DE3540632A1

DE3540632A1 - Immun-regulator

Info

Publication number: DE3540632A1
Application number: DE19853540632
Authority: DE
Inventors: Kineshiro Tokio/Tokyo Nagai; Taiko Kashiwa Chiba Suda
Original assignee: Nihon University; University of Tokyo NUC
Current assignee: Nihon University; University of Tokyo NUC
Priority date: 1985-02-13
Filing date: 1985-11-15
Publication date: 1986-08-21
Also published as: DK171288B1; FR2577138A1; GB2170707A; US4717716A; SE8505121D0; DK500585D0; CH666188A5; SE466787B; JPH0481966B2; DK500585A; JPS61186322A; GB2170707B; GB8527243D0; SE8505121L; NL8600112A; DE3540632C2; FR2577138B1

Description

₂ " 3540G32

Die Erfindung betrifft einen Immun-Regulator, der als wirksamen Bestandteil L-Carnosin oder eines seiner Salze enthält.

Zur Behandlung verschiedener Krankheiten, die durch eine abnormale Funktion der Immunität verursacht werden, wurden verschiedene pharmazeutische Mittel, die im allgemeinen als "Immun-Regulatoren" bezeichnet werden, entwickelt. Der Ausdruck "Immun-Regulator", wie er in der vorliegenden Anmeldung verwendet wird, bedeutet Mittel zur Wiederherstellung der Immunreaktion von ihrem abnormalen Abfall und die Unterdrückung ihrer übermäßigen Beschleunigung, so daß die normale Immunitätsfunktion erhalten bleibt. Als Mittel, die zu dieser Kategorie gehören, wurden verschiedene Arten von Mitteln einschließlich Levamisol (Aldrich Corporation) entwickelt. Diese bekannten Immun-Regulatoren leiten sich jedoch von chemischen Materialien und nicht von biologischen Materialien ab, so daß ihre gefährlichen Nebenwirkungen nicht vollständig beseitigt werden können. In der Tat wird für einige Immun-Regulatoren über schlimme Nebenwirkungen berichtet.

Im wesentlichen besitzt die Immun-Reaktion die physiologische Funktion, die Homöostase zu erhalten, die durch physiologisch aktive Substanzen, die im lebenden Körper vorkommen, reguliert wird.

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, einen Immun-Regulator aus einer physiologisch aktiven Substanz zur Verfügung zu stellen, der wer.-ger Nebenwirkungen zeigt im Vergleich mit solchen, die aus bekann-

35 ten chemischen Substanzen gewonnen werden.

Die Erfindung betrifft einen L-Carnosin oder sein Salz als aktiven Bestandteil enthaltenden Immun-Regulator.

Es wurde durch Untersuchungen der physiologischen Wirkung von cu-Aminosäuren, die in einem lebenden Körper vorhanden sind, während mehrerer Jahre gefunden, daß L-Carnosin, bei dem es .sich um ein physiologisch aktives Derivat handelt, eine inimunregulierende Funktion aufweist. Bisher wurde kein physiologisch aktives Mittel gefunden, das eine solche immunregulierende Funktion aufweist. Es war weiterhin nicht bekannt, daß L-Carnosin eine Immun-Regulationswirkung besitzt.

L-Carnosin oder ß-Alanyl-L-histidin wurde in Liebig's Fleischextrakt durch Gulewitsch im Jahre 1900 entdeckt und ist ein Dipeptid, das aus L-Histidin und ß-Alanin besteht und im Überschuß in den Säugetier-Skelettmuskeln auftritt.

Seit der Entdeckung von L-Carnosin wurde seine physiologische Bedeutung und seine pharmakologische Verwendung von vielen Forschern untersucht, bis jetzt jedoch ohne Ergebnis.

L-Carnosin liegt in Form eines geschmacklosen, geruchslosen, leicht wasserlöslichen und weißen kristallinen Pulvers mit einem Schmelzpunkt von 250⁰C und [a]_ß = +20,0 (H₂O) vor. Es besitzt die folgende Strukturformel:

HC = C - CH₂CHCOOH ³⁰ HN N NH - COCH₀CH₉NH₀

Es besitzt in wäßriger Lösung einen pH-Wert im Bereich von 8,0 bis 8,5.
35

L-Carnosin ist eine Substanz, die im Überfluß in verschiedenen Säugetier-Skelettmuskeln (etwa 0,1 bis 0,350 vorkommt, und wird normalerweise aus Fleischnahrungsmitteln als Vorratsquelle für eine essentielle Aminosäure L-Histidin gewonnen. Es kann weiterhin aus L-Histidin und ß-Alanin biosynthetisiert werden. L-Carnosin, welches absorbiert ist,wird durch Carnosinase zu L-Histidin und ß-Alanin, die einen Nährwert besitzen, zersetzt, wovon ein Teil zu L-Carnosin resynthetisiert wird [ß-Alanyl-1-methyl-histidin (Anserin) ist als Zwischenprodukt der L-Carnosin-Biosynthese bekannt].

Wie oben beschrieben, ist L-Carnosin eine nahrungsmittelähnliche Substanz mit hoher Sicherheit und kann nach Absorption durch Carnosinase, die in verschiedenen inneren Organen vorhanden ist, zersetzt werden. Es unterscheidet sich so stark von anderen Pharmazeutika, die in der Leber metabolisiert werden und für die Leberfunktion eine große Belastung darstellen.

Im folgenden wird die akute Toxizität von L-Carnosin erläutert.

Akute Toxizität

L-Carnosin wird peritoneal oder oral in unterschiedlichen Mengen einer Gruppe von 10 Mäusen verabreicht und die Symptome der akuten Toxizität werden 5 Stunden nach Verabreichung beobachtet. Die LDcq wird aus der Zahl der Todesfälle nach 72 Stunden entsprechend dem Vander Waerden-Verfahren berechnet. L-Carnosin wird in einer physiologischen Salzlösung gelöst, so daß man eine Dosis von 0,1 bis 0,3 ml/10 g erhält.

Man beobachtete die folgenden toxischen Symptome von L-Carnosin.

Etwa 30 Minuten nach der peritonealen Verabreichung von 15 000 mg/kg (LD₁₀₀) zeigte die Hälfte der Mäuse eine Unterdrückung der motorischen Beweglichkeit, der Abdomenposition, eine Unterdrückung und Unregelmäßigkeit der Atmungsgeschwindigkeit, die Abwesenheit des Verschwindens der Rechts- und Fluchtreflexe, eine Schwanzerhöhungsreaktion und Myoclonia. Weitere progressive Symptome ergeben sich wiederholende Seitendrehungen, Reflexbeschleunigung beim. Kontakt mit Stimulierung, Konvulsionen und schließlich tonische Krämpfe bis zum Tod. · 50%, 80% und 100% der Mäuse starben nach 30 Minuten, 2 Stunden bzw. 5 Stunden. Die orale Verabreichung von 15 000 mg/kg zeigte nur eine geringe Wirkung, jedoch wurde eine von 10 behandelten Mäusen nach 12 Stunden getötet.

Tabelle 1 LD,-₀ von L-Carnosin

Verabreichungsweg ^DrQ (95%ige Vertraulichkeits-

^D grenze), mg/kg

20 peritoneal 9 087 (8 320 - 9 925)

oral >14 930 (minimale letale Dosis)

Die akute Toxizität (Wert nach 72 Stunden) bei DDY-Mäusen (männlich) ist in der Tabelle angegeben. Wie erkennbar, ist L-Carnosin eine Verbindung mit sehr geringer Toxizität.

Vor 10 Jahren wurde L-Carnosin als Mittel zur Behandlung einer Anorexie von der LISA Corporation in Spanien verkauft und als sicher bestätigt. Weiterhin beträgt eine wirksame Menge von L-Carnosin für transplantierbare Tumore 1 mg/Maus oder 50 mg/kg. Diese Menge entspricht 1/181 der akuten Toxizität LD₅₀ (9 087 mg/kg) bei peritonealer Verabreichung und stellt somit eine hohe

35 Sicherheit von L-Carnosin sicher.

Es ist ein synthetisches Verfahren zur Herstellung von L-Carnosin "bekannt [Journal of Biological Chemistry, 108, 753 (1935)]. L-Carnosin kann durch Chlorierung von Carbobenzoxy-ß-alanin mit Phosphorpentachlorid, BiI-dung seines Methylesters mit Methanol, Bildung des Azids über ein Hydroazid, Kuppeln des Azids mit L-Histidinmethylester und schließlich Entfernung der Carbobenzoxy-Gruppe mittels katalytischer Reduktion hergestellt werden. Die Erfindung betrifft ein Behandlungsmittel, welches ein Salz von L-Carnosin enthält, wie Salze an der Carboxylgruppe, die Säureaddukte mit pharmazeutisch annehmbaren Säuren an der Aminogruppe und Salze sowohl an der Carboxyl- als auch an der Aminogruppe. Als Salze an der Carboxylgruppe können Salze mit einem Metall, wie Natrium, Kalium, Calcium, Magnesium, Zink und Aluminium, wie auch substituierte Ammoniumsalze, wie Salze mit Trialky!aminen (z.B. Triethylamin) und anderen Aminen erwähnt werden. Als Salze an der Aminogruppe können Salze mit organischen und anorganischen Säuren, wie Chlorwasserstoffsäure, SuIfonsäure, Phosphorsäure, Essigsäure, Propionsäure, Milchsäure, Weinsäure, Citronensäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure, Benzolsulfonsäure und Toluolsulfonsäure, erwähnt werden. Diese Salze können in an sich bekannter Weise durch Umsetzung des freien L-Carnosins mit einer stöchiometrischen Menge der ausgewählten Säure oder Base hergestellt werden.

Die signifikante Immun-Regulationswirkung von L-Carnosin wird anhand der folgenden Versuchsbeispiele beschrieben.

Versuchsverfahren

Die Immun-Regulationswirkung wird gemäß dem hämolytischen Plättchen-Verfahren (PFC), einem Hämagglutinationstest und einer verzögerten Hypersensibilitatsreaktion unter Verwendung von Mäusen bewertet.

l (1) PFC-Verfahren

Die Antikörper erzeugende Kapazität wird bewertet, indem man die plättchenbildenden Zellen mittels eines modifizierten Canningham-Verfahrens oder eines Flüssigkeitskammer-Gleitverfahrens bestimmt [Hashimoto et al., Experimental Method for Immunity A, S.491-494 (1972), herausgegeben von Japan Immunology Academy], Für die Sensibilisierung werden rote Schafblutzellen (SRBC, geliefert von Shizuoka Experimental Animal Corporation) verwendet, welche im Prinzip mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) verdünnt sind, wobei man eine Lösung herstellt, welche 12,5 x 10⁸ SBRC/ml enthält. 0,2 ml (2,5 x 10 Zellen) davon werden in die Schwanzvene einer DDY-Maus (männlich, 5 Wochen alt, erhältlich von Shizuoka Experimental Animal Corporation) injiziert. Als Reaktionsmedium wird ein Eagle MEM-Medium verwendet, das 10% Rinderfetalserum (FCS) (erhältlich von Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) enthält, wobei damit 0,1 ml von 4 χ 10⁷ Milzzellen/ml Lösung, 0,5 ml von 2,5 x 10⁹ SRBC/ ml Lösung (12,5 x 10 Zellen) und 0,4 ml eines 1/4 verdünnten Komplementärserums eines Meerschweinchens vermischt werden, um eine gemischte Lösung zu erhalten, die dann fest in einer Kammer verschlossen und 1 h auf 37 C erwärmt wird. Entsprechend diesem Verfahren werden 50 bis 150 PFC-Zellen in etwa 0,02 ml der Kammer nachgewiesen.

(2) Bestimmung des Serum-Antikörper-Wertes

Blut wird in der PFC-Reaktion aus den Carotidarterien einer Gruppe von fünf Mäusen isoliert. Daraus wird das Serum auf an sich bekannte Weise zur Bestimmung des Hämagglutinationstiters (HA-Titer) abgetrennt. Das Testserum wird mit einer phosphatgepufferten Salzlösung (PBS), welche 0,5 bis V₁O Serum aus normalem Kaninchen enthält, verdünnt und dann unter Verwendung von SRBC bewertet. Die

maximale Verdünnung, die eine positive Reaktion zeigt, wird durch 2 dargestellt, wobei N den Antikörperwert bedeutet.

⁵ (3) Verzögerte Hypersensibilitätsreaktion

[Natsuume et al., Experimental Method of Immunity A, S.614 bis 620 (1972), Japan Immunology Academy] Es wird eine männliche, 5 Wochen alte DDY-Maus mit einem Gewicht von etwa 20 g zum Nachweis der Kontaktdermatitis mittels 2,4,6-Trinitro-chlorbenzol (Picrylchlorid) (erhältlich von Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) verwendet. Eine 1?£ige Picrylchloridlösung in Ethanol wird zum Imprägnieren von Mull in vier Lagen (1x1 cm) verwendet. Dieser wird dann 10 s auf das rasierte Abdomen der Maus aufgelegt, wobei eine primäre Sensibilisierung erfolgt. Die zweite Sensibilisierung für den Versuch erfolgt am 7. Tag durch Anwendung einer 1%igen Picrylchloridlösung in Olivenöl auf beide Oberflächen eines Ohrs mittels einer Bürste. Auf das andere Ohr wird als Kontrolle nur Olivenöl aufgebracht. Nach 24 h wird die Maus mit Ether anästhesiert und die Dicke des Ohrs auf 1/100 mm mittels eines Mikrometers mit einer Präzision von 1/1000 mm bestimmt. Die verzögerte Hypersensibilisierungsreaktion wird wie folgt berechnet: (Dicke des Ohrs, auf das Picrylchlorid aufgebracht wurde, nach 24 h - Dicke des Ohrs vor der Anwendung) minus (Dicke des Ohrs, auf das Olivenöl aufgebracht wurde, nach 24 h - Dicke des Ohrs vor der Anwendung).
30

(4) Versuche für die Immun-Regulationswirkung von L-

Carnosin wurden durchgeführt, indem man die Menge an Antigen, die Dosis von L-Carnosin und das Tieralter variierte. Man arbeitete beim Standard mit einer Antigen-

Menge von 2,5 x 10 SRBC und einer 5 Wochen alten Maus unter den folgenden Bedingungen:

l (a) Variation der Antigen-Menge

Es wurden sensibilisierende Antigen-Mengen im Bereich von 5 x 1O^ bis 2,5 χ 10^ SRBC zur Beobachtung der Wirkung von 100 mg/kg Dosis L-Carnosin verwendet.

(b) Variation des Mausalters

Mäuse mit einem Alter im Bereich von unreifer Maus von 2 Wochen bis alter Maus älter als 30 Wochen werden verwendet, um die Wirkung einer 100 mg/kg Dosis L-Carnosin festzustellen.

(c) Die Menge an L-Carnosin wurde variiert, um die Wirkung auf die PFC-Reaktion, die Hämagglutinationsreaktion und die verzögerte Hypersensibilitätsreaktion festzu-

15 stellen.

ω ω

fcO

to t-*

μ-¹

folgenden Tabellen angegeben.
Tabelle 2

cn ι-¹

5 χ 10

L-Carnos in

ρ

L-Carnosi η

2.5 χ 10⁹

L-Carnos in

pro Kammer

PFC-Zahl (%)

pro g

war

Anti-SRBC

•

O

•

cn O

cn

O cn

O

Normal

5 χ 10⁸

30.2 ± 2.9

Gewicht

Milz

Antikörper-Wert

Versuchsergebnisse

Normal

(100)

pro Milz d.Milz(g)

4.2 χ 10⁵

3

Die Versuchsergebnisse

sind in den :

auf die PFC-Reaktion und die Hämagglutinationsreaktion (HA-Titer)

5.1 χ 10⁴ 0.12

(100)

-

Einfluß von L-Carnosin

der Maus, die mit verschiedenen Dosismengen an SRBC immunisiert worden

39 .4 + 3.8
(130)

(100) (100)

SRBC

93.2 + 2.9

5.0 χ 10
(119)

4

Antigen-Menge

(100)

6.9 χ 10⁴ 0.14
(135) (117)

15.5 x 10⁵

9

18.6 x 10⁴ 0.12

(100)

cn

M/~) rmrj 1

67.1 + 4.8

(100) (100)

CD

LiUJ. IL(Cl J-
-7

( 72)

*

8.2 χ 10⁵

7

CD

124.3 + 3.6

12.2 χ 10^ 0.15

( 53)

CO

(100)

( 66) (125)

14.3 χ 10⁵

10

ro

86.3 ± 5.5

24.9 x 10⁴ 0.17

(100)

( 69)

(100) (100)

10.2 χ 10⁵

8

21. 1 χ 10⁴ 0.21

( 71)

( 85) (124)

11

Einer Gruppe von Mäusen, denen man L-Carnosin (100 mg/ kg/Tag s.c.) während 6 Tagen verabreicht hatte, und einer Gruppe von normalen Mäusen wurden rote Schafblutzellen (SRBC) durch ihre Schwanzvenen für die Immunlsierung verabreicht. 4 Tage danach wurde die PFC-Reaktion durchgeführt. Die Werte sind als durchschnittliche Werte von fünf Mäusen + S.D. (Standardabweichung) angegeben.

+ P <^ 0,01 10 ++P <C0,001 Vergleichsgruppe

+++ Blut wird nach der PFC-Reaktion entnommen, daraus wird am nächsten Tag für den Agglutinationstest Serum abgetrennt. Für den Antikörper-Wert (N) wird die maximale Verdünnung, bei der man eine positive Reaktion erhält, durch 2 dargestellt, worin N den Antikörper-Wert bedeutet.

co	ω	to	to
CJl	ο	σι	ο
			Tabelle 3

αϊ σ cn ^

Wirkung von L-Carnosin auf die PFC-Reaktion und die Hämagglutinationsreaktion (HA-Titer) bei Mäusen mit unterschiedlichem Alter, die mit SRBC immunisiert worden waren

Alter L-Carnosin PFC-Zahl (%)

Wochen pro Kammer pro Milz Gewicht d. pro g Anti-SRBC ₊₊ Milz_T κ Milz Antikörper-Wert N

	+	■f.	69 .7 +	5.9	1 1 .2 χ	ΙΟ⁴	ΙΟ⁴	)	ΙΟ⁴	)	ΙΟ⁴	)	ΙΟ⁴	)	0.15	)	7.5 χ	1	0^b	9	- 10	ι	CO
			(100)		( 100	)			(100		(100	)					cn
2																O
			50.8 +	1.9	6. 7 χ	ΙΟ⁴		0. 14	)	4.8 χ	1	O⁵	6	- 7		CD
		+ f	( 73)		( 60	)		( 93		( 64	)					CO
		79 .7 +	8.8	17.1 χ		0. 15	)	11 .4 χ		ΙΟ⁵	9	- 10		K)
		(100)		( 100		( 100		(100	)
5
		85.3 +	7.2	18.8 χ	0. 15	)	12.5 χ		ΙΟ⁵	9	- 10
		(107)		(110	( 100		( 1 10	)				t
		40.4 +	2.5	12.6 χ	0.19	)	6.6 χ		ΙΟ⁵	4	- 5
ο		(100)		(100	(100		(100	)
	82.5 +	4.4	26.8 χ	0.23	)	11 .7 χ		ΙΟ⁵		9
	(204)		(21 3	(121		(177	)

l Bemerkung zu Tabelle 3:

Einer Gruppe von Mäusen, denen L-Carnosin (100 mg/kg/ Tag s.c.) während 9 Tagen verabreicht wurde, und einer

Gruppe von normalen Mäusen injizierte man 2,5 x 10 rote Schaf-Blutzellen (SRBC) durch ihre Schwanzvenen für die Immunisierung. Nach 4 Tagen wurde die PFC-Reaktion durchgeführt. Die Werte sind als Durchschnittswerte von fünf Mäusen + S.D. angegeben.

+ P <c0,001 Vergleichsgruppe

++ Das Blut wird nach der PFC-Reaktion entnommen, dann wird Serum am nächsten Tag für den Agglutinationstest abgetrennt. Für den Antikörper-Wert (N) wird die maximale Verdünnung genommen, die eine positive Reaktion ergibt. Diese wird durch 2 dargestellt, worin N den Anti-

15 körper-Wert bedeutet.

ω
cn

ω
O

mg/kg

pro

fcO
cn

to
O
Tabelle 4

t—'
cn

8.7 χ
(100

Milz

PFC-Zahl (%)
Gewicht der
Milz (g)

5.7
(1

pro
Milz

und

O Cn

I

mg/kg

60.3 ί
(100

10.7 χ
(123

10⁴
)

0. 15
( 100)

7.6
( 1

χ 10
00)

g

die Hämagglutinations-

Wirkung verschiedener Mengen
reaktion (HA-Titer) bei mit ,

mg / k'!

53.0 ±
( 88

an L-Carnosin auf die PFC-Reaktion
SRBC immunisierten Mäusen

14.9 χ
(171

10⁴
)

0.14
( 92)

8.5
(1

χ 10
33)

5

Anti-SRBC
Antikörper-Wert N

Menge an
L-Carnosin

mg/kg

73.6 ί
( 122

Kammer pro

14.6 χ
(168

10⁴
)

0.18
(116)

9.5
^v (.1

χ 10
49)

5

8

0

mg/kg

69.8 ±
(116

8.9
)

8. 3 x
( 95

10⁴
)

0.15
( 100)

6.1
( I

χ 10
67)

5

9 t

25

64.8 ±
(107

6. 1
)

10⁴
)

0.14
( 89)

χ 10
07)

5

10 ' f

50

6.2
)

5

9 t

250

6.5
)

8 -*·

500

4.9
)

l Bemerkungen zu Tabelle 4:

Einer Gruppe von Mäusen, denen L-Carnosin während 6 Tagen verabreicht wurde, und einer Gruppe von normalen

Mäusen injizierte man 2,5 x 10 rote Schafblutzellen (SRBC) durch ihre Schwanzvenen für die Immunisierung. Nach 4 Tagen wurde die PFC-Reaktion durchgeführt. Die Werte sind als Durchschnittswerte von fünf Mäusen + S.D. angegeben.

+ P <^ 0,01 ++ P < 0,05 Vergleichsgruppe +++ Nach der PFC-Reaktion wird Blut entnommen, aus dem am nächsten Tag Serum für den Agglutinationstest abgetrennt wird. Für den Antikörper-Wert (N) wird die maximale Verdünnung genommen, die eine positive Reaktion ergibt. Diese wird durch 2 dargestellt, wobei N den Anti-

15 körper-Wert bedeutet.

Tabelle 5

Wirkung verschiedener Mengen an L-Caraosin auf die verzögerte Hypersensibilitätsreaktion (DHR) bei der Maus

Menge an L-Carnosin Erhöhung in der Dicke des Ohrs (*g/kg/Tag) χ 10-3 _cm Vergleich %

O	11,5	± ⁴>°	(100)
50	14,5	+ 3,6	122,6
250	15,7	±2,5⁺	136,5
500	21,3	±"8_f7⁺	185,2

L-Carnosin wird subkutan 14 Tage lang in der angegebenen Menge verabreicht. Am 7.Tag wird die Sensibilisierung mit Hilfe von 1?£Lgem Picrylchlorid durchgeführt und die Bewertung 7 Tage später vorgenommen. Die Werte sind als Durchschnittswerte von acht Mäusen + S.D. angegeben.

P<;0,05 Vergleichs gruppe.

1 Auswertung der Versuchsergebnisse

1. Einfluß auf die PFC-Reaktion und die Hamagglutinationsreaktion (HA-Titer) einer reifen Maus im Falle unterschiedlicher Dosen an Antigen Das Testverfahren hierfür ist ein Standardverfahren zum Screenen der Immun-Regulatoren. Wird eine kleine Menge des Antigens verwendet., um eine niedrige Antikörper-Antwort bei der normalen Milz eines Tieres zu erhalten, so verstärkt sich die Reaktion, wohingegen bei Verwendung einer größeren Menge von Antigen zur Verstärkung der Antwort die Reaktion unterdrückt wird. Nach Verabreichung von 100 mg/kg L-Carnosin während 6 Tagen erfolgt die Sensibilisierung mit 5 x 10 Zellen, 5 x 10⁸ Zellen oder 2,5 x 10^ Zellen von SRBC. Die PFC-Reaktion und die Hamagglutinationsreaktion nach 4 Tagen sind in Tabelle 2 angegeben. Bei der normalen Gruppe erhöht sich PFC proportional mit der Antigenmenge, während bei der Gruppe, welche L-Carnosin erhalten hat, PFC um 30% bei einer geringen Antigenmenge (5 x 10 SRBC) erhöht wurde

und um 30?£ bei der großen Antigenmenge (5 x 10 und 2,5 x 10° SRBC) abnahm. Diese Ergebnisse werden durch die Hamagglutinationsreaktion gegenüber SRBC unterstützt, bei der sich die Reaktion für 5 x 10⁸ SRBC nicht ändert, jedoch um das 4- bis 5fache für 5 x 10 SRBC erhöht und um das 10- bis 8fache für 2,5 x 10⁹ SRBC erniedrigt.

2. Einfluß auf die PFC-Reaktion und die Hamagglutinationsreaktion im Falle von Mäusen unterschiedlichen Alters

Eine noch nicht erwachsene Maus zeigt im allgemeinen eine höhere Immun-Antwort als eine erwachsene Maus und die Immun-Antwort erniedrigt sich mit steigendem Alter der Maus. In Tabelle 3 sind die Ergebnisse von Vergleichsversuchen angegeben, wobei 2, 5 und 30 Wochen alten Mäusen je 100 mg/kg L-Carnosin während 9 Tagen verabreicht

wurden und diese mit einer normalen Maus verglichen wurden. Man beobachtete keine PFC-Antwort bei der reifen Maus mit einem Alter von 5 Wochen, Jedoch wurde die Immun-Antwort bei der nicht erwachsenen Maus mit einem Alter von 2 Wochen unterdrückt, wohingegen die niedrige PFC-Antwort bei der alten Maus mit einem Alter von 30 Wochen auf das Doppelte verstärkt wurde. Diese Ergebnisse werden ebenfalls durch die Hämagglutinationsreaktion unterstützt.

3. Einfluß auf die Immun-Antwort bei unterschiedlichen

Dosismengen von L-Camosin

Wie oben beschrieben, besitzt L-Carnosin eine immunregulatorische Wirkung, es ist jedoch nicht bekannt, daß es in optimaler Dosis verwendet wird, um einen Einfluß auf den Immun-Regulator auszuüben. Es zeigt ein Inhibitorphänomen, wenn es in überschüssiger Menge, bezogen auf einen bestimmten Wert, verabreicht wird, und unterscheidet sich von anderen Medikamenten, die eine porpor-v tionale Beziehung zwischen dem Dosisgehalt und der Wirkung besitzen. Dieser Mechanismus ist noch nicht bekannt und wurde für L-Carnosin untersucht. Die PFC-Reaktion

bei der 5 Wochen alten Maus in einer Menge von 2,5 x 10 SRBC wird bei einer Dosis von 50 und 250 mg/kg während 6 Tagen erhöht, klingt jedoch bei einer Dosis von mehr als 500 mg/kg ab. Die Hämagglutinationsreaktion klingt ebenfalls bei einem Gehalt von mehr als 500 mg/kg ab (Tabelle 4). Die DHR mit 1%igem Picrylchlorid zeigt einen Erhöhungstrend bei der Reaktion in Abhängigkeit von der Dosis von 50, 250 und 500 mg/kg (Tabelle 5). Durch die Tatsache, daß DHR erhöht wird, wird bestätigt, daß L-Carnosin eine Immun-Regulationswirkung besitzt.

Denkbare klinische Anwendung
Aus den Tierversuchsergebnissen bei dem hämolytischen

Ίο

Plättchenverfahren (PFC) und der verzögerten Hypersensibilitätsreaktion (DHR) geht hervor, daß die optimale Dosis für die Immun-Regulationswirkung 100 mg/kg/Tag L-Carnosin (subkutane Verabreichung) beträgt, woraus eine Dosis von 5 g/Tag für den Erwachsenen mit einem Körpergewicht von 50 kg zu errechnen ist. Die Bestandteile des L-Carnosins sind ß-Alanin und L-Histidin, die in vivo als Aminosäuren vorliegen. L-Carnosin ist somit ein sehr sicherer Immun-Regulator, der ohne Gefahr von Nebenwirkungen verwendet werden kann.

Immun-Krankheiten, die klinisch behandelt werden können L-Carnosin kann nichtspezifisch bei Krankheiten, die durch Immun-Abnormalität hervorgerufen werden, verwendet werden. Es können beispielsweise die folgenden Krankheiten erwähnt werden: Serumkrankheit, Lupus erythematosus, verschiedene Arten von Rheumatismus, gemischte Kryoglobulinämie, verschiedene, funktionell zusammenhängende Gewebekrankheiten, HBV (hepatisches Virus vom B-Typ), Antigen-Antikörper-Komplexkrankheiten, Immunoblast-Lymphadenitis, Sklerodermie, ataxisches Mesenchym-Syndrom, ernste Myasthenia, Hashimoto-Krankheit, Basedow-Krankheit, Amyloidose, Behcet-Syndrom, Immuno-Insuffienz-Syndrom, Hodgkin-Krankheit, Multiple Sklerose, organ-

25 spezifische Autoimmunkrankheit und andere.

L-Carnosin scheint als Immun-Regulator für die Transplantation von Organen besonders geeignet.

Der erfindungsgemäße Immun-Regulator, wie er oben beschrieben wurde, kann in irgendeiner Form vorliegen, die eine geeignete Verabreichung von L-Carnosin sicherstellt, z.B. auf dem oralen oder parenteralen Weg, wie als injizierbare Lösungen, als Pulver, Granulate, Tabletten, Kapseln, in enterischen Überzügen, Inhalationsmitteln,

Lutsclibonbons, Salben und anderen. Diese Mittel können einzeln oder in Kombination, abhängig von dem Symptom, verabreicht werden. Die Dosis kann innerhalb eines großen Bereichs variiert werden, abhängig von der Art der Verabreichung, dem Typ und der Form des Mittels und den Symptomen. Als Beispiele werden im folgenden typische Formen, Dosismengen und Verabreichungswege für das erfindungsgemäße Medikament angegeben.

Form Dosis und Verabreichungsweg

injizierbare Lösung 5%ige Lösung, jeweils 0,1 bis

1,0 ml, lokale Injektion

Salbe 1%ige Salbe, jeweils 1 g,

₁₅ lokale Applikation

Die Dosismengen und Verabreichungswege sind nur zur Erläuterung angegeben und können nach Belieben innerhalb eines großen Bereichs in Abhängigkeit von den Symptomen des Patienten aufgrund der hohen Sicherheit von L-Carnosin variiert werden.

L-Carnosin ist leicht in Wasser löslich, so daß leicht eine G,3#ige, O,5?6ige oder 1,0%ige isotonische Lösung aseptisch hergestellt werden kann. Die isotonische Lösung kann in Ampullen unter einem Inertgas für die Injektion mit einer bekannten Spritze abgefüllt werden. Alternativ kann L-Carnosin-Pulver, das zuvor lyophilisiert und in eine Ampulle oder ein Fläschchen unter aseptischen Bedingungen abgefüllt wurde, unter Herstellung einer 0,3&Lgen, 0,5?£igen oder 1,0?6igen iso tonischen Lösung unmittelbar vor der Injektion verdünnt werden.

Pulver, Granulate, Tabletten oder Kapseln für die orale Verabreichung können in an sich bekannter Weise unter

Verwendung von Bindemitteln, wie sirupartigem Gummiarabikum, Gelatine, Sorbit, Tragant oder Polyvinylpyrrolidon; Verdünnungsmitteln, wie Lactose, Maisstärke, Calciumphosphat, Sorbit oder Glycin; Schmiermitteln, wie Magnesiumstearat, Talk, Polyethylenglykol, Hydroxypropylmethylcellulose oder Siliciumdioxid; Desintegrationsmitteln, wie Kartoffelstärke; oder Gleitmitteln, wie Natriumschwefelsäurelaurat, hergestellt werden. Die Tabletten können in an sich bekannter Weise beschichtet werden.

Für die Herstellung einer Salbe wird L-Camosin-Pulver in einer ausreichenden Menge für die Herstellung der Salbe mit der gewünschten Konzentration mit einem Salben-Grundstoff, wie gebleichtem Wachs, Walwachs, dehydratisiertem Lanolin, weißer Vaseline, höheren Alkoholen, Makrogelen oder Piastibase (z.B. einem Salben-Grundstoff aus einem Kohlenwasserstoffgel von Taisho Pharmaceutical Co., Ltd.), einem hydrophilen Basen-Grundstoff, einem absorptiven Basen-Grundstoff oder einem Gemisch davon vermischt, wobei man zu diesem Gemisch gegebenenfalls Öle (wie Sesamöl, Erdnußöl oder Olivenöl), Harze, Glycerin, Propylenglykol, oberflächenaktive Mittel, Fungicide, Anti-Fungimittel, Antioxidantien und andere zugeben

25 kann und dann homogen verknetet.

Der erfindungsgemäße Immun-Regulator wird in den folgenden Beispielen erläutert.

30 Beispiel 1 In.ji zierbare Lösung

Synthetisches L-Carnosin wird unter aseptischen Bedingungen unter Herstellung einer 0,3/^igen, 0,5%igen oder 1,Obigen isotonischen Lösung gelöst, die dann in eine

35 Ampulle abgefüllt wird.

Beispiel 2 Granulate

Synthetisches L-Carnosin wird zur Herstellung von Granulaten der folgenden Zusammensetzung verwendet.

L-Carnosin	BeisOiel 3	0,2
Lactose	0,34
Maisstärke	0,45
Hydroxypropylmethylcellulose	0,01
Granulate	1,00

Salbe

Synthetisches L-Carnosin und ein Salben-Grundstoff aus einem Kohlenwasserstoffgel werden zur Herstellung einer 1,Obigen Salbe der folgenden Zusammensetzung verwendet.

L-Carnosin 1,0

Kohlenwasserstoffgel 99*0

20 Salbe 100,0

Claims

KRAUS ■ WElSERT & PARTNER

PATENTANWÄLTE

UND ZUGELASSENE VERTRETER VOR DEM EUROPÄISCHEN PATENTAMT

DR. WALTER KRAUS DIPLOMCHEMIKER -. DR.-ING. DIPU-ING. ANNEKÄTE WEISERT · DIPL.-PHYS. JOHANNES SPIES

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NIHON UNIVERSITY Tokyo, Japan

Immun-Regulator

Patentanspruch

Immun-Regulator, dadurch gekennzeichnet, daß er L-Carnosin oder eines seiner Salze als wirksamen Bestandteil enthält.