JPH0481966B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

産業上の利用分野 本発明はＬ−カルノシンまたはその塩を有効に
成分として含有する免疫調節剤に関する。 従来の技術 免疫機能の変調にもとづく諸種の疾患の治療の
ため、免疫調節剤と総称される各種の薬剤が開発
されつつあるが、本明細書で言う免疫調節剤とは
免疫反応の異常低下を回復し、過度の昂進を抑制
して正常機能維持に作用する薬剤を言う。この範
ちゆうに属する薬剤としてレバミゾール（アルド
リツチ社）を代表する種々の薬剤が開発されてき
た。しかしながらこれらの従来の免疫調節剤は生
体物質ではない化学物質であるため、副作用に対
する懸念を完全に払拭することはできず、事実或
る免疫調節剤については注目すべき副作用が報告
されている。 発明が解決しようとする問題点 免疫調節作用は本来、恒常性維持の生理機能で
あるから、その生理機能は生体中に含まれる生理
活性物質によつて調節されていることが推測され
る。したがつて、本発明は従来の化学物質に代
り、副作用の少ない生理活性物質による免疫調節
剤を調整することを目的とする。 問題を解決するための手段 本発明者らは多年にわたる、生体中に含まれれ
るω−アミノ酸の生理活性作用の研究中にその誘
導体で生理活性物質であるＬ−カルノシンに免疫
調節作用があることを免疫学的に確認して本発明
を完成させた。これまでは上に定義されたような
免疫機能を調節する生理活性物質は発見できなか
つたことは言うまでもないが、Ｌ−カルノシンが
免疫調節作用を有することは全く知られていなか
つた。 Ｌ−カルノシンすなわちβ−アラニル−Ｌ−ヒ
スチジンは1900年グレウイツチ（Gulewitsch）
によつてリービツヒの肉エキス中から発見され
た、Ｌ−ヒスチジンとβ−アラニンよなるジペプ
タイドであつて、哺乳動物の骨格筋中に多量に含
有されている。 発見以来その生理学的存在意義あるいは薬理的
有用性について数多くの研究者によつて研究が行
なわれたが、今日まで未解決のままであつた。 Ｌ−カルノシンは融点250℃（分解）、〔α〕²⁰ _D＝
＋20.0°（H₂O）で、無味、無臭の水に溶け易い白
色結晶性粉末である。つぎの構造式 で表わされ、その水溶液のPHは8.0〜8.5である。 Ｌ−カルノシンは諸種の哺乳動物の、主として
骨格筋に多量（約0.1〜0.3％）に存在する物質
で、日常食肉類より食品として摂取され必須アミ
ノ酸Ｌ−ヒスチジンの供給源である。またＬ−ヒ
スチジンとβ−アラニンとから生合成される。摂
取されたＬ−カルノシンは吸収後カルノシナーゼ
によりＬ−ヒスチジンとβ−アラニンに分解され
て栄養素となり、一部はＬ−カルノシンに再合成
される〔Ｌ−カルノシン生合成の中間物質として
β−アラニル−１−メチル−ヒスチジン
（Anserine）がある〕。 上記のごとくＬ−カルノシンは食品類似の安全
性の高い物質であり、吸収後は諸臓器中に存在す
るカルノシナーゼにより分解されるので、他の多
くの医薬品が肝臓で代謝され、肝機能の負担とな
るとは全く異なる物質である。 つぎにＬ−カルノシンの急性毒性について述べ
る。 急性毒性 マウスを１群10匹とした種々の容量のＬ−カル
ノシンを腹腔内ならびに経口的に投与し、投与後
５時間の急性中毒症状を観察した。LD₅₀は72時
間後の死亡数よりフアンデアヴエルデン
（Vander Waerden）法により算出した。Ｌ−カ
ルノシンは投与液量が0.1〜0.3ml／10ｇになるよ
うに生理食塩液に溶解した。 Ｌ−カルノシンの中毒症状としては15000mg／
Kg腹腔内投与（LD₁₀₀）後約30分頃より自発運動
の低下を招き腹位をとり呼吸数は減少して不整と
なるが、正向反射あるいは逃避反射の消失はみら
れず、時々挙尾反応を示したり間代性痙れんの発
現をみるものが半数にみられた。さらに症状が進
むと横転を繰り返し、接触刺激に対して反射亢進
し痙れんの誘発がみられるようになり、強直性痙
れんに移行し死に至つた。１時間30分後に半数、
２時間後に80％、５時間後には全例が死亡した。
15000mg／Kgの経口投与後には殆んど影響を示さ
なかつたが、12時間後に10例中１例の死亡を認め
た。

【表】 DDY系雄マウスに対する急性毒性（72時間値）
は表に示す通りであり、Ｌ−カルノシンは極めて
毒性の低い化合物といえる。 またＬ−カルノシンはすでに約10年以前よりス
ペイン国のリサ社において食欲不振治療剤として
製薬化されているように、既に安全性の確認され
ている物質である。またＬ−カルノシンの移植癌
に対する有効量はマウス当り１mg、すなわち50
mg／Kgであるが、これは上記のような腹腔内投与
による急性毒性LD₅₀、9087mg／Kgの1/181に相当
することからもＬ−カルノシンの安全性は充分に
推測される。 Ｌ−カルノシンの合成法は公知であり
（Jourmal of Biological Chemistry、108、753、
1935）、カルボベンズオキシβ−アラニンを五塩
化リンでクロライドとし、メタノールでメチルエ
ステルに導き、ヒドロアザイドを経てアザイドと
なし、Ｌ−ヒスチジンメチルエステルとカツプリ
ングし、最後に接触還元によつてカルボベンズオ
キシ基をはずすことによつてＬ−カルノシンを得
ることができる。本発明のＬ−カルノシンの塩か
らなる治療剤をも包含するが、Ｌ−カルノシンの
塩としてはカルボン酸基に基づく塩と、アミノ基
にもとづく、薬理学上許容される酸との酸付加塩
があり、またカルボン酸基とアミノ基の双方にも
とづく塩がある。カルボン酸基にもとづく塩には
ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウ
ム、亜鉛およびアルミニウムのような金属との
塩、アンモニウム塩および置換アンモニウム塩、
たとえばトリエチルアミンのようなトリアルキル
アミンその他のアミンとの塩があり、アミノ基に
もとづく塩には塩酸、硫酸、リン酸、酢酸、プロ
ピオン酸、乳酸、酒石酸、クエン酸、コハク酸、
マレイン酸、ベンゼンスルホン酸、トルエンスル
ホン酸などの無機酸、有機酸との塩があるが、こ
れらはそれ自体公知の方法により、遊離のＬ−カ
ルノシンを科学量論的に計算された量の、選択さ
れた酸または塩基と反応させることによつて製造
することができる。 つぎに実験例をあげてＬ−カルノシンの優れた
免疫調節作用を説明する。 実験方法 マウスを用い溶血プラツク法（PFC）法、血
球凝集反応（Hemagglutination test）および遅
延型過敏症反応（Delayed Hypersensitivity
Reaction）により免疫調節作用を調べた。 (1) 溶血プラツク法（PFC法） カニンガム（Canningham）法を改良した液
体室−スライド法（橋本他：免疫実験操作法
Ａ、第491〜494頁、1972年、日本免疫学会編）
により、プラツク生成細胞（PFC.Plaque
forming cell）を計測し、抗体産生能を調べ
た。感作には羊の赤血球細胞（SRBC、
Sheepred blood cell、静岡県実験動物共同組
合より入手）を用い、原則として、これをリン
酸塩生理食塩水緩衝液（PBS.Phosphate
buffered saline）で１ml中12.5×10⁸個の
SRBCを含む溶液を調製し、その0.2ml（2.5×
10⁸個）をDDYマウス（静岡県実験動物共同組
合より入手、５週令、雄性）の尾静脈から注入
した。反応培地は10％の牛胎児血清（FCS）を
含むイーグルMEM培地（日水製薬株式会社）
を用い、これに４日後に取り出した脾臓細胞４
×10⁷／mlを0.1ml、１ml中2.5×10⁹個のSRBC
を含む溶液0.5ml（12.5×10⁸個）および1/4希釈
補体用モルモツト血清を0.4ml混合した溶液を
チエンバー内に封入し、37℃で１時間保温し
た。この方法で約0.02mlのチエンバー内で50〜
150個のPFCが検出できる。 (2) 血清抗体値の測定 PFC反応の際マウス１群５匹の血液を頚動
脈採血により集め、常法に従つて血清を分離
し、血球凝集反応値（HAtiter）を求めた。常
法に従つて正常なうさぎの血清を0.5〜１％添
加したリン酸塩生理食塩水緩衝液（PBS）で
被検血清を希釈し、SRBCを用いて測定した。
陽性反応を示す最大希釈倍数を2^Nで表示し、Ｎ
を抗体値とした。 (3) 遅延型過敏症反応（夏梅他：免疫実験操作法
Ａ、第614〜620頁、1972年、日本免疫学会編） DDYマウスの雄性、体重20ｇ前後、５週齢
のものを用い2.4.6−トリニトロクロロベンゼ
ン（塩化ピクリル、東京化成工業株式会社）に
よる接種型皮膚炎にて検出した。１％塩化ピク
リルのエタノール溶液に湿した４枚重ねのガー
ゼ片（１×１cm）を剃毛したマウスの腹部に10
秒間接触させて一次時感作を行つた。テスト用
二次感作は７日間目に１％の塩化ピクリルのオ
リーブ油溶液を耳の表裏に絵筆を用いて塗布す
ることにより行つた。反対側の耳にはオリーブ
油を塗り対照値とした。24時間後マウスをエー
テル麻酔し、1/1000mmまで測定可能なマイクロ
ゲージにより耳の厚さを1/100mmまで測定した。
遅延型過敏症反応の値は次式のようにして求め
た。 （24時間後の塩化ピクリル塗布耳の厚さ−塗
布前の耳の厚さ）−（24時間後のオリーブ油塗布
耳の厚さ−塗布前の耳の厚さ） (4) Ｌ−カルノシンの免疫調節作用の実験は抗原
量2.5×10⁸個のSRBC、５週令のマウスを基準
として抗原量、Ｌ−カルノシンの投与量、動物
の週齢の条件をかえてつぎのように行つた。 (a) 抗原量をかえた場合 感作抗原量を５×10⁷〜2.5×10⁹個のSRBC
とし、Ｌ−カルノシン100mg／Kg投与による
影響をみた。 (b) マウスの週齢をかえた場合 ２週齢未成熟マウスから30週齢以上の老齢
マウスまでの使用し、Ｌ−カルノシン100
mg／Kg投与による影響をみた。 (c) Ｌ−カルノシンの量をかえてPFC反応、
血球凝集反応値、遅延型過敏症反応がどのよ
うな影響を受けるのかを検討した。 実験結果 実験結果を整理するとつぎのように表示され
る。

【表】

【表】

【表】

【表】

【表】 実験結果の考察 １ 成熟マウスで抗原量を変えた場合のPFC反
応および血球凝集反応値（HAtiter）に及ぼす
影響 これらの試験法は免疫調節作用物質をスクリ
ーニングするときは標準的方法である。正常な
動物の脾臓では抗原量を少なくし抗体応答を低
く保つような条件ではこの反応を増強し、逆に
十分な抗原を与えて応答を高くした場合にはこ
れを抑制することが知られている。Ｌ−カルノ
シン100mg／Kgを６日間投与後それぞれ５×10⁷
個、５×10⁸個および2.5×10⁹個のSRBCで感作
し、４日後のPFC反応、血球凝集反応値をみ
たのが第２表である。正常群では抗原量に比例
してPFCが増加しており、これに対してＬ−
カルノシン投与群では抗原量の少ない場合（５
×10⁷SRBC）には30％増加させ、抗原量の多
い場合（５×10⁸、2.5×10⁹SRBC）には30％減
少させることがわかつた。この結果はSRBCに
対する血球凝集反応値でも裏づけられ、５×
10⁸個のSRBCでは変わらないが５×10⁷個の
SRBCでは３から４へ上昇し、2.5×10⁹個の
SRBCでは10から８へと下降した。 ２ マウスの週齢を変えた場合のPFC反応およ
び血球凝集反応値に及ぼす影響 一般に未成熟マウスは成熟マウスに比して強
い免疫応答を示し加齢とともに低下することが
知られている。第３表はそれぞれ２、５、30週
齢のマウスに100mg／KgのＬ−カルノシンを９
日間投与して正常群と比較したものであるが成
熟マウス（５週齢）のPFC応答には影響を及
ぼさないが未成熟マウス（２週齢）の免疫応答
は抑制し、逆に老齢マウス（30週齢以上）の低
下したPFC応答はこれらを２倍にも増強させ
た。血球凝集反応値もこれを裏づけた。 ３ 免疫応答に及ぼすＬ−カルノシンの投与量の
影響 前述のようにＬ−カルノシンには免疫調節作
用があるが、免疫調節剤のもう一つの特徴とし
てその作用発現にはある至適用量のあることが
知られている。他の薬物のような正常な用量−
作用関係を示すのではなく、一定量以上投与す
るとその作用は強化されるどころか抑制的な現
象を現す。その機序についてはまだ不明である
が、Ｌ−カルノシンにおいてその点を調べてみ
た。PFC反応では2.5×10⁸個のSRBCに対して
５週齢のマウスで行つた結果、50、250mg／Kg
６日間投与で増強作用を示し、500mg／Kg以上
でその反応が鎮静することが観察された。血球
凝集反応値でも同じく500mg／Kg以上で鎮静さ
れた（第４表）。１％塩化ピクリルに対する
DHRでは50、250、500mg／Kgと投与量に従つ
て反応が増強された（第５表）。このように
DHRを増強させることからもＬ−カルノシン
が免疫調節作用を有することが証明された。 推定できる臨床投与量 溶血プラツク法（PFC）および遅延型過敏症
反応（DHR）の動物実験の結果からＬ−カルノ
シンの100mg／Kg／日（皮下投与）が免疫調節作
用の至適用量であり、これから50Kgの成人で５
ｇ／日という値が得られる。Ｌ−カルノシンの構
成成分はβ−アラニンとＬ−ヒスチジンという生
体内アミノ酸であり、したがつてＬ−カルノシン
は免疫調節剤として安全性も高く、副作用等の心
配なしに使用することができる。 臨床適用が予想される免疫疾患 Ｌ−カルノシンは免疫異常の関与する疾患に非
特異的に用いられるものでその疾病の一部を代表
として挙げれば次のとおりである。 血清病、エリテマトーデス、諸種のリウマチ、
混合型のクリオグロブリン血症、混合型結合組織
病、HBV（Ｂ型肝炎ウイルス）抗原抗体複合体
病、免疫芽球性リンパ節症、硬皮症、間葉失調症
候群、重症筋無力症、橋本病、バセドー病、アミ
ロイド症、ベーチエツト病、免疫不全症候群、ホ
ジキン病、多発性硬化症、臓器特異性自己免疫疾
患。 その他臓器移植時の免疫調節作用物質として最
適であると考えられる。 本発明の免疫調節剤は上記のような免疫異常の
関与する種々の疾患に対するＬ−カルノシンの経
口投与また非経口投与が都合よく行われるもので
あればどんな剤形のものであつてもよく、例えば
注射液、粉末剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、腸
溶剤、吸入剤、トローチ、軟膏剤などの種々の剤
形をあげることができるが、これらを症状に応じ
てそれぞれ単独で、または組合わせて使用する。
投与量は投与経路、剤形、症状などにより大きく
変ることは当然であるが、本発明の治療剤の典型
的な剤形、投与量および投与方法を例示するとつ
ぎのとおりである。

【表】 なお、ここで記述した用法、用量は単なる目安
であり、Ｌ−カルノシンは前述のように極めて安
全な物質であるから患者の症状により適宜増減す
ることは何ら差し支えない。 Ｌ−カルノシンは水に易溶であるため、無菌的
操作のもとに容易にＬ−カルノシンの例えば0.3
％、0.5％または1.0％の等張溶液をつくることが
できる。これを不活性ガス気流下にアンプルに封
入したものを普通の注射器によつて注射する。ま
た予め無菌的操作によりアンプルまたはバイアル
瓶に凍結乾燥して封入したＬ−カルノシン粉末を
注射直前に0.3％、0.5％または1.0％の等張溶液と
して直ちに注射に使用してもよい。 経口投与の粉末剤、顆粒剤、錠剤またはカプセ
ル剤は結合剤例えばシロツプアラビアゴム、ゼラ
チン、ソルビツト、トラガントまたはポリビニル
ピロリドン、賦形剤例えば乳糖、とうもろこしデ
ンプン、リン酸カルシウム、ソルビツトまたはグ
リシン、潤滑剤例えばステアリン酸マグネシウ
ム、タルク、ポリエチレングリコール、ヒドロキ
シプロピルメチルセルロースまたはシリカ、崩壊
剤例えば馬鈴薯デンプン、或は湿潤剤例えばラウ
ルル硫酸ナトリウムなどを使用し、当業界では慣
用の方法で製剤する。錠剤は当業界において周知
の方法でコーテイングしてもよい。 軟膏剤を製造するには、製剤界に公知の技術に
したがい、所望濃度の軟膏となる量のＬ−カルノ
シンの微粉末を軟膏基剤例えばサラシ密ロウ、鯨
ロウ、脱水ラノリン、白色ワセリン、高級アルコ
ール、マクロゴール類あるいはプラスチベース
（大正製薬K.K.製ハイドロカーボンゲル軟膏基
剤）、日本薬局方収載の親水性軟膏、吸水軟膏ま
たはこれらの混和物として混和し、これに必要に
応じゴマ油、落花生油、オリーブ油等の油類、樹
脂類、グリセリン、プロピレングリコール、界面
活性剤、殺菌剤、防黴剤、酸化防止剤等を添加
し、均質となるまで十分にかきまぜて練り合わせ
る。 つぎに本発明の免疫調節剤の実施例を挙げる。 実施例 １ （注射剤） 無菌的操作のもとに、合成したＬ−
カルノシンを0.3％、0.5％または1.0％（いずれも
Ｌ−カルノシンとして）の等張溶液としてアンプ
ルに充填した。 実施例 ２ 合成したＬ−カルノシンを用いて下記処方 Ｌ−カルノシン 0.2ｇ 乳 糖 0.34ｇ とうもろこしデンプン 0.45ｇ ヒドロキシプロピルメチルセルロース 0.01ｇ 顆粒剤 1.00ｇ で顆粒剤を製造した。 実施例 ３ （軟膏剤） 合成したＬ−カルノシンを用い、ハイドロカー
ボンゲル軟膏剤を基剤として下記処方 Ｌ−カルノシン 1.0ｇ ハイドロカーボンゲル軟膏剤 99.0ｇ 軟膏剤 100.0ｇ で１％軟膏剤を製造した。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ Ｌ−カルノシンまたはその塩を有効成分とし
   て含有する免疫調節剤。