DE3787437T2

DE3787437T2 - Sialosylcholesterol, verfahren zu dessen herstellung und arzneimittel zur behandlung von krankheiten des nervensystems.

Info

Publication number: DE3787437T2
Application number: DE87902772T
Authority: DE
Inventors: Kimio Furuhata; Masayoshi Ito; Yoshitaka Nagai; Haruo Ogura; Shingo Sato; Yoshiyasu Shitori
Original assignee: KANTO ISHI PHARMA CO Ltd; Mect Corp
Current assignee: KANTO ISHI PHARMA CO Ltd; Mect Corp
Priority date: 1986-05-12
Filing date: 1987-05-11
Publication date: 1994-01-20
Anticipated expiration: 2007-05-12
Also published as: FI91071C; DK170648B1; AU594468B2; EP0267297A1; CA1324603C; EP0267297A4; US5023239A; FI91071B; FI880103A; EP0267297B1; FI880103A0; US5126330A; HUT46039A; DK12388A; AU7394387A; DK12388D0; HU198216B; DE3787437D1; WO1987006936A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Sialosylcholesterin, insbesondere Sialosylcholesterin, das nützlich ist als Mittel zur Heilung verschiedener Krankheiten, die von Schädigungen peripherer Nerven und zentraler Nerven herrühren.
Bis jetzt war es in der Technik bekannt, daß Sialinsäure in vielen Tierkörpern und auf der Zellenoberfläche von mehreren Bakterien anwesend ist als ein sialylierter molekularer Komplex, z. B. als Glykoprotein, Glykolipid, Oligosacharid oder Polysacharid.
Kürzlich dachte man, daß diese Verbindung medizinisch und pharmazeutisch wichtig sei für Nervenfunktion, Krebs, Entzündung, Immunität, virale Infektion, Differenzierung, Hormonrezeptor und andere. Weiterhin wurde dieser Verbindung viel Aufmerksamkeit gewidmet als eine besonders aktive, an der Zelloberfläche gelegene Substanz. Die Rolle der Sialinsäure in dem sialylierten molekularen Komplex wurde jedoch noch nicht ermittelt.
Weiterhin wurde diese Verbindung von vielen organischen Naturstoffchemikern studiert, und es wurden viele Arten von Derivaten davon erhalten. Es wurden jedoch noch keine Derivate mit bemerkenswerter physiologischer Aktivität erhalten.
Weiterhin wurde die Durchschnittsspanne menschlichen Lebens tatsächlich ausgedehnt durch verschiedene Verbesserungen in der medizinischen Behandlung bösartiger Tumore des blutbildenden Organs, vieler Arten von Krebs und Collagenkrankheit. Diese Verbesserungen haben jedoch unvermeidbar den Gebrauch von Heilmitteln wie Nebennierenrindenhormon, Immunosupressiva, etc. erhöht. Daher tauchten eine Anzahl unerwünschter Nebeneffekte wie ein Absinken der Immunstärke auf.
Aus "Nihon Yakugakkai No. 105 Koen Yoshi-shu", 5 Q9-8, ist das pharmazeutisch aktive Sialinsäure-Derivat Methyl-2-cholesteryl-4,7,8,9- tetra-O-acetyl-neuraminat bekannt. Die Verbindung dieser Schrift wird hergestellt durch zur Reaktion bringen von Methyl-2-chlor-4,7,8,9-tetra- O-acetyl-neuraminat mit Cholesterin in Gegenwart von AgClO&sub4;. Die für die α- und β-Glycosyl-Verbindung erhaltene Ausbeute ist 11,6%.
Die vorliegenden Erfinder haben der Sialinsäure, die eine lebensinhärente Verbindung ist, spezielle Aufmerksamkeit gewidmet und haben intensive Studien durchgeführt an immunitätssteuernden Mitteln mit im wesentlichen keinen Nebeneffekten und welche die Aktivität für die immunologische Überwachung steuern, indem sie die Sialinsäure chemisch modifizieren. Als Ergebnis haben die vorliegenden Erfinder Sialosylcholesterin, das als Neuropathie-Medikament von Nutzen ist, hergestellt. Dieses basiert auf der Entdeckung, daß das vorliegende Sialosylcholesterin das Wachstum der Neuriten von Neuroblastomzellen, die von Mäusen stammen (Neuro 2a) fördern, wenn die Aktivität des Sialosylcholesterins untersucht wird, indem man es zur Kultur von Neuro 2a hinzugibt.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein neues Sialosylcholesterin zur Verfügung zu stellen.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein neues Verfahren zur Erzeugung von Sialosylcholesterin zur Verfügung zu stellen.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein neues Neuropathie-Medikament zur Verfügung zu stellen.
Nebenbei hat das Cholesterin eine hervorragende Wasser-Löslichkeit und macht die Anwendbarkeit des Cholesterins breiter, da das vorliegende Sialosylcholesterin in einer Na-Salz-Form vorliegt.
Die vorliegend Erfindung betrifft die Verbindung mit der folgenden allgemeinen Formel (4):
oder der Formel (5):
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung der Verbindung (4) oder (5), aufweisend das zur Reaktion bringen einer Verbindung (1) mit einer allgemeinen Formel (1):
mit vollständig getrocknetem Cholesterin, zur Herstellung einer Verbindung mit einer allgemeinen Formel (2):
oder der Formel (3):
und dann das Hydrolysieren der Verbindung (2) oder (3).
Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung ein Neuropathie-Heilmittel, das die Verbindung (4) oder (5) enthält.
Die vorliegende Erfindung wird unten genau erläutert werden.
Zuerst wird ein Verfahren zur Herstellung der Verbindung (4) oder (5) zusammengefaßt durch das folgende Schema: Schema Verbindung Cholesterin Koenigs-Knorr Hydrolyse
Die in der vorliegenden Erfindung zu verwendende Verbindung (1) ist eine bekannte Verbindung und im Handel erhältlich.
In der obigen Reaktion wird die Verbindung (1) mit vollständig getrocknetem Cholesterin in Gegenwart eines Königs-Knorr-Katalysators bevorzugt bei etwa 20 bis 25ºC unter einem normalen Druck etwa 1 bis 7 Tage lang reagieren lassen. In diesem Fall wird Cholesterin mit der Verbindung (1) bei einem molaren Verhältnis von etwa 1 bis 5 Molen an Cholesterin zu 1 Mol der Verbindung (1) reagieren lassen.
Der Katalysator deckt zum Beispiel Quecksilberbromid, Quecksilbercyanid, Silberperchlorat, Silbertrifluormethansulfonat, Silbertrifluoracetat und andere. Der Katalysator wird bevorzugt in einer Menge von etwa 1,0 bis 1,2 Äquivalenten pro einem Äquivalent der Verbindung (1) verwendet.
Zu Lösungsmitteln, die in der vorliegenden Erfindung zu verwenden sind, gehören Acetonitril, Nitromethan, Aceton, Benzol, Tetrahydrofuran oder Dichlormethan. Unter ihnen sind Benzol, Dichlormethan und Tetrahydrofuran bevorzugte Lösungsmittel. In der vorliegenden Erfindung wird ein Trocknungsmittel verwendet, zum Beispiel Drierite oder Molekularsieb 4 Å.
Die resultierenden Verbindungen (2) und (3) werden getrennt und nach einem üblichen Verfahren wie einer Säulenchromatographie gereinigt.
Die Verbindungen werden dann hydrolysiert, um ihre Methoxycarbonyl- Gruppen in Natriumcarboxyl-Gruppen umzuwandeln und ihre Acetyl- Gruppen in Wasserstoff-Gruppen umzuwandeln, wobei sie die Verbindungen (4) und (5) ergeben. Diese Hydrolyse wird im wesentlichen nach einem üblichen Verfahren durchgeführt. Zum Beispiel wird die Hydrolyse bei etwa 15 bis 25ºC etwa 5 bis 15 Stunden lang durchgeführt, indem man die Verbindungen mit einer alkalischen Lösung bei einer Konzentration von etwa 1 bis 3 n behandelt.
Die vorliegende Verbindung kann oral verabfolgt werden. Es ist jedoch bevorzugt, daß die Verbindung durch Augenapplikation, durch Inhalation, durch intramuskuläre Injektion, durch subkutane Injektion oder durch intravenöse Injektion verabfolgt wird. Die Verabfolgungsmenge variiert in Abhängigkeit vom Ausmaß einer Krankheit und dem Gewicht eines Patienten. Es ist jedoch bevorzugt, daß die Menge 0,001 bis 10 mg beträgt.

Beispiel:

Die vorliegende Erfindung wird durch Bezugnahme auf die Beispiele genauer beschrieben.

Beispiel 1

Synthese von Methyl-5-Acetamid-4,7,8,9-Tetra-O-Acetyl- 2-O-Acetyl-2-O-(5-Cholesten-3-beta-yl)-3,5-Dideoxy-alpha- D-Glycero-D-Galacto-2-Nonulopyranosinat.

0,77 g Cholesterin (2 m mol), die vorher vollständig getrocknet worden waren, wurden in 10 ml eines Lösemittels wie getrocknetem Methylenchlorid gelöst. Nachdem 0,5 g Molecularsieb 4 Å, die vorher unter Vakuum bei hoher Temperatur getrocknet worden waren, zu der Cholesterin-Lösung zugegeben waren, wurde die sich ergebende Mischung 30 Minuten bis eine Stunde lang bei Raumtemperatur in einer Argon-Strömung gerührt. Zu dieser Mischung wurden 1,02 g (2 m mol) der Verbindung (1) hinzugefügt und dann wurden 2 bis 2,4 m mol Silbertrifluormethansulfonat hinzugefügt. Dann wurde die sich ergebende Mischung eine Nacht lang bei Raumtemperatur unter geneigtem Licht gerührt, um die Reaktion durchzuführen.
Die Reaktions-Lösung wurde mittels Celite filtriert. Das Silbersalz wurde mittels gesättigter Salzlösung entfernt. Die Mischung wurde mittels wasserfreiem Natriumsulfat etc. getrocknet. Dann wurde das Lösemittel durch Vakuum abdestilliert, um einen weißen Feststoff zu erzeugen.
Der weiße Feststoff wurde einer Säulenchromatographie (Silicagel) unterworfen, um die Verbindungen (2) und (3) zu trennen und sie zu reinigen. Es wurden 0,56 g (33%) der Verbindung (2) und 0,55 g (32%) der Verbindung (3) erhalten.
Physikalische Eigenschaften der Verbindung (2):
Masse (EI) m/z 860 (M+1) , 800 (M-59)
Elementaranalyse (%) C&sub4;&sub7;H&sub7;&sub3;O&sub1;&sub3;N
Berechnet C = 65,63, H = 8,55, N = 1,63
Gefunden C = 65,41, H = 8,61, N = 1,60
[α]d25 -23,8º (C = 1, Chloroform)
Schmp. 113-115ºC
IR ν film/max 3250, 2940, 1745, 1660 and 1540 cm&supmin;¹
¹H NMR CDCl&sub3; δ (TMS) 400 MHz
0,669 3H, s, CH&sub3;-18
0,985 3H, s, CH&sub3;-19
1,883 3H, s, NAc
2,026, 2,031, 2,126, 2,145, 3H · 4, s · 4, OAc · 4
2,596 1H, dd, J = 5,2, 12,8 Hz, 2'Heq
3,650 1H, m, H-3
3,790 3H, s, COOMe
4,02-4,09 2H, m, H-4', H-5'
4,166 1H, dd, J = 5,8, 12,5 Hz, Ha-8'
4,347 1H, dd, J = 2,5, 12,8 Hz, Hb-8'
4,854 1H, ddd, J = 5,2, 9,8, 12,0 Hz, H-3'
5,205 1H, d, J = 10,1 Hz, NH
5,33-5,37 2H, m, H-6', 7'
Physikalische Eigenschaften der Verbindung (3):
Masse (EI) m/z 860 (M+1), 800 (M-59)
Elementaranalyse (%) C&sub4;&sub7;H&sub7;&sub3;O&sub1;&sub3;N
Berechnet C = 65,63, H = 8,55, N = 1,63
Gefunden C = 65,89, H = 8,58, N = 1,66
[α]D25 -40,2º (C = 1, Chloroform)
Schmp. 138-140ºC
IR ν film/max 3420, 3250, 2930, 1740, 1660 and 1540 cm&supmin;¹
¹H NMR CDCl&sub3; δ (TMS) 400 MHz
0,670 3H, s, CH&sub3;-18
0,999 3H, s, CH&sub3;-19
1,871 3H, s, NAc
2,021, 2,021, 2,077, 2,130, 3H · 4, s · 3, OAc · 4
2,525 1H, dd, J = 4,9, 13,1 Hz, Heq-2'
3,572 1H, m, H-3
3,798 3H, s, COOCH&sub3;
4,04-4,13 2H, m, H-4', 5'
4,146 1H, dd, J = 7,6, 12,5 Hz, Ha-8'
4,888 1H, dd, J = 1,8, 12,5 Hz, Hb-8'
5,07 1H, tt, J = 2,0, 8,2 Hz, H-7'
5,22- 5,27 1H, m, H-3'
5,34- 5,38 2H, m, NH, H-6'

Beispiel 2

Synthese von 5-Acetamid-2-O-(5-Cholesten-3-beta-yl)- 3,5-Dideoxy-alpha-D-Glycero-D-Galacto-2-Nonulopyranosinsäure

Die in Beispiel 1 erhaltene Verbindung (2) wurde in 2 ml Methanol gelöst. 3 ml einer wäßrigen 1 n-Natriumhydroxid-Lösung wurden zu der Lösung zugegeben, die dann eine Nacht lang bei Raumtemperatur gerührt wurde. Nachdem 2 ml Wasser zu der sich ergebenden Lösung hinzugefügt waren, wurde die Lösung mit Dowex 50 (H&spplus;) neutralisiert, eine kleine Menge des Niederschlags wurde abfiltriert, und das Filtrat wurde unter Vakuum getrocknet, um 31,4 mg (79,7%) der Verbindung (4) (weißes Pulver) zu erzeugen.
30,0 mg (76,1%) der Verbindung (5) wurden aus der Verbindung (3) in gleicher Weise wie oben erhalten.
Physikalische Eigenschaften der Verbindung (4):
IR ν KBr/max 2750, 1570 cm&supmin;¹
¹H NMR CDCl&sub3; δ (TMS) 90 MHz
0,71 3H, s, CH&sub3;-18
0,84 and 0,91 6H, CH&sub3;-26 and CH&sub3;-27
0,95 3H, d, J = 4,5 Hz, CH&sub3;-21
1,00 3H, s, CH&sub3;-19
2,01 3H, s, NAc
2,43 1H, dd, J = 4,5 and 12,6 Hz, 3-Heg
[α]D22 -12,58º (C = 0,41, in methanol)
Physikalische Eigenschaften der Verbindung (5):
IR ν KBr/max 2870, 1620 and 1550 cm&supmin;¹
¹H NMR CD&sub3;OD δ (TMS) 90 MHz
0,71 3H, s, CH&sub3;-18
0,86 and 0,92 6H, CH&sub3;-26 and CH&sub3;-27
0,95 3H, d, J = 4,5 Hz, CH&sub3;-21
1,00 3H, s, CH&sub3;-19
2,00 3H, s, NAc
2,39 1H, dd, J = 4,5 and 12,6 Hz, 3-Heq
[α]D20 -31,77º (C = 0,78, in methanol)

Beispiel 3

50 mg der Verbindung (2), nämlich Methyl-5-acetamide -4,7,8,9-tetra-O-acetyl-2-O-(5-cholesten-3-beta-yl)-3,5- dideoxy-alpha-D-glycero-D-galacto-2-nonulopyranosinat, wurden in 100 ml Methanol gelöst. Zu dieser Lösung wurden etwa 20 ml einer wäßrigen 2 n Natriumhydroxid-Lösung unter Rühren zugetropft, um eine Natriumhydroxid-Methanol-Lösung von etwa 0,2 n zu erzeugen, die dann eine Nacht lang bei Raumtemperatur gerührt wurde, um die Verbindung zu verseifen.
Als nächstes wurde Dowex 50 W (H&spplus;)-Harz unter Rühren zu der sich ergebenden Lösung hinzugefügt. Nachdem der pH der Lösung sauer eingestellt war, (etwa pH 4), wurde das Harz entfernt. Dann wurde die Lösung unter Vakuum getrocknet, um weißes, pulvriges 5-Acetamid-2-O-acetyl-(5-cholesten-3-beta-yl)-3,5-dideoxy-alpha-D- glycero-D-galacto-2-nonulopyranosin-Säure zu erzeugen. Dieses Pulver wurde in einer wäßrigen 0,02 n Natriumhydroxid-Lösung gelöst. Die sich ergebende Lösung ließ man eine Dianon HP 20- Harz-Säulenchromatographie durchlaufen, um eine Adsorption an dem Harz zu verursachen, das dann mit Wasser gewaschen wurde. Dann, nachdem mit einer wäßrigen 75%igen Methanol-Lösung die Elution durchgeführt war, wurde das Methanol abdestilliert und eine Gefriertrocknung durchgeführt, um 37 mg (91%) von weißem, pulvrigem Natrium 5-acitoamid-2-O-(5-cholesten-3-yl)-3,5-dideoxyalpha-D-glycero-D-galacto-2-nonulopyranosinat (die Verbindung (4)) zu erzeugen. Die physikalischen Eigenschaften der Verbindung (4) waren im wesentlichen die gleichen wie die von Beispiel 2.

Beispiel 4

50 mg der Verbindung (2) wurden in 100 ml Methanol gelöst, wozu 20 ml einer wäßrigen 2 n Natriumhydroxid-Lösung hinzugefügt wurden. Die sich ergebende Lösung wurde eine Nacht lang bei Raumtemperatur gerührt, um Verseifung zu verursachen. Nachdem Dowex 50 W (H&spplus;) zu der Lösung hinzugegeben war und die Mischung gerührt war, wurde der pH der Mischung auf 7 bis 8 eingestellt. Die Mischung wurde einer Saugfiltration unterworfen, gefolgt von Waschen mit Methanol, um das Harz zu entfernen. Das Filtrat und das Waschmethanol wurden gesammelt, und das Methanol wurde abdestilliert. Das abgeschiedene, weiße, nicht lösliche Material wurde filtriert und dann dem Gefriertrocknen unterworfen, um 39 mg (96%) weißes Pulver (die Verbindung (4) zu ergeben.
Physikalische Eigenschaften der Verbindung (4):
Masse (FD) m/z 722 (M+Na), 700 (M+1), 386, 336 und 314
Elementaranalyse (%) C&sub3;&sub8;H&sub6;&sub2;O&sub9;NNa·2H&sub2;O
Berechnet C : 61,96, H : 8,42, N : 1,90
Gefunden C : 61,92, H : 8,71, N : 2,04
[α]D24 +2.2º (C = 1,0, Methanol)
IR ν KBr/max 3250, 2940 und 1605 cm&supmin;¹
¹H NMR CD&sub3;OD δ (TMS) 400 MHz
0,704 3H, s, CH&sub3;-18
0,870 and 0,885 3H · 2, d, J = 1,7 Hz, CH&sub3;-26, CH&sub3;-2
0,936 3H, d, J = 6,5 Hz, CH&sub3;-21
0,992 3H, s, CH&sub3;-19
2.010 3H, s, NAc
2,839 1H, dd, J = 4,2 and 12,0 Hz, 2'-Heq
5,332 1H, d, J = 5,5 Hz, 6-H
¹³C NMR CD&sub3;OD δ (TMS) 100 MHz
175,91 NAc,
175,26 1'-COONa
142,87 C-5
122,59 C-6
102,57 C-1'
70,50 C-3
41,00 C-2

Beispiel 5

Beispiel 3 wurde wiederholt, außer daß die Verbindung (3) nämlich Methyl-5-acetamid-4,7,8,9-tetra-O-acetyl-2-O-5(5- cholesten-3-beta-yl)-3,5-dideoxy-beta-D-glycero-D-galacto-2- nonulopyranosinat anstelle der Verbindung (2) verwendet wurde, um 36 mg (88%) der Verbindung (5), nämlich Natrium-5-acetamid-2- O-(5-cholesten-3-beta-yl)-3,5-dideoxy-beta-D-glycero-D-galacto-2- nonulopyranosinat, zu erzeugen. Die physikalischen Eigenschaften der Verbindung (5) waren im wesentlichen die gleichen wie die von Beispiel 2.

Beispiel 6

Beispiel 4 wurde wiederholt, außer das die Verbindung (3) anstelle der Verbindung (2) verwendet wurde, um die Verbindung (5) (40 mg, 98%) zu erzeugen.
Physikalische Eigenschaften der Verbindung (5):
Masse (FD) m/z 722 (M+Na), 700 (M+1) und 386
Elementaranalyse (%) C&sub3;&sub8;H&sub6;&sub2;O&sub9;NNa·H&sub2;O
Berechnet C : 63,52, H : 8,91, N : 1,95
Gefunden C : 63,81, H : 9,25, N : 2,13
[α]D24 -10.6º (C = 1,0, Methanol)
IR ν KBr/max 3270, 2950 und 1608 cm&supmin;¹
¹H NMR CD&sub3;OD δ (TMS) 400 MHz
0,700 3H, s, CH&sub3;-18
0,861 und 0,880 3H · 2, d, J = 1,5 Hz, CH&sub3;-26, CH&sub3;-27
0,928 3H, d, J = 6,5 Hz, CH&sub3;-21
0,991 3H, s, CH&sub3;-19
1,972 3H, s, NAc
2,482 1H, dd, J = 4,5 und 13,0 Hz, 2'-Heq
5,282 1H, d, J = 5,3 Hz, 6-H
¹³C NMR CD&sub3;OD δ (TMS) 100 MHz
176,95 NAc,
174,51 1'-COONa
143,08 C-5
122,46 C-6
101,37 C-1'
72,37 C-3
43,82 C-2'

Beispiel 7

50 mg der Verbindung (2) wurden in 100 ml wasserfreiem Methanol gelöst. Zu dieser Lösung wurden 0,02 ml einer 28%igen Natriummethylat-Lösung hinzugefügt, und dann wurde die sich ergebende Lösung etwa l Stunde lang bei Raumtemperatur gerührt, um Deacetylierung zu verursachen. Dann wurde zu der sich ergebenden Lösung Dowex 50 W·8 (H&spplus;)-Harz hinzugefügt und die Lösung gerührt und neutralisiert. Die Lösung wurde durch Absaugen filtriert und ein Waschen mit Methanol durchgeführt, um das Harz zu entfernen. Das Filtrat und das Waschmethanol wurden gesammelt, und dann wurden 20 ml einer wäßrigen 2 n Natriumhydroxid-Lösung zu der Lösung hinzugefügt, die dann eine Nacht lang bei Raumtemperatur gerührt wurde, um Verseifung zu verursachen. Zu der verseiften Lösung wurde Amberlite IRC-50 (H&spplus;)-Harz hinzugefügt. Die sich ergebende Lösung wurde gerührt und ihr pH wurde auf 5 bis 7 eingestellt. Die Lösung wurde einer Saugfiltration unterworfen, gefolgt von Waschen mit Methanol, um das Harz zu entfernen. Das Filtrat und das Waschmethanol wurden gesammelt und der Vakuum-Trocknung unterworfen, um das Methanol abzudestillieren. Eine kleine Menge des abgeschiedenen, weißen, nicht löslichen Materials wurde abfiltriert und dem Gefriertrocknen unterworfen, um 38 mg (93%) eines weißen Pulvers (die Verbindung (4)) zu ergeben. Die physikalischen Eigenschaften der Verbindung waren im wesentlichen die gleichen wie die von Beispiel 2.

Beispiel 8

Beispiel 7 wurde wiederholt, außer das die Verbindung (3) anstelle der Verbindung (2) verwendet wurde, um 35 mg (86%) der Verbindung (5) zu erzeugen. Die physikalischen Eigenschaften der Verbindung waren im wesentlichen die gleichen wie die von Beispiel 2.

Beispiel 9 Injektions-Zusammensetzung

In eine Ampulle wurden 2,5 mg der vorliegenden Verbindung, 0,25 mg Natrium-dihydrogenphosphat-dihydrat, 3 mg Dinatrium-hydrogenphosphat. 12 Wasser und destilliertes Wasser zur Injektion eingeführt, um eine Injektions-Zusammensetzung mit einer Gesamtmenge von 1 ml zu erzeugen.

Beispiel 10 Vor Verwendung aufzulösende Injektions-Zusammensetzung

Eine Injektions-Zusammensetzung, die hergestellt worden war durch Mischen von 0,5 mg der vorliegenden Verbindung mit 1 ml physiologischer Kochsalzlösung und anschließendes Gefriertrocknen, wurde in eine Ampulle eingeführt und 1 ml destilliertes Wasser zur Injektion wurde zu der Ampulle zugefügt, um die Injektions-Zusammensetzung zu lösen.

Beispiel 11 Zusammensetzung für Augenapplikation

In eine Ampulle wurden 1 mg der vorliegenden Verbindung, 52,5 mg Borsäure, 14,5 mg Borax, eine geeignete Menge Benzalkoniumchlorid und eine löslich machende Lösung für Augenapplikation eingeführt, um eine Augenapplikations- Zusammensetzung mit einer Gesamtmenge von 5 ml zu erzeugen.

Beispiel 12 Inhalationszusammensetzung

Die vorliegende Erfindung wurde in einem Achatmörser gut pulverisiert zu einem feinen Pulver mit einem Durchmesser von 1 bis 20 Micrometer. Zu dem Pulver wurde Laktose hinzugefügt und pulverisiert und miteinander vermischt. Weiterhin wurde zu der Mischung nach und nach Laktose hinzugefügt, und sie wurden fein pulverisiert und miteinander gut vermischt, um eine 20 bis 40- Verreibung herzustellen. 20 bis 40 mg des Pulvers wurden in eine Kapsel eingeführt oder durch ein Pulverpapier mittels eines üblichen Verfahrens gefaltet. Die Kapsel wurde für ein Pulver-Aerosol verwendet. Das gefaltete Pulver wurde für ein Flüssig-Aerosol verwendet.
Experimente zur Bestätigung der Aktivität der vorliegenden Verbindung für die Förderung der Vermehrung von Neuriten werden unten erklärt.

Experiment 1

Wirkung auf das Wachstum von Neuroblastomzellen, Neuro 2a-Stamm.
Neuro 2a wurde flotiert auf einem Kulturmedium, das bestand aus 90% Dulbecco's modifiziertem Eagle's Medium und 10% fötalem Kälberserum (FCS) und das 100 Einheiten/ml Penicillin G und 100 Micro g/ml Streptomycinsulfat enthielt, und dann kultiviert bei 37ºC in einem Kohlendioxid-Inkubator, der Luft enthielt, in die 5% Kohlendioxid inkorporiert war. Das verwendete Gefäß war eine Polystyrol-Schale mit einem Durchmesser von 60 mm. 1 bis 2 · 10&sup4; der Neuroplastom-Zellen wurden in jede Schale eingeimpft und 48 Stunden lang kultiviert. Die FCS enthaltende Kultur wurde von der resultierenden Zellkultur entfernt. Zu der Kultur, die nicht das FCS enthielt (diese Kultur enthielt 100% MEM, und die Konzentrationen der Antibiotika waren die gleichen wie die der Kultur vor dem Entfernen des FCS) wurden als Testproben hinzugefügt die Verbindung (4) (Tabelle 1), die Verbindung (5) (Tabelle 2), Gal (beta 1-3) GalNac (beta 1-4) < NAcNeu-(alpha 2- 3)> < Gal (beta 1-4) Glc (beta 1-1)-Ceramid (im Folgenden als GM bezeichnet) (Tabelle 3) und < NAcNeu (alpha 2-8) NAcNeu (alpha 2-3) > Gal (beta 1-3) GalNAc (beta 1-4)- NAcNeu (alpha 2-8) < NAcNeu- (alpha 2-3)> -Gal (beta 1-4) Glc (beta 1-1)- Ceramid (im Folgenden GQ1b bezeichnet) (Tabelle 4), jeweils in vorgeschriebenen Mengen, und die Kultivierung wurde fortgeführt. Wenn nach der Zugabe dieser Medikamente 24 und 48 Stunden vergangen waren, stieg die Zahl der lebenden Zellen in der Kultur an, die Zahl der Neuriten stieg an, und die Länge der Neuriten wurde gemessen. Das Experiment wurde auf drei Schalen im Hinblick auf jede Konzentration durchgeführt. Die sich ergebenden Daten wurden ausgedrückt durch Mittelwert plus Standardfehler (S.E.).

Ergebnisse:

Die minimal wirksamen Konzentrationen der Verbindung (4), GM&sub1; und GQ1b in 48 Stunden, nachdem diese Medikamente zu der Kultur zugegeben wurden, waren jeweils 10 ng/ml, 10 Mikro g/ml und 10 Mikro g/ml. Unter Berücksichtigung der Molekulargewichte dieser Materialien ist die Aktivität der Verbindung (4) 420 mal so hoch wie die von GM&sub1; und 270 mal so hoch wie die von GQ1b. Die minimal wirksame Konzentration der Verbindung (5) ist 100 ng/ml in 48 Stunden nach der Zugabe des Medikaments, und die Aktivität der Verbindung (5) ist 42 mal so hoch wie die von GM&sub1; und 27 mal so hoch wie die von GQ1b.
Weiterhin liefern GM&sub1; und GQ1b keinerlei Aktivität, wenn die Kultivierung 24 Stunden durchgeführt wurde. Die Verbindungen (4) und (5) jedoch zeigten Aktivität, wenn die Kultivierung 24 Stunden lang durchgeführt wurde unter Verwendung dieser Verbindungen in einer Menge von 10 ng/ml. Diese Ergebnisse zeigen klar, daß die Verbindungen (4) und (5) eine starke Aktivität für die Vermehrung der Neuriten haben.

Test auf akute Toxizität.

Der Test auf akute Toxizität wurde durchgeführt durch intravenöses Injizieren der Verbindungen in 45 Wochen alte männliche ddy Mäuse. Die Ergebnisse zeigen, daß die LD&sub5;&sub0; der Verbindungen (4) und (5) 93 mg/kg bzw. 291 mg/kg sind. Tabelle 1 Probe Gesamt-Zahl Zellen Zahl der Zellen mit Neuritenwachstum Ausmaß des Neurite Wachstums % Länge der Neurite Zahl der Neurite Kontrolle Verbindung U.C.: unmeßbar *p< 0,001, **p< 0,01, ***p< 0,05 Tabelle 2 Probe Gesamt-Zahl Zellen Zahl der Zellen mit Neuritenwachstum Ausmaß des Neurite Wachstums % Länge der Neurite Zahl der Neurite Kontrolle Verbindung U.C.: unmeßbar *p< 0,001, **p< 0,01, ***p< 0,05 Tabelle 3 Probe Gesamt-Zahl Zellen Zahl der Zellen mit Neuritenwachstum Ausmaß des Neurite Wachstums % Länge der Neurite Zahl der Neurite KONTROLLE ***p< 0,05 Tabelle 4 Probe Gesamt-Zahl Zellen Zahl der Zellen mit Neuritenwachstum Ausmaß des Neurite Wachstums % Länge der Neurite Zahl der Neurite KONTROLLE U.C.: unmeßbar ***p< 0,01

Industrielle Anwendbarkeit:

Das vorliegende Sialosylcholesterin ist insbesondere als Neuropathie- Heilmittel von Nutzen.

Claims

1. Sialosylcholesterin mit der folgenden allgemeinen Formel (4) oder (5):

worin Ac eine Acetylgruppe ist.

2. Verfahren zur Herstellung von Sialosylcholesterin mit der folgenden allgemeinen Formel (B):

worin eines von R³ und R&sup4; -COONa ist und das andere die folgende Formel hat:

aufweisend das Zur-Reaktion-Bringen einer Verbindung (1) mit der folgenden Formel (1):

mit vollständig getrocknetem Cholesterin in Gegenwart eines Koenigs-Knorr-Katalysators, zur Herstellung einer Verbindung (A) mit der folgenden Formel (A):

worin eines von R¹ und R² -COOCH&sub3; ist und das andere eine Gruppe mit der folgenden Formel ist:

und dann das Hydrolysieren der Verbindung (A).

3. Verfahren nach Anspruch 2, bei dem der Koenigs-Knorr- Katalysator ausgewählt ist aus einer Gruppe, die besteht aus Quecksilberbromid, Quecksilbercyanid, Silberperchlorat, Silbertrifluormethansulfonat und Silbertrifluoracetat.

4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, bei dem die Reaktion zwischen der Verbindung (1) und Cholesterin bei etwa 20 bis 25ºC unter normalem Druck etwa 1 bis 7 Tage lang durchgeführt wird.

5. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 2 bis 4, bei dem das Cholesterin in einer Menge von etwa 1 bis 5 Molen pro einem Mol der Verbindung (1) verwendet wird.

6. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 2 bis 5, bei dem der Königs-Knorr-Katalysator in einer Menge von etwa 1,0 bis 1,2 Äquivalenten pro einem Äquivalent der Verbindung (1) verwendet wird.

7. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 2 bis 6, bei dem ein Lösungsmittel verwendet wird, wobei das Lösungsmittel ausgewählt ist aus einer Gruppe, die besteht aus Benzol, Dichlormethan und Tetrahydrofuran.

8. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 2 bis 7, bei dem die Verbindung (A) mit einer etwa 1 bis 3 n alkalischen Lösung bei etwa 15 bis 25ºC etwa 5 bis 15 Stunden lang behandelt wird, um ihre Hydrolyse durchzuführen.

9. Sialosylcholesterin (4) oder (5) mit der folgenden allgemeinen Formel:

worin Ac eine Acetylgruppe ist, zur Verwendung als eine Neuropathien bekämpfende therapeutische Substanz.

10. Neuropathien bekämpfendes Medikament, aufweisend Sialosylcholesterin (4) oder (5) mit der allgemeinen Formel wie in Anspruch 9 beansprucht, wobei das Medikament in der Form einer Augenapplikation, einer Inhalationsapplikation, einer intravenösen Injektion, einer intramuskulären Injektion oder einer subcutanen Injektion ist.