JPH0542410B2

JPH0542410B2 -

Info

Publication number: JPH0542410B2
Application number: JP59266982A
Authority: JP
Inventors: Kaneshiro Nagai; Yasuko Suda
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1984-12-18
Filing date: 1984-12-18
Publication date: 1993-06-28
Also published as: JPS61145118A

Description

【発明の詳細な説明】

産業上の利用分野本発明はホモカルノシンまたはその塩を有効成
分として含有する免疫調節剤に関する。従来の技術免疫機能の変調にもとづく諸種の疾患の治療の
ため、免疫調節剤と総称される各種の薬剤が開発
されつつあるが、本明細書で言う免疫調節剤とは
免疫反応の異常低下を回復し、過去の昴進を抑制
して正常機能維持に作用する薬剤を言う。この範
ちゆうに属する薬剤としてレバミゾール（アルド
イツチ社）を代表とする種々の薬剤が開発されて
きた。しかにながらこれらの従来の免疫調節剤は
生体物質ではない化学物質であるため、副作用に
対する懸念を完全に払拭することはできず、事
実、或る免疫調節剤については注目すべき副作用
が報告されている。発明が解決しようとする問題点免疫調節作用は本来、恒常性維持の生理機能で
あるから、その生理機能は生体中に含まれる生理
活性物質によつて調節されていることが推測され
る。したがつて、本発明は従来の化学物質に代
り、副作用の少ない生理活性物質による免疫調節
剤を創製することを目的とする。問題点を解決するための手段本発明者らは多年にわたる、生体中に含まれる
ω−アミノ酸の生理活性作用の研究中にその誘導
体で生理活性物質であるホモカルノシンに免疫調
節作用があることを免疫学的に確認して本発明を
完成させた。これまでは上に定義されたような免
疫機能を調節する生理活性物質は発見できなかつ
たことは言うまでもないが、ホモカルノシンが免
疫調節作用を有することは全く知られていなかつ
た。ホモカルノシンは1961年ピサノ（Pisano）ら
により牛脳から抽出されたジペプチド、すなわち
Ｌ−ヒスチジニル−γ−アミノ酪酸で、脳髄中に
役0.007％含有される。発見以来その生理学的存
在意義および薬理学的有用性は未解明であつた。ホモカルノシンはつぎの化学構造式であらわさ
れる。融点242〜243℃、〔α〕²⁰ _D＝＋23.2°の白色結晶粉末
でその10％水溶液は無色透明で弱アルカリ性を呈
し、弱いアルカリ性味覚を有する。投与されたホ
モカルノシンは加水分解されてＬ−ヒスチジンと
γ−アミノ酪酸になる。Ｌ−ヒスチジンは日常食
品から栄養素として多量に摂取されるアミノ酸で
ありまたγ−アミノ酪酸は脳髄中に存在するアミ
ノ酸で脳代謝促進剤として製薬化され〔第一製薬
株式会社、ガンマロン（商標）〕、安全性の確認さ
れた物質である。ホモカルノシンの合成については種々の方法が
知られているが、例えばつぎのようにして合成さ
れる（Journal of Biological Chemistry.，236、
No.２、499〜502、1961）。カルボベンジルオキシ−γ−アミノ酪酸のメチ
レンクロライド中の懸濁液にトリエチルアミンを
加える。得られた溶液を−５℃に冷却したのちに
エチルクロロホーメートを加え、この混合物をこ
の温度に10分間保つ。この溶液へ、予め０℃に冷
却したメチレンクロライド中Ｌ−ヒスチジンメチ
ルエステルジハイドロクロライドの懸濁液にトリ
エチルアミンを加えることによつてつくつたＬ−
ヒスチジンメチルエステルの溶液を急速に加え
る。得られた混合物を一夜間25℃に放置する。つ
いでこれを水および1N−NaHCO₃で洗浄し、
Na₂SO₄で乾燥し、シラツプ状になるまで濃縮す
る。この生成物をメタノール中に溶解し、1N−
NaOHを加える。25℃において３時間保つた後、
その溶液を希硫酸によりPH５に調節し、減圧のも
とに濃縮乾固する。残渣を熱エタノールで２回抽
出し、この抽出物に水を加える。10％パラジウム
ーチヤコールを加えて後、CO₂を吸収させるため
にカロクサイド管（Caroxite tube）を装備した
装置の中でこの混合物を水素添加する。水素添加
後この溶液を濾過し、減圧のもとで濃縮する。得
られた残渣状シラツプを水に溶解し、希硫酸でPH
３に調節する。エタノールを徐々に加えると、こ
のジペプチドの硫酸塩が粒状結晶として分離す
る。生成物を濾過し、水−エタノールから上記の
同じ方法で再結晶する。融点240℃（分離点）の
ホモカルノシン硫酸塩が得られる。ダウエツクス50（Dowex50、ダウ社製イオン交
換樹脂）をカラムに充填し1N−HClで処理した
後、チモールブルー中性まで水洗しし、ホモカル
ノシン硫酸塩を10％溶液として流し、チモールブ
ルー中性まで水洗して硫酸基を除いた後、1N−
NH₄OHでホモカルノシンを溶出する。濃縮した
後エタノールを加え、冷室に放置して、遊離ホモ
カルノシンの結晶を得る。本発明はホモカルノシンの塩からなる免疫調節
剤をも包含するが、ホモカルノシンの塩としては
カルボン酸基に基づく塩と、アミノ基にもとづ
く、薬理学上許容される酸との酸付加塩があり、
またカルボン酸基とアミノ基の双方にもとづく塩
がある。カルボン酸基にもとづく塩にはナトリウ
ム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、亜鉛
およびアルミニウムのような金属との塩、アンモ
ニウム塩および置換アンモニウム塩たとえばトリ
エチルアミンのようなトリアルキルアミンその他
のアミンとの塩があり、アミノ基にもとづく塩に
は塩酸、硫酸、リン酸、酢酸、プロピオン酸、乳
酸、酒石酸、クエン酸、コハク酸、マレイン酸、
ベンゼンスルホン酸、トルエンスルホン酸などの
無機酸、有機酸との塩があるが、これらはそれ自
体公知の方法により、遊離のホモカルノシンを化
学量論的に計算された量の、選択された酸または
塩基と反応させることによつて製造することがで
きる。つぎに実験例をあげてホモカルノシンの免疫調
節作用を説明する。実験方法マウスを用い溶血プラツク法（PFC）法、血
球凝集反応（Hemagglutination test）および遅
延型皮膚反応（Delayed Hypersensitivity
Reaction）により免疫調節作用を調べた。 (1) 溶血プラツク法（PFC法）カニンガム（Cunningham）法を改良した液
体室−スライド法（橋本他：免疫実験操作法
Ａ、第491〜494頁、1972年、日本免疫学会編）
により、プラク生成細胞（PFC.Plague
forming cell）を計測し、抗体産性能を調べ
た、感作には羊の赤血球細胞（SRBC、Sheep
red blood cell、静岡県実験動物共同組合より
入手）を用い、原則として、これをリン酸塩生
理食塩水緩衝液（PBS.Phosphate buffered
saline）で１ml中12.5×10⁸個のSRBCを含む溶
液を調製し、その0.2ml（2.5×10⁸個）をddyマ
ウス（静岡県実験動物共同組合より入手、５週
令、雄性）の尾静脈から注入した。反応培地は
10％の牛胎子血清（FCS）を含むイーグル
MEM培地（日本製薬株式会社）を用い、こ
れに４日後に取り出した脾臓細胞４×10⁷／ml
を0.1ml、１ml中2.5×10⁹個のSRBCを含む溶液
の0.5ml（12.5×10⁸個）および1/4希釈補体用モ
ルモツト血清を0.4ml混合した溶液をチエンバ
ー内に封入し、37℃で１時間保温した。この方
法で約0.02mlのチエンバー内で50〜150個の
PFCが検出できる。 (2) 血清抗体価の測定 PFC反応の測定の際１群５匹の血液を頚動
脈採血により集め、常法に従つて血清を分離
し、血球凝集反応値（HA titer）は常法に従
い、正常なうさぎの血清を0.5〜１％添加した
リン酸塩生理食塩水緩衝液（PBS）で被検血
清を希釈し、SRBCを用いて測定した。陽性反
応を示す最大希釈倍数を2^Nで表示し、Ｎを抗体
価とした。 (3) 遅延型皮膚反応（夏梅他：免疫実験操作法
Ａ、第614〜620頁、1972年、日本免疫学会編） ddyマウスの雄性、体重20ｇ前後、５週令の
ものを用い２，４，６−トリニトロクロロベン
ゼン（塩化ピクリル、東京化成工業株式会社）
による接触型皮膚炎にて検出した。一次感作は
マウスの腹部を剃毛した後１×１cmのガーゼ片
４枚を重ねたものに１％塩化ピクリルのエタノ
ール溶液を浸漬し腹部皮膚に10秒間接触させ
た。テスト用二次感作は７日間に１％塩化ピク
リルのオリーブ油溶液を耳の表裏に絵筆を用い
て塗布した。反対側の耳にはオリーブ油を塗り
対照値とした。24時間後マウスをエーテル麻酔
し、1/1000mmまで測定可能なマイクロゲージに
より耳の厚さを1/100mmまで測定した。遅延型
皮膚反応の値は次式のようにして求めた。（24時間後の塩化ピクリル塗布耳の厚さ−塗布
前の耳の厚さ）−（24時間後のオリーブ油塗布耳
の厚さ−塗布前の耳の厚さ） (4) ホモカルノシンの免疫調節作用の実験は抗原
量2.5×10⁸個のSRBC、５週令の動物を基準と
して抗原量、ホモカルノシンの投与量、動物の
週令の条件を変えてつぎのように行つた。 (a) 抗原量を変えた場合感作抗原量を５×10⁷〜2.5×10⁹個のSRBC
とし、ホモカルノシン50mg／Kg投与による影
響をみた。 (b) マウスの週令を変えた場合 2.5週令の未成熟マウスから30週令以上の
老齢マウスまでを使用したホモカルノシン50
mg／Kg投与による影響をみた。 (c) ホモカルノシンの量をかえてPFC反応、
血球凝集反応値、遅延型皮膚反応がどのよう
な影響受けるかを検討した。実験結果実験結果を整理するとつぎのように表示され
る。

【表】

【表】照群

【表】

【表】実験１
0 11.6±5.3 〓100〓

【表】実験結果の考察１成熟マウスで抗原量を変えた場合のPFC反
応および血球凝集反応値（HA titer）に及ぼ
す影響これらの試験法は免疫調節作用物質をスクリ
ーニングするときの標準的方法である。正常な
動物の脾臓では抗原量を少なくし抗体応答を低
く保つような条件ではこの反応を増強し、逆に
十分な抗原を与え応答を高くした場合にはこれ
を抑制することが知られている。ホモカルノシ
ン50mg／Kgを10日間投与後それぞれ５×10⁷個、
５×10⁸個および2.5×10⁹個のSRBCで感作し、
４日後のPFC反応、血球凝集反応値をみたの
が第１表および第２表である。正常群では抗原
量に比例してPFCが増加しており、さらにホ
モカルノシン投与群では抗原量の少ない場合に
は２倍弱増加させ、抗原量の多い場合には数10
％減少させることがわかる（第１表）。この結
果はSRBCに対する血球凝集反応値でも裏づけ
られ、５×10⁸個のSRBCでは変わらないが５
×10⁷個のSRBCでは３か７と上昇し、2.5×10⁹
個のSRBCでは９から４〜５へと下降した（第
２表）。２マウスの週令を変えた場合のPFC反応およ
び血球凝集反応値に及ぼす影響一般に未成熟マウスは成熟マウスに比して強
い免疫反応を示す加令とともに低下することが
知られている。非投与群では５〜11週令の成熟
マウスに比して未成熟マウス（2.5週令）では
PFCが多く、老齢マウス（30週令以上）では
少ないことがわかつた。（第３表）。更にホモカ
ルノシン50mg／Kgを６日間投与した群では成熟
マウスのPFC反応には何ら作用しないが未成
熟マウスの強い免疫応答は50％抑制し、逆に老
齢マウスの低下したPFC応答はこれを２倍以
上も増強することがわかつた。血球凝集反応値
もこれを裏づける結果を得た（第４表）。３免疫応答に及ぼすホモカルノシンの投与量の
影響前述のようにホモカルノシンには免疫調節作
用がある。免疫調節剤のもう一つの特徴として
その作用発現にはある至適用量があることが知
られている。他の薬物のような正常な用量−作
用関係を示すのではなく、一定量以上投与する
とその作用は強化されるどころか抑制的な現象
を現わす。その機序についてはまだ不明である
が、ホモカルノシンにおいてその点を調べてみ
た。ホモカルノシンの投与量反応
（doseresponse）はPFC反応では2.5×10⁸個の
SRBCに対して10mg／Kg、50mg／Kgで増強作用
を示し250mg／Kg以上でその反応は鎮静するこ
とが観察された（第５表）。血球凝集反応値で
も同じく証明された（第６表）。１％塩化ピク
リルに対する遅延型皮膚反応（DHR）でも10
mg／Kg、50mg／Kgで増強作用を示し、250mg／
Kgでは対照群と同程度かもしくは抑制作用がみ
られた（第７表）。このように遅延型皮膚反応
を増強することからもホモカルノシンが免疫調
節作用を有することが証明された。推定できる臨床投与量溶血プラツク法（PFC）および遅延型皮膚反
応（DHR）の動物実験の結果からホモカルノシ
ンの10mg／Kg／日（皮下投与）が免疫調節剤作用
の至適用量であり、これから50Kgの成人で50.0
mg／日という値が得られる。これはホモカルノシ
ンの構成成分であるγ−アミノ酪酸の量に換算し
て323mg／日となり、径口投与では10倍して１日
あたり3.2ｇである。現在脳代謝促進剤ガンマロ
ンとして市販されているγ−アミノ酪酸の薬用量
は径口投与で３ｇであり、この値と一致し、した
がつてホモカルノシンは免疫調節剤として安全性
も高く、副作用等の心配なしに使用することがで
きる。臨床適用が予想される免疫疾患ホモカルノシンは免疫異常の関与する疾患に非
特異的に用いられるものでその疾病の一部を代表
として挙げれば次のとおりである。血清病、エリテマトーデス、諸種のリウマチ、
混合型のクリオグロブリン血症、混合型結合組織
病、HBV（Ｂ型肝炎ウイルス）抗原抗体複合体
病、免疫芽球性リンパ節症、硬皮症、間葉失調症
候群、重症筋無力症、橋本病、パセドー病、アミ
ロイド症、ペーチエツト病、免疫不全症候群、ホ
ジキン病、多発性硬化症、臓器特異性自己免疫疾
患、臓器移植。本発明の免疫調節剤は上記のような免疫異常の
関与する種々の疾患に対するホモカルノシンの径
口投与または非径口投与が都合よく行われるもの
であればどんな剤形のものであつてもよく、例え
ば注射液、粉末剤、顆粒、錠剤、カプセル剤、腸
溶剤、注腸剤、吸入剤、トローチ、軟膏剤などの
種々の剤形をあげることができるが、これらを症
状に応じてそれぞれ単独で、または組合わせて使
用する。投与量は投与経路、剤形、症状などによ
り大きく変ることは当然であるが、本発明の治療
剤の典型的な剤形、投与量および投与方法を例示
するとつぎのとおりである。

【表】なお、ここに記述した用法、用量は単なる目安
であり、ホモカルノシンは前述のように極めて安
全な物質であるから患者の症状により量を適宜増
減することは何ら差し支えない。ホモカルノシンは水に易溶であるため、無菌的
操作のもとに容易にホモカルノシンの例えば0.3
％、0.5％または1.0％の等張溶液をつくることが
できる。これを不活性ガス気流下にアンプルに封
入したものを普通の注射器によつて注射する。ま
た予め無菌的操作によりアンプルあるいはバイア
ル瓶に凍結乾燥して封入したホモカルノシン粉末
を注射直前に0.3％、0.5％または1.0％の等張溶液
として直ちに注射に使用してもよい。径口投与の粉末剤、顆粒剤、錠剤またはカプセ
ル剤は結合剤例えばシロツプ、アラビヤゴム、ゼ
ラチン、ソルビツト、トラガントまたはポリビニ
ルピロリドン、賦形剤例えば乳糖、とうもろこし
デンプン、リン酸カルシウム、ソルビツトまたは
グリシン、潤滑剤例えばスレアリン酸マグネシウ
ム、タルク、ポリエチレングリコール、ヒドロキ
シプロピルメチルセルロースまたはシリカ、崩壊
剤例えば馬鈴薯デンプン、或は湿潤剤例えばラウ
リル硫酸ナトリウムなどを使用し、当業界で慣用
の方法で製剤する。錠剤は当業界において周知の
方法でコーテイングしてもよい。軟膏剤を製造するには、製剤界に公知の技術に
しかがい、所望濃度の軟膏となる量のホモカルノ
シンの微粉末を軟膏基剤例えばサラシ蜜ロウ、鯨
ロウ、脱水ラノリン、白色ワセリン、高級アルコ
ール、マクロゴール類あるいはプラスチベース
（大正製薬K.K.製ハイドロカーボンゲル軟膏基
剤）、日本薬局法収載の親水製軟膏、吸水軟膏ま
たはこれらの混和物と混和し、これに必要に応じ
ゴマ油、落花生油、オリーブ油等の油類、樹脂
類、グリセリン、プロピレングリコール、界面活
性剤、殺菌剤、防黴剤、酸化防止剤等を添加し、
均質となるまで十分にかきまぜて練り合わせる。つぎに本発明の免疫調節剤の製剤例をあげる。製剤例１（注射剤）無菌的操作のもとに、合成したホモカルノシン
を0.3％、0.5％または1.0％（いずれもホモカルノ
シンとして）の等張溶液としてアンプルに充填し
た。製剤例２（顆粒剤）合成したホモカルノシンを用い下記処方ホモカルノシン 0.2ｇ乳糖 0.34ｇとうもろこしデンプン 0.45ｇヒドロキシプロピルメチルセルロース 0.01ｇ顆粒剤 1.00ｇで顆粒剤を製造した。製剤例３（軟膏剤）合成したホモカルノシンを用い、ハイドロカー
ボンゲル軟膏剤を基剤として下記処方ホモカルノシン 1.0ｇハイドロカーボンゲル軟膏剤 99.0ｇ 100ｇで１％軟膏剤を製造した。

Claims

【特許請求の範囲】

１ホモカルノシンまたはその塩を有効成分とし
て含有する免疫調節剤。