DE2625835A1 - Arzneimittel auf basis von adenosin-5'-thioaethern - Google Patents

Description

oo 9c O O C

Patentanwälte Dipl.-Ing. F. ¥iickmann,

Dipl.-Ing. H."Wfickmann, Dipl.-Phys. Dr. K. Fincke Dipl.-Ing. F. A.Teickmann, Dipl.-Chem. B. Huber

8 MÜNCHEN 86, DEN POSTFACH 860 820

MÖHLSTRASSE 22, RUFNUMMER 48 39 21/22

<983921/22;

AGENCE NATIONALE DE VALORISATION DE LA RECHERCHE (ANVAR)

13, rue Madeleine Michelis,

92522 NEUILLY SUR SEINE FRANKREICH

ARZNEIMITTEL AUF BASIS VON ADENOSIN-5-THIOÄTHERN

Die Erfindung betrifft Arzneimittel auf Basis von Adenosin-5-thioäthern mit insbesondere antiviraler und antitumoraler Wirksamkeit.

Die Methylierung von Proteinen, Nucleinsäuren und zahlreichen Metaboliten ist eine bekannte Reaktion, in deren Verlauf spezifische Enzyme, Methylasen oder Methyltransferasen genannt, die Übertragung einer Methylgruppe bewirken, die vom S-Adenosylmethionin an genau bestimmten Substratstellen, insbesondere bei Stickstoffbasen oder Zuckern, die in die Struktur der Nucleinsäuren eingebaut sind, geliefert wird.

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Kürzlich wurde gezeigt, daß tumoröse Gewebe bedeutendere Mengen an methylierten Nucleinbasen enthalten als normale Gewebe. Insbesondere wurde festgestellt, daß es einen Zusammenhang zwischen der Hypermethylierung von Nucleinsäuren und der Transformation normaler Zellen in bösartige Zellen gibt. Im Zusammenhang mit diesem Phänomen weiß man seit kurzem, daß die Matrizen-RNA bestimmter tumorerzeugender Viren methylierte Basen enthält.

Man weiß, daß sich die Forscher schon für das Studium der Steuerung von Methylasen, insbesondere in vitro, durch natürliche oder synthetische Inhibitoren interessiert haben. Ein bekannter natürlicher Inhibitor ist 5'-S-Adenosyl-L-homocystein-1', im Folgenden mit der Abkürzung SAH bezeichnet, das während der Übertragungsreaktion der vom S-Adenosylmethionin gelieferten Methylgruppe gebildet wird; das SAH ist selbst ein sehr wirksamer Methyltransferasen-Inhibitor, vor allem in vitro. Dieselben Forscher hatten schon die Idee, die Synthese einer bestimmten Anzahl von S-Adenosyl-homocysteinanalogen zu verwirklichen und deren inhibitorische Wirksamkeit im Vergleich zu den Methyltransferasen in vitro zu untersuchen. Alle bereits beschriebenen synthetischen Inhibitoren haben sich unter denselben Bedingungen als viel weniger aktiv als das SAH erwiesen, wenn nicht gar als inaktiv.

Die Erfindung beruht auf der Entdeckung, daß zumindest einige bestimmte SAH-Analoge eine Wirksamkeit besitzen, die einer Inhibierung von Methylasen in vivo gleichgesetzt werden zu können scheint, insbesondere von spezifischen oder nichtspezifischen Methylasen onkogener Viren. Diese Entdeckung war umso weniger zu erwarten, als das unter den selben Bedingungen untersuchte SAH empfindlich inaktiv oder inaktiviert ist, vielleicht durch Zersetzung oder intrazelluläre Hydrolyse.

Die Erfindung betrifft somit die Verwendung von Verbindungen der allgemeinen Formel I als Inhibitoren der onkogenen Gewebs-

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transformation, als Inhibitoren viraler Infektionen, besonders der durch onkogene Viren verursachten Infektionen, und als Inhibitoren der durch Mitogene hervorgerufenen Zellteilungen, wobei in der allgemeinen Formel I

(I)

X ein Wasserstoffatom oder eine Benzoylgruppe und

R eine -(CH₉) -CH^ ^R1 -Gruppe,

ρ
^R2

R. und R₂ jeweils ein Wasserstoffatom, eine Kohlenwasserstoffgruppe mit 1 bis 7 C-Atomen, OH, SH, CH₃OH, CH₃SH, COOH, COCH₃, NH₂, NHCOCH₃ oder SCH₃ oder R₁ und R₃ zusammen mit der CH-Gruppe, an die sie gebunden sind, einen Phenyl- oder Pyridyl-Ring bedeuten, oder R₁ und R₂ durch eine mit einer Doppelbindung an das Kohlenstoffatom derselben CH-Gruppe gebundene Methylengruppe ersetzt sein kann, und
η die Zahl 0 oder 1 bedeutet.

Bevorzugt sind diejenigen Verbindungen der allgemeinen Formel I, worin

X ein Wasserstoffatom,

R eine -(CH₉) -CH^^R1 -Gruppe,

^R2

R₁ ein Wasserstoffatom, eine Kohlenwasserstoffgruppe mit 1 bis 7 C-Atomen, OH, SH, CH₂OH, CH₃SH, COOH, COCH₃, NH₃ oder NHCOCH₃,

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— A -

R₂ ein Wasserstoffatom oder OH, SH, CH₂OH, CH₂SH, COOH, COCH₃, NH₂ oder NHCOCH₃ oder

R₁ und R₂ zusammen mit der CH-Gruppe, an die sie gebunden sind, einen Phenylring und

η die Zahl 0 oder 1

bedeuten.

Besonders wirksam als Inhibitoren onkogener Viren, die in den tumorösen Geweben gegenwärtig sind, sind diejenigen Verbindungen, in denen R eine Alkylgruppe mit 1 bis 5 C-Atomen bedeutet und die gegebenenfalls mindestens eine der folgenden funktionellen Gruppen enthalten: -NH₂, -SH, -SCH₃, -COOH.

Typische Beispiele für solche Inhibitoren sind diejenigen, worin R eine der folgenden Gruppen ist:-CH₂-CH₂-NH₂, -CH₂-CH₂-SH, -CH₂-CH-NH₂.
COOH

Besonders interessante Produkte stellen die Derivate der folgenden Formel dar:

.C

Worin X ein Wasserstoffatom oder eine Benzoylgruppe bedeutet.

Die Verbindung, in der X ein Wasserstoffatom ist (sie wird im Folgenden mit der Abkürzung SIA bezeichnet), ist durch eine besonders hohe inhibitorische Wirksamkeit bei gleichzeitig

— 5 —

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ausgesprochener Unschädlichkeit gekennzeichnet. Dasselbe trifft für das entsprechende N(6)-Benzoyl-derivat zu.

Weitere Beispiele für Inhibitoren sind die Verbindungen, in denen R eine der folgenden Bedeutungen zukommt:

- CH₃

- CH₀
Z.

- CH₂ - CH₂ - CH₃

- CH₂ - CH₂ - CH₂ - CH₃

^}6 - ^CH3

- CH(NH₂) - COOH

- CH₂ - CH₂ - NHCOCH₃

- CH₂ - CH₂ - CH(NHCOCH₃) - COOH

- CH₂ - CH₂OH

- CH₂ - CH₂ - COOH

- CH₂ - CH(OH) - CH₂OH

- m - Pyridyl

— Ott _ O — OTJ

- CH₂ - CH(NH₂) - COOH(D-Isomeres)

- CH(CH₃) - CH₂ - CH₃

CH₂OH

- CH₂ - CH(OH) - CH₂

- CH₂ - CH = C

Die inhibitorische Aktivität der obengenannten Verbindungen äußert sich in einer Verhütung der Transformation normaler Zellen in bösartige Zellen oder, falls diese sich bereits entwickelt haben, in einer Unterbrechung ihrer Vermehrung. Man beobachtet übrigens, daß die erfindungsgemäßen Wirkstoffe auch eine Verlangsamung der Vermehrung normaler Zellen induzieren

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können. Es ist demgegenüber bemerkenswert, wie sich aus den Ergebnissen der pharmakologischen Versuche ergibt, die weiter unten beschrieben werden, daß dieser Effekt reversibel insoweit ist, als er die Entwicklung normaler Zellen betrifft, aber irreversibel, soweit er die bösartigen Zellen betrifft.

Diese Eigenschaften machen aus den erfindungsgemäßen Verbindungen Wirkstoffe von großem Wert, die zur Herstellung von Arzneimitteln zur Verhütung oder Behandlung maligner Tumore und viraler Infektionen verwendet werden können.

Die meisten Verbindungen der oben wiedergegebenen allgemeinen Formel sind bereits beschrieben worden. Auch sind bereits mehrere Verfahren zur Herstellung dieser Verbindungen beschrieben worden.

Es sei daran erinnert, daß diese Verbindungen insbesondere auf folgende Weise erhalten werden können:

- durch Ersetzen eines p-Toluolsulfonat-Rests in 5'-Stellung des 2', 3'-O-Isopropyliden-5'-0-ptoluolsulfonyl-adenosin mit Hilfe eines Thioalkoholats der Formel RSH, in der R die obengenannte Bedeutung besitzt, insbesondere in Dimethylformamid oder flüssigem Ammoniak (Verfahren nach Baddiley),

- durch direkte Halogenierung am 5'-C-AtOm der Ribose des Adenosins durch Thionylchlorid in Hexamethylphosphorsäure-triamid, wobei das erhaltene 5'-Desoxy-5'-chloradenosin anschließend mit dem entsprechenden Thioalkoholat RSH in einer wäßrigen Natriumhydroxidlösung umgesetzt wird (Verfahren nach Kikugawa). Derartige Verfahren

— 7 —

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_ -η

wurden in der Dissertation von Michel Legraverend in Erinnerung gerufen und entwickelt. (Die Dissertation wurde am 1Ο.2.1975 im Centre d'Orsay der Universität Paris-Süd verteidigt und ist betitelt: "Etude de la methylation enzymatique des acides ribonucleiques de transfert, inhibition in. vitro

2
d'une N guanine methy!transferase et synthese de nouveaux inhibiteurs".

Bestimmte dieser Verbindungen sind neu, wie die, in der R die der folgenden Formel

- CH₂ -S- CH₃

entsprechende Gruppe bedeutet (5'-S-Desoxy(methylthiomethylthio)adenosin).

Dieses Produkt, das ausgehend von 5'-Desoxy-5'-chloradenosin unter den oben beschriebenen Bedingungen hergestellt wurde, schmilzt bei 98 bis 99°C.

Dasselbe gilt für die Verbindung, in der R die Gruppe -CH(CH₃)-CH₂-CH₃ bedeutet, die bei 9 3 bis 95°C schmilzt.

Das N(6)-Benzoyl-SIA kann schließlich wie folgt hergestellt werden:

Die spezifische Benzoylierung am Stickstoffatom 6 wird nach der von Ranganathan et al. beschriebenen Methode (J. Org. Chem. 39_, S. 290 (1974)) durchgeführt.

10 mMol destilliertes Benzoylchlorid werden tropfenweise zu einer Lösung von etwa 3 mMol SIA in 30 ml Pyridin bei 0 C

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hinzugefügt. Die Lösung wird zwei Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt, anschließend gibt man 40 ml NaONH- hinzu. Nach einer Stunde in basischem Medium wird das Reaktionsgemisch bei 0 C mit Essigsäure angesäuert. Nach dem Abdampfen der Lösungsmittel wird das Produkt mit Chloroform extrahiert. Die organische Phase wird nacheinander mit Natriumbicarbonat, 1N-SaIzsäure und Wasser gewaschen, anschließend über MgSO. getrocknet und eingedampft. Man erhält ein chromatographisch reines Produkt: Rf = 0,82 (Chloroform/Methanol 8/2), Fp: 210 bis 214°C.

Weitere Merkmale der Erfindung ergeben sich aus der folgenden Beschreibung der mit den oben definierten Verbindungen durchgeführten pharmakologischen Versuche. Im Verlauf dieser Beschreibung wird auf die Figuren 1 bis 5 der Zeichnung Bezug genommen werden, die schematisch die Wirkungen der genannten Verbindungen unter Bedingungen, die später erläutert werden, wiedergeben.

1. Wirkung des SIA und des SAH auf das Wachstum der Fibroblasten von gesunden und durch den Rous-Sarkorn-Virus infizierten Hühnerembryonen

a) Wirkungen des SIA und des SAH auf das Wachstum der Fibroblasten normaler Huhnerembryonen.

Diese Wirkung wird unter den folgenden Bedingungen untersucht. Fibroblasten-Zellen von Embryonen werden auf HAM F-10 Kulturmedium (beschrieben im Aufsatz von R.G. HAM, Exp. Cell. Res., 29_, S. 515 bis 526 (1963)) gesät, und zwar in Falcon-Schalen von 60 oder 35 mm Durchmesser, in einer Menge von 3 χ 10 . Die Zellen haften am Boden der Schale. Jedesmal, wenn eine Zählung durchgeführt werden soll, werden die Zellen mit Hilfe einer 0,12%igen Trypsinlösung abgetrennt. Die Zählung wird unter dem

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Mikroskop mit Hilfe eines Hämozytometers durchgeführt.

Der verwendete Inhibitor wird zu Beginn der Versuche in das Nährmedium in bestimmten Versuchskonzentrationen eingegeben. Das Nährmedium wird mit den Inhibitoren am 2. und 4. Tag erneuert. Am 5. Tag entfernt man die Inhibitoren durch wiederholte Erneuerung des Nährmediums .

Die Kurven 1, 2 und 3 der Fig. 1 geben die Vermehrung der Zellen (auf der Ordinate durch die Zahl N der Zellen ausgedrückt) in Abhängigkeit von der Zeit(auf der Abszisse in Tagen ausgedrückt) wieder, und zwar in Vergleichskulturen (Kurve 1), in Gegenwart von SAH in einer Konzentration von 1 mMol (Kurve 2) und in Gegenwart von SIA in einer Konzentration von 1 mMol (Kurve 3).

Fig. 1 zeigt, daß SIA und SAH das Wachstum normaler Zellen verlangsamen. Diese Wirkung ist reversibel, sogar nach 5 Tagen. Das Wachstum wird, sobald der Inhibitor entfernt wird, tatsächlich schnell wieder aufgenommen.

b) Inhibierung der virus-induzierten Zelltransformation durch Adenosin-5'-thioäther.

Untersuchtes System: Hühnerembryonen-Fibroblasten, infiziert durch den Rous-Sarkom-Virus (RSV).

Als Kulturmedium wird HAM F-10, das 5% Kälberserum enthält, verwendet.

Fibroblastenzellen von Hühnerembryonen werden in das obengenannte Nährmedium in Falcon-Schalen von 35 mm Durchmesser in einer Menge von 10 Zellen pro Schale

- 10 -

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gesät. Diese Kulturen werden mit einer verdünnten
Virussuspension infiziert, wodurch 60 bis 100 Herde
transformierter Zellen pro Schale erhalten werden können- Der Inhibitor wird für eine Dauer von 48 Stunden
entweder sofort nach der Infizierung (Testreihe A) oder 2 und 4 Tage nach der Infizierung (Testreihen B und C) zugefügt. Nach 48-stündiger Kontaktzeit wechselt man
das Nährmedium, um den Inhibitor zu entfernen, und
zählt die gebildeten Herde 7 Tage später. Während dieser Zeit wird das Nährmedium in gleichen Zeitabständen erneuert.

Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle I wiedergegeben. Die linke Spalte enthält die Inhibitoren und
die angewandten Konzentrationen dieser Inhibitoren.
Rechts sind jeweils die Anzahl der Herde und die Prozentsätze der beobachteten Inhibierung für die Testreihen A, B und C angegeben.

TABELLE I

Wirkung von SIA und SAH auf die virus-induzierte (RSV) Transformation von Hühnerembryonenfibroblasten

Blindprobe (Vergleich) SAH 1,0 mMol SIA O,5 mMol SIA 1,0 mMol

Anzahl der Herde

72

58

23

% Inhibierung

Testreihe A

11 -

60 985 2/0 952

	(Vergleich)	Anzahl der Herde	% Inhibierung	y Test reihe B
Blindprobe	1,0 mMol	110
SAH	0,5 mMol	112	0 1
SIA	1,0 mMol	60	45
SIA	(Vergleich)	6	95 J	Test reihe C
Blindprobe	1,0 mMol	72
SAH	0,5 mMol	60	17 >
SIA	0,1 mMol	2	97
SIA	0	100 Λ

Die Prüfung dieser Tabelle läßt hervorstechen, daß das SIA ein sehr wirksamer Inhibitor der onkogenen Transformation von Hühnerembryonenfibroblasten ist. Bei einer Konzentration von 1 mMol inhibiert SIA die bösartige Transformation vollständig, und zwar auf irreversible Weise. Diese Inhibierung bleibt mindestens während 7 bis 8 Tagen irreversibel.

Das zum.Vergleich untersuchte SAH, natürlicher Inhibitor der Transmethylasen, unterdrückt die Transformation kaum, wahrscheinlich wegen seiner Zersetzung (intrazelluläre Hydrolyse). Die folgende Tabelle gibt die mit Analogen des SIA erhaltenen Ergebnisse wieder.

In dieser nachstehenden Tabelle II sind die Ergebnisse zusammengefaßt, die mit der oben angegebenen allgemeinen Formel entsprechenden Analogen erhalten wurden. Sie sind in der Tabelle durch Angabe ihrer Gruppe R gekennzeichnet. Diese Tabelle gibt darüber hinaus wieder:

- die Konzentration jedes verwendeten Inhibitors,

- die Zeit, während der der Inhibitor mit der Kultur in

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- 12 -

Berührung stand ,

- den. Prozentsatz der Inhibierung der onkogenen Transformation von Hühnerembrvonenfibroblasten.

TABELL

TT

Wirksamkeit verschiedener Analoger auf mit dem Rcus-Virus infizierte Hühnerembryonenfibroblasten.

Ana	log	e s	Il	— S "~ OH q.	Konzen	mMol	Kontakt	Stdn.	% Inhibierung
X	R			tration	mMol	zeit	Stdn.	d. Transform.
H	- CH3		0,5	mMol	24	Stdn.	70
H	Il		0,5	mMol	48	Stdn.	95
H	- (CH	2}2 - CH3	0,5	mMol	24	Stdn.	44
II	Il		0,5	mMol	48	Stdn.	83
H	- (CH	2)3 - CH3	0,5	mMol	24	Stdn.	62
			0,5	mMol	48	Stdn.	86
H	CH2 -	CH,- NH, Ct £*	1	mMol	48	Stdn.	87
H	CH2 -	CH2- SH	0,5	mMol	24	Stdn.	26
Il	Il		0,5	mMol	48	Stdn.	84
I!	Il		1	mMol	48	Stdn.	96
H	- CH0	,COOE - CH - NH2	1	mMol	48	Stdn.	76
H	- CH2	- CH2- COOH	1	mMol	48	Stdn.	58
H	- (CH	2>6-CH3	0,1	mMol	48	Stdn.	33
H	~"2	- C6H5	0,1	mMol	48	Stdn.	36
H			1	mMol	48	Stdn.	98
Il		0,5	0,25 mMol	48	Stdn.	93
H	- CH2	0,5	48	100
Il		48	95

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-13-

Ana	1 o g e s	Konzen-	tion	Kontakt- %	Inhibierung
χ	R	trai	itiMol	zeit d.	Transform.
H	-CH2-CH(NH2)-COOH	0,5		4 8 Stdn.	70
	(D-Isomer)		mMol
H	-CH(CH3)-C3H5	0,5	inMol	48 Stdn.	99
H	-CH2-CH(OH)-CH2OH	0,5	mMol	48 Stdn.	70
H	-CH2-CH=CH2	0,5	mMol	2 4 Stdn.	99
-CO-C^H1-	-CH2-CH-(CH3)2	0,5	sofortiger Abbruch	99

Die Tabelle II bringt die Tatsache ans Licht, daß alle untersuchten Verbindungen, sine signifikante Inhibierungswirkung auf die onkogene Transformation von Hühnerembryonenfibroblasten ausüben.

2. Wirkung von S-Isobutyladenosin auf die durch den Murin-Sarkom-Virus (M-MuSV) verursachte onkogene Transformation von Mäusezellen.

Die Versuche wurden anhand von Mäusefibroblastenzellen (MLg-ZeIlen) durchgeführt, die am Vorabend auf HAM-Nähr-

4
medium in Petrischalen (5 χ 10 Zellen pro Petrischale mit 35 mm Durchmesser) gesät wurden; diese Zellen wurden 2 Stunden lang mit dem M-MuSV-Virus in Berührung gebracht, danach wieder in das HAM-Medium mit oder ohne Testverbindung, in diesem Fall dem SIA, gebracht. Die Zellen bleiben 24 oder 48 Stunden lang in Kontakt mit dem Inhibitor. Der Inhibitor wird durch Wechsel des Nährmediums entfernt, und die 3 Tage nach der Entfernung des Inhibitors gebildeten Herde werden gezählt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle III wiedergegeben, in der die angewandten Inhibitordosen, die Kontaktzeit und die Anzahl der transformierten Herde aufgeführt sind.

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TABELLE III

	SIA	Kontaktzeit	Anzahl trans formierter Herde
	(Vergleich)	24 Stdn.	ineinanderfließende Herde
O	mMol	24 Stdn.	148
2			139
	(Vergleich)	48 Stdn.	ineinanderfließende Herde
O	5 mMol	48 Stdn.	218
ο,			188
	mMol	48 Stdn	18
2			35

Die Tabelle zeigt die Vermehrung der bösartigen Zellen in der Vergleichskultur, während SIA die bösartige, durch den Murin-Sarkom-Virus hervorgerufene Transformation von Mäusezellen sehr wirksam inhibiert.

3. Einfluß des SIA auf die makromolekulare intrazelluläre Synthese

Die vorstehend beschriebenen Versuche konnten die Tatsache aufzeigen, daß das SIA die Wirkung besitzt, die Zellteilung zu stoppen, wobei diese Wirkung zugleich besonders nachdrücklich und in bezug auf Zellen, die eine onkogene Transformation erlitten haben, irreversibel ist. Diese Wirkung kann auch durch die Untersuchung der Einwirkung des Inhi-

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_ 1 c _

bitors auf die makromolekulare Synthese augenscheinlich gemacht werden. Diese Einwirkung ist auf Kulturen normaler Zellen und transformierter Zellen unter den oben unter 1. beschriebenen Bedingungen offenkundig gemacht worden, und zwar bei der Untersuchung der Wirkung der Adenosin-5'-thioäther auf das Wachstum von Hühnerembryonenfibroblasten durch Isotopenmarkierung dieser Kulturen, nämlich

3 3 3

durch Einverleibung von H-Leucin, H-Thymidin und H-Uridin in normale und transformierte Zellen verschiedener Kulturen, sowohl in Vergleichszellen als auch in in Gegenwart von SIA gezüchtete Zellen während 24 und 48 Stunden.

Die Ergebnisse dieser Versuche bilden den Gegenstand der grafischen Darstellung der Fig. 2, die die Prozentsätze der Einverleibung in die Zellen verschiedener Kulturen wiedergibt, und zwar

- des H-Leucins (Ergebnisse zusammengefaßt unter der Klammer A),
des H-Thym:
Klammer B),
des ³H-Urid:
Klammer C).

- des H-Thymidins (Ergebnisse zusammengefaßt unter der

"JIU

- des H-Uridins (Ergebnisse zusammengefaßt unter der

Die mit den Klammern η zusammengefaßten Ergebnisse betreffen Kulturen normaler Zellen, die unter den Klammern t zusammengefaßten betreffen Kulturen transformierter Zellen.

Die sich vertikal erstreckenden ausgezogen gezeichneten Kästchen (deren Länge dem Prozentsatz der Einverleibung der Markierungssubstanz proportional ist), die mit der Bezugsziffer 1 bezeichnet sind, betreffen Vergleichskulturen ohne Inhibitor; die voll ausgezogenen Kästchen, die mit der Bezugsziffer 2 bezeichnet sind, betreffen die Prozentsätze der Einverleibung der Markierungssubstanz in Zellen,

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die in Gegenwart von 1 itiMol SIA 24 Stunden lang gezüchtet wurden, und die Kästchen mit der Bezugsziffer 3 geben die Prozentsätze der Einverleibung der Markierungssubstanz in Zellen wieder, die in Gegenwart von 1 mMol SIA 48 Stunden lang gezüchtet wurden.

Die gestrichelt eingerahmten Kästchen geben die Prozentsätze der Einverleibung der Markierungssubstanz wieder, wobei diese den Kulturen 24 Stunden nach der Entfernung des Inhibitors in einer Konzentration und mit Kontaktzeiten, wie sie oben angegeben wurden, zugegeben wurde.

3 Die Fig. 2 macht deutlich, daß die Einverleibung von H-

3 3

Leucin, H-Thymidin und H-Uridin in normale Zellen in Gegenwart von SIA in gleicher Weise empfindlich inhibiert wird. Dagegen ist diese Wirkung reversibel. Man stellt tatsächlich eine Wiederaufnahme der makromolekularen Synthesen fest, sobald der Inhibitor entfernt wird.

In Gegenwart des Inhibitors stellt man fest, daß dieselben Dosen an SIA eine viel stärkere Inhibierungswirkung auf die Entwicklung transformierter Zellen ausüben als auf die normaler Zellen,und vor allem, daß die Aufrechterhaltung des Kontakts des Inhibitors mit transformierten Zellen während einer ausreichend langen Zeit, besonders während einer Zeit von 48 Stunden, eine irreversible Inhibierung jeder Einverleibung in die transformierten Zellen mit sich bringt und damit die makromolekularen Synthesen (besonders der Proteine, der Desoxyribonucleinsäuren und der Ribonucleinsäuren, denen die drei verwendeten Markierungssubstanzen, nämlich

3 3 3

das H-Leucin, das H-Thymidin und das H-Uridin entsprechen) stoppen und somit folglich die Zellteilung stoppen.

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4. Bestimmung der antlmitogenen Eigenschaften der Adenosin-5'-thioäther

Mit der Beschreibung der folgenden Versuche sollen die antimitogenen Eigenschaften der Adenosin-5'-thioäther gezeigt werden, für die SIA eine stellvertretende Verbindung ist. Die antimitogene Wirkung der untersuchten Verbindung ergibt sich aus ihrer Fähigkeit, die mitogene Wirkung bekannter Verbindungen, die diese Wirkung in bezug auf Lymphozyten-Kulturen ausüben, zu inhibieren. Gegenstand der grafischen Darstellungen der Fig. 3, 4 und 5 sind die Ergebnisse, die in bezug auf Milzlymphozyten von Mäusen, Milzlymphozyten von Kaninchen und Humanlymphozyten erhalten wurden.

Die Lymphozytenkulturen wurden nach der im Aufsatz von C. Bona et al., "The Journal of Immunology", Vol. 112, S. 2028 (1974), beschriebenen Methode angelegt, und zwar in Gegenwart der unten genannten mitogenen Mittel und der zu untersuchenden Verbindung, hier also dem SIA, bei zwei verschiedenen Konzentrationen, 0,1 mMol und 0,3 mMol, während 48 Stunden im Falle der Milzlymphozyten von Mäusen (Fig. 3), 72 Stunden im Falle der Milzlymphozyten-von Kaninchen (Fig. 4) und 120 Stunden im Falle der Humanlymphozyten (Fig. 5). In jedem dieser Fälle werden Kulturen derselben Lymphozyten in Gegenwart mitogener Mittel allein (Vergleichskulturen) angelegt. Die mitogene oder, je nach dem Fall, antimitogene Wirkung der mitogenen Mittel bzw. des SIA wird durch die Radioaktivität der Lymphozyten bestimmt, die sich aus der Einverleibung von Tritium-markiertem Thymidin in dieselben ergibt.

Als mitogene Mittel wurden die folgenden verwendet:

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Con A: Concavaline A: Mitogen T bei der Maus und dem

Kaninchen, T und B beim Menschen. PHA: Phytohämagglutinin: Mitogen T bei der Maus und dem Kaninchen, T und B beim Menschen.

ALS: Antilymphozytäres Serum: Mitogen T beim Menschen. PPD: Tuberkulin: spezifisches Mitogen der T-Zellen in Fällen, wo das Versuchsobjekt vorher durch

Mykobakterien sensibilisiert worden ist. NWSM: als wasserlösliches mitogenes Mittel verwendeter Extrakt aus Nocardia-Zellen: Mitogen der B-Zellen

bei der Maus und dem Kaninchen. Anti-B,: Gegen die genetischen Determinanten der leichten Immunoglobulinkette des Kaninchens gerichtetes Serum, von B-Zellen des Kaninchens getragen: es

handelt sich um ein Mitogen B des Kaninchens. PG: Peptidoglykan von E. coli: Mitogen B für die Maus

und das Kaninchen.
LPS: Lipopolysaccharid von Salmonella enteridis: Mitogen

B für die Maus.
Lip. A: Lipid A oder mitogener Wirkstoff des LPS.

Die Dosen der in jedem der beschriebenen Versuche verwendeten antimitogenen Mittel, ausgedrückt in Y"~gramm (y-) oder, sofern es ALS oder das Anti-B.-Serum betrifft, in der Verdünnung, sind in der untenstehenden Tabelle wiedergegeben, und zwar jeweils im Zusammenhang mit den Kulturen von Milzlymphozyten der Maus, Milzlymphozyten des Kaninchens und Humanlymphozyten:

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Mi Izlymphozyten	3	Γ	MiIzlymphozyten	t	Humanlympho-	5 r
der Maus	ο,	■2Ϋ·	des Kaninchens		zyten	1 t
Con A	-		5	γ-	1/100
PHA	-		1		io if-
ALS	10	γ-	-		loo Y
PPD	-		-	-
NWSM	50	If	50	-
Anti-B4	10	γ-	1/50	-
PG	10	t	100	-
LPS		-
Lip. A	-

Die Ergebnisse sind in den Figuren 3 bis 5 für jedes ausgewählte mitogene Mittel zusairunengefaßt. Die Länge der dort gezeichneten Kästchen ist der gemessenen Radioaktivität R (Stöße pro Minute multipliziert mit 10 ) proportional. Der mit ausgezogenen Strichen einfach umgrenzte Bereich entspricht den in Gegenwart eines mitogenen Mittels allein erhaltenen Ergebnissen, der mit ansteigenden Strichen schraffierte Bereich entspricht den in Gegenwart des mitogenen Mittels und des SIA in einer Konzentration von 0,1 mMol erhaltenen Ergebnissan und der mit waagerechten Strichen schraffierte Bereich entspricht den in Gegenwart des mitogenen Mittels und des SIA in einer Konzentration von 0,3 mMol erhaltenen Ergebnissen.

Die in jeder Figur vorhandene durchgezogene waagerechte Linie entspricht der Aufnahme der Markierungssubstanz in Vergleichskulturen, die weder ein mitogenes Mittel noch SIA enthalten. Außerdem wurden die aufgenommenen, gemessenen Radioaktivitäten der Lymphozytenkulturen in Gegenwart des SIA alleine wiedergegeben. Die entsprechenden Ergebnisse sind über der Abkürzung SIA, die sich in jeder der Fig. 3 bis 5 wiederfindet, aufgetragen.

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Die Zeichnung macht die beträchtlichen antimitogenen Eigenschaften des SIA deutlich. Man stellt eine hervorragende Inhibierung der mitogenen Wirkung der ausgewählten mitogenen Mittel fest, und zwar in den meisten Fällen bei einer SIA-Konzentration von 0,1 mMol. Sie ist in allen Fällen bei einer Konzentration von 0,3 mMol sehr kräftig, woraus sich ergibt, daß die Adenosin-5'-thioäther nicht nur die Zellteilung inhibieren, sondern auch der Wirkung der mitogenen Mittel wirksam entgegentreten.

5. Toxizitätsbestimmungen

a) akute Toxizität

Drei Gruppen aus je 5 Mäusen mit einem Gewicht von 20 bis 25 g wurden untersucht. Diesen Mäusen wurde in einer einzigen intraperitonealen Injektion SIA in Suspension in physiologischem Serum verabreicht. Die den Mäusen der ersten Gruppe verabreichten Dosen waren 100 mg/kg, an diejenigen der zweiten Gruppe wurden 200 mg/kg und an diejenigen der dritten Gruppe 500 mg/kg verabreicht.

Die Mäuse wurden nach 1 Stunde, 2 und 24 Stunden untersucht. Die Sterblichkeit ist, sogar nach mehreren Wochen , 0.

b) chronische Toxizität

Diese Versuche wurden an 5 Vergleichsmäusen und 15 behandelten Mäusen durchgeführt.

Die Vergleichstiere erhielten physiologisches Serum auf intraperitonealem Wege in einer Menge von 1 ml/10 g Gewicht. Die übrigen Mäuse erhielten 1 ml einer Suspension,

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die 1 mg SIA in physiologischem Serum enthielt. Die Injektionen wurden im Rhythmus von 30 Injektionen in 2 Monaten gemacht.

Nach der 28. Injektion hatte man eine einzige tote Maus herauszunehmen, vermutlich mehr wegen eines durch die Injektion verursachten Traumas als wegen des Inhalts der injizierten Suspension.

Diese Ergebnisse zeigen die bemerkenswerte Unschädlichkeit des SIA bei der Maus.

Die Adenosin-5 '-thioäther stellen wertvolle Wirkstoffe für Arzneimittel zur Verhütung oder Behandlung bösartiger Tumore und viraler Infektionen dar. Ihre starken antimitogenen Eigenschaften machen sie auch zu wertvollen Wirkstoffen für die Herstellung von Arzneimitteln für die Behandlung oder Verhütung von Leukämien und Myelomen. Die Erfindung betrifft somit pharmazeutische Zusammensetzungen, die Verbindungen wie die oben definierten enthalten, insbesondere in wirksamer Dosis in Verbindung mit einem pharmazeutischen oder physiologisch verträglichen Trägerstoff. Die Erfindung betrifft insbesondere Mittel, in denen die aktiven Verbindungen zusammen mit einem festen oder flüssigen, physiologisch verträglichen und zur oralen Verabreichung geeigneten Trägerstoff oder zusammen mit einem zur rektalen Verabreichung geeigneten Trägerstoff vorliegen.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden diese Zusammensetzungen auf parenteralem Wege verabreicht. Die Erfindung betrifft aber auch und ganz besonders flüssige Zusammensetzungen, die mindestens eine der oben definierten Verbindungen in Verbindung mit einem flüssigen, sterilen und injizierbaren Trägerstoff enthalten.

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Es versteht sich, und dies geht auch schon aus dem Vorstehenden hervor, daß die Erfindung in keiner Weise auf die ausdrücklich genannten Applikations- und Verwirklichungsarten beschränkt ist; sie umfaßt vielmehr alle möglichen Varianten.

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Claims (9)

1. Patentansprüche

   Arzneimittel mit in vivo inhibitorischer Wirksamkeit bezüglich der onkogenen,virus-induzierten Zelltransformation, mit die Zellteilung von Zellen, die eine onkogene Transformation erlitten haben, verlangsamender Wirkung und mit antimitogener Wirksamkeit, enthaltend als Wirkstoff mindestens eine Verbindung der allgemeinen Formel (D

   (D

   OH OH

   worin X ein Wasserstoffatom oder eine Benzoylgruppe,

   S 1
   R eine -(CH₉) -CH '

   ^{z n K}2 -Gruppe,

   R₁ und R₂ jeweils 1 Wasserstoffatom, eine Kohlenwasserstoff gruppe mit 1 bis 7 C-Atomen, OH, SH, CH₂OH, CH₂SH, COOH, COCH₃, NH₂, NHCOCH₃ oder SCH₃ oder R₁ und R₉ zusammen mit der CH-Gruppe, an die sie gebunden sind, einen Phenyl- oder Pyridylring oder R₁ und R₉ zusammen eine mit einer Doppelbindung an das Kohlenstoffatom derselben CH-Gruppe gebundene Methylengruppe und
   η die Zahl 0 oder 1 bedeuten.
2. 2. Arzneimittel nach Anspruch 1, enthaltend als Wirkstoff mindestens eine Verbindung der allgemeinen Formel T, worin

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   X ein Wasserstoffatom,

   R eine -(CH₀) -CH. . „

   2'η \ -Gruppe

   2
   R.ein Wasserstoffatom, eine Kohlenwasserstoffgruppe mit 1 bis 7 C-Atomen, OH, SH, CH₂OH, CH₂SH, COOH, COCH₃, NH₂ oder NHCOCH₃,

   R₂ ein Wasserstoffatom oder OH, SH, CH₂OH, CH₂SH, COOH, COCH₃, NH₂ oder NHCOCH₃ oder

   R₁ und R₉ zusammen mit der CH-Gruppe, an die sie gebunden sind, einen Phenylring und

   η die Zahl 0 oder 1 bedeuten.
3. 3. Arzneimittel nach Anspruch 1, enthaltend als Wirkstoff mindestens eine Verbindung der allgemeinen Formel I, worin R eine Alkylgruppe mit 1 bis 5 C-Atomen, die gegebenenfalls mindestens eine der funktioneilen Gruppen -NH₂, -SH, -SCH₃, - COOH enthält, bedeutet.
4. 4. Arzneimittel nach Anspruch 3, wobei R eine der folgenden Gruppen bedeutet: -CH₂-CH₂-NH₂, -CH₂-CH₂-SH, -CH₂-CH-NH₂

   COOH
5. 5. Arzneimittel nach Anspruch 1, enthaltend als Wirkstoff S-Isobutyl-adenosin.
6. 6. Arzneimittel nach Anspruch 1, enthaltend als Wirkstoff N(6)-Benzoyl-S-isobutyl-adenosin.
7. 7. Arzneimittel nach Anspruch 1, enthaltend als Wirkstoff mindestens eine der Verbindungen der allgemeinen Formel I, worin R eine der folgenden Bedeutungen besitzt:

   - 25 -

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   - CH₃

   - CH₂ - CH₂ - CH₂ - CH₃

   - CH₂ - CH₂ - CH₂ - CH₂ - CH₃

   - ^(CH2>6 - ^CH3

   - ^CH2 - ^C6^H5

   - CH₀ - CH(NH₉) - COOH

   - CH₂ - CH₂ - NH₂

   - CH₂ - CH₂ - NHCOCH₃

   - CH₂ - CH₂ - CH(NHCOCH₃) - COOH

   - CH₂ - CH₂OH

   - CH₂ - CH₂ - COOH

   - CH₂ - CH(OH) - CH₂OH

   - m - Pyridyl

   - CH₂ - S - CH₃

   - CH₂ - CH(NH₂) - COOH(D-Isomeres)

   - CH(CH₃) - CH₂ - CH₃

   - CH₂ - CH(OH) - CH₂OH

   - CH₂ - CH = CH
8. 8. Arzneimittel nach einem der Ansprüche 1 bis 7, enthaltend als Wirkstoff mindestens eine Verbindung der allgemeinen Formel I in Verbindung mit einem pharmazeutisch verträglichen Trägerstoff.
9. 9. Arzneimittel nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet , daß der Trägerstoff injizierbar ist.

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