DK170648B1

DK170648B1 - Sialosylcholesterol, fremgangsmåde til fremstilling heraf og neuropatimiddel omfattende samme

Info

Publication number: DK170648B1
Application number: DK012388A
Authority: DK
Inventors: Haruo Ogura; Kimio Furuhata; Shingo Sato; Masayoshi Ito; Yoshiyasu Shitori; Yoshitaka Nagai
Original assignee: Kanto Ishi Pharma Co Ltd
Priority date: 1986-05-12
Filing date: 1988-01-12
Publication date: 1995-11-20
Also published as: FI880103A; DK12388D0; DE3787437T2; FI91071C; HUT46039A; WO1987006936A1; FI880103A0; AU594468B2; DE3787437D1; EP0267297A1; DK12388A; HU198216B; FI91071B; AU7394387A; US5023239A; US5126330A; EP0267297A4; EP0267297B1; CA1324603C

Description

i DK 170648 B1

Opfindelsen angår hidtil ukendt sialosylcholesterol, der er anvendeligt som middel til helbredelse af forskellige sygdomme hidrørende fra skader på de perifere og centrale nerver, en fremgangsmåde til fremstilling af sialosyl-5 cholesterol samt neuropatimiddel indeholdende forbindelsen.

Hidtil har det været velkendt inden for fagområdet, at sialinsyre er til stede i mange dyrelegemer og på celleoverfladen af adskillige bakterier som et sialiniseret 10 molekylkompleks, som f.eks. glycoprotein, glycolipid, oligosaccharid eller polysaccharid.

På det seneste er denne forbindelse blevet tillagt medicinsk og farmaceutisk betydning for nervefunktionen, 15 kræft, betændelse, immunitet, virusinfektion, differenti ering, hormonreceptor og andet. Desuden har der været rettet stor opmærksomhed mod denne forbindelse som et særligt aktivt stof, der er til stede på celleoverfladen. Sialinsyrens rolle i det sialiniserede molekylkompleks er 20 dog endnu ikke blevet fastlagt.

Forbindelsen er endvidere blevet studeret af mange naturorganiske kemikere, og mange typer derivater deraf er blevet fremstillet. Dog er der hidtil ikke blevet fremstillet 25 derivater med nogen bemærkelsesværdig fysiologisk aktivi tet.

Menneskets gennemsnitlige levetid er blevet stærkt forlænget ved forskellige forbedringer af medicinsk behandling af 30 ondartede svulster i hæmatopoietiske organer, mange typer kræft og kollagensygdomme. Disse forbedringer har dog uundgåeligt øget anvendelsen af mediciner, såsom adrenal-corticalhormon, immunsuppresseringsmiddel, o.s.v. Derved er der fremkommet et antal uønskede bivirkninger, såsom fald 35 i immuniseringsevnen.

Opfinderne har udvist særlig interesse for sialinsyre, som er en naturlig biologisk bestanddel, og har udført intensi- 2 DK 170648 B1 ve undersøgelser af et immunstyrende middel, der tilnærmelsesvis ingen bivirkninger har, og som styrer aktiviteten for immuniseringsovervågningen ved hjælp af kemisk modificering af sialinsyren. Som et resultat heraf har 5 opfinderne fremstillet sialosylcholesterol, der er an vendeligt som et neuropatimiddel. Dette bygger på erkendelsen af, at den foreliggende sialosylcholesterol fremmer 1 vækst af neuriter i neuroblastceller, der stammer fra mus (Neuro 2a) , når sialosylcholesterolens aktivitet undersøges 10 ved at sætte den til kulturer af Neuro 2a. Denne vækstfrem- ning er større end den, der opnås med en tilsvarende methylesterforbindelse, jf. efterfølgende sammenlignende afprøvningseksempel.

15 Formålet med den foreliggende opfindelse er at tilvejebrin ge en hidtil ukendt sialosylcholesterol.

Et andet formål med opfindelsen er at tilvejebringe en ny fremgangsmåde til fremstilling af sialosylcholesterol.

20

Et yderligere formål med den foreliggende opfindelse er at tilvejebringe et hidtil ukendt neuropatimiddel.

Da den foreliggende sialosylcholesterol er til stede i en 25 Na-saltform, har cholesterolen en udmærket vandopløselig- hed, hvilket gør anvendeligheden af cholesterolen bredere.

Den foreliggende opfindelse angår en hidtil ukendt forbindelse med den almene formel (4) : ♦ ' :.!:j -:i#| 3 DK 170648 B1 H J C C H , H a C ^CK,

5 H,C f T

3 HO OH COOiN'a - 'ST^o'fo-(4)

Ac u\L<r^^J

Oli 10 eller med formlen (5): ch3

η 5 C H J

15 ✓νΛ h3c HO OH O-L JL· .

uy i (5) 20 0'"/VC00Na HO / /

OH

hvor Ac betegner en acetylgruppe.

25

Den foreliggende opfindelse angår også en fremgangsmåde til fremstilling af forbindelsen (4) eller (5), hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved at en forbindelse med den almene formel (1): 30

AcO OAc C£ / / 0 / COOCH, ...

AcO / / (1)

AcKNj^^^/ 3 5 ' JD OAc hvor Ac betegner en acetylgruppe, omsættes med cholesterol til fremstilling-af en forbindelse med den almene formel (2) : 4 DK 170648 B1 H >c c H 3 K,c ^^ck,

5 H' C

A = ^ O Ac COOCHa ^

../τ'·'/·—CO

lcK\Of\V

io 0Ac hvor Ac tetegner en acetylgruppe, eller formlen (3): K,C\^\,Sy/Nv^ CK, 15 K3C ^\ςκ3

H3C

AcO 0 A c 0-L JL· 20 ^ / / G""^ /''COOCHa

AcO / / O Ac 25 hvor Ac betegner en acetylgruppe, og en efterfølgende hydrolysering af forbindelsen (2) eller (3).

Endvidere angår opfindelsen et neuropatimiddel, hvilket middel indeholder forbindelsen (4) eller (5).

30

Den foreliggende opfindelse beskrives i detaljer nedenfor.

v

Fremgangsmåden til fremstilling af forbindelsen (4) eller (5) kan illustreres ved følgende skema: DK 170648 B1 Λ O 5 λ.

* (Λ « η n >t * Ο

= = r-l W

U «J O PI o >1

5 G O

£ \ / ,§ ~ y % V \ o O / \ / \ tøffe n O -f J? h = tt ==° o i—i y ό

OG § C

S—c ci—»J-3 !q r7i · w1 ^ o-J c“ ji -=^ g <=:-= ^ . «s t_t η n 0 O _n „ nj V/ “ “ ~ ~ S / ^ \/ o o " > i { < V 5 U / m > 1 sH ? Μ ν/Ί « \ )~\ 1 i 2T~\ ΛΛ 1 \—/ * \a y = V_^ \ o ' ( ^ \ / Sj

§ ^ rH i I

«I g O % § S

ϋ T ®--J* | °/g o / S o 7 is 'G __ /** <3-^'§1 g =1 oi '=1 < ^ = A< =C A < *T sl DK 170648 B1 e

Forbindelsen (1), der skal anvendes ifølge den foreliggende opfindelse, er en kendt forbindelse og er almindeligt tilgængelig.

5 I den ovenfor viste reaktion omsættes forbindelsen (1) med cholesterol i nærvær af en Koenigs-Knorr-katalysator ved ca. 20-25°C under normalt tryk i ca. 1-7 dage. I dette * tilfælde reagerer cholesterol med forbindelsen (1) ved et molforhold på ca. 1-5 mol cholesterol pr. mol af for-10 bindeisen (1).

Katalysatoren kan være kviksølvbromid, kviksølvcyanid, sølvperchlorat, sølvtrifluormethansulfonat, sølvtrifluora-cetat og andre. Katalysatoren anvendes i en mængde på ca.

15 1,0-1,2 ækvivalent pr. ækvivalent af forbindelsen (1).

Opløsningsmidler til anvendelse ifølge den foreliggende opfindelse omfatter acetonitril, nitromethan, acetone, benzen, tetrahydrofuran, dichlormethan og andre. Blandt 20 disse er benzen, dichlormethan og tetrahydrofuran fore trukne opløsningsmidler. Ifølge den foreliggende opfindelse kan der anvendes et tørremiddel, f.eks. Drierite- eller en 4 Å molekylsigte.

25 De fremkomne forbindelser (2) og (3) fraskilles og renses på kendt måde, såsom ved søjlechromatografi.

Derefter hydrolyseres forbindelserne for at omdanne deres methoxycarbonylgrupper til natriumcarboxylgrupper og 30 omdanne deres acetylgrupper til hydrogengrupper. Ved denne hydrolyse kan forbindelserne (4) og (5) fremstilles. Denne hydrolyse udføres generelt på kendt måde. F.eks. udføres hydrolysen ved ca. 15-25’c i ca. 5-15 timer ved at behandle forbindelserne med en alkalisk opløsning med en koncentra-35 tion på ca. 1-3 N.

Den foreliggende forbindelse kan indgives oralt. Dog foretrækkes det, at forbindelsen gives ved øjenapplikation, 7 DK 170648 B1 ved inhalering, ved intramuskulær injektion, ved subcutan injektion eller ved intravenøs injektion. Indgivelsesmængden varierer afhængig af sygdomsgraden og patientens vægt. Det foretrækkes dog, at mængden er på mellem 0,001 og 10 5 mg.

Eksempler

Den foreliggende opfindelse vil i det følgende blive belyst 10 nærmere i forbindelse med nedenstående eksempler.

Eksempel 1

Syntese af methyl-5-acetamid-4,7,8,9-tetra-0-acetyl-2-0-15 acetyl-2-0-(5-cholesten-3-beta-yl) -3,5-dideoxy-alfa-D- glycero-D-galacto-2-nonulopyranosonat.

0,77 g Cholesterol (2 mmol), som forud var blevet fuld-20 stændigt tørret, blev opløst i 10 ml af et opløsnings middel, såsom tørret methylenchlorid. Efter at 0,5 g 4 Å molekylsigte, der forud var blevet tørret under vacuum ved høj temperatur, var sat til cholesterolopløsningen, blev den fremkomne blanding omrørt i h-1 time ved stuetemperatur 25 i en argonstrøm. Til denne blanding sattes 1,02 g (2 mmol) af forbindelsen (1), og derefter blev 2-2,4 mmol sølvtri-fluormethansulfonat tilsat. Derpå blev den fremkomne blanding omrørt natten over ved stuetemperatur under afbøj et lys for at udføre reaktionen.

30

Reaktionsopløsningen blev filtreret med Celite. Sølvsaltet blev fjernet med en mættet saltopløsning. Blandingen blev tørret med vandfrit natriumsulfat. Derefter blev opløsningsmidlet afdestilleret under vacuum under dannelse af et 35 hvidt fast stof.

Det hvide faste stof blev underkastet søjlechromatografi (silicagel) for at adskille forbindelserne (2) og (3) og 8 DK 170648 B1 rense dem. 0,56 g (33%) af forbindelsen (2) og 0,55 g (32%) af forbindelsen (3) opnåedes.

Fysiske egenskaber af forbindelsen (2): 5

Masse (El) m/z 860 (M+l), 800 (M-59)

Grundstof analyse (%) C^H^O^N f

Beregnet: C=65,63, H=8,55, N=l,63 10 Fundet: 0=65,41, H=8,61, N=l,60 [a]jj5 -23,80° (C=l, chloroform)

15 sm.p. 113-115°C

film , IR V Μχ 3250, 2940, 1745, 1660 og 1540 cm*1 1H NMR CDC13 S (TMS) 400 MHz 20

0,669 3H, s, CH3-18 0,985 3H, s, CH3-I9 1,883 3H, S, NAC

2,026, 2,031, 2,126, 2,145, 3H X 4, S X 4, OAc X 4 25 2,596 IH, dd, J=5,2, 12,8Hz, 2'Heg 3,650 IH, m, H-3 3,790 3H, S, COOMe 4,02 - 4,09 2H, m, H-4', H-5' 4,166 IH, dd, J=5,8, 12,5Hz, Ha-8' 30 4,347 IH, dd, J=2,5, 12,8Hz, Hb-8' 4,854 IH, ddd, J=5,2, 9,8, 12,OHz, H-3' 5,205 IH, d, J=10,1Hz, NH 5,33 - 5,37 2H, m, H-6', 7' i- 35 Fysiske egenskaber af forbindelsen (3):

Masse (El) m/z 860 (M+l), 800 (M-59)

Grundstof analyse (%) C^H^ o13n

Beregnet: C=65,63, H=8,55, N=l,63 40 Fundet: C=65,89, H=8,58, N=l,66 25 9 DK 170648 B1 [a]D -40,2° (C=l, chloroform)

5 sm.p. 138-140eC

film .

IR v max 3420, 3250, 2930, 1740, 1660 og 1540 cm'1 10 . 1H NMR CDC13 S (TMS) 400 MHz 0,670 3H, S, CH3-I8 0,999 3H, s, CH3-I9 1,871 3H, s, NAc 2,021, 2,021, 2,077, 2,130, 3H x 4, s x 3, OAc x 4 15 2,525 IH, dd, J=4,9, 13,1Hz, Heq-2' 3,572 IH, m, H-3 3,798 3H, s, COOCH3 4,04 - 4,13 2H, m, H-4', 5' 4,146 IH, dd, J=7,6, 12,5Hz, Ha-8' 20 4,888 IH, dd, J=l,8, 12,5Hz, Hb-8' 5,07 IH, tt, J=2,0, 8,2Hz, H-7' 5,22 - 5,27 IH, m, H-3' 5,34 - 5,38 2H, m, NH, H-6' 25 Eksempel 2

Syntese af 5-acetamid-2-0-(5-cholesten-3-beta-yl)-3,5-dideoxy-alfa-D-glycero-D-galacto-2-nonulopyranosonsyre.

30 Forbindelsen (2) , fremstillet ifølge eksempel 1, blev opløst i 2 ml methanol. 3 ml Af en vandig 1 N natriumhydroxidopløsning blev sat til opløsningen, der derefter blev omrørt natten over ved stuetemperatur. Efter at 2 ml vand var blevet tilsat den fremkomne opløsning, blev 35 opløsningen neutraliseret med Dowex® 50 (H+) , en lille mængde af præcipitatet blev frafiltreret, og filtratet blev tørret under vacuum til frembringelse af 31,4 mg (79,7%) af forbindelsen (4) (hvidt pulver).

40 30,0 mg (76,1%) Af forbindelsen (5) opnåedes ud fra 10 DK 170648 B1 forbindelsen (3) på samme måde, som nævnt ovenfor.

Fysiske egenskaber af forbindelsen (4): 5 +* ICBr IR V mÅ 2750, 1570 cm-1 1H NMR CDC13 δ (TMS) 90 MHz 10 0,71 3H, s, CH3-I8 0,84 og 0.91 6H, CH3-26 og CH3-27 0,95 3H, d, J=4,5 Hz, CH3-21 1.00 3H, s, CH3-I9 2.01 3H, s, NAc 15 2,43 IH, dd, J=4,5 og 12,6 Hz, 3-Heq [a]p -12,58° (C=0,41 i methanol) 20 Fysiske egenskaber af forbindelsen (5): KBr IR V ^ 2870, 1620 og 1550 cm'1 ’H NMR CD3OD δ (TMS) 90 MHz 25 0,71 3H, s, CH3-I8 0,8 6 og 0,92 6H, CH3-26 og CH3-27 0,95 3H, d, J=4,5 HZ, CH3-21 1,00 3H, s, CH3-I9

30 2,00 3H, S, NAC

2,39 IH, dd, J=4,5 og 12,6 Hz, 3-Heq 20 [a]D -31,77° (C=0,78 i methanol) 35

Eksempel 3 * 50 mg Af forbindelsen (2) , nemlig methyl-5-acetamid- 4,7,8,9-tetra-0-acetyl-2-0-(5-cholesten-3-beta-yl)-3,5-40 dideoxy-alfa-D-glycero-D-galacto-2-nonulopyranosonat,blev opløst i 100 ml methanol. Til denne opløsning sattes 11 DK 170648 B1 dråbevis ca. 20 ml af en vandig 2 N natriumhydroxidopløsning under omrøring til frembringelse af en natriumhy-droxid/methanolopløsning på ca. 0,2 N, der derefter blev omrørt natten over ved stuetemperatur for at forsæbe 5 forbindelsen.

Dernæst blev Dowex® 50 W (H+) harpiks sat til den fremkomne opløsning under omrøring. Efter at opløsningens pH var justeret til surhed (ca. pH 4) , blev harpiksen fjernet.

10 Opløsningen blev derefter tørret under vacuum til frem bringelse af et hvidt pulver, 5-acetamid-2-0-acetyl-(5-cholesten-3-beta-yl) -3,5-dideoxy-alfa-D-glycero-D-galacto- 2-nonulopyranosonsyre. Dette pulver blev opløst i en vandig 0,02 N natriumhydroxidopløsning. Den fremkomne opløsning 15 blev ledt gennem en "Dianon HP 20" harpikssøjlechromatograf for at fremkalde adsorption på harpiksen, hvilken harpiks blev vasket med vand. Efter at eluering var foretaget med en vandig 75% methanolopløsning, blev methanolen derefter afdestilleret og en frysetørring blev udført til frem-20 bringelse af 37 mg (91%) hvidt natrium-5-acetamid-2-0-(5- cholesten-3-yl)-3,5-dideoxy-alfa-D-glycero-D-galacto-2-nonulopyranosonatpulver (forbindelsen (4)). De fysiske egenskaber af forbindelsen (4) var tilnærmelsesvis de samme som angivet i eksempel 2.

25

Eksempel 4 50 mg Af forbindelsen (2) blev opløst i 100 ml methanol, hvortil der sattes 20 ml af en vandig 2N natriumhydroxidop-30 løsning. Den fremkomne opløsning blev omrørt natten over ved stuetemperatur til fremkaldelse af forsæbning. Efter at Dowex® 50 W (H+) var sat til opløsningen og blandingen var omrørt, blev blandingens pH justeret til 7-8. Blandingen blev underkastet sugefiltration efterfulgt af methanolvask 35 for at fjerne harpiksen. Filtratet og den methanolholdige vaskeopløsning blev indvundet, og methanolen blev afdestilleret. Det udfældede, hvide, uopløste materiale blev frafiltreret og derefter underkastet frysetørring til 12 DK 170648 B1 frembringelse af 39 mg (96%) hvidt pulver (forbindelse (4)).

Fysiske egenskaber af forbindelsen (4) : 5

Masse (FD) m/z 722 (M+Na), 700 (M+l), 386, 336 og 314.

>

Grundstofanalyse (%) C38H6209NNa· 2H20

Beregnet: C:61,96, H:8,42, N:l,90 10 Fundet: 0:61,92, H:8,71, N:2,04 24 [a]D +2,2° (C=l,0 i methanol) 15 KBr IR V ^ 3250, 2940 og 1605 cm'1

1H NMR CD3OD δ (TMS) 400 MHZ

20 0,704 3H, S, CH3-I8 0,870 og 0,885 3H X 2, d, J=l,7 Hz, CH3-26, CH3-27 0,936 3H, d, J=6,5 Hz, CH3-21 0,992 3H, s, CH3-I9 2,010 3H, s, NAc 25 2,839 IH, dd, J=4,2 og 12,0 Hz, 2/-Heq

5,332 IH, d, J=5,5 Hz, 6-H

13C NMR CD3OD δ (TMS) 100 MHz 30 175,91 NAc 175,26 l'-COONa 142,87 C-5 122,59 C-6 102,57 C-l' 35 70,50 C-3 41,00 C-2 r ς*

Eksempel 5 13 DK 170648 B1

Eksempel 3 blev gentaget bortset fra, at forbindelsen (3), nemlig methyl-5-acetamid-4,7,8,9-tetra-0-acetyl-2-0-(5-5 cholesten-3-beta-yl) -3,5-dideoxy-beta-D-glycero-D-galacto- 2-nonulopyranosonat blev anvendt i stedet for forbindelsen (2) til frembringelse af 36 mg (88%) af forbindelsen (5), nemlig natrium-5-acetamid-2-0-(5-cholesten-3-beta-yl)-3,5-dideoxy-beta-D-glycero-D-galacto-2-nonulpyranosonat. De 10 fysiske egenskaber af forbindelsen (5) var tilnærmelsesvis de samme som angivet i eksempel 2.

Eksempel 6 15 Eksempel 4 blev gentaget bortset fra, at forbindelsen (3) blev anvendt i stedet for forbindelsen (2) til frembringelse af forbindelsen (5) (40 mg, 98%).

Fysiske egenskaber af forbindelsen (5): 20

Masse (FD) m/z 722 (M+Na), 700 (M+l) og 386

Grundstof analyse (%) C38H6209NNa · H20 Beregnet: C:63,52, H:8,91, N:l,95 25 Fundet: C:63,81, H:9,25, N:2,13 24 [a]D -10,6° (C=l,0, methanol) 30 K3r IR V max 3270f 2950 1608 cm-1 1 H NMR CDjOD δ (TMS) 400 MHz 35 0,700 3H, s, CH3-18 0,861 og 0,880 3H x 2, d, J=l,5 Hz, CH3-26, CH3-27 0,928 3H, d, J=6,5 Hz, CH3-21 0,991 3H, S, CH3-19 40 1,972 3H, S, NAc 14 DK 170648 B1

2,482 IH, dd, J=4,5 og 13,0 Hz, 2'-Heq 5,282 IH, d, J=5,3 Hz, 6-H

13C NMR CD30D δ (TMS) 100 MHz 5

176,95 NAC

* 174,51 l'-COONa 143,08 C-5 122,46 C-6 10 101,37 C-l' 72,37 C-3 43,82 02'

Eksempel 7 15 50 mg Af forbindelsen (2) blev opløst i 100 ml vandfrit methanol. Til denne opløsning sattes 0,02 ml af en 28% natriummethylatopløsning, og derefter blev den fremkomne opløsning omrørt i ca. I time ved stuetemperatur til 20 fremkaldelse af deacetylering. Derefter blev Dowex® 50 W x 8 (H+) harpiks sat til den fremkomne opløsning, hvilken opløsning blev omrørt og neutraliseret. Opløsningen blev filtreret ved sugning, og methanolvask blev udført til fjernelse af harpiksen. Filtratet og vaskemethanolen blev 25 opsamlet, og derefter blev 20 ml af en vandig 2N natrium hydroxidopløsning sat til opløsningen, der blev omrørt natten over ved stuetemperatur til fremkaldelse af forsæbning. Der blev sat Amberiite IRC-50 (H+) harpiks til den forsæbede opløsning. Den fremkomne opløsning blev 30 omrørt, og pH værdi en blev derefter justeret til 5-7.

Opløsnigen blev underkastet sugefiltrering efterfulgt af methanolvask til fjernelse af harpiksen. Filtratet og vaskemethanolen blev samlet og underkastet vacuumtørring til afdestillering af methanolen. En lille mængde af det 35 udfældede hvide, uopløste materiale blev frafiltreret og underkastet frysetørring til frembringelse af 38 mg (93%) hvidt pulver (forbindelsen (4)). De fysiske egenskaber af forbindelsen var tilnærmelsesvis de samme som angivet i eksempel 2.

15 DK 170648 B1

Eksempel 8 5 Eksempel 7 blev gentaget bortset fra, at forbindelsen (3) blev anvendt i stedet for forbindelsen (2) til frembringelse af 35 mg (86%) af forbindelsen (5) . De fysiske egenskaber af forbindelsen var tilnærmelsesvis de samme som angivet i eksempel 2.

10

Eksempel 9 - Injektionssammensætning.

I en ampul blev der indført 2,5 mg af den foreliggende forbindelse, 0,25 mg natriumdihydrogenphosphatdihydrat, 3 15 mg dinatriumhydrogenphosphat-12-H2, og destilleret vand til injektion til frembringelse af en injektionssammensætning med et samlet omfang på 1 ml.

Eksempel 10 - Injektionssammensætning, der skal opløses før 20 anvendelse.

En injektionskomposition, der fremstilledes ved at blande 0,5 mg af den foreliggende forbindelse med 1 ml fysiologisk saltopløsning og ved derefter at underkaste blandingen 25 frysetørring, blev indført i en hætteflaske, og 1 ml destilleret vand til indsprøjtning blev tilført hætteflasken for at opløse injektionskompositionen.

Eksempel 11 - Sammensætning til øjeanvendelse.

30 I en hætteflaske blev der fyldt 1 mg af den foreliggende forbindelse, 52,5 mg borsyre, 14,5 mg borax, en tilstrækkelig mængde af benzalkoniumchlorid og en opløsende opløsning til øjenapplikation til frembringelse af en komposition til 35 øjenapplikation med et totalt omfang på 5 ml.

16 DK 170648 B1

Eksempel 12 - Inhaleringsammensætning.

Den foreliggende forbindelse blev grundigt pulveriseret i en agatmorter til fint pulver med en diameter på 1-20 5 micron. Der blev tilsat lactose til pulveret, og lactosen blev pulveriseret og blandet med pulveret. Yderligere lactose blev sat til blandingen lidt efter lidt og de blev pulveriseret til finhed og grundigt blandet med hinanden for at lave en 20-40 findeling. 20-40 mg af pulveret blev 10 fyldt i en kapsel eller foldet ind i et pulverpapir på kendt måde. Kapslen blev anvendt til pulverformig aerosol. Det i papir sammenfoldede pulver blev anvendt til væskeformig aerosol.

15 Forsøg til bekræftelse af aktiviteten af den foreliggende forbindelse til fremme af propagering af neuritter vil blive forklaret i det efterfølgende.

Forsøg 1 20

Virkning på formeringen af neuroblastceller, Neuro-2a-stamme.

25 Neuro-2a blev udspredt på et dyrkningsmedium bestående af 90% Dulbecco's modificerede Eagle's medium og 10% føtalt kalveserum (FCS), og indeholdende 100 U/ml penicillin G og 100 jug/ml strep tomycinsulfat, og derefter dyrket ved 37*C i et carbondioxidvarmeskab, der indeholdte luft, i hvilken 30 5% carbondioxid var inkorporeret. Beholderen, som blev anvendt, var en polystyrenbakke med en diameter på 60 mm. 1-2 x 104 neuroblastceller implanteredes i hver bakke og dyrket i 48 timer. Det FCS-holdige dyrkningsmedium blev fjernet fra den fremkomne cellekultur. Til kulturen, der 35 ikke indeholdt FCS (denne kultur indeholdt 100% MEM, og antibioticakoncentrationerne var de samme som for ovennævnte dyrkningsmedier før fjernelse af FCS'en), blev der som testprøver tilsat forbindelse (4) (tabel 1), for- 17 DK 170648 B1 bindelse (5) (tabel 2), Gal-(beta 1-3) GalNAc (beta 1-4) <NAcNeu-(alfa 2-3)> Gal (beta-1-4) Glc-(beta-1-1) ceramid (i det følgende omtalt som GM) (tabel 3) henholdsvis <NAcNeu (alfa 2-8) NAcNeu (alfa 2-3)> Gal (beta 1-3) GalNAc 5 (beta 1-4)-NAcNeu-(alfa 2-8) <NAcNeu- (alfa 2-3) > -Gal (beta 1-4) Glc (beta-l-l)ceramid (i det følgende omtalt som GQ1b (tabel 4) , i foreskrevne mængder, og dyrkningen blev fortsat. Da der var gået 24 og 48 timer efter til sætningen af disse mediciner, blev det forøgede antal af levende 10 celler i dyrkningsmediet, det forøgede antal af neurites og længden af neuritterne målt. Forsøget blev udført på tre bakker for hver koncentration. De fremkomne værdier blev udtrykt som gennemsnitsværdi ± standardafvigelse (S.E.) 15 Resultater;

De mindst effektive koncentrationer af forbindelsen (4), GM1 og GQ1b 48 timer efter at disse mediciner var sat til dyrkningsmediet var 10 ng/ml, 10 Mg/ml henholdsvis 10 20 jLtg/ml. Ved at tage disse materialers molekylvægt i be tragtning er aktiviteten af forbindelsen (4) 420 gange så stor som aktiviteten af GM1 og 270 gange så stor som aktivitetenen af GQ1b. Den mindste effektive koncentration af forbindelsen (5) er 100 ng/ml i 48 timer efter til-25 sætning af medicinen og aktiviteten af forbindelsen (5) er 42 gange så stor som aktiviteten af GM1 og og 27 gange så stor som aktiviten af GQ1b.

Yderligere viste GM1 og GQ1b ingen aktivitet, når dyrkningen 30 blev udført i 24 timer. Dog indikerede forbindelserne (4) og (5) aktivitet, når dyrkningen blev udført i 24 timer under anvendelse af disse forbindelser i en mængde på 10 ng/ml. Disse resultater viser tydeligt, at forbindelserne (4) og (5) har stor aktivitet med hensyn til propageringen 35 af neuritter.

18 DK 170648 B1

Sammenligningseksemoel På samme måde som i eksempel 1 ovenfor blev en subkultur af Neuro-2a-celler podet i en dyrkningsskål med en densitet på 5 104 celler/skål og dyrket i 48 timer. Cellerne blev derpå ' overført til Dulbecco's modificerede Eagle's medium, som ikke indeholdt serum men forbindelse (4) ifølge den foreliggende opfindelse og den i nedenstående tabel anførte forbindelse i mængder på ΙΟ'6 M. Efter 24 timers dyrkning 10 blev længden af neuritterne målt og udtrykt i forhold til længden af kontrolneuritten (ingen forbindelse tilsat), som blev sat til 1,00.

Resultaterne blev som vist i nedenstående tabel.

15

Tilsat forbindelse Relativ neuritlængde

Ingen (kontrol) 1,00

Forbindelse (4) ifølge opfindelsen 1,85 5-acetoamid-2-0-(chlolesten-3-yl)-20 3,5-dideoxy~a-D-glycero-D-galacto-2- nonulopyranosonatmethylester (kendt forbindelse) 1,01

Resultaterne viser, at forbindelsen (4) ifølge opfindelsen 25 (Na-saltet) har en højere aktivitet med hensyn til fremme af væksten af neuroblastomacellen, Neuro-2a-stammen, end den kendte forbindelse 5-acetoamid-2-0-(chlolesten-3-yl)- 3,5-dideoxy-a-D-glycero“D-galactO“2-nonulopyranosonat-methylester. Denne aktivitet indicerer, at forbindelserne 30 ifølge opfindelsen er nyttige som neuropatiske midler (jf.

ovenfor side 2, linie 7-10).

På baggrund af ovenstående forsøgsdata ses forbindelserne ifølge opfindelsen at have en større kemisk, biologisk 35 eller pharmakologisk aktivitet end den kendte forbindelse.

19 DK 170648 B1

Akut toxicitetsforsøa:

Et akut toxicitetsforsøg blev udført ved intravenøst at indsprøjte 30 forbindelserne i 45 uger gamle ddy hanmus.

5

Resultaterne viser, at LD50 af forbindelserne (4) og (5) er 93 mg/kg henholdsvis 291 mg/kg.

20 DK 170648 B1

QJ

I r—

J- O GJ O

+i \ ti 'Z X 'Z. % η n Tf M- Γ" o o o o o o o o α S o o o © J o o o o . * c + ' + +1 +1 · +1 +i -f-1 +1 .

rtUJ °l V 'Ί °1 N W N N ^ 4-3 * r—f ♦*—< i—< f—i . . . .

c 00 I*—<»—l * < +1 4- 3 —v -r- O * 5— *fc -k 4£ r— ^ ^ ^ 4c *k <k CO g £ ^ ™ co æ o csj

C\ V ”""1 V O π Π CO

^ E CM w V o J -t in ω CO .

a w +1+1 +1 + _· + i +, +l +l '-J

g lJ t t V <o en CD co =

Sco 2 2 2 ro^ioir)

_3 *ν. S ^ ^ M OCVJCMLO

- ^ -1 ·—C ·—< ·—1 <—c S" rs xj Q. rs O J_ 5· CT “1 « « <* r- cn CD ro T = ° ° CM o r>s CT1 ^ n Tf W i «· >S- «S- is- i

O CJ

s: cn T“^ O i -O O s-

r= S- CJ

I— CL i— *J r— .— o S- O ·£> =3 ° O O "

C Ό . .V

P 2roi^S° LO cn co CM l_3 Cl.

^sei LO ro cn · o —I cn CO · * •Sct Pi pi 33 N N -I ri 3 * C rt *

< CL

rS

·*-> _ C ^ -(-) ro . ^ ΓΖω i lo ro o co r-ι m- lo o o 5> ^ ^ ^ ' co lo o cn v

O ^ ^ ν n 3 ^ Tf Tf Π 3 CL

I- O * ΪΪ55. ε Έ ε ε g g1 g g σ> σ> σϊ o? v c-c:3.a. 0 = ¾.¾. Q.

O O.—lO O O pi O * ·—1 O —< Pi O 1—1 - 1-1 Pi i-

rS

f ν' ^ ^ ^ <N Λ qT ^ «· “i Tf S- -3- M- Ti- PS- r-

E - - - - I ^ - H

ΓΤ ^ oooo ·— o) o o a g w « "i m +J n LO LO in G) l* Q* o cj tu a co o o tu m s/ ~ S, -j -O -o T> -O ^ -j-5-σ-σ-σ ΐ t- S1 §.= = = = = § = = = 1 ί_ = g L- 5- 5- S_ 4J Z i- S. S_ J_ o pT O O O O O O U- O O O o o .

ω '-L- ^ L, L. lt Ll LU k; U. Ll £ Ll 33 21 DK 170648 B1 o i— S-

CJ CJ

4-> c_> 4- > \ Τ'- s S ΰ S ro χί- χ?· ro O O O O o o o o CJ C O O O O O O O O ·

C rt o O

'—' +' +i +i + ' · +i +1 -f· i +i .

<— 2D ;r> ro · ro ro cj cj cj cj ro cj 4—5 LiJ — — — — rsf.Hr.

C r—( i—ti—ii—t ·—r ·—i < tn + 1 +J r—- ·*“ o * 5— i— -if 3 ,— £ 0 o ro ro cn lo cd ro ro cn co <f n tn >h o cn cj ro *4— E n <τ in tn · if to in rt c o o *-- +1 +1 +1 +1 · +| 4-1 +1 +1 .

CJ 2D ro ~o · V c c o tn t a o t

Ct Ο Λ r r. ·. rs rs «. H

c· ot ci ta o ro o t_n cd f~J tn CO r—t ro o .—< CD co —J +1 r—I i—( i—( I—I f—I r—t re Ό CL rt o s-

5- O

CL 10 4-> cn tn ro o cd c-, σι cj in •r-C ----- 1···— o xr o ro oj r-» o tn Z3 ί- χΓΓΟΧΤίηι ·<— «— LO LO l o o

CJ 2 C

CJ

-O i n o S- f— J_ o CL ,—

4- > — LO

·>- o O

5- O H

=» · · o

o O Ol C to (O U O LO CJ CJ l_> V

CXJ O CJ LO i—I · o C\J »—I LO · c.

cj i—< >—i ·—i cj rå cj cj cj cj ro * <— S- * ri o * 4-> cn C rs

< CL

rs 4-> C o +-> « . .

i— O Γ'» —i xtf" LO O Γ0 CJ CJ O o

rS i— h to 03 CTi 00 S CJ in · V

4-3 i— xj· ro ro ro 2D <r < χτ >β· d cl o o * l- O 4;

O

r— r-r—c— i— ,— i— i— O

εεεε εεεε

S \ \ \ \ N. \ \ O

Ot D Ot O) Cn Cn cn cn v c c a. ct er c a. a. a.

* O O·—to O O 1—to •—I O ·—I i—I O i—I ·

·—t »—t L

n S- lo in lo lo $_ tn m lo m i— ε cj i —

*'— > CJ CJ CJ CJ -r— O CJ CJ CJ

4-3 ^l tn <S) <Sl t/l 4-> 1/1 t/) ι/l t/l CJ

S— f— t— i— r— I— t— r— ,—.

Xj“ CL O CJ o O CO CJ CJ CJ CJ JJ

CJ tn —I XJ "O X) "O χτ I *σ Ό Ό "O — , ΟΙ o c c c c occcc cj in I— o o ο o ο H jo o o ja

4-> S- 2L.1.1.J- 4J XZ U L- i. S- O

Lf— o ooooo c- ooooo

UJ lJ_ y L. L II II LU L2 Ll_ Ll_ Li_ Lu 2D

22 DK 170648 B1 03 i—’ f— CJ 03 +-» O +-“ S.

T »Z 2 2 !£ in in to ψ ^ in ^ £ o o o o o o o o o o o o

" = o o o o' o~ o' o o o" o' o' cT

+1+1 +1 +1 +1 +1 +1 +, +r +I +l +1 rt UJ M v oo ^ » n „ lo <+, * 1 * 1 ' 1 . 1 . 1 ,—* ,-T _7 ,_T __7 +j ø~s i- a * 3 '— ί

c'o rt n n ® σι N

c ~ ^ ^ o rr r-- co uoocno^roJ

*j5 IC Ifl ΙΛ IO Ti n ^ LO UO ΙΟ ΙΟ LO

a 3 +' +1 +1 +1 +1 +1 + 1 +, +, +| +| +, "§iuj ^ ^ ^ ^ ^ ^ o s eo N co σ 5ϊ , * 1—1 ' 1 o o o Lomcoenroen f3t£, o cn o o α o cn o o o Π § —J T * r—1 *“—< ^ ^

CO

c S

— i

« li XJ

H- O. rt 0 S- k Μ ^ T. “ ^ o n n cn i—i C3 •k C 2 S C; 2 2 £ « CD cT cmT o~ £ ^“Lo^runoo =3 i-cj o

2C CD

O S- S- o CL I— 4-> I—

•r- CJ

s- u rs

CJ CJ

c -σ cj r— S-

rt CJ

•P CJi OLDCNJOCnCvJ

SS -e-ia-lDr-llOCO

<Q. *~| ’—1 ,—* ·—1 ·—‘ ·—* CO cn UD 1—i o ΟΪ 1—I *-H f—» CM CM r* rs

P

C

-P fO i— CJ rtf r—

+-1 >— o tj- 1^. ej lo o ro co cn cm o J

,o o cm ro σ> ro cm —1 co n <? tn η h co co cm co ro co ro ro co co ro ro « ε α ε E E i i i Ί ΐ e p f £ ? ? ? ? ? Oi &i ci k k k ==¾¾.¾ c c a. a. a. in 04 £, _j 0 O r-< ° ° 2 —I O O <—I o O °

t- w g ~ 2 ^ o g ~ 2 ^2 S

CL) OD 1— ΟΙ— X

uj £ §§§000 uj § o o § § § * 23 DK 170648 B1 o r— i- i— in w ·# tn us in id t <t o· 0 o o o o o o o o o o o +JU ----- ----- -*-> V, o o o o o o o o o o

•i—i— O O

S- (0 +1+1 +1 +· +1 · +1 +1 +1 +1 +1

3 +-> =3 O

a c ro ro co m· m- n- lo cm ro co C rS ----- -----

r—i »-H r-i f—< r-i r—1 i—i r—< i—i r-H

rtf UJ

C 00 < +1 +-> T- <—s * S- O * SS I— -M-OCMinCO -HlOCDOCn o.— o o r~~ cr> cn ιο s o oi co ----- ----- o lo lo ri- rr lo · rr lo lo lo ld ·

c»- \ <_? O

rt ε +i+i +i +i +i · +i +i +i +i +i 3 =3 =>

O*— OLOOCOCn CO Μ" M- LO LO

TD · ----- ----- cn lu »—i co lo r^> o* lo o o o cm c· o co co cn i—i cn o cn o cm 00 I-1 *-' I----1 i—l i-1 —i +' s 0- rt *o

C. rS

1— O i.

o i- cn JO Cl on rs 4-> cn

Η- -I- C

S-·«- LO CO O O Cn O LO i—i O" CO

3 S- -----I - - - - - I

0 O U0 1—' CO ^ CO CO CM ri- i--. i—I

2C Cl ri· LO rr Lf> LO rr r— rr ri" LQ

O U S- o a. r— 4-> I—

•i- O

s- u 3 o o c -a o t— s- r3 o -U Cl LO rj- Cl f-» LO O rr co co cm o- o

Crt rj- f LO LO O CO LD LO CO 1—1

< Q- i—l i—1 i—t i—l CM HD 1—1 i—l 1—1 r—l CM O

1—1

1— O

ra +-> o

C V

+J c3 o.

•—O * ri i— < · * 4-> i— O LO i—i CO i—t l_> O H S <· (O o O O CM CO CO O CM CO N « (D «i .

t— o ro ro ro ro ro Γ3 ro ro ro ro co 3d 1 1 1 1 1 I I I— i— i— S_ εεεεε εεεεε «

s- \ \ \ \ s. 5- S X N S. s. JO

O Dl Dl Dl Dl Dl O Dl Dl Dl Dl Dl i— ε o e c a, a a ε c c a a a jy

•1— D* *1 +J

4- J TS. O O 1—1 O O +J O O·—100

D— 1—* O 1—1 O r—1 O 1—1 o O

rT Cl ·—11—1 CO ·—li—1 cm m _i rr _i OO O —

5- CO CO S- CO

O </> 1— JO J3 JO JO JO O 1— JO JO J3 JD JO

4—1 S— —C 1—1 f—1 i—l 1—1 i—l 4—1 2C '—I 1—I 1—1 1—I 1—1 c_) +- o o σ σ σ σ σ +- ocro-ocro- UJ U_ ^ O O O O O UJ iaC O O O O O o 24 DK 170648 B1

Det foreliggende sialosylcholesterol er anvendeligt, navnlig som lægemiddel mod neuropati.

* f:

Claims

1. Sialosylcholesterol, kendetegne t ved, at den har den almene formel (4) eller (5): 5 H’c T \ck, »0 OH COOH, X_ OH eller 15 K 3 C C H ’ KjC H j C 20 ‘4L OH 25 n hvor Ac betegner en acetylgruppe.

2. Fremgangsmåde til fremstilling af sialosylcholesterol, 30 med den almene formel (B): HO OH R1 n cb)

35 AcHSn/^T-^7 OK hvor Ac betegner en acetylgruppe, en af grupperne R3 og R4 betegner -COONa, og den anden har følgende formel: DK 170648 B1 'CH- rrØ * 10 kendetegnet ved, at en forbindelse med formlen (1): AcO Ac f 1 AcO / / (1) OAc 20 hvor Ac betegner en acetylgruppe, omsættes med cholesterol i nærværelse af en Koenigs-Knorr-katalysator til frembringelse af en forbindelse med formlen (A):

25 AcQ OAc R' / B* (A) AcO / / OAc 30 hvor Ac betegner en acetylgruppe, en af grupperne R1 og R2 , betegner -COOCH3, og den anden er en gruppe med følgende formel: 5 DK 170648 B1 10 og at forbindelsen (A) derefter hydrolyseres.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at Koenigs-Knorr-katalysatoren er udvalgt fra en 15 gruppe, der består kviksølvbromid, kviksølvcyanid, sølv- perchlorat, sølvtrifluormethansulfonat og sølvtrifluoroace-tat.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet 20 ved, at omsætningen af forbindelsen (1) med cholesterol udføres ved ca. 20-25°C under normalt tryk i ca. 1-7 dage.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at cholesterolen anvendes i en mængde på ca. 1-5 mol 25 pr. mol af forbindelsen (l).

6. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved, at Koenigs-Knorr katalysatoren anvendes i en mængde på fra ca. 1,0 til 1,2 ækvivalent pr. ækvivalent af for- 30 bindeisen (I).

7. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at der anvendes et opløsningsmiddel, hvilket opløsningsmiddel er udvalgt fra en gruppe bestående af 35 benzen, dichlormethan og tetrahydrofuran.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at forbindelsen (A) behandles med en baseopløsning i DK 170648 B1 en koncentration på ca. 1-3 N ved ca. 15-25*C i ca. 5-15 timer til hydrolysering af forbindelsen.

9. Neuropatimiddel, kendetegnet ved, at det 5 omfatter sialosylcholesterol med den almene formel: 4 H a C I £«

10 J. ^n» Η? OK COONa k/7^0?° (4) AcKii / / 1 '

15 N^V . OH eller 20 K,C ^^CK, H,C

25 I KO OH o--L uy i / / 0 " j* COONa &lrU OH 30 hvori Ac betegner en acetylgruppe.

10. Neuropatimiddel ifølge krav 9, kendetegnet * 35 ved, at midlet findes i en form, der er anvendeligt til øjenapplikation, inhalering, intravenøs injektion, intramu-skulærinjektion eller subkutan injektion.