KR102022673B1 - Yap/taz를 이용한 간세포 분화 및 간질환 관련 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 YAP/TAZ를 이용한 간질환의 진단, 치료 또는 치료제의 스크리닝 용도에 관한 것으로서, 더욱 자세하게는 YAP/TAZ 단백질 및 유전자, YAP/TAZ와 관련 단백질 및 유전자를 이용하여, 간세포계통 세포의 분화 조절을 하거나, 간질환, 예를 들면 간내 담관세포의 과증식, 간섬유증, 간내 담관암 또는 혼합 간세포 담관상피암종(combined hepatocellular-cholangiocarcinoma, combined HCC-CCC)의 진단 또는 치료하거나, 약물 후보물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

Description

YAP/TAZ를 이용한 간세포 분화 및 간질환 관련 용도{Use related with liver cell differentiation and liver disease using Yap/Taz}
본 발명은 YAP/TAZ를 이용한 간모세포의 분화 및 간질환 관련 용도에 관한 것으로서, 더욱 자세하게는 YAP/TAZ 단백질 및 유전자, YAP/TAZ와 관련 단백질 및 유전자를 이용하여, 간세포계통 세포의 분화 조절을 하거나, 간질환, 예를 들면 간내 담관세포의 과증식, 간섬유증, 간내 담관암 또는 혼합 간세포 담관상피암종(combined hepatocellular-cholangiocarcinoma, combined HCC-CCC)의 진단 또는 치료하거나, 약물 후보물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
간세포는 여러 물질의 대사나 해독, 효소의 합성 등 다양한 기능으로 신약후보 물질의 독성평가나 약물대사 분석에 매우 중요하게 사용되고 있다. 그러나 간세포를 체외에서 배양 시 증식하지 않고 사멸하기 때문에 현재 간세포 단계에서 증식시켜 성숙한 간세포로 유도 및 발달시키는 기술 개발에 초점을 맞추고 있다.
간은 내배엽(endoderm) 유래로 발생되며 발생과정에서 특이적인 성장인자와 유전자 발현 조절을 통하여 형성된다. 섬유아세포 성장인자(fibroblast growth factor; FGF)와 골형성유도 단백질(bone morphogenetic protein; BMP) 등의 성장 인자의 상호작용에 의하여 발생과정 중 간 상피세포계(hepatic epithelial lineage)로의 분화가 결정되며 간세포(hepatocyte)와 간내 담관세포(cholangiocyte)를 만들 수 있는 양극성 세포인 간모세포(hepatoblast)가 형성된다.
간암은 전세계에서 암중에서 5번째로 많이 발생하는 암으로서 암으로 인한 사망중 2번째로 높은 암종류이다. 간에서 발생하는 암은 간세포의 이상으로 발생하는 간세포암(Hepatocellular carcinoma, HCC)과 담관세포의 이상으로 발생하는 담관암(cholangiocarcinoma)이 대표적이며, 드물게 같은 종양 내 간세포암종과 담관상피암종의 특징을 동시에 가지는 암이 발생할 수 있다. 현재 WHO에서 이러한 종양을 혼합 간세포 담관상피암종(combined hepatocellular-cholangiocarcinoma, combined HCC-CCC)으로 별개의 원발성 간암으로 분류하고 있으며 전체 원발성 간암의 1% 미만을 차지한다. 간 세포암 환자의 5년 생존율은 전이, 재발 및 화학 및 방사선치료에 대한 저항성으로 인해서 상당히 낮다. 간 세포암이 스스로 발달하는 과정은 설명하기 어려운 현상이다.
따라서, 간세포 분화, 증식 및 암 발달과정에서 역할을 확인하고, 이를 이용하여 간세포 분화 및 증식 조절, 간내 담관세포, 간내 담관세포의 과증식, 간섬유증, 나아가 암의 예방 및 진단법의 개발과 치료 약물의 스크리닝 방법의 개발이 요구된다.
본 발명의 일예는 간모세포를 간내 담관세포로 분화 또는 증식을 조절하는 방법, 및 담도 세포 분화 조절용 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명의 또 다른 일예는 YAP/TAZ 발현 또는 활성 수준을 측정하는 제제를 포함하는 간내 담관세포의 분화를 측정하는 조성물, 또는 상기 제제를 포함하는 담도 세포 분화 측정방법에 관한 것이다.
본 발명의 일예는, Yap/Taz의 발현 또는 활성을 조절하는 조절제를 포함하는, 간질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다. 상기 간질환은 p53 의존성 간암, 및 간내 담관세포의 과증식 또는 이로 인한 질환을 의미한다. 간내 담관세포의 과증식 또는 이로 인한 간질환은 간내 담관세포의 과증식, 간섬유화, 간내 담관암 및 혼합 간세포 담관상피암종일 수 있다.
본 발명의 추가 예는 YAP/TAZ 활성화 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 간 기능에 영향을 미치는 약물 후보물질의 스크리닝용 조성물 및 이를 이용한 스크리닝 방법에 관한 것이다.
본 발명의 추가 예는 YAP/TAZ 단백질 또는 유전자를 포함하는 세포에 후보 물질을 처리하고 YAP/TSZ 단백질의 발현 또는 활성 수준을 측정하여, 간질환 치료제, 예를 들면 간내 담관세포의 과증식과 간섬유증을 억제하는 약물의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가 예는 YAP/TSZ 단백질의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 제제를 포함하는 간질환 치료제, 예를 들면 간내 담관세포간내 담관세포의 과증식과 간섬유증을 억제하는 약물의 스크리닝용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 간 조직에서의 세포 분화 및 증식을 조절하거나, 간 조직에서의 세포 분화 또는 증식 정도를 측정할 수 있으며, 예를 들면, TGF-beta 및/또는 Hnf4-alpha를 조절하여 간모세포에서 간세포로 분화 및/또는 BEC 세포의 분화를 조절할 수 있으며, 간질환 예방 또는 치료, p53 의존성 암의 예방 또는 치료를 수행할 수 있는, 단백질 또는 이의 유전자를 확인하여 본 발명을 완성하였다. 상기 간질환은 p53 의존성 간암, 및 간내 담관세포의 과증식 또는 이로 인한 질환을 의미한다. 간내 담관세포의 과증식 또는 이로 인한 간질환은 간내 담관세포의 과증식, 간섬유화, 간내 담관암 및 혼합 간세포 담관상피암종일 수 있다. 상기 관련 단백질로서 Hippo 경로에 위치하는 하위에서 상위방향으로, YAP/TAZ 단백질, YAP/TAZ 기능을 조절하는 Lats1 및 Lats2 단백질, Lats1 및 Lats2 기능을 조절하는 Mst1 단백질 및 Mst2 단백질 등을 포함한다.
본 발명의 일예에서, 간모세포를 간세포 및/또는 간내 담관세포로 분화 또는 분화를 촉진하는 방법, 및 간세포 및/또는 간내 담관세포의 분화 조절용 조성물에 관한 것이다. 구체적으로, 상기 관련 단백질 또는 이를 암호화 하는 유전자의 조절제로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 조절제를 포함하는, 간세포 및/또는 간내 담관세포의 분화 조절용 조성물, 또는 상기 하나 이상의 조절제를 세포에 접촉하는 단계를 포함하는, 간모세포를 간세포 및/또는 간내 담관세포로 분화시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 추가 일예에서, 간 조직에서 YAP/TAZ 발현 또는 활성 수준을 측정하는 제제를 포함하는 간세포 및/또는 간내 담관세포의 분화를 측정하는 조성물, 또는 상기 제제를 포함하는 간세포 및/또는 간내 담관세포의 분화 측정방법에 관한 것이다.
본 발명의 추가 일예에서, YAP/TAZ 활성화 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 간 기능에 영향을 미치는 약물 후보물질의 스크리닝용 조성물 및 이를 이용한 스크리닝 방법에 관한 것이다. 구체적으로, YAP/TAZ 단백질 또는 유전자를 포함하는 세포에 후보 물질을 처리하는 단계; 상기 후보 물질이 처리된 세포에서 YAP/TAZ 단백질의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 단계; 및 상기 후보 물질의 미처리 대조 세포와 처리된 세포에서 측정된 YAP/TAZ 단백질의 발현 또는 활성 수준을 비교하여
후보 물질을 항암 치료제로 결정하는 단계를 포함하는, 간질환의 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다. 상기 간질환은 p53 의존성 간암, 및 간내 담관세포의 과증식 또는 이로 인한 질환을 의미한다. 간내 담관세포의 과증식 또는 이로 인한 간질환은 간내 담관세포의 과증식, 간섬유화, 간내 담관암 및 혼합 간세포 담관상피암종일 수 있다.
본 발명의 추가 일예는 상기 관련 단백질 또는 이를 암호화 하는 유전자의 조절제로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 조절제를 포함하는, 간내 담관세포의 과증식과 간섬유증을 억제하는 조성물, 간암 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 바람직하게 YAP-Tead 활성에 의존적인 간내 담관세포의 과증식, 간섬유증과 간암일 수 있다.
이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명의 일예는 간 조직에서 YAP/TAZ 활성 또는 발현을 조절함으로써 간세포 및/또는 간내 담관세포의 분화를 조절하는 방법 또는 YAP/TAZ 활성 또는 발현 조절제를 포함하는 간세포 및/또는 간내 담관세포의 분화 조절용 조성물에 관한 것이다. 예를 들면, 간 조직에서 YAP/TAZ 활성 또는 발현을 증가시키는 경우 간세포로의 분화를 억제하고 간내 담관세포로의 분화를 증가 또는 촉진을 유도하고, 간 조직에서 YAP/TAZ 활성 또는 발현을 감소시키는 경우 간세포로의 분화를 증가 또는 촉진하고, 간내 담관세포로의 분화를 억제한다.
구체적으로, 간 조직에서 YAP/TAZ 활성화 또는 발현을 증가함으로써 간세포로의 분화를 억제하고 간내 담관세포로의 분화를 증가 또는 촉진을 유도하며, 구체적으로, TGF-beta 신호를 증가시켜(up-regulation) BEC 세포 및 섬유아세포의 증식을 촉진 또는 증가하고, Hnf4-alpha 발현을 억제하여 간모세포에서 간세포로 분화를 억제할 수 있다.
역으로, 간 조직에서 YAP/TAZ 활성화 또는 발현을 억제함으로써 간세포 분화로의 촉진할 수 있으며, 예를 들면 TGF-beta 신호를 감소시켜(down-regulation) BEC 세포 및 섬유아세포의 증식을 억제 또는 감소시키고, Hnf4-alpha 발현을 증가 또는 촉진하여 간모세포에서 간세포로 분화를 촉진 또는 증가할 수 있다.
본 발명의 일예에 따르면, 본 발명에 따르면, YAP/TAZ 발현 또는 활성 수준은 간모세포에서 간세포 및 간내 담관세포의 분화 및 증식을 조절한다. 구체적으로, Hippo 경로에 위치하는 YAP/TAZ 유전자 또는 단백질의 활성화 또는 발현 증가는 간모세포의 세포 분화를 조절하여, 간세포 계통의 분화 및 증식을 조절할 수 있다. 구체적으로, Hippo 경로에서 YAP/TAZ 유전자의 상위(upstream)에 존재하는 Lats 1 및/또는 Lats 2의 결실 또는 비활성화를 초래한 마우스 또는 1차 간모세포(hepatoblast)는 하위에 존재하는 YAP/TAZ 유전자 또는 단백질의 활성화를 유도한다. 상기 YAP/TAZ 활성화는, 간모세포를 biliary epithelial cell(BEC) 계통으로 세포를 분화시키거나, TGF-beta 신호전달을 증가시켜(up-regulation), BEC 세포 및 섬유아세포의 증식을 촉진 또는 증가시키고, Hnf4-alpha 발현을 억제하여 간모세포에서 간세포로 분화를 억제한다.
상기 Yap/Taz 단백질의 활성의 조절은 Verteporfin 처리에 의해 수행할 수 있다. 상기 Yap/Taz 단백질의 발현은 Yap/Taz 단백질을 암호화하는 유전자의 증폭, YAP S127 변이, Lats1/2 결손이나 비활성화, 또는 Mst1/2 결손이나 비활성화에 의해 조절될 수 있다.
본 명세서에서, 상기 "계통"은 공통된 조상과 유전자형이 같은 개체군을 의미하는 것이며, 보통　실험생물 중에서 공통 조상에서 유래하고 일정한 형질을 보유하면서 세대를 쌓아가는 개체군을 말한다.　상기 "분화"는 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 서로 구조나 기능이 특수화하는 현상. 즉　생물의 세포, 조직 등이 각각에게 주어진 일을 수행하기 위하여 형태나 기능이 변해가는 것을 말한다. 즉, "계통분화"는 어떤 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 서로 구조나 기능이 특수화되어 공통된 조상과 유전자형이 같은 개체군으로 형태나 기능이 변해가는 것을 의미할 수 있다.
본 발명의 일예에서, YAP/TAZ 발현 또는 활성 수준은 Hippo 경로의 상위에 존재하는 Lats 1 및/또는 Lats 2의 발현 또는 활성을 조절함으로써 달성할 수 있다. 구체적으로, 결실, 발현수준 감소, 또는 비활성화 등의 방법으로 Lats 1 및/또는 Lats 2의 활성을 억제함으로써, YAP/TAZ 활성화 수준을 증가시킬 수 있다.
Yap/Taz는 Hippo pathawy에 속하며 목적 유전자를 상향 조절하는 전사 공활성인자 (transcriptional co-activators)로 알려져 있다.
본 발명에 따른 Yap/Taz 활성 억제제는 Yap/Taz 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 모방체, 기질유사체, 앱타머 및 항체로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 mRNA의 발현 여부를 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 쌍, 프로브 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된다. 즉, 핵산의 검출은 유전자를 암호화하는 핵산 분자 또는 상기 핵산 분자의 상보물에 하이브리드화되는 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하는 증폭반응 에 의해 수행될 수 있다. 예컨대, 프라이머를 이용한 mRNA의 검출은 PCR과 같은 증폭 방법을 사용하여 유전자 서열을 증폭한 다음 당 분야에 공지된 방법으로 유전자의 증폭 여부를 확인함으로써 수행될 수 있다. 상기 프라이머의 예로서, Yap mRNA 측정용 프라이머로서 예를 들면 마우스 Yap mRNA 측정용 프라이머 및 사람 Yap mRNA 측정용 프라이머, Taz mRNA 측정용 프라이머로서 예를 들면 마우스 Taz mRNA 측정용 프라이머와 사람 Taz mRNA 측정용 프라이머, 및 YAP/TAZ 활성 측정 프라이머로서 마우스 Ctgf mRNA (서열번호 29의 정방향 프라이머 및 서열번호 30의 역방향 프라이머) 및 사람 CTGF mRNA 측정용 프라이머를 포함할 수 있다. 상기 예시적인 프라이머 서열은 하기 표에 기재하였다.
명명 방향 서열(5'→3') 서열번호
mouse Yap mRNA 측정 F tactgatgcaggtactgcgg 58
mouse Yap mRNA 측정 R tcagggatctcaaaggaggac 59
human YAP mRNA 측정 F gaaccagagaatcagtcaga 60
human YAP mRNA 측정 R ggattgatattccgcattgc 61
mouse Taz mRNA 측정 F catggcggaaaaagatcctcc 62
mouse Taz mRNA 측정 R gtcggtcacgtcataggactg 63
human Taz mRNA 측정 F gtcctacgacgtgaccgac 64
human Taz mRNA 측정 R cacgagatttggctgggatac 65
Mouse CTGF mRNA 측정 F gggcctcttctgcgatttc 29
Mouse CTGF mRNA 측정 R atccaggcaagtgcattggta 30
human CTGF mRNA 측정 F aggagtgggtgtgtgacga 66
human CTGF mRNA 측정 R ccaggcagttggctctaatc 67
상기 mRNA의 발현수준은 당업계에 알려진 통상적인 방법으로 중합효소연쇄반응([0063] PCR), 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay; RPA), 마이크로어레이(microarray), 또는 노던 블롯팅(northern blotting)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 측정될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 펩타이드 또는 뉴클레오티드를 포함한다. 상기 단백질의 발현 여부를 측정하는 제제는 상기 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 의미하고, 다클론 항체, 단클론 항체, 재조합 항체 및 이들의 조합을 모두 포함한다. 상기 항체의 예로서 YAP/TAZ 발현 측정용 항체, YAP 항체, TAZ 항체 등이 있으며, YAP/TAZ 활성화 측정용 항체로는 YAP s127 항체, CTGF 항체 등을 포함한다.
상기 단백질 발현수준은 당업계에 알려진 통상적인 방법으로 웨스턴 블롯팅(western blotting), 방사선면역분석법(radioimmunoassay; RIA), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 효소면역분석법(ELISA), 면역침강법(immunoprecipitation), 유세포분석법(flow cytometry), 면역형광염색법(immunofluorescence), 오우크테로니(ouchterlony), 보체 고정 분석법(complement fixation assay), 또는 단백질 칩(protein chip)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 측정될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 조성물은 상술한 유전자의 발현 여부를 측정하는 제제뿐만 아니라, 항원-항체 복합체의 형성을 정량 또는 정성적으로 측정 가능하게 하는 라벨, 면역학적 분석에 사용되는 통상적인 도구, 시약 등을 더 포함할 수 있다.
본 발명에서, 간조직 또는 간모세포에서 YAP/TAZ 활성 또는 발현 증가는, TGF-beta2 전사를 직접적으로 조절하여 TGF-beta 신호 활성을 유도한다. 따라서 YAP/TAZ 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성 억제제는 TGF-beta 신호 억제제로 작용할 수 있고, 간섬유증 및 간내 담관세포 증식에 기여하는 TGF-beta 신호를 조절하여 간질환, 예를 들면 간섬유증간내 담관세포, 간암, 또는 간내담관암의 예방 및/또는 치료를 위한 약학 조성물로 사용될 수 있다. 구체적으로, 본 발명자들은 Yap/Taz에 의한 L1L2_Adeno 간에서의 Tgf-β 신호의 상향 조절 (up-regulation)이 섬유 세포 (fibrocytes)의 모집 (recruitment) 및 증식을 향상시키고 콜라겐-섬유 생산을 촉진하여 섬유형성을 유도할 수 있음을 나타낸다. 즉, Lats1/2의 손실에 의해 발생하는 Yap/Taz의 활성화가 미성숙 간내 담관세포의 확장 및 성체 간에서의 섬유형성을 유도하기 위해서 Tgf-β 신호를 상향 조절할 수 있음을 나타냄을 확인하였다(실시예 5 참조).
이에, 본 발명은 YAP/TAZ 활성 또는 발현을 조절하는 조절제를 포함하는 간질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하며, 바람직하게는 상기 간질환은 p53 의존성 간암, 및 간내 담관세포의 과증식 또는 이로 인한 질환을 의미한다. 간내 담관세포의 과증식 또는 이로 인한 간질환은 간내 담관세포의 과증식, 간섬유화, 간내 담관암 및 혼합 간세포 담관상피암종일 수 있다. 상기 간질환은 YAP-TEAD 활성에 의존적인 간내 담관세포의 과증식 또는 이로 인한 질환으로서, 구체적으로, 간내 담관세포의 과증식, 간섬유화, 간내 담관암 및 혼합 간세포 담관상피암종을 포함한다.
본 발명의 일예는, YAP/TAZ 단백질 또는 유전자를 포함하는 세포에 후보물질의 처리하고, 처리 및 무처리 군에서 YAP/TAZ 단백질 발현 또는 활성 수준을 측정함으로써, 후보 물질을 간질환의 치료제로 스크리닝할 수 있다. 상기 간질환은 p53 의존성 간암, 및 간내 담관세포의 과증식 또는 이로 인한 질환을 의미한다. 간내 담관세포의 과증식 또는 이로 인한 간질환은 간내 담관세포의 과증식, 간섬유화, 간내 담관암 및 혼합 간세포 담관상피암종일 수 있다.
이에, 본 발명은 본 발명의 추가 예는 YAP/TAZ 단백질의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 제제를 포함하는 간내 담관세포 증식 억제제 또는 간섬유증 치료제의 스크리닝용 조성물, 또는 YAP/TAZ 단백질 또는 유전자를 포함하는 세포에 후보 물질을 처리하는 단계와 YAP/TAZ 단백질의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 단계를 포함하는 간내 담관세포 증식 억제제 또는 간섬유증의 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 간질환의 치료제의 스크리닝 방법은, 예를 들면 YAP/TAZ 단백질 또는 유전자를 포함하는 세포에 후보 물질을 처리하는 단계; 상기 후보 물질이 처리된 세포에서 YAP/TAZ 단백질의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 단계; 및 상기 후보 물질의 미처리 대조 세포와 처리된 세포에서 측정된 YAP/TAZ 단백질의 발현 또는 활성 수준을 비교하여 후보 물질을 간질환의 치료제로 결정하는 단계를 포함하는, 후보물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다. 또는, 간질환의 치료제를 스크리닝하는 방법은, 후보물질 및 YAP/TAZ 단백질 또는 유전자를 포함하는 시험관 내 시스템을 준비하는 단계, 상기 후보물질을 상기 시스템에 처리하는 단계, YAP/TAZ 단백질 또는 유전자와 접촉시키는 단계, 및 상기 후보물질이 상기 YAP/TAZ 단백질의 활성 또는 발현을 증가시키는 지 여부를 결정하는 단계를 포함한다.
상기 간질환의 치료제의 결정화 단계는, YAP/TAZ 단백질의 발현 또는 활성 수준을 증가시키는 후보 물질을 선별하여 TGF-beta 신호 비활성화로 결정하는 것이다.
상기 YAP/TAZ 단백질의 발현 또는 활성 수준 상기 기술한 방법과 동일한 방법으로 측정할 수 있으며, 상기 측정단계에서, 항원-항체 복합체의 형성을 정량 또는 정성적으로 측정 가능하게 하는 라벨, 면역학적 분석에 사용되는 통상적인 도구, 시약 등을 추가로 사용하여 수행될 수 있다. 또한, 상기 YAP/TRZ 단백질의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 제제는 상술한 바와 같다.
본 발명에서, TGF-beta 신호는 TGF-beta 리간드에 의하여 활성화되어 Smad3/4의 활성화를 유도하고 Smad3/4는 전사조절인자로서 다양한 유전자를 증가시킨다. 그동안 TGF-beta 신호는 상피세포에서 중엽세포로의 전환에 중요하며 암세포의 전이 및 다양한 섬유증에 기여할 수 있음이 밝혀졌다. 특히 간에서 여러 종류의 질병과 연관된 것이 연구로 증명되었고 특히 간섬유증을 유발하는 다양한 ECM factor (예컨대, Vimentin, Collagen, SMA 등) 발현을 증가시킨다. 따라서 TGF-beta 신호는 간경화로 발전하기 전 간섬유증을 치료할 수 있는 저지노선으로 여겨진다. 그러나 그 동안 다양한 마우스 모델에서 시험한 것과 다르게 TGF-beta 신호 억제제 만을 투여하는 임상시험에서 유의미한 개선 효과를 보이지 못하여 간섬유증 치료제 개발이 시급한 실정이다. 따라서 본 발명을 통하여 개발된 YAP/TAZ 활성의 저해제가 간담세포 증식 및 간섬유증 유발 인자 발현을 억제하고 간세포로의 분화를 촉진함으로써 기존 치료보다 개선된 간섬유증 치료 효과가 얻어질 수 있다.
간 기능에 대한 영향 및 간 손상은 약물에 의한 주요 독성 유발 요인 중 하나로] 신약개발의 초기단계에 있어서 약물의 간독성 여부나 예상치 못한 대사물 생성 여부에 대한 평가가 매우 중요하지만 사람의 간이 가지는 구조적, 기능적 복잡성 때문에 간을 대체할 수 있는 in vitro 평가도구가 없는 상태이다.
간 생검조직으로부터 초대배양세포를 얻어내어 이용하거나 상용화된 초대배양 간세포를 구입하여 이용할 수 있지만 앞서 지적하였듯이 초대배양세포는 증식력이 매우 제한적이고, 품질이 일정하지 못한 단점이 있어 비용대비 효용성이 매우 낮다. 이에 대한 대안으로 사람의 종양세포주인 HepG2 세포주 등이 사용되고 있으나 이는 간세포 특이 약물대사효소 및 주요 단백질 발현수준에서 체내의 간세포와 현격한 차이가 있다.
약물대사효소계 활성은 줄기세포에서 간세포 유도시 해결해야할 큰 문제 중 하나이다. Glutathione S transferase(GST) 등의 phase II 효소의 경우 줄기세포유래 간세포가 사람의 간세포와 유사한 수준으로 발현한다는 보고가 있으며, phase I 효소인 cytochrome P450(CYP) 역시 messenger RNA 및 단백질 수준에서 발현될 수 있음이 일부 보고되고 있다[9,10]. 하지만 현재까지 줄기세포 유래 간세포에서 CYP 효소가 체내 간세포와 유사한 수준으로 발현될 수 있는지에 대한 보고는 없으며 이러한 효소계가 실제로 효소활성을 나타낸다는 보고 또한 극히 제한적이다.
이러한 문제를 극복하기 위해 3차원 배양 등 배양조건의 세밀화 및 분화법의 효율화를 위한 다양한 시도가 이루어지고 있으며, 이를 통해 줄기세포로부터 대사효소 및 간세포의 주요 단백질 등 기능적으로 사람 간세포의 체내 조건과 동일하고 안정적인 세포주를 개발할 경우 신약개발 및 평가의 신뢰성 제고뿐만 아니라 비용 절감 및 신약개발 성공률 증진을 통한 수익성 향상에 미칠 영향은 매우 클 것이다.
본 발명에서 간질환의 예방 또는 치료 방법에 있어서, 치료 대상은 인간, 원숭이 등의 영장류, 래트, 마우스 등의 설치류 등을 포함하는 포유동물 또는 인간을 제외한 포유 동물일 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 약학 조성물은, 통상의 방법에 따라 제형화 된, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 또는 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 외용제, 좌제, 멸균 주사 용액, 이식용 제제 등의 비경구용 제형 등으로 제형화하여 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있는데, 실제 임상 투여 시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있다. 본 발명에 따른 간질환 치료제는 약학조성물 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 바람직하게는 비경구로 투여된다. 비경구로 투여되는 경우, 본 발명의 약학 조성물은 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입 및 복강 주입 등으로 투여할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 적용되는 질환의 종류에 따라, 투여 경로가 결정되는 것이 바람직하다.
본 발명의 약학적 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에 활성 성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 질병종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1 ㎏ 당 0.001 내지 150 ㎎, 바람직하게는 0.01 내지 100 ㎎을 매일 또는 격일 투여하거나, 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명은 YAP/TAZ 단백질 및 유전자, YAP/TAZ와 관련 단백질 및 유전자를 이용하여, 간세포/간내 담관세포의 분화를 조절하거나, 간섬유증 진단 또는 치료하거나, 간암의 진단 또는 치료하거나, 상기 간세포를 이용한 약물 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
도 1a은 실시예 1에 따른 E14.5 간에서 간모세포를 분리 배양 및 생체 외 분화시키는 생체 외 배양 시스템의 모식도이다.
도 1b는 실시예 1에 따른 대조군 및 L1L2_Alb 간모세포를 14일 동안 생체 외 분화를 시켜 얻은 간내 담관세포에 대한 bright-field 이미지 (상단 왼쪽)를 나타낸다. 스케일 바는 400 um를 나타낸다. 상단 오른쪽 그래프는 대조군 및 L1L2_Alb 간내 담관세포에 대하여 qRT-PCR를 수행하여 Cytokeratin 7(Krt 7) 및 Cytokeratin 19(Krt 9)의 mRNA 발현 수준을 확인한 결과를 나타낸다. 하단의 상자는 대조군 및 L1L2_Alb 간내 담관세포에 대한 RNA 서열 분석 결과 상향-조절 또는 하향-조절된 유전자 세트를 나타낸다.
도 1c는 실시예 1에 따른 대조군, L1L2_Alb 간모세포, 및 간세포에 대해서 항-Hnf4α 항체를 사용하여 수행한 면역형광 염색 결과 (상단 왼쪽) 및 qRT-PCR로 확인한 Hnf4α 및 Cyp7a1의 상대적 mRNA 발현 수준 (상단 오른쪽)이다. 스케일 바는 50 um를 나타낸다. 하단의 상자는 대조군 및 L1L2_Alb 간세포에 대한 RNA 서열분석 결과 상향-조절 또는 하향-조절된 유전자 세트를 나타낸다.
도 2a는 실시예 2에 따른 대조군 및 L1L2_Alb 간의 출생후의 날 (P) 1 (첫째 및 넷째 행), 배아 날 (E) E17.5 (둘째 및 다섯째 행), 및 배아 날 (E) E16.5 (셋째 및 여섯째 행)에서 Hematoxylin 및 eosin (H&E) 염색 (왼쪽), 면역형광 분석 (가운데 및 오른쪽 칼럼)사진이다. 면역형광 분석에는 항-CK19, 항-pan-CK 및 DAPI (가운데 칼럼), 및 항-Hnf4α 및 DAPI (오른쪽 칼럼)을 사용하였다. 검은 화살표는 관판 세포를 나타내고, 점선은 관판을 나타내고, 노란색 화살표는 양성 항체 신호를 나타내고, 흰색 화살표는 염색이 없음을 나타내고, 스케일 바는 50 um를 나타낸다.
도 2b는 실시예 2에 따른 출생 후 시기인 P1에서 N1ICD Tg_Alb 간 (상단) 및 L1L2RbpJ_Alb 간 (하단)에서의 H&E 염색(왼쪽 칼럼), 항-CK19 및 DAPI(중간) 및 항-Hnf4α 및 DAPI (오른쪽 칼럼)로 염색한 면역형광 이미지이다. 검은 화살표는 관판 세포를 나타내고, 점선은 담관을 나타낸다. 노란색 화살표는 양성 항체 신호를 나타내고; 흰색 화살표는 염색이 없음을 나타낸다. 스케일 바는 50 um를 나타낸다.
도 2c는 실시예 2에 따른 qRT-PCR을 통해서 확인한 표시된 유전자형의 마우스 P1 간에서 얻은 간세포-연관된 유전자의 상대적 mRNA 발현 수준을 나타내는 그래프이다.
도 2d는 실시예 2에 따른 qRT-PCR을 통해서 확인한 표시된 유전자형의 마우스 P1 간에서 얻은 간내 담관세포-연관된 유전자의 상대적 mRNA 발현 수준이다.
도 2e는 실시예 2에 따른 P1의 대조군 및 L1L2_Alb 간에서의 100 개의 pan-CK- 및 Hnf4α-발현하는 세포 중에서 pH3 (S10)-양성 세포의 개수를 나타낸 그래프이다.
도 3a은 실시예 3에 따라 E16.5의 대조군 및 L1L2_Alb 간에서 항-phospho-Yap (S127) 및 항-Yap을 사용해 얻은 대표적인 면역조직화학 염색 결과이다. 검은색 화살표는 양성 신호를 나타낸다.
도 3b는 실시예 3에 따라 표시한 유전자형의 배아의 E17.5에서 얻은 전체 간에 대한 면역블롯 분석결과를 나타낸다.
도 3c는 실시예 3에 따라 대조군 및 L1L2_Alb P1 간에서 얻은 mRNA에 대하여 qRT-PCR을 수행한 결과이다.
도 3d는 실시예 3에 따라 Yap_Alb, Taz_Alb, 및 Yap/Taz_Alb 마우스의 간에 대하여 H&E 염색 및 항-pan-CK 항체를 이용한 면역형광 분석결과이다. 검은색 화살표는 pan-CK에 대한 양성 신호이고 붉은색 화살표는 pan-CK에 대한 음성 신호를 나타낸다. 스케일 바는 50 um를 나타낸다. P1에서 Lats1-/-; Lats2fl /fl; Yapfl /fl; Alb-Cre (L1L2Yap_Alb), Lats1-/-; Lats2fl /fl; Tazfl /fl; Alb-Cre (L1LTaz_Alb) 및 Lats1-/-; Lats2fl /fl; Yapfl /fl; Tazfl /fl; Alb-Cre (L1L2YapTaz_Alb) 간에 대한 H&E 염색 (상단) 및 항-CK19 항체 및 DAPI를 사용한 면역형광 (하단) 분석의 대표적 이미지이다. 검은색 점선은 관판 및 비관판 사이의 경계를 나타낸다. 검은색 화살표는 관판 세포를 나타낸다. 노란색 화살표는 CK19 양성 신호를 나타낸다.
도 3e는 실시예 3에 따라 대조군, Yap WT (Wild type), Yap-2SA 및 Yap-5SA 과발현 생체 외 분화 간세포 (iHP)에 대하여 qRT-PCR을 수행하여 HNF4α의 상대적 mRNA 발현 수준을 확인한 결과이다.
도 3f은 실시예 3에 따라 대조군, Yap WT (Wild type), Yap-2SA 및 Yap-5SA 과발현 생체 외 분화 간내 담관세포 (iBEC)에 대하여 qRT-PCR을 수행하여 cytokeratin 7의 상대적 mRNA 발현 수준을 수량화한 그래프이다(N=2)
도 3g은 실시예 3에 따라 P1 시기의 Mst1 및 Mst2 이중 녹아웃 마우스 및 Nf2 녹아웃 마우스 간의 H&E 염색 (왼쪽 상단) 및 항-CK19 항체 및 DAPI를 사용한 면역형광 (왼쪽 하단) 분석 결과이다. 오른쪽 그래프는 간문맥 (portal vein)당 100개의 pan-CK 양성 세포의 개수를 나타낸다. 검은색 화살표는 관판 세포를 나타내고, 점선은 관판을 나타낸다. 노란색 화살표는 CK19에 양성 신호를 나타낸다. 스케일 바는 50 um를 나타낸다; 데이터는 평균 ± 평균표준오차로 나타냈다; n = 3, *p < 0.05 및 **p < 0.01 (Student's t-test).
도 4a는 실시예 4에 따라 Lats1/2 이중 녹아웃된 간내 담관세포 및 대조군 간내 담관세포 사이의 Tgfβ 반응의 상향 조절된 유전자 세트의 특징적 그래프 (왼쪽) 및 대조군 및 Lats1/2 이중 녹아웃된 간모세포, 간내 담관세포, 및 간세포에서 Tgfβ 반응의 상향 조절된 유전자의 mRNA 발현 수준의 heap map 결과 (오른쪽)이다.
도 4b은 실시예 4에 따라 qRT-PCR을 통해 확인한 간모세포 (iHB), 간세포 (iHP), 및 간내 담관세포 (iBEC) (왼쪽) 및 대조군 및 L1L2_Alb 마우스의 P1 간 (오른쪽)에서의 Tgfβ2 mRNA의 상대적 발현을 나타내는 그래프이다.
도 4c는 실시예 4에 따라 대조군 및 L1L2_Alb P1 간에서 항-Smad2/3 및 항-CK19를 사용해서 얻은 대표적인 면역형광 분석 결과이다. 노란색 화살표는 CK19 양성 세포에서 핵의 Smad2/3를 나타내고 흰색 화살표는 CK19 양성 세포에서 세포질의 Smad2/3를 나타낸다.
도 4d는 실시예 4에 따라 FLAG-YAP 5SA를 과발현하는 간세포에서 항-FLAG 또는 항-YAP 항체를 사용하고 Tgfβ2 유전자 위치로 확인한 크로마틴 면역침강 분석결과이다. Pou5f1은 YAP이 간세포에서 결합하지 않는 음성 대조군 (negative control)을 나타내고, TGFβ R1, R2, 및 R3 는 YAP이 결합할 수 있는 TEAD 결합 서열 부위 (binding sequence region)를 나타내고, E1, E2는 Tgf-b2 엑손 1 및 엑손 2를 나타낸다. 세로축은 음성 대조구 (IgG) 대비 YAP이 특정 유전자에 결합하는 정도를 나타낸다.
도 4e은 실시예 4에 따라 TGFβ-수용체 저해제인 SB431542를 처리하거나 처리하지 않은 YAP 5SA 과발현 간내 담관세포에 대하여 qRT-PCR을 수행하여 cytokeratin 7 및 19의 상대적 mRNA 발현 수준을 확인한 그래프이다.
도 4f는 실시예 4에 따라 TGFβ-수용체 저해제인 SB431542를 처리하거나 처리하지 않은 YAP 5SA 과발현 간내 담관세포에 대하여 qRT-PCR을 수행하여 Hnf4α의 상대적 mRNA 발현 수준을 확인한 그래프이다. 스케일 바는 5 um를 나타낸다; 데이터는 평균 ± 평균표준오차로 나타냈다; n = 3, *p < 0.05 및 **p < 0.01 (Student's t-test).
도 5a는 실시예 5에 따라 Adeno-Cre (2 X 108 PFU) 주입된 대조군 및 Lats1-/-; Lats2fl /fl 주입된 마우스 (L1L2_Adeno)의 간을 나타낸다.
도 5b는 실시예 5에 따라 Adeno-Cre 바이러스를 주입한 간의 간과 체중의 비율을 나타낸 점그래프 (dot graph)를 나타낸다.
도 5c은 실시예 5에 따라 대조군 및 L1L2_Adseno 간에 대한 H&E 염색 결과를 나타낸다. 상단에서 스케일 바는 100 um를 나타내고 하단에서 스케일 바는 50 um를 나타낸다. 붉은색 화살표는 간세포에서 큰 세포 변화를 나타낸다.
도 5d은 실시예 5에 따라 대조군 및 L1L2_Adseno 간에 대한 항-pan-CK, Sirius red 및 Fast green, 및 항-Smad2/3 및 항-CK19 항체를 사용한 염색 이미지이다. 검은색 화살표는 튜브형의 담관을 나타내고 노란색 화살표는 미성숙 간내 담관세포를 나타낸다. Sirius red는 간 섬유화 지역을 나타낸다. 붉은색 화살표는 간세포에서 큰 세포 변화를 나타낸다. 맨 위쪽 패널의 노란색 화살표는 pan-CK-양성 신호를 나타낸다. 가장 아래 패널의 흰색 화살표는 CK19 양성 세포에서 세포질의 Smad2/3 신호를 나타낸다; 가장 아래 패널의 노란색 화살표는 CK19 양성 세포에서 핵의 Smad2/3 신호를 나타낸다. 스케일 바는 50 um를 나타낸다.
도 5e는 실시예 5에 따라 100 개의 pan-CK- 및 Hnf4α-양성 세포중에서 BrdU-양성 세포의 수량화를 나타낸 그래프(상단), 대조군 및 L1L2_Adeno 간에 대하여 qRT-PCR을 수행하여 간내담관세포 및 간세포 마커의 상대적 mRNA 발현 수준(중단), Tgfβ2 및 섬유화 형성 마커의 상대적 mRNA 발현 수준을 나타낸 그래프이다(하단).
도 5f는 실시예 5에 따라 L1L2_AAV 마우스를 이용한 실험결과로서, a는 대조군 및 L1L2_AAV 간에 대하여 qRT-PCR을 수행하여 간손상과 연관된 유전자의 상대적 mRNA 발현 수준을 나타낸 그래프(n=4)이고, b, c, d는 대조군 및 L1L2_AAV 간에 대하여 H&E 염색 및 항-pan-CK 및 항-Hnf4α항체로 면역조직화학적 분석을 수행한 이미지이고(스케일 바는 50 um를 나타낸다), e는 대조군 및 L1L2_AAV 간세포 또는 비-유조직 세포 부분에 대한 Lats2의 재조합 PCR 결과를 나타낸다.
도 6a는 실시예 6에 따라 대조군 및 L1L2_Adeno 간에서 항-Hnf4α (상단) 및 항-phospho-γ-H2AX (S139) (하단) 항체를 이용하여 수행한 면역조직화학 분석 결과이다. 검은색 화살표는 정상 간세포를 나타내고, 상단의 붉은색 화살표는 간세포의 큰 변화를 나타내고, 하단의 붉은색 화살표는 p-γ-H2AX에 대한 양성 신호를 나타낸다. 스케일 바는 50 um를 나타낸다.
도 6b는 실시예 6에 따라 대조군 및 adeno-Cre (L1L2_Ad) (lanes 1-6), Lats2fl/fl; Alb-Cre (L2_Alb) (lane 7, HCC), 및 Mst1fl /fl; Mst2-/-; Alb-Cre (Mst1/2_Alb) (lanes 8 및 9, HCC)를 주입한 Lats1-/-; Lats2fl/fl 마우스의 간 용해물에 대한 면역블롯 분석 결과이다. 별표는 상당히 확장된 섬유세포 (fibrocytes)를 가지고 있는 간의 용해물을 나타낸다.
도 6c는 실시예 6에 따라 대조군, L1L2_Adeno, L1L2_p53_Adeno 및 p53_Adeno 간에서 Yap, p21, 및 pH3 (S10)에 대한 항체를 이용하여 수행한 H&E 염색 및 면역조직화학 결과이다. H&E 염색 이미지에서, 검은색 화살표는 간세포의 큰 변화를 나타낸다. 면역조직화학 염색 이미지에서, 검은색 화살표는 나타낸 항체에 대한 양성 신호를 나타내고 노란색 화살표는 염색이 존재하지 않음을 나타낸다. 스케일 바는 50 um를 나타낸다.
도 6d는 실시예 6에 따라 대조군, L1L2_Adeno, L1L2_p53_Adeno 및 p53_Adeno 마우스에서 얻은 간에 대하여 qRT-PCR을 수행하여 얻은 간세포 및 간내 담관세포 마커의 상대적 mRNA 발현양을 나타내는 그래프이다.
도 6e은 실시예 6에 따라 대조군, Yap WT, Yap-2SA 및 Yap-5SA를 과발현하는 간모세포 또는 간세포에 대하여 qRT-PCR을 수행하여 얻은 Hnf4α의 상대적 mRNA 발현 수준결과이다. 데이터는 평균 ± 평균표준오차로 나타냈다; n = 3, *p < 0.05, **p < 0.01 및 ***p < 0.005 (Student's t-test).
도 7a는 실시예 7에 따라 대조군 및 Lats1/2 이중 녹아웃된 간세포 사이의 Hnf4α 목표 유전자의 특징적 그래프 (Signature plot)이다.
도 7b은 실시예 7에 따라 Yap 5SA 및 Yap 5SA 94A (Tead-결합 부위의 결실)를 과발현하는 간모세포 및 간세포에 대하여 qRT-PCR을 수행하여 얻은 HNF4α 및 Cyp7a1의 상대적 mRNA 발현 수준결과이다.
도 7c는 실시예 7에 따라 대조군 및 Yap 녹아웃 마우스에서 얻은 간세포에 대하여 qRT-PCR을 수행하여 얻은 HNF4α의 상대적 mRNA 발현 수준 결과이다.
도 7d은 실시예 7에 따라 FLAG- Yap 5SA를 과발현하는 간세포의 HNF4α 위치에 대한 크로마틴 면역침강 분석 결과이다 (항-FLAG 또는 항-YAP를 사용함). 데이터는 평균 ± 평균표준오차로 나타냈다; n = 3, *p < 0.05 (Student's t-test).
도 7e는 실시예 7에 따라 FLAG- Yap 5SA를 과발현하는 간세포의 HNF4α 위치에 대한 크로마틴 면역침강 분석 결과이다 (항-CHD4를 사용함). 데이터는 평균 ± 평균표준오차로 나타냈다; n = 3, *p < 0.05 (Student's t-test).
도 7f은 실시예 7에 따라 대조군 및 L1L2_Adeno 간에 대하여 FACS 분석을 수행한 결과를 나타낸다.
도 8a 내지 도 8b는 실시예 6에 따라 p53 유전자를 결실시킨 간 세포를 조직학적 및 면역조직화학적 분석을 수행하여 p53 유전자의 결실에 의해서 Last1/2 이중 녹아웃된 간세포의 감소된 생존력 및 증식 능력이 회복됨을 확인한 결과로서, 도 8a는 대조구, L1L2_Adeno, L1L2p53_Adeno 및 p53_Adeno liver에서 추출된 단백질의 웨스턴 블랏 분석 결과이고, 도 8b는 BrdU incorporation assay 결과를 나타낸다(scale bar는 100마이크로미터를 의미한다).
이하 본 발명을 참고예 및 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 이들 참고예 및 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 아니 된다.
< 참고예 1> 조건적 녹아웃 마우스의 제작
종래에 알려진 방법을 사용하여 Lats1-/-, Lats2fl /fl, Yapfl /fl, Tazfl /fl, Mst1fl/fl, Mst2-/-, Nf2fl /fl, Notch2fl /fl 및 p53-/- 마우스를 제작하였다 (Das, A. et al. Stromal-epithelial crosstalk regulates kidney progenitor cell differentiation. Nat. Cell Biol. 15, 1035-1044 (2013). 64., Chiyoda, T. et al. LATS1/WARTS phosphorylates MYPT1 to counteract PLK1 and regulate mammalian mitotic progression. J. Cell Biol. 197, 625-641 (2012). 65., Kim, M. et al. cAMP/PKA signalling reinforces the LATS-YAP pathway to fully suppress YAP in response to actin cytoskeletal changes. EMBO J. 32, 1543-1555 (2013). 66., Oh, S. et al. Crucial role for Mst1 and Mst2 kinases in early embryonic development of the mouse. Mol. Cell Biol. 29, 6309-6320 (2009). 67., Chung, C. et al. Hippo-Foxa2 signaling pathway plays a role in peripheral lung maturation and surfactant homeostasis. Proc. Natl Acad. Sci. USA 110, 7732-7737 (2013)).
조건적으로 NICD를 과발현하는 Albumin-Cre (B6.Cg-Tg(Alb-cre)21Mgn/J), (Gt(ROSA)26Sortm1(Notch1)Dam/J) 마우스는 Jackson Laboratory에서 구입하였고 RbpJfl /fl 마우스는 RIKEN (RBRC01071)에서 얻었다. Lats2 유전자 위치를 결실하기 위해서, 2 X 108 ~ 2 X 109 PFU Adeno-Cre 바이러스 (Vector Bio 1710, 1710-HT)를 PBS에서 희석하고 생후 4-6주된 웅성 마우스 (B6/129 혼합된 스트레인 (strain))의 정맥을 통해서 주입 (100 uL)하였다. AAV-TBG-Cre 바이러스는 University of Pennsylvania Vector Core (AV-8-PV1091)에서 구입하거나 Salk Institute 생명과학 부분에서 제공된 프로토콜에 따라서 AAV 바이러스로 정제하였다.
AAV-TBG-Cre 바이러스를 정제하기 위해서, 각각의 플라스미드 (pAAV2/8, pAdDeltaF6 및 pENN.AAV.TBG.PI.Cre; University of Pennsylvania Vector Core에서 구입함) 6 ug을 PEI를 사용하여 100 mm 플레이트의 293T 세포에 트랜스펙션하였다. 트랜스펙션하고 72시간 후에, 20 개 플레이트의 세포들을 모아서 10 분간 1000 g의 속도로 원심분리하였다. 펠릿 (Pellet)은 0.15 M NaCl, 50 mM Tris-Cl (pH 8.5), 0.05% (v/v) Tween을 포함하는 용해 버퍼 20 mL로 재부유하고, 그리고 나서 얻은 용해물 (lysates)에 대하여 액체 질소에서 급속히 얼리고 37℃에서 녹이는 과정을 3회 수행하였다. 그리고 나서 benzonase가 최종 농도가 50 Unit/mL가 되도록 추가했고 37℃에서 30분간 배양하였다. 그리고 나서 용해물은 3700 g의 속도로 20분간 원심분리하고 상청액 (supernatant)을 새로운 튜브에 옮겨 담았다. 그 다음에, 6 mL의 AAV 용해물은 부드럽게 Beckman Ultra Tubes (Ca. 34241)의 iodixanol gradient (15%-25%-40%-54%)의 상단에 부드럽게 놓고 Beckman 70Ti rotor에서 48000 rpm의 속도에서 2시간 동안 초원심분리 (ultracentrifuge)하였다.
정제한 AAV 바이러스를 포함하는 층은 19 게이지의 주사 바늘과 5 mL 주사기를 이용하여 추출하였다. AAV 바이러스의 농도 및 PBS에 대한 버퍼 교환은 Amicon 초원심분리 필터 (Millipore UFC910024)에서 3700 rpm의 속도로 20분간 수행되었다. 100 uL 부피의 바이러스를 모았고 유전자 복제 숫자 (gene copy number, gcp)의 수량화를 위해서 바이러스 유전체 (genome)를 NaOH로 추출하고 이어서 qRT-PCR을 수행하였다. 실험 동물의 관리 및 모든 실험들은 카이스트 (Korea Advanced Institute of Science and Technology) 의생명 연구 센터에서 승인된 지침을 준수하여 수행하였다.
< 참고예 2> 조직학, 면역조직화학, 및 면역형광 분석
배아 간 (Embryonic livers)은 E14.5 ~ P1 사이의 임신중인 암컷 또는 새로 태어난 마우스에서 추출하였다. 성년 마우스는 희생되었고 간 분리이전에 20 mL PBS로 관류하였다. 간은 10% (w/v) 포르말린을 포함하는 PBS에서 4℃ 상태로 4 ~ 24시간 동안 고정하고 파라핀에 끼워 넣었다. 4 um의 부분으로 자르고 hematoxylin & eosin (H&E)으로 염색하였다.
면역조직화학 (Immunohistochemistry, IHC) 및 면역형광 (Immunofluorescence, IF) 염색을 위해서, 1 mM EDTA (pH 8.0)상에서 전자레인지 안에서 끓이면서 항원 회복 (Antigen retrieval)을 수행하였다. 냉각된 후, PBS에 녹인 3% (w/v) BSA 및 0.3% (w/v) Triton X-100를 포함하는 블로킹 용액을 1시간 동안 처리하였다. 또한, 면역조직화학을 위해서, 1% (v/v) H2O2를 10분간 처리하여 세포 내부의 과산화효소 (Peroxidase)를 저해하기 위한 단계를 추가했다. 자른 부분들은 Yap (Cell Signaling, 1:100), p-Yap (Cell Signaling (S127), 1:100), pH3 (Cell Signaling (S10), 1:200), Smad2/3 (Santa Cruz, 1:100), BrdU (BD Bioscience, 1:400), p21 (BD Bioscience, 1:200), pan-CK (Dako, 1:200), Ck19 (DSHB (Troma III), 1:200) 및 HNF4α (Santa Cruz, 1:200)에 대한 항체들과 4℃에서 밤새 배양하였다.
면역조직화학을 위해서, 부분들은 PBS로 세척하고 DAB Substrate kit (Dako)를 사용하여 현상하고, 그리고 나서 hematoxylin으로 대비염색 했다. 면역형광 염색을 위해서, 부분들은 PBS로 세척하고 항-염소 AF488, 항-토끼 AF594, 항-마우스 AF488, 항-토끼 AF488 (Invitrogen)과 배양하고, 그리고 나서 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI; Sigma)로 대비염색 했다. Imager M1 fluorescence microscope (Zeiss), Axio Scan Z1 (Carl Zeiss) 또는 Leica DMLB microscope (Leica)을 사용하여 이미지들을 얻었다.
< 참고예 3> 간모세포 ( Hepatoblast) 분리 및 생체 외 분화
간모세포 배양을 위해서, 대조군 및 L1L2_Alb (Lats1-/-; Lats2fl /fl; Alb-cre) 간을 절제하고 1 mg/mL의 collagenase/dispase (Roche)를 넣어 37에서 30분간 일정한 흔들기로 배양하여 분해하였다. 상기 대조군 마우스는 참고예 1에서 cre가 없는 녹아웃 시키지 않은 마우스이다. 분해된 전체 세포들을 100 um 두께의 세포 여과기 (cell strainer) (BD Bioscience)를 통과시키고 250 g의 속도로 10분간 원심분리하여 세포들을 모았다. 붉은색 혈액 세포를 1X 암모늄-염소-칼륨 버퍼로 용해하고 남아 있는 간모세포들의 숫자를 계산했다.
간모세포 (1 X 106)는 collagen I (BD Bioscience) 또는 gelatin (Sigma)으로 코팅된 60 mm 그릇에 플레이팅하고 10% (v/v) FBS, 25 ng/mL hEGF (Peprotech), 25 ng/mL hHGF, 5 ug/ mL insulin, 및 40 ng/mL dexamethasone (Sigma)을 포함하는 Dulbecco's modified Eagle's medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) (Welgene)에서 배양했다.
간 분화를 위해서, 상기 간모세포에 대하여 12.5 ng/mL의 Oncostatin M (Sigma)을 6일 동안 처리했다 (생체 외 분화 간세포; iHP). 간내 담관세포 (Biliary epithelial cells, BECs) 분화를 위해서, 상기 간모세포를 Matrigel (BD Bioscience)에서 14일 동안 배양하였다 (생체 외 분화 간내 담관세포; iBEC).
Yap 과발현을 위해서, 세포를 플레이팅하고 2일 후 Yap WT, YAP 2SA 및 YAP 5SA를 포함하는 레트로 바이러스로 감염시켰다. 레트로 바이러스는 pMSCV puro, pMSCV-Yap WT, pMSCV-Yap 2SA, pMSCV-Yap 5SA, 및 패키징 벡터 (Gag-pol 및 VSV-G)를 가지고 있는 293T에서 생산했다.
< 참고예 4> 간세포 ( Hepatocyte ) 분리 및 유동세포분석 (Flow cytometry )
마우스는 안락사하고 30 mL의 PBS로 관류시키고, 그리고 나서 0.5 mg/mL의 collagenase/dispase 혼합물을 간문맥 (portal vein)을 통해서 주입했다. 간을 절개하고 작은 조각으로 잘게 잘랐다. 1 mg/mL의 collagenase/dispase 혼합물을 첨가하고 37 ℃에서 30분간 흔들어 배양했다. 상청액을 수집한 후에, 1 mg/mL의 collagenase/dispase 혼합물이 새로 첨가되고 37 ℃에서 30분간 일정하게 흔들어 배양하였다. 상청액은 세포 여과기 (100 um)를 통과하여 50 g의 속도로 4 ℃에서 5분간 원심분리 했다. 펠릿에 존재하는 세포는 간세포 부분을 포함한다. 죽은 세포 및 세포 잔해물은 25% 퍼콜을 사용하여 제거했다 (1200 g의 속도로 4℃에서 20분간). 비실질 부분 (non-parenchymal fraction)을 생산하기 위해서 상청액에 대하여 밀도구배 원심분리 (Density gradient centrifugation, 25% (w/v) 퍼콜 (Percoll) 및 50% 퍼콜, 1,800 g, 4℃, 30 분간)를 수행했다.
간모세포, 생체 외 분화 간세포, 및 마우스 배아 섬유아세포 (Mouse embryonic fibroblast, MEF)는 수집되어, 70% (v/v) 에탄올에 20℃에서 고정하고, DAPI로 염색하였다. 샘플당 20,000-50,000 세포를 기록하였다.
더블릿 (doublets)을 제거하기 위해서 제한을 설정하고 subG1 세포의 빈도를 계산했다. 배수성 (polyploidy)을 계산하기 위해서 subG1 세포 및 더블릿을 제외하고, 그리고 나서 한 세포가 4n 이상의 핵상을 가진 세포들을 계산하였다. 데이터 분석을 위해서 FlowJo v.7와 같이 BD LSRFortessa를 사용하였다.
< 참고예 5> qRT - PCR에 의한 유전자 발현 분석
간 또는 배양 세포에서 Ribo-ex (Gene All)를 사용하여 전체 mRNA를 분리하고, M-MLV reverse transcriptase (Enzynomics), oligo dT18 및 random hexamer를 이용하여 3.5 ug 양의 전체 mRNA에서 cDNA를 합성했다. CFX Connect (BioRad) 및 2X SYBR green premix (Enzynomics)를 사용하여 qRT-PCR을 수행했다. 사용한 올리고뉴클레오티드의 서열은 하기 표에 나타나 있다.
명명 서열 (5' → 3') 서열번호
Krt7_F gacccttcacgagacagagtt 1
Krt7_R gcaatctcattccgggtgttg 2
Krt19_F gggggttcagtacgcattgg 3
Krt19_R gaggacgaggtcacgaagc 4
Hnf1b_F gaaagcaacgggagatcctc 5
Hnf1b_R cctccactaaggcctccctc 6
Hnf6_F agccctggagcaaactcaagtcg 7
Hnf6_R tgcatgtagagttcgacgttggac 8
Notch2_F atgcaccatgacatcgttcg 9
Notch2_R gatagagtcactgagctctcg 10
Hey1_F agaaggctggtacccagtgcctt 11
Hey1_R caaactccgatagtccatagcca 12
Sox9_F gagccggatctgaagaagga 13
Sox9_R gcttgacgtgtggcttgttc 14
Hes1_F ccagccagtgtcaacacga 15
Hes1_R aatgccgggagctatctttct 16
Hnf4a_F cacgcggaggtcaagctac 17
Hnf4a_R cccagagatgggagaggtgat 18
Cyp7a1_F agcaactaaacaacctgccagtacta 19
Cyp7a1_R gtccggatattcaaggatgca 20
Albumin_F cgagaagcttggagaatatgg 21
Albumin_R gtcagagcagagaagcatgg 22
Cebpa_F gaacagcaacgagtaccgggta 23
Cebpa_R cccatggccttgaccaaggag 24
Ankrd1_F cgactcttgatgaccttcgg 25
Ankrd1_R attgctttggttccactctg 26
Cyr61_F cccccggctggtgaaagt 27
Cyr61_R gcggttcggtgccaaaga 28
Ctgf_F gggcctcttctgcgatttc 29
Ctgf_R atccaggcaagtgcattggta 30
TGF-beta2_F tggagttcagacactcaacaca 31
TGF-beta2_R aagcttcgggatttatggtgt 32
Vimentin_F cggctgcgagagaaattgc 33
Vimentin_R ccactttccgttcaaggtcaag 34
β-actin_F gaaatcgtgcgtgacatcaaag 35
β-actin_R tgtagtttcatggatgccacag 36
CollagenI_F gctcctcttaggggccact 37
CollagenI_R ccacgtctcaccattgggg 38
< 참고예 6> 마이크로어레이 및 RNA 서열 분석
간과 세포주에서 RNeasy Mini Kit (Qiagen)를 사용하여 전체 mRNA를 분리했다. 마이크로어레이 분석은 MouseRef-8 v2.0 chip (Illumina)를 사용하여 수행하였고, RNA 서열 분석은 Truseq RNA library prep kit v2 (Illumina) 및 Hi-seq 2000 장비 (Illumina)를 사용하여 수행하였다. 마이크로어레이 및 RNA 서열 분석에서 얻은 모든 유전자 발현 수치는 log2값으로 변환하여 추가적으로 분석하였다.
Heat map을 그리기 위해서 Multi-experiment Viewer (MeV) 프로그램을 사용하였다. 각각의 Heat map을 생성하기 위해서 사용한 상대적 발현 프로파일 (Relative expression profile)은 하기 표 4 및 표 5 나타나 있다. p<0.05의 유의성 있는 마이크로어레이 데이터에 대하여 분석을 수행하였다.
RNA 서열분석을 위해서 v5.0의 Molecular Signature Database (http://www.broadinstitute.org/gsea/msigdb/index.jsp)를 사용하여 유전자 세트 농축 분석 (Gene set enrichment analysis, GSEA)를 수행하였고, 0.025 미만의 FDR q-value gene set들만을 데이터에 표시했다. Raw 데이터는 accession code GSE71872, GSE71873 및 GSE71874를 사용하여 GEO에서 확인 가능하다.
< 참고예 7> 면역블롯 분석
전체 간 및 세포 주들은 protease 및 phosphatase 저해제 (1 mM NaF, 1 mM Na3OV4, PMSF, 2 ug/mL leupeptin 및 pepstatin; 모두 Sigma에서 구입)를 포함하는 RIPA buffer (50 mM Tris-Cl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.1% (w/v) SDS, 0.5% (w/v) sodium deoxycholate, 1 mM EDTA)를 4℃에서 30분간 배양하여 용해했다. 각각의 용해물의 단백질 농도는 Pierce BCA protein assay kit (Thermo Scientific)를 사용하여 정량화했다. 블롯들은 항-Lats1 (Bethyl Laboratories, 1:2,000), 항-Lats2 (Cell Signaling, 1:1,000), 항-pYap (Cell Signaling (S127), 1:1,000), 항-Yap (Cell Signaling, 1:1,000), 항-Taz (Cell Signaling, 1:1,000), 항-Ctgf (Santa Cruz, 1:500), 항-β-actin (Sigma, 1:5,000), 항-pChk2 (Cell Signaling, 1:500), 항-pCdc2 (Cell Signaling, 1:500) 및 항-p21 (BD Bioscience, 1:500)과 배양하였다.
< 참고예 8> 통계적 분석
GraphPad Prism 5 소프트웨어를 사용하여 그래프 분석 및 통계적 분석 (paired two-tailed Student's t test)을 수행하였다.
< 실시예 1> Lats1 /2 - 이중 녹아웃된 간모세포를 EBC로 분화
( 1)간 특이적 Lats1 /2 녹아웃 마우스에서 유전자 발현 분석
Hippo 경로 (pathway)에서 Lats1/2 kinase는 Yap 및 Taz를 직접적으로 인산화하고 그 활성을 저해한다. 간 세포의 특징화 (liver cell specification)에서 Lats1/2의 역할을 확인하기 위해서, 종래에 알려진 방법인 Albumin-Cre 마우스 시스템 (Lats1-/-; Lats2fl /fl; Alb-cre; 이후 L1L2_Alb로 표시함)을 이용하여 참고예 1과 같은 방법으로 간 특이적 Lats1/2 녹아웃 마우스를 제작하였다. 상기 대조군 마우스는 녹아웃 시키지 않은 cre가 없는 정상마우스이다.
도 1a에 나타난 것과 같이 참고예 3과 같은 방법으로 대조군 (control) 및 L1L2_Alb 마우스의 E14.5 시기 간에서 간모세포를 분리하여 이를 배양하고, 이들을 생체 외에서 간 담도세포 (Biliary epithelial cells, BECs) 또는 간세포 (Hepatocytes)로 분화시켰다. 상기 얻어진 간모세포를 iHB로, In vitro BEC를 iBEC로, In vitro 분화 간세포를 iHP로 명명하였다.
( 2)간 특이적 Lats1 /2 녹아웃 마우스의 간모세포에서 분화된 간내 담관세포 (L1L2_Alb_iBEC)
참고예 3의 간내 담관세포로 분화시키는 방법을 사용하여 대조군 및 L1L2_Alb 간모세포(iHB)를 생체 외 분화 간내 담관세포로 분화시킨 후(iBEC), bright field 현미경(Inverted microscope, IX71, Olympus)을 사용하여 관찰하여 도 1b의 왼쪽에 나타난 것과 같이, Lats1/2 이중 녹아웃된 L1L2_Alb 간모세포에서 더욱 큰 간내 담관세포 콜로니 (BEC colonies)가 생성되었음을 확인하였다.
참고예 5에 나타난 방법을 사용하여, Lats1/2 이중 녹아웃된 L1L2_Alb 간모세포에 분화된 간내 담관세포 콜로니의 qRT-PCR을 수행하여 mRNA의 발현양을 분석하였으며 그 결과를 도 1b의 오른쪽 그래프로 나타냈다. 도 1b의 오른쪽 그래프에서 확인할 수 있는 것과 같이, qRT-PCR을 수행한 결과 L1L2_Alb 간모세포에서 분화한 간내 담관세포 콜로니에는 대조군(CON_iBEC)에 비해 간내 담관세포 마커인 cytokeratin 7 및 19의 mRNA의 양이 더 많음을 확인했다.
( 3)간 특이적 Lats1 /2 녹아웃 마우스의 간모세포에서 분화된 간세포(L1L2_Alb_iHP)
참고예 3의 간세포로 분화시키는 방법을 사용하여 (Oncostatin M을 처리) 대조군 및 L1L2_Alb 간모세포를 생체 외 분화 간세포로 분화시킨 후, 참고예 2와 같은 방법으로 면역형광 염색을 수행하여 간세포 특징화를 위해 핵심적인 역할을 하는 전사 인자로 알려진 Hnf4α의 발현 수준의 변화를 확인해 보았다.
도 1c의 왼쪽에 나타난 것과 같이, 대조군 간세포에서는 Hnf4α가 정상적으로 발현되어 있었지만, L1L2_Alb에서 분화가 유도된 간세포 (L1L2_Alb_iHP)에서는 Hnf4α의 발현이 대조군에 비해서 상당히 낮았다.
참고예 5에 나타난 방법을 이용한 qRT-PCR을 수행하여, L1L2_Alb에서 분화가 유도된 간세포 (L1L2_Alb_iHP)에서는 유전자 발현양을 분석하였으며 그 결과를 도 1c의 오른쪽 그래프에 나타냈다.
도 1c의 오른쪽 그래프에 나타난 것과 같이, Hnf4α의 전사 목적 유전자이며 성숙한 간세포의 마커인 Cyp7a1, 및 간세포 관련된 많은 다른 유전자들의 발현 수준도 대조군 간세포 (CON_iHP)에 비해서 L1L2_Alb 간세포 (L1L2_Alb_iHP)에서 상당히 감소되어 있음을 확인했다. 이러한 결과를 통해서, Lat1/2가 이중 녹아웃된 간모세포는 정상적으로 간세포로 분화하지 못함을 알 수 있었다.
(4) 간 특이적 Lats1 /2 녹아웃 마우스의 간모세포에서 분화된 세포에서, Lats1/2-Yap/Taz의 하위 신호 인자 확인
간모세포 계통 (Lineage)을 간세포 및 간내 담관세포로 특징화하는 경로에서 작용하는 Lats1/2-Yap/Taz의 하위 신호 인자에 대해 확인하기 위해서, 참고예 6과 같은 방법으로, 생체 외 배양 간모세포 (iHB), 생체 외 분화 간내 담관세포 (iBEC), 및 생체 외 분화 간세포 (iHP)에 대하여 RNA 서열결정 분석 및 유전자 세트 농축 분석 (gene set enrichment analysis, GSEA)을 수행하고 그 결과를 하기 표 3 및 표 4에 나타냈다.
하기 표에 나타낸 바와 같이, L1L2_Alb 간내 담관세포 (L1L2_Alb_iBEC) 및 L1L2_Alb 간세포 (L1L2_Alb_iHP) 에서 Yap의 전사 목적 유전자가 증가함과 동시에 몇 개의 다른 신호 경로에서 작용하는 인자가 증가한 것을 확인했다.
Figure 112017053026121-pat00001
Figure 112017053026121-pat00002
(5) Lats1 / 2이 이중 녹아웃된 간세포에서 Notch 신호의 변화를 관찰
Jagged1-Notch-Sox9 신호는 간 발달과정 동안 간모세포가 간내 담관세포로 분화하는 것 및 간세포의 탈분화 (de-differentiation)를 촉발한다고 알려져 있다. 또한, 간에서 Notch 또는 Jagged1의 기능 장애를 촉발하는 돌연변이는 Yap이 결실된 경우에서 나타나는 것과 유사하게 담관의 부재를 일으킴이 알려져 있다. 이를 바탕으로, 성체 간세포 탈분화 과정에서 Notch 신호가 Yap의 전사 목적물이라 가정하고 이를 확인해보았다. Yap을 저해하는 상위 인자인 Lats1/2이 이중 녹아웃된 세포에서 참고예 6과 같은 방법으로 유전자 세트 농축 분석을 수행하여 Notch 신호의 변화를 관찰하였다.
상기 표 2에서 보는 바와 같이, Lats1/2이 이중 녹아웃된 세포에서 Lats1/2가 세포에서 Notch 신호는 큰 변화가 없었지만, 참고예 3의 방법으로 L1L2_Alb 간에서 분화시켜 제작한 생체 외 간내 담관세포(iBEC)에서 Notch1을 활성화시킨 경우 일반적으로 하향-조절되는 유전자들이 상향-조절되는 것 (Notch1 targets down)을 관찰했다.
이러한 결과를 종합하여, Lats1/2 kinase가 없는 경우 Notch와 구별되는 다른 신호 경로에 의해서 간모세포에서 BEC로의 분화가 조절될 것이라고 예상할 수 있었다.
<실시예 2> Lats1/2 이중 녹아웃된 간과 N1ICD Tg 간의 차이점 분석
(1) L1L2_Alb 간의 배아 발달 과정의 면역학적 분석
In vivo상의 간 발달 과정에서 Lats1/2의 역할을 확인하기 위해서, 대조군 및 L1L2_Alb 간의 배아 발달 과정 (E)을 분석하였다. 참고예 2와 같은 방법을 사용하여 E16.5 (Embryonic day), E17.5, 및 P1 (Postnatal day)의 배아 간에 대하여 면역 조직학적 분석을 수행하여 그 결과를 도 2a에 나타냈다.
도 2a에서 나타난 것과 같이, L1L2_Alb 간은 담관판 (ductal plate)이 형성되고 담관판 세포 (ductal cell)가 빠르게 분열할 때인 E16.5에서 비정상적인 다층의 담관판을 확인할 수 있었다. 담관판세포를 검출하기 위해서 pan-CK 항체 및 CK19 항체를 사용하였는데, pan-CK 항체는 모든 종류의 Cytokeratin을 검출할 수 있고 CK19 항체는 Cytokeratin 19를 특이적이게 검출할 수 있다. 상기의 담관판 확장은 발달 시간 (developmental time)이 경과함과 동시에 Lats1/2 수준이 보다 감소함에 따라서 더욱 명확하게 나타났다. 출생 후 시기인 P1에서, L1L2_Alb 간은 기능적으로 성숙한 간세포가 사라지고, 미성숙한 간내 담관세포 및 섬유아세포 (fibroblasts)가 증가 (도 2a의 왼쪽 칼럼)함을 확인할 수 있었다.
도 2e에서 확인할 수 있는 것과 같이, 간세포로 분화가 결정된 것이 아닌 간내 담관세포로 분화가 결정된 경우에서만 세포의 증식률이 높음을 관찰할 수 있었다.
L1L2_Alb 마우스 간의 크기는 대조군 간의 것과 유사했지만, L1L2_Ab 마우스는 미성숙한 간내 담관세포의 증가 및 기능적인 간세포의 감소로 인해 젖을 떼기 전에 죽었다. 이러한 결과는 대조군에 비하여 L1L2_Alb 마우스가 일찍 죽어서 돌연변이 간이 충분한 성장을 할 수 없기 때문이라고 설명될 수 있다.
간 조직 특이적으로 과발현하는 Notch1 세포내 도메인 유전자가 삽입된 마우스 (N1ICD_Alb)의 간은 대조군에 비하여 더 많은 간내의 담관을 가지고, 종국적으로 쓸개관암종 (cholangiocarcinomas)으로 발달하였다. 반면, 도 2a의 하단의 P1에서 볼 수 있는 바와 같이, L1L2_Alb 간은 기능적인 간 세포를 거의 가지고 있지 않고, 형태 형성 (morphogenesis)이 완성되지 않은 미성숙한 간내 담관세포로 대부분 구성되어 있다. 또한, L1L2_Alb 간의 미성숙한 간내 담관세포는 N1ICD 간에서 발견되는 간내 담관세포에 비해서 CK19 (cytokeratin 19) 양성 신호가 더 많이 검출되었다.
(2) L1L2 _ Alb 및 N1ICD Tg _ Alb에서 유전자 발현 분석
L1L2_Alb에 대하여 참고예 6에서 기재된 것과 같이 마이크로어레이 분석을 수행하였다. 참고예 5에 기재된 것과 같이 qRT-PCR을 수행하여, 그 결과를 도 2c 및 도 2d에 나타냈다.
도 2c 및 도 2d에서 볼 수 있는 것과 같이, L1L2_Alb 간에서 간내 담관세포의 특징적인 유전자의 mRNA가 증가 (Krt7 및 Krt19)하고 간세포의 특징적인 유전자의 mRNA가 감소 (Hnf4α, Cyp7a1 및 Cebpα)함을 확인했다. 이러한 특징적인 유전자 발현의 변화는 N1ICD Tg_Alb 간에 비해서 L1L2_Alb 간에서 더 현저했다.
N1ICD 과발현은 담관 형태 형성과 연관된 유전자 (Sox9, Hnf1b, 및 Hnf6)를 높게 발현시키는 것을 관찰할 수 있었지만, 반면에 L1L2_Alb 간에서는 그러한 결과를 확인하지 못했다. 따라서, Lats1/2의 감소와 비교해 보면, Notch 신호의 활성화는 Lats1/2의 감소의 경우와 다르게 배아 간 기능의 완만한 감소를 유도한 것으로 보인다.
( 3)Notch와 Hippo 경로 사이의 유전적 관계 조사
Notch와 Hippo 경로 사이의 유전적 관계를 추가적으로 조사하기 위해서, 참고예 1과 같은 방법으로 Lats1-/-; Lats2fl/fl; RbpJfl/fl; Alb-cre (L1L2RbpJ_Alb) 마우스 및 N1ICD Tg; Yapfl /fl; Alb-cre (N1ICD Tg; Yap_Alb) 마우스를 제작하였다. Notch 신호의 하위 작용기인 RbpJ (Recombination signal Binding Protein for immunoglobulin kappa J region)가 결실된 간은 Notch1/2 활성화의 완전한 부재 및 담관 형태 형성 (bile duct morphogenesis)의 결함을 나타내는 것으로 알려져 있다.
상기의 기재된 것과 동일한 방법으로 L1L2RbpJ_Alb 간에 대하여 조직학적 분석, 마이크로어레이, 및 qRT-PCR을 수행한 결과, 도 2b 에서 볼 수 있는 바와 같이, L1L2_Alb 간에 비교하면 비록 미미한 간내 담관세포의 감소 및 간세포의 증가가 있었지만, 여전히 L1L2RbpJ_Alb 간은 미성숙한 간내 담관세포의 상당한 확장을 관찰할 수 있었다. 또한, N1ICD 과발현하는 마우스에서 Yap 유전자를 결실시킨 경우 Sox9 발현의 변화는 없었지만, cytokeratin 발현은 상당히 감소했다. 상기 데이터에 기초하여, Notch 신호전달 회로가 Hippo-Yap/Taz 경로의 하위 단계에 있지 않고 서로 보완적으로 작용함을 알 수 있었다.
즉, Notch-Sox9 신호 및 Hippo-Yap/Taz 신호 모두는 간 발달 동안 계통 특징화 (lineage specification)를 위해 중요한 역할을 한다.
< 실시예 3> Yap/ Taz 활성에 의한 간내 담관세포 증식의 조절
(1) Yap의 세포 내 위치 및 인산화 (S127) 정도 분석
Lats1/2는 직접적으로 Yap/Taz를 인산화하고 그들의 활성을 저해하는 것은 알려져 있으므로, Yap의 세포 내 위치 및 인산화 (S127) 정도를 면역조직화학적 분석 및 면역블롯을 통해 살펴보았다.
참고예 2와 같은 방법으로 면역조직화학적 분석을 수행하여, 도 3a에서 볼 수 있는 바와 같이, E16.5에서 얻은 대조군 배아 간에서 Yap은 담판 (출산 후 간 내의 담관을 생성함)으로 구성된 세포의 핵에 위치하였으나, 인산화된 Yap (S127)은 담판 세포의 세포질에 위치하였고 이것은 간에 존재하는 모든 세포의 세포질에서 드문드문 존재하였다.
반면, 참고예 7과 같은 방법으로 면역블롯을 수행하여, 도 3a 및 도 3b에서 확인할 수 있는 바와 같이, L1L2_Alb 간의 핵에서 활성이 있는 Yap/Taz의 수준은 상당히 증가하였지만, Yap의 인산화된 수준은 감소함을 확인했다.
(2) L1L2 _ Alb 간의 유전자 발현 분석
도 3c의 참고예 5와 같은 방법을 사용한 qRT-PCR을 수행한 결과에서와 같이, L1L2_Alb 간은 Ankrd1, Ctgf, 및 Cry61를 포함하는 Yap의 전사 목표 유전자 (Transcriptional target gene) 발현이 증가했음을 확인 할 수 있었다.
L1L2_Alb 간은 담관판 (ductal plate)이 형성되고 담관판세포 (ductal plate cell)가 빠르게 분열할 때인 E16.5에서 비정상적인 다층의 담관판을 확인할 수 있었던 실시예 2의 결과를 바탕으로, Yap, Taz, 또는 이들 모두가 L1L2_Alb 간에서 관찰되는 담관판세포 확장에 필수적 기능을 하는지 여부를 확인하였다.
참고예 2와 같은 방법을 사용해서, 조직학적 및 면역조직화학적 분석을 수행하여 도 3d에서 확인할 수 있는 바와 같이 Yap/Taz 이중-녹아웃 마우스에서 담관이 더욱 감소함을 확인했다. 이러한 결과를 바탕으로, Yap/Taz 모두가 담관판세포 증식 및 담관 형성에 필수적 역할을 함을 알 수 있었다. 도 3d에서 볼 수 있는 것과 같이 Yap 또는 Taz를 발현하고 있는 마우스 (Lats1-/-; Lats2fl /fl; Yapfl /fl; Taz+l/+; Alb-Cre 또는 Lats1-/-; Lats2fl /fl; Yap+/+; Tazfl /fl; Alb-Cre)는 부분적으로 회복된 표현형을 나타냈으나 여전히 간 발달이 비정상적이고, 출생 후 1달 이내에 죽는 것을 확인할 수 있었다. 도 3d의 오른쪽 끝에서 볼 수 있는 바와 같이, Yap/Taz 유전자 모두를 결실한 경우에만 담관이 부족해지고, L1L2_Alb 표현형인 담관판세포 확장이 Lats1/2를 제거하지 않았던 경우와 같이 회복됨을 확인할 수 있었다.
상기의 결과들을 종합하면, Yap 및 Taz 모두가 담관판 형성 및 그 세포 증식에 필수적 기능을 하고, 배아 간에서 Lats1/2를 제거한 경우 Yap/Taz가 과활성 (hyper-activation)을 갖게 되어 담관판세포 증식을 향상시키는 기능을 하는 것을 알 수 있었다.
(3) In vitro Yap 과발현 변이와 간 분화
In vitro 배양 시스템에서 Yap을 과발현(over-expression)한 경우 Lats1/2 이중 녹아웃된 경우의 표현형과 동일한 결과를 나타내는지 확인하기 위해서, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로, 참고예 3의 방법으로 생체 외 분화 간세포(iHP)에 대하여, Yap WT, YAP 2SA 또는 YAP 5SA를 과발현시키고 참고예 5과 같은 방법으로 qRT-PCR을 수행하여 mRNA 발현 수준을 분석하였다. 도3e 및 도 3f에서 확인 할 수 있는 바와 같이, Yap 활성에 의해서 간내 담관세포 및 간세포의 분화 정도가 조절 (각각 향상 및 저해) 되었음을 확인할 수 있었다. 또한, YAP 활성화 정도에 비례하여 분화 정도가 달라지는 지 여부를 확인하기 위하여 Lats1/2에 의하여 인산화 되는 아미노산을 다섯 개 서열을 모두 인산화되지 못하도록 바꾼 YAP 5SA, 두 개의 서열을 바꾼 YAP 2SA, 서열을 바꾸지 않은 YAP WT을 발현하도록 만드는 바이러스를 제작하였다. 이를 분화 간세포에 주입하여 간세포로 분화시켰고 그 결과 도 3e에서 보이는 것처럼 간세포의 분화가 저해됨을 확인하였다. 마찬가지의 바이러스를 간 담관 세포 분화 전에 주입하고 담관 세포로의 분화를 유도하였고 그 결과 간 담관 세포로의 분화가 증가하는 것을 확인하였다(도 3f).
(4) Mst1/2 및 Nf2 유전자 결실과 간 분화
YAP/TAZ 기능을 억제하는 Hippo 경로의 구성 요소인 Mst1/2 및 Nf2 유전자를 결실한 Mst1/2 이중 녹아웃 및 Nf2 녹아웃 마우스 간에 대하여, 참고예 2와 같은 방법으로 조직학적 및 면역형광 분석을 수행하여, 도 3g에서 나타난 것과 같이, Mst1/2 이중 녹아웃 및 Nf2 녹아웃 마우스 간에서 담즙/전구 세포의 확장을 관찰할 수 있었다.
상기의 결과들을 종합해 보면, Hippo 경로의 요소들을 결실하여 증가된 Yap의 활성에 의하여 간모세포가 우선적으로 간내 담관세포로 분화하게 되고, 그 세포의 증식도 증가하게 됨을 알 수 있었다.
< 실시예 4> Yap/ Taz 과활성화에 의한 TGF -β 신호의 상향 조절
간내 담관세포 분화를 유도하기 위해 Notch 신호를 활성화하는 Jagged1외에도, 간문맥 (Portal vein) 주위의 중간엽 세포 (Mesenchymal cells)에서 분비된 Tgf-β는 간문맥 주위에서 간모세포가 간내 담관세포로 분화하고, 이후 담관 형태 형성 동안 TGF-β 신호는 감소한다. 또한, Tgfβ가 상향 조절된 간은 미성숙 간내 담관세포가 확장되어 있다. 실시예 2의 결과를 통해 간 발달 동안에 Hippo-Yap/Taz 신호가 Notch 신호와 다른 경로의 조절을 통해 간 세포 세분적 특징화를 조절할 수 있음을 확인하였으므로, Hippo-Yap/Taz 신호가 Tgfβ 신호를 통해 간 발달을 조절하는지 여부를 본 실시예에서 확인하고자 하였다.
(1) Lats1 /2 결실 간 및 분화세포의 Tgf - β관련 유전자 발현 분석
참고예 6과 같은 방법으로, Lats1/2이 결실된 간모세포, 간내 담관세포 및 간세포에서 전체 RNA를 추출하여, 마이크로어레이 및 RNA 서열분석을 수행하여 Heat map을 작성하였다. 그 결과를 도 4a에 나타냈다. 도 4a에서 나타낸 것과 같이, Lats1/2이 결실된 간모세포, 간내 담관세포 및 간세포에서, Tgf-β에 반응하는 특정 유전자 세트가 상당히 증가해 있음을 확인할 수 있었다.
생체 외 분화 세포 및 L1L2_Alb 간에 대하여 참고예 5와 같은 방법으로 qRT-PCR을 수행하여, 도 4b에 결과를 나타냈다. 도 4b에 나타낸 바와 같이, 생체 외 분화된 세포 및 L1L2_Alb 간에서 Tgf-β2의 mRNA 발현이 상당히 증가된 것을 확인했다.
참고예 2에서와 같은 방법으로 면역형광 분석을 사용하여 Smad3의 세포내의 위치를 확인해본 결과, 도 4c에서 볼 수 있는 바와 같이, Smad3가 확장된 간내 담관세포의 핵에 위치함을 확인할 수 있었고, 이를 통해 Tgf-β 신호가 L1L2_Alb 간에서 활성화되었음을 알 수 있었다.
2) Yap에 의한 Tgf - β2의 직접적 전사 조절
Yap이 직접적으로 Tgfβ2의 전사를 조절하는지 여부를 확인하기 위해서, Tgfβ2 유전자 자리 (locus)에서 Yap-TEAD 복합체가 인식하는 Tead-결합 서열을 크로마토 면역침강 분석을 수행하여 찾았다. TEAD는 Ypa또는 Taz와 결합하여 핵 내에서 목적 유전자의 프로모터 또는 인핸서 에 결합하여 목적 유전자의 전사를 증가시키거나 혹은 감소시킬 수 있다고 알려져 있다.
크로마토 면역침강 분석은 다음과 같이 수행되었다. 세포들은 1% 포름알데히드로 상온에서 15분간 배양하여 크로스링크하고 125 mM glycine을 5분간 처리하여 중화했다. 그 후에 세포들을 수집하여 세포질 부분을 제거하고 핵 부분은 50 mM Tris-Cl, pH 7.5, 1% (w/v) SDS, 0.5% (w/v) deoxycholate 및 1 mM MgCl2를 포함하는 버퍼로 재부유하였다.
혼합물은 Bioruptor를 사용하여 20분간 초음파를 처리 (30초의 초음파 및 30초의 휴지기를 1주기로 함)하고, 그리고 나서 원심분리하였다. 각 용해물의 DNA 농도는 분광광도계 (spectrometer)를 사용하여 측정하였고, 50 ug의 용해물은 50 mM Tris-Cl, pH7.5, 0.5% (v/v) Triton X-100 버퍼를 사용하여 희석하고 Protein A/G agarose beads (GenDEPOT)를 사용하여 사전배양 (precleared)하였다.
면역침강을 위해서, 항-Chd4 (Abcam), 항-FLAG (Sigma), 항-Yap (논문 참조 Nat. Commun. 6:10186 doi: 10.1038/ncomms10186 (2015)에 기재된 방법대로 제조함) 및 IgG (Santa Cruz) 항체를 용해물과 4℃에서 밤새 배양하였다. 그리고 나서, protein A/G beads를 첨가하고 유전체 DNA를 Cell Signaling의 제조사 프로토콜에 따라서 희석하고 정제하였다. 하기 프라이머를 이용하여 CFX Connect (BioRad) 및 2X SYBR green premix (Enzynomics)로 정량적(quantitative) PCR을 수행하였다.
명명 서열(5' → 3') 서열번호
TGF-beta2_R1_F gagatttggaggagcagggctg 39
TGF-beta2_R1_R cggcgactttcccatgacttc 40
TGF-beta2_R2_F tgctggcctaatgaagtggaa 41
TGF-beta2_R2_R ggtcctgagttcaagtcccag 42
TGF-beta2_R3_F tgaaacctcaagtccacccccc 43
TGF-beta2_R3_R gctctaaacaccacagccctc 44
Hnf4α_R1_F accctgtgctgccagtttctc 45
Hnf4α_R1_R cctggtcccaaggttatcctt 46
Hnf4α_R2_F aaggctgaggcaggagtgtca 47
Hnf4α_R2_R ctcacccccaaaccatcattt 48
Hnf4α_R3_F ggccctatcttcgggcccctg 49
Hnf4α_R3_R gtgcctcctgtcacaatcact 50
Pou5f1_F ggcagacggcagatgcataac 51
Pou5f1_R ctcaatagcagattaaggaagggc 52
Ctgf_F caatccggtgtgagttgatg 53
Ctgf_R ggcgctggcttttatacg 54
크로마틴 면역침강 분석 결과, 도 4d에서 볼 수 있는 바와 같이, Yap이 Tgf-β2 유전자 자리 (Tgfβ2 인핸서 부위) (+9.2 kb)에 결합함을 확인할 수 있었다.
(3) Yap 5SA 과발현 간모세포에 TGF -beta 수용체 저해제 처리
참고예 3의 방법으로 제작한 Yap의 구성적(constitutive) 활성화 형태 돌연변이 Yap 5SA 과발현 간모세포에 TGF-beta 수용체 저해제인 SB431542를 50 uM 처리하고 참고예 5와 같은 방법을 사용하여 qRT-PCR을 수행하여, 도 4e 및 도 4f에 나타냈다.
도 4e에서 볼 수 있는 바와 같이, TGF-beta 수용체 저해제를 처리한 경우 Yap 5SA 과발현 간모세포가 간내 담관세포로의 분화가 저해되고, 도 4f에서 볼 수 있는 바와 같이, Yap 5SA 과발현 간세포에서 감소한 간세포 마커인 Hnf4 및 Cyp7a1의 mRNA 발현 수준이 Tgfβ 수용체 저해제인 SB431542의 처리에 의해서 회복되는 것(즉, 증가함)을 확인 할 수 있었다.
YAP 활성화는 Tgf-β2 를 직접적으로 전사 촉진함으로써 Tgf-β 신호를 활성화시킨다. 이로써 간모세포가 간 담관 상피세로 분화 및 증식을 돕는다. YAP의 과활성화는 무분별한 담관 형성을 유발할 수 있으며, 이때 Tgf-β 신호를 억제하면 담관 형성 결함이 개선됨을 알 수 있었다.
< 실시예 5> Lats1 /2 결실에 의한 간세포로부터 BEC로 전환의 촉진
Hippo 요소 녹아웃 및 Yap 과발현된 다른 마우스 모델에서 확인된 것과 같이, 간 발달 후에 Lats1/2 유전자를 결실한 경우에도 성체 간에서 Tgfβ2 분비를 향상시켜서 미성숙 간내 담관세포의 확장, 간세포가 담즙/전구 세포 및/또는 간 종양 발달로의 탈분화 (de-differentiation)를 야기 할 수 있는지 여부를 확인했다.
(1) L1L2 _ Adeno 마우스 및 L1L2 _ AAV 마우스 제조
구체적으로, 참고예 1과 같은 방법으로 참고예 1과 같은 방법으로 Lats1-/-;Lats2fl/fl 마우스를 제작하고, Adeno-Cre 또는 AAV-TBG-Cre 바이러스를 주입하여, 성체 간에서 Lats1/2 유전자를 급성 결실 (acute deletion)시켜, L1L2_Adeno 마우스 및 L1L2_AAV 마우스를 제작하였다. 구체적으로, 특이적이게 간세포를 감염시키기 위해서 AAV-TBG-Cre 바이러스 (마우스 당 1011 PFU 또는 5 X 1011 gcp (gene copy number))를 사용하였다.
(2) L1L2_AAV 마우스의 분석
과도한 양의 미성숙 간내 담관세포가 잔존하는 담관 세포에서 유래했는지 또는 간세포에서 탈분화가 일어났는지를 여부를 확인하기 위해서 하기와 같은 실험을 수행하였으며, 그 실험결과를 도 5f에 나타냈다.
구체적으로, 특이적이게 간세포를 감염시키기 위해서 AAV-TBG-Cre 바이러스 (마우스 당 1011 PFU 또는 5 X 1011 gcp (gene copy number))를 사용하였다. 한편, 상기 L1L2_AAV 마우스는 간 부전 (hepatic failure)으로 인해 2주 이내에 병에 걸린다 (도 5f의 상단 왼쪽 그래프).
참고예 2와 같은 방법으로 조직학적 및 면역조직학적 분석을 수행한 결과, 도 5f에서 볼 수 있는 바와 같이 L1L2_Adeno 간에서와 마찬가지로 L1L2_AAV 간은 CK19-양성 간내 담관세포가 풍부했지만, 간세포는 거의 존재하지 않음을 확인할 수 있었다(도 5f의 b 내지 d 사진 참조).
또한, L1L2_AAV 간에서 유래한 간세포 및 비-유조직 (non-parenchymal) 세포 부분에서 유전체 DNA를 분리하여 하기 표 6에 기재된 세가지 프라이머를 이용하여 공지된 방법으로 재조합 PCR (recombination PCR)을 수행하여, Lats1/2가 결실된 밴드 세기와 Lats1/2가 결실되지 않은 밴드 세기를 측정하였다. 도 5f에서 볼 수 있는 바와 같이, 대략 60%의 미성숙 간내 담관세포는 Lats1/2가 결실된 간세포에서 역분화되어 유래되었음을 확인할 수 있었다(도 5f의 e의 밴드 사진 참조).
명명 서열(5' → 3') 서열번호
Forward CCGGAGTCATTGCTTGTTTT 55
Reverse GGAGATCCTGGGTACTGCAC 56
del Forward ACATGACACTACGGGGCCTAGC 57
따라서, 대부분의 미성숙 간내 담관세포는 Lats1/2가 결실된 간세포가 탈분화(역분화)하여 발생한 것이며, 비자율적인 세포 분비인자에 의한 간내 섬유아세포 및 면역세포 증식이 함께 동반되어 간섬유증이 일어남을 알 수 있었다.
(3) L1L2 _ Adeno 마우스의 조직학적 분석
도 5a 및 도 5b에서 나타난 것과 같이, L1L2_Adeno 마우스는 복부 팽만 (abdominal distension), 간 비대 (hepatomegaly) 및 간 부전(liver failure)에 의한 종국적 치사 (lethality)를 나타냈다.
참고예 2와 같은 방법으로 조직학적 분석을 수행하여, 도 5c 및 도 5d에서 나타난 것과 같이, L1L2_adeno 간에서 pan-CK 양성 세포를 통해 담관세포 증가를 확인하고, Sirius red-Fast green 염색에서 Sirius red 양성을 통해서 collagen 축적을 보였고 이를 통하여 비-간세포의 증가와 함께 간섬유증 (liver fibrosis)를 확인하였다. Adeno-Cre 바이러스 감염 후 2~3주 이내에 미성숙 간내 담관세포, 섬유아세포 및 면역세포를 포함하는 비-간세포가 확장함으로써 간섬유증이 발생함을 알 수 있었다.
(4) L1L2 _ Adeno 마우스를 이용한 성체 간에서 Lats1 /2 결실 세포의 증식의 변화
성체 간에서 Lats1/2를 결실했을 때, 세포의 증식의 변화를 살펴보기 위해서, BrdU 결합 검정을 수행하였다.
구체적으로 in vivo BrdU 결합 검정을 위해서, 마우스를 희생하기 1시간 전에 복강내로 100 mg/kg BrdU (Sigma)를 주입하여 제조사가 제공하는 프로토콜에 따라서 실험을 수행하였다.
도 5e 첫 번째 그래프에서 볼 수 있는 바와 같이, L1L2_Adeno 간에서 pan-CK-양성 세포의 증식은 활발했지만, Hnf4α를 발현하는 간세포는 증식이 활발하지 않았다. 이러한 표현형은 L1L2_Alb의 표현형과 상당히 유사했으나, 다른 Hippo 경로 구성의 녹아웃 간의 경우와는 차이가 있었다.
( 5)L1L2 _ Adeno 마우스를 이용한 탈분화 과정에서 Notch 신호 관여 확인
상기와 같은 탈분화 과정에서 Notch 신호가 어떻게 관여하는지 확인하기 위해서, 참고예 1과 같은 방법으로 Lats1-/-; Lats2fl/fl; Notch2fl/fl 마우스를 제작하고 이들에 대해 AAV-TBG-Cre 바이러스를 주입했다.
참고예 2와 같은 방법으로 조직학적 및 면역형광 분석을 수행하여 도 5d에서 나타난 바와 같이 제작한 상기 L1L2N2_AAV 마우스는 간내 담관세포의 확장을 포함하여 L1L2_AAV 마우스와 비슷한 표현형을 나타냄을 확인할 수 있었다. 이러한 결과를 통해, 최소한 Notch2는 상기의 탈분화 과정에 관여하지 않는다는 것을 알 수 있었다. 상기 실험결과는 Yap 과발현에 의해서 마우스의 간세포가 담증/전구 세포로 탈분화할 수 있다는 사실과 일치하고, 성체 간에서 Lats kinase가 직접적으로 Yap/Taz를 저해함으로써 미성숙 간내 담관세포 증식을 제한하고 성숙한 간세포를 미성숙 간내 담관세포로 전환하는 것을 저해함을 나타낸다.
그러나, 참고예 2에서 사용한 방법과 동일하게 조직학적 및 면역형광 분석을 한 결과, 도 2a, 도 5c 및 도 5d에서 볼 수 있는 것처럼, L1L2_Alb 및 L1L2_Adeno 간은 상당히 많이 간내 담관세포로 분화하였으나, 담관은 많이 형성되지 않았다.
참고예 2와 같은 방법을 사용하여 면역형광 분석을 수행하여, 도 5d에서 볼 수 있는 바와 같이, Smad3가 L1L2_Adeno 간 세포의 핵에 위치함을 확인하였고, 참고예 5과 같은 방법으로 L1L2_Adeno 간 샘플에 대하여 qRT-PCR을 수행하여 도 5e에서 볼 수 있는 바와 같이, TGFβ2 및 그것의 섬유 형성 관련된 목표 유전자의 mRNA 발현 수준이 L1L2_Adeno 간에서 상당히 증가하였음을 확인했다.
또한, 도 5e에서 볼 수 있는 바와 같이 참고예 5과 같은 방법으로 L1L2_Adeno 간 샘플에 대하여 qRT-PCR을 수행하여 L1L2_Adeno 간은 간내 담관세포 마커인 cytokeratin 7 및 19의 mRNA 발현이 높았지만, Hnf6 및 Hnf1β (담관 형성과정에 작용하는 두 개의 핵심 분자)의 mRNA의 발현은 감소했음을 확인했고, 이러한 결과는 도 2d에서와 나타난 것과 같이 L1L2_Alb 간에서 qRT-PCR을 수행하여 나온 결과와 경향이 유사했다.
이러한 결과들은 Yap/Taz에 의한 L1L2_Adeno 간에서의 Tgfβ 신호의 상향 조절 (up-regulation)이 섬유 세포 (fibrocytes)의 모집 (recruitment) 및 증식을 향상시키고 콜라겐-섬유 생산을 촉진하여 섬유형성을 유도할 수 있음을 나타낸다. 즉, Lats1/2의 손실에 의해 발생하는 Yap/Taz의 활성화가 미성숙 간내 담관세포의 확장 및 성체 간에서의 섬유형성을 유도하기 위해서 Tgfβ 신호를 상향 조절할 수 있음을 나타낸다.
<실시예 6> 간세포에서 Yap/Taz 과활성화(hyper-activation)에 의한 간 변화
TGFβ 신호를 저해하더라도 Yap 5SA 과발현 (over-expression)에 의해서 발생하는 간 분화의 저해를 완벽하게 회복 (rescue)하지 못하기 때문에, Yap/Taz이 아마도 다른 신호 경로를 통해서 간 분화를 조절할 것으로 판단할 수 있다. 비록 Lats1/2이 이중 녹아웃된 배아 및 성체 간세포는 핵에 존재하는 Yap을 가지고 있지만, 도 2e에서 확인한 바와 같이 이들은 간세포의 과증식 (hyper-proliferation)을 나타내지 않았다. 따라서, 감소된 간세포 분화가 간세포 증식의 결점 또는 분화 자체에 대한 문제로 인해서 발생한 것인지 확인이 필요하다.
(1) Lats1 /2 이중 녹아웃된 마우스의 분화 간세포에서 유전자 발현 및
Lats1/2 이중 녹아웃된 마우스의 분화 간세포에서 RNA 서열분석으로서, 상기 표 3에서 볼 수 있는 바와 같이, Lats1/2 이중 녹아웃된 간세포(iHP)에서 얻은 RNA 서열분석 데이터에서는 p53 경로가 활성화되었고 E2F 목적 유전자가 하향 조절되었다. 이는 DNA 손상이 증가 (p53)했고 세포 증식이 감소 (E2F)했음을 나타낸다(도 1c).
(2) Lats1 /2 이중 녹아웃된 또는 YAP 5SA 과발현 간세포
참고예 4의 실험 방법에 따라서, 대조군 세포, L1L2_Alb 간모세포, YAP 5SA 과발현 간모세포를 분리하여 생체 외 분화시켜 얻은 간 세포에 대해서, 면역조직화학 분석으로서, 참고예 2와 같은 방법으로 대조군과 L1L2_Adeno 간에 대하여 면역조직화학 분석을 수행하여 도 6a에 나타냈다.
도 6a에서 볼 수 있는 것과 같이, Lats1/2가 이중 녹아웃된 성체 간의 성숙한 간세포의 일부는 정상 간세포에 비해서 기이한 세포 형태 및 세포질 및 핵의 2배 이상의 확대 (소위 "큰 세포 변화"(Large cell change, LCC)라 불림)를 나타냄을 확인하였다. 또한, 상기의 간 조직의 간세포 일부 샘플을 이용하여 FACS 분석을 수행한 결과, 도 7f에서 볼 수 있는 바와 같이, 대조군 간세포에 비해서 L1L2_Adeno 간 세포가 더 높은 DNA 함량을 나타냈다. 도 6a에서와 같이, 참고예 2와 같은 방법으로 면역조직화학 및 면역형광 분석을 수행하여 동일한 간에 존재하는 상당히 빠르게 증식하는 간내 담관세포와 비교하여, 상기 확대된 간세포 (~80%가 LCC를 나타냄)에는 p21, γ-H2AX, 및 TUNEL에 대해 양성을 나타냈고, oncogenic stress에 의한 p53 활성화 및 간세포 다핵화와 노화를 유도함을 알 수 있었다.
(3) Mst1 /2 이중 녹아웃과 Lats1 /2 이중 녹아웃된 마우스
면역 블롯 분석으로서, 참고예 1과 같은 방법으로 제작한 Mst1/2 이중 녹아웃과 Lats1/2 이중 녹아웃된 마우스에서 추출한 간 샘플을 이용하여 참고예 7과 같은 방법으로 면역 블롯 분석을 수행하였다. 도 6b에서, Mst1/2 이중 녹아웃 간 세포암(HCC)과 다르게, Lats1/2이 이중 녹아웃된 간은 명확하게 p21 발현 및 Chk2 인산화 수준이 증가했다. 따라서, 이러한 결과를 통해 Lats 1/2이 이중 녹아웃된 간은 DNA 손상 및 p53 활성화가 존재함을 알 수 있다. 이와 유사한 표현형은, 발암 유전자 H-rasG12V를 발현하는 간에서 관찰된다. Mst1/2 이중 녹아웃(double knock-out) 마우스는 간세포가 증식하는 간세포암이 발생하나 Lats1/2 이중 녹아웃된 간은 간세포가 간내 담관세포로 변하거나 거대세포로 변화한다. Mst1/2 는 Lats1/2를 인산화시키는 upstream kinase로 녹아웃 되어도 Lats1/2가 정상적으로 남아있어 YAP 인산화가 어느 정도 일어난다. 반면 Lats1/2가 녹아웃이 되면 YAP 인산화가 전혀 이루어지지 않아 Mst1/2에 비하여 더 활성화된 YAP/TAZ가 존재한다.
(5) p53 유전자의 결실에 의해서 Last1 /2 이중 녹아웃된 간세포의 감소된 생존력 및 증식 능력이 회복 시험
도 6c에서 볼 수 있는 것과 같이, p53 유전자를 결실시킨 간 세포를 참고예 2와 같은 방법으로 조직학적 및 면역조직화학적 분석을 수행하여 p53 유전자의 결실에 의해서 Last1/2 이중 녹아웃된 간세포의 감소된 생존력 및 증식 능력이 회복됨을 확인했다.
또한, 도 8a 내지 도 8b에서, p53 유전자를 결실시킨 간 세포를 조직학적 및 면역조직화학적 분석을 수행하여 p53 유전자의 결실에 의해서 Last1/2 이중 녹아웃된 간세포의 감소된 생존력 및 증식 능력이 회복됨을 확인한 결과로서, 도 8a는 대조군, L1L2_Adeno, L1L2p53_Adeno 및 p53_Adeno liver에서 추출된 단백질의 웨스턴 블랏 분석 결과이고, 도 8b는 BrdU incorporation assay 결과를 나타낸다(scale bar는 100마이크로미터를 의미한다).
(6) p53 유전자의 결실된 간모세포에서 , Yap 과발현 또는 과활성화에 의한 간세포 분화 억제
도 6e에서와 같이, p53이 결실된 간모세포 (L1L2p53_Adeno 간 조직 염색 사진)는 Yap/Taz 과활성화는 여전히 간세포로의 분화를 저해하고 있음을 확인할 수 있었다.
생체 외 분화 간모세포 (iHB), 및 생체 외 분화 간세포 (iHP)에 대하여 참고예 3과 같은 방법을 사용하여 레트로바이러스를 이용하여 Yap 야생형, 또는 Yap 과활성화형 (Yap 2SA, 또는 Yap 5SA) 돌연변이를 제조하고 참고예 5와 같은 방법으로 qRT-PCR을 수행하여, 도 6e에서와 같이 Yap을 과발현하였을 때 모두 Hnf4α 가 감소하여 간세포 분화가 억제됨을 확인할 수 있었다.
< 실시예 7> Hnf4α 저해를 통한 Yap/ Taz의 간의 분화 억제
Tgfβ 신호 또는 p53 경로를 저해한다 하더라도 YAP 5SA 과발현 세포에서 간 분화의 결함이 완전히 회복되지 않았기 때문에, Yap/Taz가 아마도 다른 신호 경로를 통해서 간 분화를 조정할 것이라 예상할 수 있었다 (도 4f, 도 6d, 도 6e 참조).
Hnf1α, Hnf1β, Hnf4α, Foxa2, Hnf6 및 Nr5a2은 서로 및 다른 유전자의 발현 수준을 조절하는 간 전사 인자 네트워크 (Hepatic transcription factor network)이다. 간 발달 동안, Hnf4α가 다른 간 전사 인자 네트워크 요소를 조절하는데 가장 핵심적인 역할을 한다. 또한, 간 및 이자의 증진 인자 (enhancer) 조절 메커니즘에서 Yap은 Hnf4α 및 Foxa2와 협력 (Cooperation)하여 작용한다. 따라서, 과활성화된 Yap이 Hnf4α 및 Foxa2의 활성을 변화시켜 간 분화에 영향을 줄 수 있을 것이라고 예상했다.
(1) Lats1/2 이중 녹아웃된 마우스 간의 유전자 발현 분석
그러나, 참고예 6과 같은 방법으로 Lats1/2가 이중 녹아웃된 간모세포(iHB), 분화 된 간세포(iHP), 및 간내 담관세포(iEBC)에 대하여 RNA 서열 분석 후 GSEA 분석 결과, 도 7a에서 볼 수 있는 것과 같이 Lats1/2이 이중 녹아웃된 간세포 계통 유지에 필수적인 HNF4-alpha 및 그 타겟 유전자들이 하향 조절되어 있었다.
(2) Yap 과발현에 의한 Hnf4α 발현 분석
Aml12 세포 (ATCC)를 10% (v/v) FBS (Gibco), 2 mM glutamine, 5 ㎍ /mL insulin, 5 ㎍/mL transfferrin (Sigma), 5 ng/mL selenium (Sigma), 및 40 ng/mL dexamethasone (Sigma)을 첨가한 DMEM/F12에서 배양하고, Yap 돌연변이를 과발현하기 위해서, YAP WT-ERT2, YAP 2SA-ERT2 및 YAP 5SA ERT2 벡터 를 포함하는 레트로 바이러스를 8 ug/mL polybrene 로 감염시키고, 감염 후 48시간 후에 2 ug/mL puromycin을 처리하고 ERT2 시스템을 활성화 시키기 위해서 표시된 시간 동안 1 nM hydroxytamoxifen (Sigma)을 처리한 다음에, 참고예 5과 같은 방법으로 qRT-PCR을 수행하였다.
상기 YAP 2SA (S127A, S381A를 포함하는 YAP 아미노산 서열의 변이서열), YAP 5SA (S61A, S109A, S127A, S164A, S381A를 포함하는 YAP 아미노산 서열의 변이서열)는 Kunliang Guan LAB으로부터 분양받았으며, pMSCV-puro-ERT2에 YAP-WT, YAP 2SA, YAP 5SA를 Nat. Commun. 6:10186 doi: 10.1038/ncomms10186 (2015), Cell reports. 11(2)270:282)에 기재된 방법으로 제조하였다. YAP 5SA94A (S61A, S94A, S109A, S127A, S164A, S381A) 는 Kunliang Guan LAB으로부터 분양받았다(Nat. Commun. 6:10186 doi: 10.1038/ncomms10186 (2015))
그러나, 도 7b에서 볼 수 있는 바와 같이, 간모세포에서 Tead 결합 부위가 결실된 YAP 5SA 94A 돌연변이를 과발현시킨 경우 Hnf4α의 발현이 저해되지 않았고, 정상 간 분화가 유도되었다. 이는, Tead 단백질 (TEAD1, TEAD2, 및 TEAD4)이 Yap의 과활성화에 의해서 매개되는 Hnf4α의 발현 감소 과정에서 필수적 역할을 한다는 것을 나타낸다.
(3) Yap 녹아웃 간세포의 RNA 분석
Yap 녹아웃 간세포에 대하여 참고예 5와 같은 방법으로 qRT-PCR을 수행한 결과, 도 7c에서 볼 수 있는 바와 같이 Yap을 결실하는 경우 Hnf4α의 발현이 증가했다. 즉, Lats1/2 이중 녹아웃된 및 YAP 5SA 과발현 간모세포에서 관찰된 간 전사인자의 발현 수준의 감소 결과는 Yap이 직접적인 조절을 통해 전사 인자의 발현을 감소시킴을 나타내며, 이것이 분화능력의 손실에 의한 후속 기작으로 발생하는 것은 아니라는 것을 나타낸다.
Yap/Taz는 목적 유전자를 상향 조절하는 전사 공활성인자 (transcriptional co-activators)로 알려져있지만, 이러한 기능 이외에 이들은 저해제 복합체 (repressor complexes)와 협력하여 저해적 기능을 하기도 한다. Hnf4α 유전자 위치에 몇 개의 Tead 결합 모티프가 존재하는 것을 발견했기 때문에, Yap이 직접적으로 Hnf4α에 결합하여 그 유전자 발현을 저해할 수 있는지 여부를 확인했다. FLAG-Yap5SA를 과발현하는 간세포에 대하여 실시예 4와 같은 방법으로 크로마틴 면역침강분석을 수행하여, 도 7d에서 볼 수 있는 바와 같이 Hnf4α 유전자 위치 (TSS+0.5kb)에서 Yap이 강하게 결합함을 확인했다. 또한, 도 7g에서와 같이 양성 대조군으로 Yap과 상호작용하는 저해제 복합체 Chd4를 사용하여 상기와 동일한 Hnf4α 유전자 위치에 Chd4가 결합함을 확인했다.
도 7d은 실시예 7에 따라 FLAG- Yap 5SA를 과발현하는 간세포의 HNF4α 위치에 대한 크로마틴 면역침강 분석 결과이다 (항-FLAG 또는 항-YAP를 사용함). 도 7e는 실시예 7에 따라 FLAG- Yap 5SA를 과발현하는 간세포의 HNF4α 위치에 대한 크로마틴 면역침강 분석 결과이다 (항-CHD4를 사용함). 도 7f은 실시예 7에 따라 대조군 및 L1L2_Adeno 간에 대하여 FACS 분석을 수행한 결과를 나타낸다.
이러한 결과들을 종합하여, Yap/Taz가 간 전사 인자 네트워크를 직접적으로 저해하여 간 분화를 조절한다고 결론을 내릴 수 있었다.
<110> KOREA ADVANCED INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY <120> Use related with liver cell differentiation and liver disease using Yap/Taz <130> DPP20161903KR <160> 67 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer -forward (Krt7_F) <400> 1 gacccttcac gagacagagt t 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer -backward (Krt7_R) <400> 2 gcaatctcat tccgggtgtt g 21 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer -forward (Krt19_F) <400> 3 gggggttcag tacgcattgg 20 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer -backward (Krt19_R) <400> 4 gaggacgagg tcacgaagc 19 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer -forward (Hnf1b_F) <400> 5 gaaagcaacg ggagatcctc 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer -reverse (Hnf1b_R) <400> 6 cctccactaa ggcctccctc 20 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer - forward (Hnf6_F) <400> 7 agccctggag caaactcaag tcg 23 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer - reverse (Hnf6_R) <400> 8 tgcatgtaga gttcgacgtt ggac 24 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer - forward (Notch2_F) <400> 9 atgcaccatg acatcgttcg 20 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer - reverse (Notch2_R) <400> 10 gatagagtca ctgagctctc g 21 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer - forward (Hey1_F) <400> 11 agaaggctgg tacccagtgc ctt 23 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer - reverse (Hey1_R) <400> 12 caaactccga tagtccatag cca 23 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer - forward (Sox9_F) <400> 13 gagccggatc tgaagaagga 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer - reverse (Sox9_R) <400> 14 gcttgacgtg tggcttgttc 20 <210> 15 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer - forward (Hes1_F) <400> 15 ccagccagtg tcaacacga 19 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer - reverse (Hes1_R) <400> 16 aatgccggga gctatctttc t 21 <210> 17 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer - forward (Hnf4a_F) <400> 17 cacgcggagg tcaagctac 19 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer - reverse (Hnf4a_R) <400> 18 cccagagatg ggagaggtga t 21 <210> 19 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer - forward (Cyp7a1_F) <400> 19 agcaactaaa caacctgcca gtacta 26 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer - reverse (Cyp7a1_R) <400> 20 gtccggatat tcaaggatgc a 21 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer - forward (Albumin_F) <400> 21 cgagaagctt ggagaatatg g 21 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer - reverse (Albumin_R) <400> 22 gtcagagcag agaagcatgg 20 <210> 23 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer - forward (Cebpa_F) <400> 23 gaacagcaac gagtaccggg ta 22 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer - reverse (Cebpa_R) <400> 24 cccatggcct tgaccaagga g 21 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer - forward (Ankrd1_F) <400> 25 cgactcttga tgaccttcgg 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer - reverse (Ankrd1_R) <400> 26 attgctttgg ttccactctg 20 <210> 27 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer - forward (Cyr61_F) <400> 27 cccccggctg gtgaaagt 18 <210> 28 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer - reverse (Cyr61_R) <400> 28 gcggttcggt gccaaaga 18 <210> 29 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer - forward (Ctgf_F) <400> 29 gggcctcttc tgcgatttc 19 <210> 30 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer - reverse (Ctgf_R) <400> 30 atccaggcaa gtgcattggt a 21 <210> 31 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer - 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forward (Hnf4a_R2_F) <400> 47 aaggctgagg caggagtgtc a 21 <210> 48 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer - reverse (Hnf4a_R2_R) <400> 48 ctcaccccca aaccatcatt t 21 <210> 49 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer - forward (Hnf4a_R3_F) <400> 49 ggccctatct tcgggcccct g 21 <210> 50 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer - reverse (Hnf4a_R3_R) <400> 50 gtgcctcctg tcacaatcac t 21 <210> 51 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer - forward (Pou5f1_F) <400> 51 ggcagacggc agatgcataa c 21 <210> 52 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer - reverse (Pou5f1_R) <400> 52 ctcaatagca gattaaggaa gggc 24 <210> 53 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer - forward (Ctgf_F) <400> 53 caatccggtg tgagttgatg 20 <210> 54 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer - reverse (Ctgf_R) <400> 54 ggcgctggct tttatacg 18 <210> 55 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer - forward (amplifying a gene derived from L1L2_AAV liver) <400> 55 ccggagtcat tgcttgtttt 20 <210> 56 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer - reverse (amplifying a gene derived from L1L2_AAV liver) <400> 56 ggagatcctg ggtactgcac 20 <210> 57 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer - del forward (amplifying a gene derived from L1L2_AAV liver) <400> 57 acatgacact acggggccta gc 22 <210> 58 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer - forward (mouse Yap mRNA ) <400> 58 tactgatgca ggtactgcgg 20 <210> 59 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer - reverse (mouse Yap mRNA ) <400> 59 tcagggatct caaaggagga c 21 <210> 60 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer - forward (human YAP mRNA ) <400> 60 gaaccagaga atcagtcaga 20 <210> 61 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer - reverse (human YAP mRNA ) <400> 61 ggattgatat tccgcattgc 20 <210> 62 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer - forward (mouse Taz mRNA ) <400> 62 catggcggaa aaagatcctc c 21 <210> 63 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer - reverse (mouse Taz mRNA ) <400> 63 gtcggtcacg tcataggact g 21 <210> 64 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer - forward (human Taz mRNA ) <400> 64 gtcctacgac gtgaccgac 19 <210> 65 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer - reverse (human Taz mRNA ) <400> 65 cacgagattt ggctgggata c 21 <210> 66 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer - forward (human CTGF mRNA ) <400> 66 aggagtgggt gtgtgacga 19 <210> 67 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer - reverse (human CTGF mRNA ) <400> 67 ccaggcagtt ggctctaatc 20

Claims (19)

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  9. Yap/Taz 단백질과 TGFb2 또는 Hnf4a를 암호화하는 유전자 위치의 결합 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 간세포계통 세포의 분화 측정용 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 제제는 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제로서, Yap/Taz 단백질을 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합하는 올리고뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브인 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 프라이머는 서열번호 58 및 59의 프라이머쌍 또는 서열번호 60 및 61의 프라이머쌍을 갖는 Yap mRNA 측정용 프라이머;
    서열번호 62 및 63의 프라이머쌍 또는 서열번호 64 및 65의 프라이머쌍을 갖는 Taz mRNA 측정용 프라이머; 또는
    서열번호 29 및 30의 프라이머쌍 또는 서열번호 66 및 67의 프라이머쌍을 갖는 Yap/Taz 활성 측정용 프라이머인 조성물.
  12. 제9항에 있어서, 상기 제제는 단백질의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 제제로서, 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 펩타이드 또는 뉴클레오티드인 조성물.
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. Yap/Taz 단백질 또는 유전자를 포함하는 인체 내의 세포를 제외한 세포에 후보 물질을 처리하는 단계;
    상기 후보 물질이 처리된 세포에서 Yap/Taz 단백질과 간세포 분화 관련 유전자 위치의 결합 수준을 측정하는 단계; 및
    Yap/Taz 단백질과 간세포 분화 관련 유전자 위치의 결합 수준을 비교하여 후보 물질을 간질환의 치료제로 결정하는 단계를 포함하는, 간질환 치료제의 스크리닝 방법으로서,
    상기 간세포 관련 유전자는 TGFb2 또는 Hnf4a를 암호화하는 유전자이고,
    상기 간질환은 간내 담관세포의 과증식, 간섬유증, 간내담관암 또는 혼합 간세포 담관상피암종(combined hepatocellular-cholangiocarcinoma, combined HCC-CCC)인 방법.
  17. 삭제
  18. 제16항에 있어서, 상기 Yap/Taz 단백질과 간세포 분화 관련 유전자 위치의 결합 수준을 측정하는 단계는, 중합효소연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay; RPA), 마이크로어레이(microarray), 또는 노던 블롯팅(northern blotting)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 mRNA의 발현 수준 측정법으로 수행하는 것인 방법.
  19. 제16항에 있어서, 상기 Yap/Taz 단백질과 간세포 분화 관련 유전자 위치의 결합 수준을 측정하는 단계는, 웨스턴 블롯팅(western blotting), 방사선면역분석법(radioimmunoassay; RIA), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 효소면역분석법(ELISA), 면역침강법(immunoprecipitation), 유세포분석법(flow cytometry), 면역형광염색법(immunofluorescence), 오우크테로니(ouchterlony), 보체 고정 분석법(complement fixation assay), 또는 단백질 칩(protein chip)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 단백질 발현 또는 활성 수준을 측정하는 방법으로 수행하는 것인 방법.
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