CN114292817A - 从多能性干细胞诱导细胞免疫治疗用t细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
提供了一种诱导细胞免疫治疗用T细胞的方法，包括以下步骤：(1)提供具有编码期望抗原特异性T细胞受体的基因并且敲除了Rag1和/或Rag2基因的人类多能干细胞，以及(2)从步骤(1)的所述多能干细胞诱导T细胞。还提供了一种使用细胞免疫用T细胞的细胞免疫治疗方法和一种细胞免疫治用iPS细胞银行。
Description
本申请是申请日为2015年7月17日、申请号为201580049887.6、发明名称为“从多能性干细胞诱导细胞免疫治疗用T细胞的方法”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本申请涉及一种诱导细胞免疫治疗用T细胞的方法。特别是，提供了一种从多能性干细胞(比如iPS细胞)有效可靠地诱导T细胞的方法，该T细胞具有期望抗原特异性T细胞受体基因。本申请还涉及一种利用iPS细胞形成细胞银行的方法，该细胞银行能有效用于细胞免疫治疗。
背景技术
每个T细胞表达具有不同特异性的T细胞受体(TCR)。当传染病发展时，一个具有适合特异性的T细胞会增殖从而形成一个T细胞群(克隆集落(clone))，这种T细胞群会与病原体进行斗争。这是获得性免疫的基本理念。如果有可能人工扩增具有期望抗原特异性TCR的T细胞，就可将扩增的T细胞用于过继性免疫治疗。特异性T细胞的扩增被称为“克隆”。事实上，通过对从患者得到的抗原特异性T细胞进行扩增而制备的多个抗原特异性T细胞的自体移植已进行了临床实施。然而，几乎所有的自体T细胞移植治疗不使用纯化到“克隆的”细胞程度的细胞群。此外，细胞的重复体外培养可能造成杀死癌细胞功能的损失。
业已提出了一种通过使细胞不死化而能够使其无限增殖的T细胞提供方法。可使细胞不死化并对其进行增殖而形成克隆的细胞群。使细胞不死化的方法可以包括细胞与癌细胞的融合以及在存在细胞因子条件下刺激TCR而进行的长期细胞培养。然而，由此获得的不死化T细胞的自体移植可能是危险的。此外，克隆过程可能降低细胞功能。
业已提出了一种细胞免疫疗法，其中，从一个人类T细胞建立多个iPS细胞，再从iPS细胞再生多个T细胞，这些T细胞具有重排的TCR基因，这些重排的TCR基因与诱导出iPS细胞的初始的人类T细胞中的TCR基因相同，将再生的T细胞用于治疗(WO 2013/176197 A1；Vizcardo等，Cell Stem Cell，12：31-36，2013；以及Nishimura T等，Cell Stem Cell，2013)。
根据上述引用文献提供的方法，iPS细胞可以从人类T细胞建立并再分化为成熟T细胞。在iPS细胞分化为成熟T细胞的过程中，TCRα链遭到额外的重排。(Nishimura T等，Cell Stem Cell，2013)。这种额外的TCRα基因重排不仅导致TCR特异性的损失，还可能由于与非期望的链的错误配对而产生自身反应性T细胞。当产生自身反应性T细胞时，可能发生损害正常组织的极其危险的反应。
采用具有在日本人中高频出现的纯合的HLA单倍型的供体形成一种高度通用的iPS细胞银行的项目正在进行中。(CURANOSKI，Nature，卷488：139，2012；以及Shin Kaneko,The Medical Frontline，69：724-733，2014)。T细胞从具有纯合的HLA单倍型的供体移植到具有杂合的HLA单倍型的受体(同种异体移植)一直被视为绝对禁忌。因此，细胞免疫疗的(其中使用从选自iPS细胞银行的iPS细胞再生的具有期望TCR的成熟T细胞)的概念一直被否定。当受体具有杂合的HLA单倍型而供体具有纯合的HLA单倍型时，从受体的免疫系统角度来说，供体的T细胞是自体的(自体移植)，但从供体的T细胞角度来说，受体的体细胞是非自体(异体移植)。由于这个原因，有报告称有引起导致患者死亡的严重的移植物抗宿主反应的危险(Ito等，Lancet，331：413，1988)。
引用列表
专利文献
专利文献1：WO2013/176197 A1
专利文献2：WO2011/096482 A1
非专利文献
非专利文献1：Vizcardo等，Cell Stem Cell，12：31-36，2013
非专利文献2：Nishimura T等，Cell Stem Cell，12：114-226，2013
非专利文献3：Ito等，Lancet，331:413，1988
非专利文献4：Bendle GM等，Nat.Med.，16(5)：565-70，2010非专利文献5：Cyranoski,Nature，488：139，2012
非专利文献6：Shin Kaneko,The Medical Frontline，69：724-733，2014
非专利文献7：Le Cong等，Science，39：819，2013
非专利文献8：Prashant Mali等，Science，39：823，2013。
发明内容
本申请提供了一种从多能性干细胞诱导具有期望TCR的T细胞克隆集落的方法。本申请还提供了一种从iPS细胞形成细胞免疫治疗用细胞银行的方法以及一种细胞免疫疗法用细胞银行。
在一个实施例中，本申请提供了一种诱导细胞免疫治疗用T细胞的方法，包括步骤：
(1)提供具有编码期望抗原特异性T细胞受体(TCR)的基因且敲除了Rag1和/或Rag2基因的人类多能性干细胞，以及
(2)从步骤(1)的多能性干细胞诱导T细胞。
在该实施例中，“具有编码期望抗原特异性T细胞受体(TCR)的基因且敲除了Rag1和/或Rag2的人类多能性干细胞”可以通过包括以下步骤的方法制备：(a)诱导具有编码所述抗原特异性TCR的基因的多能性干细胞，以及(b)通过基因组编辑敲除所述多能性干细胞的Rag1和/或Rag2基因。在该实施例中，具有编码所述抗原特异性TCR的基因的多能性干细胞可通过从具有所述期望TCR的T细胞来诱导多能性干细胞而获得。可替代地，编码所述抗原特异性TCR的基因可以被导入到所述多能性干细胞中。
可替代地，“具有编码期望抗原特异性TCR的基因且敲除了Rag1和/或Rag2的人类多能性干细胞”可以通过基因组编辑敲除所述多能性干细胞中的Rag1和/或Rag2基因之后将编码所述抗原特异性TCR的基因导入到所述敲除了Rag1和/或Rag2细胞中。
在本申请中，可以通过基因组编辑在两个等位基因中导入移码突变来敲除Rag1和/或Rag2基因，尤其是，基因组编辑使用CRISPER-Cas 9或TALEN系统。也可通过同源重组来敲除Rag1和/或Rag2基因。
通过敲除多能性干细胞中的Rag1和/或Rag2基因，在具有期望TCR的多能性干细胞分化为T细胞的过程中，不会或不可能发生TCR的重排。因此，由本实施例提供的细胞免疫治疗用T细胞将会是具有期望TCR的单克隆细胞，因而可用于进行安全有效的免疫治疗。
在本申请的另一实施例中，将提供一种细胞免疫治疗用iPS细胞银行，其中与每个供体的HLA信息相关联地存储有来自于具有纯合的HLA单倍型的供体并且敲除了Rag1和/或Rag2的iPS细胞。
形成包含iPS细胞的iPS细胞库的项目现在正在进行中，这些iPS细胞是从来自于具有纯合的HLA单倍型的健康志愿者的细胞建立的，即为不太可能产生排斥反应的iPS细胞(Shin Kaneko，The Medical Frontline，69:724-733，2014)。第二实施例中使用的iPS细胞可从与各健康志愿者(iPS细胞即从其建立)的HLA信息相关联地存储有iPS细胞的iPS细胞库中获取。
该实施例的细胞免疫治疗用iPS细胞银行可用于各种类型的免疫治疗。当用于细胞免疫治疗中时，选择从HLA匹配供体(即待治疗的患者的至少一个HLA单倍型与供体的纯合的HLA单倍型相匹配)建立的iPS细胞，并将用于治疗的编码TCR的基因导入所选的iPS细胞中。导入的TCR的iPS细胞然后分化为T细胞，从而产生适合患者的细胞免疫治疗用T细胞。
在另一个实施例中，提供了一种形成细胞免疫治疗用iPS细胞银行的方法，包括步骤：(1)提供从源自于具有纯合的HLA单倍型的供体的细胞建立的iPS细胞，(2)通过基因组编辑敲除iPS细胞中的Rag1和/或Rag2基因，(3)向步骤(2)中得到的敲除了Rag1和/或Rag2基因的iPS细胞中导入编码期望TCR的基因，以及(4)将由步骤(3)得到iPS细胞与每个供体的HLA信息以及导入的编码TCR的基因的信息相关联地进行存储。在该方法中，将导入有治疗用TCR基因的iPS细胞进行了存储。根据该实施例，能够快速提供细胞免疫治疗用T细胞。
在另一个实施例中，提供了一种诱导细胞免疫治疗用T细胞的方法，包括步骤：(1)从iPS细胞银行选择iPS细胞，该iPS细胞从具有纯合的HLA单倍型的供体的细胞建立，该纯合的HLA单倍型与待治疗的患者的至少一个HLA单倍型相匹配，该iPS细胞银行中与各供体的HLA信息相关联地存储有从源自于具有纯合的HLA单倍型的供体的细胞建立的iPS细胞，(2)通过基因组编辑敲除所选的iPS细胞中的Rag1和/或Rag2基因，(3)向步骤(2)中得到的敲除了Rag1和/或Rag2基因的iPS细胞中导入编码期望TCR的基因，以及(4)将导入了TCR并敲除了Rag1和/或Rag2的iPS细胞分化为T细胞。
在另一个实施例中，提供了一种细胞免疫治疗方法，包括将通过本申请提供的诱导细胞免疫治疗用T细胞的方法得到的T细胞投放至需要治疗的患者。
通过敲除具有期望TCR基因的多能性干细胞中的Rag1和/或Rag2基因，阻止或很好地抑制了在多能性干细胞分化为T细胞过程中的TCR重排。通过该方法诱导的T细胞被用作具有期望TCR的克隆扩增细胞。
在另一个实施例中，提供了一种细胞免疫治疗方法，包括从多能性干细胞诱导T细胞祖细胞或成熟T细胞，该多能性干细胞从具有纯合的HLA单倍型的供体的细胞建立并具有编码期望的抗原特异性TCR的基因，以及将得到的T细胞祖细胞或成熟T细胞投放至受体，该受体的一个或两个HLA单倍型与供体的HLA单倍型相匹配。此外，本申请提供了一种iPS细胞银行，其中与每个供体的HLA信息以及TCR信息相关联地存储有从具有纯合的HLA单倍型的供体的细胞建立并具有编码期望抗原特异性TCR的基因的iPS细胞。
在同种异体移植的情况下，供体的HLA与受体的HLA完全一致的情况几乎不可能找到。T细胞一旦被移植，供体T细胞可能会将HLA错误配对识别为攻击目标。结果导致发生所谓的移植物抗宿主反应，在该反应中一部分移植的供体T细胞攻击受体的细胞。
相比之下，通过本申请的方法诱导的T细胞为带有单一的TCR的克隆扩增细胞，发挥单一T细胞特异性。因此，即使将源自于具有纯合的HLA单倍型的供体的细胞移植到具有杂合的HLA单倍型(其中之一与供体的HLA单倍型相匹配)的受体中(同种异体移植)，导致移植物抗宿主反应的可能性也显著较低。
附图说明
图1为实施例1中建立的iPS细胞集落(iPS cell colony)的照片。
图2为FACS分析结果，示出了从由具有纯合的HLA单倍型的供体的末梢血T细胞建立的T-iPS细胞诱导产生了CD4CD8双阳性细胞。
图3示出了实施例2的结果，其中将从由具有纯合的HLA单倍型的供体的末梢血T细胞建立的T-iPS细胞诱导产生的CD8阳性T细胞用作刺激因子，并且将分别从供体A和供体B的末梢血单核细胞分离的CD8阳性T细胞用作效应细胞。将这些细胞共培养6天，然后通过流式细胞术(flow cytometry)检测细胞分裂。
图4示出了从具有纯合的HLA单倍型的iPS细胞诱导的CD8阳性T细胞没有发生对抗来自具有HLA单倍型(其中之一与iPS细胞的HLA单倍型相匹配)的供体A的细胞的MLR反应。另一方面，所述T细胞发生了对抗具有HLA单倍型(与iPS细胞的HLA单倍型完全不匹配)的供体B的T细胞的MLR反应。
图5示出了从具有纯合的HLA单倍型的iPS细胞诱导的CD8阳性T细胞活化了具有杂合的HLA单倍型(其中之一与iPS细胞的HLA单倍型相匹配)的NK细胞。
图6为FACS分析结果，示出了从实施例4中的健康志愿者的T细胞诱导产生了LMP2四聚体阳性-CD8阳性T细胞。
图7示出在实施例4中使用LMP2肽从取自具有HLA-A2402且曾经感染了EB病毒的健康志愿者的末梢血诱导的T细胞发挥了肽特异性杀伤活性。
图8为从LMP2肽特异性T细胞诱导的iPS细胞集落的照片。
图9为从LMP2肽特异性T细胞建立的T-iPS细胞分化为T细胞的第13天的细胞的FACS分析结果。
图10为从LMP2肽特异性T细胞建立的T-iPS细胞分化为T细胞的第36天的细胞的FACS分析结果。
图11为从LMP2肽特异性T细胞建立的T-iPS细胞分化为T细胞的第41天的细胞的FACS分析结果。确认产生了LMP2特异性成熟T细胞(CTL)。
图12示出了从T-iPS细胞(从LMP2肽特异性T细胞建立)再生的成熟T细胞(CTL)的LMP2特异性杀伤活性。使用LCL作为目标细胞对存在(p+)或不存在(p-)LMP2肽情况下的该杀伤活性进行了观察。
图13示出了从T-iPS细胞(从LMP2肽特异性T细胞建立)再生的成熟T细胞的自然杀伤细胞样活性。
图14为FACS分析结果，示出了在实施例5中从T-iPS细胞(从具有纯合的HLA单倍型的供体的细胞建立)诱导产生了WT1四聚体阳性和CD8阳性细胞。
图15为从WT1肽特异性T细胞建立的iPS细胞集落的照片。
图16为从WT1肽特异性T细胞建立的T-iPS细胞分化为T细胞的第13天的细胞的FACS分析结果。
图17为从WT1肽特异性T细胞建立的T-iPS细胞分化为T细胞的第36天的细胞的FACS分析结果。
图18为实施例6中从导入了TCR的iPS细胞分化的T细胞的FACS分析结果。
图19为实施例7中在敲除了Rag2基因的T-iPS细胞的基因组上的T7E试验结果。
图20示出了实施例7中从T-iPS细胞(TKT3v)和敲除了Rag2的T-iPS细胞(Rag2KO)分化的T细胞的FACS分析结果。
图21示出了使用针对在TKT3v的TCRα链中的V区域和C区域中的各个片段的引物在T-iPS细胞(TKT3v)上进行RT-PCR的结果。
图22示出了：随着CD4CD8双阴性细胞分化为CD4CD8双阳性T细胞，T-iPS细胞(TKT3v)中的Rag2被活化。
图23示出了使用针对在TKT3v的TCRα链中的V区域和C区域中的各个片段的引物在由T-iPS细胞(TKT3v)分化的CD4CD8双阴性T细胞上进行RT-PCR的结果。
图24示出了使用针对在TKT3v的TCRα链中的V区域和C区域中的各个片段的引物在由T-iPS细胞(TKT3v)分化的CD4CD8双阳性T细胞上进行RT-PCR的结果。
图25示出了由敲除了Rag2的TKT3v/Rag2KO iPS细胞分化的DP细胞中的TCRα链重排。
图26示出了从CD4CD8双阳性细胞(由TKT3V/RAG2KO iPS细胞诱导形成)分化形成了CD8单阳性成熟T细胞。
图27示出了：确认了从敲除了Rag2的TKT3v/Rag2KO iPS细胞分化的CD8单阳性T细胞中的TCR链重排。
图28示出了在实施例8中Rag2基因被敲除。
图29示出了实施例9中经过相对长的时间段从T-iPS细胞(WT)和敲除了Rag2的T-iPS细胞(Rag2KO)分化的T细胞的FACS分析结果。
图30示出了实施例9中从敲除了Rag2的T-iPS细胞分化的CD8阳性细胞保持TCR。
具体实施方式
在本申请中，提供了一种诱导细胞免疫治疗用T细胞的方法，包括步骤：
(1)提供具有编码期望的抗原特异性T细胞受体(TCR)的基因且敲除了Rag1和/或Rag2基因的人类多能性干细胞，以及
(2)从步骤(1)的多能性干细胞诱导T细胞。
在说明书和权利要求书中，“多能性干细胞”是指具有多能性(即在体内分化为多种类型的细胞的能力以及自我繁殖的能力)的干细胞。多能性干细胞的例子可以包括胚胎干细胞(ES细胞)、核移植胚胎干细胞(ntES细胞)、生殖干细胞(GS细胞)、胚胎生殖细胞(EG细胞)、诱导多能性干细胞(iPS细胞)以及源自于培养的成纤维细胞和骨髓干细胞的多能性细胞(Muse细胞)。鉴于事实上iPS细胞和Muse细胞可以通过不破坏胚胎而得到，因此优选iPS细胞和Muse细胞。所述多能性干细胞优选为源自哺乳动物的多能性干细胞，并且更优选为人类多能性干细胞。优选使用iPS细胞。
在一个实施例中，具有编码期望抗原特异性TCR的基因并且敲除了Rag1和/或Rag2的人类多能性干细胞可以通过从具有期望TCR的人类T细胞建立iPS细胞之后敲除所建立的iPS细胞(T-iPS细胞)中的Rag1和/或Rag2基因而得到。
在说明书和权利要求书中，“T细胞”是指表达抗原的受体(称为T细胞受体(TCR))的细胞。据报道(WO2011/096482；Vizcardo等,Cell Stem Cell 12，31-36，2013；以及Nishimura T等，Cell Stem Cell，114-126,2013)，事实上T细胞的TCR保持在由T细胞建立的iPS细胞中。
用作iPS细胞的源的T细胞可优选为除了表达CD3之外、还表达CD4和CD8中的至少一个的T细胞。优选的人类T细胞的例子可以包括：辅助/调节性T细胞，即CD4阳性细胞；细胞毒性T细胞，即CD8阳性细胞；初始T细胞，即CD45RA+CD62L+细胞；中枢记忆T细胞，即CD45RA-CD62L+细胞；效应记忆T细胞，即CD45RA-CD62L-细胞；以及末端效应T细胞，即CD45RA+CD62L-细胞。
可以通过已知的方法将人类T细胞从人类组织中分离出来。人类组织没有特别限制，只要该组织含有上述类型的T细胞即可，其例子包括末梢血、淋巴结、骨髓、胸腺、脾脏、脐带血和病变部位组织。其中，优选末梢血和脐带血，因为这二者可以较少损伤地从人体取得且易于制备。分离人类T细胞的已知方法包括，例如，使用定向至细胞表面标记(比如CD4)的抗体的流式细胞计术，以及如以下实施例所示的细胞分选仪。可替代地，通过检测细胞因子的分泌或作为指示剂的功能分子的表达来分离期望的T细胞。在这种情况下，例如，T细胞根据其是否为Th1或Th2型而分泌不同的细胞因子，因而期望Th型的T细胞能够通过使用细胞因子作为指示剂来选择T细胞而进行分离。同样地，细胞毒性(杀伤)T细胞能够利用作为指示剂的沉淀酶(granzyme)、穿孔素等的分泌或产生来进行分离。
“具有期望抗原特异性TCR的T细胞”可以为具有从供体获得或源自于供体的TCR的细胞毒性T淋巴细胞。例如，癌抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞可以通过常规方法将从供体获得的淋巴细胞与对待治疗的癌症特异的癌抗原进行共培养而制备。已经为多种癌症识别出癌抗原，并且使用癌抗原或其表位肽来诱导细胞毒性T淋巴细胞的方法也已广为人知。可替代地，淋巴细胞可与待治疗的癌细胞共培养。
可替代地，对待治疗的癌症的癌抗原特异的细胞毒性T淋巴细胞可从患有癌症的患者的末梢血来诱导。
“期望抗原特异性人类T细胞”可通过使用与抗原结合的主要组织相容性复合体的四聚体(MHC四聚体)从含有抗原特异性T细胞的人类细胞培养物或人类组织中分离。
诱导的多能性干(iPS)细胞可以通过向体细胞中导入特定的重编程因子而制备。iPS细胞为源自体细胞的人工干细胞并具有几乎与这些ES细胞等同的性能(K.Takahashi和S.Yamanaka，Cell，126：663-676，2006；K.Takahashi等，Cell，131：861-872，2007；J.Yu等，Science，318：1917-1920，2007；Nakagawa M.等，Nat.Biotechnol，26：101-106，2008；以及WO 2007/069666)。重编程因子可由专门在ES细胞中被表达的基因或这些基因的基因产物、或非编码RNA构成；或者由在保持ES细胞的未分化状态方面发挥重要作用的基因或这些基因的基因产物、非编码RNA或低分子量的化合物构成。包括在重编程因子中的基因的例子包括Oct3/4、Sox2、Sox1、Sox3、Sox15、Sox17、Klf4、Klf2、c-Myc、N-Myc、L-Myc、Nanog、Lin28、Fbx15、ERas、ECAT15-2、Tcll、beta-catenin、Lin28b、Sall1、Sall4、Esrrb、Nr5a2、Tbx3以及Glis1，这些重编程因子可单独使用或组合使用。重编程因子的组合的例子包括在以下文献中描述的那些：WO2007/069666；WO2008/118820；WO2009/007852；WO2009/032194；WO2009/058413；WO2009/057831；WO2009/075119；WO2009/079007；WO2009/091659；WO2009/101084；WO2009/101407；WO2009/102983；WO2009/114949；WO2009/117439；WO2009/126250；WO2009/126251；WO2009/126655；WO2009/157593；WO2010/009015；WO2010/033906；WO2010/033920；WO2010/042800；WO2010/050626；WO2010/056831；WO2010/068955；WO2010/098419；WO2010/102267；WO2010/111409；WO 2010/111422；WO2010/115050；WO2010/124290；WO2010/147395；WO2010/147612；Huangfu D等，Nat.Biotechnol，26：795-797，2008；Shi Y等，CellStem Cell，2：525-528，2008；Eminli S等，Stem Cells，26：2467-2474，2008；Huangfu D等，Nat Biotechnol，26：1269-1275，2008；Shi Y等，Cell Stem Cell，3：568-574，2008；Zhao Y等，Cell Stem Cell，3：475-479，2008；Marson A，Cell Stem Cell，3：132-135，2008；FengB等，Nat Cell Biol.，11：197-203，2009；R.L.Judson等，Nat Biotech.，27：459-461，2009；Lyssiotis CA等，Proc Natl Acad Sci U S A，106：8912-8917，2009；Kim JB等，Nature，461：649-643，2009；Ichida JK等，Cell Stem Cell，5：491-503，2009；Heng JC等，CellStem Cell，6：167-74，2010；Han J等，Nature，463：1096-100，2010；Mali P等，Stem Cells，28：713-720，2010；以及Maekawa M等，Nature，474：225-9，2011。本段所引用的文献的内容以引用的方式结合于此。
可编程因子可通过已知的方法(该方法适用于所使用的因子的形式)与体细胞相接触或导入到体细胞中。
在重编程因子是以蛋白质的形成的情况下，可通过某种方法(比如，脂质体转染、与细胞渗透性肽(例如，由源自于HIV的TAT或聚精氨酸)的融合、或显微注射)将重编程因子导入到体细胞中。
在重编程因子是以DNA的形式的情况下，可通过某种方法(比如使用病毒、质粒和人工染色体的载体；脂质体转染法；使用脂质体；或显微注射)将重编程因子导入到体细胞中。病毒载体的例子包括逆转录病毒载体、慢病毒载体(见述于：Cell，126：663-676，2006；Cell，131：861-872，2007；以及Science，318：1917-1920，2007)、腺病毒载体(Science，322：945-949，2008)，腺相关病毒载体以及仙台病毒载体(WO2010/008054)。人工染色体载体的例子包括人类人工染色体(HAC)、酵母人工染色体(YAC)以及细菌人工染色体(BAC和PAC)。可利用的质粒的例子包括用于哺乳动物细胞的质粒(Science，322：949-953，2008)。载体可以包含使核重编程因子能够表达的启动子(promoter)、增强子(enhancer)、核糖体结合序列、终止子(terminator)和/或多聚腺苷酸化位点；(根据需要)诸如耐药基因(例如，卡那霉素抗性基因(kanamycin-resistant gene)，氨苄青霉素抗性基因(ampicillin-resistantgene)或嘌呤霉素抗性基因(puromycin-resistant gene))的筛选标记的序列、胸苷激酶基因或白喉毒素基因；报道基因(reporter)(如绿色荧光蛋白(GFP)、β-葡萄糖苷酸酶(β-glucuronidase)(GUS)或FLAG)的基因序列。此外，在将基因导入到体细胞中并且基因表达之后，为了移除编码重编程因子的基因或同时移除促进剂和与其链接的编码重编程因子的基因，载体可具有LoxP序列上游和这些序列的下游。
此外，在重编程因子是以RNA的形式的情况下，可将每个重编程因子通过某种方法(比如脂质体转染或显微注射)导入体细胞中，为了抑制降解，可以使用其中结合有5-甲基胞苷和假尿苷(TriLink Biotechnologies)的RNA(Warren L，Cell Stem Cell，7：618-630，2010)。本段所引用的文献以引用的形式结合于此。
用于诱导iPS细胞的培养液的例子包括DMEM培养液、DMEM/F12培养液以及补加有DME 10-15％FBS的DME培养液(这些培养液可以进一步含有LIF、青霉素/链霉素、嘌呤霉素，L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、β-巯基乙醇和/或其类似物，如适用)；以及例如市售的培养液(例如，培养小鼠ES细胞用的培养液(TX-WES培养液、Thromb-x)、培养灵长类ES细胞用的培养液(灵长类ES/iPS细胞用培养液、ReproCELL)、以及无血清培养液(mTeSR，StemcellTechnology))。
诱导iPS细胞的方法的各个实施例包括一种方法，在该方法中，在37℃并存在5％CO2的条件下在DMEM培养液或补加有10％FBS的DMEM/F12培养液中使体细胞和重编程因子相互接触，然后进行约4-7天的细胞培养，之后将细胞接种到饲养细胞(例如，丝裂霉素C处理的STO细胞或SNL细胞)上并在体细胞和重编程因子接触的10天之后在含有bFGF的培养液中开始培养灵长类ES细胞，从而使ES样集落(colony)在接触之后的约30到约45天或更晚时出现。
另外，这些细胞可与重编程因子接触并在37℃且存在5％CO2的条件下在补加有10％FBS的DMEM培养液(这种培养液还可进一步含有LIF、青霉素/链霉素、嘌呤霉素、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、β-巯基乙醇等，如适用)中的饲养细胞(如丝裂霉素C处理的STO细胞或SNL细胞)上进行培养约25-30天或更长，从而使ES样集落出现。该培养方法的优选实施例包括一种使用被重编程的体细胞本身代替饲养细胞的方法(Takahashi K等，PLoS One，4：e8067，2009；或WO2010/137746)以及一种替代使用细胞外基质(例如，层粘连蛋白-5(WO2009/123349)、层粘连蛋白-10(US2008/0213885)或其片段(WO2011/043405)或基质胶(BD))的方法。本段所引用的文献以引用的形式结合于此。
其它的实施例包括一种使用无血清培养液建立iPS细胞的方法(Sun N等，ProcNatl Acad Sci USA，106：15720-15725，2009)。此外，为了提高建立效率，可以在低氧条件下(在0.1％-15％的氧浓度下)生成iPS细胞(Yoshida Y等，Cell Stem Cell，5：237-241，2009；或WO2010/013845)。本段所引用的文献的内容以引用的方式结合于此。
用于提高建立效率所述使用的因子(factor)的例子可以包括组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制因子(例如，小分子抑制因子，比如丙戊酸(VPA)、曲古抑菌素A、丁酸钠、MC1293和M344；基于核酸的表达抑制因子，比如针对HDAC的siRNA和shRNA(例如，HDAC1 siRNAsmartpool，注册商标(Millipore))，针对HDAC1(OriGene)的HuSH 29mer shRNAConstructs等；等等)、MEK抑制因子(例如，PD184352、PD98059、U0126、SL327和PD0325901)、糖原合成酶激酶-3抑制子(例如，Bio和CHIR99021)、DNA甲基转移酶抑制因子(例如，5-氮杂胞苷)、组蛋白甲基转移酶抑制因子(例如，小分子抑制因子，比如BIX-01294；基于核酸的表达抑制因子，比如针对Suv39h1、Suv39h2,SetDB1和G9a的siRNA和shRNA)、L型通道钙激动剂(例如，BayK8644)、丁酸、TGFβ抑制因子或ALK5抑制剂(例如，LY364947、SB431542、616453和A-83-01)、p53抑制因子(例如，针对p53的siRNA和shRNA)，ARID3A抑制因子(例如，针对ARID3A的siRNA和shRNA)、miRNA(比如miR-291-3p、miR-294、miR-295、mir-302等)、Wnt信号(Wnt Signaling)(例如，可溶性Wnt3a)、神经肽Y、前列腺素(例如，前列腺素E2和前列腺素J2)、hTERT、SV40LT、UTF1、IRX6、GLIS1、PITX2、DMRTB1等。在建立iPS细胞后，可采用在培养液中加入提高生成效率的因子。
在培养过程中，从培养的第2天起每天使用新鲜培养液对培养液进行更换。用于核重编程的体细胞数量是没有限制的，通常在培养板上每100cm2面积有约5×103到约5×l06个细胞。
iPS细胞可以基于各形成集落的形状进行选择。在药物抗性基因作为标记基因被导入的情况下，当体细胞被重编程时，耐药基因连同被表达的基因一起被表达(例如，Oct3/4或Nanog)，可以通过在含有相应药物的培养液(选择培养液)中培养细胞来选择所建立的iPS细胞。此外，当标记基因为荧光蛋白基因时，可以通过在荧光显微镜下进行观察来选择iPS细胞。
根据已知方法(比如可参见：Le Cong等，Science，39：819，2013；或Prashant Mali等，Science，39：823，2013)，利用已知的基因组编辑系统(比如CRISPER-Cas9或TALEN)或借助同源重组，可以通过基因组编辑而从T-iPS细胞中敲除Rag1和/或Rag2基因。
CRISPER-Cas9是一种简单而有效的基因组编辑方法，其在基因组的特定部位中导入造成功能缺陷的突变。通过制备指向所述基因组的特定部分的单导向RNA(sgRNA)能够将目标基因灭活，在结合sgRNA的基因组部位导入Cas9核酸酶而切断双链DNA，然后，引起灭活目标基因功能的移码插入缺失突变(frame shift indel mutation)。Rag1和/或Rag2敲除可以通过任何一种已知的基因组编辑方法进行。
在另一个实施例中，“具有期望抗原特异性TCR且敲除了Rag1和/或Rag2的人类多能性干细胞”可以通过基因组编辑来从人类多能性干细胞中敲除Rag1和/或Rag2基因之后向敲除了Rag1和/或Rag2的人类多能性干细胞中导入编码所述抗原特异性TCR的基因而制备。
在该实施例中，人类多能性干细胞可以为从待通过免疫疗法治疗的患者的体细胞建立的iPS细胞，或者从具有与患者的HLA匹配至预定程度的HLA的人的体细胞建立的iPS细胞。可替代地，iPS细胞可以从已经从供体的体细胞建立并与各供体的HLA信息相关联地被存储的那些细胞中进行选择。
例如，iPS细胞可以为具有与待治疗患者的HLA单倍型中的至少一个相匹配的一个HLA单倍型的那些，并可从iPS细胞银行(其中与各供体的HLA信息相关地存储有从具有纯合的HLA单倍型的供体的细胞建立的iPS细胞)中进行选择。
在说明书和权利要求书中使用的术语“体细胞”是指动物细胞(优选包括人类的哺乳动物)，而不是生殖系细胞或多能性细胞(比如精子、精母细胞、卵子、卵母细胞和ES细胞)。体细胞的例子包括但不限于：任何胎儿体细胞，新生儿体细胞，以及成熟体细胞、健康体细胞和病变体细胞，以及任何初代培养的细胞，继代培养的细胞和建立的细胞株。体细胞的具体例子包括但不限于：(1)组织干细胞(成体干细胞)，比如神经干细胞、造血干细胞、间充质干细胞和牙髓干细胞；(2)组织祖细胞；以及(3)分化的细胞，比如淋巴细胞、上皮细胞、内皮细胞、肌细胞、成纤维细胞(皮肤细胞等)、毛细胞、肝细胞、胃粘膜细胞、肠细胞、脾细胞、胰腺细胞(胰腺外分泌细胞等)、脑细胞、肺细胞、肾细胞和脂肪细胞。鉴于侵袭性较低，优选源自于末梢血、皮肤和脐带血的细胞。
可按照上述解释的从T-iPS细胞中敲除Rag1和/或Rag2基因相同的方法敲除iPS细胞中的Rag2基因。
将编码期望抗原特异性TCR的基因导入到敲除了Rag1和/或Rag2的iPS细胞中。
已经报道了编码多种癌症抗原特异性TCR的基因。TCR基因可以从期望抗原(分离自患有癌症或传染病的患者)特异性T细胞获得。可从这些得到的T细胞中分离TCR基因。在本申请中，可以将编码抗原特异性TCR的基因导入到iPS细胞(从供体细胞建立)。例如，该方法过程可参见：Morgan R.A.等，Science，314:126，2006(该文献以引用的形式结合于此)。特别地，可以将含有TCR基因的适合载体导入到iPS细胞中。例如，可以通过载体(比如病毒、质粒和人工染色体载体)或通过脂质体转染、脂质体或显微注射来导入TCR基因。病毒载体的例子包括逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体和仙台病毒载体。人工染色体载体的例子包括人类人工染色体(HAC)、酵母人工染色体(YAC)和细菌人工染色体(BAC和PAC)。可用的质粒的例子包括哺乳动物细胞用质粒。载体可以含有调控序列，比如启动子、增强因子、核糖体结合序列、终止子和/或多聚腺苷酸化位点，从而能够使TCR基因表达。如果需要，载体还可以含有筛选标记，比如耐药基因(例如，卡那霉素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因或嘌呤霉素抗性基因)，胸苷激酶基因或白喉毒素基因；以及报告基因，比如绿色荧光蛋白(GFP)、β-葡萄糖苷酸酶(GUS)或FLAG。
在本说明书中，通过导入TCR基因而得到的iPS细胞被称为“TCR-iPS细胞”。T细胞是从敲除了Rag1和/或Rag2的T-iPS或TCR-iPS细胞分化而来。将多能性干细胞分化为T细胞的方法可参见：Timmermans等，Journal of Immunology，2009，182：6879-6888；NishimuraT等，2013，Cell Stem Cell，114-126；WO 2013176197 A1以及WO 2011096482 A1。
T细胞粗分裂为αβT细胞和γδT细胞。αβT细胞包括杀伤T细胞(killer T cell)和辅助T细胞(helper T cell)。本说明书和权利要求书中的“从iPS细胞分化的T细胞”涵盖所有类型的T细胞。T细胞可涵盖任何T祖细胞和成熟T细胞。优选地，T细胞可以为除了表达CD3之外还表达CD4和CD8中的至少一个的那些。
在至今提出的各种疗法(其中各种细胞或组织而不是从iPS细胞分化的T细胞被移植)中，期望将被移植的细胞固定在患者的体内且伴随他/她的整个生命。在使用从同种异体移植用iPS细胞库再生的细胞或组织的再生治疗中，患者在其整个生命当中都需要服用免疫抑制药物。
另一方面，同种异体移植物将最终由于次要组织相容性抗原的错误配对(甚至在HLA配对的供体和受体中)而被排斥。在这一点上，相比其它从iPS细胞再生的细胞或组织的同种异体移植，本申请提供的细胞免疫疗法具有不可预料的优势。
在本申请的一个实施例中，提供了一种细胞免疫治疗用iPS细胞银行。iPS细胞银行可以通过使用源自于具有纯合的HLA单倍型的供体的细胞而形成。iPS细胞银行可以为存储有与每个供体的HLA信息相关联的敲除了Rag2的iPS细胞的那些，敲除了Rag2的iPS细胞是通过从具有纯合的HLA单倍型的供体的细胞建立iPS细胞并敲除iPS细胞中的Rag1和/或Rag2基因而得到的。
可代替地，细胞免疫治疗用细胞银行可以是存储有从T-iPS细胞或TCR-iPS细胞再生的T细胞祖细胞或成熟T细胞的那些。储存再生的T细胞的优点可以在于：不仅缩短了开始治疗前所需的准备时间，而且使得在移植前检验细胞的质量成为可能。
以本申请的细胞免疫治疗中，将再生的T细胞分散在适合的培养液(比如生理盐水或PBS)中，然后可将分散物投放至具有HLA单倍型(其中至少有一个与供体的HLA单倍型相匹配)的患者。可通过静脉注射(intravenously)来投放细胞。
细胞的投放数量没有限制，并可根据例如患者的年龄、性别、身高和体重、待治疗的疾病和病情来确定。最佳的细胞数可由临床研究来确定。
T细胞可攻击各种抗原，因此本申请的方法可以通过选择适用于治疗的TCR而应用于针对各种疾病(包括但不限于癌症、传染病、自身免疫性疾病和过敏症)的细胞免疫治疗。
本申请还提供了一种细胞免疫治疗的方法，包括：从iPS细胞(从具有纯合的HLA单倍型的供体的细胞建立)诱导T细胞祖细胞或成熟T细胞，以及将T细胞祖细胞或成熟T细胞投放至患者(其至少一个HLA单倍型与供体的HLA单倍型相匹配)。此外，本申请提供了一种iPS细胞银行，其中与每个供体的HLA信息相关联地存储有具有编码期望抗原特异性TCR的基因的iPS细胞(从具有纯合的HLA单倍型的供体的细胞建立)。
如实施例4和实施例5，通过在T-iPS细胞向T细胞分化的早期阶段采用抗原刺激(即使还没有从T-iPS细胞敲除Rag1和/或Rag2基因)，有可能再生出保留原始T细胞(从其建立T-iPS细胞)的抗原特异性的T细胞。在本申请中，还提供了一种由没有敲除Rag1和/或Rag2基因的T-iPS细胞或TCR-iPS细胞形成的iPS细胞银行。本申请将通过以下实施例进行更加详细的阐释。
实施例1
从具有纯合的HLA单倍型的T细胞建立iPS细胞以及从由此获得的iPS细胞再生T细胞。
使用从具有HLA-A*3303-B*4403-C*1403-ERB1*1302纯合子的供体获得的末梢血。
1)Homo-T-iPS细胞的建立
所使用的培养液如下：
【表1】
T细胞用培养液(T细胞培养液)
| 量 | 最终浓度 | |
| RPMI | 45ml | |
| 人类AB血清 | 5ml | 10％ |
| 总量 | 50ml |
A.CD8阳性T细胞的活化
1.使用Ficoll对从健康志愿者获得的末梢血单核细胞进行精制，并使用MACS珠富集CD8阳性细胞。
2.将富集的细胞分散在T细胞培养液中并加入IL-2(最终浓度：30U/mL)、IL-7(最终浓度：5ng/mL)和IL-15(最终浓度：1ng/mL)。添加Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28形成珠-细胞比例为1:1，将混合物培养2天从而活化CD8阳性细胞。
B.借助仙台病毒载体导入四山中因子(Four Yamanaka factors)和SV40。
1.将活化的CD8阳性细胞分散在T细胞培养液中，然后将结合有四山中因子和SV40的仙台病毒添加到该培养液中，将细胞悬浮液培养2天。
2.得到的细胞用T细胞培养液进行清洗，然后加入到添加有IL-2(最终浓度：30U/mL)、IL-7(最终浓度：5ng/mL)和IL-15(终浓度：1ng/mL)的T细胞培养液中。对细胞进一步培养2天。
3.之后，收集所有的细胞并将其分散在添加有IL-2(最终浓度：30U/mL)的T细胞培养液中。然后将细胞悬浮液接种在饲养细胞上。
4.2天后，用新鲜的iPS细胞培养液更换一半的培养液。之后，每天用新鲜的iPS细胞培养液更换一半的培养液，对细胞进行连续培养。
C.拾取iPS细胞集落
1.导入山中因子三周后，目视观察iPS细胞的集落。
2.使用200μL的吸头机械拾取集落。
3.单独地建立数个克隆集落。得到的克隆集落的集落的照片如图1所示。
2)从iPS细胞分化T细胞
使用的培养液如下：
【表2】
培养液A：用于维持OP9基质细胞
| 所含物 | 添加量 | 最终浓度 |
| αMEM培养液 | 500mL | |
| FCS | 125mL | 20％ |
| 青霉素-链霉素溶液* | 6.25mL | 1％ |
| 总量 | 631.25mL |
*青霉素(10000U/mL)和链霉素(10000μg/mL)的混合物。最终浓度分别为100U/mL和100μg/mL。
【表3】
培养液B：用于诱导T细胞的分化
| 所含物 | 添加量 | 最终浓度 |
| αMEM培养液 | 500mL | |
| FCS | 125mL | 20％ |
| 青霉素-链霉素溶液* | 5mL | 1％ |
| hrIL-7(stock:10μg/mL) | 315μL | 5ng/mL |
| hrFlT-3L(stock:10μg/mL) | 315μL | 5ng/mL |
| hrSCF(stock:10μg/mL) | 630μL | 10ng/mL |
| 总量 | 631.26mL |
*青霉素(10000U/mL)和链霉素(10000μg/mL)的混合物。最终浓度分别为100U/mL和100μg/mL。
OP9细胞的制备
将六毫升(6ml)的0.1％明胶溶液(在PBS中)添加到一个10cm的培养皿(Falcon)并在37℃下培养30分钟以上。使用胰蛋白酶/EDTA溶液将OP9基质细胞从汇合培养皿(confluent culture dish)分离，将约1/4所得细胞加入到涂布明胶的10cm细胞培养皿。将10mL的培养液A加入细胞培养皿。四天后，将10mL的培养液A加入培养皿(最终量为20mL)。
从iPS细胞诱导造血祖细胞
吸出共培养用OP9基质细胞培养物中的培养液并用新鲜培养液A更换。吸出人类iPS细胞培养皿中的培养液，然后加入10mL的新鲜培养液A。使用EZ-passage辊切割人类iPS细胞块(human iPS cell mass)。使用带有200μL吸头的吸管将切割得到的iPS细胞块悬置。目测计算iPS细胞簇(iPS cell cluster)的数量，并将约600个细胞簇接种于OP9细胞上。每次iPS细胞的克隆使用三个或更多培养皿，当继代培养时，将所有培养皿中的细胞一次汇集在一个培养皿中，然后重新分配到相同数目的培养皿中，从而降低不同培养皿之间的差异。
第1天：(更换培养液)
观察iPS细胞块是否粘附到培养皿以及是否开始细胞分化。用20mL的新鲜培养液A更换细胞培养液。
第5天：(更换一半的培养液)
用10mL的新鲜培养液A更换一半的细胞培养液。
第9天：(更换一半的培养液)
用10mL的新鲜培养液A更换一半的细胞培养液。
第13天：(将诱导的中胚层细胞从OP9细胞层转移到OP9/DLL1细胞层)
吸取去除细胞培养的培养液，并使用HBSS(+Mg+Ca)洗掉培养细胞表面的培养液。将10mL的胶原酶IV 250U(在HBSS(+Mg+Ca)溶液中)添加到培养皿中，然后在37℃培养45分钟。
吸取去除胶原酶溶液并使用10mL PBS(-)清洗细胞。然后，将0.05％胰蛋白酶/EDTA溶液添加到培养皿，在37℃培养20分钟。培养之后，从培养皿的底部剥离片状细胞聚集体，然后通过吹吸将细胞聚集体机械破碎至较小的尺寸。将如此处理的细胞加入20mL新鲜培养液A，并在37℃培养45分钟。将含有悬浮细胞的培养液过100μm筛并收集细胞。然后将细胞在4℃以1200rpm离心7分钟。将得到的沉淀悬浮于10mL的培养液B中。分离出十分之一的悬浮液用于FACS分析。剩余的细胞悬浮液接种到含有OP9/DLL1细胞的多个新培养皿上。将数个培养皿的细胞悬浮液进行汇合，然后重新分配到相同数目的培养皿。
为了确定得到的细胞当中是否含有造血祖细胞中，使用抗CD34抗体和抗CD43抗体进行FACS分析。结果如图4所示。可以确认足够数量的细胞是在CD34lowCD43+细胞分级，因此确认诱导形成了造血祖细胞。
C.从造血祖细胞诱导T细胞。
然后，得到的细胞接种于含OP9/DLL1细胞的多个新培养皿。在这一步骤中，不进行CD34lowCD43+细胞分级的细胞分选。相比于不进行分选的情况，当此分级被分选时，由于分选造成的细胞减少或损失，T细胞的分化效率可能会降低。
在培养期间，进行了几次FACS分析用以确认分化阶段。在培养期间观察到大量的死亡细胞。优选地，在FACS分析之前，通过使用例如碘化丙啶(PI)或7-AAD将死亡细胞消除。
第16天：(细胞的继代培养)
通过轻轻几次吹吸将松散地粘附于OP9/DLL1细胞的细胞解离。将细胞过100μm筛，并收集到一个50mL锥形管中。将锥形管在4℃以1200rpm离心7分钟。将沉淀分散在10mL培养液B中。然后将制得的细胞接种到一个新培养皿中的OP9/DLL1细胞上。
第23天：(细胞的继代培养)血细胞集落开始出现。
通过轻轻几次吹吸将松散地粘附于OP9/DLL1细胞的细胞解离。将细胞过100μm筛，并收集到一个50mL锥形管中。将锥形管在4℃以1200rpm离心7分钟。然后将沉淀分散在10mL培养液B中。然后将制得的细胞接种到含有OP9/DLL1细胞的多个新培养皿上。
第30天：(细胞的继代培养)
通过轻轻几次吹吸将松散地粘附于OP9/DLL1细胞的细胞解离。将细胞过100μm筛，并收集到一个50mL锥形管中。将锥形管在4℃以1200rpm离心7分钟。然后将沉淀分散在10mL培养液B中。然后将制得的细胞接种到含有OP9/DLL1细胞的多个新培养皿上。
第37天：(细胞的继代培养)
通过轻轻几次吹吸将松散地粘附于OP9/DLL1细胞的细胞解离。将细胞过100μm筛，并收集到一个50mL锥形管中。将锥形管在4℃以1200rpm离心7分钟。然后将沉淀分散在10mL培养液B中。然后将制得的细胞接种到含有OP9/DLL1细胞的多个新培养皿上。
第44天：CD4+CD8+T细胞被确认
为了确认如愿地诱导形成了T细胞，使用抗CD4抗体和抗CD8抗体对第44天的细胞进行了FACS分析。结果如图2所示。确认生成了CD4CD8双阳性细胞。
如上所示，成功地从具有纯合的HLA单倍型的供体的末梢血建立了iPS细胞，并且成功地从得到的iPS细胞再生出T细胞。
实施例2
1.从实施例1中生成的T-iPS细胞诱导CD8阳性T细胞。
2.采用实施例1中获得的具有纯合的HLA单倍型的iPS细胞克隆集落。选定供体A(其HLA单倍型中至少有一个与iPS细胞的HLA单倍型相匹配)和供体B(其HLA单倍型与iPS细胞的HLA单倍型都完全不匹配)。
供体A：HLA-A*31:01/33:03；B*44:03/48:01；C*04:01/14:03；DRB1*04:03/13:02
供体B：HLA-A*24:02/24:02；B*07:02/52:01；C*07:02/12:02；DRB1*01:01/15:02
3.采用Ficoll从供体A和供体B的末梢血中精制单核细胞，并通过CD8微珠富集CD8阳性细胞。
4.利用从T-iPS细胞再生的CD8阳性T细胞作为刺激因子进行混合淋巴细胞反应(MLR)。将从供体获得的CD8细胞用作效应因子。使用Cell Trace紫细胞增殖试剂盒(CellTrace Violet Cell Proliferation Kit)对效应细胞进行荧光标记。采用Cell TraceCFSF细胞增殖试剂盒(Cell Trace CFSF Cell Proliferation Kit)对刺激细胞进行荧光标记。
5.将效应细胞和刺激细胞进行混合，使效应细胞/刺激细胞的比例为1:1(各有1×105个细胞)，然后将细胞共培养6天。在共培养的第3天，将IL-2(12.5U/mL)、IL-7(5ng/mL)、IL-21(10ng/mL)以及抗CD28抗体(2ng/mL)添加到培养液中。
6.在共培养的第6天，通过流式细胞术检测细胞分裂情况。结果如图3所示。上面几张图示出了使用源自于供体A的T细胞(效应细胞)情况下获得的结果，下面几张图示出了使用源自于供体B的T细胞情况下获得的结果。
7.图4示出了通过特定MLR诱导的细胞增殖的比例。从具有纯合的HLA单倍型的iPS细胞再生的CD8阳性T细胞没有发生对抗供体A(其HLA单倍型之一与iPS细胞的HLA相匹配)的细胞的MLR反应。另一方面，T细胞发生了对抗供体B(其HLA单倍型与iPS细胞的HLA单倍型都不匹配)的T细胞的MLR反应。
基于上述结果，从具有纯合的HLA单倍型的iPS细胞再生的CD8阳性T细胞没有活化具有杂合的HLA单倍型(其中之一与iPS细胞相匹配)的T细胞。因此，从具有纯合的HLA单倍型的iPS细胞再生的CTL没有发生针对具有杂合的HLA单倍型(其中之一与iPS细胞相匹配)的受试者的移植物抗宿主病，因此，可使用这些CTL有效地地进行细胞免疫治疗。
实施例3
借助常规方法将实施例1中获得的具有纯合的HLA单倍型的T-iPS细胞分化为CD8阳性T细胞(CTL)。对CTL是否将源自于具有杂合的HLA单倍型(其中之一与iPS细胞的HLA单倍型相匹配)的受试者的末梢血的NK细胞活化进行了检查。
1.将实施例1中通过常规方法从具有纯合的HLA单倍型的iPS细胞分化的CD8阳性T细胞作用刺激因子。
2.通过常规方法从具有杂合的HLA单倍型(其中之一与刺激细胞的HLA单倍型相匹配)的供体A的细胞建立iPS细胞，并通过常规方法将得到的iPS细胞分化为CD8阳性T细胞。并将得到的CD8阳性T细胞也用作刺激因子。
3.获取供体A的末梢血，并利用Ficoll分离出末梢血单核细胞(PBMC)。使用CD3、CD4、CD8、CD14和CD19微珠通过阴性筛选从PBMC富集NK细胞。并将获得的NK细胞用作效应因子。
4.将刺激因子(即再生的CD8阳性T细胞)和效应因子(即NK细胞)进行混合，使得效应/刺激细胞的比例为1:1(各1×105个细胞)并将细胞在添加有IL-2(1000U/ml)和抗CD107a抗体的培养液中共培养6小时。
5.共培养6小时后，通过流式细胞术检测NK细胞的活化情况。结果如图5所示。
6.从由供体A的细胞建立的iPS细胞分化的CD8阳性T细胞没有活化源自于供体A的NK细胞。另一方面，从具有纯合的HLA单倍型的iPS细胞分化的CD8阳性T细胞活化了源自于供体A(其HLA单倍型之一与所述纯合的HLA单体型相匹配)的NK细胞。
7.根据以上结果，发明人得出如下结论。
从具有纯合的HLA单倍型的iPS细胞分化的CD8阳性T细胞活化了具有杂合的HLA单倍型(其中之一与所述纯合的HLA单体型相匹配)的NK细胞。因此，当将从具有纯合的HLA单倍型的iPS细胞再生的成熟T细胞或CTL移植到具有杂合的HLA单倍型(其中之一与供体的HLA单倍型相匹配)的受体中，在NK细胞的作用下移植的T细胞将逐渐被消除。因此，可将通过本申请的方法得到的T细胞用于安全治疗，并显著减小移植细胞癌变的危险。
根据实施例2的结果，当受体具有至少一个与供体的HLA单倍型相匹配的HLA单倍型时，受体的T细胞不对抗从iPS细胞(从具有纯合的HLA单倍型的供体的细胞建立)再生的T细胞。相比当再生细胞为其它有核细胞时，当移植细胞为淋巴细胞时，从具有纯合的HLA单倍型的供体向具有杂合的HLA单倍型(其中之一与纯合的HLA单倍型相匹配)的受体的移植(异源移植物)将更有利。根据实施例3，从具有纯合的HLA单倍型的供体向具有杂合的HLA单倍型的受体的移植之后，NK细胞会排斥来自供体的细胞。通过这种机制，移植的淋巴细胞最终被排斥，因此，该方法能够避免移植的淋巴细胞变癌的危险。
实施例4
从LMP2抗原特异性T细胞(源自于EB病毒携带者的末梢血单核细胞)建立的T-iPS细胞。T-iPS细胞分化为LMP2抗原特异性CTL。
急性期中的EB病毒感染可引起传染性单核细胞增多症，并且有时导致癌症，比如barkitt淋巴瘤。在本实施例中，T细胞的供体为曾感染过EB病毒的健康人。一旦感染，这种病毒会在整个生命当中保留在淋巴细胞中，因此，供体为EB病毒携带者。供体因此被认为是具有慢性EB病毒感染。
1)LMP2抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的繁殖
i)使用以下培养液。
树状细胞用培养液：CellGro(CellGenix)
【表4】
T细胞用培养液(T细胞培养液)：
| 量 | 最终浓度 | |
| RPMI | 45ml | |
| 人类AB血清 | 5ml | 10％ |
| 总量 | 50ml |
ii)使用的LMP2抗原肽如下。
LMP2：IYVLVMLVL(序列号：1)
LMP2四聚体购自MBL。
iii)使用的LCL(淋巴母细胞株，Lymphoblastoid cell line)如下。
使用在日本京都的京都大学的药学研究生院血液和肿瘤科从健康志愿者(曾感染EB病毒)建立的具有HLA-A2402的淋巴母细胞株(LCL)。
A.从人类末梢血诱导源自于人类单核细胞的树状细胞(MoDC)
1.从具有HLA-A2402的健康志愿者(曾感染EB病毒)获取末梢血。采用CD14微珠从血液中分离单核细胞。对细胞进行清洗，然后加入树状细胞用培养液，得到5×105个细胞/mL的悬浮液。
2.将细胞因子添加到细胞悬浮液中，得到最终浓度GM-CSF800U/mL(或50ng/mL)、IL-4 200U/mL(或40ng/mL)。在六孔板的每个孔中接种五毫升(5mL)的细胞悬浮液。在5％CO2以及37℃条件下对六孔板进行培养。
3.对六孔板培养3天，并在第3天从每个孔中轻轻移除2.5mL的培养上清液。在新鲜的树状细胞用培养液中添加GM-CSF和IL-4，得到最终浓度分别为800U/mL和200U/mL。
4.在每个孔中分别加入3mL如此制得的新鲜树状细胞用培养液。
5.在第6天，从六孔板中收集源自于未成熟单核细胞的树状细胞(MoDC)并将其添加到少量的新鲜树状细胞用培养液中。
6.将细胞悬浮液的密度调整为5×105个细胞/mL。
7.将GM-CSF(最终浓度：800U/mL)、IL-4(最终浓度：200U/mL)、TNF-α(最终浓度：10ng/mL)和PGE2(最终浓度：1μg/mL)加入到细胞悬浮液中。在24孔板的每个孔中加入约5×105个细胞/mL/孔的细胞悬浮液。
8.在5％CO2以及37℃条件下对板培养24小时。
9.在24小时培养周期的最后的2小时内在每个孔中加入肽。肽的最终浓度为10μM。从板中收集树状细胞(DC)，并用T细胞用培养液洗涤两次。
10.计算DC的数量，然后加入T细胞用培养液，得到2×105个细胞/mL的悬浮液。
B.从人类末梢血分离T细胞及T细胞与树状细胞的共培养。
1.使用CD3微珠通过MACS技术从健康志愿者A(与上述步骤A中为同一人)的末梢血中分离T细胞。对细胞进行洗涤，加入T细胞用培养液，得到2×106个细胞/mL的悬浮液。分离出一小部分的T细胞悬浮液用于流式细胞术分析。
2.在24孔板的每个孔中一起添加0.5mL/孔的DC细胞悬浮液(2×105个细胞/mL)和0.5mL/孔的T细胞悬浮液(2×106个细胞/mL)。(DC细胞：T细胞＝1×105:1×106＝1:10)。
3.在第3天，在每个孔中加入IL-7(最终浓度：5ng/mL)和IL-15(最终浓度：10ng/mL)。
4.在第14天，从培养液中收集细胞。
C.向LCL添加肽
1.从培养物中收集LCL并以35Gy的剂量进行照射。
2.将照射后的细胞悬浮在T细胞培养液中，得到5×105个细胞/mL的悬浮液。
3.在悬浮液中添加肽100nM，培养2小时。
4.收集LCL并用T细胞培养液洗涤，然后将其分散在T细胞培养液中，得到2×105个细胞/mL的悬浮液。
D.LCL与由树状细胞刺激的T细胞的共培养。
1.将由树状细胞刺激的T细胞分散在T细胞培养液中，得到2×106个细胞/mL的悬浮液。
2.将0.5mL/孔的LCL悬浮液(2×105个细胞/mL)在存在肽的条件下进行培养，并在24孔板的每个孔中一起加入0.5mL/孔的T细胞悬浮液(2×106个细胞/mL)(LCL：T细胞＝1×105:1×106＝1:10)。同时，将肽添加到各孔中形成最终浓度为100nM。
3.在第3天，向各孔中加入IL-7(最终浓度：5ng/mL)和IL-15(最终浓度：1ng/mL)。将板培养2周并且每周用添加有细胞因子的新鲜T细胞培养液更换培养液。(借助肽脉冲LCL的第一道刺激)
4.再次将LCL在添加有100nM肽的培养液中培养2小时，然后向其中加入CTL。
5.在第3天，向各孔中加入IL-7(最终浓度：5ng/mL)和IL-15(最终浓度：1ng/mL)。将板培养2周并且每周用添加有细胞因子的新鲜T细胞培养液更换培养液。(借助肽脉冲LCL的第二道刺激)
6.采用流式细胞术对得到的细胞进行分析，证实了：超过80％的CD8阳性T细胞为CD8阳性和LMP-2四聚体阳性细胞。结果如图6所示。
E.LMP2特异性CTL的抗原特异性杀伤活性
1.将标记CFSE的OUN-1白血病细胞作为目标细胞。将标记的细胞分散在T细胞培养液中，并在存在1nM的LMP2肽条件下培养2小时。
2.按照不同的效应细胞/目标细胞比例(0:1、1:9、1:3、1:1和3:1)，将在肽刺激作用下扩增的LMP2特异性细胞毒性T细胞(CD8阳性和LMP-2四聚体阳性细胞)和标记CFSE的OUN-1白血病细胞一起添到96孔圆底板的每个孔中。分别在存在或不存在肽的条件下对细胞进行培养。确定CFSE阳性细胞分级中Annexin V阳性细胞和PI(碘化丙啶)阳性细胞的比例，从而确定目标细胞当中死亡细胞的百分比。结果如图7所示。
3.确认的是：如此制得的LMP2特异性杀伤T细胞具有针对目标细胞的抗原特异性杀伤活性。
2)LMP2-T-iPS细胞的建立
A.LMP2特异性CTL的活化。
1.利用MACS珠从以上得到的LMP2特异性CTL富集CD8阳性细胞。
2.将富集的细胞群分散在T细胞培养液中，并加入IL-7(最终浓度：5ng/mL)和IL-15(最终浓度：10ng/mL)。添加Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28，形成珠与细胞的比例为1:1，并将该混合物培养2天从而活化CD8阳性细胞。
B.借助仙台病毒载体导入山中四因子和SV40。
1.将活化的LMP2特异性CTL分散在T细胞培养液中，将结合有山中四因子和SV40的仙台病毒添加到培养液中，然后将细胞悬浮液培养2天。
2.使用T细胞培养液对得到的细胞进行清洗，然后将其加入到添加有IL-7(最终浓度：5ng/mL)和IL-15(最终浓度：1ng/mL)的T细胞培养液中。将细胞进一步培养2天。
3.之后，收集所有的细胞并将其分散在添加有IL-7(最终浓度：5ng/mL)和IL-15(最终浓度：1ng/mL)的T细胞培养液中。将细胞悬浮液接种在饲养细胞上。
4.在第2天，用新鲜的iPS细胞培养液更换一半的培养液。之后，每天用新鲜的iPS细胞培养液更换一半的培养液，并对细胞进行连续培养。
C.从培养物中拾取iPS细胞集落
1.导入山中因子三周后，对iPS细胞集落进行目视观察。
2.使用200μL吸量头机械拾取集落。
3.单独地生成数个克隆集落，其中之一用作以下实施例中的LMP2-T-iPS细胞。一个所得克隆集落的集落的照片如图8所示。
3)从LMP2-iPS细胞诱导T细胞。
使用的培养液如下：
【表5】
培养液A：用于维持OP9基质细胞
| 所含物 | 添加量 | 最终浓度 |
| αMEM培养液 | 500mL | |
| FCS | 125mL | 20％ |
| 青霉素-链霉素溶液* | 6.25mL | 1％ |
| 总量 | 631.25mL |
*青霉素(10000U/mL)和链霉素(10000μg/mL)的混合物。最终浓度分别为100U/mL和100μg/mL。
【表6】
培养液B：用于诱导T细胞的分化
| 所含物 | 添加量 | 最终浓度 |
| αMEM培养液 | 500mL | |
| FCS | 125mL | 20％ |
| 青霉素-链霉素溶液* | 5mL | 1％ |
| hrIL-7(stock:10μg/mL) | 315μL | 5ng/mL |
| hrFlT-3L(stock:10μg/mL) | 315μL | 5ng/mL |
| hrSCF(stock:10μg/mL) | 630μL | 10ng/mL |
| 总量 | 631.26mL |
*青霉素(10000U/mL)和链霉素(10000μg/mL)的混合物。最终浓度分别为100U/mL和100μg/mL。
【表7】
培养液C：用于从未成熟的T细胞诱导成熟T细胞
| 所含物 | 添加量 | 最终浓度 |
| αMEM培养液 | 500mL | |
| FCS | 125mL | 20％ |
| 青霉素-链霉素溶液* | 5mL | 1％ |
| hrIL-7(stock:10μg/mL) | 315μL | 5ng/mL |
| 总量 | 630.315mL |
*青霉素(10000U/mL)和链霉素(10000μg/mL)的混合物。最终浓度分别为100U/mL和100μg/mL。
OP9细胞的制备
将六毫升(6mL)0.1％明胶溶液(在PBS中)加入到一个10cm的培养皿(Falcon)并在37℃培养30分钟。然后移除明胶溶液，向培养皿中加入10mL培养液A。取1/4形成汇合培养的OP9基质细胞，并将其接种在所述培养皿上。四天后，向培养皿中添加10mL的新鲜培养液A(最终量为20mL)。
从iPS细胞诱导造血祖细胞
将有待用于共培养OP9基质细胞培养中的培养液吸取去除并更换新鲜的培养液A。也将iPS细胞培养皿中的培养液吸取去除并添加10mL的新鲜培养A。使用EZ-passage辊切下iPS细胞块。使用一个带有200ul吸头的吸管将切下的iPS细胞块悬置。目视计算iPS细胞簇的数量，并将大约600个iPS细胞簇接种于OP9细胞上。iPS细胞的每个克隆集落使用三个或更多的培养皿，并且当继代培养时，将所有培养皿的细胞一次汇集在一个培养皿中，然后再重新分配至相同数量的培养皿中从而减少培养皿之间的差异性。
第1天：(更换培养液)
对iPS细胞是否粘附在培养皿上并开始进行分化进行了确认。用20mL的新鲜培养液A更换细胞培养的培养液。
第5天：(更换一半的培养液)
用10mL的新鲜培养液A更换一半的细胞培养的培养液。
第9天：(更换一半的培养液)
用10mL的新鲜培养液A更换一半的细胞培养的培养液。
第13天：(将诱导的中胚层细胞从OP9细胞层转移到OP9/DLL1细胞层)
吸取去除除细胞培养的培养液，使用HBSS(+Mg+Ca)清洗掉培养的细胞表面的培养液。将10mL的250U胶原酶IV(在HBSS(+Mg+Ca)溶液中)添加到培养皿中并在37℃培养45分钟。
吸取去除胶原酶溶液，并用10mL的PBS(-))清洗细胞。然后，向培养皿中加入0.05％胰蛋白酶/EDTA溶液并在37℃培养20分钟。培养之后，将片状细胞聚集体从培养皿的底部剥离并通过吹吸将细胞聚集体破碎至较小的尺寸。将如此处理后的细胞与20mL的新鲜培养液A混合，并在37℃另外再培养45分钟。
将含有漂浮细胞的培养液过100μm筛并收集细胞。然后将细胞在4℃以1200rpm离心7分钟。将得到的沉淀悬浮于10mL的培养液B中。取十分之一的悬浮液用于FACS分析。将剩余的细胞悬浮液接种于含OP9/DLL1细胞的多个新培养皿上。然后，将数个培养皿中的细胞悬浮液汇集并将汇集的细胞接种到相同数量的新培养皿上。
为了确定得到的细胞中是否含有造血祖细胞，使用抗CD34抗体和抗CD43抗体进行FACS分析。结果如图9所示。可以确认有足够数量的细胞是属于CD34lowCD43+分级，因此确认了诱导形成了造血祖细胞。
C.从造血祖细胞诱导T细胞。
然后，将得到的细胞接种到OP9/DLL1细胞上。在这一步骤中，不进行CD34lowCD43+细胞分级的细胞分选。相比于未分选情况，当此分级被分选时，因为分选过程造成细胞减少或损伤，因此T细胞的分化效率可能会降低。
在培养期间，进行了数次FACS分析用以确认分化阶段。在培养期间观察到大量的死亡细胞。在FACS分析之前，使用例如碘化丙啶(PI)或7-AAD消除死亡细胞。
第16天：(细胞的继代培养)
通过轻轻吹吸数次将松散地粘附在OP9细胞上的细胞分离。然后将细胞过100μm筛，并收集在50mL锥形管中。将锥形管在4℃以1200rpm离心7分钟。然后将沉淀分散在10mL的培养液B中。再将如此制得的细胞悬浮液接种到含有OP9/DLL1细胞的多个新培养皿上。
第23天：(细胞的继代培养)开始出现血细胞集落。
通过轻轻吹吸数次将松散地粘附在OP9/DLL1细胞上的细胞分离。然后将细胞过100μm筛，并收集在50mL锥形管中。将锥形管在4℃以1200rpm离心7分钟。然后将沉淀分散在10mL的培养液B中。
第36天：LMP2四聚体阳性细胞被确认。
为了确认诱导形成了LMP2抗原特异性T细胞，在第36天使用抗CD3抗体和LMP2四聚体对细胞进行了FACS分析。
结果如图10所示。观察到了CD3+细胞并且一部分细胞分化为CD3+LMP2四聚体阳性细胞。
D.从未成熟T细胞诱导成熟的杀伤T细胞。
在第36天，采用流式细胞术确认了LMP2阳性T细胞，然后向细胞加入IL-15，从而使细胞分化为成熟的杀伤T细胞或CD8SP细胞。将T细胞分散在培养液C中，然后以3×105个细胞/孔的密度接种到24孔板各孔中的新鲜OP9/DLL1细胞层上。然后向每孔中加入IL-15(最终浓度：10ng/mL)。
第41天：观察到成熟的杀伤T细胞
添加IL-15五天后，对细胞进行FACS分析。结果如图11所示。观察到了成熟的CD8单阳性细胞。
4)再生的LMP2特异性CTL的抗原特异性杀伤活性
1.使用标记CFSE的LCL作为目标细胞。将标记的细胞分散在T细胞培养液中并在存在1nM的LMP2肽条件下培养2小时。
2.按照不同的效应细胞/目标细胞比例(0:1、1:9、1:3、1:1、3:1、10:1和30:1)，将再生的CD8单阳性T细胞和目标细胞(LCL)一起添加到96孔圆底板的每个孔中。分别在存在(P+)或不存在(P-)肽的条件下对细胞进行培养。确认在CFSE阳性细胞分级中Annexin V阳性细胞和PI(碘化丙啶)阳性细胞的比例，从而确认目标细胞当中死亡细胞的百分比。
3.结果如图12所示。确认了：如此制备的LMP2特异性杀伤T细胞具有针对目标细胞的抗原特异性杀伤活性。
5)再生的LMP2特异性CTL的自然杀伤细胞样活性
1.将在细胞表面上不表达HLA的K562细胞株(用于确定同种异体反应性)和自体末梢单核细胞(MA p-)(用于确定自身反应性)用作目标细胞。将这些细胞用CFSE标记并悬浮在T细胞培养液中。
2.按照不同效应细胞/目标细胞的比例(0:1、1:9、1:3、1:1和3:1)，将再生的CD8T细胞和目标细胞一起添加到一个96孔圆底板的每个孔中。对细胞进行培养，并确认在CFSE阳性细胞分级中Annexin V阳性细胞和PI(碘化丙啶)阳性细胞的比例从而确认目标细胞当中的死亡细胞的百分比。
3.结果如图13所示。LMP2特异性杀伤T细胞没有杀死自体PBMC(MA p-)，但显示出针对K562细胞的高杀伤活性。这一结果表明LMP2特异性杀伤T细胞具有自然杀伤细胞样活性。
实施例5
从健康志愿者的末梢血诱导WT1抗原特异性细胞毒性T细胞，并从CTL建立T-iPS细胞。然后，从T-iPS细胞诱导形成WT1抗原特异性成熟T细胞。
本实施例包括以下步骤：
1)WT1抗原特异性CTL的扩增
2)WT1-T-iPS细胞的建立
3)从WT1-T-iPS细胞诱导T细胞。
1)WT1抗原特异性CTL的扩增
i)使用的培养液如下。
【表8】
T细胞用培养液(T细胞培养液)：
| 量 | 最终浓度 | |
| RPMI | 45ml | |
| 人类AB血清 | 5ml | 10％ |
| 总量 | 50ml |
ii)使用的WT1抗原肽如下。
WT1(改变型：CYTWNQMNL(序列号：2)，Cancer Immunol.Immunothera.，51：614(2002))
以下使用的WT1肽和WT1四聚体均为改变型。
iii)使用的LCL(淋巴母细胞株)为如下所示。
使用在日本京都的京都大学的药学研究生院血液和肿瘤科从健康志愿者建立的具有HLA-A2402的LCL。
A.从人类末梢血分离T细胞以及用肽刺激细胞
1.获取健康志愿者的末梢血。使用Ficoll从血液中精制单核细胞，然后将其分散在T细胞培养液中。
2.以2.5×105个细胞/mL/孔的密度将细胞悬浮液添加到96孔圆底板的每个孔中，并且加入肽形成最终浓度为10μM。
3.在第3天，在每孔中添加IL-2(最终浓度：12.5U/mL)、IL-7(最终浓度：5ng/mL)和IL-15(最终浓度：1ng/mL)。培养2周并且每周用添加有细胞因子的新鲜T细胞培养液更换培养液。
B.向LCL添加肽。
1.从培养物中收集LCL并以35Gy的剂量进行照射。
2.将照射后的细胞悬浮在T细胞培养液中，得到5×105个细胞/mL的悬浮液。
3.向悬浮液中加入肽(100nM)，培养2小时。
4.收集LCL并用T细胞培养液对其进行清洗，然后将其分散在T细胞培养液中形成2×105个细胞/mL的悬浮液。
C.肽脉冲的LCL与T细胞的共培养。
1.在肽刺激后培养2周时，收集肽刺激的T细胞，清洗后分散在T细胞培养液中，形成2×106个细胞/mL的悬浮液。分离出小部分的T细胞悬浮液用于流式细胞术分析。
2.在存在肽条件下培养获得的LCL混悬浮液(2×105个细胞/mL)以0.5mL/孔和T细胞悬浮液(2×106个细胞/mL)以0.5mL/孔一起添加到一个24孔板的每个孔中。(LCL：T细胞＝1×105:1×106＝1:10)。
3.在第3天，将IL-2(最终浓度：12.5U/mL)、IL-7(最终浓度：5ng/mL)和IL-15(最终浓度：1ng/mL)一起添加到每个孔中。培养2周并且每周用添加有细胞因子的新鲜T细胞培养液更换培养液。(使用肽脉冲LCL的第一道刺激)
4.将LCL又在添加有肽(100nM)的培养液中培养2小时，然后添加CTL。
5.在第3天，向每个孔中添加IL-2(最终浓度：12.5U/mL)、IL-7(最终浓度：5ng/mL)和IL-15(最终浓度：1ng/mL)。培养2周并且每周用添加有细胞因子的新鲜T细胞培养液更换培养液。(使用肽脉冲LCL的第二道刺激)
6.将LCL再次在添加有肽(100nM)的培养液中培养2小时，然后添加CTL。
7.在第3天，向每个孔中添加IL-2(最终浓度：12.5U/mL)、IL-7(最终浓度：5ng/mL)和IL-15(最终浓度：1ng/mL)。培养2周并且每周用添加有细胞因子的新鲜T细胞培养液更换培养液。(使用肽脉冲LCL的第三道刺激)
8.用流式细胞术分析获得的细胞。结果如图14所示。确认的是：超过60％的CD8阳性T细胞为CD8阳性和WT1四聚体阳性细胞。
2)WT1-T-iPS细胞的建立
A.WT1特异性CTL的活化。
1.使用MACS珠从以上得到的WT1特异性CTL富集CD8阳性细胞。
2.将富集的细胞群分散在T细胞培养液中并添加IL-2(最终浓度：12.5U/mL)、IL-7(最终浓度：5ng/mL)和IL-15(最终浓度：1ng/mL)。添加Dynabeads Human T-ActivatorCD3/CD28从而形成珠：细胞的比例为1:1，然后将混合物培养2天从而活化CD8阳性细胞。
B.借助仙台病毒载体导入山中四因子和SV40。
1.将活化的WT1特异性CTL分散在T细胞培养液中，将结合有四山中因子和SV40的仙台病毒添加到培养液，并将细胞悬浮液培养2天。
2.使用T细胞培养液清洗得到的细胞，然后将其添加到添加有IL-2(最终浓度：12.5U/mL)、IL-7(最终浓度：5ng/mL)和IL-15(最终浓度：1ng/mL)的T细胞培养液中。将细胞进一步培养2天。
3.之后，收集所有的细胞并将其分散在不含细胞因子的T细胞培养液中。然后将细胞悬浮液接种在饲养细胞上。
4.第2天，用新鲜的iPS细胞培养液更换一半的培养液。之后，每天用新鲜的iPS细胞培养液更换一半的培养液，并对细胞进行连续培养。
C.从培养物中拾取iPS细胞集落
1.导入山中因子三周后，目视观察iPS细胞的集落。
2.使用一个200μL吸量头机械地拾取集落。
3.单独地建立数个集落。得到的一个克隆集落的集落的照片如图15所示。
3)从WT1-T-iPS细胞诱导T细胞。
使用的培养液如下：
【表9】
培养液A：用于维持OP9基质细胞
| 所含物 | 添加量 | 最终浓度 |
| αMEM培养液 | 500mL | |
| FCS | 125mL | 20％ |
| 青霉素-链霉素溶液* | 6.25mL | 1％ |
| 总量 | 631.25mL |
*青霉素(10000U/mL)和链霉素(10000μg/mL)的混合物。最终浓度分别为100U/mL和100μg/mL。
【表10】
培养液B：用于诱导T细胞的分化
| 所含物 | 添加量 | 最终浓度 |
| αMEM培养液 | 500mL | |
| FCS | 125mL | 20％ |
| 青霉素-链霉素溶液* | 5mL | 1％ |
| hrIL-7(stock:10μg/mL) | 315μL | 5ng/mL |
| hrFlT-3L(stock:10μg/mL) | 315μL | 5ng/mL |
| hrSCF(stock:10μg/mL) | 630μL | 10ng/mL |
| 总量 | 631.26mL |
*青霉素(10000U/mL)和链霉素(10000μg/mL)的混合物。最终浓度分别为100U/mL和100μg/mL。
OP9细胞的制备
将六毫升(6mL)0.1％明胶溶液(在PBS中)添加到一个10cm的培养皿(Falcon)中并且在37℃培养30分钟。用胰蛋白酶/EDTA溶液从汇合培养皿中分离出OP9基质细胞，并将约1/4的所得细胞添加到涂布明胶的10cm细胞培养皿中。向细胞培养皿中加入10mL培养液A。4天后，再向培养皿中加入10mL培养液A(最终量为20mL)。
从iPS细胞诱导造血祖细胞
吸取去除待用于共培养的OP9基质细胞培养物中的培养液并用新鲜的培养液A更换。也吸取去除iPS细胞培养皿中的培养液，然后添加10mL新鲜培养液。使用EZ-passage辊切下iPS细胞块。借助一个带有200ul吸头的吸管将切下的iPS细胞块悬置。目视计算iPS细胞簇的数量，并将大约600个iPS细胞簇接种在OP9细胞上。iPS细胞的每个克隆集落使用3个或更多的培养皿，继代培养时，将所有培养皿中的细胞一次汇集在一个培养皿中，并将其重新分配至相同数目的培养皿从而减少培养皿之间的差异。
第1天：(更换培养液)
确认iPS细胞块是否粘附到培养皿并开始分化。用20mL的新鲜培养液A更换细胞培养的培养液。
第5天：(更换一半的培养液)
用10mL的新鲜培养液A更换一半的细胞培养的培养液。
第9天：(更换一半的培养液)
用10mL的新鲜培养液A更换一半的细胞培养的培养液。
13天：(将诱导的中胚层细胞从OP9细胞层转移到OP9/DLL1细胞层上)
吸取去除细胞培养的培养液，并使用HBSS(+Mg+Ca)洗掉培养细胞表面的培养液。将10mL的250U胶原酶IV(在HBSS(+Mg+Ca)溶液中)添加到培养皿中，然后在37℃培养45分钟。
吸取去除胶原酶溶液并使用10mL的PBS(-)清洗细胞。之后，将0.05％胰蛋白酶/EDTA溶液添加到培养皿，然后在37℃培养20分钟。培养之后，从培养皿的底部剥离片状细胞聚集体，然后通过吹吸将细胞聚集体机械破碎至较小的尺寸。将如此处理后的细胞加入20mL新鲜培养液A，并在37℃培养45分钟。将含有悬浮细胞的培养液过100μm筛并收集细胞。然后将细胞在4℃以1200rpm离心7分钟。将得到的沉淀悬浮于10mL的培养液B中。分离出十分之一的悬浮液用于FACS分析。剩余的细胞悬浮液接种到含有OP9/DLL1细胞的多个新培养皿上。将数个培养皿的细胞悬浮液进行汇合，然后重新分配到相同数目的培养皿上。
为了确定得到的细胞中是否含有造血祖细胞中，使用抗CD34抗体和抗CD43抗体进行FACS分析。结果如图16所示。可以确认足够数量的细胞是在CD34lowCD43+细胞分级，因此确认诱导形成了造血祖细胞。
C.从造血祖细胞诱导T细胞。
然后，将得到的细胞接种到OP9/DLL1细胞上。在这一步骤中，不进行CD34lowCD43+细胞分级的细胞分选。相比于未分选的情况，当此分级被分选时，因为分选过程造成细胞减少或损伤，所以T细胞的分化效率可能会降低。
第16天：(细胞的继代培养)
通过轻轻吹吸数次将松散地粘附在OP9细胞上的细胞分离。然后将细胞过100μm筛，并收集在一个50mL锥形管中。将锥形管在4℃以1200rpm离心7分钟。然后将沉淀分散在10mL的培养液B中。再将如此制得的细胞接种到含有OP9/DLL1细胞的多个新培养皿上。
第23天：(细胞的继代培养)开始出现血细胞集落。
通过轻轻吹吸数次将松散地粘附在OP9/DLL1细胞上的细胞分离。然后将细胞过100μm筛，并收集在一个50mL锥形管中。将锥形管在4℃以1200rpm离心7分钟。然后将沉淀分散在10mL的培养液B中。
第36天：WT1四聚体阳性T细胞被确定
为了证实诱导形成了WT1抗原特异性T细胞，在第36天使用抗CD3抗体和WT1四聚体对细胞进行了FACS分析。结果如图17所示。观察到了CD3+细胞并且大部分的细胞分化为CD3+WT1四聚体阳性细胞。
如上所示，证实了从T-iPS细胞再生的T细胞具有与初始T细胞相同的抗原特异性。此外，再生的T细胞表达了在成熟T细胞所观察到的的表面抗原，因此确认具有成熟的功能。
实施例6
从导入有WT1抗原特异性TCR的HLA纯合的供体单核细胞制备iPS细胞
使用在京都大学iPS细胞研究与应用中心从具有纯合的HLA单倍型的供体的单核细胞建立的iPS细胞克隆集落。
从日本爱媛大学血液科建立的WT1特异性CTL克隆集落“TAK1”克隆克隆编码HLA-A2402限制性WT1特异性TCR的基因。编码WT1-TCR的基因为Vα20/J33/Cα和Vβ5.1/J2.1/Cβ2。将TCRβ(Vβ5.1/J2.1/Cβ2)-p2A-TCRα(Vα20/J33/Cα)以此顺序插入到Gateway系统的入门载体中，从而构建质粒。
1)对WT1-TCR慢病毒载体的构建
使用由日本物理化学研究所的Hiroyuki MIYOSHI博士提供的CS-UbC-RfA-IRES2-hKO1载体。将结合有WT1-TCR基因的Gateway系统的入门载体和CS-UbC-RfA-IRES2-hKO1载体进行LR clonase反应(生命技术)，从而生成CS-UbC-RfA-IRES2-hKO1/WT1-TCR质粒载体。
2)含有WT1-TCR慢病毒载体的培养上清液的制备
将以上得到的CS-UbC-RfA-IRES2-hKO1/WT1-TCR导入至包装细胞株LentiX-293T中并对细胞进行培养。收集含有WT1-TCR慢病毒载体的培养上清液，然后采用超速离心浓缩病毒。
3)从WT1-TCR转染的HLA纯合单核细胞建立iPS细胞克隆集落。
将从具有纯合的HLA单倍型的单核细胞建立并在iMatrix(Nippi)上培养的iPS细胞感染含CS-UbC-RfA-IRES2-hKO1/WT1-TCR病毒的上清液。通过在荧光显微镜下观察细胞，确认了载体中hKO1蛋白的表达，并确认了WT1-TCR正如期望地导入到了iPS细胞中，从而生成了WT1-TCR/mono-iPS细胞。
4)WT1-TCR/mono-iPS细胞的克隆
感染后四天，将受感染的iPS细胞从培养皿中移除，使用FACS Aria分选hKO1表达细胞且不使细胞染色，从而得到WT1-TCR/mono-iPS balk。将hKO1阳性细胞接种在iMatrix上并培养一周。培养一周后，在荧光显微镜下观察扩增的集落，机械拾取强烈表达hKO1的集落并对其进行克隆，得到WT1-TCR/mono-iPS克隆集落。按照WO2013176197A1公开的类似方法将基于hKO1表达分选的细胞和克隆的细胞都分化为T细胞。
特别地，将小的iPS细胞块(少于100个细胞)转移到已经照射的C3H10T1/2细胞上，并且在添加有20ng/mL VEGF、50ng/mL SCF和50ng/mL FLT-3L(Peprotech)的EB培养液中进行培养。在培养的第14天，收集含在iPS-sac结构中的造血细胞并将其转移至照射后的OP9-DL1细胞上，然后在添加有10ng/mL FLT-3和1ng/mL IL-7的OP9培养液进行培养。分化第38天的细胞的FACS分析结果如图18所示。
在分化的第38天，使用FACS Aria对mono-iPS细胞、WT1-TCR/mono-iPS balk和WTTCR/mono-iPS细胞克隆集落进行分析。源自于单核细胞(mono-iPS细胞)的iPS细胞没有表达CD3，而导入有WT1-TCR的iPS细胞表达了CD3。几乎100％的CD3阳性细胞为Vβ5.1抗体阳性。Vβ5.1包含在导入的TCR链中。这些细胞也为TCRαβ抗体阳性。确认的是：导入的WT1-TCR在功能上被表达在细胞表面上。
实施例7
通过向T细胞中导入山中因子而得到的iPS细胞克隆集落TKT3v1-7由日本的京都大学提供。这些细胞被缩写为“TKT3V”。
1.设计靶向具有PAM序列的人类RAG2基因的gDNA，并将其结合到具有H3启动子的表达质粒中。gDNA设计为：移除了目标序列GGTTATGCTTTACATCCAGATGG(序列号：3)的一个等位基因中画下划线的两个碱基，并在其它等位基因中画下划线部分的5'侧插入一个碱基。
2.将上述制备质粒与Cas9蛋白表达质粒一起转染到源自于人类末梢血T细胞的iPS细胞(TKT3V)中。
3.对转染的iPS细胞进行克隆，得到50个克隆集落。通过T7E1试验对这50个克隆集落进行筛选，筛选出基因组上的错误配对(图19)。
4.将筛选的克隆集落进行RAG2基因的测序，并选择两个等位基因的所述基因中含有错义突变的克隆集落(TKT3V1-7/RAG2KO)。
5.通过畸胎瘤形成将选择的iPS克隆集落进行染色体分析和多能性的评估。在细胞中没有观察到基因改变的iPS细胞的异常。
6.按照WO2013176197A1中公开的同样方法将TKT3V和TKT3V/RAG2KO的iPS细胞克隆集落分化为T细胞。特别地，将小的iPS细胞块(少于100个细胞)转移到已经照射的C3H10T1/2细胞上并在添加有20ng/mL VEGF、50ng/mL SCF和50ng/mL FLT-3L(Peprotech)的EB培养液中进行培养。在培养的第14天，收集含在iPS-sac结构中的造血细胞并将其转移到照射后的OP9-DL1细胞上，然后在添加有10ng/mL FLT-3和1ng/mL IL-7的OP9培养液中进行培养。诱导细胞的FACS分析结果如图20所示。观察到生成了CD4+CD8+DP细胞群。
7.通过流式细胞术分离DP细胞群，并从细胞中提取mRNA。
8.使用针对TCRα链的V区域和C区域中各片段的引物，在提取的mRNA上进行RT-PCR，并检测TCRα链的重排。以同样的方式也在TKT3V的mRNA上进行RT-PCR。TKT3V细胞只有Va14为TCRα链(图21)。
在TKT3V细胞(iPS细胞)分化为T细胞过程中，确认了在从CD4-CD8-双阴性(DN)细胞向双阳性(DP)细胞分化的细胞中的RAG2的再活性化(图22)。在T细胞的DN和DP阶段中的TCRα链的重排分别如图23和图24所示。在DN细胞，类似于iPS细胞，确认了只有Va14重排。在DP细胞，频频观察到非Va14的片段重排。看似RAG蛋白的活性化引起TCRα链的重排。这种非特异性重排可能导致诱导的T细胞的抗原特异性的损失。
从TKT3v/RAG2KO克隆集落(即敲除了RAG2的iPS细胞)分化的DP细胞的TCRα链重排如图25所示。在从敲除了RAG2的克隆集落分化的DP细胞中，除了Va14基因重排之外没有观察到其它基因重排。认为Rag2基因的敲除未能产生RAG2蛋白并防止了TCRα链的重排。
确认的是：通过在iPS细胞阶段向RAG2基因中导入错义突变，是可能防止TCRα链的另外重排并且保持从iPS细胞分化的T细胞中的抗原特异性的。
通过常规方法将从TKT3V/RAG2KO克隆集落分化的DP细胞进一步分化为CD8单阳性细胞毒性T淋巴细胞(图26)。使用流式细胞术将CD8单阳性细胞群分离，并提取出分离细胞的mRNA。用RT-PCR检测TCR重排。结果如图27所示。从基因改变的iPS细胞分化的CD8单阳性T细胞仅有Va14为重排基因。在Va19道(lane)中的带(band)为超出了该图框所围的TCRa的大小的一种非特异性带(nonspecific band)。
实施例8
从具有纯合的HLA单倍型的人类单核细胞建立的iPS细胞中敲除Rag2基因
1.采用从人类单核细胞建立的iPS细胞克隆集落。iPS细胞克隆集落是从具有纯合的HLA单倍型HLA-A*3303-B*4403-C*1403-DRB1*1302的一个供体的末梢血单核细胞建立的。此处使用的iPS细胞是根据日本京都大学iPS细胞研究与应用中心提供的CiRA_FFiPSC_protocol_JP_vl40310协议在无饲养条件下维持培养的那些。
2.在iPS细胞中的人类Rag2基因的外显子1中进行双切割。具体来说，使用CRISPR-Cas9切割外显子1核苷酸的440到441之间以及679到680之间的位置。
3.目的sgRNA如下：
正义链：caccGATTAATGTGGTGTACAGCCG(序列号：4)
反义链：aaacCGGCTGTACACCACATTAATC(序列号：5)
ii)正义链：caccGTTGGCAGGCCGGATATTAT(序列号：6)
反义链：aaacATAATATCCGGCCTGCCAAC(序列号：7)
4.将上述sgRNA插入购自addgene的质粒pSpCas9(BB)-2A-Puro(PX459)。对iPS细胞进行酶处理从而形成单细胞悬浮液，并使用NEPA21(Nepagene)通过电穿孔转染质粒。
5.转染后，将细胞接种到板中，并在存在嘌呤霉素条件下进行培养，然后拾取多个克隆集落。
从每个克隆集落中收集DNA，通过PCR检测基因的缺失的存在与否。用于PCR的引物如下。
正向引物：CCCAAAAGATCCTGCCCCACTGG(序列号：8)
反向引物：AGTCAGGATTGCACTGGAGACAG(序列号：9)
7.根据PCR结果，共采集到57个克隆集落，并进行了评价。
i)未缺失的克隆集落：31
ii)在单个等位基因中发生缺失的克隆集落：14
iii)同时在两个等位基因中发生缺失的克隆集落：2
8.初始iPS细胞克隆集落和其中在两个等位基因(RAG2KO)中都发生了缺失的iPS细胞克隆集落的PCR分析结果如图28所示。缩短的带表示在两个等位基因中都发生了缺失。
9.建立两个敲除RAG2的iPS细胞克隆集落。
实施例9
使用通过向抗原特异性CD8单阳性T细胞中导入山中因子而建立的T-iPS细胞，而不是在实施例7中使用的那些。以与实施例7中同样的方式敲除T-iPS细胞中Rag2基因。以与实施例7中同样的方式将没有敲除Rag2基因的T-iPS细胞(WT)和敲除了Rag2基因的T-iPS细胞分化为T细胞。在OP9培养液中培养的第41天(在分化的第55天)，对细胞进行分析。结果如图29和图30所示。图中，AgDex代表T细胞(从其建立T-iPS细胞)特异结合抗原的多聚体(Dextramer)。
从敲除了Rag2的iPS克隆集落经过较长时间段分化的T细胞对四聚体(CD8阳性细胞的60％以上)保持相对较强的亲和力。另一方面，许多从WT克隆集落分化的T细胞没有保持TCR特异性。
序列表
<110> 国立大学法人京都大学
赛雅思株式会社
<120> 从多能性干细胞诱导细胞免疫治疗用T细胞的方法
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Ile Tyr Val Leu Val Met Leu Val Leu
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agtcaggatt gcactggaga cag 23
Claims (4)
1.一种形成细胞免疫治疗用iPS细胞银行的方法，包括以下步骤：
(1)提供从具有纯合的HLA单倍型的供体建立的iPS细胞，
(2)通过基因组编辑敲除所述iPS细胞中的Rag1和/或Rag2基因，以及
(3)将所述敲除了Rag1和/或Rag2基因的iPS细胞与每个供体的信息相关联地进行存储。
2.一种细胞免疫治疗用iPS细胞银行，其中与每个供体的HLA信息相关联地存储有从具有纯合的HLA单倍型的供体建立并且敲除了Rag1和/或Rag2基因的iPS细胞。
3.一种形成细胞免疫治疗用iPS细胞银行的方法，包括以下步骤：
(1)提供从具有纯合的HLA单倍型的供体建立的iPS细胞，
(2)通过基因组编辑敲除所述iPS细胞中的Rag1和/或Rag2基因，以及
(3)向步骤(2)中得到的所述敲除了Rag1和/或Rag2基因的iPS细胞中导入编码期望抗原特异性T细胞受体的基因，以及
(4)将步骤(3)中得到的所述iPS细胞与每个供体的HLA信息以及编码所述抗原特异性T细胞受体的基因的信息相关联地进行存储。
4.一种iPS细胞银行，包括从来源于供体的细胞建立的iPS细胞，所述供体具有纯合的HLA单倍型，并且所述iPS细胞具有编码期望抗原特异性T细胞受体的基因，其中所述iPS细胞与每个供体的HLA信息以及所述抗原特异性T细胞受体的信息相关联地被存储。
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