KR102654784B1 - 다능성 줄기세포로부터 세포-기반 면역요법용 t 세포를 유도하는 방법 - Google Patents
다능성 줄기세포로부터 세포-기반 면역요법용 t 세포를 유도하는 방법 Download PDFInfo
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Abstract
하기 단계를 포함하는, 세포-기반 면역요법을 위한 T 세포를 유도하는 방법이 제공된다:
(1) 목적하는 항원에 특이적인 T 세포 수용체를 인코딩하는 유전자를 보유하는 Rag 1 및/또는 Rag2 유전자 넉아웃 인간 다능성 줄기세포를 제공하는 단계, 및
(2) 단계 (1)의 다능성 줄기세포로부터 T 세포를 유도하는 단계. 세포-기반 면역요법용 T 세포를 사용하는 세포-기반 면역요법 방법 및 세포-기반 면역요법을 위한 iPS 세포 은행이 또한 제공된다.
(1) 목적하는 항원에 특이적인 T 세포 수용체를 인코딩하는 유전자를 보유하는 Rag 1 및/또는 Rag2 유전자 넉아웃 인간 다능성 줄기세포를 제공하는 단계, 및
(2) 단계 (1)의 다능성 줄기세포로부터 T 세포를 유도하는 단계. 세포-기반 면역요법용 T 세포를 사용하는 세포-기반 면역요법 방법 및 세포-기반 면역요법을 위한 iPS 세포 은행이 또한 제공된다.
Description
본 출원은 세포-기반 면역요법에 사용되는 T 세포를 유도하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 목적하는 항원 특이적 T 세포 수용체 유전자를 보유하는 T 세포를 iPS 세포와 같은 다능성 줄기세포로부터 효율적이고 확실하게 유도하는 방법이 제공된다. 본 출원은 또한 iPS 세포를 사용하여 세포 은행을 생성하는 방법에 관한 것이고 이는 세포-기반 면역요법에 효과적으로 사용된다.
각각의 T 세포는 상이한 특이성으로 T 세포 수용체 (TCR)를 발현한다. 감염성 질환이 발병하는 경우, 적합한 특이성을 갖는 T 세포가 병원체와 맞서게 될 T 세포 집단 (클론)을 제공하도록 증식할 것이다. 이는 후천성 면역의 기본적 개념이다. 만약 목적하는 항원에 특이적인 TCR을 보유하는 T 세포를 인위적으로 증폭할 수 있다면, 증폭된 T 세포는 입양 면역요법 (adoptive immunotherapy)에 사용될 수 있다. 특이적 T 세포의 증폭은 "클로닝 (cloning)"으로 불린다. 실제로, 환자로부터 수득된 항원 특이적 T 세포의 증폭에 의해 제조된 항원 특이적 T 세포의 자가 이식이 임상적으로 실시되고 있다. 그러나, 거의 모든 자가 T 세포 이식 요법은 "클로닝된" 세포의 정도로 정제된 세포 집단을 사용하지 않는다. 또한, 세포의 반복된 시험관 내 계대배양은 암세포를 사멸시키는 기능의 손실을 야기할 수 있다.
세포를 불멸화시킴으로써 무한히 증식할 수 있는 T 세포를 제공하는 방법이 제안되고 있다. 세포는 클로닝된 세포 집단을 제공하기 위해 불멸화되고 증식될 수 있다. 세포를 불멸화시키는 과정에는 세포와 암세포의 융합뿐만 아니라 사이토카인의 존재하에서 TCR을 자극하면서 세포의 장기간 배양을 포함할 수 있다. 그러나, 이렇게 수득된 불멸화된 T 세포의 자가-이식은 위험할 수 있다. 또한, 클로닝 과정은 세포 기능을 저하시킬 수 있다.
iPS 세포가 인간 T 세포로부터 확립되고, iPS 세포가 유도된 최초 인간 T 세포에서의 것들과 동일한 재배열된 TCR 유전자를 갖는 T 세포가 iPS 세포로부터 재-생성되고, 재-생성된 T 세포가 치료에 사용되는 세포-기반 면역요법이 제안되고 있다 (WO 2013/176197 A1 및 Vizcardo et al. Cell Stem Cell 12, 31-36 2013, 및 Nishimura T et al. Cell Stem Cell, 2013).
iPS 세포는 인간 T 세포로부터 확립되고 상기에 논의된 참고문헌에 의해 개시된 과정에 따라서 성숙 T 세포로 재-분화될 수 있다. iPS 세포의 성숙 T 세포로의 분화 동안에, TCRα 사슬은 부가적인 재배열에 적용된다 (Nishimura T et al. Cell Stem Cell, 2013). 이 부가적인 TCRα 유전자 재배열은 TCR 특이성의 손실뿐만 아니라 의도하지 않은 사슬과의 틀린짝짓기 (mispairing)에 의한 자가반응성 T 세포의 생산 가능성을 초래한다. 자가-반응성 T 세포가 생성되는 경우, 정상 조직을 손상시키는 극히 위험한 반응이 일어날 수 있다.
동형접합으로 일본인에게서 빈번하게 발견되는 HLA 일배체형을 갖는 공여자를 이용해 고도로 다양한 iPS 세포 은행을 생성하기 위한 프로젝트가 진행 중이다 (CURANOSKI, Nature vol. 488, 139 (2012) 및 Shin Kaneko, The Medical Frontline 69: 724-733, 2014). T 세포의 경우에, 동형접합 HLA 일배체형을 갖는 공여자로부터 이형접합 HLA 일배체형을 갖는 수용자로의 이식 (동종이형 (allogenic) 이식)은 절대 금기로 간주되고 있다. 따라서, iPS 세포 은행으로부터 선택된 iPS 세포로부터 재생된 목적하는 TCR을 갖는 성숙 T 세포가 사용되는 세포 기반 면역요법의 개념은 부정적으로 생각되고 있다. 수용자의 면역 체계로부터, 공여자의 T 세포는 수용자가 이형접합 HLA 일배체형을 갖고 공여자가 동형접합 HLA 일배체형을 갖는 경우 자가 (자가이식, autograft)이지만, 공여자의 T 세포로부터, 수용자의 체세포는 비-자가 (동종이식, allograft)이다. 이러한 이유로 인해, 수용자의 사망을 초래하는 심각한 이식편대숙주 (graft-versus-host) 반응을 초래할 위험성이 보고되었다 (Ito et al. Lancet.331:413.1988).
선행기술문헌
특허문헌
특허 문헌 1: WO2013/176197 A1
특허 문헌 2: WO2011/096482 A1
비특허문헌
비-특허 문헌 1: Vizcardo et al. Cell Stem Cell. 12:31-36. 2013
비-특허 문헌 2: Nishimura T et al. Cell Stem Cell. 12:114-226 2013
비-특허 문헌 3: Ito et al. Lancet.331:413.1988
비-특허 문헌 4: Bendle GM et al. Nat. Med.16(5):565-70.2010
비-특허 문헌 5: Cyranoski, Nature. 488:139.2012
비-특허 문헌 6: Shin Kaneko, The Medical Frontline 69:724-733, 2014
비-특허 문헌 7: Le Cong et al. Science.39:819.2013
비-특허 문헌 8: Prashant Mali et al. Science.39:823.2013
발명의 요약
본 출원은 목적하는 TCR을 보유하는 T 세포 클론을 다능성 줄기세포로부터 유도하는 방법을 제공한다. 본 출원은 또한 iPS 세포로부터 세포-기반 면역요법을 위한 세포 은행을 생성하는 방법 및 세포-기반 면역요법을 위한 세포 은행을 제공한다.
일 실시양태에서, 본 출원은 하기 단계를 포함하는, 세포-기반 면역요법을 위한 T 세포를 유도하는 방법을 제공한다:
(1) 목적하는 항원에 특이적인 T 세포 수용체 (TCR)를 인코딩하는 유전자를 보유하는 Rag1 및/또는 Rag2 유전자 넉아웃 인간 다능성 줄기세포를 제공하는 단계, 그리고
(2) 단계 (1)의 다능성 줄기세포로부터 T 세포를 유도하는 단계.
이 실시양태에서, "목적하는 항원에 특이적인 T 세포 수용체 (TCR)를 인코딩하는 유전자를 보유하는 Rag1 및/또는 Rag2 넉아웃 인간 다능성 줄기세포"는 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다:
(a) 항원 특이적 TCR을 인코딩하는 유전자를 보유하는 다능성 줄기세포를 유도하는 단계, 및 (b) 다능성 줄기세포의 Rag1 및/또는 Rag2 유전자를 게놈 편집 (genome editing)에 의해 넉아웃시키는 단계. 이 실시양태에서, 항원 특이적 TCR을 인코딩하는 유전자를 보유하는 다능성 줄기세포는 목적하는 TCR을 보유하는 T 세포로부터 다능성 줄기세포를 유도함으로써 수득 될 수 있다. 대안적으로, 항원 특이적 TCR을 인코딩하는 유전자가 다능성 줄기세포 내로 도입될 수 있다.
대안적으로, "목적하는 항원에 특이적인 TCR을 인코딩하는 유전자를 보유하는 Rag1 및/또는 Rag2 넉아웃 인간 다능성 줄기세포"는 다능성 줄기세포에서 Rag1 및/또는 Rag2 유전자를 게놈 편집에 의해 넉아웃시킨 후, 항원 특이적 TCR을 인코딩하는 유전자를 Rag1 및/또는 Rag2 넉아웃 세포 내로 도입함으로써 제조될 수 있다.
이 출원에서, Rag1 및/또는 Rag2 유전자는 게놈 편집, 특히, CRISPR-Cas 9 또는 TALEN 시스템을 이용한 게놈 편집에 의해 두 유전자좌 내에 해독틀 변이를 도입함으로써 넉아웃될 수 있다. Rag1 및/또는 Rag2 유전자는 또한 상동 재조합에 의해 넉아웃될 수 있다.
다능성 줄기세포에서 Rag1 및/또는 Rag2 유전자를 넉아웃시킴으로써, TCR의 재배열이 목적하는 TCR을 보유하는 다능성 줄기세포의 T 세포로의 분화 동안에 일어나지 않거나 일어난 가능성이 희박하다. 따라서, 이 실시양태에 의해 제공된 세포-기반 면역요법을 위한 T 세포는 목적하는 TCR을 보유하는 모노클론 세포일 것이고, 따라서 안전하고 효과적인 면역요법을 실시하는데 사용될 수 있다.
본 출원의 다른 실시양태에서, 동형접합 HLA 일배체형을 갖는 공여자로부터 유래한 Rag1 또는 Rag2 넉아웃 iPS 세포가 각 공여자의 HLA에 대한 정보와 관련하여 보관된 세포-기반 면역요법을 위한 iPS 세포 은행이 제공될 것이다.
동형접합 HLA 일배체형을 갖는 건강한 지원자로부터 유래한 세포로부터 확립된 iPS 세포, 즉 거부 반응을 초래할 가능성이 더 적은 iPS 세포 (Shin Kaneko, The Medical Frontline, 69: 724-733, 2014.)를 포함하는 iPS 세포 스톡 (stock)을 생성하기 위한 프로젝트가 현재 진행중이다. 두 번째 실시양태에서 사용된 iPS 세포는 그로부터 상기 iPS 세포가 확립되어 있는 각각의 건강한 지원자의 HLA 정보와 관련하여 iPS 세포가 비축된 iPS 세포 스톡으로부터 수득 될 수 있다.
이 실시양태의 세포-기반 면역요법을 위한 iPS 세포 은행은 다양한 유형의 면역요법에 사용될 수 있다. 세포-기반 면역요법에 사용되는 경우, HLA-매칭된 (matched), 즉 치료되는 개체의 적어도 하나의 HLA 일배체형이 공여자의 동형접합 HLA 일배체형과 매칭되는 공여자로부터 확립된 iPS 세포를 선택하고, 치료를 위해 TCR을 인코딩하는 유전자를 선택된 iPS 세포 내로 도입한다. TCR-도입된 iPS 세포는 그 후에 T 세포로 분화하여 개체에 적합한 세포-기반 면역요법을 위한 T 세포를 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 하기 단계를 포함하는, 세포-기반 면역요법을 위한 iPS 세포 은행을 생성하는 방법이 제공된다: (1) 동형접합 HLA 일배체형을 갖는 공여자로부터 유래한 세포로부터 확립된 iPS 세포를 제공하는 단계, (2) iPS 세포에서 Rag1 및/또는 Rag2 유전자를 게놈 편집에 의해 넉아웃시키는 단계, (3) 목적하는 TCR을 인코딩하는 유전자를 단계 (2)에서 수득된 Rag1 및/또는 Rag2 유전자 넉아웃 iPS 세포 내로 도입하는 단계, 및 각 공여자의 HLA 및 TCR을 인코딩하는 도입된 유전자의 정보와 함께 iPS 세포를 보관하는 단계. 이 방법에서, 치료에 유용한 TCR 유전자가 도입된 iPS 세포를 보관한다. 이 실시양태에 따르면, 세포-기반 면역요법을 위한 T 세포가 신속하게 제공될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 하기 단계를 포함하는, 세포-기반 면역요법을 위한 T 세포를 유도하는 방법이 제공된다: (1) 동형접합 HLA 일배체형을 갖는 공여자로부터 유래한 세포로부터 확립된 iPS 세포가 각 공여자의 HLA에 대한 정보와 관련하여 보관된 iPS 세포 은행으로부터, 치료되는 개체의 적어도 하나의 HLA 일배체형과 매치하는 동형접합 HLA 일배체형을 갖는 공여자의 세포로터 확립된 iPS 세포를 선별하는 단계, (2) 선별된 iPS 세포에서 Rag1 및/또는 Rag2 유전자를 게놈 편집에 의해 넉아웃시키는 단계, (3) 목적하는 TCR을 인코딩하는 유전자를 단계 (2)에서 수득된 Rag1 및/또는 Rag2 유전자 넉아웃 iPS 세포에 도입하는 단계, 및 (4) TCR 도입된 Rag1 및/또는 Rag2 넉아웃 iPS 세포를 T 세포로 분화시키는 단계.
또 다른 실시양태에서, 본 출원에 의해 제공된 세포-기반 면역요법을 위한 T 세포를 유도하는 방법에 의해 수득된 T 세포를 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함하는, 세포-기반 면역요법 방법이 제공된다.
목적하는 TCR 유전자를 보유하는 다능성 줄기세포에서 Rag1 및/또는 Rag2 유전자를 넉아웃시킴으로써, 다능성 줄기세포의 T 세포로의 분화 동안에 TCR-재배열이 차단되거나 잘 억제된다. 이 방법에 의해 유도된 T 세포는 목적하는 TCR을 보유하는 클론 증대된 (clonally expanded) 세포로 사용된다.
추가 실시양태에서, 동형접합 HLA 일배체형을 갖는 공여자의 세포로부터 확립된 목적하는 항원에 특이적인 TCR을 인코딩하는 유전자를 보유하는 다능성 줄기세포로부터 T 세포 전구체 또는 성숙 T 세포를 유도하고, 수득된 T 세포 전구체 또는 성숙 T 세포를 그의 하나 또는 둘 모두의 HLA 일배체형이 공여자의 HLA 일배체형과 매치하는 수용자에 투여하는 것을 포함하는, 세포-기반 면역요법 방법이 제공된다. 또한, 본 출원은 동형접합 HLA 일배체형을 갖는 공여자의 세포로부터 확립된 목적하는 항원에 특이적인 TCR을 인코딩하는 유전자를 보유하는 iPS 세포가 각 공여자의 HLA 및 TCR에 대한 정보와 관련하여 보관된 iPS 세포 은행을 제공한다.
동종이형 (allogeneic) 이식의 경우에, 그의 HLA가 수용자의 것과 완벽히 동일한 공여자를 찾는 것은 거의 불가능하다. 일단 T 세포가 이식되면, 공여자 T 세포는 공격 표적으로서 HLA 미스매치를 인식할 수 있다. 그 결과, 이식된 공여자 T 세포의 일부가 수용체 세포를 공격하는 소위 이식편대숙주 반응이 일어난다.
반면, 본 출원의 방법에 의해 유도된 T 세포는 단일 TCR을 갖는 클론 증대된 세포이고 단일 T 세포 특이성을 발휘한다. 따라서, 동형접합 HLA 일배체형을 갖는 공여자로부터 유래한 세포가 그중 하나가 공여자의 HLA 일배체형과 매치하는 이종 HLA 일배체형을 갖는 수용자 내로 이식 (동종이형 이식)된다고 하더라도, 이식편대숙주 반응을 야기할 가능성은 유의미하게 낮다.
도 1은 실시예 1에서 확립된 iPS 세포 콜로니의 사진이다.
도 2는 CD4CD8 이중 양성 세포가 동형접합 HLA 일배체형을 갖는 공여자의 말초혈액 T 세포로부터 확립된 T-iPS 세포로부터 유도되었음을 나타내는 FACS 분석 결과이다.
도 3은 동형접합 HLA 일배체형을 갖는 공여자의 말초혈액 T 세포로부터 확립된 T-iPS 세포로부터 유도된 CD8 양성 T 세포가 자극기로 사용되고 공여자 A 및 B 각각의 말초혈액 단핵구 세포로부터 분리된 CD8 양성 T 세포가 효과기 세포로 사용된, 실시예 2의 결과를 나타낸다. 이들 세포를 6일간 동시-배양한 후 세포 분열을 유세포분석에 의해 평가하였다.
도 4는 동형접합 HLA 일배체형을 갖는 iPS 세포로부터 유도된 CD8 양성 T 세포가 그의 하나가 iPS 세포의 HLA 일배체형과 매치하는 HLA 일배체형을 갖는 공여자 A로부터의 세포에 대해 MLR 반응을 발휘하지 않았음을 나타낸다. 반면, T 세포는 iPS 세포의 HLA 일배체형과 전혀 매치하지 않는 HLA 일배체형을 갖는 공여자 B의 T 세포에 대해 MLR 반응을 발휘하였다.
도 5는 동형접합 HLA 일배체형을 갖는 iPS 세포로부터 유도된 CD8 양성 T 세포가 그의 하나가 iPS 세포의 HLA 일배체형과 매치하는 이형접합 HLA 일배체형을 갖는 NK 세포를 활성화시켰음을 나타낸다.
도 6은 LMP2 테트라머 양성-CD8 양성 T 세포가 실시예 4에서 건강한 지원자의 T 세포로부터 유도되었음을 나타내는 FACS 분석 결과이다.
도 7은 EB 바이러스로 이미 감염되어 있는 HLA-A2402를 갖는 건강한 지원자로부터 수득된 말초혈액 유래의 LMP2 펩티드의 사용에 의해 유도된 T 세포가 실시예 4에서 펩티드 특이적 살해 활성을 발휘하였음을 나타낸다.
도 8은 LMP2 펩티드 특이적 T 세포로부터 유도된 iPS 세포 콜로니의 사진이다.
도 9는 LMP2 펩티드 특이적 T 세포로부터 확립된 T-iPS 세포의 T 세포로의 분화 13일째에 세포의 FACS 분석 결과다.
도 10은 LMP2 펩티드 특이적 T 세포로부터 확립된 T-iPS 세포의 T 세포로의 분화 36일째에 세포의 FACS 분석 결과다.
도 11은 LMP2 펩티드 특이적 T 세포로부터 확립된 T-iPS 세포의 T 세포로의 분화 41일째에 세포의 FACS 분석 결과다. LMP2 특이적 성숙 T 세포 (CTL)의 생성이 확인되었다.
도 12는 LMP2 펩티드 특이적 T 세포로부터 확립된 T-iPS 세포로부터 재-생성된 성숙 T 세포 (CTL)의 LMP2 특이적 살해 활성을 나타낸다. LMP2 펩티드의 존재 (p+) 또는 부재 (p-) 시의 살해 활성을 표적 세포로 LCL를 사용하여 관찰하였다.
도 13은 LMP2 펩티드 특이적 T 세포로부터 확립된 T-iPS 세포로부터 재-생성된 성숙 T 세포의 자연 살해 세포-유사 활성을 나타낸다.
도 14는 WT1 테트라머 양성 및 CD8 양성 세포가 실시예 5에서 동형접합 HLA 일배체형을 갖는 공여자의 세포로부터 확립된 T-iPS 세포로부터 유도되었음을 보여주는 FACS 분석 결과이다.
도 15는 WT1 펩티드 특이적 T 세포로부터 확립된 iPS 세포 콜로니의 사진이다.
도 16은 WT1 펩티드 특이적 T 세포로부터 확립된 T-iPS 세포의 T 세포로의 분화 13일째에 세포의 FACS 분석 결과이다.
도 17은 WT1 펩티드 특이적 T 세포로부터 확립된 T-iPS 세포의 T 세포로의 분화 36일째에 세포의 FACS 분석 결과이다.
도 18은 실시예 6에서 TCR 도입된 iPS 세포로부터 분화된 T 세포의 FACS 분석 결과이다.
도 19는 실시예 7에서 Rag2 유전자 넉아웃 T-iPS 세포의 게놈에 대한 T7E 검정의 결과를 나타낸다.
도 20은 실시예 7에서 T-iPS 세포 (TKT3v) 및 Rag2 넉아웃 T-iPS 세포 (Rag2KO)로부터 분화된 T 세포의 FACS 분석 결과를 나타낸다.
도 21은 T-iPS 세포 (TKT3v)에 대한 TKT3v의 TCRα 사슬 내 V 및 C 영역 내 각 분절을 표적하는 프라이머를 이용한 RT-PCR의 결과를 나타낸다.
도 22는 T-iPS 세포 (TKT3v)에서 Rag2가 CD4CD8 이중 음성 세포로부터 CD4CD8 이중 양성 T 세포로의 세포 분화 시 활성화되었음을 나타낸다.
도 23은 T-iPS 세포로부터 분화된 CD4CD8 이중 음성 T 세포 (TKT3v)에 대한 TKT3v의 TCRα 사슬의 V 및 C 영역 내 각 분절을 표적하는 프라이머를 이용한 RT-PCR의 결과를 나타낸다.
도 24는 T-iPS 세포로부터 분화된 CD4CD8 이중 양성 T 세포 (TKT3v)에 대한 TKT3v의 TCRα 사슬의 V 및 C 영역 내 각 분절을 표적하는 프라이머를 이용한 RT-PCR의 결과를 나타낸다.
도 25는 Rag2 넉아웃 TKT3v/Rag2KO iPS 세포로부터 분화된 DP 세포에서 TCRα 사슬 재배열을 나타낸다.
도 26은 CD8 단일 양성 성숙 T 세포가 TKT3V/RAG2KO iPS 세포로부터 유도된 CD4CD8 이중 양성 세포로부터 분화되었음을 나타낸다.
도 27은 Rag2 넉아웃 TKT3v/Rag2KO iPS 세포로부터 분화된 CD8 단일 양성 T 세포에서 TCR 사슬 재배열이 확인되었음을 나타낸다.
도 28은 실시예 8에서 Rag2 유전자가 넉아웃되었음을 나타낸다.
도 29는 실시예 9에서 T-iPS 세포 (WT) 및 Rag2 넉아웃 T-iPS 세포 (Rag2KO)로부터 상대적으로 장시간에 걸쳐서 분화된 T 세포의 FACS 분석 결과를 나타낸다.
도 30은 실시예 9에서 Rag2 넉아웃 T-iPS 세포로부터 분화된 CD8 양성 세포가 TCR을 유지하였음을 나타낸다.
도 2는 CD4CD8 이중 양성 세포가 동형접합 HLA 일배체형을 갖는 공여자의 말초혈액 T 세포로부터 확립된 T-iPS 세포로부터 유도되었음을 나타내는 FACS 분석 결과이다.
도 3은 동형접합 HLA 일배체형을 갖는 공여자의 말초혈액 T 세포로부터 확립된 T-iPS 세포로부터 유도된 CD8 양성 T 세포가 자극기로 사용되고 공여자 A 및 B 각각의 말초혈액 단핵구 세포로부터 분리된 CD8 양성 T 세포가 효과기 세포로 사용된, 실시예 2의 결과를 나타낸다. 이들 세포를 6일간 동시-배양한 후 세포 분열을 유세포분석에 의해 평가하였다.
도 4는 동형접합 HLA 일배체형을 갖는 iPS 세포로부터 유도된 CD8 양성 T 세포가 그의 하나가 iPS 세포의 HLA 일배체형과 매치하는 HLA 일배체형을 갖는 공여자 A로부터의 세포에 대해 MLR 반응을 발휘하지 않았음을 나타낸다. 반면, T 세포는 iPS 세포의 HLA 일배체형과 전혀 매치하지 않는 HLA 일배체형을 갖는 공여자 B의 T 세포에 대해 MLR 반응을 발휘하였다.
도 5는 동형접합 HLA 일배체형을 갖는 iPS 세포로부터 유도된 CD8 양성 T 세포가 그의 하나가 iPS 세포의 HLA 일배체형과 매치하는 이형접합 HLA 일배체형을 갖는 NK 세포를 활성화시켰음을 나타낸다.
도 6은 LMP2 테트라머 양성-CD8 양성 T 세포가 실시예 4에서 건강한 지원자의 T 세포로부터 유도되었음을 나타내는 FACS 분석 결과이다.
도 7은 EB 바이러스로 이미 감염되어 있는 HLA-A2402를 갖는 건강한 지원자로부터 수득된 말초혈액 유래의 LMP2 펩티드의 사용에 의해 유도된 T 세포가 실시예 4에서 펩티드 특이적 살해 활성을 발휘하였음을 나타낸다.
도 8은 LMP2 펩티드 특이적 T 세포로부터 유도된 iPS 세포 콜로니의 사진이다.
도 9는 LMP2 펩티드 특이적 T 세포로부터 확립된 T-iPS 세포의 T 세포로의 분화 13일째에 세포의 FACS 분석 결과다.
도 10은 LMP2 펩티드 특이적 T 세포로부터 확립된 T-iPS 세포의 T 세포로의 분화 36일째에 세포의 FACS 분석 결과다.
도 11은 LMP2 펩티드 특이적 T 세포로부터 확립된 T-iPS 세포의 T 세포로의 분화 41일째에 세포의 FACS 분석 결과다. LMP2 특이적 성숙 T 세포 (CTL)의 생성이 확인되었다.
도 12는 LMP2 펩티드 특이적 T 세포로부터 확립된 T-iPS 세포로부터 재-생성된 성숙 T 세포 (CTL)의 LMP2 특이적 살해 활성을 나타낸다. LMP2 펩티드의 존재 (p+) 또는 부재 (p-) 시의 살해 활성을 표적 세포로 LCL를 사용하여 관찰하였다.
도 13은 LMP2 펩티드 특이적 T 세포로부터 확립된 T-iPS 세포로부터 재-생성된 성숙 T 세포의 자연 살해 세포-유사 활성을 나타낸다.
도 14는 WT1 테트라머 양성 및 CD8 양성 세포가 실시예 5에서 동형접합 HLA 일배체형을 갖는 공여자의 세포로부터 확립된 T-iPS 세포로부터 유도되었음을 보여주는 FACS 분석 결과이다.
도 15는 WT1 펩티드 특이적 T 세포로부터 확립된 iPS 세포 콜로니의 사진이다.
도 16은 WT1 펩티드 특이적 T 세포로부터 확립된 T-iPS 세포의 T 세포로의 분화 13일째에 세포의 FACS 분석 결과이다.
도 17은 WT1 펩티드 특이적 T 세포로부터 확립된 T-iPS 세포의 T 세포로의 분화 36일째에 세포의 FACS 분석 결과이다.
도 18은 실시예 6에서 TCR 도입된 iPS 세포로부터 분화된 T 세포의 FACS 분석 결과이다.
도 19는 실시예 7에서 Rag2 유전자 넉아웃 T-iPS 세포의 게놈에 대한 T7E 검정의 결과를 나타낸다.
도 20은 실시예 7에서 T-iPS 세포 (TKT3v) 및 Rag2 넉아웃 T-iPS 세포 (Rag2KO)로부터 분화된 T 세포의 FACS 분석 결과를 나타낸다.
도 21은 T-iPS 세포 (TKT3v)에 대한 TKT3v의 TCRα 사슬 내 V 및 C 영역 내 각 분절을 표적하는 프라이머를 이용한 RT-PCR의 결과를 나타낸다.
도 22는 T-iPS 세포 (TKT3v)에서 Rag2가 CD4CD8 이중 음성 세포로부터 CD4CD8 이중 양성 T 세포로의 세포 분화 시 활성화되었음을 나타낸다.
도 23은 T-iPS 세포로부터 분화된 CD4CD8 이중 음성 T 세포 (TKT3v)에 대한 TKT3v의 TCRα 사슬의 V 및 C 영역 내 각 분절을 표적하는 프라이머를 이용한 RT-PCR의 결과를 나타낸다.
도 24는 T-iPS 세포로부터 분화된 CD4CD8 이중 양성 T 세포 (TKT3v)에 대한 TKT3v의 TCRα 사슬의 V 및 C 영역 내 각 분절을 표적하는 프라이머를 이용한 RT-PCR의 결과를 나타낸다.
도 25는 Rag2 넉아웃 TKT3v/Rag2KO iPS 세포로부터 분화된 DP 세포에서 TCRα 사슬 재배열을 나타낸다.
도 26은 CD8 단일 양성 성숙 T 세포가 TKT3V/RAG2KO iPS 세포로부터 유도된 CD4CD8 이중 양성 세포로부터 분화되었음을 나타낸다.
도 27은 Rag2 넉아웃 TKT3v/Rag2KO iPS 세포로부터 분화된 CD8 단일 양성 T 세포에서 TCR 사슬 재배열이 확인되었음을 나타낸다.
도 28은 실시예 8에서 Rag2 유전자가 넉아웃되었음을 나타낸다.
도 29는 실시예 9에서 T-iPS 세포 (WT) 및 Rag2 넉아웃 T-iPS 세포 (Rag2KO)로부터 상대적으로 장시간에 걸쳐서 분화된 T 세포의 FACS 분석 결과를 나타낸다.
도 30은 실시예 9에서 Rag2 넉아웃 T-iPS 세포로부터 분화된 CD8 양성 세포가 TCR을 유지하였음을 나타낸다.
본 출원에서, 하기 단계를 포함하는, 세포-기반 면역요법을 위한 T 세포를 유도하는 방법이 제공된다:
(1) 목적하는 항원에 특이적인 T 세포 수용체 (TCR)를 인코딩하는 유전자를 보유하는 Rag1 및/또는 Rag2 유전자 넉아웃 인간 다능성 줄기세포를 제공하는 단계, 및
(2) 단계 (1)의 다능성 줄기세포로부터 T 세포를 유도하는 단계.
본 명세서 및 청구범위에서, "다능성 줄기세포"는 다능성 (pluripotency), 즉 체내에서 다양한 유형의 세포로 분화할 수 있는 능력, 및 자가-증식능을 갖는 줄기세포를 지칭한다. 다능성 줄기세포의 예시에는 배아 줄기세포 (ES 세포), 핵 이식 배아 줄기세포 (ntES 세포), 생식계 줄기세포 (GS 세포), 배아 생식세포 (EG 세포), 유도 다능성 줄기세포 (iPS 세포), 및 배양된 섬유아세포 및 골수 줄기세포로부터 유래된 다능성 세포 (Muse 세포)가 포함될 수 있다. iPS 세포 및 Muse 세포는 이들 다능성 줄기세포가 배아를 파괴하지 않고 수득 될 수 있다는 점에서 바람직하다. 다능성 줄기세포는 포유동물로부터 유래한 것들이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 인간 다능성 줄기세포이다. iPS 세포가 바람직하게 사용된다.
일 실시양태에서, 목적하는 항원에 특이적인 TCR을 인코딩하는 유전자를 보유하는 Rag1 및/또는 Rag2 넉아웃 인간 다능성 줄기세포는 목적하는 TCR을 보유하는 인간 T세포로부터 iPS 세포를 확립한 후 확립된 iPS 세포 (T-iPS 세포)에서 Rag1 및/또는 Rag2 유전자를 넉아웃시킴으로써 수득 될 수 있다.
본 명세서 및 청구범위에서, "T 세포"는 T 세포 수용체 (TCR)로 불리는 항원에 대한 수용체를 발현하는 세포를 지칭한다. T 세포의 TCR이 T 세포로부터 확립된 iPS 세포에서 유지된다는 사실은 문헌 [WO2011/096482, Vizcardo et al. Cell Stem Cell, 12, 31-36, 2013 및 Nishimura T et al. Cell Stem Cell, 114-126, 2013]에 보고되어 있다.
iPS 세포의 기원으로 사용된 T 세포는 바람직하게는 CD3에 추가하여, CD4 및 CD8 중 적어도 하나를 발현하는 T 세포일 수 있다. 바람직한 인간 T 세포의 예시에는 CD4 양성 세포인 헬퍼/조절 T 세포; CD8 양성 세포인 세포독성 T 세포; CD45RA+CD62L+ 세포인 나이브 (naive) T 세포; CD45RA-CD62L+ 세포인 중심 기억 T 세포, CD45RA-CD62L- 세포인 효과기 기억 T 세포 및 CD45RA+CD62L- 세포인 말단 효과기 T 세포가 포함될 수 있다.
인간 T 세포는 공지의 과정에 의해 인간 조직으로부터 분리될 수 있다. 인간 조직은 그 조직이 상기에 언급된 유형의 T 세포를 함유하고 있기만 하다면 특별히 제한되지 않으며, 이의 예시에는 말초혈액, 림프절, 골수, 가슴샘, 비장, 제대혈, 및 병소 부위 조직이 포함된다. 이들 중에서, 말초혈액 및 제대혈이 인체로부터 덜 침습적으로 유래 될 수 있고 용이하게 제조될 수 있기 때문에 이들이 바람직하다. 인간 T 세포를 분리하는 공지의 과정에는, 예를 들어, 하기에 언급된 실시예에 나타낸 바와 같은, CD4와 같은 세포 표면 마커에 대해 지시된 항체를 이용한 유세포분석 및 세포 분류기가 포함된다. 대안적으로, 목적하는 T 세포는 지표로서 사이토카인의 분비 또는 기능성 분자의 발현을 검출함으로써 분리될 수 있다. 이 경우에, 예를 들어, T 세포는 이들이 Th1 또는 Th2 유형인지 여부에 따라서 상이한 사이토카인을 분비하고, 따라서 목적하는 Th 유형의 T 세포는 지표로서 이 사이토카인을 사용하여 T 세포를 선별함으로써 분리될 수 있다. 유사하게, 세포독성 (살해) T 세포는 지표로서 그랜자임 (granzyme), 퍼포린 (perforin) 또는 기타 등등의 분비 또는 생산을 이용하여 분리될 수 있다.
"목적하는 항원에 특이적인 TCR을 보유하는 T 세포"는 공여자로부터 수득되거나 그로부터 유래한 TCR을 갖는 세포독성 T 림프구일 수 있다. 예를 들어, 암 항원에 특이적인 세포독성 T 림프구는 통상적인 절차에 의해 공여자로부터 수득된 림프구를 치료되는 암에 특이적인 암 항원과 동시-배양함으로써 제조될 수 있다. 암 항원이 다양한 암에 대해 동정되어 있고 암 항원 또는 이의 에피토프 펩티드를 이용하여 세포독성 T 림프구를 유도하는 절차는 잘 알려져 있다. 대안적으로, 림프구는 치료되는 암의 세포와 동시-배양될 수 있다.
대안적으로, 치료되는 암의 암 항원에 특이적인 세포독성 T 림프구는 그 암으로부터 고통받는 개체의 말초혈액으로부터 유도될 수 있다.
"목적하는 항원에 특이적인 인간 T 세포"는 항원-결합된 주조직적합성 복합체의 테트라머 (MHC 테트라머)를 사용하여 항원에 특이적인 T 세포를 함유하는 인간 세포 배양 또는 인간 조직으로부터 분리된다.
유도 다능성 줄기 (iPS) 세포는 특이적 리프로그래밍 (reprogramming) 인자를 체세포에 도입함으로써 제조될 수 있다. iPS 세포는 ES 세포의 것과 거의 동등한 특성을 갖는 체세포-유래 인공 줄기세포이다 (K. Takahashi and S. Yamanaka. Cell.126: 663-676.2006; K. Takahashi et al. Cell. 131:861-872.2007; J. Yu et al. Science.318:1917-1920.2007; Nakagawa M. et al. Nat.Biotechnol.26:101-106.2008; 및 WO 2007/069666). 리프로그래밍 인자는 ES 세포에서 특이적으로 발현되는 유전자 또는 이의 유전자 산물, 또는 비-코딩 RNA; 또는 ES 세포의 미분화 상태를 유지하는데 중요한 역할을 하는 유전자 또는 이의 유전자 산물, 비-코딩 RNA 또는 저분자량 화합물로 구성될 수 있다. 리프로그래밍 인자에 포함되는 유전자의 예시에는 Oct3/4, Sox2, Sox1, Sox3, Sox15, Sox17, Klf4, Klf2, c-Myc, N-Myc, L-Myc, Nanog, Lin28, Fbx15, ERas, ECAT15-2, Tell, 베타-카테닌, Lin28b, Sall1 , Sall4, Esrrb, Nr5a2, Tbx3 및 Glis1이 포함되고, 이들 리프로그래밍 인자는 개별적으로 또는 조합하여 사용될 수 있다. 리프로그래밍 인자의 조합의 예시에는 WO2007/069666; WO2008/1 18820; WO2009/007852; WO2009/032194; WO2009/058413; WO2009/057831; WO2009/075119; WO2009/079007; WO2009/091659; WO2009/101084; WO2009/101407; WO2009/102983; WO2009/114949; WO2009/117439; WO2009/126250; WO2009/126251; WO2009/126655; WO2009/157593; WO2010/009015; WO2010/033906; WO2010/033920; WO2010/042800; WO2010/050626; WO 2010/056831; WO2010/068955; WO2010/098419; WO2010/102267; WO2010/11 1409; WO2010/111422; WO2010/115050; WO2010/124290; WO2010/147395; WO2010/147612; Huangfu D et al. Nat. Biotechnol. 26:795-797.2008; Shi Y et al. Cell Stem Cell.2:525-5283.2008; Eminli S et al. Stem Cells.26:2467-2474.2008; Huangfu D et al. Nat Biotechnol.26:1269-1275.2008; Shi Y et al. Cell Stem Cell.3:568-574.2008; Zhao Y et al. Cell Stem Cell.3:475-479.2008; Marson A.Cell Stem Cell.3:132-135.2008; Feng B et al. Nat Cell Biol.11:197-203.2008; R.L. Judson et al. Nat. Biotech.27:459-461.2009; Lyssiotis CA et al. Proc Natl Acad Sci USA. 106:8912-8917.2009; Kim JB et al. Nature.461:649-643.2009; Ichida JK et al. Cell Stem Cell.5:491-503.2009; Heng JC et al. Cell Stem Cell.6:167-74.2009; Han J et al. Nature. 463:1096-100.2010; Mali P et al. Stem Cells. 28:713-720.2010, 및 Maekawa M, et al. Nature.474:225-9.2011.에 개시된 것들이 포함된다. 이 단락에 인용된 문헌들의 내용은 본원에 참조로서 포함된다.
리프로그래밍 인자는 사용되는 인자의 형태에 적합한 공지의 절차에 의해서 체세포와 접촉하거나 그 내로 도입될 수 있다.
리프로그래밍 인자가 단백질의 형태인 경우, 리프로그래밍 인자는 리포펙션 (lipofection), 세포-투과성 펩티드와의 융합 (예컨대, HIV-유래 TAT 또는 폴리아르기닌), 또는 미세주입 (microinjection)과 같은 방법에 의해 체세포 내로 도입될 수 있다.
리프로그래밍 인자가 DNA의 형태인 경우, 리프로그래밍 인자는 바이러스, 플라스미드 및 인공 염색체 벡터를 비롯한 벡터의 사용; 리포펙션; 리포좀의 사용; 또는 미세주입과 같은 방법에 의해 체세포 내로 도입될 수 있다. 바이러스 벡터의 예시에는 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 (이들은 Cell.126:663-676, 2006; Cell.131:861-872.2007; 및 Science.318:1917-1920, 2007에 기술됨), 아데노바이러스 벡터 (Science.322:945-949.2008), 아데노-연관 바이러스 벡터 및 센다이 (Sendai) 바이러스 벡터 (WO 2010/008054)가 포함된다. 인공 염색체 벡터의 예시에는 인간 인공 염색체 (HAC), 효모 인공 염색체 (YAC), 및 세균 인공 염색체 (BAC 및 PAC)가 포함된다. 사용될 수 있는 플라스미드의 예시에는 포유동물 세포용 플라스미드가 포함된다 (Science, 322: 949-953, 2008). 벡터는 핵 리프로그래밍 인자의 발현을 가능케 하는 프로모터, 인핸서, 리보솜 결합 서열, 터미네이터 및/또는 폴리아데닐화 부위와 같은 조절 서열(들); 및, 필요에 따라, 약물 내성 유전자 (예컨대, 카나마이신-내성 유전자, 암피실린-내성 유전자 또는 퓨로마이신-내성 유전자), 티미딘 키나제 유전자 또는 디프테리아 독소 유전자와 같은 선별 마커의 서열; 녹색-형광 단백질 (GFP), β-글루쿠로니다제 (GUS) 또는 FLAG와 같은 리포터의 유전자 서열을 함유할 수 있다. 나아가, 체세포 내로 유전자의 도입 및 이의 발현 후, 리프로그래밍 인자를 인코딩하는 유전자, 또는 프로모터(들) 및 그에 연결된 리프로그래밍 인자를 인코딩하는 유전자 둘 모두를 제거하기 위하여, 벡터는 이들 서열의 상류 및 하류에 LoxP 서열을 가질 수 있다.
또한, 리프로그래밍 인자가 RNA의 형태인 경우, 각각의 리프로그래밍 인자는 리포펙션 또는 미세주입과 같은 방법에 의해 체세포 내로 도입될 수 있고, 5-메틸시티딘 및 슈도우리딘 (pseudouridine) (TriLink Biotechnologies)이 도입된 RNA가 분해를 억제하기 위해 사용될 수 있다 (Warren L.Cell Stem Cell.7:618-630.2010). 이 단락에 인용된 문헌은 본원에 참조로서 포함된다.
iPS 세포를 유도하기 위한 배지의 예시에는 10 내지 15% FBS (이들 배지는 적절한 경우 LIF, 페니실린/스트렙토마이신, 퓨로마이신, L-글루타민, 비필수 아미노산, β-머캅토에탄올 및/또는 기타 등등을 추가로 함유할 수 있음)가 보충된 DMEM, DMEM/F12 및 DME 배지; 및 상업적으로 이용가능한 배지 [예를 들어, 마우스 ES 세포의 배양 배지 (TX-WES 배지, Thromb-X), 영장류 ES 세포 배양 배지 (영장류 ES/iPS 세포용 배지, ReproCELL) 및 무혈청 배지 (mTeSR, Stemcell Technology)]가 포함된다.
iPS 세포를 유도하는 방법의 예시에는, 체세포 및 리프로그래밍 인자를 10% FBS가 보충된 DMEM 또는 DMEM/F12 배지에서 5% CO2의 존재하에 37℃에서 서로 접촉되게 하고, 세포를 4 내지 7일간 배양한 후, 세포를 피더 세포 (예컨대, 마이토마이신 C-처리된 STO 세포 또는 SNL 세포) 상에 도말하고, 체세포와 리프로그래밍 인자 사이의 접촉 약 10일 후 영장류 ES 세포를 배양하기 위한 bFGF-함유 배지에서 배양을 개시하고, 그로써 ES-유사 콜로니가 접촉 약 30일 내지 약 45일 후, 또는 그 이후에 나타나게 하는 방법이 포함된다.
대안적으로, 세포를 리프로그래밍 인자와 접촉시키고 10% FBS (이 배지는 적절한 경우 LIF, 페니실린/스트렙토마이신, 퓨로마이신, L-글루타민, 비필수 아미노산, β-머캅토에탄올 및 기타 등등을 추가로 함유할 수 있음)가 보충된 DMEM배지에서 약 25일 내지 약 30일 또는 그 이상 5% CO2의 존재하 37℃에서 피더 세포 (예컨대, 마이토마이신 C-처리된 STO 세포 또는 SNL 세포) 상에 배양하고, 그로써 ES-유사 콜로니가 나타나게 할 수 있다. 배양 방법의 바람직한 예시에는 리프로그래밍되는 체세포 자체가 피더 세포 대신에 사용되는 방법 (Takahashi K et al. PLoS One.4:e8067.2009 또는 WO2010/137746), 및 세포외 기질 (예컨대, 라미닌-5 (WO2009/123349), 라미닌-5 (WO2009/123349), 라미닌-10 (US2008/0213885) 또는 이의 단편 (WO2011/043405) 또는 마트리겔 (BD))이 대신 사용되는 방법이 포함된다. 이 단락에 인용된 문헌은 본원에 참조로서 포함된다.
다른 예시에는 iPS 세포가 무혈청 배지를 사용하여 확립되는 방법이 포함된다 (Sun N et al. Proc Natl Acad Sci USA. 106:15720-15725.2009). 또한, 확립 효율을 증강시키기 위하여, iPS 세포를 저산소 조건하 (0.1% 내지 15%의 산소 농도)에서 확립할 수 있다 (Yoshida Y et al. Cell Stem Cell.5:237-241.2009 또는 WO2010/013845). 이 단락에 인용된 문헌의 내용은 본원에 참조로서 포함된다.
확립 효율을 증강시키기 위해 사용되는 인자의 예시에는 히스톤 디아세틸라제 (HDAC) 억제제 [예컨대, 발프로산 (VPA), 트리코스타틴 A, 소듐 부티레이트, MC 1293, 및 M344와 같은 저-분자량 억제제, HDAC에 대한 siRNA 및 shRNA (예컨대, HDAC1 siRNA Smartpool, 등록 상표 (Millipore)), HDAC1에 대한 HuSH 29mer shRNA 컨스트럭트 (OriGene) 및 기타), 및 기타]와 같은 핵산-계 발현 억제제, MEK 억제제 (예컨대, PD184352, PD98059, U0126, SL327 및 PD0325901), 글리코겐 신타제 키나제-3 억제제 (예컨대, Bio 및 CHIR99021), DNA 메틸 트랜스퍼라제 억제제 (예컨대, 5-아자시티딘), 히스톤 메틸 트랜스퍼라제 억제제 [예를 들어, BIX-01294와 같은 저-분자량 억제제, 및 Suv39h1, Suv39h2, SetDB1 및 G9a에 대한 siRNA 및 shRNA와 같은 핵산-계 발현 억제제], L-채널 칼슘 아고니스트 (예를 들어, Bayk8644), 부티르산, TGFβ 억제제 또는 ALK5 억제제 (예컨대, LY364947, SB431542, 616453 및 A-83-01), p53 억제제 (예를 들어, p53에 대한 siRNA 및 shRNA), ARID3A 억제제 (예컨대, ARID3A에 대한 siRNA 및 shRNA), miR-291-3p, miR-294, miR-295, mir-302 및 기타 등등과 같은 miRNA, Wnt 시그널링 (예를 들어, 가용성 Wnt3a), 신경펩티드 Y, 프로스타글란딘 (예컨대, 프로스타글란딘 E2 및 프로스타글란딘 J2), hTERT, SV40LT, UTF1, IRX6, GLIS1, PITX2, DMRTB1 및 기타 등등이 포함될 수 있다. iPS 세포의 확립 시, 확립 효율을 증강시키기 위한 인자가 첨가된 배지가 사용될 수 있다.
배양 동안, 배지는 배양 2일째부터 매일 1회 신선한 배지로 교체된다. 핵 리프로그래밍에 사용된 체세포의 수는 제한되지 않으며, 일반적으로 배양 플레이트 상의 100 cm2 면적당 약 5×103 내지 약 5×l06 세포의 범위 내이다.
iPS 세포는 각각의 형성된 콜로니의 모양을 기준으로 선별될 수 있다. 체세포가 리프로그래밍되었을 경우 발현되는 유전자 (예컨대, Oct3/4 또는 Nanog)와 함께 약물 내성 유전자가 발현되도록 마커 유전자로서 약물 내성 유전자가 도입된 경우, 확립된 iPS 세포는 세포를 상응하는 약물을 함유하는 배지 (선별 배지)에서 배양함으로써 선별될 수 있다. 또한, iPS 세포는 마커 유전자가 형광 단백질의 유전자인 경우 형광 현미경 하에서의 관찰에 의해 선별될 수 있다.
Rag1 및/또는 Rag2 유전자는 문헌 [Le Cong et al. Science 39; 819, 2013 또는 Prashant Mali et al. Science 39; 823, 2013]에 교시된 바와 같은 공지의 절차에 따라서, CRISPR-Cas9 또는 TALEN과 같은 공지의 게놈 편집 시스템을 이용하거나 또는 상동 제조합에 의해 T-iPS 세포로부터 넉아웃될 수 있다.
CRISPR-Cas9는 게놈의 특정 부분에 기능적 결함을 야기하는 돌연변이를 도입하기 위한 게놈 편집의 간단하고 효과적인 방법이다. 표적 유전자는, 게놈의 특정 부분을 표적하는 단일-유도 RNA (single-guide RNA, sgRNA)를 제조하고, Cas9 뉴클리아제를 그에 sgRNA가 부착되는 게놈의 부분에 전달함으로써 이중 가닥 DNA의 절단을 야기하고, 그 후에 표적된 유전자 기능을 불활성화시키는 해독틀 삽입 및 결실 돌연변이 (indel mutation)를 야기함으로써 불활성화될 수 있다. Rag1 및/Rag2 넉아웃은 공지의 게놈 편집 절차 중 하나에 의해 달성될 수 있다
다른 실시양태에서, "목적하는 항원에 특이적인 TCR을 보유하는 Rag1 및/또는 Rag2 넉아웃 인간 다능성 줄기세포"는 인간 다능성 줄기세포로부터 Rag1 및/또는 Rag 2 유전자를 게놈 편집에 의해 넉아웃시킨 후, 항원 특이적 TCR을 인코딩하는 유전자를 Rag 1 및/또는 Rag 2 넉아웃 인간 다능성 줄기세포 내로 도입함으로써 제조될 수 있다.
이 실시양태에서, 인간 다능성 줄기세포는 면역요법으로 처리되는 개체의 체세포로부터 확립된 iPS 세포 또는 기결정된 정도로 개체의 HLA와 매치하는 HLA를 갖는 사람의 체세포로부터 확립된 iPS 세포일 수 있다. 대안적으로, iPS 세포는 공여자의 체세포로부터 이전에 확립된 것들로부터 선별되고 각 공여자의 HLA에 대한 정보와 관련하여 보관될 수 있다.
예를 들어, iPS 세포는 처리되는 개체의 HLA 일배체형의 적어도 하나와 매치하는 HLA 일배체형을 갖는 것들일 수 있고 동형접합 HLA 일배체형을 갖는 공여자의 세포로부터 확립된 iPS 세포가 각 공여자의 HLA에 대한 정보와 관련하여 보관된 iPS 세포 은행으로부터 선별될 수 있다.
본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어 "체세포"는 생식-계열 세포 또는 다능성 세포가 아닌 (정자, 정모세포, 난자, 난모세포 및 ES 세포와 같은 세포 이외) 임의의 동물 세포 (바람직하게는 인간을 비롯한 포유동물의 세포)를 의미한다. 체세포의 예시에는 태아 체세포, 신생아 체세포, 및 성숙, 건강한 및 이환된 (diseased) 체세포 중 하나, 뿐만 아니라 일차 배양된 세포, 계대배양된 세포 및 확립된 세포주 중의 하나가 포함되지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 체세포의 특정 예시에는, (1) 신경 줄기세포, 조혈 줄기세포, 중간엽 줄기세포 및 치아 속질 (dental pulp) 줄기세포와 같은 조직 줄기세포 (체세포 줄기세포); (2) 조직 전구세포; 및 (3) 림프구, 상피세포, 내피세포, 근육세포, 섬유아세포 (피부세포 등), 모발세포, 간세포, 위점막세포, 장세포, 비장세포, 췌장세포 (췌장 외분비 세포 등), 뇌세포, 폐세포, 신장세포 및 지방세포와 같은 분화된 세포가 포함되지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 낮은 침습성 측면에서, 말초혈액, 피부 및 제대혈로부터 유래한 세포가 바람직하게 사용된다.
iPS 세포에서 Rag2 유전자는 T-iPS 세포로부터 Rag1 및/또는 Rag2 유전자를 넉아웃시키기 위해 상기에 설명된 절차와 동일한 방식으로 넉아웃될 수 있다.
목적하는 항원에 특이적인 TCR을 인코딩하는 유전자가 Rag1 및/또는 Rag2 넉아웃 iPS 세포 내로 도입된다.
다양한 암 항원에 특이적인 TCR을 인코딩하는 유전자가 보고되어 있다. TCR 유전자는 암 또는 감염성 질환을 갖는 환자로부터 분리된 목적하는 항원에 특이적인 T 세포로부터 수득 될 수 있다. TCR 유전자가 이렇게 수득된 T 세포로부터 분리될 수 있다. 본 출원에서, 항원 특이적 TCR을 인코딩하는 유전자가 공여자 세포로부터 확립되었던 iPS 세포 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 이 절차는 문헌 [Morgan R.A. et al. Science, 314:126.2006 (이 문헌은 참조로서 본원에 포함됨)]에 교시된 바와 같이 수행될 수 있다. 특히, TCR 유전자를 함유하는 적합한 벡터가 iPS 세포 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, TCR 유전자는 바이러스, 플라스미드 및 인공 염색체 벡터와 같은 벡터에 의해; 또는 리포펙션, 리포좀 또는 미세주입에 의해 도입될 수 있다. 바이러스 벡터의 예시에는 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 및 센다이 바이러스 벡터가 포함된다. 인공 염색체 벡터의 예시에는 인간 인공 염색체 (HAC), 효모 인공 염색체 (YAC), 및 세균 인공 염색체 (BAC 및 PAC)가 포함된다. 사용될 수 있는 플라스미드의 예시에는 포유동물 세포의 플라스미드가 포함된다. 벡터는 TCR 유전자의 발현을 가능하게 하도록 프로모터, 인핸서, 리보솜 결합 서열, 터미네이터 및/또는 폴리아데닐화 부위와 같은 조절 서열(들)을 함유할 수 있다. 바람직하다면, 벡터는 또한 약물 내성 유전자 (예컨대, 카나마이신-내성 유전자, 암피실린-내성 유전자 또는 퓨로마이신-내성 유전자), 티미딘 키나제 유전자 또는 디프테리아 독소 유전자와 같은 선별 마커; 및 녹색-형광 단백질 (GFP), β-글루쿠로니다제 (GUS) 또는 FLAG와 같은 리포터를 함유할 수 있다.
본 명세서에서, TCR 유전자의 도입에 의해 수득된 iPS 세포는 소위 "TCR-iPS 세포"로 불린다. T 세포는 Rag1 및/또는 Rag2 넉아웃 T-iPS 또는 TCR-iPS 세포로부터 분화된다. 다능성 줄기세포를 T 세포로 분화시키는 절차는 문헌 [Timmermans et al. Journal of Immunology, 2009, 182:6879-6888, Nishimura T et al. 2013, Cell Stem Cell 114-126, WO 2013176197 A1 및 WO 2011096482 A1]에 교시된 것일 수 있다.
T 세포는 대략 αβ T 세포 및 γδ T 세포로 나뉜다. αβ T 세포에는 살해 T 세포 및 헬퍼 T 세포가 포함된다. 본 명세서 및 청구범위에서, "iPS 세포로부터 분화된 T 세포"는 모든 유형의 T 세포를 포함한다. T 세포는 임의의 T 전구세포 및 성숙 T 세포를 포함한다. 바람직하게는, T 세포는 CD3에 추가하여 CD4 및 CD8의 적어도 하나를 발현하는 것들일 수 있다.
iPS 세포로부터 분화된, T 세포 이외의, 다양한 세포 또는 조직이 이식되는 지금까지 제안된 다양한 요법에서, 이식되는 세포는 그/그녀의 평생 동안 환자의 신체 내에 고정될 것으로 예상된다. 동종이형 이식을 위해 iPS 세포 스톡으로부터 재-생성된 세포 또는 조직을 사용하는 재생 요법에서, 환자는 그들의 평생 동안 면역 억제 약물의 섭취를 필요로 한다.
반면, 동종이형 이식편은 HLA-매치된 공여자 및 수용자에서조차 주조직적합성 항원의 미스매치로 인해 종국에는 거부될 것이다. 이 점에서, 본 출원에 의해 제공된 세포-기반 면역요법은 iPS 세포로부터 재-생성된 세포 또는 조직의 다른 동종이형 이식보다 예상치 못하게 유리하다.
본 출원의 일 실시양태에서, 세포-기반 면역요법을 위한 iPS 세포 은행이 제공된다. iPS 세포 은행은 동형접합 HLA 일배체형을 갖는 공여자로부터 유래한 세포를 사용하여 생성될 수 있다. iPS 세포 은행은 iPS 세포를 동형접합 HLA 일배체형을 갖는 공여자의 세포로부터 확립하고 iPS 세포에서 Rag1 및/또는 Rag2 유전자를 넉아웃시켜 수득된 Rag2 넉아웃 iPS 세포를 각 공여자의 HLA에 대한 정보와 관련하여 보관하는 것일 수 있다.
대안적으로, 세포-기반 면역요법을 위한 세포 은행은 T-iPS 세포 또는 TCR-iPS 세포로부터 재-생성된 T 세포 전구체 또는 성숙 T 세포를 보관하는 것일 수 있다. 재-생성된 T 세포를 보관하는 장점은 요법의 개시 전에 제조에 요구되는 시간의 단축뿐만 아니라 이식 전에 세포의 품질 확인을 가능케 한다는 것일 수 있다.
본 출원의 세포-기반 면역요법에서, 재-생성된 T 세포는 식염수 또는 PBS와 같은 적합한 배지에 분산되고 분산액은 그의 적어도 하나가 공여자의 HLA 일배체형과 매치하는 HLA 일배체형을 갖는 환자에 투여될 수 있다. 세포는 정맥 내로 투여될 수 있다.
투여되는 세포의 수는 제한되지 않으며, 예를 들어, 환자의 연령, 성별, 키 및 체중과 처리되는 질환 및 병태를 기준으로 결정될 수 있다. 최적의 세포 수는 임상 연구를 통해서 결정될 수 있다.
T 세포는 다양한 항원을 표적 할 수 있고, 따라서 이 출원의 방법은 그 요법에 적합한 TCR을 선별함으로써, 이들로 제한되는 것은 아니지만, 암, 감염성 질환, 자가면역 질환 및 알러지를 비롯한 다양한 질환에 대한 세포-기반 면역요법을 위해 적용될 수 있다.
본 출원은 또한 동형접합 HLA 일배체형을 갖는 공여자의 세포로부터 확립되었던 iPS 세포로부터 유도된 T 세포 전구체 또는 성숙 T 세포를 유도하는 단계 및 T 세포 전구체 또는 성숙 T 세포를 그의 HLA 일배체형의 적어도 하나가 공여자의 HLA 일배체형과 일치하는 환자에 투여하는 단계를 포함하는, 세포-기반 면역요법을 위한 방법을 제공한다. 또한, 본 출원은 동형접합 HLA 일배체형을 갖는 공여자의 세포로부터 확립된 목적하는 항원에 대해 특이적인 TCR을 인코딩하는 유전자를 보유하는 iPS 세포가 각 공여자의 HLA에 대한 정보와 관련하여 보관된, iPS 세포 은행을 제공한다.
실시예 4 및 5에 나타난 바와 같이, Rag1 및/또는 Rag2 유전자가 T-iPS 세포로부터 넉아웃되지 않은 경우에도, T-iPS 세포의 T 세포로의 분화 초기에 항원을 이용한 자극을 제공함으로써, 그로부터 T-iPS 세포가 확립되었던 최초 T 세포의 항원 특이성을 유지하는 T 세포를 재-생성할 수 있다. 본 출원에서, Rag1 및/또는 Rag2 유전자의 넉아웃 없이 T-iPS 세포 또는 TCR-iPS 세포로부터 생성된 iPS 세포 은행이 또한 제공된다. 본 출원은 하기에 나타낸 실시예와 함께 더욱 상세히 설명될 것이다.
실시예 1
동형접합 HLA 일배체형을 갖는 T 세포로부터 iPS 세포의 확립 및 이렇게 수득된 iPS 세포로부터 T 세포의 재생성
HLA-A*3303-B*4403-C*1403-ERB1*1302 동형접합체를 갖는 공여자로부터 수득된 말초혈액을 사용하였다.
1) 호모-T-iPS 세포의 확립
사용된 배지는 다음과 같다:
| 양 | 최종 농도 | |
| RPMI | 45 ml | |
| 인간 AB 혈청 | 5 ml | 10% |
| 총 | 50 ml |
A. CD8 양성 T 세포의 활성화
1. 건강한 지원자로부터 수득된 말초혈액 단핵세포를 Ficoll을 사용하여 정제하고 CD8 양성 세포를 MACS 비드를 사용하여 농축하였다.
2. 농축된 세포를 T 세포 배지 내로 분산시키고 IL-2 (최종 농도: 30 U/mL), IL-7 (최종 농도: 5 ng/mL), 및 IL-15 (최종 농도: 1 ng/mL)를 첨가하였다. Dynabeads 인간 T-활성제 CD3/CD28을 1:1의 비드-대-세포 비율을 제공하도록 첨가하고, 혼합물을 2일간 인큐베이션하여 CD8 양성 세포를 활성화하였다.
B. 센다이 바이러스 벡터를 이용한 4종의 야마나카 (Yamanaka) 인자 및 SV40의 도입
1. 활성화된 CD8 양성 세포를 T 세포 배지에 분산시키고, 4종의 야마나카 인자 및 SV40를 보유하는 센다이 바이러스를 배지에 첨가한 후 세포 현탁액을 2일간 배양하였다.
2. 수득된 세포를 T 세포 배지로 세척하고 IL-2 (최종 농도: 30 U/mL), IL-7 (최종 농도: 5 ng/mL), 및 IL-15 (최종 농도: 1 ng/mL)가 보충된 T 세포 배지를 첨가하였다. 세포를 2일간 추가 배양하였다.
3. 그 후에, 모든 세포를 수집하고 IL-2 (최종 농도: 30 U/mL)가 보충된 T 세포 배지에 분산시켰다. 세포 현탁액을 피더 세포 위에 접종하였다.
4. 2일째, 배지의 절반을 신선한 iPS 세포 배지로 교체하였다. 그 후에, 배지의 절반을 매일 신선한 iPS 세포 배지로 교체하고 세포를 계속 배양하였다.
C. 배양액으로부터 iPS 세포 콜로니의 픽업 (Picking up)
1. 야마나카 인자의 도입 3주 후, iPS 세포의 콜로니를 시각적으로 관찰하였다.
2. 콜로니를 200 μl 피펫 팁을 이용해 기계적으로 픽업하였다.
3. 몇몇 클론을 개별적으로 확립하였다. 수득된 클론의 콜로니 사진이 도 1에 나타나있다.
2) iPS 세포로부터 T 세포의 분화
배지는 다음과 같다:
| 내용물 | 첨가량 | 최종 농도 |
| αMEM 배지 | 500 mL | |
| FCS | 125 mL | 20% |
| 페니실린-스트렙토마이신 용액* | 6.25 mL | 1% |
| 총 | 631.25 mL |
*페니실린 (10,000 U/ml)과 스트렙토마이신 (10,000 μg/ml)의 혼합물. 최종 농도는 각각 100 U/ml 및 100 μg/ml이었다.
| 내용물 | 첨가량 | 최종 농도 |
| αMEM 배지 | 500 mL | |
| FCS | 125 mL | 20% |
| 페니실린-스트렙토마이신 용액* | 5 mL | 1% |
| hrIL-7 (스톡: 10 μg/ mL) | 315 μL | 5 ng/mL |
| hrFlT-3L (스톡: 10 μg/mL) | 315 μL | 5 ng/mL |
| hrSCF (스톡: 10 μg/mL) | 630 μL | 10 ng/mL |
| Total | 631.26 mL |
*페니실린 (10,000 U/ml)과 스트렙토마이신 (10,000 μg/ml)의 혼합물. 최종 농도는 각각 100 U/ml 및 100 μg/ml이었다.
OP9 세포의 제조
PBS 중의 6 mL의 0.1% 젤라틴 용액을 10 cm 접시 (Falcon)에 첨가하고 37℃에서 30분 이상 인큐베이션하였다. OP9 간질세포를 트립신/EDTA 용액을 이용하여 융합성 배양 접시로부터 탈착하고 수득된 세포의 약 1/4을 젤라틴-코팅된 10 cm 세포 배양 접시에 첨가하였다. 10 mL의 배지 A를 세포 배양 접시에 첨가하였다. 4일 후, 10 mL의 배지 A를 접시에 첨가하였다 (최종 양은 20 mL이었다).
iPS 세포로부터 조혈 전구세포의 유도
동시-배양에 사용되는 OP9 간질세포 배양액 중의 배지를 흡인하여 제거하고 신선한 배지 A로 교체하였다. 인간 iPS 세포 배양 접시 내 배지를 또한 흡인하여 제거하고 10 mL의 신선한 배지 A를 거기에 첨가하였다. 인간 iPS 세포 덩어리 (cell mass)를 EZ-패시지 롤러 (EZ-passage roller)를 이용해 절단하였다. 절단된 iPS 세포 덩어리를 200 μL 팁이 구비된 피펫맨 (pipetteman)을 이용해 현탁하였다. iPS 세포 클러스터의 수를 시각적으로 계수하고 대략 600개의 클러스터를 OP9 세포상에 접종하였다. iPS 세포의 클론 당 3종 이상의 접시를 사용하였고, 계대배양 시, 모든 접시의 세포를 일단 한 접시 내에서 풀링한 (pooled) 후 접시들 사이의 불균형을 줄이기 위해 동일한 수의 접시로 재분배하였다.
1일째: (배지를 교체하였음)
iPS 세포 덩어리가 접시에 부착되었는지 여부, 및 분화가 개시되었는지 여부를 관찰하였다. 세포 배양 배지를 20 mL의 신선한 배지 A로 교체하였다.
5일째: (배지의 절반을 교체하였음)
세포 배양 배지의 절반을 10 mL의 신선한 배지 A로 교체하였다.
9일째: (배지의 절반을 교체하였음)
세포 배양 배지의 절반을 10 mL의 신선한 배지 A로 교체하였다.
13일째: (유도된 중배엽 세포를 OP9 세포층으로부터 OP9/DLL1 세포층으로 이동시켰음)
세포 배양 배지를 흡인하여 제거하고 배양된 세포의 표면을 HBSS (+Mg+Ca)로 세척하여 세포 배양 배지를 헹구었다. HBSS (+Mg+Ca) 용액 중의 10 mL의 콜라게나제 IV 250 U를 접시에 첨가하고 37℃에서 45분간 인큐베이션하였다.
콜라게나제 용액을 흡인에 의해 제거하고 세포를 10 mL의 PBS(-)로 세척하였다. 그 후, 0.05% 트립신/EDTA 용액을 접시에 첨가하고 접시를 37℃에서 20분간 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 시트-유사 세포 (sheet like cell) 응집체를 접시의 바닥으로부터 벗겨내고 세포 응집체를 피펫팅을 이용하여 기계적으로 더 작은 크기로 단편화하였다. 이렇게 처리된 세포를 20 mL의 신선한 배지 A에 첨가하고 37℃에서 45분이상 배양하였다. 부유 세포를 함유하는 배양 배지를 100 μm 메쉬를 통과시키고 세포를 수집하였다. 세포를 그 후에 4℃에서 7 분간 1200 rpm에서 원심분리하였다. 수득된 펠렛을 10 mL의 배지 B에 현탁하였다.
B. 현탁액의 1/10을 분리하고 FACS 분석에 사용하였다. 잔여 세포 현탁액을 OP9/DLL1 세포를 함유하는 새로운 접시에 접종하였다. 몇몇 접시로부터 수득된 세포 현탁액을 풀링하고 풀링된 세포를 그 후에 동일한 수의 접시로 재분배하였다.
조혈 전구세포가 수득된 세포 내에 함유되어 있는지 여부를 확인하기 위하여, 항-CD34 항체 및 항-CD43 항체를 사용하여 FACS 분석을 수행하였다. 결과를 도 4에 나타내었다. 충분한 수의 세포가 CD34lowCD43+ 세포 분획 내에서 확인될 수 있었고, 따라서 조혈 전구세포가 유도되었음이 확인되었다.
C. 조혈 전구세포로부터 T 세포의 유도
그 후에, 수득된 세포를 OP9/DLL1 세포를 함유하는 새로운 접시에 접종하였다. 이 단계에서는, CD34lowCD43+ 세포 분획에 대한 세포 분류를 실시하지 않았다. 이 분획이 분류되는 경우, T 세포의 분화 효율이 분류에 의한 세포의 감소 또는 세포에의 손상으로 인해 분류를 실시하지 않은 경우에 비해 감소될 수 있다.
배양 기간 동안에, 분화 단계를 확인하기 위하여 FACS 분석을 여러 차례 수행하였다. 상당한 수의 죽은 세포가 배양 기간에 걸쳐서 관찰되었다. 죽은 세포는 바람직하게는 FACS 분석 전에, 예를 들어, 프로피디움 아이오다이드 (Propidium Iodide, PI) 또는 7-AAD를 사용하여 제거되었다.
16일째: (세포를 계대배양하였음)
OP9/DLL1 세포에 느슨하게 부착된 세포를 수차례의 피펫팅으로 가볍게 분리시켰다. 세포를 100 μm 메쉬를 통과시키고 50 mL 코니칼 튜브에 수집하였다. 튜브를 4℃에서 7분간 1200 rpm으로 원심분리하였다. 펠렛을 10 mL의 배지 B에 분산시켰다. 이렇게 제조된 세포를 OP9/DLL1 세포를 함유하는 새로운 접시에 접종하였다.
23일째: (세포를 계대배양하였음) 혈액 세포 콜로니가 나타나기 시작하였다.
OP9/DLL1 세포에 느슨하게 부착된 세포를 수차례의 피펫팅으로 가볍게 분리시켰다. 세포를 100 μm 메쉬를 통과시키고 50 mL 코니칼 튜브에 수집하였다. 튜브를 4℃에서 7분간 1200 rpm으로 원심분리하였다. 펠렛을 10 mL의 배지 B에 분산시켰다. 이렇게 제조된 세포를 OP9/DLL1 세포를 함유하는 새로운 접시에 접종하였다.
30일째: (세포를 계대배양하였음)
OP9/DLL1 세포에 느슨하게 부착된 세포를 수차례의 피펫팅으로 가볍게 분리시켰다. 세포를 100 μm 메쉬를 통과시키고 50 mL 코니칼 튜브에 수집하였다. 튜브를 4℃에서 7분간 1200 rpm으로 원심분리하였다. 펠렛을 10 mL의 배지 B에 분산시켰다. 이렇게 제조된 세포를 OP9/DLL1 세포를 함유하는 새로운 접시에 접종하였다.
37일째: (세포를 계대배양하였음)
OP9/DLL1 세포에 느슨하게 부착된 세포를 수차례의 피펫팅으로 가볍게 분리시켰다. 세포를 100 μm 메쉬를 통과시키고 50 mL 코니칼 튜브에 수집하였다. 튜브를 4℃에서 7분간 1200 rpm으로 원심분리하였다. 펠렛을 10 mL의 배지 B에 분산시켰다. 이렇게 제조된 세포를 OP9/DLL1 세포를 함유하는 새로운 접시에 접종하였다.
44일째: CD4+CD8+ T 세포를 확인하였다.
T 세포가 적절히 유도되었는지를 확인하기 위하여, 44일째의 세포를 항-CD4 항체 및 항-CD8 항체를 이용한 FACS로 분석하였다. 결과를 도 2에 나타내었다. CD4CD8 이중 양성 세포의 생성을 확인하였다.
상기에 나타난 바와 같이, iPS 세포가 동형접합 HLA 일배체형을 갖는 공여자의 말초혈액으로부터 성공적으로 확립되었고, 이렇게 수득된 iPS 세포로부터 T 세포를 성공적으로 재-생성시켰다.
실시예 2
1. CD8 양성 T 세포를 실시예 1에서 확립된 T-iPS 세포로부터 유도하였다
2. 실시예 1에서 수득된 동형접합 HLA 일배체형을 갖는 iPS 세포 클론을 사용하였다. 그의 HLA 일배체형의 하나가 iPS 세포의 HLA 일배체형과 매치하는 공여자 A, 및 iPS 세포의 HLA 일배체형과 전혀 매치하지 않는 HLA 일배체형을 갖는 공여자 B를 선별하였다.
공여자 A: HLA-A*31:01/33:03；B*44:03/48:01; C*04:01/14:03; DRB1*04:03/13:02
공여자 B: HLA-A*24:02/24:02；B*07:02/52:01; C*07:02/12:02; DRB1*01:01/15:02
3. 공여자 A 및 공여자 B의 단핵구 세포를 Ficoll을 사용하여 이들의 말초혈액으로부터 정제하고 CD8 양성 세포를 CD8 마이크로 비드를 사용하여 농축하였다.
4. 혼합된 림프구 반응 (MLR)을 T-iPS 세포로부터 재-생성된 CD8 양성 T 세포를 자극기로 사용하여 수행하였다. 공여자로부터 수득된 CD8 세포를 효과기로 사용하였다. 효과기 세포를 Cell Trace Violet 세포 증식 키트를 사용하여 형광-표지하였다.
5. 효과기 및 자극기 세포를 효과기/자극기 세포 비율이 1:1 (각각 1×105 세포)이 되도록 혼합하고 세포를 6일간 동시-배양하였다. 동시-배양의 3일째, IL-2 (12.5 U/mL), IL-7 (5 ng/mL), IL-21 (10 ng/mL) 및 항-CD28 항체 (2 ng/mL)를 배양 배지에 첨가하였다.
6. 동시-배양 6일째, 세포 분열을 유세포분석으로 평가하였다. 결과를 도 3에 나타내었다. 상부 이미지는 공여자 A로부터 유래한 T 세포 (효과기 세포)를 이용해 수득된 결과를 나타내고 하부 이미지는 공여자 B로부터 유래한 T 세포를 이용해 수득된 결과를 나타낸다.
7. 도 4는 특이적 MLR에 의해 유도된 세포 증식의 비율을 나타낸다. 동형접합 HLA 일배체형을 갖는 iPS 세포로부터 재-생성된 CD8 양성 T 세포는, 그의 하나가 iPS 세포의 HLA와 매치하는 HLA 일배체형을 갖는 공여자 A에 대해 MLR 반응을 발휘하지 않았다. 반면, T 세포는 iPS 세포의 HLA 일배체형과 전혀 매치하지 않았던 HLA 일배체형을 갖는 공여자 B의 T 세포에 대해 MLR 반응을 발휘하였다.
상기 결과를 토대로, 동형접합 HLA 일배체형을 갖는 iPS 세포로부터 재-생성된 CD8 양성 T 세포는 그의 하나가 iPS 세포와 매치하는 이종 HLA 일배체형을 갖는 T 세포를 활성화하지 않는다. 따라서, 동형접합 HLA 일배체형을 갖는 iPS 세포로부터 재-생성된 CTL은 그의 하나가 iPS 세포의 HLA와 매치하는 HLA 일배체형을 갖는 개체에 대해 이식편대숙주 질환 (graft-versus-host-disease)을 유발하지 않으며, 따라서, 세포-기반 면역요법은 그러한 CTL을 이용해 효과적으로 수행될 수 있다.
실시예 3
실시예 1에서 수득된 동형접합 HLA 일배체형을 갖는 T-iPS 세포를 통상적인 절차에 의해 CD8 양성 T 세포 (CTL)로 분화시켰다. CTL이 그의 하나가 T-iPS 세포의 HLA 일배체형과 매치하는 이형접합 HLA 일배체형을 갖는 개체의 말초혈액으로부터 유래한 NK 세포를 활성화시켰는지 여부를 조사하였다.
1. 실시예 1에서 수득된 동형접합 HLA 일배체형을 갖는 iPS 세포로부터 통상적인 절차에 의해 분화된 CD8 양성 T 세포를 자극기로 사용하였다.
2. iPS 세포를 그의 하나가 자극기 세포의 HLA 일배체형과 매치하는 이형접합 HLA 일배체형을 갖는 공여자 A의 세포로부터 통상적인 절차에 의해 확립하였고, 수득된 iPS 세포를 통상적인 절차에 의해 CD8 양성 T 세포로 분화시켰다. 이렇게 수득된 CD8 양성 T 세포를 또한 자극기로 사용하였다.
3. 공여자 A의 말초혈액을 수득하고 말초혈액 단핵구 세포 (PBMC)를 Ficoll을 사용하여 분리하였다. NK 세포를 CD3, CD4, CD8, CD14 및 CD19 마이크로비드를 이용한 음성 선별에 의해 PBMC로부터 농축하였다. 이렇게 수득된 NK 세포를 효과기로 사용하였다.
4. 자극기, 즉 재-생성된 CD8 양성 T 세포 및 효과기, 즉 NK 세포를 효과기/자극기 세포 비율이 1:1 (각각 1×105 세포)이 되도록 혼합하고 세포를 IL-2 (1000 U/mL) 및 항-CD107a 항체가 보충된 배지에서 6시간 동안 동시-배양하였다.
5. 동시-배양 6시간 후, NK 세포의 활성화를 유세포분석으로 평가하였다. 결과를 도 5에 나타내었다.
6. 공여자 A의 세포로부터 확립된 iPS 세포로부터 분화된 CD8 양성 T 세포는 공여자 A로부터 유래한 NK 세포를 활성화시키지 않았다. 반면, 동형접합 HLA 일배체형을 갖는 iPS 세포로부터 분화된 CD8 양성 T 세포는 그의 하나의 HLA 일배체형이 동형접합 HLA 일배체형과 매치하는 공여자 A로부터 유래한 NK 세포를 활성화시켰다.
7. 상기 결과를 토대로, 본 발명자들은 하기와 같이 결론을 내렸다.
동형접합 HLA 일배체형을 갖는 iPS 세포로부터 분화된 CD8 양성 T 세포는 그의 하나가 동형접합 HLA 일배체형과 매치하는 이형접합 HLA 일배체형을 갖는 NK 세포를 활성화시켰다. 따라서, 동형접합 HLA 일배체형을 갖는 iPS 세포로부터 재-생성된 성숙 T 세포 또는 CTL이 그의 하나가 공여자의 HLA 일배체형과 매치하는 이형접합 HLA 일배체형을 갖는 수용자에 이식되는 경우, 이식된 T 세포는 NK 세포의 기능에 의해 서서히 제거될 것이다. 따라서, 본 출원의 방법에 의해 수득된 T 세포는 이식된 세포의 암화 (canceration)의 유의미하게 더 적은 위험성으로 안전한 치료에 사용될 수 있다.
실시예 2의 결과에 따르면, 수용자가 공여자의 HLA 일배체형과 매치하는 적어도 하는 HLA 일배체형을 갖는 경우, 수용자의 T 세포는 동형접합 HLA 일배체형을 갖는 공여자의 세포로부터 확립된 iPS 세포로부터 재-생성된 T 세포에 대해 대항하지 않는다. 동형접합 HLA 일배체형을 갖는 공여자로부터 그의 하나가 동형접합 HLA 일배체형과 매치하는 이형접합 HLA 일배체형을 갖는 수용자로의 이식 (동종이식)은, 재-생성된 세포가 다른 유핵 (nucleated) 세포인 경우에 비해 이식된 세포가 림프구인 경우에 유리할 것이다. 실시예 3에 따르면, 동형접합 HLA 일배체형을 갖는 공여자로부터 이형접합 HLA 일배체형을 갖는 수용자로의 이식 시, NK 세포는 공여자로부터의 세포를 거부할 것이다. 이 기전에 의해, 이식된 림프구는 종국에는 거부되고, 따라서 본 방법은 이식된 림프구가 암이 되는 위험성을 회피할 수 있다.
실시예 4
T-iPS 세포를 EB 바이러스 보유자의 말초혈액 단핵구 세포로부터 유래한 LMP2 항원에 특이적인 T 세포로부터 확립하였다. T-iPS 세포를 LMP2 항원 특이적 CTL로 분화시켰다.
급성기의 EB 바이러스 감염은 감염성 단핵구증을 야기하고, 종종 버킷 림프종과 같은 암을 야기할 수 있다. 이 실시예에서, T 세포의 공여자는 이미 EB 바이러스로 감염되어 있는 건강한 사람이었다. 일단 감염되면, 이 바이러스는 평생 림프구에 머물게 되고, 따라서 공여자는 EB 바이러스 보유자이다. 따라서, 공여자는 만성 EB 바이러스 감염을 갖는 것으로 고려된다.
1) LMP2 항원에 특이적인 세포독성 T 림프구 (CTL)의 증식
i) 하기 배지를 사용하였다.
수지상 세포용 배지: CellGro (CellGenix)
| 양 | 최종 농도 | |
| RPMI | 45ml | |
| 인간 AB 혈청 | 5ml | 10% |
| 총 | 50ml |
ii) LMP2 항원 펩티드는 다음과 같다.
LMP2: IYVLVMLVL (서열번호: 1)
LMP2 테트라머를 MBL사로부터 구입하였다.
iii) 사용된 LCL (림프아구성 세포주, Lymphoblastoid cell line)은 하기와 같다.
일본 교토대학교의 의과대학원, 혈액학 및 종양학부 내 EB 바이러스에 이미 감염되어 있는 건강한 지원자로부터 확립된 HLA-A2402를 갖는 림프아구성 세포주 (LCL)를 사용하였다.
A. 인간 말초혈액으로부터 인간 단핵구-유래 수지상 세포 (MoDC)의 유도
1. 말초혈액을 EB 바이러스에 이미 감염되어 있는 HLA-A2402를 갖는 건강한 지원자로부터 수득하였다. 단핵구를 CD14 마이크로비드를 사용하여 혈액으로부터 분리하였다. 세포를 세척하고 5×105 세포/mL 현탁액을 제공하도록 수지상 세포용 배지를 첨가하였다.
2. 사이토카인을 세포 현탁액에 첨가하여 GM-CSF 800 U/mL (또는 50 ng/mL), IL-4 200 U/mL (또는 40 ng/mL)의 최종 농도를 제공하였다. 5 mL의 세포 현탁액을 6-웰 플레이트의 각 웰에 접종하였다. 플레이트를 5% CO2와 함께 37℃에서 인큐베이션하였다.
3. 플레이트를 3일간 인큐베이션하고, 3일째 2.5 mL의 배양 상청액을 부드럽게 제거하였다. 수지상 세포용 신선한 배지에 각각 800 U/mL 및 200 U/mL의 최종 농도를 제공하도록 GM-CSF 및 IL-4를 첨가하였다.
4. 이렇게 제조된 수지상 세포용 신선한 배지 3 mL을 각 웰에 첨가하였다.
5. 6일째, 미성숙 단핵구-유래 수지상 세포 (MoDC)를 플레이트로부터 수집하고 소량의 수지상 세포용 신선한 배지에 첨가하였다.
6. 세포 현탁액의 밀도를 5×105 세포/mL로 조정하였다.
7. GM-CSF (최종 농도: 800 U/mL), IL-4 (최종 농도: 200 U/mL), TNF-알파 (최종 농도: 10 ng/mL), 및 PGE2 (최종 농도: 1 μg/mL)를 세포 현탁액에 첨가하였다. 세포 현탁액의 약 5×105 세포/mL/웰을 24-웰 플레이트의 각 웰에 첨가하였다.
8. 플레이트를 24시간 동안 5% CO2와 함께 37℃에서 인큐베이션하였다.
9. 펩티드를 24시간 인큐베이션 기간의 마지막 2시간 동안 각 웰에 첨가하였다. 펩티드의 최종 농도는 10 μM이었다. 수지상 세포 (DC)를 플레이트로부터 수집하고 T 세포용 배지로 2회 세척하였다.
10. DC의 수를 계수하고 2×105 세포/mL 현탁액을 제공하도록 T 세포용 배지를 첨가하였다.
B. 인간 말초혈액으로부터 T 세포의 분리 및 T 세포와 수지상 세포의 동시-배양
1. T 세포를 CD3 마이크로비드를 사용한 MACS 기법에 의해 건강한 지원자 A (상기 단계 A에서와 동일한 사람)로부터 말초혈액을 분리하였다. 세포를 세척하고 2×106 세포/mL 현탁액을 제공하도록 T 세포용 배지를 첨가하였다. 작은 일부의 T 세포 현탁액을 유세포분석 분석을 위해 분리하였다.
2. 0.5 mL/웰의 DC 세포 현탁액 (2×105 세포/mL) 및 0.5 mL/웰의 T 세포 현탁액 (2×106 세포/mL)을 함께 24웰 플레이트의 각 웰에 첨가하였다 (DC 세포 : T 세포 = 1×105 : 1×106=1:10).
3. 3일째, IL-7 (최종 농도: 5 ng/mL) 및 IL-15 (최종 농도: 10 ng/mL)를 각 웰에 첨가하였다.
4. 14일째, 세포를 각 배양액으로부터 수집하였다.
C. LCL에 펩티드의 첨가
1. LCL를 배양액으로부터 수집하고 35 Gy의 선량으로 방사선을 조사하였다.
2. 방사선 조사된 세포를 5×105 세포/mL 현탁액을 제공하도록 T 세포 배지에 현탁하였다.
3. 펩티드를 현탁액 100 nM에 첨가하고 2시간 동안 인큐베이션하였다.
4. LCL을 수집하고 T 세포 배지로 세척한 후, 2×105 세포/mL 현탁액을 제공하도록 T 세포 배지에 분산시켰다.
D. LCL과 수지상 세포로 자극된 T 세포의 동시-배양
1. 수지상 세포로 자극된 T 세포를 2×106 세포/mL 현탁액을 제공하도록 T 세포 배지에 분산시켰다.
2. 펩티드의 존재하에서 인큐베이션된 0.5 mL/웰의 LCL 현탁액 (2×105 세포/mL) 및 0.5 mL/웰의 세포 현탁액 (2×106 세포/mL)을 함께 24-웰 플레이트의 각 웰에 첨가하였다 (LCL : T 세포 = 1×105 : 1×106 = 1:10). 동시에, 펩티드를 100 nM의 최종 농도를 제공하도록 웰에 첨가하였다.
3. 3일째, IL-7 (최종 농도: 5 ng/mL) 및 IL-15 (최종 농도: 1 ng/mL)를 웰에 첨가하였다. 플레이트를 2주간 인큐베이션하고 배지를 매주마다 사이토카인이 보충된 신선한 T 세포 배지로 교체하였다 (펩티드-펄스화된 LCL을 이용한 첫 번째 자극 과정)
4. LCL를 다시 100 nM의 펩티드가 보충된 배지 중에서 2시간 동안 인큐베이션한 후, CTL를 첨가하였다.
5. 3일째, IL-7 (최종 농도: 5 ng/mL) 및 IL-15 (최종 농도: 1 ng/mL)을 웰에 첨가하였다. 플레이트를 2주간 인큐베이션하고 배지를 사이토카인이 보충된 신선한 T 세포 배지로 매주 교환하였다 (펩티드-펄스화된 LCL을 이용한 두 번째 자극 과정)
6. 이렇게 수득된 세포를 유세포분석으로 분석하고 80% 초과의 CD8 양성 T 세포가 CD8 양성이고 LMP-2 테트라머 양성 세포였음을 확인하였다. 결과를 도 6에 나타내었다.
E. LMP2 특이적 CTL의 항원 특이적 살해 활성
1. CFSE-표지된 OUN-1 백혈병 세포를 표적 세포로 사용하였다. 표지된 세포를 T 세포 배지 중에 분산시키고 2시간 동안 1 nM의 LMP2 펩티드의 존재하에서 인큐베이션하였다.
2. 펩티드 자극하에서 증대된 LMP2 특이적 세포독성 T 세포 (CD8 양성 및 LMP-2 테트라머 양성 세포) 및 CFSE-표지된 OUN-1 백혈병 세포를 0:1, 1:9, 1:3, 1:1 및 3:1의 다양한 효과기/표적 세포의 비율로 96-웰 둥근 바닥 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 세포를 펩티드의 존재 또는 부재하에서 인큐베이션하였다. 표적 세포 중에서 죽은 세포의 비율을 확인하기 위해 CFSE 양성 세포 분획에서 아넥신 V (Annexin V) 양성 세포 대 PI (프로피디움 아이오다이드) 양성 세포의 비율을 결정하였다. 결과를 도 7에 나타내었다.
3. 이렇게 준비된 LMP2 특이적 살해 T 세포가 표적 세포에 대해 항원 특이적 살해 활성을 가짐을 확인하였다.
b) LMP2-T-iPS 세포의 확립
A. LMP2 특이적 CTL의 활성화
1. CD8 양성 세포를 MACS 비드를 사용하여 상기에서 수득된 LMP2 특이적 CTL로부터 농축하였다.
2. 농축된 세포 집단을 T 세포 배지 중에 분산시키고 IL-7 (최종 농도: 5 ng/mL) 및 IL-15 (최종 농도: 10 ng/mL)를 첨가하였다. 다이나비드 (Dynabeads) 인간 T-활성제 CD3/CD28을 1:1의 비드-대-세포 비율을 제공하도록 첨가하고, 혼합물을 2일간 인큐베이션하여 CD8 양성 세포를 활성화하였다.
B. 센다이 바이러스 벡터에 의한 야마나카 (Yamanaka) 4종 인자 및 SV40의 도입
1. 활성화된 LMP2 특이적 CTL을 T 세포 배지 중에 분산시키고, 야마나카 4종 인자 및 SV40을 보유하는 센다이 바이러스를 배지에 첨가하고 세포 현탁액을 2일간 배양하였다.
2. 수득된 세포를 T 세포 배지로 세척하고 IL-7 (최종 농도: 5 ng/mL) 및 IL-15 (최종 농도: 1 ng/mL)가 보충된 T 세포 배지를 첨가하였다. 세포를 2일간 추가 배양하였다.
3. 그 후에, 모든 세포를 수집하고 IL-7 (최종 농도: 5 ng/mL) 및 IL-15 (최종 농도: 1 ng/mL)이 보충된 T 세포 배지 중에 분산시켰다. 세포 현탁액을 피더 세포 상에 접종하였다.
4. 2일째, 배지의 절반을 신선한 iPS 세포 배지로 교체하였다. 그 후에, 배지의 절반을 신선한 iPS 세포 배지로 매일 교체하고 세포를 계속 배양하였다.
C. 배양액으로부터 iPS 세포 콜로니의 픽업
1. 야마나카 인자의 도입 3주 후, iPS 세포의 콜로니를 시각적으로 관찰하였다.
2. 콜로니를 200 μl 피펫 팁을 이용해 기계적으로 픽업하였다.
3. 몇몇 클론을 개별적으로 확립하였고 이들 중 하나를 하기 실시예에서 LMP2-T-iPS 세포로 사용하였다. 수득된 클론의 콜로니 사진을 도 8에 나타내었다.
3) LMP2-iPS 세포로부터 T 세포의 유도
사용된 배지는 다음과 같다:
| 내용물 | 첨가량 | 최종 농도 |
| αMEM 배지 | 500 mL | |
| FCS | 125 mL | 20% |
| 페니실린-스트렙토마이신 용액* | 6.25 mL | 1% |
| 총 | 631.25 mL |
*페니실린 (10,000 U/ml)과 스트렙토마이신 (10,000 μg/ml)의 혼합물. 최종 농도는 각각 100 U/ml 및 100 μg/ml이었다.
| 내용물 | 첨가량 | 최종 농도 |
| αMEM 배지 | 500 mL | |
| FCS | 125 mL | 20% |
| 페니실린-스트렙토마이신 용액* | 5 mL | 1% |
| hrIL-7 (스톡: 10 μg/ mL) | 315 μL | 5 ng/mL |
| hrFlT-3L (스톡: 10 μg/mL) | 315 μL | 5 ng/mL |
| hrSCF (스톡: 10 μg/mL) | 630 μL | 10 ng/mL |
| 총 | 631.26 mL |
*페니실린 (10,000 U/ml)과 스트렙토마이신 (10,000 μg/ml)의 혼합물. 최종 농도는 각각 100 U/ml 및 100 μg/ml이었다.
| 내용물 | 첨가량 | 최종 농도 |
| αMEM 배지 | 500 mL | |
| FCS | 125 mL | 20% |
| 페니실린-스트렙토마이신 용액* | 5 mL | 1% |
| hrIL-7 (스톡: 10 μg/ mL) | 315 μL | 5 ng/mL |
| 총 | 630.315 mL |
*페니실린 (10,000 U/ml)과 스트렙토마이신 (10,000 μg/ml)의 혼합물. 최종 농도는 각각 100 U/ml 및 100 μg/ml이었다.
OP9 세포의 제조
PBS 중의 6 mL의 0.1% 젤라틴 용액을 10 cm 접시 (Falcon)에 첨가하고 37℃에서 30분간 인큐베이션하였다. 젤라틴 용액을 그 후에 제거하고 10 mL의 배지 A를 접시에 첨가하였다. 융합성 배양액 중의 OP9 간질세포의 약 1/4을 수득하고 접시 위에 접종하였다. 4일 후, 10 mL의 신선한 배지 A를 접시에 첨가하였다 (최종 농도는 20 mL이었음).
iPS 세포로부터 조혈 전구세포의 유도
동시-배양에 사용된 OP9 간질세포 배양액 중의 배지를 흡인 제거하고 신선한 배지 A로 교체하였다. iPS 세포 배양 접시 중의 배지를 또한 흡인 제거하고 10 mL의 신선한 배지 A를 첨가하였다. iPS 세포 덩어리를 EZ-패시지 롤러를 이용해 절단하였다. 절단된 iPS 세포 덩어리를 200 μl 팁이 구비된 피펫맨을 사용하여 현탁하였다. iPS 세포 클러스터의 수를 시각적으로 계수하고 대략 600개의 iPS 세포 클러스터를 OP9 세포 위에 접종하였다. iPS 세포의 클론 당 3개 이상의 접시를 사용하였고, 계대배양 시, 모든 접시의 세포를 한 접시에서 1회 풀링시킨 후 접시들 사이의 불균형을 감소시키기 위해 동일한 수의 접시로 재분배하였다.
1일째: (배지를 교체하였음)
iPS 세포 덩어리가 접시에 부착하고 분화가 시작되었는지 여부를 확인하였다. 세포 배양 배지를 20 mL의 신선한 배지 A로 교체하였다.
5일째: (배지의 절반을 교체하였음)
세포 배양 배지의 절반을 10 mL의 신선한 배지 A로 교체하였다.
9일째: (배지의 절반을 교체하였음)
세포 배양 배지의 절반을 10 mL의 신선한 배지 A로 교체하였다.
13일째: (유도된 중배엽 세포를 OP9 세포층으로부터 OP9/DLL1 세포층 위로 이동시킴)
세포 배양 배지를 흡인하여 제거하고 배양된 세포의 표면을 HBSS (+Mg+Ca)로 세척하여 세포 배양 배지를 헹궈 내었다. HBSS (+Mg+Ca) 용액 중의 10 mL의 콜라게나제 IV 250 U을 접시에 첨가하고 37℃에서 45분간 인큐베이션하였다.
콜라게나제 용액을 흡인에 의해 제거하고 세포를 10 mL의 PBS(-)로 세척하였다. 그 후, 0.05% 트립신/EDTA 용액을 접시에 첨가하고 접시를 37℃에서 20분간 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 시트 유사 세포 응집체를 접시의 바닥으로부터 벗겨내고 세포 응집체를 피펫팅에 의해 더 작은 크기로 기계적으로 단편화하였다. 이렇게 처리된 세포에 신선한 배지 A 20 mL을 첨가하고 37℃에서 추가 45분간 배양하였다.
부유 세포를 함유하는 배양 배지를 100 μm 메쉬를 통과시키고 세포를 수집하였다. 그 후에 세포를 4℃에서 7분간 1200 rpm으로 원심분리하였다. 수득된 펠렛을 10 mL의 배지 B 중에 현탁하였다. 현탁액의 1/10을 분리하여 FACS 분석에 사용하였다. 잔여 세포 현탁액을 OP9/DLL1 세포를 함유하는 새로운 접시에 접종하였다. 몇몇 접시로부터 수득된 세포 현탁액을 풀링하고 풀링된 세포를 동일한 개수의 새로운 접시에 접종하였다.
조혈 전구세포가 수득된 세포 내에 함유되어 있는지 여부를 확인하기 위하여, 항-CD34 항체 및 항-CD43 항체를 사용하여 FACS 분석을 실시하였다. 결과를 도 9에 나타내었다. 충분한 수의 세포가 CD34lowCD43+ 세포 분획에서 확인되었기 때문에, 조혈 전구세포가 유도되었음이 확인되었다.
C. 조혈 전구세포로부터 T 세포의 유도
그 후에, 수득된 세포를 OP9/DLL1 세포 위에 접종하였다. 이 단계에서는, CD34lowCD43+ 세포 분획의 세포 분류를 실시하지 않았다. 이 분획이 분류되면, 분류를 실시하지 않았던 경우에 비해 분류에 의한 세포의 감소 또는 세포에의 손상으로 인해 T 세포의 분화 효율이 감소 될 수 있다.
배양 기간 동안에, 분류 단계를 확인하기 위해 FACS 분석을 수차례 실시하였다. 상당한 수의 죽은 세포가 배양 기간에 걸쳐서 관찰되었다. FACS 분석 전에, 죽은 세포를, 예를 들어, 프로피디움 아이오다이드 (PI) 또는 7-AAD를 사용하여 제거하였다.
16일째: (세포를 계대배양하였음)
OP9 세포에 느슨하게 부착된 세포를 수차례의 피펫팅으로 가볍게 분리시켰다. 세포를 100 μm 메쉬를 통과시키고 50 mL 코니칼 튜브에 수집하였다. 튜브를 4℃에서 7분간 1200 rpm으로 원심분리하였다. 펠렛을 10 mL의 배지 B에 분산시켰다. 이렇게 제조된 세포 현탁액을 OP9/DLL1 세포를 함유하는 새로운 접시에 접종하였다.
23일째: (세포를 계대배양하였음) 혈액 세포 콜로니가 나타나기 시작하였다.
OP9/DLL1 세포에 느슨하게 부착된 세포를 수차례의 피펫팅으로 가볍게 분리시켰다. 세포를 100 μm 메쉬를 통과시키고 50 mL 코니칼 튜브에 수집하였다. 튜브를 4℃에서 7분간 1200 rpm으로 원심분리하였다. 펠렛을 10 mL의 배지 B에 분산시켰다.
36일째: LMP2 테트라머 양성 세포를 확인하였다.
LMP2 항원에 특이적인 T 세포가 유도되었는지 여부를 확인하기 위하여, 36일째의 세포를 CD3 항체 및 LMP2 테트라머를 이용한 FACS로 분석하였다.
결과를 도 10에 나타내었다. CD3+ 세포를 관찰하였고 세포의 일부가 CD3+LMP2 테트라머 양성 세포로 분화하였다.
D. 미성숙 T 세포로부터 성숙 살해 T 세포의 유도
36일째, LMP2 양성 T 세포를 유세포분석으로 확인한 후, 세포가 성숙 살해 T 세포 또는 CD8SP 세포로 분화하도록 세포에 IL-15를 첨가하였다. T 세포를 배지 C에 분산시키고 3×105 세포/웰의 밀도로 24-웰 플레이트의 각 웰 내 신선한 OP9/DLL1 세포층 위에 접종하였다. IL-15를 10 ng/mL의 최종 농도를 제공하도록 각 웰에 첨가하였다.
41일째: 성숙 살해 T 세포가 관찰되었다.
IL-15의 첨가 5일 후, 세포를 FACS로 분석하였다. 결과를 도 11에 나타내었다. 성숙 CD8 단일 양성 세포를 관찰하였다.
4) 재-생성된 LMP2 특이적 CTL의 항원-특이적 살해 활성
1. CFSE-표지된 LCL를 표적 세포로 사용하였다. 표지된 세포를 T 세포 배지 중에 분산시키고 2시간 동안 1 nM의 LMP2 펩티드의 존재하에 인큐베이션하였다.
2. 재-생성된 CD8 단일 양성 T 세포 및 표적 세포 (LCL)를 함께 0:1, 1:9, 1:3, 1:1, 3:1, 10:1 및 30:1의 상이한 효과기/표적 세포 비율로 96-웰 둥근 바닥 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 세포를 펩티드의 존재 (p+) 또는 부재 (p-) 하에서 인큐베이션하였다. 표적 세포들 중에서 죽은 세포의 비율을 확인하기 CFSE 양성 세포 분획 중의 아넥신 V 양성 세포 대 PI (프로피디움 아이오다이드) 양성 세포의 비율을 위해 결정하였다.
3. 결과를 도 12에 나타내었다. 이렇게 제조된 LMP2 특이적 살해 T 세포는 표적 세포에 대해 항원 특이적 살해 활성을 갖는 것으로 확인되었다.
5) 재-생성된 LMP2 특이적 CTL의 자연 살해 세포-유사 활성
1. (동종반응성 (alloreactivity)을 결정하기 위해) 세포 표면상에 HLA를 발현하지 않는 K562 세포주 및 (자가반응성 (autoreactivity)을 결정하기 위해) 자가 말초 단핵구 세포 (MA p-)를 표적 세포로 사용하였다. 이들 세포를 CFSE로 표지하고 T 세포 배지 중에 현탁하였다.
2. 재-생성된 CD8T 세포 및 표적 세포를 함께 0:1, 1:9, 1:3, 1:1, 및 3:1의 상이한 효과기/표적 세포 비율로 96-웰 둥근 바닥 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 표적 세포들 중에서 죽은 세포의 비율을 확인하기 위해 CFSE 양성 세포 분획 중의 아넥신 V 양성 세포 대 PI (프로피디움 아이오다이드) 양성 세포의 비율을 결정하였다.
3. 결과를 도 13에 나타내었다. LMP2 특이적 살해 T 세포는 자가 PBMC (MA p-)를 발현하지 않았지만 K562 세포에 대해 높은 살해 활성을 나타내었다. 이 결과는 LMP2 특이적 살해 T 세포가 자연-살해 세포 유사 활성을 가짐을 뒷받침한다.
실시예 5
WT1 항원 특이적 세포독성 T 세포를 건강한 지원자의 말초혈액으로부터 유도하고, T-iPS 세포를 CTL로부터 확립하였다. 그 후에, WT1 항원 특이적 성숙 T 세포를 T-iPS 세포로부터 유도하였다.
이 실시예는 하기 단계를 포함한다:
1) WT1 항원 특이적 CTL의 증폭
2) WT1-T-iPS 세포의 확립
3) WT1-T-iPS 세포로부터 T 세포의 유도
1) WT1 항원 특이적 CTL의 증폭
i) 사용된 배지는 다음과 같다.
| 양 | 최종 농도 | |
| RPMI | 45ml | |
| 인간 AB 혈청 | 5ml | 10% |
| 총 | 50ml |
ii) 사용된 WT1 항원 펩티드는 다음과 같다.
WT1 변형된 형태: CYTWNQMNL (서열번호: 2) (Cancer Immunol. Immunothera. 51: 614 (2002))
하기에 사용된 WT1 펩티드 및 WT1 테트라머 둘 모두는 변형된 형태였다.
iii) 사용된 LCL (림프아구성 세포주)은 다음과 같다.
일본 교토대학교의 의과대학원, 혈액학 및 종양학부 내 건강한 지원자로부터 확립된 HLA-A2402를 갖는 LCL을 사용하였다.
A. 인간 말초혈액으로부터 T 세포의 분리 및 펩티드를 이용한 세포의 자극
1. 말초혈액을 건강한 지원자로부터 수득하였다. 단핵구를 Ficoll을 사용하여 혈액으로부터 정제하고 T 세포 배지에 분산시켰다.
2. 세포 현탁액을 2.5×105 세포/mL/웰의 밀도로 96-웰 둥근 바닥 플레이트의 각 웰에 첨가하고, 펩티드를 10 μM의 최종 농도를 제공하도록 첨가하였다.
3. 3일째, IL-2 (최종 농도: 12.5 U/mL), IL-7 (최종 농도: 5 ng/mL) 및 IL-15 (최종 농도: 1 ng/mL)를 웰에 첨가하였다. 플레이트를 2주간 인큐베이션하고 배지를 사이토카인이 보충된 신선한 T 세포 배지로 매주 교환하였다.
B. 펩티드의 LCL에의 첨가
1. LCL를 배양액으로부터 수집하고 35 Gy의 선량으로 방사선 조사하였다.
2. 방사선 조사된 세포를 5×105 세포/mL 현탁액을 제공하도록 T 세포 배지 중에 현탁하였다.
3. 펩티드 100 nM을 현탁액에 첨가하고 2시간 동안 인큐베이션하였다.
4. LCL를 수집하고 T 세포 배지로 세척한 후, 2×105 세포/mL 현탁액을 제공하도록 T 세포 배지 중에 분산시켰다.
C. 펩티드로 펄스화된 LCL와 T 세포의 동시-배양
1. 펩티드 자극 후 2주 동안 이들을 인큐베이션하면서 펩티드 자극된 T 세포를 수집한 후, 2×106 세포/mL 현탁액을 제공하도록 T 세포 배지 중에 분산시켰다. 작은 일부분의 T 세포 현탁액을 유세포 분석을 위해 분리하였다.
2. 0.5 mL/웰의 펩티드의 존재하에서 인큐베이션되었던 LCL 현탁액 (2×105 세포/mL) 및 0.5 mL/웰의 T 세포 현탁액 (2×106 세포/mL)을 함께 플레이트의 각 웰에 첨가하였다 (LCL: T 세포=1×105 : 1×106=1:10).
3. 3일째, IL-2 (최종 농도: 12.5 U/mL), IL-7 (최종 농도: 5 ng/mL) 및 IL-15 (최종 농도: 1 ng/mL)를 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 2주간 인큐베이션하고 배지를 사이토카인이 보충된 신선한 T 세포 배지로 매주 교환하였다 (펩티드-펄스화된 LCL을 이용한 첫 번째 자극 과정).
4. LCL를 다시 100 nM의 펩티드가 보충된 배지 중에서 2시간 동안 인큐베이션한 후, CTL를 첨가하였다.
5. 3일째, IL-2 (최종 농도: 12.5 U/mL), IL-7 (최종 농도: 5 ng/mL) 및 IL-15 (최종 농도: 1 ng/mL)를 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 2주간 인큐베이션하고 배지를 사이토카인이 보충된 신선한 T 세포 배지로 매주 교환하였다 (펩티드-펄스화된 LCL을 이용한 두 번째 자극 과정).
6. LCL를 다시 100 nM의 펩티드가 보충된 배지 중에서 2시간 동안 인큐베이션한 후, CTL를 첨가하였다.
7. 3일째, IL-2 (최종 농도: 12.5 U/mL), IL-7 (최종 농도: 5 ng/mL) 및 IL-15 (최종 농도: 1 ng/mL)를 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 플레이트를 2주간 인큐베이션하고 배지를 사이토카인이 보충된 신선한 T 세포 배지로 매주 교환하였다 (펩티드-펄스화된 LCL을 이용한 세 번째 자극 과정).
8. 이렇게 수득된 세포를 유세포분석으로 분석하였다. 결과를 도 14에 나타내었다. 60% 초과의 CD8 양성 T 세포가 CD8 양성 및 WT1 테트라머 양성 세포였음을 확인하였다.
2) WT1-T-iPS 세포의 확립
A. WT1 특이적 CTL의 활성화
1. CD8 양성 세포를 MACS 비드를 사용해 상기에서 수득된 WT1 특이적 CTL로부터 농축하였다.
2. 농축된 세포 집단을 T 세포 배지 중에 분산시키고 IL-2 (최종 농도: 12.5 U/mL), IL-7 (최종 농도: 5 ng/mL) 및 IL-15 (최종 농도: 1 ng/mL)를 첨가하였다. 다이나비드 인간 T-활성제 CD3/CD28을 1:1의 비드-대-세포 비율을 제공하도록 첨가하고, 혼합물을 2일간 인큐베이션하여 CD8 양성 세포를 활성화하였다.
B. 센다이 바이러스 벡터를 이용한 야마나카 4종 인자 및 SV40의 도입
1. 활성화된 WT1 특이적 CTL을 T 세포 배지 중에 분산시키고, 야마나카 4종 인자 및 SV40을 보유하는 센다이 바이러스를 배지에 첨가하고 세포 현탁액을 2일간 배양하였다.
2. 수득된 세포를 T 세포 배지로 세척하고 IL-2 (최종 농도: 12.5 U/mL), IL-7 (최종 농도: 5 ng/mL) 및 IL-15 (최종 농도: 1 ng/mL)가 보충된 T 세포 배지를 첨가하였다. 세포를 추가로 2일간 배양하였다.
3. 그 후, 모든 세포를 수집하고 사이토카인 무함유 T 세포 배지에 분산시켰다. 세포 현탁액을 피더 세포 위에 접종하였다.
4. 2일째, 배지의 절반을 신선한 iPS 세포 배지로 교체하였다. 그 후에, 배지의 절반을 매일 신선한 iPS 세포 배지로 교체하고 계속 배양하였다.
C. 배양물로부터 iPS 세포 콜로니의 픽업
1. 야마나카 인자의 도입 3주 후, iPS 세포의 콜로니를 시각적으로 관찰하였다.
2. 콜로니를 200 μl 피펫 팁을 이용해 기계적으로 픽업하였다.
3. 몇몇 콜로니를 개별적으로 확립하였다. 수득된 클론의 콜로니 사진을 도 15에 나타내었다.
3) WT1-T-iPS 세포로부터 T 세포의 도입
사용된 배지는 다음과 같다:
| 내용물 | 첨가량 | 최종 농도 |
| αMEM 배지 | 500 mL | |
| FCS | 125 mL | 20% |
| 페니실린-스트렙토마이신 용액* | 6.25 mL | 1% |
| 총 | 631.25 mL |
*페니실린 (10,000 U/ml)과 스트렙토마이신 (10,000 μg/ml)의 혼합물. 최종 농도는 각각 100 U/ml 및 100 μg/ml이었다.
| 내용물 | 첨가량 | 최종 농도 |
| αMEM 배지 | 500 mL | |
| FCS | 125 mL | 20% |
| 페니실린-스트렙토마이신 용액* | 5 mL | 1% |
| hrIL-7 (스톡: 10 μg/ mL) | 315 μL | 5 ng/mL |
| hrFlT-3L (스톡: 10 μg/mL) | 315 μL | 5 ng/mL |
| hrSCF (스톡: 10 μg/mL) | 630 μL | 10 ng/mL |
| 총 | 631.26 mL |
*페니실린 (10,000 U/ml)과 스트렙토마이신 (10,000 μg/ml)의 혼합물. 최종 농도는 각각 100 U/ml 및 100 μg/ml이었다.
OP9 세포의 제조
PBS 중의 6 mL의 0.1% 젤라틴 용액을 10 cm 접시 (Falcon)에 첨가하고 37℃에서 30분간 인큐베이션하였다. OP9 간질세포를 트립신/EDTA 용액을 이용해 융합성 배양 접시로부터 탈착하고 수득된 세포의 약 1/4을 젤라틴 코팅된 10 cm 세포 배양 접시에 첨가하였다. 10 mL의 배지 A를 세포 배양 접시에 첨가하였다. 4일 후, 배지 A 10 mL을 접시에 첨가하였다 (최종 양은 20 mL이었음).
iPS 세포로부터 조혈 전구세포의 유도
동시-배양에 사용된 OP9 간질세포 배양액 중의 배지를 흡인 제거하고 신선한 배지 A로 교체하였다. iPS 세포 배양 접시 중의 배지를 또한 흡인 제거하고 10 mL의 신선한 배지 A를 첨가하였다. iPS 세포 덩어리를 EZ-패시지 롤러를 이용해 절단하였다. 절단된 iPS 세포 덩어리를 200 μl 팁이 구비된 피펫맨을 이용해 현탁하였다. iPS 세포 클러스터의 수를 시각적으로 계수하고 대략 600개의 iPS 세포 클러스터를 OP9 세포 위에 접종하였다. iPS 세포의 클론 당 3개 이상의 접시를 사용하였고, 계대배양 시, 모든 접시의 세포를 한 접시에서 1회 풀링시킨 후 접시들 사이의 불균형을 감소시키기 위해 동일한 수의 접시로 재분배하였다.
1일째: (배지를 교체하였음)
iPS 세포가 접시에 부착하고 분화하기 시작하였는지 여부를 확인하였다. 세포 배양 배지를 20 mL의 신선한 배지 A로 교체하였다.
5일째: (배지의 절반을 교체하였음)
세포 배양 배지의 절반을 10 mL의 신선한 배지 A로 교체하였다.
9일째: (배지의 절반을 교체하였음)
세포 배양 배지의 절반을 10 mL의 신선한 배지 A로 교체하였다.
13일째: (유도된 중배엽 세포를 OP9 세포층으로부터 OP9/DLL1 세포층 위로 이동시켰음)
세포 배양 배지를 흡인하여 제거하고 배양된 세포의 표면을 HBSS (+Mg+Ca)로 세척하여 세포 배양 배지를 헹궈 내었다. HBSS (+Mg+Ca) 용액 중의 10 mL의 콜라게나제 IV 250 U를 접시에 첨가하고 37℃에서 45분간 인큐베이션하였다.
콜라게나제 용액을 흡인에 의해 제거하고 세포를 10 mL의 PBS(-)로 세척하였다. 그 후, 0.05% 트립신/EDTA 용액을 접시에 첨가하고 접시를 37℃에서 20분간 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 시트 유사 세포 응집체를 접시의 바닥으로부터 벗겨내고 세포 응집체를 피펫팅에 의해 기계적으로 더 작은 크기로 단편화하였다. 이렇게 처리된 세포에 신선한 배지 A 20 mL을 첨가하고 37℃에서 45분 이상 배양하였다. 부유 세포를 함유하는 배양 배지를 100 μm 메쉬를 통과시키고 세포를 수집하였다. 세포를 그 후에 4℃에서 7분간 1200 rpm으로 원심분리하였다. 수득된 펠렛을 10 mL의 배지 B 중에 현탁하였다. 현탁액의 1/10을 분리하고 FACS 분석에 사용하였다. 잔여 세포 현탁액을 OP9/DLL1 세포를 함유하는 새로운 접시 위에 접종하였다. 몇몇 접시로부터 수득된 세포 현탁액을 풀링하고, 풀링된 세포를 동일한 수의 새로운 접시 위에 접종하였다.
조혈 전구세포가 수득된 세포 내에 함유되었는지 여부를 확인하기 위하여, 항-CD34 항체, 항-CD43 항체를 사용하여 FACS 분석을 수행하였다. 결과를 도 16에 나타내었다. 충분한 수의 세포가 CD34lowCD43+ 세포 분획에서 확인되었기 때문에, 조혈 전구세포가 유도되었음이 확인되었다.
C. 조혈 전구세포로부터 T 세포의 유도
그 후에, 수득된 세포를 OP9/DLL1 세포 위에 접종하였다. 이 단계에서는, CD34lowCD43+ 세포 분획의 세포 분류를 실시하지 않았다. 이 분획이 분류되면, 분류를 실시하지 않았던 경우에 비해 분류에 의한 세포의 감소 또는 세포에의 손상으로 인해 T 세포의 분화 효율이 감소 될 수 있다.
16일째: (세포를 계대배양하였음)
OP9 세포에 느슨하게 부착된 세포를 수차례의 피펫팅으로 가볍게 분리시켰다. 세포를 100 μm 메쉬를 통과시키고 50 mL 코니칼 튜브에 수집하였다. 튜브를 4℃에서 7분간 1200 rpm으로 원심분리하였다. 펠렛을 10 mL의 배지 B에 분산시켰다. 이렇게 제조된 세포를 OP9/DLL1 세포를 함유하는 새로운 접시 위에 접종하였다.
23일째: (세포를 계대배양하였음) 혈액 세포 콜로니가 나타나기 시작하였다.
OP9/DLL1 세포에 느슨하게 부착된 세포를 수차례의 피펫팅으로 가볍게 분리시켰다. 세포를 100 μm 메쉬를 통과시키고 50 mL 코니칼 튜브에 수집하였다. 튜브를 4℃에서 7분간 1200 rpm으로 원심분리하였다. 펠렛을 10 mL의 배지 B에 분산시켰다.
36일째: WT1 테트라머 양성 세포를 확인하였다.
WT1 항원에 특이적인 T 세포가 유도되었는지 여부를 확인하기 위하여, 36일째의 세포를 CD3 항체 및 WT1 테트라머를 이용한 FACS로 분석하였다. 결과를 도 17에 나타내었다. CD3+ 세포가 관찰되었고 세포의 일부가 CD3+WT1 테트라머 양성 세포로 분화하였다.
상기에 나타난 바와 같이, T-iPS 세포로부터 재-생성된 T 세포는 최초 T 세포와 동일한 항원 특이성을 나타내는 것으로 확인되었다. 또한, 그렇개 재-생성된 T 세포는 성숙 T 세포에서 관찰되는 표면 항원을 발현하였고, 따라서 잘 성숙된 기능을 가졌다.
실시예 6
WT1 항원 특이적 TCR이 도입된 HLA 동형접합 공여자의 단핵구로부터 iPS 세포의 제조
교토대학교의 iPS 세포 연구 및 응용 센터 (Center for iPS Cell Research and Application) 내 동형접합 HLA 일배체형을 갖는 공여자의 단핵구로부터 확립된 iPS 세포를 사용하였다.
HLA-A2402-제한된 WT1에 특이적인 TCR을 인코딩하는 유전자를 에히메 대학교 (Ehime University)의 혈액학부에서 확립된 WT1 특이적 CTL 클론 "TAK1"으로부터 클로닝하였다. WT1-TCR을 인코딩하는 유전자는 Vα20/J33/Cα 및 Vβ5.1/J2.1/Cβ2였다. TCRβ(Vβ5.1/J2.1/Cβ2)-p2A-TCRα(Vα20/J33/Cα)를 이 순서대로 Gateway System의 도입 (entry) 벡터에 삽입하여 플라스미드를 제작하였다.
1) WT1-TCR 렌티바이러스 벡터의 제작
일본 이화학연구소 (Institute of Physical and Chemical Research)의 Hiroyuki MIYOSHI 박사로부터 제공된 CS-UbC-RfA-IRES2-hKO1 벡터를 사용하였다. WT1-TCR 유전자가 도입된 Gateway System의 도입 벡터 및 CS-UbC-RfA-IRES2-hKO1 벡터를 LR 클로나제 (clonase) 반응 (Life Technologies)에 적용하여 CS-UbC-RfA-IRES2-hKO1/WT1-TCR 플라스미드 벡터를 제공하였다.
2) WT1-TCR 렌티바이러스 벡터를 포함하는 배양 상청액의 제조
상기에서 수득된 CS-UbC-RfA-IRES2-hKO1/WT1-TCR을 패키징 세포주 LentiX-293T 내로 도입하고 세포를 배양하였다. WT1-TCR 렌티바이러스 벡터를 함유하는 배양 상청액을 수집하고 바이러스를 초-원심분리로 응축시켰다.
3) WT1-TCR 형질도입된 HLA 동형접합 단핵구로부터 iPS 세포 클론의 확립
동형접합 HLA 일배체형을 갖는 단핵구로부터 확립되고 iMatrix (Nippi) 상에서 배양된 iPS 세포를 CS-UbC-RfA-IRES2-hKO1/WT1-TCR 바이러스를 함유하는 상청액으로 감염시켰다. 벡터 내에 포함된 hKO1 단백질의 발현을 확인하기 위해 세포를 형광 현미경으로 관찰하고, WT1-TCR이 iPS 세포 내로 적절히 도입되어 WT1-TCR/mono-iPS 세포를 제공하였음을 확인하였다.
4) WT1-TCR/mono-iPS 세포의 클로닝
감염 4일 후, 감염된 iPS 세포를 접시로부터 제거하고 세포를 염색하지 않고 FACS Aria를 사용하여 hKO1 발현 세포를 분류하여 WT1-TCR/mono-iPS balk를 제공하였다. hKO1 양성 세포를 iMatrix 위에 접종하고 1주일간 배양하였다. 1주일의 배양 후, 증대된 콜로니를 형광 현미경 하에서 관찰하였고 hKO1을 강력하게 발현하는 콜로니를 기계적으로 픽업하고 클로닝하여 WT1-TCR/mono-iPS 클론을 제공하였다. hKO1의 발현을 근거로 분류된 세포 및 클로닝된 세포 둘 모두는 WO2013176197A1에 개시된 바와 유사한 방식으로 T 세포를 향해 분화하였다.
특히, 작은 iPS 세포 덩어리 (100개 세포 미만)를 미리 방사선 조사된 C3H10T1/2 세포 위로 옮기고 20 ng/mL의 VEGF, 50 ng/mL의 SCF 및 50 ng/mL의 FLT-3L (Peprotech)이 보충된 EB 배지 중에서 배양하였다. 배양 14일째, iPS-sac 구조 중에 함유된 조혈 세포를 수집하고 방사선 조사된 OP9-DL1 새포 위로 옮긴 후, 10 ng/mL의 FLT-3 및 1 ng/mL의 IL-7이 보충된 OP9 배지 중에서 배양하였다. 분화 38일째 세포의 FACS 분석을 도 18에 나타내었다.
분화 38일째, mono-iPS 세포, WT1-TCR/mono-iPS balk, 및 WT TCR/mono-iPS 세포 클론을 FACS Aria로 분석하였다. 단핵구로부터 유래한 iPS 세포 (mono-iPS 세포)는 CD3을 발현하지 않은 반면 WT1-TCR이 도입된 iPS 세포는 CD3을 발현하였다. 거의 100%의 CD3 양성 세포가 또한 Vβ5.1 항체에 대해 양성이었다. Vβ5.1은 도입된 TCR 사슬 내에 포함되었다. 세포는 또한 TCRαβ 항체에 대해 양성이었다. 도입된 WT1-TCR이 세포 표면 위에서 기능적으로 발현되었음이 확인되었다.
실시예 7
T 세포 내로 야마나카 인자의 도입에 의해 수득된 iPS 세포 클론 TKT3v1-7을 일본 교토대학교로부터 분양받았다. 세포를 "TKT3V"로 약칭하였다.
1. PAM 서열을 갖는 인간 RAG2 유전자를 표적하는 gDNA를 디자인하고 H3 프로모터를 갖는 발현 플라스미드 내로 도입하였다. gDNA는 GGTTATGCTTTACATCCAGATGG (서열번호: 3)의 표적 서열의 하나의 대립인자에서 밑줄 친 2개의 염기를 제거하고 다른 대립인자에서 밑줄 친 부분의 5' 측면에 1개 염기를 삽입하도록 디자인되었다.
2. 상기 제조된 플라스미드를 Cas9 단백질 발현 플라스미드와 함께 인간 말초혈액-T 세포 유래 iPS 세포 (TKT3V) 내로 형질감염시켰다.
3. 형질감염된 iPS 세포를 클로닝하고 50개 클론을 수득하였다. 50개 클론을 T7E1 검정으로 게놈 상의 미스매치에 대해 스크리닝하였다 (도 19).
4. 스크리닝한 클론을 RAG2 유전자의 서열분석에 적용하고 두 대립인자의 상기 유전자 내 과오 돌연변이를 함유하는 클론을 선별하였다 (TKT3V/RAG2KO).
5. 선별된 iPS 클론을 염색체 분석 및 기형종 형성에 의한 다능성 평가에 적용하였다. 어떠한 비정상도 유전적으로 변형된 iPS 세포와 같은 세포에서 관찰되지 않았다.
6. TKT3V 및 TKT3V/RAG2KO의 iPS 세포 클론은 WO2013176197A1에 교시된 바와 동일한 방식으로 T 세포로 분화하였다. 구체적으로, 작은 iPS 세포 덩어리 (100개 세포 미만)를 미리 방사선 조사된 C3H10T1/2 세포 위로 옮기고 20 ng/mL의 VEGF, 50 ng/mL의 SCF 및 50 ng/mL의 FLT-3L (Peprotech)이 보충된 EB 배지 중에서 배양하였다. 배양 14일째, iPS-sac 구조 중에 함유된 조혈 세포를 수집하고 방사선 조사된 OP9-DL1 세포 위로 옮긴 후, 10 ng/mL의 FLT-3 및 1 ng/mL의 IL-7이 보충된 OP9 배지 중에서 배양하였다. 유도된 세포의 FACS 분석을 도 20에 나타내었다. CD4+CD8+ DP 세포 집단의 생성을 관찰하였다.
7. DP 세포 집단을 유세포분석으로 분리하고 mRNA를 세포로부터 추출하였다.
8. TCRα 사슬의 V 및 C 역역 내 각 분절을 표적하는 프라이머를 사용하여 추출된 mRNA에 대해 RT-PCR을 실시하고 TCRα 사슬의 재배열을 검출하였다. 또한, TKT3V의 mRNA에 대해 동일한 방식으로 RT-PCR을 실시하였다. TKT3V 세포는 TCRα 사슬로서 Va14만을 가지고 있었다 (도 21).
TKT3V 세포 (iPS 세포)의 T 세포로의 분화 동안, RAG2 재활성화가 CD4-CD8- 이중 음성 (DN) 세포의 이중 양성 (DP) 세포로의 세포 분화에서 확인되었다 (도 22). T 세포의 DN 및 DP 시기에서 TCRα 사슬의 재배열이 각각 도 23 및 도 24에 나타나있다. DN 세포에서는, iPS 세포와 유사하게, 단지 Va14 재배열만이 확인되었다. DP 세포에서는, Va14 이외 분절의 재배열이 빈번하게 관찰되었다. RAG 단백질의 활성화가 TCRα 사슬의 재배열을 야기한 것으로 보인다. 이 비특이적 재배열은 유도된 T 세포의 항원 특이성의 손실을 초래할 수 있다.
TKT3v/RAG2KO 클론으로부터 분화된 DP 세포, 즉 RAG2 넉아웃 iPS 세포의 TCRα 사슬 재배열이 도 25에 나타나있다. RAG2 넉아웃 클론으로부터 분화된 DP 세포에서는, Va14가 아닌 유전자의 어떠한 재배열도 관찰되지 않았다. Rag2 유전자 넉아웃은 RAG2 단백질을 생산하지 못하였고 TCRα 사슬의 재배열을 방지한 것으로 고려된다.
iPS 세포의 시기에서 RAG2 유전자 내로 과오 돌연변이를 도입함으로써 iPS 세포로부터 분화된 T 세포에서 TCRα 사슬의 추가적인 재배열을 방지하고 항원 특이성을 유지할 수 있음이 확인되었다.
TKT3V/RAG2KO 클론으로부터 분화된 DP 세포는 통상적인 절차에 의해 CD8 단일 양성 세포독성 T 림프구로 더욱 분화되었다 (도 26). CD8 단일 양성 세포 집단을 유세포분석을 이용해 분리하고 분리된 세포의 mRNA를 추출하였다. TCR 재배열을 RT-PCR로 검사하였다. 결과를 도 27에 나타내었다. 유전자 변형된 iPS 세포로부터 분화된 CD8 단일 양성 T 세포는 재배열된 유전자로서 단지 Va14를 보유하였다. Va19 레인에서의 밴드는 이 도면의 프레임에 의해 기술된 TCRa의 크기를 벗어난 비특이적 밴드이다.
실시예 8
동형접합 HLA 일배체형을 갖는 인간 단핵구로부터 확립된 iPS 세포에서 Rag2 유전자의 넉아웃
1. 인간 단핵구로부터 확립된 iPS 세포 클론을 사용하였다. iPS 세포 클론을 HLA-A*3303-B*4403-C*1403-DRB1*1302의 HLA 일배체형에 대한 공여자 동형접합의 말초혈액 단핵구로부터 확립하였다. 여기서 사용된 iPS 세포는 일본, 교토대학교의 iPS 세포 연구 및 응용 센터에 의해 제공된 프로토콜 CiRA_FFiPSC_protocol_JP_vl40310에 따라서 피더 무함유 조건하에서 유지된 것들이었다.
2. iPS 세포 내 인간 Rag2 유전자의 엑손 1에 이중 절단을 만들었다. 구체적으로, 엑손 1 뉴클레오티드의 위치 440 내지 441 사이와 679 내지 680 사이를 CRISPR-Cas9로 절단하였다.
3. 표적 sgRNA는 아래와 같다:
i) 센스 사슬: caccGATTAATGTGGTGTACAGCCG (서열번호: 4)
안티-센스 사슬: aaacCGGCTGTACACCACATTAATC (서열번호: 5)
ii) 센스 사슬: caccGTTGGCAGGCCGGATATTAT (서열번호: 6)
안티-센스 사슬: aaacATAATATCCGGCCTGCCAAC (서열번호: 7)
4. 상기 sgRNA를 addgene사로부터 구입한 플라스미드 pSpCas9(BB)-2A-Puro (PX459) 내에 삽입하였다. iPS 세포를 효소적으로 처리하여 단일 세포 현탁액을 제공하고 NEPA21 (Nepagene)을 이용한 전기천공에 의해 플라스미드로 형질감염시켰다.
5. 형질감염 후, 세포를 플레이트에 접종하고 퓨로마이신의 존재하에 배양한 후, 복수의 클론을 픽업하였다.
DNA를 각 클론으로부터 수집하고 유전자 결실의 존재 또는 부재를 PCR로 검사하였다. PCR에 사용된 프라이머는 다음과 같다.
정방향: CCCAAAAGATCCTGCCCCACTGG (서열번호: 8)
역방향: AGTCAGGATTGCACTGGAGACAG (서열번호: 9)
7. 총 57개 클론을 픽업하고 PCR의 결과를 토대로 하기와 같이 평가하였다.
i) 결실 부재 클론: 31개
ii) 결실이 단일 대립인자에서 야기된 클론: 14개
iii) 결실이 두 대립인자 모두에서 야기된 클론: 2개
8. 결실이 두 대립인자 모두에서 야기된 최초 iPS 세포 클론 (WT) 및 iPS 세포 클론의 PCR 분석 (RAG2KO)이 도 28에 나타나있다. 단축된 밴드는 결실이 두 대립인자 모두에서 야기되었음을 나타낸다.
9. 2개의 RAG2 넉아웃 iPS 세포 클론을 확립하였다.
실시예 9
실시예 7에 사용된 것들 이외의, 아마나카 인자를 항원 특이적 CD8 단일 양성 T 세포 내로 도입함으로써 확립된 T iPS 세포를 사용하였다. T-iPS 세포에서 Rag2 유전자를 실시예 7과 동일한 방식으로 넉아웃시켰다. Rag2 넉아웃 부재 (WT)의 T-iPS 세포 및 Rag2 넉아웃 T-iPS 세포를 실시예 7과 동일한 방식으로 T 세포로 분화시켰다. OP9 배지에서 배양 41일째 (분화 55일째), 세포를 분석하였다. 결과를 도 29 및 30에 나타내었다. 이들 도면에서, AgDex는 그로부터 T-iPS 세포가 확립된 T 세포가 그에 특이적으로 결합하는 항원의 다량체 (Dextramer)를 나타낸다.
상대적으로 긴 기간에 걸쳐서 Rag2 넉아웃 iPS 클론으로부터 분화된 T 세포는 테트라머에 상대적으로 강력한 친화도를 유지하였다 (CD8 양성 세포의 60% 초과). 반면, WT 클론으로부터 분화된 많은 T 세포는 TCR 특이성을 유지하지 않았다.
<110> Kyoto University
Thyas Co.Ltd.
<120> METHOD FOR INDUCING T CELLS FOR IMMUNOCYTOTHERAPHY FROM
PLURIPOTENT STEM CELLS
<130> IPA170074-JP
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<160> 9
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
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<212> PRT
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<400> 1
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<211> 9
<212> PRT
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1 5
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agtcaggatt gcactggaga cag 23
Claims (16)
- 하기 단계를 포함하는, 세포-기반 면역요법을 위한 T 세포를 유도하는 시험관 내 방법:
(1) 목적하는 항원에 특이적인 T 세포 수용체를 인코딩하는 유전자를 보유하는 Rag1 및/또는 Rag2 유전자 넉아웃 인간 다능성 줄기세포를 제공하는 단계,
(2) 단계 (1)의 다능성 줄기세포로부터 CD4CD8 이중 양성 T 세포를 유도하고 이를 단리하는 단계, 및
(3) 단계 (2)의 CD4CD8 이중 양성 T 세포로부터 CD8 단일 양성 T 세포를 유도하는 단계. - 제1항에 있어서, 단계 (1)의 다능성 줄기세포가 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되는 것인, 시험관 내 방법:
(a) 항원 특이적 T 세포 수용체를 인코딩하는 유전자를 보유하는 다능성 줄기세포를 유도하는 단계, 및
(b) 단계 (a)에서 수득된 다능성 줄기세포에서 게놈 편집 (genome editing)에 의해 Rag1 및/또는 Rag2 유전자를 넉아웃시키는 단계. - 제2항에 있어서, 단계 (a)에서 항원 특이적 T 세포 수용체를 인코딩하는 유전자를 보유하는 다능성 줄기세포가 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 수득되는 것인, 시험관 내 방법:
항원 특이적 T 세포 수용체를 인코딩하는 유전자를 보유하는 인간 T 세포로부터 다능성 줄기세포를 유도하는 단계. - 제2항에 있어서, 단계 (a)에서 항원 특이적 T 세포 수용체를 인코딩하는 유전자를 보유하는 다능성 줄기세포가 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 수득되는 것인, 시험관 내 방법:
항원 특이적 T 세포 수용체를 인코딩하는 유전자를 다능성 줄기세포 내로 도입하는 단계. - 제1항에 있어서, 단계 (1)의 다능성 줄기세포가 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 수득되는 것인, 시험관 내 방법:
(a) 인간 다능성 줄기세포에서 Rag1 및/또는 Rag2 유전자를 게놈 편집에 의해 넉아웃시키는 단계, 및
(b) 항원 특이적 T 세포 수용체를 인코딩하는 유전자를 단계 (a)에서 수득된 Rag 1 및/또는 Rag2 넉아웃 다능성 줄기세포 내로 도입하는 단계. - 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 다능성 줄기세포가 인간 iPS 세포인 것인, 시험관 내 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, Rag1 및/또는 Rag2 유전자가 CRISPR-Cas9에 의해 넉아웃되는 것인, 시험관 내 방법.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 하기 단계를 포함하는, 세포-기반 면역요법을 위한 T 세포를 유도하는 시험관 내 방법:
(1) 치료 대상의 적어도 하나의 HLA 일배체형과 일치하는 동형접합 HLA 일배체형을 갖는 공여자로부터 확립된 iPS 세포를, iPS 세포 은행으로부터 선별하는 단계로, iPS 세포 은행이 각 공여자의 HLA에 대한 정보와 관련하여 동형접합 HLA 일배체형을 갖는 공여자로부터 확립된 Rag1 및/또는 Rag2 유전자 넉아웃 iPS 세포를 보관하는 것인, 단계,
(2) 상기 요법을 위한 항원에 특이적인 T 세포 수용체를 인코딩하는 유전자를 단계 (1)에서 수득된 Rag1 및/또는 Rag2 유전자 넉아웃 iPS 세포 내로 도입하는 단계,
(3) 항원 특이적 T 세포 수용체를 인코딩하는 유전자가 도입된 Rag1 및/또는 Rag2 유전자 넉아웃 iPS 세포를 CD4CD8 이중 양성 T 세포로 분화시키고 이를 단리하는 단계, 및
(4) 단계 (3)의 CD4CD8 이중 양성 T 세포로부터 CD8 단일 양성 T 세포를 유도하는 단계. - 삭제
- 삭제
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- 삭제
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