CH666188A5 - Immuno-regulator in form einer pharmazeutischen zusammensetzung. - Google Patents

Description

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PATENTANSPRUCH Immuno-Regulator in Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass er L-Carno-sin oder ein Salz davon als wirksamen Bestandteil enthält.

BESCHREIBUNG

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen Immuno-Regulator in Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung, welcher dadurch gekennzeichnet ist, dass er L-Carnosin oder eines seiner Salze als wirksamen Bestandteil enthält.

Um verschiedene Krankheiten zu behandeln, welche durch abnormale Funktion der Immunität hervorgerufen werden, wurden zahlreiche pharmazeutische Mittel entwik-kelt, welche im allgemeinen als Immuno-Regulatoren bezeichnet werden. Die Bezeichnung «Immuno-Regulator», wie sie hier verwendet wird, bedeutet Mittel zur Wiederherstellung der Immuno-Reaktion aus deren abnormalem Abfall und die Unterdrückung ihrer übermässigen Beschleunigung, um eine normale Funktion der Immunität aufrecht zu erhalten. Als Mittel, welche zu einer solchen Kategorie gehören, wurden verschiedene Typen von Mitteln entwickelt, einschliesslich Levamisol (Aldrich Corporation). Diese konventionellen Immuno-Regulatoren sind jedoch von chemischen Materialien abgeleitet und nicht von biologischen Materialien, so dass ihre gefahrlichen Nebenwirkungen nicht vollständig eliminiert werden können.

Tatsächlich wurden wesentliche Nebenwirkungen für gewisse Immuno-Regulatoren festgestellt.

Die Immuno-Reaktion hat im wesentlichen die physiologische Funktion, die Homeostase aufrecht zu erhalten, welche durch physiologisch aktive Substanzen, die in einem lebenden Körper vorhanden sind, reguliert werden sollte, s Ziel der vorliegenden Erfindung ist es daher, einen Immuno-Regulator einer physiologisch aktiven Substanz zur Verfügung zu stellen, welche weniger Nebenwirkungen aufweist, anstelle der konventionellen chemischen Substanzen.

Dieses Ziel wird erfindungsgemäss durch einen Immuno-io Regulator in Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung erreicht, welcher L-Carnosin oder eines seiner Salze als wirksamen Bestandteil enthält.

Es wurde nun durch langjährige Studien der physiologischen Wirkung von a-Aminosäuren, welche in einem leben-i5 den Körper vorkommen, gefunden, dass L-Carnosin, welches ein physiologisch aktives Derivat ist, eine immunoregu-lierende Funktion ausübt. Es wurde bisher kein physiologisch aktives Mittel mit solcher Immuno-Regulator-Funkti-on gefunden. Ferner war nicht bekannt, dass L-Carnosin die 20 Immuno-Regulator-Funktion aufweist.

L-Carnosin oder ß-Alanyl-L-histidin wurde in einem Lie-big-Fleischextrakt durch Gulewitsh im Jahre 1900 entdeckt und ist ein Dipeptid, welches aus L-Histidin und ß-Alanin besteht und welches in grossen Mengen in Skelett-Muskeln 25 von Säugetieren enthalten ist.

Seit der Entdeckung von L-Carnosin wurden dessen physiologische Bedeutung und pharmakologische Nützlichkeit durch viele Forscher untersucht, doch blieben sie bisher ungelöst.

30 L-Carnosin blieb in Form eines geschmacklosen, geruchlosen, leicht wasserlöslichen und weissen kristallinen Pulvers mit einem Schmelzpunkt von 250 °C und [cc]d = +20,0 (H2O). Es weist die folgende Strukturformel auf:

HC -, C — CH

HN N

H

und sein pH in einer wässerigen Lösung liegt im Bereich von 8,0 bis 8,5.

L-Carnosin ist eine Substanz, welche in grossen Mengen in verschiedenen Skelett-Muskeln von Säugetieren enthalten ist (etwa 0,1 bis 0,3%), und welche üblicherweise aus Fleischnahrungsmitteln als Quelle für die essentielle Aminosäure L-Histidin entnommen wird. Es kann ferner aus L-Histidin und ß-Alanin biosynthetisiert werden. L-Carnosin, welches absorbiert wurde, wird durch Carnosinase zu nahrhaftem (nutritious) L-Histidin und ß-Alanin zersetzt, von welchem ein Teil wieder zu L-Carnosin synthetisiert wird [ß-

CHCOOH

NH— COCH2CH2NH2

Alanyl-l-methyl-histidin (Anserin) ist bekannt als ein Zwischenprodukt der L-Carnosin-Biosynthese].

45 Wie oben beschrieben, ist L-Carnosin eine nahrungsmittelähnliche Substanz von hoher Sicherheit und kann nach der Absorption durch Carnosinase zersetzt werden, welche in verschiedenen inneren Organen enthalten ist, und dadurch unterscheidet es sich vollständig von zahlreichen anderen soPharmazeutika, welche in der Leber verdaut werden und eine schwere Last für die Leberfunktion darstellen.

Die akute Toxizität von L-Carnosin wird im folgenden dargelegt.

Akute Toxizität

L-Carnosin wurde peritoneal oder oral in verschiedenen Mengen an eine Gruppe von 10 Mäusen verabreicht, und die akuten toxischen Symptome wurden 5 Stunden nach der Verabreichung beobachtet. Die LD50 wurde aus der Anzahl Todesfälle nach 72 Stunden bestimmt gemäss der Methode von V.ander Waerden. L-Carnosin wurde in einer physiologischen Kochsalzlösung gelöst, um eine Dosis von 0,1 bis 0,3 ml/10 g zu ergeben.

Die folgenden toxischen Symptome von L-Carnosin wurden beobachtet. Etwa 30 Minuten nach der peritonealen Verabreichung von 15 000 mg/kg (LD 100) wies die Hälfte der Mäuse eine Herabsetzung der Beweglichkeit aus eigenem Antrieb (voluntary motility), abdominale Stellung, Herabsetzung und Unregelmässigkeit der Atmungsgeschwindig-60 keit, Abwesenheit oder Verschwinden der Aufrichte- (right-ing) und Fluchtreflexe, Schwanzheben und Myoclonie auf. Weitere progressive Symptome führen zu wiederholten lateralen Drehungen, Reflexbeschleunigung bei Berührungsstimulation, Convulsionen und schliesslich tonischem Krampf 65 bis zum Tod. 50%, 80% und 100% der Mäuse starben innerhalb 30 Minuten bzw. 2 Stunden und 5 Stunden. Die orale Verabreichung von 15 000 mg/kg zeigte wenig Wirkung, tötete aber eine der 10 behandelten Mäuse nach 12 Stunden.

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Tabelle 1

LD50 von L-Carnosin

Verabreichung

LD50 (95% Vertrauensgrenze) mg/kg peritoneal

9,087 (8,320-9,925)

oral

> 14,930 (minimale lethale Dosis)

Die akute Toxizität (Wert nach 72 Stunden) für männliche DDY-Mäuse ist in der obigen Tabelle dargestellt. Wie ersichtlich, ist L-Carnosin eine Verbindung mit sehr niedriger Toxizität.

Seit 10 Jahren wurde L-Carnosin als Behandlungsmittel für Anorexie durch LISA Corporation in Spanien formuliert und als sicher bestätigt. Ferner ist eine wirksame Menge an L-Carnosin für transplantierbare Tumoren 1 mg pro Maus oder 50 mg/kg. Diese Menge entspricht 1/181 der akuten Toxizität LD50 (9087 mg/kg) bei der peritonealen Verabreichung, und damit ist die hohe Sicherheit von L-Carnosin anzunehmen.

Eine synthetische Methode zur Herstellung von L-Carnosin ist bekannt [Journal of Biological Chemistry, 108, 753 (1935)]. L-Carnosin kann durch Chlorierung von Carbo-benzoxy-ß-alanin mit Phosphorpentachlorid, Bildung des Methylesters mit Methanol, Bildung des Azides durch Hy-droazid, Kupplung des Azides mit L-Histidinmethylester und schliesslich Entfernung der Carbobenzoxygruppe durch katalytische Reduktion hergestellt werden. Die Erfindung umfasst ein Behandlungsmittel, welches ein Salz von L-Carnosin enthält, wie die Salze an seiner Carboxylgruppe, Säureadditionssalze mit pharmazeutisch annehmbaren Säuren an seiner Aminogruppe und Salze an sowohl der Carb-oxyl- wie der Aminogruppe. Als Salze an der Carboxylgruppe können Salze mit Metallen, wie Natrium, Kalium, Calcium, Magnesium, Zink und Aluminium, wie auch substituierte Ammoniumsalze, wie Salze mit Trialkylaminen (Triäthyl-amin) und anderen Aminen genannt werden. Als Salze an der Aminogruppe können Salze mit organischen und anorganischen Säuren, wie Salzsäure, Sulfonsäure, Phosphorsäure, Essigsäure, Propionsäure, Milchsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure, Benzolsulfonsäure und Toluolsulfonsäure genannt werden. Diese Salze können auf bekannte Weise durch Reaktion von freiem L-Carnosin mit einer stöchiometrischen Menge einer gewählten Säure oder Base hergestellt werden.

Der bedeutende immunoregulierende Effekt von L-Carnosin wird im folgenden unter Bezugnahme auf experimentelle Beispiele näher beschrieben.

Experimentelle Methode

Die immunoregulierende Wirkung wurde durch eine hämolytische Beulen-Methode (hemolytic plaque method) [PFC], einen Hämagglutinationstest und eine verzögerte Hy-persensitivität-Reaktion unter Verwendung von Mäusen bestimmt.

(1) PFC-Methode

Die Antikörper erzeugende Kapazität wurde bestimmt durch Zählen der Beulen bildenden Zellen mit Hilfe einer modifizierten Canningham-Methode oder einer Flüssigkammer-Scheibenmethode [Hashimoto et al., Expérimental Method for Immunity A, Seiten 491 bis 494 (1972), herausgegeben durch Japan Immunology Academy]. Für die Sensibilisierung wurden rote Blutzellen von Schafen (SRBC, geliefert von Shizuoka Expérimental Animal Corporation) verwendet, welche zu Beginn mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung, PBS, verdünnt wurden, um eine Lösung herzustellen, welche 12,5 x 108 SBRC/ml enthielt, von welcher 0,2 ml (2,5 x 108 Zellen) in eine Schwanzvene einer DDY-Maus (männlich, 5 Wochen alt, erhältlich von Shizuoka Expérimental Animal Corporation) injiziert wurden. Als Reaktionsmedium wurde ein Eagel-MEM-Medium verwendet, welches 10% Rinderfötus-Serum (FCS) (erhältlich von Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) enthielt, zu welchem 0,1 ml an 4 x 107 Milzzellen/ml-Lösung, 0,5 ml an 2,5 x 109 SRBC/ml-Lösung (12,5 x 108 Zellen) und 0,4 ml eines verdünnten komplementären Serums eines Meerschweinchens zugesetzt -wurden, um eine gemischte Lösung herzustellen, welche sodann in einer Kammer versiegelt und während 1 Stunde auf 37 C erwärmt wurde. Gemäss dieser Methode wurden 50 bis 150 PVC-Zellen in etwa 0,02 ml Kammer nachgewiesen.

(2) Bestimmung des Serum-Antikörper-Wertes

Blut wurde in der PFC-Reaktion aus den carotiden Arterien einer Gruppe von 5 Mäusen gesammelt, aus welchem ein Serum in konventioneller Weise hergestellt wurde, zur Bestimmung des Hämagglutinations-Titers (HA-Titer). Das Testserum wurde mit einer phosphatgepufferten Kochsalzlösung (PBS), welche 0,5 bis 1 % eines Serums von einem normalen Kaninchen enthielt, verdünnt, und wurde unter Verwendung von SRBC bestimmt. Die maximale Verdünnung, welche positive Reaktion zeigte, wurde durch 2N dargestellt, worin N einen Antikörperwert bedeutet.

(3) Verzögerte Hypersensibilitäts-Reaktion

[Natsuume et al., Expérimental Method of Immunity A, Seiten 614 bis 620 (1972), Japan Immunology Academy],

Eine männliche DDY-Maus von 5 Wochen, welche etwa 20 g wog, wurde verwendet, um ihre Kontaktdermatitis mit 2,4,6-Trinitrochlorbenzol (Picrylchlorid) (erhältlich von Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) zu bestimmen. Eine Äthanollösung von 1 % Picrylchlorid wurde in eine vierlagige Gase (lxl cm) imprägniert, welche sodann mit dem rasierten Bauch der Maus während 10 Sekunden in Berührung gebracht wurde, um die primäre Sensibilisierung zu erzeugen. Die sekundäre Sensibilisierung für den Test wurde am siebten Tag erzeugt durch Auftragen einer Olivenöllösung von 1 % Picrylchlorid auf beide Oberflächen eines Ohrs mit Hilfe eines Malerpinsels. Das andere Ohr wurde nur mit Olivenöl als Kontrolle bepinselt. Nach 24 Stunden wurde die Maus mit Äther anästhesiert und die Dicke des Ohrs wurde in der Grössenordnung von '/ioo mm mit einem Mikrometer gemessen, welches eine Genauigkeit von '/îooo mm aufwies. Die verzögerte Hypersensibilisierungs-Reaktion wurde wie folgt berechnet:

Dicke des mit Picrylchlorid behandelten Ohrs nach 24 Stunden — Dicke des Ohrs vor dem Auftrag) minus (Dicke des mit Olivenöl behandelten Ohrs nach 24 Stunden — Dik-ke des Ohrs vor dem Auftrag).

(4) Versuche für immunoregulierende Wirkung von L-Carnosin wurden ausgeführt durch Variieren einer Menge von Antigen, einer Dosis von L-Carnosin und einem Tieralter, aufgrund des Standards einer Antigenmenge von 2,5 x 108 SRBC und einer Maus von 5 Wochen unter den folgenden Bedingungen:

(a) Veränderung der Antigenmenge

Sensibilisierende Antigenmengen im Bereich von 5 x 107

bis 2,5 x 109 SRBC wurden verwendet, um die Wirkung von einer 100 mg/kg Dosis von L-Carnosin zu beobachten.

(b) Veränderung des Mäusealters

Mäuse im Bereich einer unreifen Maus von 2 Wochen bis zu einer alten Maus von mehr als 30 Wochen wurden ver-

5

10

15

20

25

30

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40

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50

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60

65

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wendet, um die Wirkung einer 100 mg/kg Dosis von L- agglutinations-Reaktion und die verzögerte Hypersensibi-

Oarnosin zu beobachten. liÉPUHgS-RMktiûfi 2U böööaolltöll.

Versuchsresultate

(c) Die Veränderung der Menge an L-Carnosin wurde 5 Die Versuchsresultate sind aus der folgenden Tabelle II eingesetzt, um die Wirkung auf die PFC-Reaktion, die Häm- zu entnehmen.

Tabelle II

Wirkung von L-Carnosin auf die PFC-Reaktion und die Hämagglutinations-Reaktion (HA-Titer) einer mit verschiedenen Dosen an SRBC immunisierten Manus

PFC-Zahl (%)

SRBC Antigenmenge pro Kammer pro Milz Gewicht der pro g Milz Anti-SRBC

Milz (g) Antikörperwert

30,2 + 2,9

5,1 x 104

0,12

4,2 x 105

3

normal

(100)

(100)

(100)

(100)

L-Carnosin

39,4 + 3,8

6,9 x 104

0,14

5,0 x 105

4

*

(130)

(135)

(117)

93,2 + 2,9

18,6 x 104

0,12

15,5 xlO5

9

normal

(100)

(100)

(100)

(100)

L-Carnosin

67,1+4,8

12,2 x 104

0,15

8,2 x 105

7

**

(72)

(66)

(125)

(53)

124,3 + 3,6

24,9 x 104

0,17

14,3 x 105

10

normal

(100)

(100)

(100)

(100)

L-Carnosin

86,3 + 5,5

21,1 xlO4

0,21

10,2 x 105

8

***

(69)

(85)

(124)

(71)

Einer Gruppe von Mäusen, welchen L-Carnosin (100 mg kg Tag S.C.) während 6 Tagen verabreicht worden war. und einer Gruppe von normalen Mäusen wurden rote Blutzellen von Schafen (SRBC) durch die Schwanzvenen zur Immunisierung injiziert, und nach 4 Tagen wurde die PFC-Reaktion durchgeführt. Die Werte sind in einem Durchschnitt von 5 Mäusen + S.D. dargestellt.

35 * P<0,01

** P< 0,001 Kontrollgruppe

***Blut wurde nach der PFC-Reaktion gesammelt, aus welchem das Serum am nächsten Tag für den Aggutinations-Test abgetrennt wurde. Für den Antikörperwert (N) wird die 40 maximale Verdünnung, welche positive Reaktion zeigt, dargestellt durch 2N, worin N den Antikörperwert bedeutet.

Tabelle III

Wirkung von L-Carnosin auf die PFC-Reaktion und die Hämagglutinations-Reaktion (HA-Titer) bei Mäusen von verschiedenem Alter, welche mit SRBC immunisiert wurden

PFC-Zahl (%)

Alter L-Carnosin pro Kammer pro Milz Gewicht der pro g Milz Anti-SRBC

(Wochen) Milz (g) Antikörperwert

N**

69,7 + 5,9

ll,2x 104

0,15

7,5 x 105

9-10

(100)

(100)

(100)

(100)

+ *

50,8 + 1,9

6,7 x 104

0,14

4,8 x 105

6-7

(73)

(60)

(93)

(64)

79,7 + 8,8

17,1 xlO4

0,15

ll,4x 105

9-10

-

(100)

(100)

(100)

(100)

+

85,3 + 7,2

18,8 x 104

0,15

12,5 x 105

9-10

(107)

(110)

(100)

(110)

40,4 + 2,5

12,6 x 104

0,19

6,6 xlO5

4-5

-

(100)

(100)

(100)

(100)

+ *

82,5+4,4

26,8+ 104

0,23

11,7 x 105

9

(204)

(213)

(121)

(177)

Einer Gruppe von Mäusen, welchen L-Carnosin verabreicht worden war (100 mg/kg/Tag S.C.) während 9 Tagen und einer Gruppe von normalen Mäusen wurden 2,5 x 108 rote Blutzellen von Schafen (SRBC) durch die Schwanzvenen zur Immunisierung injiziert, und nach 4 Tagen wurde die PFC-Reaktion durchgeführt. Die Werte sind als Durchschnitt von 5 Mäusen ± S.D. gezeigt.

Tabelle IV

Wirkung von verschiedenen Mengen an L-Carnosin auf die PFC-Reaktion und die Hämagglutinations-Reaktion (HA-Titer) bei mit SRBC immunisierten Mäusen

Menge an

Gewicht der

Anti-SRBC Anti-

L-Carnosin pro Kammer pro Milz

Milz (g)

pro g Milz körper-Wert N**

0 mg/kg

60,3 + 8,9

8,7 x 104

0,15

5,7 x 105

8

(100)

(100)

(100)

(100)

25 mg/kg

53,0 + 6,1

10,7 x 104

0,14

7,6 xlO5

9 Î

(88)

(123)

(92)

(133)

50 mg/kg

73,6 + 6,2

14,9 x 104

0,18

8,5 xlO5

10 Î

(122)

(171) .

(116)

(149)

250 mg/kg

69,8 + 6,5

14,6 x 104

0,15

9,5 x 105

9 î

**

(116)

(168)

(100)

(167)

500 mg/kg

64,8 + 4,9

8,3 x 104

0,14

6,1 x 105

8 -►

(107)

(95)

(89)

(107)

5 666188

* P< 0,001 Kontrollgruppe.

** Blut wurde nach der PFC-Reaktion gesammelt, aus welchem am nächsten Tag Serum für den Agglutinationstest abgetrennt wurde. Für den Antikörperwert (N) wird die maxi-5 male Verdünnung, welche positive Reaktionen zeigt, dargestellt durch 2n, worin N den Antikörperwert bedeutet.

Einer Gruppe von Mäusen, welchen L-Carnosin während 6 Tagen verabreicht worden war, und einer Gruppe von normalen Mäusen wurden 2,5 x 108 rote Blutzellen von Schafen (SRBC) durch die Schwanzvenen zur Immunisierung injiziert, und nach 4 Tagen wurde die PFC-Reaktion durchgeführt. Die Werte sind als Durchschnitt von 5 Mäusen + S.D. gezeigt.

'* P<0,01

** P < 0,05 Kontrollgruppe

***Blut wurde nach der PFC-Reaktion gesammelt, aus welchem am nächsten Tag Serum für den Agglutinationstest abgetrennt wurde. Für den Antikörperwert (N) wird die maximale Verdünnung, welche positive Reaktion zeigt, durch 2N dargestellt, worin N den Antikörperwert bedeutet.

Tabelle V

Wirkung von verschiedenen Mengen an L-Carnosin auf die verzögerte Hypersensibilisierungs-Reaktion (DHR) bei Mäusen

Menge an Dickenzuwachs des Ohrs

L-Carnosin xl0-3cm Kontrolle %

(mg/kg/Tag)

0 11,5 ±4,0 (100)

50 14,1 ±3,6 122,6

250 15,7 + 2,5* 136,5

500 21,3 ±8,7* 185,2

L-Carnosin wurde subcutan in den angegebenen Mengen während 14 Tagen verabreicht. Am 7. Tag wurde die Sensibilisierung durch 1 % Picrylchlorid durchgeführt und die Prüfung erfolgte 7 Tage später. Die Werte sind als Durchschnitt von 8 Mäusen + S.D. gezeigt.

* P < 0,05 Kontrollgruppe.

65

Untersuchung der experimentellen Resultate 1. Die Wirkungen auf die PFC-Reaktion und die Häm-agglutinations-Reaktion (HA-Titer) bei einer reifen Maus im Fall von verschiedenen Dosen von Antigen.

Eine Untersuchungsmethode dafür ist eine Standard-Methode zur Trennung (screening) von immuno-regulieren-den Substanzen. Unter der Bedingung, eine kleinere Menge an Antigen zu verwenden, um das Ansprechen des Antikörpers in einer normalen Milz eines Tieres niedrig zu halten, wird die Reaktion verstärkt, während im Fall der Verwendung einer grösseren Menge an Antigen um das Ansprechen zu verstärken, wird die Reaktion unterdrückt. Nachdem 100 mg/kg L-Carnosin während 6 Tagen verabreicht worden waren, wurde die Sensibilisierung mit 5 x 107 Zellen, 5 x 108 Zellen oder 2,5 x 109 Zellen von SRBC durchgeführt. Die PFC-Reaktion und die Hämogglutinations-Reaktion nach 4 Tagen sind in Tabelle II zusammengestellt. Bei der normalen Gruppe war das PFC proportional zur Antigenmenge erhöht, während in der L-Carnosin-Dosierungsgruppe das PFC um 30% zunahm für die kleine Antigenmenge (5 x 107 SRBC) und 30% abnahm für die grosse Antigenmenge (5 x 108,2,5 x 109 SRBC). Diese Resultate können durch die Hämogglutinations-Reaktion auf SRBC unterstützt werden, in welcher die Reaktion mit 5 x 108 SRBC nicht geändert wurde, aber von 3 bis zu 4 anstieg für 5 x 107 SRBC und von 10 auf 8 abnahm für 2,5 x 109 SRBC.

2. Wirkungen auf die PFC-Reaktion und die Hämogglutinations-Reaktion im Fall von verschiedenem Alter einer Maus.

Eine unreife Maus wies im allgemeinen eine höhere Immunoantwort auf als eine reife Maus, und die Immunoantwort nahm mit zunehmeödem Alter der Maus ab. Tabelle III zeigt die Resultate des Vergleiches, in welchem Mäuse von 2, 5 und 30 Tagen je mit 100 mg/kg L-Carnosin während 9 Tagen behandelt worden waren und mit der normalen Maus verglichen wurden. Keine Wirkung auf die PFC-Antwort wurde beobachtet bei der reifen Maus von 5 Wochen, aber die Immunoantwort wurde bei der unreifen Maus von 2 Wochen unterdrückt, während die niedere PFC-Antwort doppelt verstärkt wurde bei der alten Maus von 30 Wochen. Diese Resultate wurden auch durch die Hämogglutinations-Reaktion bestätigt.

35

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6

3. Wirkungen auf die Immuno-Antwort durch verschiedene Dosen an L-Carnosin.'

Wie oben beschrieben, weist L-Carnosin immuno-regu-lierende Wirkung auf, doch ist es dafür bekannt, in einer optimalen Dosis zur Erzeugung einer Wirkung des Immuno- s Regulators verwendet zu werden, welcher ein inhibitorisches Phänomen zeigt, wenn in übermässiger Menge über einem gewissen Spiegel angewendet, und verschieden ist von anderen Medikamenten, welche ein proportionales Verhältnis zwischen der Dosierungshöhe und der Wirkung aufweisen. io Dieser Mechanismus ist bisher nicht bekannt und wurde für L-Carnosin untersucht. Die PFC-Reaktion für die Maus von 5 Wochen in der Höhe von 2,5 x 108 SRBC wurde durch die Dosis von 50 und 250 mg/kg während 6 Tagen erhöht, herabgesetzt durch die Dosis von mehr als 500 mg/kg. Die Hä- 15 mogglutinations-Reaktion wurde ebenfalls in der Höhe von über 500 mg/kg herabgesetzt (Tabelle IV). Die DHR mit 1% Picrylchlorid weist eine zunehmende Reaktionstendenz auf, abhängig von den Dosen von 50 bzw. 250 und 500 mg/kg (Tabelle V). Durch die Tatsache, dass die DHR erhöht wird, 20 wird bestätigt, dass L-Carnosin eine immuno-regulierende Wirkung ausübt.

Voraussichtliche klinische Anwendung:

Aus den experimentellen Resultaten bei Tieren in der hämolytischen Plattenmethode (PFC) und der verzögerten Hy- 25 persensibilisierungs-Reaktion (DHR) ist zu entnehmen, dass die optimale Dosierung für die immuno-regulierende Wirkung 100 mg/kg/Tag an L-Carnosin (auf subcutanem Weg) beträgt, woraus die Dosis von 5 g/Tag für Erwachsene, mit einem Körpergewicht von 50 kg, errechnet wird. Die Be- 30 standteile von L-Carnosin sind ß-Alanin und L-Histidin,

welche Aminosäuren in vivo darstellen. L-Carnosin ist daher ein äusserst sicherer Immuno-Regulator, welcher ohne Gefahr von Nebenwirkungen verwendet werden kann.

Klinisch anwendbare Immuno-Erkrankungen:

L-Carnosin wird nicht spezifisch für Erkrankungen verwendet, welche durch Immuno-Abnormalitäten hervorgerufen werden. Beispielsweise können die folgenden Erkrankungen genannt werden:

Serum-Erkrankung, Lupus erythematosus, verschiedene Arten von Rheumatismus, gemischte Clioglobulinemie, gemischte kollektive Gewebeerkrankungen, HBV (Gelbsuchtvirus B-Typus) Antigen-Antikörper-Komplex-Erkrankung, Immunoblaten-lymphadenitis, Scleroderma, Mesenchyma-ataxis-Syndrom, schwere Myasthenie, Hashimoto-Krankheit, Basedow-Krankheit, Asmyloidosis, Behcet-Syndrom, Immuno-Insufficience-Syndrom, Hodgkin-Krankheit, Multiple Sclerose, organspezifische Auto-Immun-Erkrankung und andere.

L-Carnosin scheint sehr geeignet zu sein als immunoregulierende Substanz für die Transplantation von Organen.

Der Immuno-Regulator gemäss der vorliegenden Erfindung, wie er oben beschrieben wurde, kann in jeder beliebigen Form vorliegen, welche ermöglicht, L-Carnosin bequem auf oralem oder parenteralem Wege zu verabreichen, wie z.B. injizierbare Lösungen, Pulver, Granulate, Tabletten, Kapseln, «enteric coatings», Inhalationsmittel, Plättchen, Salben und andere. Diese Mittel können einzeln oder zusammen verabreicht werden, je nach den Symptomen. Eine Do- ' sis kann innerhalb weiter Grenzen variiert werden, je nach der Verabreichungsart, dem Typus und der Form des Mittels und den Symptomen. Beispielsweise sind typische Formen, Dosen und Verabreichungswege für das Medikament gemäss der Erfindung im folgenden zusammengestellt.

Form Dosis und Verabreichungsweg

Injektionslösung 5% Lösung, 0,1 bis 1,0 ml jedesmal, lokale Injektion

Salbe 1% Salbe, 1 g jedesmal, örtliche

Anwendung

Die Dosen und Verabreichungswege sind lediglich zur Illustrierung gezeigt und können in einem weiten Bereich verändert werden, je nach den Symptomen der Patienten,

dank der hohen Sicherheit von L-Carnosin.

L-Carnosin ist leicht löslich in Wasser, so dass seine 0,3%ige oder l,0%ige isotonische Lösung leicht durch aseptische Verarbeitung hergestellt werden kann. Die isotonische Lösung kann in einer Ampulle unter einem inerten Gas zur Injektion mit einer üblichen Spritze versiegelt werden. Andererseits kann auch L-Carnosin-Pulver, welches zuvor lyophilisiert und unter aseptischen Bedingungen in einer Ampulle oder Flasche versiegelt wurde, aufgelöst werden, um 0,3%ige, 0,5%ige oder l,0%ige isotonische Lösung unmittelbar vor der Injektion zuzubereiten.

Pulver, Granulate, Tabletten oder Kapseln für orale Dosierung können mit üblichen bekannten Methoden hergestellt werden, unter Verwendung von Bindemitteln, wie si-rupförmigem Gummi arabicum, Gelatine, Sorbit, Traga-canth oder Polyvinylpyrolidon; Excipienten, wie Lactose, Maisstärke, Calciumphosphat, Sorbit oder Glycerin; Schmiermittel, wie Magnesiumstearat, Talk, Polyäthylengly-kol, Hydroxypropylmethyl-Cellulose oder Siliciumdioxid; Streckmittel (disintegrants), wie Kartoffelstärke; oder Schmiermittel, wie Natriumsulfolaurat (sodium sulfric lau-

45 rate). Die Tabletten können auf bekannte Weise überzogen werden.

Für die Herstellung der Salbe wird L-Carnosin-Pulver in einer genügenden Menge um die Salbe von gewünschter Konzentration zu bilden, mit einer Salbengrundlage ver-50 mischt, z.B. gebleichtem Wachs, Walfett (whale wax), dehydriertem Lanolin, weisser Vaseline, höheren Alkoholen, Ma-crogolen oder Piastibasen (z.B. die Salbengrundlage aus Kohlenwasserstoffgel von Taisho Pharmaceutical Co., Ltd.), hydrophilen Salben, absorptiven Salben oder Gemischen dass von, zu welchen, falls erwünscht Öle (z. B. Sesamöl, Erdnuss-öl oder Olivenöl), Harze, Glycerin, Propylenglykol, oberflächenaktive Mittel, Fungizide, antifungaie Mittel, Antioxidantien und andere zugesetzt werden können, worauf das Gemisch homogen geknetet wird.

60 Das erflndungsgemässe Immuno-Regulator-Präparat wird durch die folgenden Beispiele noch näher illustriert.

Beispiel 1 (injizierbare Lösung) ss Synthetisches L-Carnosin wurde unter aseptischen Bedingungen aufgelöst, um seine 0,3%ige, 0,5%ige oder l,0%ige isotonische Lösung zu bilden, welche sodann in Ampullen abgefüllt wurde.

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Beispiel 2 (Granulate)

Synthetisches L-Carnosin wurde verwendet, um Granulate der folgenden Zusammensetzung herzustellen:

L-Carnosin 0,2 g

Lactose 0,34 g

Maisstärke 0,45 g

Hydroxypropylmethylcellulose 0,01 g

Granulat 1,00 g

Beispiel 3 (Salbe)

Synthetisches L-Carnosin und eine Salbengrundlage aus Kohlenwasserstoffgel wurden verwendet, um eine 1 %ige Salbe der folgenden Zusammensetzung herzustellen: L-Carnosin 1,0 g

Kohlenwasserstoffgel 99,0 g

Salbe 100,0 g s

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65