DK171288B1 - Anvendelse af L-carnosin eller et salt deraf til fremstilling af et immunregulerende middel til behandling af immunsygdomme - Google Patents

Description

] DK 171288 B1

Opfindelsen angår anvendelsen af L-carnosin eller et salt deraf som aktiv ingrediens til fremstilling af et immunregulerende middel til behandling af immunsygdomme .

5 For at behandle forskellige sygdomme forårsaget af unormal immunfunktion er der blevet udviklet forskellige farmaceutiske midler, som almindeligvis betegnes som immun-regulerende midler. Betegnelsen "immunregulerende middel" anvendes i denne beskrivelse med krav om midler til JO genopretning af immunreaktion fra unormalt fald deri og undertrykkelse af overdreven acceleration deri for at opretholde normal immunfunktion. Som midler tilhørende denne kategori er der blevet udviklet forskellige typer af midler, herunder levamisol (Aldrich Corporation).

15 Imidlertid er disse konventionelle immunregulerende midler afledt fra kemiske materialer, men ikke fra biologiske materialer, således at farlige bivirkninger deraf ikke fuldstændigt kan udelukkes. Faktisk er der blevet rapporteret væsentlige bivirkninger for nogle immunregu- 20 lerende midler.

I hovedsagen har immunreaktionen den fysiologiske funktion at opretholde homøostase, som antages at blive reguleret af fysiologisk aktive stoffer indeholdt i en levende krop .

25 Det er således opfindelsens formål at tilvejebringe et immunregulerende middel baseret på et fysiologisk aktivt stof med mindre bivirkninger end konventionelle kemiske stoffer.

I DE offentliggørelsesskrift nr. 3 424 781 angives, 30 at L-carnosin (β-alanyl-L-histidin) har en granulations- fremmende virkning og har lignende antitumorvirkninger som homocarnosin (l-histidinyl-^-aminosmørsyre), der 2 DK 171288 B1 tidligere er vist at være virksomt over Tor visse eksperimentelle cancercelle.linier med positiv proli ferationsevne, som næppe kan holdes under kontrol ved hjælp af immunitets fremmende lægemidler.

5 Efter mange års undersøgelse af den fysiologiske virk ning aful-aminosyrer indeholdt i en levende krop har det nu vist sig, at L-carnosin, som er et fysiologisk aktivt derivat, har en immunregulerende funktion. Der er ikke hidtil blevet fundet noget fysiologisk aktivt 10 middel med en sådan immunregulerende funktion. Endvidere har det ikke været kendt, at L-carnosin har den immunregulerende funktion.

L-carnosin, eller β-alanyl-L-histidin, blev opdaget i en Liebig's kødekstrakt af Gulewitsh i. 1900 og er 15 et dipeptid bestående af L-histidin og β-alanin, som indeholdes rigeligt i pattedyrs tværstribede muskulatur.

L-carnosin har form af et smag- og lugtfrit, let vandopløseligt og hvidt krystallinsk pulver med et smelte- 9 n punkt på 250 °C og [ot]p = +20,0 (H^O). Det har den 20 følgende strukturformel

HC = C - CH„CHC00H

I I 2I

HN N NH-C0CH„CH„NHo \ // 2 2 2

C

H

og dets pH-værdi i vandig opløsning er i området 8,0 - 8,5.

L-carnosin indeholdes som nævnt rigeligt i forskellige tværstribede muskler hos pattedyr (omkring 0,1 - 0,3 25 %), og det indvindes almindeligvis fra kødfodere som 3 DK 171288 B1 kilde for den essentielle aminosyre L-histidin. Endvidere kan det biosyntetiseres ud fra L-histidin og β-alanm. L-carnosin, som er blevet absorberet, dekomponeres af carnosinase til nærende L-histidin og β-alanin, hvoraf 5 en portion resyntetiseres til L-carnosin [β-alanyl-l- methyl-hist ldin (ansenn) kendes som mellemprodukt, ved L-carnosin-biosyn tesen].

Som beskrevet ovenfor er L-carnosin et fødevarelignende stof med høj sikkerhed og kan, efter absorption, de -10 komponeres af carnosinase indeholdt i forskellige indre organer, og det adskiller sig således fra mange andre farmaceutika, som metaboliseres j leveren og lægger en tung byrde på leverfunktionen.

Den akutte toxicitet. af L-carnosin vil blive påvist 15 nedenfor.

Akut toxicitet L-carnosin blev indgivet peritoneal! eller oralt i forskellige mængder til en gruppe på 10 mus, og akutte toxiske symptomer blev iagttaget 5 timer efter mdgi-20 velsen. LD^g blev udregnet fra dødstallet efter 72 timer ifølge van der Waerden's metode. L-carnosin blev opløst i fysiologisk saltopløsning, så der blev givet en dosis på 0,1 - 0,3 ml/10 g.

De følgende toxiske symptomer af L-carnosin blev lagtta-25 get. Fra omkring 30 minutter efter peritoneal indgivelse af 15000 mg/kg (LD^qq) viste halvdelen af musene depression af frivillig motiIltet, maveleje, depression og uregelmæssighed af åndedrætshastighed, manglende forsvinden af opretnings- og undvigelsesreflekser , ha 1erejsnings-30 reaktion, og myoclonia. Yderligere fremadskridende symp tomer resulterede i gentagne sidevendinger, reflex-acce- 4 DK 171288 B1 leration ved kontakts timuJenng, konvulsioner og onde Jig tonisk krampe til døden. 50 % , 80 % og 100 % af musene var døde efter henholdsvis 30 minutter, 2 timer og 5 timer. Oral indgivelse af 15000 mg/kg viste kun lidt.

^ virkning, men dræbte en af de 10 behandlede mus efter 12 timer.

TABEL 1 LD,.^ af L-carnosin

Indgivelses- LD^ °° sandsynlighedsgrænse) v e j__mg/kg__

Peritoneal 9087 (8320 - 9925)

Oral >14930 (minimal dødelig dosis)

Den akutte toxicitet (værdi efter 72 timer) over for DDY hanmus er vist i tabellen. Som vist, er L-carnosin en forbindelse med meget lav toxicitet.

10 I de sidste 10 år er L-carnosin blevet sammensat som et anorexi-behandlingsmiddel af LISA Corporation i Spanien og bekræftet at være sikkert. Endvidere er en effektiv mængde L-carnosin over for transplanterbare tumorer 1 mg pr. mus eller 50 mg/kg. Denne mængde svarer til 15 1/181 af den akutte toxicitet LD,-g (9087 mg/kg) ved den pentoneale indgivelse og tyder således på en høj sikkerhed af L-carnosin.

Der kendes en syntesemetode for L-carnosin [Journal of Biological Chemistry, 108, 753 (1935)]. L-carnosin 20 kan fremstilles ved chlorenng af carbobenzoxy-P-alanin med phosphorpentach1 orid, dannelse af dens methylester med methanol, dannelse af azid via hydroazid, kobling 5 DK 171288 B1 af azidet med L-histidin-methylester og endelig fjernelse af carbobenzoxygruppen ved hjælp af katalytisk reduktion. Opfindelsen inkluderer anvendelsen af et salt af L-carnosin, såsom salte ved c arboxy1 gruppen, syre-5 additionssalte med farmaceutisk acceptable syrer ved aminogruppen og salte ved både carboxyl- og aminogruppen.

Som salte ved carboxylgruppen kan nævnes salte med metal, såsom natrium, kalium, calcium, magnesium, zink og aluminium, såvel som substituerede ammoniumsalte, såsom 10 salte med trialkylaminer (f.eks. triethylamin) og andre aminer. Som salte ved aminogruppen kan nævnes salte med organiske og uorganiske syrer, såsom saltsyre, svovlsyre, phosphorsyre, eddikesyre, propionsyre, mælkesyre, vinsyre, citronsyre, ravsyre, maleinsyre, benzensul fonsyre 15 og toluensul fonsyre. Disse salte kan fremstilles på kendt måde ved omsætning af frit L-carnosin med en støkiometrisk mængde af den valgte syre eller base.

Den væsentlige immunregulerende virkning af L-carnosin vil blive beskrevet med henvisning til forsøgseksemp-20 ler.

Γorsøqsmet ode

Den immunregulerende virkning blev bedømt ved en hæmoly-ti sk-p1aque-metode (PFC), en hæmagglutinationsprøvning og en forsinke t-hypersensitiv i tets-reaktion under anven-25 delse af mus.

(1) PFC-metode

Den antistof-producerende kapacitet blev bedømt ved tælling af plaque-dannende celler ved hjælp af en modificeret Canningham-metode eller en væskekammer-objekt- 30 glas-metode [Hashimoto et al., Experimental Method for

Immunity A, side 491 - 494 (1972), edited by Japan Immu- 6 DK 171288 B1 noJogy Academy]. TiJ sens.it. iver ing anvendtes røde blodceller fra får (5RBC, leveret af Shizuoka Experimental Animal Corporation), som i princippet blev fortyndet med phosphatpufret saltopløsning (PBS) til fremstilling

Q

5 af en opløsning indeholdende 12,3 x 10 SBRC/ml, hvoraf

Q

0,2 ml (2,5 x 10 celler) blev injiceret, i halevenen på en DDY-mus (han, 5 uger gammel, kan leveres fra Shizuoka Experimental Animal Corporation). Som reaktionsmedium anvendtes et Eagle MEM medium indeholdende 10 % føtalt.

10 okseserum (CCS) (leveret af Nissui Pharmaceut. ical Co.,

Ltd.), hvormed der blev blandet. 0,1 ml 4 x 10^ milt- 9 c eller/ml opløsning, 0,5 ml 2,5 x 10 SRBC/ml opløsning g (12,5 x 10 celler) og 0,4 ml 1/4 forlvndet komplemen-taJserum fra et marsvin til fremstilling af en blandet 15 opløsning, som derpå blev forseglet i et kammer og opvar met til 37 °C i 1 time. Ifølge denne metode blev 50 -150 PFC-ceJler detekteret i omkring 0,02 ml kammer.

(2) Bestemmelse af serum-antistof-værdi

Blod blev opsamlet ved PFC-reaktionen fra karotidartener 20 hos en gruppe på fem mus, og derfra blev udskilt et serum på konventionel måde til bestemmelse af hæmaggluti-nationstiter (HA-titer). Prøveserummet blev fortyndet med en phosphatpufret saltopløsning (PBS) indeholdende 0,5 - 1 % af et serum fra en normal, kanin og blev bedømt.

25 under anvendelse af SRBC. Den maksimale fortynding,

N

som viste positiv reaktion, blev repræsenteret ved 2 , hvor N repræsenterer en antistofværdi.

(3 ) forsinket-hypersensitivitet-reaktion [Natsuume et al., Experimental Method of Immunity A, 30 side 614 - 620 (1972), Japan Immunology Academy].

En DDY-hanmus, 5 uger gammel med en vægt på omkring 7 DK 171288 B1 20 g, b]nv anvendt til at detektere dens kontaktderma-t. itis ved hjælp af 2,4,6-t. nmt ro-rhj orbnnzen (picryl-chlorid) (kan Jpveres fra Tokyo Chemical Industry Co.,

Ltd.). En ethanolopløsning af 1 picrylchlorid blev 5 imprægneret i 4-lags gaze (lxl cm), som derpå blev bragt i kontakt med musens barberede maveskind i 10 sekunder for at frembringe primær sensitivering. Den sekundære sensitivering for prøvning blev frembragt den 7. dag ved påføring af en olivenolieopløsning af 10 1 % picrylchlorid på begge sider af det ene øre ved hjælp af en ma lepensel. Det andet, øre blev kun påført olivenolie som kontrol. Efter 24 timer blev musen a η β t e 1.1 s e r e t med ether, og ørets tykkelse blev bestemt med en nøjagtighed på 1/100 mm ved hjælp af et mikrometer 15 med en præcision på 1/1000 mm. Den forsinkede hypersen- sitivitetsreaktion blev udregnet som følger: (Tykkelse efter 24 timer af øre påført, picrylchlorid minus ørets tykkelse før påføringen) minus (tykkelse efter 24 timer af øre påført olivenolie minus ørets 20 tykkel se før påføringen).

(4) Forsøg for at bestemme L-carnosins immunregulerende virkning blev udført ved at variere en mængde antigen, en dosis L. - carnosin og et dyrs alder ud fra standar-den: en antigenmængde på 2,5 x 10 (SRBC) og en musealder 25 på 5 uger, under de følgende betingelser: ( a) Variation af antigenmænqde

Sensi 11 ve rende antigenmængder i området, fra 5 x 10^ 9 til 2,5 x 10 SRBC blev anvendt til at iagttage virkningen af en dosis L-carnosin på 100 mg/kg.

8 DK 171288 B1 (b ) Variation af musealder

Mus i en alder fra en umoden mus på 2 uger t i l en gammel mus på mere end 30 uger blev anvendt til at iagttage virkningen af en dosis L-carnos i n på 100 mg/kg.

u, (c) Variation af L-carnos i. n-dosen

Dosis af L-carnosin blev varieret for at iagttage virkningen på PFC-reakti.on, hæmagglutinat ions-reaktion og forsinket-hypersensitivitets-reaktion.

Γ orsøqsresu11 at er 10 forsøgsresultaterne er anført i de nedenstående tabeller.

9 DK 171288 B1 •ri O *

U

EB

I > LJ I *

CG

cj cc o ro <f os o* o CO

□G LO -i-> <”H

01 I CO * CO -r-l ·Η

4-> 4J

1 m c C

ω ro c ro z o w

,M ·Η lA LA lA

^ CO la lA OlA O O

rø O JJ o O r—I O —I -H

_ “O —H »—( ' · I—I ' ' ' ^ r—l ' * ' ,H γ-h o O' x O (A x o x *—i

Jjdi ·ΕΧΟΧ"Η O X LA O Γ"

—j "O C-L f—1 r—( lA r—i fA l AJ

,_i C Q- CX AJ ^ O ·>—- AJ — o, ro « » la - <r o r-n*-1 LA Γ-I CO '-i '“Ji ~L ro E H ^ S t-L έ? * ro w — > U_ Q· x—' ✓-—- x'-"' x^A ' ' ry, r—i CC χ OO O <ί Γ" 04 O ιΛ ιΛ Γ*^0 -*H <Γ

q “D H □ HH i—i O Ή AJ »—I O OO OO

0 CD-Ux-i-J *- >—I *- f—I »'I—I ·“ f—i I—I ^ r—I

r E CHr-i o — O'— O— O— O— O — n -*-> ft) **h •h > ε 5 “ ^ ro ω o ^ ro <j <r <r <r

—I u'*-1 Ll. _u <t <t O O O C

LlJ I C i—< CD <—H i-1 I

CD , v 3 Q_ 'r~i x—^ H x v x N x v x· ' x N

< , E E O uo X O X SO X O X iA

>— CL· E X O X rO OSO O CO

•Ή · *—1 i—H so f-H 04 OS r—| •“H

o C—( *—H ·»— OS--- x Q_ (Λ Cl - - O 04 <t^n 3 LO Ό *-I rH 04 04 c ε ro c ό 0 ro uctnco σν oo -la _ (U ·»·.·»·> fA ·> t^ro ε csi γα csj <f la 5 o ε — — x- +1 — — a .c ro +i o +i o +i o +i A4 o +1 o

, _XOrA OA-fAOO

(Ί i-1 rH *· r—I ΓΑ ~ t-l . ---- ---- -O w t^ro poca γάγ^ αιό

π·Α> Q.IAfA θ' Ό '-(CO

H X

c* c* c* . Ή ·Η * ·Η * ^ c ro ro ro * o o o o

•H ^HCt-IC^C

-*-> ro i-ι ro t-ι ro i-i roEroeroero ro T3 tj u t-ι o «i u ro er o i o i o i

f-> CZ_JZ_JZ_I

i a o- o ε o

CO C I— CO *“H

oc ro o o co cr r—( r—i x **

• H

-i-> X X LA

C

ro LA LA AJ

10 DK 171288 B1 På en gruppe mus indgivet L-carnosin (100 mg/kg/dag s.c.) i 6 dage og på en gruppe normale mus blev injiceret røde blodceller fra får (SRBC) igennem deres hale-vener til immunisering, og efter 4 dage blev PFC-reaktio-5 nen gennemført. Værdier er anført i et gennemsnit af 5 mus - standardafvigelse.

* PC0,01 ** P<0,001 kontrolgruppe *** Blod blev opsamlet efter PFC-reaktionen, og derfra 10 blev udskilt serum den næste dag til agglutinations- prøvningen. For antistofværdien (N) er den maksimale fortynding, som viste positiv reaktion, repræsenteret ved 2^, hvor N repræsenterer antistofværdi en.

DK 171288 B1 n

fl) OJ I—I

i-H · i—i · r-i

CD C -U U

• Η £ h tc o; “o ^ /_ u ή ε cp co

ra —> I “ O -ra> C; CD -H

ftj C C TD 5· > o r- o o a ra c 01+--1 *—i >—i li ej c ra ε

CD ra- CD. C CD -ra O

ocoi i i i i o ora cn cn (J l/l 4J * DS "-i fy i cn o ό o o <r ra ra c·- r: -π ή o -π o een · rt; .ra -ra z raw c c c . u c c C _C -1 Hi -H dj -n C CO D > Ό Ό ή

C ttJ CD C "O

Qf- a a a °ro ra ra E >- ra fc a a o o a o o ra ra σ -ra & jj Jj oo—I-HO--1 ra ra ra > „ .ra -i — -c — — — -ra — — cttd ra o o ra.

ru -η o <r x o x cd o x r-~ ora cn u- o , ω -ra x o x nd o i—i x c r- e ·- o ,, — · £ r—i <j -—i a *—i -—e a- i ra ra "O o ra cd ^ ra A —- CO ^-4 »"-4 - —' \0 —- - >-— O C ra 1—I 1—I Ή , . — q. o *si—i cnj »- i—i roefy ή to 4-1 ,-^σ i <j--h i—i vo —* o ro d= ο ε c o ε er en ·η ro ral o -π · Ό co p Ξ ^ o σ .y i-

Si? — η — ra ro ra fr.^u-cr o s => ε ra ro'--'-' 4-.4-- ^ ^ ^ rara 0, -— r-i ao <taao a o cn c a -h · ce ε -π c -ra „ o* -ra i cd 1—i o r~i C3 r-i o i—i cd cn cn cj ud ra _o ra σ — ro O r—i r—i r. 4 (—( *. i 1 — i 1 — < i · -—r C Ο σ - ftj-ri 0^0^-0^ 0^0^- Ow- cd c ro en πω-ιυοε rarararafy _D -DC CToCD C7 c<- ra ra Z c I ro O ra o.

_* ra -DC ra— ra A-^o -d· <r <r <r <r A^rara td z ra ωο, o o -a· o o o o er ra c ^ —I ^ Cj_ i—I 1 I ) r--i r—H t 1 I 1 C— O CJ1 ~Z.

LlJ I , -ra r - r—i r—— ---- r - - . r s — Ά O C

cd ora α_ εχο oxo xoxo x a o ra -ra rara <c [7 ^ oxcoo -no -π e ro .y -·η o I- — · CN r—I I —H CO '—I Ό 1—I CO CN *“l CD C "O i> r, ra ~ ^—' i — »- —- ·-—- ·-— *"— o *—i ra ra ra _c

„mm Cl-η r-r^ CO CN CO ODra CW

— i—i CO *“H r—i r—i CN r—H CJ I O !> ^ ^-σο-racraz

r -) O o -ra O CN

•ral c h cl .y -ra m raoc CTeCO CN A <f -H _Q CD cn -Ό ra - - - cn > ra-nra ro εΑ r—i co r^cN <t orara ra-ra> ur ε — — — — — — c-d—i ic m ro+io +1A+10 +1A-+10 +i<r raso oro-ra j] ^ oco r-o o o o rora*u_ra T. r-.—ico r— —η a t-π <j <—i a cn o rao>a.rara . i co er en ora raoc O oc A o cn _i O ro —i ra u_ -ra 1, _h aco αγ- oo<j- co -N-orarac m 4J -ra er ra -ra · ra , c x ^ ή D.ra c en

r-r,—- > > c. ra ra (D

-HArairaocjira

cn-racøra-raccL

c -ocN-ra-oejira-Hra *h c o ra i—i .—i c ra r.Q cn ή -ra ra ro o ε > o raioracDis·' _u c * * tnracrc-racnrac

v ra i + i + i + oraorocD-Q-O

m CD EU-raooen-H

ω o -H-cnocc-ra . i ra <-) er > o jy _i ae c + i-1 ra ή ej O Ή *ra CD *—i o oj o ra cn o jd ro ra ra > ra σ - c ora cn eoxj-h > t—i ή o -ra Ή rara CJDCA’^o-ra rara ra σ o. co ·—i -h tdcj cn a o enEracren

-HO A oCDOEO+DWO

<C r-r Q-E'HCra ++ CDQ.

12 DK 171288 B1 cd

h- CD I

4- CD CD O Li I

L O 3 O — a, e o u- j-ι

•H O - -U C

Ό . - CDlA CD OJ CD

C- <r~ f— T ~ C ft) —i 1 W I C -Ή °C0 C CD L-

'H > * - L CL E OJ

L) I <1) C H Li 3 co1*- >to-*->ajcoaj 1—1 OD O * Ο ·Η Ή D CC +1

CD O -u> CO O' O CT\ 00 — C C CD C

^ I CD —i £ D Μ E E 0)

® U ·Η Ή z EEOCD

ECO 4JLJ CDEOLCft & CC C C 3 — C 4) 4) Li -C tn < co E C (D Ό D.

<—1 o o 01-0 C -H CD 4-1 Li Li

OttJ lA UX lA lA lA '—i jJ H 0) E O O O O O CD 4-J -»-t 2 C r—i ·' ' r—i i ' ·—I---S —H ·--' ,-1 s . E L flj _y ' '

O·4-1 4-) O cn O' A- A- L. 4) CDZL

'H W -ΗΧΟ X ΙΛ X <t X VO XO C C -|H "O i— O

H—1 Li · Ή —H i—\ r—t i—i —H CO C 05 -^o .Ec^-w-xowLAwLo^r-i^ >4_j c _c CDCD Li ^ r. c O CD >4) D 'H CL O lo CO CJs LO CL—I -Ή D -Η - UC C ID > H X)z

1 D J £ O c* N

t-J E L t- ft)

Li_E O (Λ 0) CD > Ό

Q- ,,_l Qj C—i C*— OJ

--- C Li Li L_ O > °CD CD o? t— Q" c 4) 4) Li 4-> OLD CD ·— — — — — --- "D -H 0) CD 4-) E iAOxJ'CXICD'DlAOO-O' — O Ό ή j) "3 W >—I -LL 4-> i—! O —H θ' <-H —Η —Η O —H CO E Li 4-) Li

•O CD CP-H-.-H - -H --—I - CTOffi CD C O

—I CDO CO a —1 O ^ O'— O^- O— O ^ C C 3s O CO 4-J

tu O JZ ^ s c c

CDC 4_j OJ <U · ·* <—I <D

<£ 1-1 ^ CD CD-P C -H CD

*— CD (Η I CO -H Li 4) 4-> ft) tJD <r <r <r o s c in

IH-1 o <3 0 0 0-3 —'ll- CD O C CL

—I'H -PO *—h ·“i t-H O \J U E Ο. Ή >s D

*-* ll. —i —i —' — —' — «-h — co ii α+J co li W I -H o x ID x —i x CO cΛ ·Η K c o oc c "O ** Q- EXO CN I" Ό X O' tn C Li CO (D - ^ ^ i—i a- ι σ' —i to -η C'— ci σα) r c

Cl— · Dl V— ---- - ' ----- ΓΑ — -H CJI rH li O

a Ih *- O <J -3 - CO Li O I Ό -H

EC Q. CO 1—I ·—I —I 00 O "CO C li U fl] +J

o c L_ 4) -i_) b_ S

** Li C C CL CO

^-)-1 CD CO O O · 0) ^ CJ Li -H _L^ Li C Li

D CD I li— -i—> 4) CD

'H <D Li O' H CXI CA O' _| ^ ΙΛ 4J □> >

Li Li 0) - - - - - Li CD O II- C Ή COW ECO Ό Ό Ό -3 4J O J) *· α> -H 4->

>C E — —' — —i —' 4J —I Li O C -H

O CO+IO +IC0 +ICXI +ΙΌ +1 X > —I | -p > CO

.y O CO CXI I—I 0-H4JCJ 4)QO

C04-) ΓΑ I—i O Ό '—I CD H CO i—I CT O L·. · CL H L α CD . - ·— - ·"— ·"— Ό Ό CL 4) E Q- CTC Li O CA ΓΛ ON -S' C O CD * . CD CD Li C CL Ό lA Ό Ό ·ϋ-Η>"-Η*Μ04)

'H O ω OJ CL O CD

c CD c—I O O Ή ·Η 3 4J JO ·*Η i_) > u E Ό > > (0 Q0)i»-QJCE·

^=1 D L OUt —I—IOC

C O. BDHO-UfflD

H cn Q) CD CD * CD O.CO O Li O 3 -Ή iD.y jy ^ jy 30 cD-TDr-i-To

0\ \ \ \ Lh^DOODOIL

DC Dl CD CD CJ1 CD CD C-HOCa “OUE E E E E X Li CO CO CO -H >

Dl CD C D -W OL Ό II- coo la o o o dla-dco *r-cco a I CXI lA LA O -t- * -H >i 4-1 ε_Ι CN LA η N B+l * * JJ -LI cd 13 DK 171288 B1 TABEL 3

Virkning af var irrede mængder L-carnosin på forsinkeh-hypersens.it. Jvit.ri.s-reaktion ( D H R ) hos mus Mængde Tykkelsesforøgelse af øre 5 L.-carnosin 1 ^ ^ (mg/kg/dag) x 10‘ cm k o n t r o 1 % 0 11,3 - 4,0 (100) 30 14,1 ί 3,6 122,6 250 15,7 - 2,5 * 136,5 10 500 21,3 ~ 8,7 * 185,2 L-carnosin blev indgivet subeut.ant. i den angivne mængde i 14 dage. På den 7. dag blev der gennemført sensitive-ring med 1 % pi c ryJchlorid, og undersøgelsen udførtes 7 dage senere. Værdierne er vist i et gennemsnit på 15 8 mus - standardafvigelse.

* P <. 0,0 5 kontrolgruppe.

Undersøgelse af forsøgsresultater 1. Virkninger på PFC-reaktion og hæmagglutinatlonsre-aktion (HA-titer) hos en voksen mus i tilfælde af varieret 20 do s is-antigen.

En prøvningsmetode derfor er en standardmetode til screening af immunregulerende stoffer. Under betingelser, hvor der anvendes en mindre mængde antigen til at holde en lav reaktion af antistof i en normal milt hos et 25 dyr, forstærkes reaktionen, medens reaktionen undertrykkes i tilfælde, hvor der anvendes en større mængde antigen til at forøge reaktionen. Efter at 100 mg/kg L-car-nosin var indgivet i 6 dage, gennemførtes sensitive ringen med 5 x 10^ celler, 5 x 10^ celler eller 2,5 x 10^ 14 DK 171288 B1 ceJier af SRBC. PFC-reaktιοηηη og hæmagglut mat i ons- reaktionen pfter 4 dage er vist i tabel 2. I den normale gruppe blev PFC- reakt, ionen forøget, proportionalt med ant i genmængden, medens den i L-carnos i n-doserings-gruppen 5 blev forøget 30 % for den lille ant igenmængde (3 x 107 SRBC) og sænket 30 % for den store antigenmængde (3 x 8 9 10 , 2,5 x 10 SRBC). Disse resultater kan understøttes af hæmagglutinat i o n s r e akt. ionen over for SRBC, hvor reaktionen ikke blev ændret for 5 x 108 SRBC, men blev for- 10 øget fra 3 op 1.11 4 for 5 x 107 SRBC og sænket, fra 10 ned til 8 for 2,5 x 109 SRBC.

2. Virkninger på PFC-reaktion og hæmagg 1 ut. i na t i ons r e ak - 11 on i tilfælde af varieret alder af musen.

En umoden mus viste almindeligvis en højere immunreaktion 15 end en moden mus, og i mmunieakt ionen faldt, med forøgelse i musens alder. Tabel 3 viser· resultaterne af sammenligning, hvorved musenr med en alder på 2,5 og 30 uger, der hver blev indgivet 100 mg/kg L-carnosin i 9 dage, blev sammenlignet med den normale mus. Der blev ikke 20 iagttaget nogen virkning på PFC-reaktionen for den modne mus på 5 uger, men .immunreaktionen blev undertrykt torden umodne mus på 2 uger, medens den lave PFC-reaktion blev fordoblet for den gamle mus på 30 uger. Disse resultater blev også understøttet af hæmagglutinat. i onsreakt 10-2 5 nen.

3. Virkninger på immunreaktion af varieret, dosis af L -carnosin.

Som beskrevet heri har L-carnosin en immunregulerende virkning, men er nu kendt, for at skulle anvendes i en 30 optimal dosis for at frembringe den immunregulerende virkning, idet den viser et inhi beringsfænomen, når den anvendes i for stor mængde i forhold til et vist 1 5 DK 171288 B1 niveau, hvorved den adskiller sig fra andre lægemidler, som udviser proportional forbindelse mellem doserings-niveauet og virkningen. Denne mekanisme er endnu ikke v kendt og er blevet undersøgt for L-carnosin. PFC-reak- 0

5 tionen for musen på 5 uger i niveauet 2,5 x 10 SRBC

blev forøget ved dosen 50 og 250 mg/kg i 6 dage, men døde hen ved dosen på over 500 mg/kg. Hæmagglutinationsreakt ionen døde også hen i niveauet på mere end 500 mg/kg (tabel 4). DHR med 1 % picrylchlorid viser en 10 stigende tendens af reaktionen afhængigt af doserne på 50, 250 og 500 mg/kg (tabel 5). Derved at DHR forøges, bekræftes L-carnosin at have den immunregulerende virkning.

Formodet klinisk anvendelse 15 Ud fra dyreforsøgsresultater ved hæmolytisk-plaque-me- toden (PFC) og forsinket-hypersensitivitets-reaktionen (DHR) vil det indses, at den optimale dosering for den immunregu1erende virkning er 100 mg/kg/dag af L-carnosin (subcutan indgivη ingsvej ) hvoraf der udregnes en 20 dosis på 5 g/dag for den voksne med en legemsvægt på 50 kg. Bestanddelene af L-carnosin er B-alanin og L-histi din, som er aminosyrer in vivo. Således er L-carnosin en meget sikker immunregulator, som kan anvendes uden fare for bivirkninger.

25 Immunsygdomme, på hvilke L-carnosin kan anvendes kli nisk.

L-carnosin anvendes uspecifikt mod sygdomme forårsaget af immunabnormalitet. Der kan f.eks. nævnes følgende sygdomme: 1 serumsygdom, lupus erythematosus, forskellige typer af rheumatisme, blandet clioglobulinæmi, blandet binde- 16 DK 171288 B1 vsevss) qdom, HBV (hepatisk virus B-type) antigen-anti-s t o f - k omp 1 e x - sy gdom , i mmu π o b ] a s t - 1 y mp ha de n .i 11 s , scleroderma, mesenkymataxi syndrom, alvorlig myastem , Hashimotos sygdom, Basedows sygdom, asmyloidosis, Behcets syndrom, 5 immuninsuff icienssyndrom, Hodgkins sygdom, dissemineret, sele rose, organspecifik autoimmun sygdom og andre.

L-carnosin synes meget velegnet som immunregulerende stof ved transplantation af organer.

Det immunregulerende middel, som fremstilles ved anven-10 elsen ifølge opfindelsen, kan være i enhver form, som gør det. muligt, at indgive L-carnos.in hensigtsmæssigt, ad utal eller parenteral vej, såsom injicer bare opløs-ri i n g e r , pulvere, granulater, tabletter, kapsler, "enteric roat ings", inhalat. lonsmidler, trokl sker, o.a. Disse 15 midler kan indgives individuelt eller i kombinationer deraf, afhængigt af symptomerne. Dosis kan varieres inden for et bredt, område afhængigt af doseringsveje, typer og former af midlet og symptomerne. Som eksempler er typiske former, doser og indgivningsveje for lægemidlet.

20 vist. i følgende skema.

Form Dosis og indgivningsvej

Injicerbar opløsning 5 % opløsning 0,1 - 1,0 ml ad gangen, lokal injektion

Salve 1 λ salve, 1 g ad gangen, lokal påføring

Doserne og indgi vningsvejene er blot. vist til belysning og kan eventuelt, varieres inden for et bredt område, afhængigt af patienternes symptomer, på grund af L-carno-sins høje sikkerhed.

17 DK 171288 B1 t-carnosin er let opløseligt. .1 vand, således at. 0,3 , 0,5 % eller 1,0 % i sotoniske opløsninger deraf let. kan fremstilles aseptisk. Den isotoniske opløsning kan forsegles i en ampul under en inert gas til injektion igennem 5 en konventionel kanyle. Alternativt kan l-earnosinpulver, som i forvejen er blevet lyophilise ret og forseglet aseptisk i en ampul, opløses tiJ fremstilling af 0,3 % , 0,5 S eller 1,0 % isotonisk opløsning umiddelbart før injektion. Pulvere, granulater, tabletter eller 10 kapsler til oral dosering kan fremstilles ved konven tionelle metoder, som er velkendte inden for faget, under anvendelse af bindemidler, såsom qummiarabicum, gelatine, sorbitol, tragacanthgummi eller poly vinylpyrro-lidon; excipienter, såsom lactose, majsstivelse, calcium-15 phosphat., sorbitol eller glycin; g] i tt em.idler, såsom magnesiumstearat, talcum, pol yet. hyl eng ly col, hydroxy-propylmethylcellulose, natnumlaury Isul fat eller silici-umdioxid; eller nedbrydmngsm.idler, såsom kartoffelstivelse. Tabletterne kan overtrækkes ved velkendte metoder 20 inden for faget.

Til fremstilling af salve kan L-carnosinpulver i tilstrækkelig mængde til at give en ønsket koncentration i salven blandes med en salvebasis, såsom bleget voks, hval-voks, dehydratiseret lanolin, hvid vaseline, højere 25 alkoholer, makrogoler eller plastibase (f.eks. salve base af carbonhydr idgel fra Taisho Pharmaceutical Co.,

Ltd.), hydrophil salve, absorptiv salve eller blandinger deraf, hvortil der, om ønsket, kan sættes olier, såsom sesamolie, jordnøddeolie eller olivenolie), formstoffer, 30 glycerol, propylenglycol, overfladeaktive midler, fungi cider, anti-svampe-midler, antioxi danter o.a., og blandingen derpå æltes homogent.

Anvendelsen ifølge opfindelsen belyses nærmere ved de efterfølgende eksempler.

18 DK 171288 B1 EKSEMPEL 1 (Injicerbar opløsning)

Syntetisk L-carnosin blev opløst under aseptiske betingelser til fremstilling af en 0,3 %, 0,5 % eller 1,0 % isotonisk opløsning, som derpå blev fyldt i en ampul.

5 EKSEMPEL 2 (Granulat)

Syntetisk L-carnosin blev anvendt til at fremstille et granulat med den følgende sammensætning: L-carnosin.......0,2 g

Lactose........0,34 g 10 Majsstivelse......0,45 g

Hydroxypropylmethyl- cellulose.......0,01 g

Granulat 1,00 g EKSEMPEL 3 (Salve) 15 Syntetisk L-carnosin og en salvebase af carbonhydr idge1 blev anvendt til at fremstille en 1,0 % salve med følgende sammensætning: L-carnosin 1,0 g

Carbonhydr idge1 99,0 g 1

Salve 100,Og

Claims (2)

1. Anvendelse af L-carnosin eller et salt drraf som aktiv ingrediens til fremstilling af et i mmu n r e gu 1 e i. o n -de middel til behandling af immunsygdomme.

2. Anvendelse ifølge krav 1, hvor immunsygdommene ei 5 serumsygdom, lupus erythematosus, forskellige typer af rheumatisme, blandet clioglobulinæmi, blandet bindevævssygdom, HBV (hopat i sk virus B-type) antigen-ant i s 1 o f -komplex-sygdom, .immunoblast - lymphadenitis, scleroderma, mesenkymataxi synd rom, alvorlig m y asteni, Hashimotos 10 sygdom, Basedows sygdom, asmylo.i dosis, Behcet, s sy nd run,. immuninsuf f .ic lenssy udi om, Hodgkins sygdom, dissemineret sclerose, organspecifik autoimmun sygdom og immunreaktioner ved transplantat ion af organer.