknet. Das erhaltene Hohprodukt (9) (255 mg, quantitative Ausbeute) war in der DünnschichtChromatographie (Isopropanol-Ammoniumhydroxid-Wasser 7 J 1 : 2) homogen und kristallisierte aus einem Gemisch aus Methanol und Äther, F = 195°» L⁰O]) = -60,3° (c = 1,1, Yfasser).

Beispiel 10

Herstellung des Antigendeterminans 8-Methoxycarbonyloctyl-2-0-(q—L—fucopyranosyl)-»(3-0~cc-D"-galaotopyrano3yl)—ß-galactopyrano— sid (10)

8xMethoxycarbonyloctyl-3-0-benzQi-4,6-0-benzyliden-2-0-(tri-0-benzyl-a-L-fucopyranosyl)-ß-D-galactopyranosid (5 g» 5,2 mMol), (vgl. Beispiel 5) in 250 ml einer frisch bereiteten methanolischen Natriummethoxidlösung (1 fo) wurde bei Raumtemperatur 2 Stunden lang gerührt und nach dieser Reaktionszeit war die Umsetzung vollständig, wie durch DünnschichtChromatographie nachgewiesen wurde. Eine ausreichende Menge saures Ionenaustauscherharz, das mit Methanol vorgewaschen war, wurde zugegeben, um die lösung zu neutralisieren (pH=* 7)· Das Harz wurde durch Filtration entfernt und das Filtrat im Vakuum eingedampft, wobei ein schwach gelber Sirup (~i 4,3 g) erhalten wurde. Kristallisation aus Äthanol-Hexan ergab 3» 55 g (80 fo) kristalline de-O-benzoylierte Verbindung, F = 104 - 105°, [a]^⁵ = -54° (c = 1, Chloroform).

Die erhaltene Verbindung (0,6 g, 0,7 mMol) wurde gelöst in Dichlormethan (0,66 ml) und Ν,Ν-Dimethylformamid (0,06 ml), enthaltend Tetraäthylammoniumbromid (0,16 g, 1 mMol), Hünigs-Base

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263059:

(0,27 g) und Molekularsieb 4 & (1 g). Frisch bereitetes Tetra-O-benzyl-oc-D-galactopyranosyrbromid (1,04 g, 1,7 mMol) in einer kleinen Menge Di chlorine than wurde sodann zugegeben und das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur 48 Stunden lang gerührt. Ein zusätzlicher Anteil (0,5 g, 0,85 mMol) des Bromozuckers wurde sodann zugegeben und das Reaktionsgemisch wurde weitere 24 Stunden lang gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde sodann mit Dichlormethan verdünnt und die Feststoffe wurden durch Filtration entfernt. Das Filtrat wurde mit Wasser gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Nach Filtration der Lösung wurde eingedampft unter Erzielung eines Sirups. Dieser Sirup wurde^lurch Schnellchromatographie auf einer Aluminiumoxidsäule gereinigt vor Aufbringung auf eine Silicagelsäule.

Die Elution wurde erzielt mit Äthylacetat-Hexan (2 : 8) und das gewünschte blockierte Trisaccharid wurde in reiner Form erhalten durch Vereinigung der entsprechenden Fraktion. Die Ausbeute betrug 0,686 g (71 % F = 82 - 83° (umkristallisiert aus Heptan-Äther)·

Zu einer Lösung der erhaltenen Verbindung (600 mg, 0,43 mMol) in Äthanol (1O ml), das Äthylacetat (1 ml) enthielt, wurden 35O mg 5 ^iges Palladium auf Aktivkohle zugegeben und das Gemisch wurde unter Wasserstoffat/mosphäre bei 7,03 atü 5 Tage lang geschüttelt. Der Katalysator wurde abfiltriert und mit heißem Äthanol (3 x 5 ml) gewaschen. Die kombinierten Filtrate wurden i. V. verdampft und es wurde die Verbindung (1O) erhalten (177 mg, 62 #). Ein Teil des Produktes wurde aus Methanol-Äther umkristallisiert, F = 147 - 150°.

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26305

Die Weiterverarbeitung geeignet blockierter Verbindungen der Formel IV ergibt Tetrasaecharidderivate der allgemeinen Formel V

Tetrasaccharid ~—> O-R-COOR¹ (V)

Auf diese Weise wird somit das endständige Tetrasaccharid-Antigendeterminans der menschlichen Blutgruppe Lewis-b erhalten, deren Herstellung im folgenden Beispiel 11 erläutert ist.

Beispiel 11

Herstellung; des Anti^endeterniinans 8-Methoxycarbonyloctyl— 2-acetamido-2-deoxy-4--Q--( _i «-I'-fucopyranosyl)-3-0-(2-0-;[a-L-fucopyranosyll-ß-D-galactopyranosyl^-ß-D-glucopyranosid (11)

8-Methoxycarbonyloctyl-2-acetamido-3-0-(3»4 ₁ 6-tri-O-benzyl-2-O-[2,3>4-tri-0-benzyl-a-L-fucopyranosyl]-ß-D-galactopyranosyl)-2-deoxy-ß-D-glucopyranosid (620 mg, 0,5 mMol) (vgl. Beispiel 9) wurde in 6-Stellung des IT-Acetylglucosaminrestes selektiv acetyliert durch Behandlung mit N-Acetylimidazol (0,6 mMol). Eine wie in Beispiel 8 durchgeführte ct-Fucosylierung ergab das gewünschte blockierte Tetrasaccharid in 70 $iger Ausbeute in Form eines in der DünnschichtChromatographie homogenen Sirups. Die Entfernung der Hydroxylschutzgruppen nach den oben beschriebenen Methoden (vgl. Beispiel 8) ergab die Tetrasaccharidverbindung (11) in 80 ^iger Ausbeute.

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263058ο 30

-QfS-

Die erfindungsgemäß erzielbaren Produkte sind herstellbar durch Anwendung von Synthesemethoden der Kohlehydrat chemie auf die Schaffung von Antigendeterminantien in Form von Verbindungen der Formeln II, III, IV und V, die nicht nur als Inhibitoren von Antikörper-Antigen-Wechselwirkungen dienen, sondern insbesondere verwendbar sind als Reagentien zur Herstellung von hochwirksamen künstlichen Antigenen und Immunoabsorbantien, deren Einsatz in einem weiten Bereich von Anwendungsgebieten zu erwarten ist.

Da der Nachweis erbracht werden konnte, daß die erfindungsgemäße Synthese zur großtechnischen Herstellung wichtiger Natur-Kohlehydratdeterminantien führen kann, bedeutet dies, daß die Menschheit nicht langer auf seltene und teure Quellen, die nur minimale Mengen dieser Determinantien liefern, angewiesen ist· Der Nachweis, daß diese Determinantien in der angegebenen V/eise herstellbar und ohne weiteres verwendbar sind zur Erzeugung wirksamer, stark immunogener Antigene, läßt deren intensive Anwendung zur Schaffung von Antikörpern, die für das betreffende Determinans monospezifisch sind, erwarten. So sind z. B. Anwendungen zur Schaffung von Typenseren für sowohl Blutseren als auch Zellen gegeben und erfolgreich gezeigt. Eine Ausdehnung auf die Typisierung von Geweben liegt auf der Hand und dürfte von besonderer Bedeutung sein für die geeignete Anpassung von Geweben für Gewebetransplantationsoperationen. Antikörper, die gegen die sehr zahlreichen, erfindungsgemäß herstellbaren Kohlehydratdeterminantien gebildet wurden, können als Diagnostizierreagentien und zur Herstellung von Affinitatssäulen dienen, die inzwischen weit verbreitete Anwendung finden und sogenannte Lectine verwenden, bei denen es sich um natürliche Proteine handelt, die eine spezifische Affinität für eine Kohlehydratstruktur besitzen. Von größter Bedeutung ist die Schaffung von Antiseren, die spezifisch gegen kleinere menschliche Blutgruppen, z. B.

a b
Le und Le , sind. Wirksame Typisierungsseren für derartige

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kleinere Gruppen sind zur Zeit selten und teuer, doch ist deren Bestimmung von steigender Bedeutung aufgrund der zunehmenden Wahrscheinlichkeit von Mehrfach-Bluttransfusionen in der modernen Medizin und dem damit verbundenen Risiko eines Empfängers, der, ohne es zu wissen, vorher sensibilisiert wurde.

Wie gezeigt werden konnte, sind die erfindungsgemäß gewonnenen Determinantien zur Herstellung stark wirksamer monospezifischer Immunoabsorbantien verwendbar. Diese Immunoabsorbantien dürften eine große Bedeutung und weit verbreitete Anwendung erlangen zur Entfernung unerwünschter Antikörper aus Blutseren und zur Isolierung und Reinigung spezifischer Antikörper durch Absorptions-Desorptionsmethoden, In letztgenannter Hinsicht ist die Verwendung unvollständiger Determinantien zur Erstellung von Affinitätschromatogrammen von größter Bedeutung, da die Verwendung kompletter Determinantien dazu führen kann, daß die Bildung des Antikörpers so fest ist, daß die Desorption nicht bewirkt werden kann ohne weitgehende Denaturierung des Antikörpers und dadurch Verlust seiner Spezifität.

Die in bezug auf die aufgezeigten Gegebenheiten erfindungsgemäß erzielbaren Vorteile werden in den unten angegebenen Beispielen 12 bis 19 gezeigt. Diese Beispiele wurden aus einer großen Zahl ähnlicher Untersuchungen ausgewählt und zeigen die Verwendbarkeit von Determinantien und Trägermolekülen zur Herstellung künstlicher Antigene, bzw. von Determinantien und festen Trägerstoffen zur Herstellung von Immunoabsorbantien.

Die Bindung der Determinantien, beginnend mit den in den Verbindungen der Formeln II, III, IV und V vorliegenden Esterverbindungen, kann nach verschiedenen bekannten Verfahren, wie sie auf diesem Fachgebiet üblich sind, erfolgen. Der unmittelbarste Weg besteht in direkter Aminolyse des Esters am Brückenbildungsarm unter Verwendung von trockenem Methanol als Lösungsmittel gemäß dem Reaktionsschema

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263059!

-GOOGH, + H₂N- > -COHH- + CH OH

wobei die Amidgruppierung als das Bindeglied zwischen Hapten und Trägermolekül oder festem Trägerstoff dient.

Eine andere anwendbare Methode besteht darin, den Ester zunächst in die freie Garbonsäure zu überführen und anschließend die Säure mit Aminogruppen zu kondensieren unter Verwendung geeigneter Eondensationsmittel, z. B. Bicyclohexyl- oder anderen Garbodiimiden oder i-Äthoxycarbonyl-2-äthoxy-i,2-dihydrochinolin (EEDQ) gemäß dem Reaktionsschema

^{000H + HN} ^OOm ^{+ H}2°

Eine weitere Methode (die bevorzugt wird) besteht in der Umwandlung des Esters zum Hydrazid und nachfolgende Oxidation des Hydrazide mit salpetriger Säure unter Bildung des Acylazids, das als Acylierungsmittel dient gemäß folgendem Reaktionsschema

-GOOGH₃ ^H2^]MH2_t -GONHITH₂ -G-N₃ + -NH₂ —» -GONH- + HN

Nach diesen verschiedenen Verfahrensweisen werden künstliche Antigene hergestellt durch Kupplung der synthetisierten Determinantien an lösliche Trägermakromoleküle, z. B. an die Proteine Rinderserumalbumin (BSA), Menschenserumalbumin (HSA) und Polylysin, an die roten Blutkörperchen und an Polysaccharide, z. B, aminiertes Dextran. Ebenso werden Immunoabsorbantien hergestellt unter Verwendung fester Trägerstoffe, z. B, aminierte Sepharose, aminiertes Polystyrol, Polyvinylamin, aminierter Polyvinylalkohol, aminiertes Polyacrylamid und aminiertes Glas. Diese Feststoffe werden in der Regel als

609.883/ 1 373 ORtQINAL INSPECTED

2630

Körperchen oder Latexpartikel verwendet, sind jedoch auch an Oberflächen von Röhren oder Schläuchen und Platten verwendbar, je nach Verwendungszweck für die antigene Oberfläche, d. h. z. B. als ein unlösliches Absorbans für die Extraktion von Antikörpern, für die Herstellung einer Affinitätschromatographiesäule, für die Bestimmung von Phänomenen vom Agglutinationstyp, z. B. für Tüpfeltests auf Oberflächen und dergleichen.

Die in den Beispielen 12 bis 16 beschriebenen künstlichen Antigene wurden durch Verabreichung an Versuchstiere, hauptsächlich Kaninchen und Ziegen, getestet. Für Kaninchen wurde die von Martineau beschriebene Immunisierungsvorschrift (vgl· R. S. Martineau, P. Z. Allen, I. J. Goldstein, R. Ή. Iyer, Immunochemistry, j3, 705 (1971))» und für Ziegen diejenige von Marcus und Groilman (vgl· D. M. Marcus und A, P· Groilman, J, Immunol., J9J7.» 867 (1966)) angewandt. Der Verlauf der Immunisierung wurde durch quantitative Präzipitintests an Blutproben, die zu verschiedenen Zeiten entnommen wurden, verfolgt, Bei den angewandten Methoden handelte es sich durchweg um Standardmethoden auf dem Gebiete der Immunologie (vgl. z. B, E. A. Kabat und M, M. Mayer, "Experimental Immunochemistry", 2. Auflage, Oliver und Boyd Verlag, London, 1967).

Beispiel 12

Herstellung des Antigens (B-D-GaI-O(CH₂JgOOlTH)₂₄-BSA (12)

1 g der Verbindung (1) wurde in einem Gemisch aus Äthanol (5 ml) und 85 folgern Hydrazinhydrat (2 ml) gelöst· Nach 24 Stunden wurde das Lösungsmittel verdampft und die restlichen Spuren von Hydrazin durch gleichzeitige Abdampfung mit Toluol entfernt, wobei 8-Hydrazinocarbonyloctyl-ß-D-galactopyranosid in Form eines weißen Feststoffs erhalten wurde, der aus Äthanol um-

6 0 9 8 8 3/1379 ORIOiNAt INSPECTED _:

263059b 34

18 Wasser), Ausbeute 92 f».

kristallisiert wurde, F = 194°, [cfL = -2,16° (c = 1,1,

Das erhaltene Hydrazid (88 mg, 0,25 mMol) wurde in Dimethylformamid (3 ml) gelöst und die erhaltene lösung wurde auf -25° abgekühlt. Eine 3»3 N-Lösung von Chlorwasserstoff in Dioxan (0,33 ml) wurde zugegeben und anschließend tert-Butylnitrit (36 mg, 0,35 mMol) in Dimethylformamid (0,1 ml) zugesetzt. Fach 30 Minuten wurde Sulfaminsäure (20 mg) zugegeben und das Rühren wurde 15 Minuten lang fortgesetzt. Die erhaltene Acylazidlösung wurde sodann direkt zu einer auf 0 gekühlten Lösung von Rinderserumalbumin (BSA) (300 mg) gelöst in einer wäßrigen Lösung, die 0,08 M an NapB.O, und 0,35 M an KHGO, war, zugegeben. Der pH-Wert der Lösung blieb zwischen 9,05 und 9,30 während der Zugabe. Nach 16 Stunden wurde die Lösung gegen Wasser dialysiert und gefriergetrocknet, wobei das Antigen (12) (310 mg) in Form eines weißen Pulvers erhalten mrde. Der Einbau von Galactose wurde nach der Phenolschwefelsäuremethode bestimmt und die Berechnung ergab 24 Mol Galactose pro Mol BSA.

Eine Gruppe von 6 San Juan-Kaninchen wurde immunisiert mit Antigen (12), das dem als "Freund¹s Complete Adjuvant" (FOA) bekannten Hilfsmittel einverleibt war. Die Menge an verabreichtem Konjugat und die Immunisierungsprozedur erfolgte nach der oben angegebenen Vorschrift von Martineau und Mitaarbeitern. Die Antikörpermengen nach Beendigung der Prozedur lagen im Bereich von 178 bis 396 /ag pro 50 /ul Serum mit einem Durchschnittswert von 277 /ug pro 50 /ul Serum.

Daß die gegen dieses Konjugat erzeugten Antikörper hauptsächlich gegen den ß-Galactopyranosidanteil des Antigens gerichtet sind, wurde gezeigt durch Messung der maximalen Menge an Antikörpern, die durch die drei Antigene (12), (a-D-Gal-O(CH₂)gCOim)₁₇-BSA und BSA ausgefällt wurde. Typische Ergebnisse für 50 /ul Rohserum waren wie folgt:

609883/1379 ORiGiNAL INSPECTED

2 6 3 O 5 9 >

Antigen (12) 396 /ug

(a-D-Gal-O(GH₂)₈GOira)₁₇-BSA 87 /Ug

BSA 87 /ug

Aus diesen Ergebnissen kann geschlossen werden, daß der größte Teil der Antikörperpopulation spezifisch auf den ß-D-Gal—Teil des Haptens anspricht. Diese Schlußfolgerung wird erhärtet durch Hemmversuche, die zeigen, daß, während Methyl-ß-D-galactopyranosid eine 50 folge Hemmung der Niederschlagsbildung (bei Verwendung von (ß-D-Gal-0(CH₂)gC0NH)₂-.-HSA als ausfällendes Antigen) bei einer Konzentration von 0,83 /uM/ml bewirkt, Verbindungen mit ähnlicher Si?uktur in sehr viel größeren Konzentrationen angewandt werden müssen, um wirksam zu sein, z. B. Galactose in Mengen von 6_t6 /uM/ml, Methyl-a-D-galactopyranosid in Mengen von 33 /um/ml und Lactose in Mengen von 70 /uM/ml, während Methyl-ß-D-glucopyranosid praktisch keine Hemmung bewirkt.

Beispiel 13

Herstellung des Antigens (B-D-GIeNAc-O(CH₂J₈COIm)₂₅-BSA (13)

Dieses Antigen wurde aus dem Hydrazidderivat der Verbindung (2) hergestellt unter Verwendung der in Beispiel 12 beschriebenen Acylazid-Kupplungsmethode. Seren von Kaninchen, die mit Verbindung (13) immunisiert worden waren, zeigten eine hohe Spezifität für Antigene mit einem Gehalt an ß-D-GlcNAc-Hapten. Ein Beweis für die Haptenspezifität der Ansprechbarkeit ergibt sich aus der Hapten-spezifischen Hemmung der Niederschlagsbildung zwischen Verbindung (13) und gegen (13) gebildeten Antiseren. Typischerweise ergab Methyl-ß-D-GlcNAc eine Hemmung der Niederschlagsbildung im Bereich von 60 - 80 fo_t wohingegen Methyl-ß-

609883/ 1379 ORIGINAL INSPECTED

263059b

D-GaINAc und Methyl-ß-D-Glc praktisch, keine Hemmung bewirkten bei der Konzentration, bei welcher Methyl-ß-D-GleNAc wirksam war.

Beispiel 14 Herstellung der Lewis-a-Antigene

1 g Verbindung (8) wurde in 85 tigern Hydrazinhydrat (4 ml) gelöst und 4 Stunden lang bei Raumtemperatur stehen gelassen. Das Reaktionsgemisch wurde verdünnt mit 95 tigern Äthanol (20 ml) worauf die Lösungsmittel verdampft wurden. Der erhaltene Rückstand wurde in 10 ml Wasser gelöst und gegen 5 mal gewechseltes V/asser in einer Ultrafiltrationszelle dialysiert. Entfernung des Wassers durch Lyophilisation ergab 8-Hydrazinocarbonyloctyl-2-acetamido-2-deoxy-4-0-(a-L-fucopyranosyl)-3-0-(ß-D-galactopyranosyl)-ß-D-glucopyranosid (14) in quantitativer Ausbeute in Form eines amorphen Peststoffs, [ocJ-q = -72,8°, (c = 1,0, Wasser).

Die erhaltene Verbindung und das 5-Hydrazonocarbonylpentylanaloge wurden zur Herstellung der folgenden Lewis-a-Antigene verwendet:

[Le^a-0(CH₂)gC0HH]_n-BSA, worin η jeden der Werte 11, 22, 30 oder 45 haben kann; [Le^a-O(CH₂)₈CONH]₂₈-HSAj [Le^a-O(CH₂)₈CONH] ^- polylysin; [Le^a-0(CH₂)gCOHH(CH₂J₂M] ^-dextran; [Le^a-O(CH₂)₅-CONH]_n-BSA, worin η = 10 oder 3O; [Le -0(CH₂) CONH]₂₅-HSA, wobei die Herstellung nach der Acylazidmethode (vgl. Beispiel 12) erfolgte·

Die verwendete Abkürzung Le steht für das Lewis-a-trisacchariddeterminans der folgenden Formel:

609883/ 1379

ORIGINAL INSPECTED

26-3 05 9'

ß-D-Gal ', ß-D-GlcFAc *

1,4

α-L-Fuc

Es zeigte sich, daß Ziegenantiserum, das gegen die natürlich vorkommenden Lewis-s-Blutgruppensubstanzen erzeugt worden war, mit di
dete.

mit den oben angegebenen Le- -Antigenen einen Niederschlag bil-

Unter Verwendung der angegebenen Le -Antigene war es möglich, den Einfluß bestimmter Faktoren zu untersuchen, z. B, der Länge des Brückbildungsarms und des Grads an Hapteneinarbeitung auf die Immunansprechbarkeit gegen erzeugtes Antiserum, das spezifisch für die Lewis-a-Blutgruppe ist.

Die Antikörpermengen von Seren, die in Kaninchen erzeugt wurden gegen die Le^a-BSA-Antigene mit Cg- und Cq-Aglycon-"Brückenbildungsarmen" neigen zu sehr geringen Schwankungen aufgrund des 3-Methylen-Unterschieds zwischen den beiden Antigenen, insbesondere bei Einarbeitungen von 30 Haptenen/Mol BSA. Bei 11 Haptenen/Mol BSA ergab das Le -BSA-Antigen mit einem Cq-Brückenbil dungs arm Werte, die durchschnittlich etwa 50 fo höher lagen als beim Cg-Analogen. Der Grad der Hapten-Einverleibung beeinflußte auch die Antikörperproduktion. Für Kaninchen zeigte sich, daß eine Einarbeitung von etwa 22 Molen Hapten/ Mol BSA eine optimale Ansprechbarkeit in bezug auf Antikörpermenge und Spezifität ergab. Bei niedrigeren Graden von Hapten-Einverleibung (-11 Mole/Mol BSA) hatten steigende Mengen von im Serum vorliegendem Antikörper eine SpezifLtät für den Träger, während bei höheren Graden an Hapten-Einarbeitung ( " 30 Mole/Mol BSA) die erzeugte Antikörpermenge in der Regel niedriger war.

609883/ 137$ ORIGINAL INSPEoTED

Die Spezifität der Antiseren wurde gezeigt durch Immunodiffusionsreaktionen. Kaninchen-Antiseren, die gegen Le-BSA-Antigene gebildet worden waren, zeigten eine starke Ausfällinie mit allen künstlichen Le -Antigenen und den natürlichen Lewis-a-Blutgruppensubstanzen, und eine sehr schwache Ausfällinie wurde mit BSA gefunden. Keine Ausfälllinie war festzustellen mit HSA, Polylysin oder Dextran.

Zur weiteren Aufklärung des Ausmaßes an Kreuzreaktionen zwischen Antikörpern, die gegen die künstlichen Le -Antigene und menschliche Lewis-a-Blutgruppensubstanzen gebildet worden waren, und zur Erzielung größerer Mengen an Antiseren, wurde eine Ziege immunisiert mit [Le^a-0(GHp)oGONH]-._Q-BSA. Das erhaltene Antiserum zeigte die erwartete Kreuzreaktion mit menschlicher Lewis-a-blutgruppensubstanz und nach geeigneter Behandlung agglutinierte es in wirksamer V/eise menschliche rote Blutkörperchen der Blutgruppe Lewis-(a+b-) und es agglutinierte nicht Lewis (a-)-rote Blutkörperchen. Das in gleicher Weise behandelte nicht-immunisierte Ziegenserum agglutinierte nicht Lewis—a-rote Blutkörperchen.

Beispiel 15 Herstellung der H(O)-Antigene

Künstliche Antigene mit dem H(o) Determinans der Formel

ß-D-Gal ß-D-GlcFAc » 0 (GH₂) qGONH-

[i,2
α-Ιί-Fuc

609883/1379 ORIGINAL INSPECTED

263059Θ

wurden aus Verbindung (9) nach den in Beispiel 14 beschriebenen Methoden hergestellt· Fünf Kaninchen wurden einer Immunisierung mit dem Antigen [H(O)]pp-BSA unterworfen. Bei der Immunodiffusion reagierten die Antisera schwach mit BSA, Jedoch stark mit den künstlichen Antigenen und menschlicher H-Blutgruppensubstanz.

Ziegenantiserum wurde gegen die natürliche Blutgruppensubstanz H erzeugt. Es zeigte sich, daß das künstliche Antigen mit dem erhaltenen Antiserum einen Niederschlag bildete beim Immunodiffusionstest. Es ergibt sich somit* daß ein Antiserum, das spezifisch ist für die endständige Trisaccharideinheit vom Typ I H-Determinans, erfolgreich gebildet wurde.

Beispiel 16 Herstellung der B-Antigene

Künstliche Antigene mit dem B-Determinans der Formel

a-D-Gal ß-D-Gal > O(CH₂)₈GOM-

a-L-Fuc

wurden aus Verbindung (10) nach den in Beispiel 14 beschriebenen Methoden hergestellt. Es zeigte sich, daß die künstlichen B-Antigene die Agglutination von B-Zellen durch menschliches Anti-B-Serum stark hemmten. Ferner zeigte sich, daß Ziegenantiserum, das gegen die natürliche Blutgruppen-Substanz B gebildet war, einen Niederschlag bildete mit den künsllichen B-Antigenen.

609883/1 379 OfttGtNAL INSPECTED

- HO 263Π59-;

Beispiel 17 Herstellung von Lewis-a-Immunoabsorbantien

Poröse Glaskörperchen (etwa 0,15 - 0,075 mm lichte Maschenweite, nominale Ausschlußgrenze 1000 ä) wurden "aminiert" unter Verwendung von 3-Aminopropyltriäthoxysilan unter Standardbedingungen (vgl. z. B. H. H. Westal und A. M. Filbert, "Methods of Enzymology", 34 (b). 64 (1974). Der Amingehalt betrug 69 /uM pro Gramm, bestimmt nach der Methode von Esko und Mitarbeitern (vgl, K. Esko, S. Karlson und J. Porath, Acta Chem. Scand., 22, 3342 (1968).

Die Lewis-a-Hapten-Vorläuferverbindung (10 mg, 14,3 /uM) (8-Hydrazinocarbonyloctyl-2-acetamido-2-deoxy-4-0-(a-L-fucopyranosyl)-3-0-(ß-D-galactopyranosyl)-ß-D-glucopyranosid) wurde in das Acylazid überführt (vgl. Beispiel 14) zur Kupplung an 5 g der "aminierten" Glaskügelchen. Die überschüssigen Aminogruppen wurden sodann acetyliert durch 20 Minuten lange Behandlung bei Raumtemperatur mit 5 $ Essigsäureanhydrid in wäßrigem gesättigtem Hatriumbicarbonat. Die Kügelchen wurden sodann mit Wasser gewaschen und an der Luft getrocknet und ergaben das Immunoabsorbans GB-Le^a-1.

Bei Zugabe von GB-Le^a-1 (50 mg) zu 250 /ul anti-Le^a-BSA-Kaninchenserum war die Absorption von Le^a-Antikörper innerhalb von 30 Minuten vollständig, wie durch Immunodiffusion festgestelt wurde. Bei Verwendung von 25 mg des Absorbens dauerte die Antikörperentfernung fast 3 Stunden. Bei Verwendung von 10 mg konnte eine kleine Menge restlichen Antikörpers nach 5 Stunden festgestellt werden.

Das angegebene Antiserum war gebildet worden gegen das künstliche Lewis-a-Antigen [Le^a-0(CH₂JgGONH]₃₀-BSA. Die maximale Ausfällung gegen [Le^a-0(CH₃JgGOEH]₂₈-HSA als Testantigen betrug

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ORIGINAL INSPECTED

277 /ug Antikörper pro 50 /ul Antiserum,

Das Immunoabsorbans GB-Le -1 wurde auch gegen ein Anti-Lewisa-Serum, das in einer Ziege unter Verwendung von natürlicher Lewis-a-Blutgruppensubstanz gebildet wurde, getestet. Das Vorliegen von 60 mg des Absorbens in 250 /ul dieses Antiserums bewirkte.das Verschwinden des Antikörpers im überstehenden Serum in weniger als 45 Minuten.

Keine nachweisbare Antikörperabsorption erfolgte, wenn N-acetylierte "aminierte¹¹ Glaskörperchen als Vergleichsmaterial verwendet wurden.

Beispiel 18 Herstellung von H(0)-lmmunoabsorbantien

Ein für Anti-H-Antikörper spezifisches Immunoabsorbans wurde hergestellt durch Kupplung der Verbindung (9) an Glaskörperchen (vgl. Beispiel 17)· Dieses Immunoabsorbans war fähig, aus Serum Antikörper zu absorbieren, die sowohl gegen künstliche H-Antigene als auch gegen natürliche H-Blutgruppensubstanz gebildet waren.

Beispiel 19 Herstellung von B-Immunoabsorbantien

Ein für Anti-B-Antikörper spezifisches Immunoabsorbans wurde hergestellt durch Kupplung von Verbindung (10) an Glaskörper<chen (vgl. Beispiel 17)« Dieses Immunoabsorbans (GB-B-1) war befähigt, aus Serum Antikörper zu absorbieren, die sowohl gegen künstliche B-Antigene als auch natürliche B-Substanz gebildet worden waren. Dieses Immunoabsorbans entfernte auch An-

609883/1379

ti-B-Antikörper aus typisiertem Serum.

Bei Verwendung einer Verdünnungsreihe frischer B—Zellen, die in Salzlösung suspendiert waren, ergab das Testserum positive Agglutination gegen eine Verdünnung von 1 bis 32. Unter den gleichen Bedingungen zeigten H(O)-Zellen keine Agglutination. Das Immunoabsorbans G-B-B-1 (50 mg) wurde zu 250 /ul Serum zugegeben und nach 45 Minuten wurden 150 All Serum entnommen und gegen in Salzlösung suspendierte B-Zellen getestet. Es erfolgte keine Agglutination der Zellen, was erkennen ließ, daß die Anti—B-Antikörper entfernt worden waren.

Es erfolgte keine erkennbare Antikörper—Absorption, wenn F-acetylierte "aminierte" G-laskörperchen als Vergleichsmaterial verwendet wurden.

Zur Herstellung eines B-Immunoabsorbans mit einem Polyacryl— träger wurde ein Harz, das Carboxylgruppen auf einem Acrylpolymer-G-rundgerüst enthielt, (1O ml) mit einem G-emisch aus Äthylendiamin (21 g), 1-Cyclohexyl-3-(2-morpholino-athyl)-carbodiimid-metho-p-rtoluolsulfonat (15 g) in 100 ml Wasser 24 Stunden lang behandelt (der pH-Wert der Lösung wurde bei 5 gehalten durch Zugabe von konzentrierter Salzsäure)· Das erhaltene Harz wurde abfiltriert, mit Wasser gewaschen und an der Luft getrocknet.

N-Äthoxycarbonyl-2-äthoxy-1,2-dihydrochinolin vermittelte die Kondensation von 8-Hydroxycarbonyloctyl-2-0-(a-L-fucopyranosyl)· 3-0-a-D-galactopyranosyl-ß-D-galactopyranosid (1O /uM/ml Harz) (hergestellt aus Verbindung (1O) durch Hydrolyse des Esters) mit dem "aminierten" Harz, und die nachfolgende H-Acetylierung der nicht-umgesetzten Aminogruppen ergab das gewünschte B-Immunoabs orbans. Dieses Immunoabsorbans entfernte ebenfalls selektiv Anti-B-Antikörper aus B-Antiseren.

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- M3 263059:,

Ein B-Immunoabsorbans mit einer Agarosematrix wurde ebenfalls hergestellt durch. Kondensation der Verbindung (.10) mit "aminierter" Agarose·

609883/ 1 379 ORIGINAL INSPECTED

Claims

26305h

Patentansprüche

Π») An Trägerstoffe knüpfbares ß-Glykosidderivat der allgemeinen Formel

(Zucker )_n -£-*► 0-R-GOR"
worin bedeuten:

R einen aliphatischen Kohlenwasserst off rest mit 3 "bis 17 Kohlenstoffatomen,

R" einen Rest der Formeln -H, -OH, -WH₂, -NHNH₂, -N₃, -O-Alkyl oder O-Aryl, und

η = 1 bis 4.
2. ß-Glykosidderivat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Zucker aus D-Glucose, D-Galactose, D-Mannose, L-Fucose oder 2-Acetamido-2-deoxy-D-glucose bestehen.
3. ß-Glykosidderivat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zwei oder drei Zucker bestehend aus D-CBLactose, D-GIucosamin oder L-Fucose vorliegen.
4. ß-Glykosidderivat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in der allgemeinen Formel R aus einem linearen aliphatischen Kohlenwasserstoffrest der allgemeinen Formel (^GH2^ worin η = 5 bis 10 bedeutet, besteht.
5. ß-Glykosidderivat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in der allgemeinen Formel R" aus Resten der Formeln -H, -OH, -NHNH₂, -N-. OCH₃ oder -OGH₂GH₃ besteht.

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ORtGtNAL. INSPECTED

263059·;
6. ß-Glykosidderivat nach Anspruch 1 in Form von Niederoligosaccharidderivaten, dadurch, gekennzeichnet, daß ein weiterer Zucker oder weitere Zucker α- oder ß-glycosidisch gebunden vorliegen.
7. ß-Glykosidderivat in Form eines Niederoligosaccharidderivats nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der weitere Zucker oder die weiteren Zuckerkomponenten ß-glycosidisch an den ursprünglichen Zucker gebunden sind.
8. ß-Glykosidderivat in Form eines Niederoligosaccharidderivats nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der weitere Zucker oder die weiteren Zuckerkomponenten a-glycosidisch an den ursprünglichen Zucker gebunden sind.
9. ß-Glykosidderivat in Form eines Fiederoligosaccharidderivats nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die folgenden Zucker das Lewis-a-Blutgruppendeterminans bilden: ß-D-Galactopyranose (ß-D-Gal), gebunden an die 3-Stellung von 2-Acetamido-2-deoxy-ß-D-glucopyranose (ß-D-GlcNAc) und a-L-Fucopyranose (a-L-Fuc), gebunden an die 4-Stellung von ß-D-GlcNAc.
10. ß-Glykosidderivat in Form eines Niederoligosaccharidderivats nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die folgenden Zucker das Lewis-b-Blutgruppendeterminans bilden: ß-D-Gal, gebunden an die 3-Stellung von ß-D-GlcNAc und a-L-Fuc, gebunden an die 2-Stellung von ß-D-Gal und eine weitere a-L-Fuc, gebunden an die 4-Stellung von ß-D-GlcNAc.
11. ß-Glykosidderivat in Form eines Niederoligosaccharidderivats nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die folgenden Zucker das B-Blutgruppendeterminans bilden: a-L-Fuc, gebunden an die 2-Stellung von ß-D-Gal und a-D-Galactopyranose (a-D-Gal), gebunden an die 3-Stellung von ß-D-Gal.

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ORIGINAL INSPECTED

--*--Hb 263059b
12. ß-G-lykosidderivat in Form eines Niederoligosaccharidderivats nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die folgenden Zucker das H(O)-Blutgruppendeterminans bilden: α-L-Fuc, gebunden an die 2-Stellung von ß-D-G-al, welche gebunden ist an die 3-Stellung von ß-D-G-lcMAc.
13· Verfahren zur Herstellung einer an Trägerstoffe knüpfbaren ß-Crlykosyl-plus Brückenbildungsarm-Verbindung nach Ansprüchen 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß man

einen aktivierten Zucker (a) bestehend aus einem Glycosylhalogenid, einem 1,2-ortho-Acylderivat eines Zuckers oder einem 1,2-Oxazolinderivat eines Zucker, umsetzt mit

einer Monohydroxycarbonsäure (b) der allgemeinen Formel I HO-R-COOR· (I)

worin R einen aliphatischen Kohlenwasserstoffrest mit 3 bis 17 Kohlenstoffatomen und R¹ eine Schutzgruppe für die Säure bedeuten, unter Bildung eines ß-Glycosids der allgemeinen Formel II

Zucker -&-* O-R-COOR¹ (II)

und gegebenenfalls 1 bis 3 weitere Zucker an die Zuckerkomponente in entweder der α- oder ß-anomeren Konfiguration glykosidisch bindet unter Bildung
eines Disaccharids der allgemeinen Formel III

Disaccharid -A* O-R-COOR» (III) oder eines Irisaccharids der allgemeinen Formel IV Trisaccharid -£-* O-R-COOR* (IV)

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ORIGINAL INSPECTED

263059

oder eines Tetrasaccharids der allgemeinen Formel V letrasaccharid -£-·· O-R-GOOR¹ (V)

und die erhaltenen Verbindungen in Verbindungen der allgemeinen Formel

(Zucker)_n -S-*. O-R-ÖOR"

worin R, R" und η die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung haben, überführt·
14· Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man als aktivierten Zucker (a) ein Derivat von D—Glucose, D-Galactose, D-Mannose, L-Fucose oder 2-Acetamido-2-deoxy-D—Glucose verwendet.
15· Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man als aktivierten Zucker (a) ein Derivat von ey&itweder D-Galactose oder D-Glucosamin verwendet.
16. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man als aktivierten Zucker (a) 2,3>4_?6-Tetra-O-acetyl-a-D-galactopyranosylbromid; 2,3,4,6-Tetra-O-acetyl-a-D-galactopyranosylchlorid; 2,3,4,6-Tetra-O-benzyl-oc-D-galactopyranosylbromid oder 3»4,6-Tetra-0-acetyl-a-D-galacrfcopyranose-1,2-(t-butyl-ortho-acetat) verwendet,
17. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man als aktivierten Zucker (a) 2-Acetamido-3,4,6-tri-0-acetyl-2-deoxy-a-D-glucopyranosylbromid, 2-Acetamido—3,4,6■ tri-O-acetyl-2-deoxy-a-D-glucopyranosylchlorid oder 2-Methyl-4,5-(3,4>6-triacetyl-2-deoxy-a-D-glucopyrano)-Δ -oxazolin verwendet·

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263059-O
18. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man als aktivierten Zucker (a) 2,3,4,6-Tetra-O-acetyl-a-D-galactopyranosylbromid oder 2-Acetamido-3,4,6-tri-0-acetyl-2-deoxy-a-D-glucopyranosylchlorid verwendet. "
19· Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Monohydroxycarbonsäure der Formel I, in der R einen linearen Polymethylenrest bedeutet der allgemeinen Formel (OHp) ., worin η = 3 bis 17 ist, verwendet.
20. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennsLchnet, daß man eine Monohydroxycarbonsäure (b) der Formel I verwendet, in der R¹ einen niedermolekularen Alkylrest bestehend aus Methyl, Äthyl, n-Propyl, Isopropyl oder η-Butyl bedeutet.
21. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Monohydroxycarbonsäure (b) der Formel I verwendet, in der R den Rest -(0H₂),-- und R¹ den Rest -CH, oder -CpH^ bedeuten unter Bildung der 5-Methoxycarbonylpentyloxy- oder 5-Äthoxycarbonylpentyloxygruppe.
22.Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Monohydroxycarbonsäure (b) verwendet, in der R

den Rest -(0H_o)_Q- und R^f den Rest -CH₀ oder -C_OH_C bedeute ο j d. ο

ten unter Bildung der 8-Methoxycarbonyloctyloxy- oder 8-Äthoxycarbonyloctyloxygruppe·
23. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man mindestens einen weiteren Zucker ß-glykosidisch bindet durch Umsetzungen mit einem aktivierten Zucker.
24. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man mindestens einen weiteren Zucker oc-glykosidisch bindet durch Umsetzungen mit einem geeignet ausgewählten

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2630591;

Glycosylhalogenid unter entsprechenden Bedingungen.
25. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß man als G-lycosylhalogenid ein Zuckerderivat verwendet, dessen in 2-Stellung befindlicher Substituent als eine an der Umsetzung nicht teilnehmende Blοckierungsgruppe dient und dem Typ einer Benzyl-, Tetrahydropyranyl- oder Methoxymethylgruppe zuzuordnen ist.
26. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß man als Glycosylhalogenid 2,3,4,6-Tetra-O-benzyl-a,ß-D-galactopyranosylchlorid oder 2,3,4,6-Tetra-O-benzyl-a-D-galactopyranosylbromid verwendet.
27· Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß man als Glycosylhalogenid 2,3,4-Tri-0-benzyl-oc,\ß-L-fucopyranosylchlorid oder 2,3,4-Tri-O-benzyl-a-L-fucopyranosylbromid verwendet.
28. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß man die Bildung der a-glykosidisehen Bindung fördert durch das Vorliegen von.Halogenidionen mit oder ohne Zusatz von Reaktionskatalysatoren vom Typ des QuecksilberClIJcyanids.
29· Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß man als Quelle für Halogenidionen Lithium oder Tetramethylammonium-, Tetraäthylammonium- oder Tetrabutylammoniumhalogenide verwendet.
30. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Herstellung einer Verbindung der Formel IV die folgenden Zucker zu einem Lewis-a-Blutgruppendeterminans vereinigt: ß-D-Galactopyranose (ß-D-Gal) wird an die 3-Stellung des ü-Alkoxycarbonylalkyl^-acetamido^-deoxy-ß-D-glucopyranosids und a-L-Pucopyranose (oc-L-Fuc) wird an die

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-<- 5V) 263059Ü

4~Stellung des ß-D-GlcNAc-Restes gebunden.
31. Verfallren nach. Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Herstellung einer Verbindung der Formel V die folgenden Zucker zu einem Lewis-b-Blutgruppendeterminans vereinigt: ß-D-G-al wird an die 3-Stellung des ü-Alkoxycarbonylalkyl-2-acetamido-2-deoxy-ß-I>-glucopyranosids und cc-L-Fuc wird an die 2-Stellung des ß—D-G-al-Restes und eine v/eitere a-L-Fuc wird an die 4-Stellung des ß-D-G-IcHAc-Re st es gebunden.
32. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Herstellung einer Verbindung der Formel IV die folgenden Zucker zu einem B-Blutgruppendeterminans vereinigt: oc-L-Fuc wird an die 2-Stellung des cj-Alkoxycarbonylalkyl-ß-D-galactopyranosids und oc-D-G-al wird an die 3-Stellung des ß-D-G-al-Restes gebunden.
33. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Herstellung einer Verbindung der Formel IV die folgenden Zucker zu einem H(0)-Blut grupp ende terminans vereinigt: a-L-Fuc wird an die 2-Stellung eines ß-D-G-al-Restes gebunden, der an die 3-Stellung eines o-Alkoxycarbonyl-2-acetamido-2-deoxy-ß-D—galactopyranosids gebunden ist·
34. Verfahren nach Anspruch 13, dadurii gekennzeichnet, daß man die Monosaccharid- oder Hiedrigoligosaccharid- plus Brückenbildungsarm-Verbindung zur Knüpfung an ein lösliches Trägermakromolekül oder einen unlöslichen Trägerstoff verwendet.
35· Verfahren nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, daß man den Brückenbildungsarm an das Trägermittel über eine Amidbindung knüpft, an der die u-Carbonylgruppe des u;-Alkoxycarbonylalkyl-Brückenbildungsarms beteiligt ist.

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ORIGINAL INSPECTED

-* - SA

2639 5 9^f: ■■
36. Verfahren nach Anspruch 35» dadurch gekennzeichnet, daß man die Amidbindung bildet mit einem ß-Glycosid der Forme 3n II bis V, in denen OR¹ = OH ist und ein lösliches Kondensationsmittel vom öarbodiimid- oder 1-Äthoxycarbonyl-2-äthoxy-1,2-dihydrochinolintyp verwendetzur Bewirkung der Kondensation des sauren Haptens mit Aminogruppen des Trägermittels.
37. Verfahren nach Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, daß man die Amidbindung bildet mit einem ß-Glycosid der Formeln II bis V, in denen OR¹ = N₃.ist.
38. Verfahren nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, daß man als Trägermittel Proteine, rote Blutkörperchen, aminierte Polysaccharide, aminiertes Glas, aminiertes Polystyrol, Polyvinylamin, aminiertes Polyacrylamid oder aminiert en Polyvinylalkohol verwendet.
39· Verwendung der ß-Glykosidderivate nach Ansprüchen 1 bis 12 in Form von an lösliche Trägermoleküle oder unlösliche Trägerstoffe gebundenen künstlichen Antigenen oder Immunoabs orbantien.
40. Verwendung nach Anspruch 39, dadurch gekennzeichnet, daß über eine Amidbindung an das Trägermittel gebundene Niederoligosaccharidderivate nach Anspruch 6 eingesetzt werden,
41. Verwendung nach Ansprüchen 39 und 40, dadurch gekennzeichnet, daß als Trägermittel Proteine, rote Blutkörperchen, aminierte Polysaccharide, aminiertes Glas, aminiertes Polystyrol, Polyvinylamin, aminiertes Polyacrylamid oder aminierter Polyvinylalkohol eingesetzt werden.

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42. Verwendung nach. Ansprüchen 39 bis 41» dadurch gekennzeichnet, daß das Niederoligosaccharid ein Blutgruppendeterminans ist·

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