DE2411823A1

DE2411823A1 - Verwendung von 1,2,4-triazol-3-carboxamiden und -thiocarboxamiden als antivirenmittel

Info

Publication number: DE2411823A1
Application number: DE2411823A
Authority: DE
Inventors: Roland Kenith Robins; Joseph Theodore Witkowski
Original assignee: ICN Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Valeant Pharmaceuticals International Inc USA
Priority date: 1973-03-12
Filing date: 1974-03-12
Publication date: 1974-09-26
Also published as: CH602785A5; JPS58219115A; IL44394A0; FR2289520B1; JPS5029720A; JPS5915886B2; NO740841L; JPS5836960B2; ZA741610B; AR205339A1; AU6670874A; IE38987B1; PH12043A; IL52848A0; GB1427304A; FR2221138B1; FR2221138A1; ES424201A1; BE903675Q; BE812191A

Description

PHAEMACETJ(EICAi₁S, INC.
2727 Campus Drive, Irvine, Kalifornien,
V.St.v.Ao

Verwendung von 1,2,4-Triazol-3-car"boxamiden und -thiocarboxamiden

als Antivirenmittel

Priorität: V.St.v.A., S.N. 340 332 vom 12. 3. 1973

Die Erfindung betrifft die Verwendung von 1, 2,4-Triazol-3-car"boxamid und 1,2,4~Triazol-3-thiocar'boxamid und physiologisch
verträglichen Salzen hiervon als Antivirenmittel. Ferner "betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Synthese von 1-ß-D-Ribofuranosyl-1,2,4-triazol-3-car"boxamid.

In den letzten zehn Jahren wurde viele Uucleosidanaloge gefunden, welche gute Antitumor- und Antivirenaktivitäten aufweisen. Unter
den derzeit "bekannten synthetischen nucleosidischen Antivirenmitteln werden im allgemeinen 5-Joä-2'-deoxyuriäin (IDU), 9-ß-D-AraMnofuranosyladenin (Ara-A) und i-ß-D-AraMnofuranosylcytosin (Ara-C) als wichtig angesehen. Diese Verbindungen sind jedoch lediglich
gegen ein "begrenztes Spektrum von Viren aktiv, welches nicht
die Viren umfaßt, welche Krankheiten des Atmungssystems "beim
Menschen hervorrufen (Influenza und Schnupfen)_o Das einzige,
der Anmelderin "bekannte Eucleοsidanaloge das gegen solche
Atmungserkrankungen hervorrufende Viren aktiv

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ist, ist i-ß-D-Ribofuranosyl-i^^—triazol^-carboxamid, das in der US-Patentanmeldung 240 252 der Anmelderin vom 31. 3. 1972

besenrieben ist.

Es wurde nun gefunden, daß bestimmte Derivate dieser letztgenannten Verbindung auch, eine bemerkenswerte Aktivität gegenüber. solchen Viren besitzen, ferner wurde gefunden, daß die Triazolbasen bestimmter dieser Verbindungen, nämlich 1,2,4-Triazol-3-earboxamid und 1,2,4-Triazol-3-thiocarboxamid ebenfalls eine bemerkenswerte Antivirusaktivität gegenüber diesen das Atmungssystem befallenden Viren besitzen. Die chemische Struktur und Synthese einer o^e<ien Verbindung ist bereits früher beschrieben worden, siehe Latvijas PSR Zinatnu Akad. Vestis, Kim. Ser.,(i965), (2), S. 204-208 und Chem. Abst. 63 (1965), 13243.

Ferner wurde gefunden, daß 1,2,4-Triazol-3-carboxamid zur enzymatischen Umwandlung in 1-ß-D-Ribofuranosyl-1,2,4-triazol-3-carboxamid gebracht werden kann, wobei dies/genannte Nucleosid eine bemerkenswert wirksame Antivirusverbindung ist. Wie im folgenden noch gezeigt werden wird, kann die Triazolbase mit dem Enzym jpicleosidphosphorylase umgesetzt werden, um die angegebene Umwandlung herbeizuführen.

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Verbindungen der folgenden allgemeinen Struktur als Antivirenmittel:

worin X * 0 (in demjenigen Pail ist die Verbindung 1,2,4-Triazol-3-carboxamid) oder S (in diesem Fall ist die Verbindung 1,2,4-Iriazol-3-thiocarboxamid) und Y=H, ein Alkalimetall oder ein

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Amin ist. Bei der Synthese von 1-ß-D-Ribofuranosy1-1,2,4-triazol-3-carboxamid kann die Triazolbase mit dem Enzym. Micleosidphosphory lase unter den im folgenden noch beschriebenen, geeigneten Bedingungen umgesetzt werden.

Die Carboxamidverbindungen können entsprechend den Arbeitsweisen der folgenden Beispiele hergestellt werden.

Beispiel 1

Ein Gemisch von 150 ml Triäthylorthoformiat und 25,2 g = 0,30 Mol 1-Cyanoformimidinsäurehydrazid, IC. Matsuda und L. T. Morin, J. Org. Chem. 26 (1961), S. 3783, wurde auf 0 ⁰C abgekühlt, und· es wurden 4 ml einer mit wasserfreiem Chlorwasserstoff gesättigten Dioxanlösung unter Rühren hinzugegeben. Das Gemisch wurde unter Kühlen in einem Eisbad 5 Stunden gerührt, und das Rühren wurde bei 25 °C während 15 Stunden fortgeführt. Das Gemisch wurde zur Trockene eingedampft, und es wurden 500 ml Äther zu dem Rückstand hinzugegeben. Die Lösung wurde filtriert, mit Wasser gewaschen, und die organische Schicht wurde über Magnesiumsulfat getrocknet. Die Lösung wurde filtriert, und der Äther wurde entfernt. Die Kristallisation des Produktes aus Äthylacetat-Benzol lieferte 16,0 g (56,8 %) an 3-Cyano-1,2,4-triazol mit einem Schmelzpunkt von 185-187 ⁰C Alle Eigenschaften der Verbindung waren mit denjenigen einer Probe identisch, die nach der Methode von Cipens und Grinsteins, Latvijas PSR Zinatnu Akad. Vestis, Kim. Ser. (1965) (2), S. 204-208; Chem. Abst., 63 (1965) 13243 hergestellt worden war.

Analyse auf C	'3^H;	= 38,	30;	H «=	2	,98;	N	- 59,	56;
berechnet:	C	= 38,	295	H =	1		N	» 59,	16;
gefunden:	C

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Beispiel 2
1_a2_A4-Triazol-3-carboxamid

Methyl-1,2,4-triazol-3-carboxalat wurde mit überschüssigem, wäßrigem Ammoniak bis zum Abschluß der Reaktion erhitzt. Das Gemisch wurde abgekühlt, und das Produkt wurde gesammelt. Umkristallisation aus Wasser lieferte nahezu die quantitative Ausbeute von 1,2,4-Triazol-3-carboxamid mit einem Schmelzpunkt von 313-315 °C (Zers.).

Analyse auf C₅H₄N₄O:

berechnet: C = 32,14; H = 3,60; N = 49,99 gefunden: C = 32,37; H * 3,73; -N = 50,09

Beispiel 3

Ein Gemisch von 4,7 g « 0,050 Mol 3-Cyano-1,2,4-triazol von Beispiel 1, 50 ml Äthanol und 8,0 ml Triäthylamin wurde bei Zimmertemperatur gerührt, während Schwefelwasserstoffgas während 4 Stunden in das Gemisch eingeleitet wurde. Das Lösungsmittel wurde entfernt, und zu dem Rückstand wurde Wasser hinzugegeben, wobei 2,7 g des Produktes anfielen. Die ümkristallisation aus Wasser lieferte reines 1,2,4-Triazol-3-thiocarboxamid mit einem Schmelzpunkt von 350 ⁰C.

Analyse auf G₅H₄N₄S:

berechnet: C * 28,12; gefunden: C - 28,12;

Beispiel 4
i^g^-Iriazol-^-carboxamid-natriumsalz

Eine aus 1,12 g ■ 10,OmMoI 1 ^^-Triazol^-carboxamid, 0,40 g * 10,0 mMol Natriumhydroxid und 10,0 ml Wasser bestehende Lösung wurde eingefroren, und die Probe wurde lyophilisiert. Das Produkt

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H m	3,	15;	N	- 43	,72;	S -	25	,02
H =	3,	18;	N	- 43	,60;	S *	25	,09

H »	2,	82;	N -	39,	16;	Na	■ 16	,07
H =	2,	78;	N =	38,	92;	Na	» 16	,00

wurde als Halbhydrat von 1^^-Triazol^-carboxamid-natriumsalz mit einem Schmelzpunkt von > 320 ⁰C erhalten.

Analyse auf C₃H₃N₄OITa berechnet: C « 25,18; gefunden: G ■ 25,24;

Andere physiologisch annehmbare Alkalimetall- und Aminsalze wie das Cholinsalz können in ähnlicher Weise hergestellt werden.

1,2,4-Triazol-3~carboxamid kann in 1-ß-D-Ribofuranosyl-i,2,4-triazol-3-carboxamid durch Reaktion mit dem Enzym Nucleosid-Phosphorylase bei einem pH-Wert innerhalb des Bereiches von etwa 5 bis etwa 9, vorzugsweise 7 bis 8, bei einer Enzymkonzentration von etwa 0,015 bis 0,75 mg/ml, vorzugsweise von etwa 0,15 mg/ml, und bei einer Temperatur innerhalb des Bereiches von etwa 0 ⁰C bis 50 ⁰C, wobei die bevorzugte Temperatur etwa 25 ⁰C bis etwa 35°C beträgt, hergestellt werden. Zufriedenstellende Ergebnisse wurden erzielt, wenn die Triazolbase in einer Konzentration von. größer als 5 x 10"% und Ribose-1-phosphat in einer Konzentration von größer als 2 χ 10"% vorhanden sind. 3für die Reaktion werden im allgemeinen etwa 0,1 bis 2 Stunden, vorzugsweise etwa 0,5 bis etwa 1 Stunde benötigt. Die üinzymquelle kann eine tierische Quelle, ein Gewebe oder eine bakterielle Quelle sein. Die hauptsächlichen Bakterienquellen sind JS. coli und Hefe, obwohl auch eine große Vielzahl von tierischen Quellen existiert, einschließlich Rindermilz, Rattenleber, Kalbsleber, Kalbsthymus, Rinderleber, Affenhirn, Pferdeleber, Kalbsmilz, menschlichen Erythrocyten, Fischhaut und · IPischmuskel.

Anhand des folgenden Beispiels wird die Synthese näher erläutert.

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Beispiel 5

Die Synthese von 1-ß-D-Ribofuranosyl-1,2,4—triazol-3-carboxamid aus 1,2,4—Triazol-3-carboxamid erfolgt über gereinigte Uucleosid-Phosphorylase aus Kalbsmilz.

Die Inkubationsproben enthielten-bei einem Endvolumen von 0,135 ml 50 uMol Tris-HCl, pH * 7,4-j 0,25 tiMol Rib ο se-1 -phosphat; 0,05/uMol 1,2,4-Thiazol-3-carboxamid (H^), 4-2 nc/^uHol und 80 >ug Nucleosid-Phosphorylase aus Kalbsmilz (Produkt von Sigma Chemical Co., St. Louis, USA).

Die Proben wurden 5 Hinuten bei 25 ⁰C inkubiert, und dann in Trockeneis-Isopropanol eingefroren, um die Eeaktion abzustoppen. Gleiche Teile der aufgetauten Proben wurden dann auf Kieselerdegel zusammen mit Standardlösungen von 1,2,4—Triazol-3-carboxamid und 1-ß-D-Ribofuranosyl-1,2,4— triazol-3-carboxamid punktförmig aufgetragen und in Isopropanoli ÜJÜ^OH: ΕΛ) (7* 1: 2) aufgetrennt. Die flächen der Chromatogramme, welche mit 1,2,4— Triazol-3-carboxamid zusammenfielen, wurden entfernt, und ausgezählt, um die prozentuale Umwandlung von 1,2,4-Triazol-3-carboxamid in 1-ß-D-Ribofuranosyl-1,2,4—thiazol-3-carboxamid zu bestimmen.

Die Ergebnisse des Hucleosid-Phosphorylaseversuchs mit 1,2,4— Triazol-3-carboxamid waren folgende:

Probe % Umwandlung -Enzym 0,8

-Eibose-1-P, + Enzym, 80 ug 1,1

+ Enzym, 20yig 37,9

+ Enzym, 4Ojag 48,4-

+ Enzym, 60 yig 54-, 1

Hieraus ist ersichtlich, daß die angegebene Umwandlung auftrat, wobei eine stärkere Umwandlung mit größerer Enzymkonzentration erzielt wurde.

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Wenn entweder 1,2,4-Triazol-3-carboxamid oder 1,2,4-Triazol-3-thioearboxamid als Antivirenmittel verwendet wird, wird eine Menge von etwa 0,001 bis etwa 10 Gew.-%, normalerweise von etwa 0,001 bis etwa 5 %t "und vorzugsweise von etwa 0,01 bis etwa 2,5 %» bezogen auf Gesamtgewicht, des Mittels in einem geeigneten Verdünnungsmittel angewandt, wobei die tatsächliche Menge von einer Anzahl von Faktoren abhängig ist, nämlich der Schwere der Infektion, dem allgemeinen Gesundheitszustand und dem Alter des Patienten usw. In jedem Fall sollte die tatsächliche Menge ausreichen, um eine chemotherapeutisch wirksame Menge des Mittels dem Patienten in einem geeigneten Volumen anzubieten. Dies liegt jedoch innerhalb des allgemeinen Fachwissens, so daß hierauf nicht weiter eingegangen werden muß.

Bei einer Anwendungsform können die Verbindungen als Aerosol-Nasenspray des Typs angewandt werden, wie er in der US-Patentschrift 3 014 844 beschrieben ist, wobei hierauf ausdrücklich Bezug genommen wird, und wobei ein solcher Aerosol-Nasenspray die angegebene Menge der Antivirenverbindung suspendiert in einem verflüssigten Treibmittel, wie einem niederen Alkan (bis zu 5 Kohlenstoffatomen), einem niederen Alkylchlorid oder einem fluorierten oder fluorchlorierten, niederen Alkan (im Handel erhältlich tuber der Warenbezeichnung Freon) suspendiert ist. Im allgemeinen ist das Treibmittel bei Zimmertemperatur und atmosphärischem Druck ein Gas, besitzt einen Siedepunkt unterhalb etwa 18 °C bei atmosphärischem Druck und/selbstverständlich ungiftig.. Besonders geeignete Treibmittel sind Dichlordifluoräthan (Freon 12), Dichlortetrafluoräthan (Freon 14) und Trichlormonofluormethan (freon 11). Wenn das Antivirenmittel in Suspension verwendet wird, sollte es fein zerteilt werden, z. B. auf weniger als 100 Mikron, vorzugsweise nicht größer als 25 Mikron und besonders bevorzugt von etwa 0,5 bis 4 Mikron Durchmesser. Ebenfalls kann es vorteilhaft sein, ein grenzflächenaktives Mittel, vorzugsweise ein nichtionisches, grenzflächenaktives Mittel, z. B. Ester oder Partialester

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von 6 bis 22 Kohlenstoffatomen enthaltenden Fettsäuren wie Capronsäure, üctansäure, Laurinsäure, Palmitinsäure, Stearinsäure, Lino leinsäure· usw. hinzuzusetzen, um eine Agglomeration des Pulvers vermeiden zu helfen. Normalerweise wird nur eine relativ kleine Menge des grenzflächenaktiven Mittel verwendet, z. ß. von etwa 0,1 bis etwa 5 Gew.-%, vorzugsweise von etwa 0,25 bis etwa 1,0 Gew.-%, obwohl auch größere Mengen gegebenenfalls angewandt werden können. In gleicher Weise kann die angegebene Menge des Carboxamid-Antivirenmittels in dem verflüssigten Treibmittel unter Hilfe eines geeigneten Lösungsmittels aufgelöst werden, wie dies in der US-Patentschrift 2 868 691 beschrieben wird, auf die hiermit verwiesen wird.

Gegebenenfalls können beide der Antivirenmittel dem Patienten bzw. Virenträger injiziert werden, wobei dies in Form einer physiologischen Salzlösung oder Suspension erfolgt, welche von etwa 10 bis etwa 500 mg des Mittels pro ml der Lösung enthält.

Die Antivirenmittel können auch als orale Präparationen in Kapseloder Tablettenform applizxert werden. Die Tabletten oder Kapseln enthalten von etwa 10 bis 500 mg der Verbindung pro Tablette oder Kapsel. Die erforderlicne Dosis der Antivirenverbindung, wie oben angegeben, variiert von dem Zustand des Patientens, normalerweise reicht sie jedoch von etwa 10 bis 2 000 mg pro Tag. Um in wirksamer Weise sowohl EMA- als auch DNA-Viren zu hemmen, ist eine Konzentration von etwa 32 ng einer jeden Verbindung pro ml Serum erforderlich. Die Kapseln sind die üblichen Gelatinekapseln und enthalten zusätzlich zu dem Antivirenmittel in der oben angegebenen Menge eine kleine Menge, z. B. weniger als 5 Gew.-% und vorzugsweise weniger als 1,0 Gew.-^, Magnesiumstearat oder ein anderes Fließmittel wie Carboxymethylzellulose (Produkt mit der Warenbezeichnung Avicel). Tabletten enthalten die zuvor genannte Menge des Antivirenmittels und ein Bindemittel, welches eine Gelatinelösung, eine Stärkepaste in Wasser, Polyvinylpyrrolidon,

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Polyvinylalkohol in Wasser usw. sein kann, zusammen mit dem typischen Zuckerüberzug.

Die Antivirenmittel können ebenfalls örtlich in einer Salbe, einer Creme, einer Emulsion oder als·örtlich aufzubringende Lösung in Abhängigkeit von dem Zustand der zu behandelnden Virushautinfektion appliziert werden, in denen das Antivirusmittel in der zuvor angegebenen Menge mit den üblichen Trägern und anderen Inhaltsstoffen, welche üblicherweise für solche örtlichen Anwendungen verwendet werden, formuliert wird. So werden Salben wegen der Fettgrundlage für chronische Zustände empfohlen, während Cremes, Emulsionen und örtlich anzuwendende Lösungen für akute und subakute Verletzungen empfohlen werden. Im Gegensatz zu Salben sind Cremes im allgemeinen wasserlöslich und zeigen vorübergehende Eigenschaften. Emulsionen sind notwendig, wo eine Behandlung mit mehreren Mitteln angezeigt ist, wovon eines in Medien unlöslich ist, in denen andere aufgelöst sein können, so daß mehrere, emulgierte !Crägerphasen für eine gleichförmige Verteilung erforderlich sind. Örtlich anzuwendende Lösungen beziehen sich auf Lösungen eines aktiven Bestandteiles in einem Lösungsmittelmaterial, welches hinsichtlich seiner Viskosität zwischen Cremes und leicht verdampfbaren Lösungsmitteln wie Alkohol liegt, so daß ein Ausgleich zwischen der Auftragbarkeit und der Verlängerung der Wirkungsdauer erreicht wird.

Als Beispiel für viele örtlich anzuwendende Formulierungen in I'orm von Salben, Cremes und Lösungen, welche allgemein aufgebracht werden können, sind die folgenden Kombinationen von Materialien aufgeführt:

Salben

a) Erdölprodukte ohne Verdünnungsmittel

b) "Piastibase", ein weichgemachtes Kohlenwasserstoffgel, welches Polyäthylen und Mineralöl enthält (Produkt von Squibb, Inc.)

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Cremes

a) Wethyl-p-hydroxybenzoat (Hethylparaben) USP Propyl-p-hydroxybenzoat (Propylparaben) USP Walrat CSpermaceti) USP Natriumlaurylsulfat USP Stearylalkohol USP Cetylalkohol USP Glyzerin USP entionisiertes Wasser

b) Stearinsäure Propylenglykol Sorbitanmonostearat und -oleat PoIyoxyäthy1ensorbitanmonostearat Zitronensäure

Methyl- und Propyl-p-hydroxybenzoat (Methyl- und Propylparabene)

c) Wassergrundlage .Laliumsorbat

hethy1- und Propyl-p-hydroxybenzoat (Methyl- und Propylparabene)

GIyζerinmonostearat Squalan

Polysorbat 80 (USP) Walrat (Spermaceti) Stearylalkohol Sorbitallösung

d) Polyäthylenglykol 400 (USP) Psopylenglykol Carboxymethy1en Monoamylamin Titandioxid

butyliertes Hydroxytoluol

örtlich anzuwendende Lösungen

a) Polyvinylalkohol-Wasser

b) Polyäthylenglykol

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Dementsprechend bestehen die örtlichen !Präger üblicherweise zusätzlich zu den den Körper bildenden Mitteln aus feuchthaltenden Mitteln, Verseifungsmitteln, Emulgatoren, Lösungsmitteln, Durchdringungsmitteln, pH-Keglern, Weichmachern, erweichenden Mitteln, Konservierungsstoffen, Härtungsmicteln, Pigmenten und Duftstoffen, wobei diese Substanzen an sich auf dem Fachgebiet bekannt sind.

Zur Verwendung gegen Vaginalinfektionen werden örtliche bzw. topikale Träger bevorzugt, welche eine maximale Verteilung des aktiven Mittels sicherstellen, z. B.

Vaginalcremes

a) Glyzerinmonostearat Maisöl Glyzerin Benzoesäure Glutaminsäure Wasser

b) Glyzerin Äthylalkohol flüssiges Petrolatum Polyäthylenglykoläther: Fettalkoholkomplex p-Hydroxybenzoatkonservierungsstoffe (Paraben) Wasser

Vaginalsuppositorien

a) Lactose

Polyäthylenglykol Polysorbat Polyäthylenglykol 4000 Glyzerin Milchsäure

b) Polyäthylenglykol Polyoxyäthylenpalmitat Milchsäure

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Träger für örtlich anzuwendende oder topikale Mittel bei Vagirialanwendungen sind im pH-Wert auf saure Bedingungen, unter denen normale Bakterien gedeihen, eingestellt, so daß die Körperabwehrmecharäsmen nicht geschwächt werden. Diese und andere zu "berücksichtigenden Faktoren, welche bei einer örtlichen Anwendung von Antivirenmitteln zu beachten sind, sind dem Fachmann auf dem Gebiet an sich bekannt.

Die örtlich anzuwendenden Präparationen enthalten die Viren wirksam hemmende Anteile des aktiven Mittels, z. B. von etwa 0,01 bis' etwa 10 Gew.-% des Gesamtgewichtes der Zusammensetzung und vorzugsweise 0,025 bis 1 Gew.-$> und besonders bevorzugt von 0,025 bis 0,1 Gew.-%. Bis zu etwa 10 Gew.-% können bei der Behandlung von hartnäckigen Zuständen verwendet werden. Die Menge der anderen Bestandteile in solchen Präparationen sind natürlich mit den Mengen solcher Bestandteile, wie sie normalerweise verwendet werden, verträglich, und die Festlegung geeigneter Formulierungen ist dem Fachmann aufgrund der gegebenen Angaben möglich.

Es sei darauf hingewiesen, daß die Form, in welcher das Antivirenmittel appliziert wird, selbstverständlich von der zu behandelnden, besonderen Virusinfektion abhängt. Falls die Infektion z. B. durch Influenzaviren oder Viren des Atmungssystems hervorgerufen wird und sich im oberen Atmungstrakt festgelegt hat, besteht die bevorzugte Behandlungsart in der Anwendung des zuvor beschriebenen Aerosol-Nasensprays, da dies in wirksamster Weise das Mittel an den Infektionsort bringt. Eine orale Therapie oder eine Ingektionstherapie kann in Abhängigkeit von der Schwere der Infektion angezeigt sein. Falls die Infektion eine Infektion des unteren Atmungssystems oder eine andere allgemeine Virusinfektion zu sein scheint, besteht die bevorzugte Behandlungsart in oraler Applikation oder durch Injektion. Falls die Infektion örtlich ist, z. B. Herpes labialis (Gesichtsherpes, Fieberbläschen), Herpes genitalis (Virusinfektion des Penis oder des Vaginalbereiches),

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Herpes zoster (Gürtelrose), Varicella (Windpocken), Exzema herpeticum, Herpes dermatitis usw., besteht die geeignete Anwendung in einer örtlichen Applikation, wie zuvor beschrieben, gegebenenfalls kombiniert mit einer oralen Behandlung oder einer Injektionstherapie, wie sie ebenfalls oben beschrieben wurden.

Zur Erläuterung sind im folgenden noch spezifische Formulierungen für örtliche Applikationen angegeben:

Creme (Gew.-%)
1,0 % Antivirusmittel 99,0 % aufsaugbare Creme, bestehend aus 0,27 f° Methyl-p-hydroxybenzoat USP, 0,03 % Propyl-p-hydroxybenzoat USP, 10 % Walrat USP, 1 % Hatriumlaurylsulfat USP, 10 % Stearylalkohol USP, 3 % Cetylalkohol NI¹, 10 % Glyzerin und entionisiertes Wasser, q.s.

Lösung (Gew.-% ) 1,0 % Antivirusmittel, 99j0 °/o topikale Lösung, bestehend aus 1,4 % Polyvinylalkohol in entionisiertem, gereinigtem Wasser

Salbe (Gew.-%) 1,0 % Antivirusmittel 99jO % weichgemachtes Kohlenwasserstoffgel (Piastibase)

Beispiel 6

Spezifische Antivirusaktivität Jedes der Triazole gemäß der Erfindung wurde nachgewiesen. Sie wurden auf ihre Aktivität unter Verwendung der Methode von Sidwell et al. (Applied Microbiology 22 (1971) S. 797-801) unter Bestimmung des durch Viren induzierten cytopathogenen Effektes (CPE) untersucht. Kurz gesagt, umfaßt · die CPE-Methode die Auflösung des Antivirusmittels in einem Zellenkulturmedium, das aus Vitaminen, Aminosäuren, Serum, Puffer, Penicillin, Streptomycin und Indikatorfarbstoff in Wasser besteht. Die in dem Zellenkulturmedium suspendierten Viren wurden zu einer

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hergestellten Monoschicht von EB-Zellen hinzugesetzt, und ein gleiches Volumen des Antivirusmittel wurde dann innerhalb von 15 Minuten hinzugegeben. Die infizierten, behandelten Zellen wurden entsprechend der nachfolgenden mikroskopischen Prüfung eingeteilt. Kontrollversuche für jedes Experiment umfaßten Zellkontrollen (Zellen und Zellkulturmedium für sich alleine), Viruskontrollen (Zellen und Viren und Zellkulturmedium) und Toxizitätskontrollen (Zellen und Chemikalie und Zellenkulturmedium)

Das Viruswertungssystem (VE-System) von Sidwell et al., das in der oben genannten Literaturstelle in Applied Microbiology angegeben ist, wurde zur Abschätzung des Ausmaßes, der Signifikanz der CPE-Inhibierung angewandt. Ein Vfi-Wert von größer als 0,5 ist ein Anzeichen für eine beträchtliche Antivirusaktivität, und ein VR-Wert von weniger als 0,5 legt nur eine schwache Antivirusaktivität nahe.

Bei Versuchen mit Masernviren, wurde die oben angegebene Methode so abgeändert, daß die infizierten Zellen mit einer Agar-Serum-Bicarbonatdeckschicht abgedeckt wurden, welche die Antivirenverbindungen enthielt, so daß Virenflecke unterschieden werden konnten. Diese Flecken wurden mit einem Neutralrotfarbstoff am vierten Tag gefärbt und ausgezählt, wobei jede Verminderung der Fleckenanzahl, die aus der Exposition gegenüber der Antivirenverbindung herrührte, bestimmt wurde. Die Methodologie für das Experiment war wie von Wear et al. beschrieben, siehe Exptl. and Molecular Pathol. 9 (1968), S. 4Q5 - 4-17).

Die Ergebnisse dieser Antivirenexperimente sind in der folgenden Tabelle I zusammengestellt:

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Tabelle I

Vergleichs-Antivirenaktivität von 1,2,4-Triazol-3-carboxamid 1,2,4-Triazol-3-thiocarboxamid (2) und 1-ß-D-Ribofuranosyl-i,2,4-triazol-3-carboxamid C3) in Zellenkultursystemen

Virusbewertuns CVR)

	1	,9	2	8	1,0-1	3
Virus					1,3
Typ 1 Herpes	0,6-0		0,4-0,		0,9-1	,5 '
Typ 2 Herpes	0,4	,5	0,3	4	0,6
Vaccinia	0,8		0,5		0,5	,0
Typ 1A Bliino	0,4-0		0,2-0,		0,8
Typ 15 Rhino	0,3		0,4		0,9
Typ 8 Rhino	0,2	,7	0,3	4	0,6-1
Typ 56 Rhino	0,3	0,4
^Typ 3 Parainfluenza	0,5-0	0,2-0,		,0

FleckeninhibierunK

	Konzentration der Verbindung (mg/ml)	1	2	3
Virus
Masern	500	99	100	100
	100	97	98	94
	20	34	5	30
Beispiel V

Jedes der Antivirenmittel wurde auf seine Leistungsfähigkeit gegenüber Influenza Ag-Infektionen in Mäusen untersucht. Junge, erwachsene Mäuse wurden einem Aerosol von Influenza-Ap-Viren in ausreichender Menge ausgesetzt, so daß annähernd 65 % der Tiere

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innerhalb von 8 bis 13 Tagen starben. Gruppen wurden intraperitoneal mit variierenden Konzentrationen der in Salzlösung suspendierten Verbindungen zweimal täglich während 6 bis 9 Tagen behandelt, wobei 4 Stunden vor der Virus-exposition begonnen wurde. Kontrollversuche umfaßten Viruskontrollen (Exposition gegenüber Viren, jedoch Behandlung mit Salzlösung alleine), Toxizitätskontrollen (scheininfiziert mit Virusverdünnungsmittel (MEM) und mit Testverbindung behandelt) und normale Kontrollen (nicht infiziert, nicht behandelt). Die Tiere, welche während des Experimentes starben, wurden täglich notiert, und die Lungen aller überlebenden Mäuse wurden am 25. Tag entfernt und auf einer Eichtskale von 0 bis 4 entsprechend dem Wert der aufgetretenen Virenkonsolidierung eingestuft. Die Lungen wurden dann zu geeigneten Gruppen zusammengefügt und in 15 ml mit Phosphat gepufferter Salzlösung (PBS, pH * 7,2, 0,2M PO^, 0,15M NaCl) homogenisiert. Die homogenisierten Lungenpräparation wurde 15 Minuten bei 1500 Upm zentrifugiert, in zweifachen Verdünnungen in PBS verdünnt und es wurde ein gleiches Volumen von 0,5 % roten Blutzellen von Meerschweinchen zu jeder Verdünnung hinzugesetzt. Das Ausmaß der Agglutination der roten Zellen, welches ein Maß für die Viren in den Lungen darstellt, wurden nach einer Inkubation von 45 Minuten bei Zimmertemperatur aufgezeichnet. Diese Agglutination der roten Zellen wurde als Hämagglutinin (HA)-titer pro ml ausgedrückt.

Die Ergebnisse dieser Tierversuche sind in der folgenden Tabelle II gezeigt und zeigen, daß jede Verbindung die Schwere der Viruserkrankung beträchtlich verringerte, wobei die angegebenen Parameter verwendet wurden.

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Tabelle II

Einfluß von 1,2,4-Triazol-3-carboxamid (1), 1,2,4-Triazol-3-thiocarboxamid (2) und 1-ß-D-Ribofuranosy1-1,2,4—triazol-3-carboxamid (3) auf die durch Influenza-A^-Viren induzierte Mortalität bei Mäusen

Gast: weibliche Schweizmäuse (15-17 g) Virusdosis: 3,2 ID

Weg der Viruseinimpfung: Aerosol *T- Beobachtungsperiode: 21 Tage

Behandlungsweg: intraperitoneal

Ver- Dosis Beschreibung Behandlungs- Überlebende MST Durchschnitts- HA-titer bin- (mg/kg/Tag) schema ^a) (Gesamt- ■ (Tage) lungenkonsoli- pro ml

dung anzahl) dierung ^)

1 1000

500 ■

250

Salzlösung + Virus

Medikament + Virus

Medikament + MM

Medikament + Virus

Medikament + MEM

Medikament + Virus

Medikament + MEM

7/20
8/10

7/10

11,7

15
(P<0,00i)^e

12,0
(P>o,O5)

>21,0

8/10 17,5

(P<0,05) (P<O,OO1)

>21,0

3,7 2,0

n.d.

2,5

n.d.

1:64 1,8

n.d. 1:16

n.d. 1:8

n.d.

Tabelle II (Portsetzung)

Ver- Dosis Beschreibung Behandlungs- Überlebende MST Durchschnitts- HA-titer ⁰^

bin- (mg/kg/Tag) schema ^a^ (Gesamt- (Tage) lungenkonsoli- pro ml

dung anzahl) dierung "J

Medikament + Virus

Medikament + MEM

Medikament + Virus

Medikament + MEM

Medikament + Virus

Medikament + MEM

Medikament + Virus

Medikament

+ MEM

37,5 Medikament + Virus

Medikament + MEM

3 3

1 1 1 1

3/10 (P>0,3)	8,3	3,7
0/5	4,2	n.d.
5/10 CP> 0,3)	7,6	2,2
V5	9,0	2,0
6/10 (P* 0,2)	9,2	3,6
5/5	>21,0	0,5
10/10 (P*0,001)	>21,0	1,0
5/5		n.d.
10/10 (P<O,OO1)	>21,0	1,0
5/5		n.d.

1:8

n.d. 1:8

1:16

n.d.

^J Behandlungsschema: 1. Das Medikament wurde zweimal am Tag

für 9 Tage beginnend 4 Stunden vor und 4 Stunden nach der Infektion appliziert. 2. Das Medikament wurde zweimal am Tag für 6 Tage beginnend 4 Stunden vor und 4 Stunden nach der Infektion appliziert. 3· Das Medikament wurde zweimal am Tag beginnend 4 Stunden vor und 4 Stunden nach der Infektion appliziert bis zum 5· ^Tag und einmal am Tag mit der halben Dosismenge beginnend am 6. Tag für weitere 3 Tage.

' Ausmaß der Lungenkonsolidierung in Mäusen am 25· Tag nach der Infektion; eine Richtskala von 0-4 wurde angewandt, um die Bungenkonsolidation von 0 bis 100 % zu bezeichnen; n. d. « nicht durchgeführt.

^c) Hämagglutinin-titer in Lungenhomogenaten aus 4 Mäusen, die am 25· Tag nach der Infektion getötet wurden.

-j\ · ρ

^J P = Wahrscheinlichkeit (Chi -Analyse) ^e^ P = Wahrscheinlichkeit (t-Test)

Aus den Beispielen 4 und 5 geht hervor, daß die beiden Verbindungen 1 und 2 ein Spektrum an Antivirenaktivität besitzen, und daß sie insbesondere gegenüber Influenzaviren wirksam sind. Untersuchungen der relativen Cytotoxizität zeigen eine schwache Veränderung in der Zellenstruktur mit der Verbindung 1, wodurch eine schwache Veränderung der Zellenstruktur bei Werten von 32 bis 1000 Aig/ml hervorgerufen wurde und die Verbindung 2 verursacht ähnliche Veränderungen in Konzentrationen bis herab zu 1 ug/ml.

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Jede Verbindung war in dem verwendeten, wäßrigen Medium relativ unlöslich, und obwohl die Antivirenaktivität möglicherweise in der Zellenkultur geringfügig beschränkt; war, schränkte dieser relative Löslichkeitsverlust die Antivirenaktivität bei den Tierexperimenten nicht übermäßig ein.

Bei den Tiertoxizitätsversuchen war die Verbindung 1 gegenüber Mäusen nicht toxisch, wenn sie in so hohen Konzentrationen wie 1000 mg/kg/Tag intraperitoneal zweimal täglich während 9 Tagen appliziert wurde, während die Verbindung 2 mäßig toxisch war, was sich durch Gewichtsverlust und Tod bei so niedrigen Konzentrationen wie 250 mg/kg/Tag zeigte, wobei diese nach derselben Behandlungsmethode appliziert wurden.

Ferner sei noch darauf hingewiesen, daß die Antivirenaktivität von 1,2,4-Triazol-3-carboxamid auch seiner enzymatischen Umwandlung in 1-ß-D-Ribofuranosyl-i,2,4—triazol-3-earboxamid durch den Gast zuzuschreiben sein könnte. In jedem Fall liefert eine solche enzymatisch^ Umwandlung jedoch ein Verfahren zur Synthese von i-ß-D-Ribofuranosyl-1,2,4—triazol-3-carboxamid. Dieses Enzym kann ein gereinigtes Protein sein, oder es kann in aktiv metabolisierenden Bakterien- oder Pilzzellen vorliegen. Wenn es in aktiv metabolisierenden Bakterien- oder Pilzzellen vorliegt, wird angenommen, daß Fermentationsprozesse unter Verwendung dieser Zellen oder Mutanten dieser Zellen zur Bildung von 1-ß-D-Ribofuranosy1-1,2,4—triazol-3-carboxamid aus 1,2,4—Triazol-3-carboxamid führen können.

Die Erfindung "betrifft ferner ein Verfahren zur Hemmung der Entwicklung von Virusinfektionen, wobei eine Virusinfektion mit einer Verbindung der zuvor genannten Formel, d. h. 1,2,4-Triazol-3-carboxamid oder -thiocarboxamid, in Kontakt gebracht wird. Bevorzugt werden hierbei Herpes Virus, Vaccinia, Rhinovirus, Influenza, Parainfluenza und Masernviren behandelt.

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Vorteilhafterweise sind bei dem Verfahren von etwa 0,001 bis etwa 10 Gew.—$> in dem Arzneimittel, mit welchem die Virusinfektion in Eontakt gebracht wird, vorhanden, bevorzugt von etwa 0,001 bis etwa 5 Gew.-^. Besonders bevorzugt wird die Virusinfektion bei diesem Verfahren mit einer Konzentration von etwa 52 ug der Verbindung pro ml Serum in Kontakt gebracht,

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Claims

Patentansprüche'

1. Verwendung von 1,2,4-l'riazol-3-carboxamid und/oder -thiocarboxamid der folgenden allgemeinen formel

X ti

worin X Sauerstoff oder Schwefel bedeutet, zur Hemmung der Entwicklung von Virusinfektionen.

2. Verwendung nach Anspruch 1 für Infektionen durch Eerpesviren, Vaccinia CKuhpocken), Rhinovirus, Influenza, Parainfluenza und Masernviren.

3« Verwendung nach Anspruch 1 in einer Arzneimittelzusammensetzung, welche von etwa 0,001 bis etwa 10 Gew.-% der Verbindung, bezogen auf das Gesamtgewicht der Zusammensetzung, enthält.

4. Verwendung nach Anspruch 3, wobei die Infektion mit etwa 0,001 bis etwa 5 Gew.-% der Verbindung in Kontakt gebracht wird.

5. Verwendung nach Anspruch 2, wobei die Virusinfektion mit einer Konzentration von etwa 32 ug der Verbindung pro ml Serum in Kontakt gebracht wird.

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6. Antivirusarzneimittel, dadurch gekennz e ichnet, daß es von etwa 0,001 bis etwa 10 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Zusammensetzung, einer Verbindung der folgenden Formel

worin X Sauerstoff oder Schwefel ist, in einen Träger in Form eines verflüssigten Treibmittels oder eines örtlich aufzubringenden Mediums enthält.

7· Arzneimittel nach Anspruch 6, dadurch gekennz eichn e t, da'ß das örtlich aufzubringende Medium eine Salbe, eine Creme, eine örtlich aufzubringende Lösung oder ein Suppositorium ist, und daß die Verbindung in einer Menge von etwa 0,025 his etwa 1 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Zusammensetzung, vorhanden ist.

8. Arzneimittel nach Anspruch 7» dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung in einer Menge von etwa 0,025 bis etwa 0,1 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Zusammensetzung, vorhanden ist.

9. Arzneimittel nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger ein verflüssigtes Treibmittel ist, und daß die Verbindung ein Pulver mit einer Teilchengröße von nicht größer als etwa 25 Mikron ist.

10. Arzneimittel nach Anspruch 9₅ dadurch gekennzeichne t, daß die Teilchengröße von etwa 0,5 bis etwa 4- Mikron beträgt.

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11. Arzneimittel nach. Anspruch 9, dadurch, gekennzeichnet, daß die Zusammensetzung von etwa 0,1 "bis etwa 5 Gew.-/O eines grenzflächenaktiven Hittels, "bezogen auf das Gesamtgewicht der Zusammensetzung, enthält.

12. Physiologische Salzlösung, dadurch gekennzeichnet, daß sie etwa 10 bis etwa 500 mg einer Verbindung der folgenden allgemeinen Formel:

— Ν

worin X Sauerstoff oder Schwefel ist pro ml der Lösung enthält.

13. Orale Antivxrenpraparatxon in Tabletten oder Kapselform, dadurch gekennz eichnet, daß sie von etwa 10 bis etwa 500 mg einer Verbindung der folgenden allgemeinen irormel

N H

worin X Sauerstoff oder Schwefel ist, pro Tablette oder Kapsel enthält.

Verfahren zur Herstellung von i-ß-D-Rxbofuranosyl-1,2,4-triazol-3-carboxamid, dadurch gekennzeichnet, daß 1,2,4—Triazol-3-carboxamid mit dem Enzym Nucleosid-Fhosphorylase in Anwesenheit von Eibοse-1-phosphat bei einem pH-Wert von etwa 5 bis etwa 9 und einer Temperatur von etwa 0 ⁰C bis etwa 50 ⁰C umgesetzt wird.

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~ 2b -

15· Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym in einer Konzentration von etwa
0,015 bis etwa 0,75 ing/ml angewandt wird.

16. Verfahren nacn Anspruch 15, dadurch gekennzeichne t, daß das l'riazol-J-carboxamid in einer Konzentration

— 5
von wenigstens etwa 5 x 10 H verwendet wird, und daß das

Kibose-1-phosphat mit einer Konzentration von wenigstens
etwa 2 χ 10~" Ii verwendet wird.

17« Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert etwa 7 his etwa 8 beträgt, und die
Temperatur von etwa 25 °C bis etwa 35 ⁰C "beträgt.

18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennz eichn -e t, daß die Konzentration des Enzyms etwa 0,15 mg/ml
beträgt.

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