JPS61186322A - 免疾調節剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はＬ−カルノシンまたはその塩を有効成分として
含有する免疫調節剤に関する。

従来の技術 免疫機能の変調にもとづく諸種の疾患の治療のため、免
疫調節剤と総称される各種の薬剤が開発されつつあるが
、本明細書で言う免疫調節剤とは免疫反応の異常低デー
復し、過度の昂進を抑制して正常機能維持に作用する薬
剤を言う。

この範ちゅうに属する薬剤としてレバミゾール（アルド
リッチ社）を代表とする種々の薬剤が開発されてきた。

しかしながらこれらの従来の免疫調節剤は生体物質では
ない化学物質であるため、副作用に対する懸念を完全に
払拭することはできず、事実酸る免疫調節剤については
注目すべき副作用が報告されている。

発明が解決しようとする問題点 免疫調節作用は本来、恒常性維持の生理機能であるから
、その生理機能は生体中に含まれる生理活性物質によっ
て調節されていることが推測される。したがって、本発
明は従来の化学物質に代シ、副作用の少ない生理活性物
質による免疫調節剤を創製することを目的とする。

問題を解決するための手段 本発明者らは多年にわたる、生体中に含まれるＷ−アミ
ノ酸の生理活性作用の研究中にその誘導体で生理活性物
質であるＬ−カルノシンに免疫調節作用があることを免
疫学的に確認して本発明を完成させた。これまでは上に
定義されたような免疫機能を調節する生理活性物質は発
見できなかつたことは言うまでもないが、Ｌ−カルノシ
ンが免疫調節作用を有することは全く知られ５ていなか
りた。

Ｌ−カルノシンすなワチβ−アラニル−Ｌ−ヒスチジン
は１９００９００年ブレウィッチｌｅｗｉｔｓｃｈ）に
よってリービッヒの肉エキス中から発見された、Ｌ−ヒ
スチジンとβ−アラニンよシなるジベブタイドであって
、哺乳動物の骨格筋中に多量に含有されている。

発見以来その生理学的存在意義あるいは薬理的有用性に
ついて数多くの研究者によって研究が行なわれたが、今
日まで未解決のままであった。

Ｌ−カルノシンは融点２５０℃（分解）、〔αが＝　＋
　２０．０’　（Ｈ２Ｏ）で、無味、無臭の水に溶は易
い白色結晶性粉末である。つぎの構造式％式％ で表わされ、その水溶液のｐＨは８．０〜８．５である
。

Ｌ−力ルノシ／は諸種の哺乳動物の、主として骨格筋に
多量（約帆１〜０．３％）に存在する物質で、日常食肉
類よシ食品として摂取され必須アミノ酸し−ヒスチジン
の供給源である。またＬ−ヒスチジンとβ−アラニンと
から生合成される。摂取されたＬ−カルノシンは吸収後
カルノシナーゼによ、？Ｌ−ヒスチジンとβ−アラニン
に分解されて栄養素となシ、一部はＬ−カルノシンに再
合成される〔Ｌ−カルノシン生合成の中間物質としてβ
−アラニル−１−メチルエステルｙ　（Ａｎｓｅｒｉｎ
ｅ　）がある〕。

上記のととくＬ−カルノシンは食品類似の安全性の高い
物質であシ、吸収後は諸臓器中に存在するカルノシナー
ゼによシ分解されるので、他の多くの医薬品が肝臓で代
謝され、肝機能の負担となるのとは全く異なる物質であ
る。

つぎにＬ−カルノシンの急性毒性について述べる。

急性毒性 マウスを１群１０匹として種々の用量のし−カルノシン
を腹腔内ならびに経口的に投与し、投与後５時間の急性
中毒症状を観察した。ＬＤｓ。

は７２時間後の死亡数よシフアンプ“アヴエルデン（Ｖ
ａｎｄｅｒ　Ｗａｅｒｄｅｎ　）法によシ算出した。Ｌ
−カルノシンは投与液量が０．１〜ｏ、ａ　ＷＬＩ！／
１ｏｆ　Ｋなるよう生理食塩液に溶解した。

Ｌ−カルノシンの中毒症状としては１５，０００ｍｙ／
ｋｇ腹腔内投与（ＬＤ＋ｏａ）後約３０分頃よシ自発運
動の低下を招き腹位をとシ呼吸数は減少して不整となる
が、正向反射あるいは逃避反射の消失はみられず、時々
挙尾反応を示したシ間代性痙れんの発現をみるものが半
数にみられた。さらに症状が進むと横転を繰シ返し、接
触刺激に対して反射先進し痙れんの誘発がみられるよう
になシ、強直性痙れんに移行し死に至った。１時間３０
分後に半数、２時間後に８０％、５時間後には食倒が死
亡した。１５，０００　ｍ１７ｋｇの経口投与後には殆
んど影響を示さたかったが、１２時間後に１０例中１例
の死亡を認めた。

第１表 ＤＤＹ系雄マウスに対する急性毒性（７２時間値）は表
に示す通シであシ、Ｌ−カルノシンは極めて毒性の低い
化合物といえる。

またＬ−カルノシンはすでに約１０年以前よシスペイン
国のリサ社において食欲不振治療剤として製薬化されて
いるように、既に安全性の確認されている物質である。

またＬ−カルノシンの移植癌に対する有効量はマウス当
り１ｆｒ１ｆ１すなわち５０　ｍｙ　／に９であるが、
これは上記のような腹腔内投与による急性毒性Ｌ　Ｄｓ
ｏ、　９，０８７　ｍ１７ｋｇの１／　１８１に相当す
ることからもＬ−カルノシンの安全性は充分に推測され
る。

Ｌ−カルノシンの合成法は公知であＪ（Ｊｏｕ−ｒｍａ
ｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
　、　１０８，７５３＋１９３５）、カルボベンズオキ
シβ−アラニンを五塩化リンでクロライドとし、メタノ
ールでメチルエステルに導き、ヒドロアザイドを経てア
ザイドとなし、Ｌ−ヒスチジンメチルエステルとカップ
リングし、最後に接触還元によってカルボベンズオキシ
基をはずすことによってＬ−カルノシンを得ることがで
きる。本発明はＬ−カルノシンの塩からなる治療剤をも
包含するが、Ｌ−カルノシンの塩としてはカルボン酸基
に基づく塩と、アミン基にもとづく、薬理学上許容され
る酸との酸付加塩があシ、またカルボン酸基とアミノ基
の双方にもとづく塩がある。カルボン酸基にもとづく塩
にはナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム
、亜鉛およびアルミニウムのような金属との塩、アンモ
ニウム塩および置換アンモニウム塩、たとえばトリエチ
ルアミンのようなトリアルキルアミンその他のアミンと
の塩があシ、アミン基にもとづく塩には塩酸、硫酸、リ
ン酸、酢酸、プロピオン酸、乳酸、酒石酸、クエン酸、
コハク酸、マレづン酸、ベンゼンスルホン酸、トルエン
スルホン酸などの無機酸、有機酸との塩があるが、これ
らはそれ自体公知の方法によシ、遊離のＬ−カルノシン
を化学量論的に計算された量の、選択された酸または塩
基と反応させることによって製造することができる。

つぎに実験例をあげてＬ−カルノシンの優れた免疫調節
作用を説明する。

実験方法 マウスを用い溶血ブラック法（ＰＦＣ）法、血球凝集反
応（Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ　ｔｅｓｔ　）
および遅延型過敏症反応（Ｄｅｌａｙｅｄ　）（ｙｐｅ
ｒｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙＲｅａｃｔｉｏｎ　）によシ
免疫調節作用を調べた。

１）溶血ブラック法（ＰＦＣ法） カニンガム（（’ａｎｎｉｎｇｈａｍ　）法を改良した
液体会編）によシ、ブラック生成細胞（ＰＦＣ、Ｐｌａ
−ｑｕｅ　ｆｏｒｍｉｎｇ　ｃｅｌｌ　）を計測し、抗
体産生能を調べた。感作には羊の赤血球細胞（５ＲＢＣ
，５ｈｅｅｐｒｅｄ　ｂｌｏｏｄ　ｃｅｌｌ、静岡系実
験動物共同組合より入手）を用い、原則として、これを
リン酸塩生理食塩水緩衝液（ＰＢＳ　、Ｐｈｏｓｐｈａ
ｔｅ　ｂｕｆｆｅｒｅｄｓａｌｉｎｅ）で１ｉ中１２．
５　Ｘ　１０”個の５ＲＢＣを含む溶液を調製し、七ｆ
）　０．２　ｍｌ　（２，５Ｘ　１０８個）をＤＤＹマ
ウス（静岡系実験動物共同組合よシ入手、５退会、雄性
）の尾静脈から注入した。

反応培地は１０％の牛胎児血清（Ｆ’Ｃ８）を含むイー
グルＭＥＭ培地（日囁製薬株式会社）を用い、これに４
日後に取シ出した牌臓細胞４Ｘ１０７／ＩＩＩ／を帆１
−１１−中２．５　Ｘ　１０？個の５ＲＢＣを含む溶液
の０．５　ｄ　（１２，５Ｘ　１０’個）およびと希釈
補体用モルモット血清を０．４４混合した溶液をチェン
バー内に封入し、３７℃で１時間保温した。

この方法で約０．０２４のチェンバー内で５０〜１５０
個のＰＦＣが検出できる。

２）血清抗体値の測定 ＰＦＣ反応の際マウス１群５匹の血液を頚動脈採血によ
ル集め、常法に従って血清を分離し、血球凝集反応値（
ＨＡｔｉｔｅｒ　）を求めた。常法に従って正常なうさ
ぎの血清を０．５〜１％添加したリン酸塩生理食塩水緩
衝液（ＰＢＳ　）で被検血清を希釈し、５ＲＢＣを用い
て測定した。陽性反応を示す最大希釈項数を２Ｎで表示
し、Ｎを抗体値とした。

３）遅延型過敏症反応（夏梅他：免疫実験操作法Ａ１第
６１４〜６２０頁、１９７２年、日本免疫学会編） ＤＤＹマウスの雄性、体重２０ｆ前後、５週齢のものを
用い２．４．６−　トリニトロクロロベンゼン（塩化ピ
クリル、東京化成工業株式会社）Ｋよる接触型皮膚炎に
て検出した。１％塩化ピクリルのエタノール溶液に湿し
た４枚重ねのガーゼ片（１ｘ１ｃｍｍ）を刺毛したマウ
スの腹部に１０秒間接触させて一次感作を行った。テス
ト用二次感作は７日目に１チ塩化ピクリルのオリーブ油
溶液を耳の表裏に絵筆を用いて塗布することによシ行っ
た。反対側の耳にはオリーブ油を塗シ対照値とした。２
４時間後マウスをエーテル麻酔し、１／１１０００ｉ　
ｉで測定可能なマイクロゲージによシ耳の厚さを１／１
００ＪＩＩＥまで測定した。遅延型過敏症反応の値は次
式のようにして求めた。

（２４時間後の塩化ビクリル塗布耳の厚さ一塗布前の耳
の厚さ）−（２４時間後のオリーブ油塗布耳の厚さ一塗
布前の耳の厚さ） ４）　　Ｌ＝カルノシンの免疫調節作用の実験は抗原量
２．５　Ｘ　１０８個の５ＲＢＣ，５週令のマウスを基
準として抗原量、Ｌ−カルノシンの投与量、動物の退動
の条件をかえてつぎのように行った。

ａ）抗原量をかえた場合 感作抗原量を５　Ｘ　１０７〜２．５　Ｘ　１０９個の
５ＲＢＣとし、Ｌ−カルノシン１００ｍ９／ｌ＜ｇ投与
による影響をみた。

ｂ）マウスの退動をかえた場合 ２週齢の未成熟マウスから３００週齢上の老齢マウスま
でを使用し、Ｌ−カルノシン１００ｒｖ／ｋｇ投与によ
る影響をみた。

Ｃ）Ｌ−カルノシンの量をかえてＰＦＣ反応、血球凝集
反応値、遅延型過敏症反応がどのような影響を受けるの
かを検討した。

実験結果 実験結果を整理するとつぎのように表示される０ 第２表　羊の赤血球細胞（５ＲＢＣ）の種々の投与量に
よって免疫されたマウスのＰＦＣ反応と血球凝集反応値
（ＨＡｔｉｔｅｒ）に対するＬ−カルノシンの影響 Ｌ−カルノシン（１００ＷＩ９／＃１日Ｓ、Ｃ，）を６
日間投与した群と正常群マウスに５ＲＢＣをマウスの尾
静脈から注入して免疫し４口径Ｋ　ＰＦＣ反応を行った
。数値は５匹のマウスの平均士Ｓ、　Ｄ。

米Ｐ＜０−０１　未来Ｐ（０，００１対対照群＊＊＊Ｐ
ＦＣ反応時に採血し、翌日血清を集めて凝集反応試験を
行った。抗体値（Ｎ）は陽性反応を示す最大希釈倍数を
２１で表示し、Ｎを抗体値とした。

第３表　羊の赤血球細胞（ＳＲＢＣ）Ｋよって免疫され
た種々の退動のマウスにおけるＰＦＣ反応と血球凝集反
応値（ＨＡｔｉｔｅｒ　）に及ぼすＬ−カルノシンの影
響 Ｌ−カルノシン（１００■／ｋｌ１日ｉＳＣ，）を９日
間投与した群と正常群マウスに２．５　Ｘ　１０′＠の
５ＲＢＣをマウスの尾静脈から注入して免疫し４日後に
ＰＦＣ反応を行った。数値は５匹のマウスの平均±Ｓ、
　Ｄ、　　来ｐ＜ｏ、ｏｏ１対対照群　未来ＰＦＣ反応
時に採血し、翌日血清を集めて凝集反応試験を行った。

抗体値（Ｎ）は陽性反応を示す最大希釈倍数を２Ｎで表
示しＮを抗体値とした。

第４表　羊の赤血球細胞（ＳＲＢＣ）によって免疫され
たマウスのＰＦＣ反応と血球凝集反応値（ＨＡｔｉｔｅ
ｒ　）に対するＬ−カルノシｙの投与量の影響 Ｌ−カルノシンを６日間投与した群と正常群マウスに２
．５　Ｘ　１０Ｂ個の５ＲＢＣをマウスの尾静脈から注
入して免疫し４日後にＰＦＣ反応を行った。

数値は５匹のマウスの平均±Ｓ、Ｄ、米Ｐ（０，０１米
奈Ｐ＜０．０５対対照群来米奈ＰＦＣ反応時に採血し翌
日血清を集めて凝集反応試験を行った。抗体値（Ｎ）は
陽性反応を示す最大希釈倍数を２Ｎで表示しＮを抗体値
とした。

第５表　マウスの遅延型過敏症反応（ＤＨＲ）に対する
Ｌ−カルノシンの投与量の影響０　　　　　　１１．５
±４．０　　　　（１００）５０　　　　　　１４．１
±３．６　　　１２２．６２５０　　　　　　１５．７
±２．５　＋１３６．５５００　　　　　　２１．３±
８．７１ｋ　　　１８５．２Ｌ−カルノシンは１４日間
それぞれの量を皮下投与した。７８目に１％塩化ピクリ
ルで感作し更に７日後に検査した。数値は８匹のマウス
の平均±Ｓ、　Ｄ、　　＊　Ｐ　（０，０５対対照群実
験結果の考察 １、　成熟マウスで抗原量を変えた場合のＰＦＣ反応お
よび血球凝集反応値（ＨＡｔｉｔｅｒ　）に及ぼす影響 これらの試験法は免疫調節作用物質をスクリーニングす
るときの標準的方法である。正常な動物の牌臓では抗原
量を少なくし抗体応答を低く保つような条件ではこの反
応を増強し、逆に十分な抗原を与え応答を高くした場合
にはこれを抑制することが知られている。Ｌ−カルノシ
ン１００ＴＲ９／Ｉｃ９　を６日間投与後それぞれ５×
１０７個、５　Ｘ　１０８個および２．５　Ｘ　１０９
個の５ＲＢＣで感作し、４日後のＰＦＣ反応、血球凝集
反応値をみたのが第２表である。正常群では抗原量に比
例してＰＦＣが増加しておシ、これに対してＬ−力ルノ
シン投与群では抗原量の少ない場合（５Ｘ　１０７ＳＲ
ＢＣ）には３０％増加させ、抗原量の多い場合（５Ｘ　
１０８．２．５　Ｘ　１０９５ＲＢＣ）　Ｋは３０％減
少させることがわかった。この結果は５ＲＢＣに対する
血球凝集反応値でも裏づけられ、５Ｘ１０”個の５ＲＢ
Ｃでは変わらないが５　Ｘ　１０７個の５ＲＢＣでは３
から４へ上昇し、２．５　Ｘ　１０９個の５ＲＢＣでは
１０から８へと下降した。

２、　マウスの退動を変えた場合のＰＦＣ反応および血
球凝集反応値に及ぼす影響 一般に未成熟マウスは成熟マウスに比して強い免疫応答
を示し加齢とともに低下することが知られている。第３
表はそれぞれ２．５．３００週齢マウスに１００ｍ９７
ｋｆｌのＬ−カルノシンを９日間投与して正常群と比較
したものであるが成熟マウス（５週齢）のＰＦＣ応答に
は影響を及低下したＰＦＣ応答はこれを２倍にも増強さ
せた。

血球凝集反応値もこれを裏づけた。

３、免疫応答に及ぼすし一カルノシンの投与量の影響 前述のようにＬ−カルノシンには免疫調節作用があるが
、免疫調節剤のもう一つの特徴としてその作用発現には
ある至適用量のあることが知られている。他の薬物のよ
うな正常な用量−作用関係を示すのではなく、一定量以
上投与す゛るとその作用は強化されるどころか抑制的な
現象を現す。その機序についてはまだ不明であるが、Ｌ
−カルノシンにおいてその点を調べてみた。ＰＦＣ反応
では２．５　Ｘ　１０８個の５ＲＢＣに対して５週齢の
マウスで行った結果、５０，２５０■／ｋｇ６日間投与
で増強作用を示し、５００７１１１ｆｉＦ／ＩＣ９以上
でその反応が鎮静することが観察された。血球凝集反応
値でも同じ＜５００■／ｋｇ以上で鎮静された（第４表
）。１％塩化ピクリルに対するＤＨＲでは５０．２５０
．５００ＴＲ９／Ｉｃｇ　と投与量に従って反応が増強
された（第５表）。このようにＤＨＲを増強させること
からもＬ−カルノシンが免疫調節作用を有することが証
明された。

推定できる臨床投与量 溶血ブラック法（ＰＦＣ）　　および遅延型過敏症反応
（ＤＨＲ）の動物実験の結果からＬ−カルノシンの１０
０■／ｋｇ　／日（皮下投与）が免疫調節作用の至適用
量であシ、これから５０ｋｆｌの成人で５９／日という
値が得られる。Ｌ−カルノシンの構成成分はβ−アラニ
ンとＬ−ヒスチジンという生体内アミノ酸であシ、シた
がってＬ−カルノシンは免疫調節剤として安全性も高く
、副作用等の心配なしに使用することができる。

臨床適用が予想される免疫疾患 Ｌ−カルノシンは免疫異常の関与する疾患に非持異的に
用いられるものでその疾病の一部を代表として挙げれば
次のとお）である。

血清病、エリテマトーデス、諸種のりウマチ、混合型の
クリオグロプリン血症、混合型結合組織病、ＨＢＶ（Ｂ
型肝炎ウィルス）抗原抗体複合体病、免疫芽球性リンパ
節症、硬皮症、間葉失調症候群、重症筋無力症、橋本病
、バセドー病、アミロイド症、ベーチェット病、免疫不
全症候群、ホジキン病、多発性硬化症、臓器特異性自己
免疫疾患。

その他臓器移植時の免疫調節作用物質として最適である
と考えられる。

本発明の免疫調節剤は上記のような免疫異常の関与する
種々の疾患に対するし一カルノシンの径口投与または非
径口投与が都合よく行われるものであればどんな剤形の
ものであってもよく、例えば注射液、粉末剤、顆粒剤、
錠剤、カプセル剤、腸溶剤、吸入剤、トローチ、軟膏剤
などの種々の剤形をあげることができるが、これらを症
状に応じてそれぞれ単独で、または組合わせて使用する
。投与量は投与経路、剤形、症状などにより大きく変る
ことは当然であるが、本発明の治療剤の典型的な剤形、
投与量および投与方法を例示するとつぎのとおシである
。

なお、ここに記述した用法、用量は単なる目安であシ、
Ｌ−カルノシンは前述のように極めて安全な物質である
から患者の症状によりｍ宜増減することは何ら差し支え
ない。

Ｌ−カルノシンは水に易溶であるため、無菌的操作のも
とに容易にＬ−カルノシンの例えば０．３チ、０．５チ
または１．０チの等張溶液をつくることができる。とれ
を不活性ガス気流下にアンプルに封入したものを普通の
注射器によって注射する。また予め無菌的操作によシア
ンプルまたはバイアル瓶に凍結乾燥して封入したＬ−カ
ルノシン粉末を注射直前に０．３　％、０．５　％　ｔ
たは１．０チの等張溶液として直ちに注射に使用しても
よい。

径口投与の粉末剤、顆粒剤、錠剤またはカプセル剤は結
合剤例えばシロップアラビアゴム、ゼラチン、ソルビッ
ト、トラガントまたはポリビニルピロリドン、賦形剤例
えば乳糖、とうもろこしデンプン、リン酸カルシウム、
ソルビットまたはグリシン、潤滑剤例えばステアリン酸
マグネシウム、メルク、ポリエチレングリコール、ヒド
ロキシプロピルメチルセルロースまたはシリカ、崩壊剤
例えば馬鈴薯デンプン、或は湿潤剤例えばラウルル硫酸
す）　ＩＪウムなどを使用し、当業界で慣用の方法で製
剤する。錠剤は当業界において周知の方法でコーティン
グしてもよい。

軟膏剤を製造するには、製剤界に公知の技術にしたがい
、所望濃度の軟膏となる量のし一カルノシンの微粉末を
軟膏基剤例えばサラシ密ロウ、鯨ロウ、脱水ラノリン、
白色ワセリン、高級アルコール、マクロゴール類あるい
はプラスチペース（大正製薬に、　Ｋ、製ハイドロカー
ボンゲル軟膏基剤）、日本薬局方収載の親水性軟膏、吸
水軟膏またはこれらの混和物と混和し、これに必要に応
じゴマ油、落花生油、オリーブ油等の油類、樹脂類、グ
リセリン、プロピレングリコール、界面活性剤、殺菌剤
、防黴剤、酸化防止剤等を添加し、均質となるまで十分
にかきまぜて練シ合わせる。

つぎに本発明の免疫調節剤の実施例をあげる。

実施例１　（注射剤） 無菌的操作のもとに、合成したＬ−カルノシンを０．３
　％、０．５　％または１．（１（いずれもＬカルノシ
ンとして）の等張溶液としてアンプルに充填した。

実施例２（顆粒剤） 合成したＬ−カルノシンを用い下記処方Ｌ−カルノシン
　　　　　　　　０．２ｆ乳　　　　　　糖　　　　　
　　　　　　　　　０．３４　ｆとうもろこしデンプン
　　　　　０．４５　ｆヒドロキシプロピルメチル セルロース　　　　　　　　　　　０．０１　Ｆ顆　　
粒　　剤　　　　　　　　　　　　１．００ｆで顆粒剤
を製造した。

実施例３（軟膏剤）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. Ｌ−カルノシンまたはその塩を有効成分として含有する
   免疫調節剤。