DE3219209C2

DE3219209C2 -

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Publication number: DE3219209C2
Application number: DE19823219209
Authority: DE
Inventors: Haruo Matsudo Chiba Jp Ogura; Kimio Furuhata; Toshiaki Osawa; Satoshi Tokio/Tokyo Jp Toyoshima; Yoshiyasu Musashino Tokio/Tokyo Jp Shitori; Masayoshi Kunitachi Tokio/Tokyo Jp Ito
Original assignee: Mect Corp
Current assignee: Mect Corp
Priority date: 1981-05-22
Filing date: 1982-05-21
Publication date: 1988-03-10
Also published as: DE3219209A1; FR2506313A1; HK27589A; SG11288G; GB2101588A; DE3249916C2; GB2101588B; FR2506313B1

Description

Gegenstand der Erfindung sind neue N-Acetylneuraminsäure-Nucleosid- Derivate, insbesondere Derivate mit immunologischer Aktivität, ein Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung.

N-Acetylneuraminsäure kommt im Tierkörper und auf der Zelloberfläche bestimmter Bakterien in Form eines Sialo- Komplexes vor (Glycoproteine, Glycolipide, Oligosaccharide, und Polysaccharide). In jüngerer Zeit wurde erkannt, daß diese Verbindung auf medizinischem und pharmazeutischem Gebiet eine wichtige Rolle spielt, da sie die Funktion des Nervensystems, die Zelldifferenzierung und Immunität, die Behandlung von Entzündungen, Tumoren und Virusinfektionen beeinflußt und als Hormonrezeptor wirkt. Die Verbindung hat außerdem als spezifisches aktives Molekül, das an der Zelloberfläche lokalisiert ist, Beachtung gefunden. Die Rolle, die diese Verbindung in dem Sialo-Komplex spielt, ist jedoch immer noch ungeklärt.

Auch über einfache Derivate der N-Acetylneuraminsäure wurde bereits berichtet; vgl. J. Biol. Chem., Bd 244 (1969), S. 1306 und Z. Physiol. Chem., Bd. 352 (1971), S. 1715. Derivate mit auffallender physiologischer Aktivität sind bisher jedoch nicht bekannt.

Als Folge der jüngst entwickelten mehrseitigen Behandlungen von bestimmten Erkrankungen, wie allen Tumorarten einschließlich von malignen Tumoren der blutbildenden Organe und Kollagenose (Kollagenkrankheit) wird tatsächlich ein Apothanasiaeffekt erreicht. Ein überhöhter Gebrauch von Nebennierenrindenhormonen und Immunosuppressoren ist meist unvermeidlich. Das führt zu Nebenwirkungen sowie einer Verminderung oder Abnahme der sogenannten Immunkapazität und damit zu ernsten Problemen.

Es besteht deshalb ein starkes Bedürfnis nach sicheren und wirksameren Arzneimitteln, zur Beeinflussung des Immunsystems ohne ernste Nebenwirkungen.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, neue N-Acetylneuraminsäure- Derivate bereitzustellen, die eine hohe immunologische Aktivität aufweisen ohne dabei irgendwelche ernsten Nebenwirkungen zu haben. Diese Aufgabe wird durch den überraschenden Befund gelöst, daß die vorstehend genannten Nachteile überwunden werden können, wenn N-Acetylneuraminsäure zu einer Sialinsäure chemisch modifiziert wird, die ein natürlicher Bestandteil des lebenden Organismus ist.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung der neuen N-Acetylneuraminsäure-Nucleosid-Derivate zu schaffen.

Gegenstand der Erfindung sind somit neue N-Acetylneuraminsäure- Nucleosid-Derivate der allgemeinen Formel I,

in der R¹ ein Wasserstoffatom, einen niederen Alkylrest oder einen gegebenenfalls mit einem niederen Alkylrest substituierten Aralkyl- oder Arylrest, R² einen Nucleosidrest, nämlich einen Inosinrest oder ein Derivat davon oder einen Uridinrest oder ein Derivat davon und R³ und R⁴ unabhängig voneinander Wasserstoffatome oder Acetylgruppen bedeuten.

Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung sind in den Unteransprüchen beschrieben.

Der Begriff "niederer Alkylrest" bedeutet Reste mit 1 bis 7, vorzugsweise 1 bis 4 Kohlenstoffatomen. Die Methyl- und Ethylgruppe ist besonders bevorzugt.

Folgende Nucleosid-Reste können bevorzugt verwendet werden:

Die neuen N-Acetylneuraminsäure-Nucleosid-Derivate der Erfindung können durch Umsetzen einer Verbindung der allgemeinen Formel II,

in der R⁵ einen niederen Alkylrest oder einen gegebenenfalls durch einen niederen Alkylrest substituierten Aralkyl- oder Arylrest, R³ und R⁴ unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom oder eine Acetylgruppe und hal ein Halogenatom bedeuten, mit einem der vorstehend genannten Nucleosidreste hergestellt werden. Die Umsetzung verläuft nach der Königs-Knorr-Reaktion. Die erhaltenen Produkte können gegebenenfalls deacetyliert werden.

In der Königs-Knorr-Reaktion kann beispielsweise Ag₂CO₃, Ag₂O, Hg(CN)₂, HgBr₂ oder AgClO₄ als Katalysator eingesetzt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Molekularsieb, beispielsweise Molekularsieb 3A oder 4A zusammen mit einem Katalysator verwendet, um den bei der Umsetzung entstandenen Halogenwasserstoff wirksam zu entfernen. Dadurch wird die Reaktionsgeschwindigkeit erhöht und die Produktausbeute verbessert.

Die Reaktionstemperatur ist nicht besonders kritisch. Die Umsetzung wird gewöhnlich aus wirtschaftlichen Gründen und wegen der einfachen Durchführung bei Raumtemperatur vorgenommen.

Die Reaktionszeit beträgt 30 Minuten bis 24 Stunden.

Als Reaktionsmedium werden vorzugsweise Acetonitril oder Nitromethan verwendet.

Die Deacetylierungsreaktion kann nach einem Verfahren durchgeführt werden, bei dem das Produkt mit den Acetylgruppen, das nach der Königs-Knorr-Reaktion erhalten wird, bei einer Temperatur von -20 bis 0°C etwa 20 Minuten in einem Reaktionsmedium, wie Methanol, in Gegenwart eines Alkalimetallalkoholats gerührt wird. Anschließend wird die Reaktionslösung mit Dowex 50 × 8 (Kationenaustauscher) in der H⁺- Form neutralisiert und danach nach üblichen Verfahren weiter behandelt.

Bevorzugte Beispiele für das Verfahren zur Herstellung der neuen N-Acetylneuraminsäure-Derivate sind in den nachstehenden Reaktionsgleichungen angegeben.

Die Ausgangsverbindungen der allgemeinen Formel II sind bekannt. Sie können beispielsweise nach dem Verfahren hergestellt werden, das von Richard Kuhn u. Mitarb. in Chem. Ber., Bd. 99 (1966), S. 611 beschrieben wurde. Dieses Verfahren enthält drei Stufen, nämlich die Veresterung von N-Acetylneuraminsäure zu β-D-N-Acetylneuraminsäureestern, die Acetylierung der veresterten Produkte zu 4,7,8,9-tetra- O-Acetyl-β-D-N-acetylneuraminsäureestern und anschließend die Halogenierung der erhaltenen acetylierten Produkte.

Die Verbindungen der allgemeinen Formel II können auch nach einem neuen Verfahren hergestellt werden, das Gegenstand der parallelen Patentanmeldung P 32 49 916.7 ist. Dieses Verfahren umfaßt die Veresterung von N-Acetylneuraminsäure und dann die gleichzeitige Acetylierung und Halogenierung der erhaltenen N-Acetylneuraminsäureester. Nach dem neuen Verfahren können die Verbindungen der Formel II in höherer Ausbeute als nach dem Verfahren von R. Kuhn u. Mitarb. erhalten werden. Das Verfahren ist auch im Hinblick auf Sicherheit und Wirtschaftlichkeit überlegen.

Die Verbindungen der allgemeinen Formel I sind wertvolle Arzneistoffe mit bemerkenswerter Aktivität im Hinblick auf eine Beeinflussung des Immunsystems.

Die immunologischen Wirkungen können mit folgenden Verfahren bestimmt werden:

(i) Wirkung auf die Con A-Aktivierung von Milz-Lymphozyten der Maus

Suppressor-T-Zellen werden durch Concanavalin A (Con A) unspezifisch aktiviert. Es wird die Wirkung der N- Acetylneuraminsäure-Derivate der Erfindung auf dieses Reaktionssystem untersucht. Die Untersuchung wird nach folgendem Verfahren durchgeführt. Zunächst werden Con A und die zu untersuchende Verbindung der allgemeinen Formel I zu den Milz-Lymphozyten (SPC) gegeben, die aus BALB/C- Mäusen erhalten werden. Die dabei erhaltenen Proben werden 20 Stunden bei 37°C auf einer Mikroplatte in einer Atmosphäre mit 5% CO₂ kultiviert. Anschließend werden sie mit Tritium markiertem Thymidin versetzt. Die Proben werden weitere 18 Stunden bei 37°C kultiviert. Dann werden die SPC gesammelt, und die Menge des eingebauten ³H-Thymidins in den SPC wird unter Verwendung eines Szintillationszählers bestimmt.

Es wird festgestellt, daß der Einbau von ³H-Thymidin in SPC beschleunigt und erhöht ist und daß auch die Aktivierung der T-Zellen durch Con A durch die Gegenwart der Verbindungen der allgemeinen Formel I verstärkt ist. Die Ergebnisse mit ausgewählten Verbindungen sind in Tabelle I zusammengefaßt.

Tabelle I

Wirkung von Neuraminsäure-Derivaten auf die DNA-Synthese von Con A-stimulierten Lymphozyten

Die Ergebnisse in Tabelle I zeigen, daß der durch Con A induzierte Anstieg der DNA-Synthese der Lymphozyten durch die Verbindungen gemäß Beispiel 6 (10^-5 mol/l) und Beispiel 7 (10^-4 mol/l) deutlich erhöht wird. FIU, ein Bestandteil der Verbindung von Beispiel 6, und DAI, ein Bestandteil der Verbindung von Beispiel 7, ergeben dagegen keinerlei Erhöhung der DNA-Synthese bei durch Con-A-stimulierten Lymphozyten. Eine fast vollständige Hemmung des [6-³H]-Thymidineinbaus wird bei der mit FIU (10^-5 mol/l) behandelten Kultur beobachtet.

Die Verbindung der Formel II′, die gemeinsamer Bestandteil der Verbindungen gemäß Beispiel 6 und Beispiel 7 ist, scheint eine Erhöhung der DNA-Synthese zu induzieren. Das Ausmaß der Erhöhung ist aber nicht nennenswert. Ein Gemisch aus der Verbindung der Formel II′ (10^-5 mol/l) und FIU (10^-5 mol/l), sowie ein Gemisch aus der Verbindung der Formel II′ (10^-4 mol/l) und DAI (10^-4 mol/l) hat die gleiche Wirkung wie FIU oder DAI allein auf die DNA-Synthese von Con-A-stimulierten Lymphozyten. Die Verbindungen gemäß Beispiel 6 und Beispiel 7 der Erfindung erhöhen die DNA-Synthese der Lymphozyten auch bei einer Kultur ohne Con A (Tabelle I).

(ii) Wirkung auf die Immunglobulinsynthese der Milz-Lymphozyten von Mäusen

Die Wirkung der N-Acetylneuraminsäure-Derivate, die T-Zellen aktivierende Wirkung aufweisen, auf die Immunglobulinsynthese wird durch Messung der Anzahl der Plaque bildenden Zellen (PFC) bestimmt. Zu diesem Zweck werden SPC zusammen mit roten Blutzellen vom Schaf (SRBC) sowie der zu prüfenden Verbindung der allgemeinen Formel I 5 Tage bei 37°C kultiviert. Dann werden die sensibilisierten SPC weiter mit SRBC und einem Komplement versetzt. Die erhaltenen Proben werden 3 bis 12 Stunden bei 37°C in einer Cunningham- Kammer kultiviert. Anschließend wird die Anzahl der PFC bestimmt.

Es wird festgestellt, daß die Anzahl der PFC vermindert ist und daß die Lebensfähigkeit der Zellen identisch mit der Kontrollprobe ist, die keine Verbindung der allgemeinen Formel I enthält. Dies zeigt, daß die Verbindungen der allgemeinen Formel I eine unterdrückende Wirkung auf die Immunglobulinsynthese aufweisen.

Tabelle II

Wirkung von Disaccharid-nucleosiden und der zu ihrer Herstellung verwendeten Ausgangsverbindungen auf die primäre PFC-Antwort auf SRBC in vitro

Die Ergebnisse in Tabelle II zeigen, daß die Verbindungen gemäß Beispiel 6 und Beispiel 7 sowie die zu ihrer Herstellung verwendeten Ausgangsverbindungen eine Abnahme der PFC-Antwort auf SRBC induzieren.

Mit Con A stimulierte Lymphozyten zeigen Suppressoraktivität auf die primäre PFC-Antwort auf SRBC. Diese Aktivierung von Suppressorzellen durch Con A wird durch die Anwesenheit der Verbindung gemäß Beispiel 6 (10^-5 mol/l) und der Verbindung gemäß Beispiel 7 (10^-4 mol/l) während der Inkubation mit Con A deutlich verstärkt. Außerdem weisen auch SPC, die mit der Verbindung gemäß Beispiel 6 oder derjenigen gemäß Beispiel 7 in Abwesenheit von Con A vorkultiviert wurden, Suppressoraktivität auf. Andererseits induzieren weder FIU und DAI noch die Verbindung der allgemeinen Formel II′ eine Suppressoraktivität der Zellen; vgl. Tabelle III.

Die Induktion von Suppressorzellen durch die Verbindungen gemäß Beispiel 6 und Beispiel 7 wird durch Vorbehandlung der Lymphozyten mit Anti-Thy-1-Antiserum und Komplement aufgehoben. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, daß diese Disaccharidnucleoside die Suppressor-T-Zellen induzieren können.

Tabelle III

Wirkung der Behandlung von mit Con A stimulierten und von nichtstimulierten Zellen mit Disaccharidnucleosiden auf die Suppressoraktivität der Zellen

Bei Autoimmunerkrankungen, wie Kollagenkrankheit, ist die Funktion der Suppressor-T-Zellen geschwächt. Die N-Acetylneuraminsäure-Derivate der Erfindung, die eine aktivierende Wirkung auf die Suppressor-T-Zellen ausüben, können deshalb wertvolle Arzneimittel zur gezielten Beeinflussung des Immunsystems darstellen. Die Nucleosid- Derivate der N-Acetylneuraminsäure weisen, wie erläutert, immunologische Aktivität auf. Sie sind deshalb wertvolle Arzneistoffe, insbesondere als Immunosuppressoren und eignen sich zur Behandlung von Autoimmunoerkrankungen, wie Kollagenose. Dabei verursachen sie keine ernsten Nebenwirkungen.

Beispiel 1 a) Herstellung von 2-Chlor-4,7,8,9-tetra-O-acetyl-β-D-N- acetylneuraminsäuremethylester (Verbindung II′)

1 g N-Acetylneuraminsäure wird in 100 ml Methanol gelöst und mit 2 g Dowex 50 × 8 (H⁺) versetzt. Das Gemisch wird 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, anschließend abfiltriert und das Filtrat zur Trockene eingedampft. Der erhaltene Rückstand wird aus einem Gemisch von Methanol und Diethylether umkristalliert. Es werden 1 g β-D-N-Acetylneuraminsäuremethylester als farblose nadelartige Kristalle erhalten (Ausbeute: 95%).

Physikalische Eigenschaften:
S. 175 bis 178°C

Elementaranalyse für C₁₂H₂₁NO₉:

ber.:C 44,58 H 6,55 N 4,33 gef.:C 44,62 H 6,57 N 4,23

1 g des erhaltenen β-D-N-Acetylneuraminsäuremethylesters wird mit 10 ml Acetylchlorid versetzt und das Gemisch 5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wird das überschüssige Acetylchlorid unter vermindertem Druck abdestilliert, die Lösung mit Benzol versetzt und das Lösungsmittel abdestilliert. Es werden 1,5 g der Titelverbindung als farblose amorphe Substanz erhalten (Ausbeute: 95%). Das Rohprodukt wird aus einem Gemisch von Benzol, Diethylether und Petrolether umkristallisiert. Es werden 1,26 g der Titelverbindung als farblose nadelförmige Kristalle erhalten (Ausbeute: 80%).

Physikalische Eigenschaften:
S 116 bis 118°C.

¹H NMR (CDCl₃) δ _H (TMS): 1,92 (3H, s), 1,99 - 2,10 (OAcx4), 2,87 (1H, dd, J = 5,0 und 12,0 Hz), 3,91 (3H, s)

b) Herstellung von 2′,3′-Di-O-acetyl-5′-O-(4-N-acetyl-2,4- dideoxy-3,6,7,8-tetra-O-acetyl-1-methoxycarbonyl-D-glycero- α-D-galacto-octopyranosyl)-inosin

30 ml Acetonitril werden mit 550 mg 2′,3′-Di-O-acetylinosin, 150 mg Hg(CN)₂, 300 mg HgBr₂ und 500 mg eines Molekularsiebs (4A) versetzt; das Gemisch wird weiter mit 510 mg 2-Chlor-4,7,8,9-tetra-O-acetyl-β-D-N-acetylneuraminsäuremethylester (Verbindung (II′)) versetzt und das Gemisch 48 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die erhaltene Lösung wird abfiltriert und das Filtrat zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird mit 50 ml Ethylacetat versetzt und die Lösung zweimal mit einer 30prozentigen Kaliumjodidlösung gewaschen, um Hg(CN)₂ und HgBr₂ zu entfernen. Anschließend wird die Lösung über Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel abdestilliert. Zur Reinigung wird das Rohprodukt an einer mit Aluminiumoxid gefüllten Säule chromatographiert und mit einem Benzol-Ethylacetat-Gemisch eluiert. Es werden 430 mg der Titelverbindung als farbloses Pulver erhalten (Ausbeute: 52%).

Physikalische Eigenschaften:

Elementaranalyse für C₃₄H₄₃ N₅O₁₉:

ber.:C 49,46 H 5,25 N 8,48 gef.:C 49,15 H 5,41 N 8,11

Massenspektroskopie (FD) m/z 825 (M⁺).

¹H NMR (CDCl₃) δ _H (RMS): 1,88-2,20 (OAcx7), 2,76 (1H, dd, J = 13,0 und 4,5 Hz), 3,78 (3H, s), 5,95 (1H, d, J = 2,2 Hz), 8,20 (1H, s), 8,44 (1H, s).

Beispiel 2 Herstellung von 2′,3′-Isopropyliden-5′-O-(4-N-acetyl-2,4- dideoxy-3,6,7,8-tetra-O-acetyl-1-methoxycarbonyl-D-glycero- α-D-galacto-octopyranosyl)-uridin

Ein Gemisch von 1 g 2′,3′-Isopropylidenuridin, 150 mg Hg(CN)₂ und 300 mg HgBr₂ wird mit 50 ml Acetonitril und weiter mit 1 g eines Molekularsiebs (4A) versetzt.

Das Gemisch wird mit 510 mg der Verbindung (II′) versetzt und 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die erhaltene Lösung wird abfiltriert und das Filtrat unter vermindertem Druck bei 40°C vom Lösungsmittel befreit. Der Rückstand wird mit 100 ml Ethylacetat versetzt und die Lösung mit einer 30prozentigen Lösung von Kaliumjodid zur Entfernung von Hg(CN)₂ und HgBr₂ versetzt. Anschließend wird die Ethylacetatlösung über Natriumsulfat getrocknet, das Lösungsmittel entfernt und ein öliger Rückstand erhalten. Der ölige Rückstand wird mit Diethylether behandelt, die Diethyletherlösung mit 10 ml Chloroform versetzt und nichtlösliches Material entfernt. Nach Zugabe von Diethylether zur Chloroformlösung entsteht ein Niederschlag, der abfiltriert und getrocknet wird. Es werden 300 mg eines farblosen Pulvers erhalten (Ausbeute: 40%).

Physikalische Eigenschaften:

Elementaranalyse für C₃₂H₄₃N₃O₁₈ (MG = 757,70):

ber.:C 50,73 H 5,72 N 5,55 gef.:C 50,56 H 5,90 N 5,22

Massenspektroskopie m/z: 757 (M⁺), 742 (M⁺ -15), 714 (M⁺ -43), 698 (M⁺ -59)

¹H NMR (CDCl₃) δ _H (TMS)
1,48 (s, 3H), 170 (s, 3H), 1,88 (s, 3H), 2,00- 2,20 (OAcx4), 260 (dd, 1H, J = 4,0 und 13,0 Hz) 3,80 (s, 3H), 5,68 (d, 1H, J = 7,0 Hz), 7,60 (d, 1H, J = 7,0 Hz).

Beispiel 3 Herstellung von 2′,3′-Isopropyliden-5′-O-(4-N-acetyl-2,4- dideoxy-1-methoxycarbonyl-D-glycero-α-D-galacto-octapyranosyl)- uridin

Die gemäß Beispiel 2 erhaltene Verbindung wird in 10 ml Methanol gelöst und mit einer Lösung von 100 mg metallischem Kalium in 10 ml Methanol versetzt. Die erhaltene Lösung wird 20 Minuten bei 0°C gerührt. Anschließend wird die Lösung mit Dowex 50 × 8 (H⁺) bei -20°C neutralisiert, abfiltriert, konzentriert und zur Trockne eingedampft. Der erhaltene Rückstand wird in 5 ml Methanol gelöst, mit Dioxan versetzt und vom ausgefällten Niederschlag abfiltriert. Es werden 230 mg eines farblosen Pulvers erhalten (Ausbeute: 60%).

Physikalische Eigenschaften:

Elementaranalyse für C₂₄H₃₅N₃O₁₄ (MG = 589,55):

ber.:C 48,89 H 5,98 N 7,13 gef.:C 48,25 H 6,03 N 7,05

¹H NMR (D₂O) w _H (DSS): 1,55 (s, 3H), 1,66 (s, 3H), 2,30 (s, 3H), 3,4 (s, 3H), 5,96 (d, 1H, J = 8,5 Hz), 5,99 (d, 1H, J = 1,2 Hz), 7,90 (d, 1H, J = 8,5 Hz).

Beispiel 4 Herstellung von 5′-O-(4-N-Acetyl-2,4-dideoxy-1-methoxy- carbonyl-D-glycero-α-D-galacto-octopyranosyl)-inosin nach folgendem Reaktionsschema:

300 mg der Verbindung (A) werden in 10 ml Methanol gelöst und mit einer Lösung von 80 mg metallischem Kalium in 10 ml Methanol versetzt. Die erhaltene Lösung wird 20 Minuten bei 0°C gerührt und anschließend durch Zugabe von Dowex 50 × 8 (H⁺) bei -20°C neutralisiert. Die neutralisierte Lösung wird abfiltriert und zur Trockne eingedampft. Der erhaltene Rückstand wird in 1 ml Wasser gelöst und mit Ethanol versetzt. Es werden 150 mg der Verbindung (B) als farbloses Pulver erhalten (Ausbeute: 71%).

Physikalische Eigenschaften:

Elementaranalyse für C₂₂H₃₁N₅O₁₃ (MG = 573):

ber.:C 46,07 H 5,45 N 12,21 gef.:C 45,65 H 5,61 N 12,18

¹H NMR (D₂O) δ _H (DSS): 2,05 (s, 3H), 3,85 (s, 3H), 8,15 (s, 1H), 8,62 (s, 1H).

Beispiel 5 Herstellung von 5-Fluor-2′,3′-isopropyliden-5′-O-(4-N- acetyl-2,4-dideoxy-1-methoxycarbonyl-D-glycero-α-D- galacto-octopyranosyl)-uridin nach folgendem Reaktionsschema:

Eine Lösung von 500 mg der Verbindung (C) in 10 ml Methanol wird mit einer Lösung von 100 mg metallischem Kalium in 10 ml Methanol versetzt und 20 Minuten bei 0°C gerührt. Anschließend wird das Reaktionsgemisch mit Dowex 50 × 8 (H⁺) bei -20°C neutralisiert, die erhaltene Lösung abfiltriert und zur Trockne eingedampft. Anschließend wird der erhaltene Rückstand in 5 ml Methanol gelöst und mit Dioxan versetzt. Der Niederschlag wird abfiltriert. Es werden 180 mg der Verbindung (D) als farbloses Pulver erhalten (Ausbeute: 48%).

Physikalische Eigenschaften:

Elementaranalyse für C₂₄H₃₄N₃O₁₄F (MG = 607):

ber.:C 47,45 H 5,60 N 6,92 gef.:C 47,92 H 5,45 N 6,21

Beispiel 6 Herstellung von 5-Fluor-2′,3′-isopropyliden-5′-O-(4-N- acetyl-2,4-dideoxy-3,6,7,8-tetra-O-acetyl-1-methoxycarbonyl- D-glycero-α-D-galacto-octopyranosyl)-uridin nach folgendem Reaktionsschema: Verfahren (i)

500 mg 5-Fluor-2′,3′-isopropylidenuridin (E), 150 mg Hg(CN)₂ und 300 mg HgBr₂ werden in 30 ml Acetonitril gelöst und mit 1 g pulverigem Molekularsieb (3A) versetzt. Nach 1stündigem Rühren wird das Reaktionsgemisch mit 510 mg der Verbindung (II′) versetzt und die Lösung 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wird die Lösung abfiltriert und das Lösungsmittel des Filtrats unter vermindertem Druck bei 40°C zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wird in 100 ml Ethylacetat gelöst und mit einer 30prozentigen wäßrigen Kaliumjodidlösung gewaschen, um Hg(CN)₂ und HgBr₂ zu entfernen. Die Ethylacetatlösung wird über Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel abdestilliert. Der ölige Rückstand wird mit Diethylether behandelt und die Diethyletherlösung mit 10 ml Chloroform versetzt, um in Chloroform unlösliches Material zu entfernen. Die so erhaltene Chloroformlösung wird mit Diethylether versetzt, wobei ein Niederschlag ausfällt. Der Niederschlag wird an einer mit Aluminiumoxid gefüllten Säule chromatographiert und mit einem Gemisch von Ethylacetat und Ethanol eluiert. Es werden 62 mg der Verbindung (F) als farbloses Pulver erhalten (Ausbeute: 8%).

Physikalische Eigenschaften:

Elementaranalyse für C₃₂H₄₂N₃O₁₈F:

ber.:C 49,55 H 5,42 N 5,45 gef.:C 49,24 H 5,80 N 5,12

Massenspektroskopie m/z:

775 (M⁺), 760 (M⁺ - Me), 732 (M⁺ - Me), 716 (M⁺ - COOMe). ¹H NMR (CDCl₃) δ _H (TMS): 1,89-2,20 (15H, all s, -NHAc und -OAc), 2,63 (1H, dd, J = 4,0 und 14,0 Hz, 3′′-H eq.) 3,80 (3H s, Methylester), 5,95 (1H, d, J = 2,0 Hz, 1′-H), 7,62 (1H, d, J = 7 Hz, 6-H).

Verfahren (ii)

500 mg der Verbindung (E) werden in 10 ml Nitromethan gelöst und mit 350 mg AgClO₄ und 200 mg pulverisiertes Molekularsieb (4A) versetzt. Das Gemisch wird 30 Minuten gerührt. Anschließend wird das Reaktionsgemisch mit einer Lösung von 510 mg der Verbindung (II′) in 5 ml Nitromethan versetzt und die erhaltene Lösung 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die erhaltene Lösung wird abfiltriert und das Filtrat mit 50 ml Ethylacetat versetzt. Nach Zugabe von 20 ml einer gesättigten Natriumchloridlösung wird die Nitromethan- Ethylacetatlösung über Natriumsulfat getrocknet und nach dem Abfiltrieren des Lösungsmittels abdestilliert. Der Rückstand wird mit Diethylether extrahiert, um etherlösliche Substanzen zu entfernen. Anschließend wird der Rückstand mit Chloroform extrahiert, um choroformunlösliches Material zu entfernen. Die erhaltene Chloroformlösung wird mit Diethylether versetzt. Der erhaltene Niederschlag wird an einer mit Aluminiumoxid gefüllten Säule chromatographiert und mit einem Gemisch von Ethylacetat und Ethanol eluiert. Es werden 150 mg der Verbindung (F) als farbloses Pulver erhalten (Ausbeute: 20%).

Beispiel 7 Herstellung von 2′,3′-Di-O-acetyl-5′-O-(4-N-acetyl-2,4- dideoxy-3,6,7,8-tetra-O-acetyl-1-methoxycarbonyl-D-glycero- α-D-galacto-octopyranosyl)-inosin nach dem folgenden Reaktionsschema:

30 ml Acetonitril werden mit 550 mg der Verbindung (G), 150 mg Hg(CN)₂, 300 mg HgBr₂ und 500 mg pulverisiertes Molekularsieb (4A) versetzt. Das erhaltene Gemisch wird 1 Stunde gerührt. Anschließend wird das Reaktionsgemisch mit 510 mg der Verbindung (II′) versetzt und die erhaltene Lösung 48 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionslösung wird abfiltriert und das Filtrat zur Trockne eingedampft. Der erhaltene Rückstand wird in 50 ml Ethylacetat gelöst und die Lösung zweimal mit 30prozentigem Kaliumjodid gewaschen, um Hg(CN)₂ und HgBr₂ zu entfernen. Anschließend wird die Ethylacetatlösung über Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel abdestilliert. Der ölige Rückstand wird an einer mit Aluminiumoxid gefüllten Säule chromatographiert und mit einem Gemisch aus Benzol, Ethylacetat und Ethanol eluiert. Es werden 210 mg der Titelverbindung als farbloses Pulver erhalten (Ausbeute: 25%).

Physikalische Eigenschaften:

Elementaranalyse für C₃₄H₄₃N₅O₁₉:

ber.:C 49,46 H 5,25 N 8,48 gef.:C 49,15 H 5,41 N 8,11

Massenspektroskopie (FD) m/z: 825 (M⁺).

¹H NMR (CDCl₃) δ _H (TMS): 1,88-2,20 (21H, alle s, NHAc und OAcx6) 2,76 (3H, s, Methylester), 595 (1H, s, J = 2,2 Hz, 1′-H), 8,20 (1H, s, 2-H), 8,44 (1H, s, 6-H).

Versuchsbericht 1. Testverfahren

Verwendete Tiere: Acht Wochen alte weibliche SPFBALB/c-Mäuse.
Krebszellen: NL-17.

Die Tiere aller Testgruppen werden mit NL-17-Zellen in einer Menge von 5 × 10⁴ Zellen/Maus infiziert. Die Testverbindung (Verbindung von Beispiel 9) wird intravenös in der nachstehend angegebenen Menge verabreicht.

22 Tage nach der Infizierung mit den Krebszellen werden die Mäuse getötet und auf die Zahl in der Lunge entstandenen Metastase-Knoten untersucht.

Testgruppen:

I: Ungekochtes Futter
II: NL-17 + ungekochtes Futter
III: NL-17 (vorbehandelt mit der Testverbindung) + Testverbindung (0,5 mg/Maus/3 Tage)
IV: NL-17 + Testverbindung (0,5 mg/Maus/3 Tage)
V: NL-17 + Testverbindung (1,0 mg/Maus/3 Tage)
VI: NL-17 + Testverbindung (0,5 mg/Maus/jeden Tag)
VII: NL-17 + Testverbindung (0,5 mg/Maus/7 Tage)

2. Ergebnisse des Tests

Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengefaßt. Sie zeigen, daß die mit der Testverbindung behandelten Versuchstiergruppen III bis VII eine erheblich verminderte Metastasenbildung zeigten, wobei ein Hemmfaktor von 66 bis 88% im Vergleich zur Kontrollgruppe II erhalten wurde. Eine bemerkenswerte Wirkung wurde in der Gruppe VII festgestellt, bei der die Testverbindung 7 Tage lang verabreicht und dann abgesetzt wurde. Eine gewisse Konzentrationsabhängigkeit ist beim Vergleich der Ergebnisse der Gruppen IV und V festzustellen.

Tabelle I

3. Toxizität

Die akute Toxizität der Testverbindung wurde an weiblichen und männlichen Mäusen geprüft, denen die Verbindung oral und intravenös verabreicht wurde.

Testverfahren

Verwendete Tiere:
Zur oralen Verabreichung 6 Wochen alte männliche ddy-Mäuse, zur intravenösen Verabreichung 6 Wochen alte weibliche ICR-Mäuse.
Konzentration der Testverbindung: 13 bis 15% (G/V in entsalztem Wasser).
Anzahl der Tiere pro Dosierungshöhe: 10 Mäuse.
Beobachtungszeitraum: 14 Tage.

Die Ergebnisse sind in Tabelle II zusammengefaßt. Sie zeigen die extrem niedrige Toxizität der Testverbindung.

Tabelle II

Claims

1. N-Acetylneuraminsäure-Nucleosid-Derivate der allgemeinen Formel I, in der R¹ ein Wasserstoffatom, einen niederen Alkylnosinrest oder einen gegebenenfalls mit einem niederen Alkylnosinrest substituierten Aralkyl- oder Arylrest, R² einen Inosinrest oder ein Derivat davon oder einen Uridinrest oder ein Derivat davon und R³ und R⁴ unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom oder eine Acetylgruppe bedeuten.

2. Verbindungen nach Anspruch 1, wobei R² eine 5-Fluor-2′,3′-isopropylidenuridingruppe und R³ und R⁴ Acetylgruppen bedeuten.

3. Verbindungen nach Anspruch 1, wobei R¹ eine Methylgruppe, R² eine 2′,3′-acetylinosingruppe und R³ und R⁴ Acetylgruppen bedeuten.

4. Verbindungen nach Anspruch 1, wobei R¹ eine Methylgruppe, R² eine 2′,3′-Isopropylidenuridingruppe, R³ ein Wasserstoffatom und R⁴ eine Acetylgruppe bedeuten.

5. Verbindungen nach Anspruch 1, wobei R¹ eine Methylgruppe, R² eine 2′,3′-Isopropylidenuridingruppe und R³ und R⁴ Acetylgruppen bedeuten.

6. Verfahren zur Herstellung der N-Acetylneuraminsäure-Nucleosid- Derivate der allgemeinen Formel I, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung der allgemeinen Formel II, in der R³ und R⁴ die vorstehend angegebenen Bedeutungen haben und R⁵ einen niederen Alkylrest oder einen gegebenenfalls mit einem niederen Alkylrest substituierten Aralkyl- oder Arylrest und hal ein Halogenatom bedeuten, mit Inosin oder einem Derivat davon oder mit Uridin oder einem Derivat davon in einer Königs- Knorr-Reaktion umsetzt und gegebenenfalls das erhaltene Produkt deacetyliert.

7. Verfahren gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung der allgemeinen Formel II einsetzt, in der R⁵ eine Methylgruppe darstellt.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man 5-Fluor-2′,3′-isopropylidenuridin, 2′,3′-Isopropylidenuridin oder 2′,3′-Di-O-acetylinosin einsetzt.

9. Verwendung der N-Acetylneuraminsäure-Nucleosid-Derivate gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 zur spezifischen Beeinflussung des Immunsystems.