DE3515178A1 - Verfahren zur herstellung von neuen anthracyclinkonjugaten anionischer polymerer - Google Patents

Verfahren zur herstellung von neuen anthracyclinkonjugaten anionischer polymerer

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DE3515178A1
DE3515178A1 DE19853515178 DE3515178A DE3515178A1 DE 3515178 A1 DE3515178 A1 DE 3515178A1 DE 19853515178 DE19853515178 DE 19853515178 DE 3515178 A DE3515178 A DE 3515178A DE 3515178 A1 DE3515178 A1 DE 3515178A1
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Farmitalia Carlo Erba SRL
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Description

Beschreibung
Die Erfindung betrifft Konjugate von Doxorubicin und seinen Analogen mit anionischen Polymeren und ein Verfahren zu ihrer Herstellung.
Die Bindung von Antitumormitteln an geeignete, wasserlösliche, makromolekulare Trägersysteme wurde als neue Möglichkeit in der Krebstherapie vorgeschlagen, um die therapeutische Wirksamkeit eines Arzneimittels zu verbessern. In der Tat ist der therapeutische Index der meisten Antitumormittel (einschließlich der Anthracyclin-Antibiotika) klein und die Wirtstoxizität ist die einzige Beschränkung bei der Verwendung der verfügbaren Arzneimittel.
10
15 20 25 30 35
Die Erfindung betrifft ein Anthracyclin-anionisches PoIymeres-Konjugat, welches ein 1:2 regelmäßig alternierendes Cyclopolymer von Divinylether und Maleinsäureanhydrid in Polycarboxylat-Form, gebunden an Doxorubicin oder ein Analoges davon durch eine Esterbindung an dem 14-C-Atom von Anthracyclin, enthält.
Das 1:2 regelmäßig alternierende Cyclopolymere von Divinylether und Maleinsäureanhydrid, das auch als DVE-MA oder als Pyran-Polymeres bekannt ist, besitzt die Formel
Divinylether-Maleinsäureanhydrid-Copolymeres (DVE-MA)
Es kann in die Polycarboxylat-Form durch Hydrolyse mit einer starken Base, bevorzugt bei einem pH-Wert über 12, beispielsweise mit 0,2N wäßriger Natriumhydroxidlösung, überführt werden. Das Natriumsalz der Polycarboxylat-Form besitzt die Formel
COO" Na+
Na+ "OOC
COO" NaH
Jn
Polycarboxylat-Form
Das Anthracyclin-anionisches Polymeres-Konjugat gemäß der Erfindung kann die freie Form des Arzneimittels in vivo durch Hydrolyse der Esterbindung langsam freisetzen, wodurch das pharmakokinetische Verhalten des Arzneimittels geändert wird. Die Konjugation über die Seitenkette (C-13, C-14) vermeidet eine Modifizierung des Arzneimitte 1-Amino zucker s, von dem angenommen wird, daß er für eine optimale Arzneimittelaktivität wesentlich ist.
Die Antitumorwirkungen bei Versuchstumormodellen in vivo zeigen klare therapeutische Vorteile bei Verwendung von Anthracyclinen, die an das polyanionische Polymere gebunden werden. Dies ist durch eine Verringerung der Toxizität des Arzneimittels und eine Verstärkung der Wirksamkeit bei allen verwendeten Tiertumoren erkennbar. Die Verbesserung des therapeutischen Index des an das Polymere gebundenen Arzneimittels kann das Ergebnis der erwarteten Änderung der pharmakologischen Verteilung und einer bevorzugten Abgabe des Arzneimittels an Tumorzellen, die eine hohe endocytoische Kapazität aufweisen, sein.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Her-
Stellung des erfindungsgemäßen Anthracyclin-anionisches Polymeres-Konjugats. Das Verfahren umfaßt die Hydrolyse eines 1:2 regulär alternierenden Cyclopolymeren von Divinylether und Maleinsäureanhydrid mit einer starken Base und die Umsetzung der entstehenden Polycarboxylat-Form des Polymeren mit 14-Bromdoxorubicin oder einem 14-Brom-Derivat eines Doxorubicin-Analogen. Das Verfahren für Doxorubicin, 4-Demethoxy-doxorubicin und 4f-Desoxydoxorubicin allein wird in dem folgenden Reakt ions schema erläutert.
COO" Na+
NbOH
20 Divinylether-Maleinsäureanhydrid-Copolymeres (DVE-MA)
OOC
COO-Na+
Polycarboxylat-Fo rm
COO-Na-
ι—»J«+
O OH
R2
OCH3
H
OCH3 		OH
OH
H
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. Beispiel 1
Doxorubicin-Pvran-Copolymer-Kon.iugat (I) 100 mg Pyran-Copolymeres mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 32 000, gelöst in 5 ml destilliertem Wasser, werden in die Polycarboxylat-Form durch Hydrolyse mit 0,2N wäßriger Natriumhydroxidlösung (pH >12) während mindestens 15 min überführt. Die vollständige Hydrolyse des Maleinsäureanhydrids wird durch eine Titrationskurve bestätigt. Nach der Hydrolyse wird der pH der Lösung auf 8,5 eingestellt. 20 bis 50 mg 14-Brom-daunorubicin, frisch gelöst in einem kleinen Volumen Methanol, werden unter Rühren zu der Polymerlösung gegeben. Die Reaktion wird bei Zimmertemperatur durchgeführt. Die während der nukleophilen Substitutionsreaktion gebildete Säure wird durch Zugabe von einer verdünnten, wäßrigen Natriumhydroxidlösung neutralisiert. Das Reaktionsgemisch wird 2 h gerührt und dann auf pH 7,0 eingestellt. Irgendwelches freies Antibiotikum wird durch Ionenaustausch-Chromatographie an Dowex 50W-X2 entfernt. Im allgemeinen wird das Daunorubicin-Polymer-Konjugat mit Wasser oder einem wäßrigen Lösungsmittel zur Verringerung der Polymerkonzentration verdünnt. DünnschichtChromatographie (unter Verwendung
von Chloroform-Methanol-Essigsäure = 80/20/4, ausgedrückt durch das Volumen, für die Elution) und Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie an einer C-18 Umkehrphasensäule [unter Verwendung von Wasser-Acetonitril = 66/34 (Vol.)» eingestellt auf pH 3,8 mit Phosphorsäure, als mobile Phase bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 1,5 ml/min; fluorimetrischem Nachweis, Anregung, 500 nm; Emission = 590 nm) werden zum Nachweis der freien Anthracyclin-Derivate in den Proben der polymeren Derivate verwendet. Proben, die restliches, freies Arzneimittel enthalten, werden weiter an Dowex 50W-X2 erneut chromatographiert. Die Konzentration des gebundenen Arzneimittels in dem polymeren Derivat wird durch Absorption bei 480 nm bestimmt bzw. geschätzt. Der Polymergehalt in den !5 Konjugaten wird durch das Trockengewicht nach einer ausgedehnten Dialyse des Konjugats gegenüber destilliertem Wasser zur Entfernung irgendeines Salzes bestimmt. Die Titrationswerte werden ebenfalls zur Berechnung der verfügbaren Carboxylgruppen und damit für das Ausmaß der Arzneimittelsubstitution verwendet. Dieses Verfahren liefert identische Ergebnisse. Da die Anhydridfunktion ebenfalls mit der Arzneimittel-Aminogruppe unter Bildung einer Amid-Bindung reagieren kann, wurde diese Art von Reaktion durch die folgenden Beobachtungen ausgeschlossen: (a) die Titrationskurven zeigen eine vollständige Hydrolyse des Anhydrids bei den Kupplungsreaktionsbedingungen an;
(b) die Anwesenheit von verbleibendem Anhydrid wurde ebenfalls dadurch ausgeschlossen, daß keine Bildung von N-Acylderivaten auftritt, wenn die freien Aminoglycoside vermischt und mit einem Alkali-hydrolysierten Polymeren unter Standard-Reaktionsbedingungen inkubiert werden.
B e i s ρ i e 1
4-Demethoxy-doxorubicin-Pyran-Copolymer-Kon,iugat (II) i4-Brom-4'-desoxydoxorubicin wird anstelle von 14-Bromdoxorubicin bei dem Verfahren von Beispiel 1 verwendet, wobei man die .Titelverbindung erhält.
Beispiel 3
4*-Desoxydoxorubicin-Pyran-Copolymer-Kon.iugat (III) i4-Brom-4'-desoxy-daunorubicin wird anstelle von 14-Brom~ doxorubicin bei dem Verfahren von Beispiel 1 verwendet, wobei man die Titelverbindung erhält.
Biologische Aktivität
Doxorubicin-Pyran-Copolymer-Konjugat (I), welches im folgenden als P-DX bezeichnet wird, wird auf seine cytotoxische Aktivität und auf seine Antitumoraktivität gegenüber Versuchstumoren bei Mäusen untersucht. Die Ergebnisse werden denen von freiem Daunorubicin (DR) und Doxorubicin (DX) als Vergleichsarzneimitteln von dieser Klasse von Antitumormitteln verglichen. Die Inhibierung der koloniebildenden Fähigkeit von HeLa-Zellen wird zur quantitativen Bestimmung der cytotoxischen Aktivität des an die Polymeren gebundenen Arzneimittels verwendet. Obgleich eine bemerkenswerte Verringerung in der cytotoxischen Wirkung des gebundenen Arzneimittels, verglichen mit dem freien Arzneimittel, ständig beobachtet wurde (Tabelle 1), ist die Konzentration an gebundenem Arzneimittel, die für eine 50%ige Inhibierung der koloniebildenden Fähigkeit von HeLa-Zellen (15 ng/ml) erforderlich ist, nur etwas höher als diejenige, die für das freie Arzneimittel erforderlich ist (10 ng/ml).
Vergleichsuntersuchungen von Anthracyclinen wurden sowohl bei i.p. (P388 Leukämie, J-744 Lymphema) als auch i.v. (starke Leukämie) transplantierten Tumorsystemen durch-
geführt. Bei diesen Untersuchungen ist der Weg der Arzneimittelverabreichung ähnlich wie der bei der Tumorzelleninokulation. Die Ergebnisse einer Anzahl von Versuchen gegenüber P388 Leukämie sind in Tabelle 2 zusammengefaßt. Freies Daunorubicin gibt bei seiner optimalen Dosis von 4 mg/kg einen T/C-Wert von 209%. Doxorubicin, geprüft bei seiner optimalen Dosis von 10 mg/kg, ist aktiver (T/C = 274%) als Daunorubicin. P-DX wurde bei verschiedenen Dosismengen (ausgedrückt als Doxorubicin-Gehalt in dem Konjugat) geprüft, und es tritt eine dosisabhängige Antitumoraktivität auf. Geringere Dosen ergeben Antitumorwirkungen, die ähnlich sind wie die des freien Arzneimittels. Jedoch erlaubt die niedrige Toxizität des Doxorubicin-Polymer-Konougats eine Erhöhung in der Dosis, wodurch die therapeutische Wirksamkeit der Antitumormittel verbessert wird. In der Tat werden hohe Dosen (mehr als 40 mg/kg) sehr gut toleriert, was eine bemerkenswerte Reduzierung der Arzneimittel-Toxizität in P-DX anzeigt. Unter Verwendung des gleichen BehandlungsSchemas werden gleichzeitig Gemische der freien Arzneimittel und des Polymeren verabreicht, und man erhält Antitumorwirkungen, die nur etwas besser sind als diejenigen des freien Arzneimittels allein in dem optimalen Bereich (d.h. innerhalb der maximal tolerierten Dosen). Das Pyran-Copolymere beeinflußt jedoch die Arzneimittel-Toxizität nicht wesentlich. Die hohe Aktivität des makromolekularen Derivats von Doxorubicin zeigt sich ebenfalls in dem relevanten Anteil der langdauernden (tumorfreien) Überlebenden, die man bei optimaler Dosis erhält. Diese Heilwirkung wird mit Daunorubicin nicht und nur gelegentlich mit Doxorubicin beobachtet. Das Polymere selbst besitzt nur eine Randaktivität in diesem Tumorsystem (maximale T/C = 165%).
Zur besseren Charakterisierung des Unterschieds zwischen den freien Anthracyclinen und dem makromolekularen Derivat wurden weitere Untersuchungen in J-744 Lymphoma und Gross Leukämie durchgeführt (Tabelle 3). Die Ergebnisse der Vergleichsversuche mit Mäusen, welche J744 Lymphoma tragen, sind ähnlich wie die Ergebnisse bei Mäusen, die P388 Leukämie tragen (Tabelle 2). P-DX erhöht die Lebensspanne in größerem Ausmaß als entweder das freie Daunorubicin oder das freie Doxorubicin. Nur P-DX ergibt während langer Zeiten Überlebende.
Diese Arzneimittel werden gegenüber Gross-Leukämie Modell unter Verwendung einer mehrfachen Injektionsbehandlung (Tabelle 4) geprüft. Obgleich die Bindung von Doxorubicin an das Polymere die Arzneimittelwirksamkeit reduziert, ist P-DX bei seiner optimalen Dosis wesentlich aktiver als entweder Daunorubicin oder Doxorubicin und ergibt eine große Erhöhung in der Lebensspanne und eine relevante Zahl an während langer Zeiten Überlebender.
4-Demethoxydoxorubicin-Pyran-Copolymer-Konjugat (P-DmX) zeigt, wenn es gegenüber Gross-Leukämie unter Verwendung eines MehrfachbehandlungsSchemas (q 3 d χ 3» i.v.) geprüft wird, Antitumorwirkungen, die besser sind als jene von 4-Demethoxy-daunorubicin (DmDR) und nur geringfügig besser als jene von 4-Demethoxy-doxorubicin (DmDx) (Tabelle 5).
Jedoch zeigt, wie es auch für P-Dx gefunden wurde, nur das Konjugat eine bemerkenswerte Anzahl von Überlebenden während langer Zeiten.
Die Verringerung der systemischen Toxizität erlaubt die Verabreichung einer höheren Dosis des Arzneimittels in dem Konjugat. Das Verhältnis zwischen gleichen toxischen
Dosen des freien Arzneimittels (LD 10 - 0,6 mg/kg) und des an das Polymere gebundenen Arzneimittels (LD 10 1,7 mg/kg) beträgt etwa 3.
Tabelle 1
Cytotoxische Aktivität von Daunorubicin, Doxorubicin und Doxorubicin-Pyran-Copolymer-Konougat gegenüber HeLa-Zellen
Arzneimittelkonzentration (ng/ml)
Überlebende (% der Kontrolle)
DX
P-DX
3,125 94
6,25 75
12,5 42
25,0 3
50,0 _
- 100
- 55
45 54
23 35
1 6
Die Zellen werden den Arzneimitteln während 24 h ausgesetzt. Die Überlebenden werden durch die Fähigkeit der behandelten Zellen, Kolonien zu bilden, bestimmt. Nach der Behandlung wird das Medium entfernt und die Zellen werden gewaschen, in Eagle's Minimalessentialmedium, das 10% fetales Kalbsserum enthält, suspendiert und plattiert. Die Kolonien werden 8 Tage nach der Inkubation gezählt.
Tabelle 2
Vergleich der therapeutischen Wirkung der i.ρ-Behandlung
bei P 388 Leukämie1 		4
10		 209 (190-240)
274 (260-288)		 Zahl d.toxischen
Toten		 LTS^
Arz- Z Dosis5 Τ/C4
nei- mg/kg % 		Zahl d.behandel
ten Mäuse
mittel 4/38
1/19		 2/19
DR
DX
1 Tabelle 2 4 (Forts.) 0/10 1/19
P-DX 8 227 0/18 4/10
16 264 (250-278) 0/18 6/19
32 230 (210-250) 0/19 4/10
38.5 295 (290-300) 0/10
48 395 2/1S
60 347 (320-374) 1/10
4 + 20 421 o/io
DR+P6 8 + 40 222 1/10 0/10
16 + 80 255 10/10 0/10
32+160 90 10/10 0/10
20 70 0/10 0/10
P6 40 140 0/10
80 145 0/10
160 165 0/10
150
Die Versuche werden bei BDF1 Mäusen, inokuliert i.p. mit 1 χ 10 Zellen/Maus, durchgeführt. Der Bereich der mittleren Überlebenszeit (MST) der Kontrollmäuse beträgt 9 bis 10 Tage bei sechs Versuchen.
^Einzelbehandlung i.p. am Tag 1 nach der Tumorzellen-Transplantation. Für P-DX wird die Dosis als Doxorubicin-Gehalt ausgedrückt. Für DR+P wird die Dosis als Daunorubicin-Gehalt ausgedrückt.
ΈΒΤ der sterbenden Mäuse nur in der behandelten Gruppe, dividiert durch die MST der Kontrollgruppe, χ 100. In Klammern sind die Werte der einzelnen Versuche oder Bereiche angegeben.
* LTS, Überlebende während langer Zeit (> 60 Tage), ρ DR+B, Gemische von Daunorubicin und Pyran-Copoly-
merem; P, Pyran-Copolymeres.
jDie Dosis wird als mg Polymer ausgedrückt; neues Arzneimittel:Polymer-Molverhältnis = 19 zu 29 in unterschiedlichen Präparationen.
Tabelle 3
Aktivität Dosis _______
gegenüber J-744 Lymphoma		 Zahl d.toxischen Toten LTS^
Arznei mg/kg T/C Zahl d.behänd.Mäuse
mittel 3,3 0/8
DR 5,0 139 8/8
6,6 71 0/8
DX 10,0 168 3/8
30,0 176 0/8 2/8
P-DX 45,0 302 4/8 1/8
265
Die Versuche wurden bei BALB/c Mäusen, inokuliert i.p. mit 1 χ 106 Zellen/Maus, durchgeführt. Die MST der. Kontrollmäuse betrug 19 Tage.
2 Einzelbehandlung i.p. am Tag 1 nach der Tumorzellen-Transplantation.
^ LTS, während langer Zeit Überlebende (> 90 Tage).
Tabelle 4
Einfluß der mehrfachen Verabreichung auf Gross 414 T/C Zahl d.tox.Toten Ί
Leukämie
Arznei Dosis' 258 % Zahl d.beh.Mäuse LTS^
mittel mg/kg 171 (220-608) 1/17
DR 8 768 (216-300) 6/17 2/17
DX 7 426 (160-183) 0/17 0/17
P-DX 8 (720-816) 0/17 1/17
12 (320-533) 9/17 5/17
18 0/17
Die Versuche wurden bei C3H/He-Mäusen, inokuliert i.v. mit 1 χ 10 Zellen/Maus, durchgeführt. Die MST der Kontrollmäuse betrug 5,5 Tage bei zwei Versuchen.
14
Behandlung i.v. an den Tagen 1, 4 und 7 nach
der Tumor-Transplantation.
^ LTS, Überlebende während langer Zeiten (> 60 Tage).
Tabelle
Einfluß von 4-Demethoxy-daunorubicin (DmDR), 4-Demethoxydoxorubicin (DmDX) und 4-Demethoxy-doxorubicin-Pyran-Co~ polymer-Konjugat (P-DmDX) auf Gross Leukämie
Arznei Dosis oder 288 T/C 3 Todes LTS4
mittel optimale 229 % fälle
Dosis(mg/kg)
DmDR 0,75 286 143 1/10 0/10
DmDX 0,50 (285-291) 0/20 1/20
0,75 (200-258) 12/20" 1/20
P-DmX 1,13 350 1/10 0/10
1,70 (272-300) 3/20 3/20
Die Versuche wurden bei C3H/He-Mäusen, inokuliert mit 1 x1O6 Zellen/Maus, durchgeführt. Die MST der Kontrollmäuse betrug 6,5 Tage bei zwei Versuchen. 2 Behandlung i.v. an den Tagen 1, 4 und 7 nach der Tumor-Transplantation.
^ in Klammern Bereich
LTS, die Überlebenden während langer Zeit ( > 60 Tage). 25

Claims (1)

  1. KRAUS · WEISERT & PARTNER
    PATENTANWÄLTE
    UND ZUGELASSENE VERTRETER VOR DEM EUROPÄISCHEN PATENTAMT DR. WALTER KRAUS DIPLOMCHEMIKER ■ DR.-ING. DIPL.-INQ. ANNEKÄTE WEISERT · DIPL.-PHYS. JOHANNES SPIES
    IRMGARDSTRASSE 15 · D-BOOO MÜNCHEN 71 · TELEFON 089/797077 TELEGRAMM KRAUSPATENT · TELEX 5-212 156 koat d · TELEFAX (O89) 7 9182 33
    4964 AW/My
    (1) FARMITALIA CARLO ERBA S.p.Α., I-2O159 Milano
    (2) ISTITUTO NAZIONALE PER LO STUDIO E LA CURA DEI TUMORI, 1-20133 Milane
    Verfahren zur Herstellung von neuen Anthracyclinkonjuga- \
    ten anionischer Polymerer
    Patentansprüche
    1. Verfahren zur Herstellung von neuen Konjugaten von Doxorubin und seinen Analogen mit einem anionischen Polymeren durch Umwandlung eines Pyran-Copolymeren in seine Polycarboxylat-Form durch milde Hydrolyse mit 0,2N NaOH, dadurch gekennzeichnet, daß 14-Bromdaunorubicin oder seine 14-Brom-Analogen in wäßriger, methanolischer Lösung bei Zimmertemperatur und während einer Zeit von 120 bis 180 Minuten mit dem anionischen Polymeren in Carboxylat-Form umgesetzt werden, während die Lösung durch Zugabe einer verdünnten, wäßrigen Lösung von Natriumhydroxid bei Neutralität gehalten wird, anschließend
    l irgendwelches freies Antibiotikum durch Chromatographie an Ionenaustauscherhar2 entfernt wird, wobei man die reine Lösung der gewünschten, neuen !Conjugate erhält.
    5 2. Doxorubicin und seine analogen, neuen !Conjugate mit einem anionischen Pyran-Copolymeren, dadurch gekennzeichnet, daß sie nach dem Verfahren gemäß Anspruch 1 erhalten worden sind.
DE19853515178 1984-05-25 1985-04-26 Verfahren zur herstellung von neuen anthracyclinkonjugaten anionischer polymerer Withdrawn DE3515178A1 (de)

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GB2158078A (en) 1985-11-06
GB2158078B (en) 1987-09-16
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