JPS61204120A - 免疫調節剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はβ−アラニンまたはその塩を有効成分として含
有する免疫調節剤に関する。

従来の技術 免疫機能の変調にもとづく諸種の疾患の治療のため、免
疫調節剤と総称される各種の薬剤が開発されつつあるが
、本明細書で言う免疫調節剤とは免疫反応の異常低下を
回復し、過度の昂進を抑制して正常機能維持に作用する
薬剤を言う。この範ちゅうに属する薬剤としてレバミゾ
ール（アルドイッチ社）を代表とする種々の薬剤・が開
発されてきた。しかしながらこれらの従来の免疫調節剤
は生体物質ではない化学物質であるため、副作用に対す
る懸念を完全に払拭することはできず、事実、ある免疫
調節剤については注目すべき副作用が報告されている。

発明が解決しようとする問題点 免疫調節作用は本来、恒常性維持の生理機能であるから
、その生理機能は生体中に含まれる生理活性物質によっ
て調節されていることが推測される。したがって、本発
明は従来の化学物質に代り、副作用の少ない生理活性物
質による免疫調節剤を創製することを目的とする。

問題を解決するための手段 本発明者らは多年にわたる、生体中に含まれるω−アミ
ノ酸の生・理活性作用の研究中にβ−アラニンに免疫調
節作用があることを免疫学的に確認して本発明を完成さ
せた。これまでは上に定義されたような免疫機能を調節
する生理活性物質は発見できなかった、ことは言うまで
もないが、β−アラニン免疫調節作用を有することは全
く知られていなかった。またレバミゾールのような従来
から市販されてきた免疫調節剤とその作用が異なる点は
レバミゾールのような免疫調節剤には免疫調節作用はあ
ってもその作用は病巣組織の修復にまでは及ばないのに
対し、β−アラニンの場合は病巣修復にまでその免疫調
節作用が及ぶことである。

β−アラニンはつぎの化学構造式 ％式％ であられされる融点１９６℃（分解）の、水に溶けやす
い、弱い甘味のある白色結晶性粉末で、その５％水溶液
のｐＨは６．０〜７．３である。β−アラニンは蛋白質
の加水分解物中には発見されないが、ヒスチジンなどと
結合して天然に存在するペプチドであるカルノシンやア
ンセリンとして動物の筋肉中に存在し、またウラシルの
分解産物でもある。

また重要なビタミンであるパントテン酸、コツニレメン
）Ａ（ＣｏＡ）などの成分をなし生物学上重要な物質で
ある。マメ科植物の根瘤には遊離状態で存在し、茶の葉
や哺乳類の脳の加水分解物中にも存在する。細菌のアス
パラギン酸デカルボキシラーゼはアスパラギン酸を脱炭
酸してβ−アラニンを生合成する。このようにβ−アラ
ニンは動植物の組織中に存在するものであり、安全性の
高い物質である。

β−アラニンの合成法は公知であり〔オルガニック・シ
ンセシス、、第１６巻、第１頁、１９３６年（Ｏｒｇａ
ｎｉｃ　５ｙｎｔｈｅｓｅｓ、、ユニ、１．１９３６）
、ｌ、水酸化カリウムと次亜臭素酸カリウムの冷溶液に
コハク酸イミドを加えてホフマン反応を行い、β−アラ
ニンを得ることができる。本発明はβ−アラニンの塩か
らなる免疫調節剤をも包含するが、β−アラニンの塩と
してはカルボン酸基にもとすく塩と、アミノ基にもとす
く、薬理学上許容される酸との酸付加塩があり、またカ
ルボン酸基とアミノ基の双方にもとずく塩がある。カル
ボン酸基にもとずく塩にはナトリウム、カリウム、カル
シウム、マグネシウム、亜鉛およびアルミニウムのよう
な金属との塩、アンモニウム塩および置換アンモニウム
塩たとえばトリエチルアミンのようなトリアルキルアミ
ンその他のアミンとの塩があり、アミノ基にもとずく塩
には塩酸、硫酸、リン酸、酢酸、プロピオン酸、乳酸、
酒石酸、クエン酸、コハク酸、マレイン酸、ベンゼンス
ルホン酸、トルエンス、ルホン酸などの無機酸、有機酸
との塩があるが、これらはそれ自体公知の方法により、
遊離のβ−アラニンを化学看論的に計算された量の、選
択された酸または塩基と反応させることによって製造す
ることができる。

つぎに実験例をあげてβ−アラニンの優れた免疫調節作
用を説明する。

実験方法 マウスを用い溶血ブラック（ＰＦＣ）法、血球凝集反応
（Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ　ｔｅｓｔ　）お
よび遅延型過敏症反応（Ｄｅｌａｙｅｄ　Ｈｙｐｅｒｓ
ｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙＲｅａｃｔｉｏｎ　）により免疫
調節作用を調べた。

１）　溶血ブラック（ＰＦＣ法） カニンガム（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ　）法を改良した液
体室−スライド法（橋本性：免疫実験操作法Ａ１第４９
１〜４９４頁、１９７２年、日本免疫学全編）により、
プラグ生成細胞（Ｐ　Ｆ　Ｃ、Ｐｌａｑｕｅ　ｆｏｒｍ
ｉｎｇ　　ｃｅｌｌ　）を計測し、抗体産生能を調べた
。感作には羊の赤血球細胞（Ｓ　ＲＢ　Ｃ、５ｈｅｅｐ
　ｒｅｄ　ｂｌｏ。

ｄ　　ｃｅｌｌ、静岡県実験動物共同組合より人手）を
用い、原則としてこれをリン酸塩生理食塩水緩衝液（Ｐ
　Ｂ　Ｓ　、　Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒｅｄ
　５ａｌｉｎｅ　）で１ｍｌ中１．２５Ｘ１０’個の５
ＲＢＣを含む溶液を調製し、その０．２ｍｌ１（２，５
Ｘ　１０”個）をｄｄｙマウス（静岡県実験動物共同組
合より入手、５週令、雄性）の尾静脈から注入した。反
応培地は１０％の牛胎児血清（ＦＣ３）を含むイーグル
ＭＥＭ培−（日本製薬株式会社）を用い、これに４日後
に取り出した牌臓細胞４Ｘ１０’／ｍｎを０．１ｍｊ２
．１ｍｆ中２．５Ｘ１０９個の５ＲＢＣを含む溶液の０
、５ｍＡ　（１，２５Ｘ　１０９個）およびＺ希釈補体
用モルモット血清を０．４＋＋＋ｊ！混合した溶液をチ
ェンバー内に封入し、３７℃で１時間保温した。この方
法で約０．０２ｍ！のチェンバー内で５０〜１５０個の
ＰＦＣが検出できる。

２）　血清抗体値の測定 ＰＦＣ反応の測定にはマウス１群５匹の血液を頚動脈採
血により集め、常法に従って血清を分離した。血球凝集
反応値（ＨＡ　ｔｉｔｅｒ　）は常法に従い、正常なう
さぎの血清を０．５〜１％添加したリン酸塩生理食塩水
緩衝液（ＰＢＳ）で被検血清を希釈し、５ＲＢＣを用い
て測定した。陽性反応を示す最大希釈倍数を２Ｎで表示
し、Ｎを抗体値とした。

３）　遅延型過敏症反応（夏梅他：免疫実験操作法Ａ、
第６１４〜６２０頁、１９７２年、日本免疫学全組） ｄｄｙマウスの雄性、体重２０ｇ前後、５週令のものヲ
用い、２．４．６−）リニトロクロロベンゼン（塩化ピ
クリル、東京化成工業株式会社）による接触型皮膚炎に
て検出した。１％塩化ピクリルのエタノール溶液に湿し
た４枚重ねのガーゼ片（ｌＸ１ｃｍ）を剃毛したマウス
の腹部に１０秒間接触させ一次感作を行った。テスト用
二次感作は７日後に１％塩化ピクリルのオリーブ油溶液
を耳の表裏に絵筆を用いて塗布することにより行った。

反応側の耳にはオリーブ油を塗り対照値とした。

２４時間後マウスをエーテル麻酔し、１／１０００ｍｍ
まで測定可能なマイクロゲージにより耳の厚さを１／１
００　ｍｍまで測定した。遅延型過敏症反応の値は次式
のようにして求めた。

（２４時間後の塩化ピクリル塗布耳の厚さ一塗布前の耳
の厚さ）−（２４時間後のオリーブ油塗布耳の厚さ一塗
布前の耳の厚さ） ４）　β−アラニンの免疫調節作用の実験は抗原量２．
５Ｘ１０’個の５ＲＢＣ，５週令のマウスを基準として
抗原量、β−アラニンの投与量、動物の連合の条件を変
えてつぎのように行った。

ａ）抗原量を変えた場合 感作抗原量を５Ｘ１０’〜２．５Ｘ１０’個の５ＲＢＣ
とし、β−アラ＝７３０ｍｇ／ｋｇ投与による影響をみ
た。

ｂ）マウスの連合を変えた場合 ２．５週令の未成熟マウスから３００週令上の考齢マウ
スまでを使用し、β−アラニン３０ｍｇ／ｋｇ投与によ
る影響をみた。

Ｃ）β−アラニンの量を変えてＰＦＣ反応、血球凝集反
応値、遅延型過敏症反応がどのような影響を受けるかを
゛検討した。

実験結果 実験結果を整理するとつぎのように表示される。

第１表　羊の赤血球細胞（ＳＲＢＣ）の種々の投与量に
よって免疫されたマウスのＰＦＣ反応と血球凝集反応値
（ＨＡ　ｔｉｔｅｒ　）に対するβ−アラニンの影響 β−アラニン（３０ｍｇ／ｋｇ／日Ｓ、Ｃ０）を５日間
投与した群と正常群マウスに５ＲＢＣをマウスの尾静脈
から注入して免疫して５日後にＰＦＣ反応を行った。数
値は５匹のマウスの平均±Ｓ、　Ｄ。

＊Ｐ＜０．０５　　＊＊ｐ＜０．００１対対照群。

＊＊＊ＰＦＣ反応時に採血し、翌日血清を集めて凝集反
応試験を行った。抗体値（Ｎ）は陽性反応を示す最大希
釈倍数を２Ｎで表示し、Ｎを抗体値とした。

第２表　羊の赤血球細胞（ＳＲＢＣ）によって免疫され
た種々の連合のマウスにおける ＰＦＣ反応と血球凝集反応値（ＨＡ　ｔｉｔｅｒ　）に
及ぼすβ−アラニンの影響 β−アラニン（３０ｍｇ／ｋｇ／日Ｓ、Ｃ０）を６日間
投与したマウス群と正常群マウスに２．５　ＸＩＯ”個
の５ＲＢＣをマウスの尾静脈から注入して免疫して４日
後にＰＦＣ反応を行った。数値は５匹のマウスの平均上
Ｓ、Ｄ、　　　＊Ｐ＜０．００１対対照群。

＊＊ＰＦＣ反応時に採血し、翌日血清を集めて凝集反応
試験を行った。抗体値（Ｎ）は陽性反応を示す最大希釈
倍数を２Ｎで表示しＮを抗体値とした。

第３表　羊の赤血球細胞（ＳＲＢＣ）によって免疫され
たマウスのＰＦＣ反応と血球凝集反応値（ＨＡ　ｔｉｔ
ｅｒ　）に対するβ−アラニンの投与量の影響 β−アラニンを６日投与したマウス群と正常群マウスに
２．５Ｘ１（１’個の５ＲＢＣをマウスの尾静脈から注
入して免疫して４日後にＰＦＣ反応を行った。数値は５
匹のマウスの平均±Ｓ、Ｄ、　　　＊Ｐ＜０．００１対
対照群。＊＊ＰＦＣ反応時に採血し、翌日血清を集めて
凝集反応試験を行った。抗体値（Ｎ）は陽性反応を示す
最大希釈倍数を２１′　で表示しＮを抗体値とした。

第４表　マウスの遅延型過敏症反応（ＤＨＲ）に対する
β−アラニンの投与量の影響 β−アラニンの投与量　　　耳の厚さの増加（ｍｇ　／
　ｋｇ　／日）　　　　ＸＸｌ０−３ａ　　　　　対照
％０　　　　　　　　　　　　１６．４±５．９　　　
　　＜１００＞２０　　　　　　２１、０±８．０　　
　１２８．０１００　　　　　　１６、４±６．４　　
　１００．０２００　　　　　　１１、９±３．７　　
　７２．６β−アラニンは１４日間それぞれの量を皮下
投与した。７日日に１％塩化ピクリルで感作し更に７日
後に検査した。数値は８匹のマウスの平均±Ｓ、Ｄ。

実験効果の考察 １、　成熟マウスで抗原量を変えた場合のＰＦＣ反応お
よび血球凝集反応値（ＨＡ　ｔｉｔｅｒ　）に及ぼす影
響 これら試験法は免疫調節作用物質をスクリーニングする
ときの標準的方法である。正常な動物の肺臓では抗原量
を少なくし抗体応答を低く保つような条件でこの反応を
増強し、逆に十分な抗原を与え応答を高（した場合には
これを抑制することが知られている。β−アラニン３０
ｍｇ／ｋｇを５日間投与後それぞれ５Ｘ１０’　、２．
５Ｘ１０ａ％２．５Ｘ１０’　個の５ＲＢＣで感作し、
４日後のＰＦＣ反応、血球凝集反応値をみたのが第１表
である。正常群では抗原量に比例してＰＦＣが増加して
おり、これに対してβ−アラニン投与群では抗原量の少
ない場合（５Ｘ１０１５ＲＢＣ）には増加させ、抗原量
の多い場合（２，５Ｘ　１０ｇ５ＲＢＣ）には５０％も
減少させることがわかった。この結果は５ＲＢＣに対す
る血球凝集反応値でも裏づけられ、２．５Ｘ１０８個の
５ＲＢＣでは変えられないが５Ｘ１０’個の５ＲＢＣで
は３から４へ上昇し、２．５Ｘ１０９個の５ＲＢＣでは
９から７へと下降した。

２、　マウスの連合をかえた場合のＰＦＣ反応ふよび血
球凝集反応値に及ぼす影響 一般に未成熟マウスは成熟マウスに比べて強い免疫応答
を示し加令とともに低下することが知られている。第２
表はそれぞれ２．５．５．３００週令マウスに３０ｍｇ
／ｋｇのβ−アラニンを６日間投与して正常マウス群と
比較したものであるが、未成熟マウス（２，５週令）の
免疫応答は抑制し逆に考齢マウス（３００週令上）の低
下したＰＦＣ応答はこれを２倍にも増強させた。血球凝
集反応値もこれを裏づけだ。

３、　免疫応答に及ぼすβ−アラニンの投与量の影響 前述のようにβ−アラニンは免疫調節作用があるが、免
疫調節剤のもう一つの特徴としてその作用発現にはある
至適用量があることが知られている。他の薬物のような
正常な用量−作用関係を示すのではなく、一定壷以上投
与するとその作用は強化されるどころか抑制的な現象を
現すのである。

その機序についてはまだ不明であるが、β−アラニンに
おいてその点を調べてみた。ＰＦＣ反応では２．５Ｘ１
０′１個の５ＲＢＣに対して５週令のマウスで行った結
果２０．１００ｍｇ／ｋｇ６日間投与で増強作用を示し
、２００ｍｇ／ｋｇ以上でその反応が鎮静することが観
察された。血球凝集反応値でも同じ＜２００ｍｇ／ｋｇ
以上でその反応が鎮静することが観察された（第３表）
。１％塩化ピクリルに対する遅延型過敏症反応（ＤＨＲ
）では２０ｍｇ／　ｋｇで増強作用を示し、１００ｍｇ
／ｋｇ以上で鎮静化が観察された（第４表）。このよう
にＤＨＲを増強させることからもβ−アラニンが免疫調
節作用を有することが証明された。

推定できる臨床投与量 ＰＦＣおよびＤＨＲの動物実験の結果からβ−アラニン
の３０ｍｇ／ｋｇ／日（皮下投与）が免疫調節作用の至
適用量であり、これから５０ｋｇの成人で１．５　ｇ　
／日という値が１尋られる。β−アラニンは生体内のア
ミノ酸であり、したがって免疫調節剤として安全性も高
く、副作用等の心配なしに使用することができる。

臨床適用が予想される免疫疾患 β−アラニンは免疫異常の関与する疾患に非特異的に用
いられるものでその疾病の一部を代表として挙げればつ
ぎのとおりである。

血清病、エリテマトーデス、諸種のリウマチ、混合型の
クリオグロプリン血症、混合型結合組織病、ＨＢＶ　（
Ｂ型肝炎ウィルス）抗原抗体複合体病、免疫芽球性リン
パ節症、諸種の膠原病、硬皮症、間葉失調症侯群、重症
筋無力症、橋本病、バセドー病、アミロイド症、バーチ
エツト病、免疫不全症候群、ホジキン病、多発性硬化症
、臓器特異性自己免疫疾患、角膜潰瘍、褥斎性潰瘍、一
般外科創、抜歯前、アレルギー面皮１炎、アレルギー性
鼻炎、喘息、上気道炎、ヘルペス潰瘍。

その他臓器移植時の免疫調節作用物質として最適である
と考えられる。

本発明の免疫調節剤は上記のような免疫異常の関与する
種々の疾患に対するβ−アラニンの経口投与または非経
口投与が都合よ（行われるものであればどんな剤形のも
のであってもよく、例えば注射液、粉末剤、顆粒剤、錠
剤、カプセル剤、腸溶剤、注腸剤、吸入剤、トローチ、
軟膏剤などの種々の剤形をあげることができるが、これ
らを症状に応じてそれぞれ単独で、または組合わせて使
用する。投与量は投与経路、剤形、症状などにより大き
く変えることは当然であるが、本発明の治療剤の典型的
な剤形、投与量および投与方法を例示するとつぎのとお
りである。

なお、ここに記述した用法、用量は単なる目安であり、
β−アラニンは前述のように極めて安全な物質であるか
ら患者の症状により量を適宜増減することは何ら差し支
えない。

β−アラニンは水に易溶であるため、無菌的操作のもと
に容易にβ−アラニンの例えば０．３％、０．５％また
は１．０％の等張溶液をつくることができる。これを不
活性ガス気流下にアンプルに封入したものを普通の注射
器によって注射する。また予め無菌的操作によりアンプ
ルあるいはバイアル瓶に凍結乾燥して封入したβごアラ
ニン粉末を注射直前に０．３％、０．５％または１．０
％の等張溶液として直ちに注射に使用ひてもよい。

経口投与の粉末剤、顆粒剤、錠剤またはカプセル繭は結
合剤例えばシロップ、アラビヤゴム、ゼラチン、ソルビ
ット、トラガントまたはポリビニルピロリドン、賦形剤
例えば乳糖、とうもろこしデンプン、リン酸カルシウム
、ソルビットまたはグリシン、潤滑剤例えばステアリン
酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコール、ヒ
ドロキシプロピルメチルセルロースまたはシリカ、崩壊
剤例えば馬鈴薯デンプン、或は湿潤剤例えばラウリル硫
酸ナトリウムなどを使用し、当業界で慣用の方法で製剤
する。錠剤は当業界において周知の方法でコーティング
してもよい。

軟膏剤を製造するには、製剤界に公知の技術にしたがい
、所望濃度の軟膏となる量のβ−アラニンの微粉末を軟
膏基剤例えばサラシ密ロウ、鯨ロウ、脱水ラノリン、白
色ワセリン、高級アルコール、マクロゴール類あるいは
プラスチベース（大正製薬に、に、製ハイドロカーボン
ゲル軟膏基剤）、日本薬局法収載の親木製軟膏、吸水軟
膏またはこれらの混和物と混和し、これに必要に応じゴ
マ油、落花生油、オリーブ油等の油類、樹脂類、グリセ
リン、プロピレングリコール、界面活性剤、殺菌剤、防
黴剤、酸化防止剤等を添加し、均質となるまで十分にか
きまぜて練り合わせる。

つぎに本発明の免疫調節剤の製剤例をあげる。

製剤例１（注射剤） 無菌的操作のもとに、合成したβ−アラニンを］、３％
、０．５％または１．０％（いずれもβ−アラニンとし
て）の等張溶液としてアンプルに充填し社。

製剤例２（顆粒剤） 合成したβ−アラニンを用い下記処方 β−アラニン　　　　　　　　　０・２ｇ乳　　　　　
　　糖　　　　　　　　　　　　　　　０．３　４　　
ｇとうもろこしデンプン　　　　　０．４５　ｇヒドロ
キシプロピルメチル 頚　　　粒　　　剤　　　　　　　１．　ＯＯｇで顆粒
剤を製造した。

製剤例３（軟膏剤） 合成したβ−アラニンを用い、ハイドロカーボンゲル軟
膏剤を基剤として下記処方 β−アラニン　　　　　　　　　１．０ｇハイドロカー
ボンゲル軟膏剤　９９．０ｇ００　ｇ で１％軟膏剤を製造した。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. β−アラニンまたはその塩を有効成分として含有する免
   疫調節剤。