DE2709820C2

DE2709820C2 - N-(Mercaptoacyl)-L oder DL-cysteine, Verfahren zu ihrer Herstellung und diese Verbindungen enthaltende mucolytische Mittel

Info

Publication number: DE2709820C2
Application number: DE2709820A
Authority: DE
Inventors: Tadashi Dr. Sakai Osaka Fujita; Tadashi Dr. Tondabayashi Osaka Iso; Masayuki Osaka Oya; Hideo Kobe Hyogo Takashina
Original assignee: Santen Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Santen Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1976-03-08
Filing date: 1977-03-07
Publication date: 1982-07-29
Also published as: FR2344533B1; FR2344533A1; JPS535112A; US4305958A; SE7702129L; SE439484B; CA1079299A; GB1530071A; CH630069A5; JPS565388B2; US4137420A; DE2709820A1

Description

in der Z die Methylen-, Ethylen-, Ethyliden oder 2,2-Propylidengruppe bedeutet

2. Verfahren zur Herstellung der N-(Mercaptoacyl)-cysteine gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man jeweils in an sich bekannter Weise ein S-Benzylmercaptoacylhalogenid der allgemeinen Formel II

Z— CO — X (II)

S — CH2—CjHj

in der Z die in Anspruch 1 angegebenen Bedeutun-

20 gen besitzt und X Halogen bedeutet, mit S-Benzylcystein der Formel III

H₂N-CH-COOH

C H2—S — C H-2 —

(III)

umsetzt und die erhaltenen N-(Benzylmercaptoacyl)-S-benzylcysteine der allgemeinen Formel IV

Z—CO—NH-CH-COOH (IV)

I I

S-CH₂C₆H₅ CH₂-S-CH₂C₆H₅

reduziert

3. Mucolytische Mittel, enthaltend ein N-Mercaptoacylcystein gemäß Anspruch 1.

Gegenstand der Erfindung sind N-(Mercaptoacyl)-L oder DL-cysteine, Verfahren zu ihrer Herstellung und mucolytische Mittel gemäß den Patentansprüchen.

Die Verbindungen I und die Zwischenprodukte IV sind bisher nicht in der Literatur beschrieben worden. Die Verbindungen I besitzen eine starke Wirkung im Hinblick auf die Abnahme der Mucus- bzw. Schleimviskosität und sind daher als Mittel zur Verflüssigung von Sputum verwendbar. Man nimmt an, daß die Sulfhydrylverbindungen I Sputum verflüssigen, indem sie die Mucoproteindisulfidbindungen spalten.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können nach dem folgenden Verfahren hergestellt werden.

Die durch die nachstehende Formel II dargestellten Benzylmercaptoacylhalogenide reagieren mit dem S-Benzylcystein (nachstehende Formel III) nach einer herkömmlichen Methode, wie der Schotten-Baumann-Reaktion, unter Bildung von N-(Benzylmercaptoacyl)-S-benzylcysteinen, dargestellt durch die nachstehende Formel IV. Die erhaltenen Verbindungen IV reagieren mit Reduktionsmitteln, die eine Entbenzylierung ermöglichen, unter 3ildung von N-(Mercaptoacyl)-cysteinen (I). Es können sämtliche Reduktionsmittel des herkömmlichen Typs verwendet werden, wobei jedoch metallisches Natrium in flüssigem Ammoniak bevorzugt ist.

Z—CO —X H₂N-CH-COOH

+ I

CH₂-S-CH₂-C₆H₅ (III)

CH-COOH

-CH₂-C₆H₅ CH₂-S-CH₂-C₆H₅

(IV)

Z—CO —NH-CH-COOH

SH

CH₂-SH

(I)

In den vorstehenden Formeln hat Z die in Anspruch 1 angegebenen Bedeutungen und X bedeutet Halogen.

Die bei dieser Umsetzung verwendeten Verbindungen II können erhalten werden, indem man Benzylmercaptocarbonsäure mit einem Halogenierungsmittel, wie Thionylchlorid, in üblicher Weise umsetzt. Einige Verbindungen, die durch die Formel II und die Formel III dargestellt werden, besitzen ein asymmetrisches Kohlenstoffatom in ihren Strukturen und die aus diesen erhaltenen Verbindungen IV oder I besitzen naturgemäß zwei asymmetrische Kohlenstoffatome in jeder Verbindung. Demgemäß wird, wenn die Verbindungen II und/oder III optisch aktive Substanzen sind, die Verbindung IV oder I in der optisch aktiven Form erhalten. Sind eine der beiden Verbindungen II und III optisch aktive Substanzen, so werden Diastereomere gebildet Erfindungsgemäß wurden zwei Arten von Verbindungen erhalten, indem man die racemische Form der Verbindung II, worin Z CH₃-CH bedeutet, mit der L-Form der Verbindung III umsetzte. Diese

beiden Arten an erhaltenen Verfeindungen werden aufgrund ihrer optischen Drehwerte als Diastereomere angesehen.
Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgen-

den Beispiele und der pharmakologischen Untersuchungen in vitro sowie toxikologischen Untersuchungen an Tieren weiter veranschaulicht ,

Beispiel 1

(1) Herstellung von N-(2-Benzylmercaptoisobutyryl)-S-benzyl-L-cystein (IV, Z=(CH₃J₂C^)

Man löste 733 g S-Benzyl-L-cystein (III) in 700 ml 1 η Natriumhydroxidlösung. Man kühlte die Lösung in einem Eisbad ab und rührte. Man fügte tropfenweise zu dieser Lösung 2-Benzylmercaptoisobutyrylchlorid (II, Z=(CH₃)₂<) zu, das erhalten worden war durch Umsetzung von 63,1 g 2-Benzylmercaptoisobuttersäure mit 29,3 g Thionylchlorid. Die erhaltene Mischung wurde eine weitere Stunde gerührt, mit Salzsäure angesäuert und mit Äthylacetat extrahiert Der Extrakt wurde mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und zur Trockne eingedampft Der Rückstand wurde an Silicagel unter Verwendung von Benzol-Äthylacetat (1:1) als Eluierungsmittel chromatographiert Das Eluat wurde zur Trockne eingedampft und man erhielt 46,9 g eines öligen Rückstands entsprechend einer Ausbeute von 74%.

(2) Herstellung von N-(2-Mercaptoisobutyryl)-L-cystein (I, Z=(CH₃)₂<)

Man löste 46,9 g der vorstehend unter (1) erhaltenen Verbindung (IV, Z=(CHs)₂C <) in 500 ml flüssigem Ammoniak und fügte 21,1 g metallisches Natrium stückenweise unter Rühren zu. Nach Beendigung der Umsetzung fügte man 59,4 g Ammoniumchlorid zu und entfernte danach das Ammoniak durch Destillation. Man fügte zu dem Rückstand Wasser zu, um den Feststoff zu lösen. Man trennte die Wasserschicht ab, wusch mit Äthylacetat und säuerte mit Salzsäure unter Kühlen an. Der auf diese Weise erhaltene Niederschlag wurde mit Äthylacetat er.trahiert Der Extrakt wurde mit. Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und zur Trockne eingedampft. Man erhielt 43,6 g Produkt entsprechend einer Ausbeute von 88%. Nach dem Umkristallisieren aus Äthylacetat wurde die gewünschte Verbindung mit einem F von 139—140°C erhalten.

[α]έ³: +32,3° (c-1,0, Äthanol)

Analyse für C₇Hi₃NO₃S₂ ber.: C 37,65, H 5,87, N 6,27 gef.: C 37,78, H 5,86, N 6,16

Beispiel 2

(1) Herstellung von N-(2-BenzyImercaptopropionyl)-S-benzyl-L-cystein (A) und (B) (IV, Z=CH₃-CH <)

Man löste 211 g S-Benzyl-L-cysteln (III) in 221 0,1 η Natriumhydroxidlösung und fügte zu der Lösung tropfenweise und unter Kühlen und Rühren 236 g DL-Benzylmercaptopropionylchlorid (II, Z = CH₃-CH<). Die erhaltene Mischung wurde für eine weitere Stunde gerührt, mit Salzsäure angesäuert und mit Äthylacetat extrahiert. Der Extrakt wurde mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und unter Bildung von Kristallen eingeengt Die Kristalle wurden durch Filtrieren gesammelt und hernach mit einer geringen Menge Athylacetat gewaschen. Man erhielt 154 g Produkt entsprechend einer Ausbeute von 40%. Nach dem Umkristallisieren aus Äthylacetat erhielt man N-(2-Benzylmercaptopropionyl)-S-benzyl-L-cystein (A)

(IV,Z=CH₃-CH<)miteinemFvon [«]?: -135^° (c= 1,4, Äthanol)

Analyse für CmH₂₃NO₃S₂ ber.: C 61,69, H 5,95, N 3,60 gef.: C 61,73, H 5,92, N 3,62

Man engte das Filtrat, aus dem N-(2-Benzylmercaptopropionyl)-S-benzyl-L-cystein-A entfernt worden war, ίο ein und chromatographierte den Rückstand an SiO₂ mit Athylacetat Man dampfte das Eluat zur Trockne ein und erhielt 144 g öligen Rückstand entsprechend einer Ausbeute von 37%.

[λ]?⁵: +46,2° (c= 5,2,Äthanol)

Man erhielt öliges N-(2-Benzy!mercaptopropionyl)-S-benzyl-L-cystein-(B) (IV, Z = CH₃CH<).

(2) (i) Herstellung von N-[(2S)-2-Mercaptopro-

panoyl>L-cystein (I, Z=CH₃—CH <), in den

Versuchen bezeichnet als N-(2-Mercaptopro-

pion yl)-L-cystein (A)

Man löste 77,8 g N-(2-Benzylmercaptopropionyl)-S-benzyl-L-cystein (A) in 2J51 flüssigem Ammoniak. Man fügte unter Rühren in kleinen Anteilen 16,1 g metallisches Natrium zu. Nach Beendigung der Reaktion-fügte man 25 g Ammoniumchlorid zu und entfernte danach das Ammoniak durch Destillation. Man fügte Wasser zu dem Rückstand zu, um den Feststoff zu lösen. Man trennte die wäßrige Schicht ab, wusch mit Athylacetat und säuerte unter Kühlung mit Salzsäure an. Die so erhaltenen Niederschläge wurden mit Athylacetat extrahiert Der Extrakt wurde mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und zur Trockne eingedampft Das Produkt wog 39,3 g entsprechend einer Ausbeute von 94%. Nach dem Umkristallisieren aus Äther besaß das gewünschte Produkt einen F von U4bisll5°C.

V: +3^° (C= 2,0, Äthanol)

Analyse für C₆HnNO₃S₂ ber.: C 34,45, H 5,30, N 6,70 gef.: C 34,95, H 5,36, N 6,61

(2)(ii) Herstellung von N-[(2R)-2-Mercaptopropanoyl]-L-cystein (I, Z=CH₃ - CH <),

nachstehend bezeichnet als N-(2-Mercaptopropionyl)-L-cystein(B)

Indem man wie unter (2)-(i) wie vorstehend arbeitete,

wobei man von 144 g N-(2-Benzylmercaptopropionyl)-

S-benzyl-L-cystein (B), 2 1 flüssigem Ammoniak, 28 g

metallischem Natrium und 37 g Ammoniumchlorid ausging, erhielt man N-(2-Mercaptopropionyl)-L-cy stein (B) (I, Z = CH₃-CH <) in einer Ausbeute von 71 g (92% der Theorie). Nach dem Umkristallisieren aus

Athylacetat wurde die gewünschte Verbindung mit

einem F von 124 bis 125° C erhalten.

[«]!>': +16,8° (c= 1,7, Äthanol)

Analyse für C₆Hi 1NO₃S₂

ber.: C 34,45, H 5,30, N 6,70 gef.: C 34,67, H 5,28, N 6,77

Beispiel 3

Nach den in den vorangegangenen Beispielen beschriebenen Methoden und unter Verwendung der geeigneten Ausgangsmaterialien stellte man die folgenden Verbindungen der Formel I her:

N-ß-Mercaptopropionyl-L-cystein (I, Z=(CH₂J₂ <). F=97° C.

[λ]ϊ^!: +4,9° ^c= 1,0,Äthanol)

Analyse für C₆H_nNO₃S₂
ber.: C 34,45, H 5,30, N 6,70
gef.: C 34,45, H 5,37, N 6,70

N-Mercaptoacetyl-L-cystein (I, Z=CH₂C). F=113°C(Zers.).

[λ] ΐ: +24,9° (c= 1,0, Äthanol)

Analyse für C₅H₉NO₃S₂

ber.: C 30,77, H 4,65, N 7,18
gef.: C 30,80. H 4,71, N 7,24

Die mucoJytische Aktivität wurde ermittelt, indem man die Viskositätserniedrigung von Eiweiß oder Mucin in vitro bestimmte. Zu Vergleichszwecken verwendete man L-Cysteinäthylesterhydrochlorid, L-Cysteinmethylesterhydrochlorid und Acetyl-L-cystein als zu untersuchende Verbindungen.

(1) In vitro Bestimmung der Viskositätserniedrigung von Eiweiß

Eiweiß, das in ausreichender Menge für sämtliche Bestimmungen bereitgestellt wird, wird unter milden Bedingungen während 5 Minuten in einem Mischer gemischt Man bringt 9 ml Anteile dieses Materials in ein 50 ml Becherglas und fügt 1 ml Testlösung, die verschiedene Konzentrationen der zu untersuchenden Verbindung enthält, zu (die Testverbindung wird in destilliertem Wasser gelöst und die Lösung mit 1 η Natriumhydroxid auf einem pH von 8,0 eingestellt, während zur Kontrolle destilliertes Wasser verwendet wird). Die Mischung wird dann 20 Minuten bei 37° C geschüttelt. Die Viskosität der erhaltenen Lösung wird auf einem Ostwald-Viskosimeter bestimmt. Die in Tabelle 1 angegebenen Ergebnisse stellen die prozentuale Erniedrigung der relativen Viskosität bei verschiedenen Konzentrationen der verwendeten Testverbindungen dar.

(2) 'Ln vitro Bestimmung der
Viskositätserniedrigung von Mucin

Gemäß der von Sheffner et al (Ann. N.Y. Acad. ScL, VoL 106, S. 298-310, 1963) beschriebenen Methode wird bakteriologisches Mucin (Nakarai Chemical Co,

ίο Ltd) in einem Sorensen-Phosphatpuffer (pH=8,0) gelöst und eine l%ige Mucinlösung hergestellt Man bringt 0,9 ml Anteile der Lösung in Teströhrchen und fügt zu diesen in einer Konzentration von 1OmM die Testverbiridungen zu (hergestellt in der gleichen Weise wie vorstehend unter (1) beschrieben mit Ausnahme dessen, daß die Pufferlösung zur Kontrolle verwendet wird). Die Mischung wird dann eine Stunde bei 37° C geschüttelt Man bestimmt die Viskosität der erhaltenen Lösung mit Hilfe eines Ostwald-Viskosimeters. Die in Tabelle 1 angegebenen Ergebnisse stellen die prozentuale Erniedrigung der relativen Viskosität bei einer Konzentration von 10 mM der verwendeten Testverbindungen dar.

^2j (3) Veränderungen der mucolytischen Aktivität
der Testverbmdungen, die mit Kaninchenserum
behandelt worden waren

Man bringt 0,1 ml Testverbindung (hergestellt in der gleichen Weise wie vorgestehend unter (1) beschrieben) und 0,9 ml Kaninchenserum in ein 50 ml Becherglas und schüttelt die Mischung 30 Minuten bei 37° C. Man fügt dann 9 ml Eiweiß zu und schüttelt weitere 20 Minuten. Man bestimmt die Viskosität der erhaltenen Lösung mit Hilfe eines Ostwald-Viskosimeters. Die in Tabelle 2 dargestellten Ergebnisse zeigen die prozentuale Erniedrigung der relativen Viskosität von Eiweiß bei einer Konzentration von 1 mM der Testverbindungen nach Behandlung mit oder ohne Kaninchenserum.

Tabelle 1

Testverbindung

Endkonzentration (mM)

Prozentuale Erniedrigung der
relativen Viskosität

Eiweiß

Mucin

N-(2-Mercapioisobutyryl)-L-cystein

N-(2-Mercaptopropionyl)-L-cystein(A)

N-(2-Mercaptopropionyl)-L-cystein(B)

N-(3-Mercaptopropionyl)-L-cystein

N-Mercaptoacetyl-L-cystein

23.1 ± 1,4

38.3 ± 2,2

57.0 ± 1,0

24,9 ± 1,5

41.2 + 2,1

56.4 ± 1,6

24,9 ± 1,4

38.1 ± 2,6

57.7 ± 1,0

22.8 ± 0,1

36.7 ± 1,6

54.5 ± 4,7

26,1 + 4,1

39.8 ± 3,0
60.0 + 4.4

22,5 ± 1,5

26,6 ± 1,5

20,1 ± 0,4

28,1 ±0,5

31.3 + 1.5

Fortsetzung

Testverbindung

F.ndkonzen-	Prozentual
tration (niM)	relativen V
	Eiweiß
0,1	25,1 ±3,5
1,0	42,0 ± 1,1
10,0	59,9 ± 1,2
0,1	31,1 ±5,6
1,0	45,5 ± 2,0
10,0	60,6 ± 2,4
0,!	11 f\ -L- T £. I 1,W -i- £-y\J
1,0	29,5 ± 2,5
10,0	49,0 ±1,8

Mucin

L-Cysteinäthylesterhydrochlorid

L-Cysteinmethylesterhydrochlorid

N-Acetyl-L-cystcin

19,7 ± 1,5

17,8 ±0,2

4,8 ± 2,5

Die Ergebnisse sind Mittelwerte ± die Fehlergrenze (S.E.) von 3 bis 5 Untersuchungen.

Tabelle 2

Testverbindung

Endkonzen	Prozentuale Erniedrigung der	behandelt	Erniedrigung
tration (mM)	relativen Viskosität von Eiweiß	mit Kaninchen	der mucolyti-
	nicht behandelt	serum	schen Aktivi
	mit Kaninchen	32,9 ± 1,0	tät (%)
	serum	30,0 ± 1,0
1,0	38,3 ± 2,2	31,1 ±3,8	14,1
1,0	41,2 ±2,1	38,7 ± 2,6	27,2
1,0	38,1 ± 2,6	35,9 ± 0,3	18,8
1,0	36,7 ± 1,6	15,4 ± 1,8	- 5,4
1,0	39,8 ± 3,0	7,0 ± 1,2	9,8
1,0	42,0 ± 1,1	18,5 ±0,8	63,3
1,0	45,5 ± 2,0	84,6
1,0	29,5 ± 2,5	37,3

N-(2-Mercaptoisobutyryl)-L-cystein N-(2-Mercaptopropionyl)-L-cystein-A N-(2-Mercaptopropionyl)-L-cystein-B N-(3-Mercaptopropionyl)-L-cystein N-Mercaptoacetyl-L-cystein L-Cysteinäthylesterhydrochlorid L-Cysteinmethylesterhydrochlorid N-Acetyl-L-cystein

Die Ergebnisse sind Mittelwerte ± die Fehlergrenze (S. E.) von 3 bis 5 Untersuchungen.

Toxikologische Untersuchung

Unter den erfindungsgemäßen Verbindungen I wurden N-(2-Mercaptoisobutyryl)-L-cystein und N-(2-Mercaptopropionyl)-L-cystein-A im Hinblick auf ihre akute Toxizität untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 angegeben.

Tabelle 3

Testverbindung

Verwendetes
Tier

Verabreichungsart

Akute Toxizität (LDso)

N-(2-MercaptoisobutyryI)-L-cystein

N-(2-MercaptopropionyI)-L-cystein-A Maus

Maus

i-P-i.v.

i.p.

2285 mg/kg 989,6 mg/kg

2092 mg/kg

Verwendete Tiere

Man verwendete 5 Wochen alte männliche Mäuse vom ddy-Stamm (Körpergewicht 24 bis 28 g). Diese wurden eine Woche lang vor der Untersuchung gefüttert und die Tiere, die während dieses Zeitraums ein anormales Wachstum zeigten, wurden ausgeschlossen.

Testlösung

Die Testverbindung wurde zu einer physiologischen Salzlösung zugegeben und die erhaltene Lösung mit Natriumhydroxid unter Bildung einer 5°/oigen Lösung (pH 7,0) neutralisiert.

Beobachtungen

Nach Verabreichung der Testlösung wurden allgemeine Symptome und Todesfälle, die während 7 Tagen eintraten, beobachtet. Man berechnete die LF50-Werte gemäß der Methode von Litchfield und Wilcoxon.

Wie aus der pharmakologischen und toxikologischen Untersuchung der erfindungsgemäßen Verbindungen I hervorgeht, sind diese als Mittel zur Verflüssigung von Sputum geeignet. Bei der medizinischen Behandlung eines Erwachsenen liegt die tägliche Dosis im Bereich von 100 bis 600 mg in Abhängigkeit von der Methode und der Häufigkeit der Verabreichung. Die Verbindungen können oral oder direkt auf die Tracheen verabreicht werden oder sie können in Form eines Aerosols inhaliert werden.

Eine Arzneimittelzusammensetzung der erfindungsgemäßen Verbindung kann für die orale Verabreichung derart in Form von Tabletten, Pulvern oder Kapseln formuliert werden, daß diese leicht vom Magen oder Intestinum absorbiert werden, wobei eine derartige Formulierung im Hinblick auf die Zweckmäßigkeit erfolgt. Hierzu kann ein Bindemittel, wie Gelatine, Sorbit, Polyvinylpyrrolidon, ein Formmittel, wie Lactose, Stärke, Calciumphosphat, ein Gleitmittel, wie Magnesiumstearat, Talg, und ein das Zerfallen begünstigendes Mittel, wie Calciumcarboxymethylcellulose, zugegeben werden. Die Zusammensetzung kann in einer wäßrigen Lösung der Verbindung allein oder von dessen Salz, beispielsweise Natriumsalz, zur Verwendung in Aerosolen oder für die Injektion formuliert werden.

Im folgenden sind Beispiele für Formulierungen angegeben, bei denen N-^-MercaptoisobutyrylJ-L-cystein beispielsweise verwendet wird, wobei diese Verbindung durch andere Verbindungen der Formel I in Übereinstimmung mit den Formulierungsformen ausgetauscht werden kann.

(1) Für die orale Verabreichung
(a) in Form von Tabletten
N-(2-Mercaptoisobutyryl)-

L-cystein 100 mg

Äthylcellulose 50 mg

kristalline Cellulose 80 mg

Carboxymethylcellulose 7 mg

Magnesiumstearat 3 mg

insgesamt 240 mg

Die Tablette kann mit einem Filmüberzug überzogen werden, der normalerweise verwendet wird. Sie kann weiterhin mit einem Zuckerüberzug überzogen werden.

(b) in Form von Granulaten	100 mg
N-(2-Mercaptoisobutyryl)-	25 mg
L-cystein	365 mg
Polyvinylpyrrolidon	10 mg
Lactose	500 mg
Talg
insgesamt
(c) in Form eines Pulvers	100 mg
N-(2-Mercaptoisobutyryl)-	500 mg
L-cystein	370 mg
Lactose	30 mg
Stärke	1000 mg
kolloidales Siliciumdioxid
insgesamt
(d) in Form von Kapseln	100 mg
N-(2-Mercaptoisobutyryl)-	32 mg
L-cystein	56 mg
Lactose	2 mg
kristalline Cellulose	190 mg
kolloidales Siliciumdioxid
insgesamt

(2) in Form eines Aerosols und in Form einer für die Injektion geeigneten Zubereitung

mg N-(2-Mercaptoisobutyryl)-L-cystein sind in ml einer wäßrigen Lösung mit einem pH von 63 bis 7,0 als Natriumsalz der Verbindung enthalten.

Claims

Patentansprüche:

1. N-(Mercaptoacyl)-L oder DL-cysteine der allgemeinen Formel

Z—CO—NH- CH-COOH

I I

SH CH₂-SH

(D