JP2017532964A - 多能性幹細胞を使用するヒト小腸のin vivoモデル、並びにそれを作製、及び使用する方法 - Google Patents
多能性幹細胞を使用するヒト小腸のin vivoモデル、並びにそれを作製、及び使用する方法 Download PDFInfo
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Abstract
Description
本出願は、『In vivo Model of Human Small Intestine Using Pluripotent Stem Cells』と題する、2014年10月17日に出願された米国出願第62,065,131号に対する優先権、及びその出願の利益を主張する。
本発明は、DK083325、DK098350、NS080815、及びDK092456の下での政府支援でなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
in vivo HIOモデルを確立するため、出願人は、以前に開示された(Spence, et al, Nature 2011、McCracken et al, Nat. Protoc. 2011)ように、ヒトESCまたはiPSCからHIOを作製した。分化プロセスは約35日かかり(図1A及び図5A)、支持間葉に包囲される円柱腸上皮を有するHIOを産生した(図1B及び図5B)。それから出願人は、HIOをI型コラーゲン中に埋め込み、それを免疫不全の非肥満糖尿病性重症複合型免疫不全症インターロイキン−2Rγnull(NSG)マウスの腎被膜下に移植し、6週間にわたり成熟かつ成長させた(図1A及び図5D、1E)。回収時点では、HIOは大きさとしてかなり、上向きに体積が50から100倍大きく成長しており(図1C、図1D、並びに図5C及び図6A)、高度に血管が張り巡らされていた(図1C)。とりわけ、移植されたHIOの92.4%が、腎被膜化にきちんと生着した(図5F)。組織の目視検査は、それぞれが各自の中心毛細管ネットワークを有する粘膜充満性内腔とよく発達した絨毛シートとを有する(図1E)、腸の形態を示した(図1D)。組織学的には、移植された組織は、粘膜固有層、粘膜筋板、並びに粘膜下及び外側平滑筋層を含む、陰窩−絨毛構造とその下に広がる層状の粘膜下層を有する、天然のヒト腸に類似した(図2A及び図6C)。移植されたin vivoの組織は、そのin vitroの対照物(データ表示なし)との比較では、より成熟しかつ分化しているように見え、陰窩−絨毛軸の適切な領域内に配置される、腸細胞、杯細胞、パネート細胞、腸内分泌細胞、及び刷子細胞を含む、全ての主な腸細胞系列を有した(図2B〜D、及び図6D〜G)。パネート細胞は、上皮の至るところに散在するのではなく、予期されたように陰窩底部内に配置されていた(図2B、2C)。透過型電子顕微鏡図(TEM)は、よく発達した密着結合を有する刷子縁を示し、それはin vitroのHIOのそれと同様であった(図7A)。しかしながら、移植物の上皮内に見られるような成熟杯細胞及び腸内分泌細胞(図7B、C)は、in vitroのHIOのTEMにおいては存在していなかった(データ表示なし)。上皮内において、出願人は、移植物をin vitroのHIOと比較すると、上皮細胞種に特徴的な遺伝子の相対発現の増加を観察した(図8A〜G)。出願人は、移植物内の血管はマウス特異的汎内皮細胞抗原(mMECA−32)について陽性染色されることを発見した(図2E)。移植された組織は、また、5−エタニル−2’−デオキシウリジン(Edu)取込みにより明らかになるように、個別の陰窩内において活発に増殖していた(図2F)。腸幹細胞を追跡するためにトランスジェニックのヒトLGR5レポーターHIOを使用し、発明人は、活発に増殖する標識幹細胞が、HIO内に存在し、移植物の陰窩の底部に局在することを発見した(図9A〜D)。さらに、移植された組織は幹細胞マーカーASCL2を発現し(図9E〜F)、また発明人は移植物の上皮由来のエンテロイドを作製することができ、このことはさらに腸幹細胞プールの存在を示す(図9G〜K)。これらのデータは、in vivoでの移植の後、HIOが成熟腸組織への相当な成熟を経ることを示唆する。
動物
全ての実験において、8〜16週齢の免疫不全NOD−SCID IL−2Rγnull(NSG)マウスが使用された(Comprehensive Mouse and Cancer Core Facility、Cincinnati、Ohioから入手)。全てのマウスは、Cincinnati Childen‘s Hospital Medical Center (CCHMC)の動物施設にて収容された。全ての実験は、Institutional Animal Care and Use Committee of CCHMCの承認を伴って行われた。
ヒト腸オルガノイドは、以前に開示されたように作製され維持された(Spence et al, Nature 2011、及びMcCracken et al. Nat. Protoc. 2011)。ヒト胚幹細胞、及び人工多能性幹細胞は、フィーダー無し条件で、Matrigel(BD Biosciences)でコートされた6ウェルNunclon表面プレート(Nunc)中で育成され、mTESR1培地(Stem Cell Technologies)中で維持された。胚体内胚葉(DE)の誘発については、ヒトESまたはiPS細胞がDispaseまたはAccutase(Invitrogen)を使用して継代され、Matrigelコート性Nunclon表面の24ウェルプレート中に、ウェルあたり100,000細胞の密度でプレートされた。Accutaseで継代した細胞については、10μMの化合物Y27632(Sigma)が初日に培地に添加された。細胞は、80〜95%のコンフルエンスに達するまで増殖させられた。それから細胞は、以前に開示されたように、100ng ml−1のアクチビンAで3日間処理された(D‘Amour et al. Nat. Biotechnol. 2005)。DEはそれから、中後腸スフェロイドの形成を誘発するために、後腸誘発培地(RPMI 1640、2mM L−グルタミン、2% 非補完性FBS、ペニシリン−ストレプトマイシン、及び100ng ml−1 アクチビンA)で4日間、500ng mL−1 FGF4(R&D)及び3μM Chiron99021(Tocris)と共に処理された。スフェロイドはそれから、ヒト腸オルガノイド(HIO)を作製するため、Matrigel(BD)中にプレートされ、100ng ml−1 EGF(R&D)及び100ng ml−1 Noggin(R&D)で補足された腸成長培地(Advanced DMEM/F−12、N2、B27、15mM HEPES、2mM L−グルタミン、ペニシリン−ストレプトマイシン)中で維持された。培地は、第3日において交換されてNogginが除去され、それ以降は週に1回交換された。HIOは、14日ごとに、新しいMatrigel中に再度プレートされた。
iPSC作製には、線維芽細胞が、リプログラミング因子Oct4、Klf4、Sox2、cMyc、及びdTomato28を共発現する、組換えVSV−G偽型多シストロン性レンチウィルス粒子でトランスダクションされた。ヌクレオフェクションされた線維芽細胞はそれから、hESC適性Matrigel上にプレートされ、トランスダクション後3〜5日に、MEF培地がmTeSR1に置換され、次いで培養物はmTeSR1で毎日フィードされた。〜3週間後、推定上のiPSCコロニーが同定され、5分間Dispaseに暴露された。個別のコンロニーが手動で切り取られ、Matrigelコート性ディッシュ上でmTeSR1中に再度プレートされた。典型的なhESC様形態を有するいくつかの株がそれから、Matrigelコート性ディッシュ上でmTeSR1中で独立に増殖させられられた。継代には、iPSCが5分間Dispaseに暴露され、洗浄され、そして再度プレートする前に穏やかにすりつぶされた。iPSC株は、mFreSR(StemCell Technologies)中で凍結保存された。全ての培養物は、5% CO2/空気環境中で維持された。本研究の全てのiPSCを用いる実験は、機関のEmbryonic Stem Cell Research Oversight(ESCRO)により承認された。
LGR5:eGFP細菌人工染色体(BAC)トランスジェニックレポーターhESC株が作製された。概要としては、BAC RP11−59F15が、Children‘s Hospital Oakland Research Institute(http://bacpac.chori.org/)から入手され、SW10535細胞中で増殖された。単一コロニーがLB+cam中で32℃にて増殖され、組換えタンパク質が20分間にわたる42℃でのインキュベーションにより誘発された。組換えカセットは、eGFP−FRT−PGKgb2−neo/kan−FRT、LGR5中の50bpの相同性領域、及びpeGFP−PGKneoに対する20bp相同性領域からなった。相同性領域は、LGR5のイニシエーターメチオニンをeGFPのそれと置換するように選択され、それにウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル、及び上下流がFRTに隣接するカナマイシン/G418耐性カセットが続いた。組換えカセットはSW105細胞中へと電気穿孔され、cam及びカナマイシン(kan:50μg ml−1)を有するプレート上で細胞が選択された。クローンはPCRにより正しく標的化されたLGR5 BACについて解析され、シークエンシングにより確認され、Amaxa Human Stem Cell Nucleofector Starter Kitを使用して、H9 hESCの単細胞懸濁液中にヌクレオフェクションされた。細胞は、G418(200ng ml−1)中で2週間かけて選択された。G418耐性細胞は、永久に抗生物質中で維持された。
NSGマウスは、抗生物質性固形飼料(275p.p.m.スルファメトキサゾール、及び1365p.p.m.トリメトプリム;試験飼料)で維持された。手術の前及び後に、食料及び水が適宜与えられた。35日間in vitroで成熟させられた単一HIOがMatrigelから除去され、冷リン酸緩衝生理食塩水(DPBS、Gibco)で洗浄され、精製I型コラーゲン(ラット尾コラーゲン、BD Biosciences)中に手術の12時間前に埋め込まれ、固化ゲルプラグを形成させた。これらのプラグはそれから、標準的な成長培地中に、100ng ml−1 EGF(R&D)で補足された腸成長培地中に(Advanced DMEM/F−12、B27、15mM HEPES、2mM L−グルタミン、ペニシリン−ストレプトマイシン)一晩配置された。HIOはそれから腎被膜下に移植された。簡潔には、マウスが2%吸入イソフルラン(Butler Schein)を用いて麻酔され、それからマウスの左側がイソプロピルアルコール及びポビドンヨードで無菌的に前調整された。小さな左後部の粘膜下切開がなされ、腎臓を露出した。被膜下ポケットが作成され、コラーゲンに埋め込まれたHIOがポケット内に配置された。それから腎臓が腹腔に戻され、マウスはZosyn(100mg/kg、Pfizer Inc.)のIP洗浄を受けた。皮膚は二層に封鎖され、マウスは、Buprenex(0.05mg/kg、Midwest Veterinary Supply)の皮下注射を受けた。移植から6週間後、それからマウスは人道的に安楽死させられ、またはさらなる実験の対象とされた。
6週間前にHIOが移植されたオスNSGマウスが無作為に回盲部切除(ICR)またはシャム手術に割り当てられた。マウスは、手術の24〜48時間前に液体飼料(Jevity 1Cal、Abbott)下に置かれ、残りの実験の間にわたり、抗生物質性固形飼料から飲料水中の液体抗生物質(200mgスルファメトキサゾール、及び40gトリメトプリム経口懸濁液、5mL−1、Hi−Tech Pharmacal)(0.3mg mL−1トリメトプリム)に切り換えられた。手術は上で開示のような麻酔下で遂行され、腸を露出するため、マウスの腹が前側で切開された。以前に開示26されたように、回盲部に加え、平均13.6cmの最遠位小腸が除去された。マウスは手術後48時間にわたり30℃のインキュベーター中で保管され、それから手術後第7日に安楽死させられた。
ヒトエンテロイドは、以前に開示12、29されたように作製された。簡潔には、移植物が採取され、切開され、粘膜層を上向きにピン止めされ、それから冷PBS(Gibco)中で濯がれた。組織はそれから2mM EDTA(EDTA、Sigma−Aldrich)を含むPBSへと移され、氷上で30分かけて揺すられた。EDTAキレート化の後、組織は再び冷PBS中で洗浄され、陰窩が、その下に広がる粘膜化組織から取り除かれ、それから100μm細胞ストレーナー(Fisher Scientific)を通してフィルタリングされた。陰窩はそれからペレット化され、Matrigel(BD Biosciences)中で再懸濁され、EGF(50ng mL−1)、Noggin(100ng mL−1)、R−スポンジン1(1μg mL−1)(R&D Systems)、50%Wnt3a馴化培地、1mM N−アセチルシステイン、10nM(Leu15)−ガストリン、10mM−Nicotidamide、10μM SB202190(Sigma−Aldrich)、500nM A−83−01(Tocris)で補足された腸成長培地(Advanced DMEM/F−12、N2、B27、15nM HEPES、2mM L−グルタミン、ペニシリン−ストレプトマイシン)で覆われた。2.5μMチアゾビビン、及び2.5μM CHIR99021(Stemgent)が、最初の2日間に渡り培地に添加された。培地は3日ごとに交換された。確立したエンテロイドは、培養7日後、酵素的(TrypLE Express、Life Technologies)、及び18ゲージの針を通じての機械的解離により、時間をかけて継代された。解離されたエンテロイドはそれから、PBS中で再懸濁され、Matrigel中での再懸濁前にペレット化され、培養条件は上記の通りである。
凍結切片がPBS中で洗浄され、ロバ血清を用いてブロッキングされた。切片はPermanent Redの使用溶液(Permanent Red基質+Permanent Red色素原、Dako)で30分間にわたり室温にてインキューベートされた。切片はそれからPBSで洗浄され、イメージングのためにマウントされた。
FITC結合デキストラン(FD4、4400 MW、 Sigma)が、最終濃度20mg ml−1にて無菌水中に溶解された。それから、8週間前の移植物を有するマウスが上で開示されたように麻酔をかけられ、左の腎臓を露出するために左後部の肋骨下の切開がなされ、腸組織を移植した。それからヒト移植物が、それぞれ100μLのFD4とともに注射された。それから、注射後30分及び4時間のタイムポイントにおいて、ヘパリン化ヘマトクリット毛細管チューブを使用して全血が採取され、ネズミ血清中の蛍光強度が蛍光プレートリーダーを使用して解析された。それから、FITC−デキストランの濃度が、水に溶解された場合のFITC−デキストラン標準曲線との比較により決定された。
フルオレセインLycopersicon esculentum(トマト)レクチン(Vector laboratories)が、最終濃度2mg ml−1にてPBS中に再懸濁させられた。HIO移植後8週間に、マウスは上で開示のように麻酔下におかれ、各々が尾静脈から200μlのトマトレクチンが注射された。それから注射から30分後にマウスは人道的に安楽死させられ、組織がイメージングのために回収された。
D−Ala−Leu−Lys−7−アミド−4−メチルクマリン(D−Ala−Leu−Lys−AMCA、Sigma)が、以前に開示30された方法に修正を加えて、DMEM(Dulbecco‘s Modified Eagle Medium、Gibco)中最終濃度25μMとなるように調整された。マウスが上に開示のように麻酔をかけられ、移植物を露出するために左後部の肋骨下の切開がなされた。それから移植物内腔に100μLのD−Ala−Leu−Lys−AMCA注入され、マウスは二層状に封鎖された。マウスは注入後30分に安楽死させられ、解析のために組織が回収された。比較のため、移植物に、媒体(DMEM溶液)のみ、またはペプチド取込みの競合阻害剤カプトプリル1mM(Sigma)と混合されたペプチド溶液もまた、注入された。
組織は、4%パラホルムアルデヒド(PFA)中で2時間から一晩にわたり固定された。オルガノイド移植物はOCT中で凍結され、マウス腸組織はパラフィン中に埋め込まれた。OCT切片は、ロバ血清(10%血清を含む1xPBS+0.5%Triton−X)を使用して30分かけてブロッキングされ、第一抗体と共に4℃にて一晩インキュベーションされた。それからスライドは洗浄され、ブロッキング緩衝液中の第二抗体中で室温(23℃)にて2時間インキュベーションされた。パラフィン切片は、脱パラフィン化され、抗原賦活化を受け、OCT切片と似たように染色が行われた。抗体及びそれぞれの希釈度のリストについては、表1を参照してください。それからスライドは、洗浄され、ProLong Gold抗褪色剤を使用してDAPI(Life Tecnologies)とともにマウントされた。画像は、Nikon Eclipse Ti上でキャプチャーされ、Nikon Elements Imaging Software(Nikon)を使用して解析された。透過型電子顕微鏡法(TEM)については、組織は、3%グルタルアルデヒドを含む0.175Mカコジル酸ナトリウム緩衝液pH 7.4中で一晩固定された。試料はそれから、1%四酸化オスミウムを含む0.175Mカコジル酸緩衝液中で、4℃にて1時間かけて固定された。試料は、洗浄され、一連の段階的エタノール(25、50、75、95、2x100%)に通された。浸潤は2x酸化プロピレエンを用いて行われ、続いてLX−112を用いて段階的浸潤が行われた。試料は37℃の重合化オーブン中に一晩配置され、それから60℃にて3日間にわたり保管された。TEM切片をイメージ化するためには、Hitachi H7600透過型電子顕微鏡が使用された。ホールマウント染色については、組織が上記と同様に処理され、それからMurray溶液中できれいにされた。イメージングは、Nikon A1共焦点顕微鏡を用いて実施された。
RNAは、RNeasy Plus Mini Kit(Qiagen)を使用して、製造元のプロトコールに従って抽出された。cDNAを合成するためには、cDNA逆転写キット(Applied Biosystems)が使用された。それからTaqman(Applied Biosystems)遺伝子発現アッセイが、OneStepサイクラー(Applied Biosystems)を使用して、トリプリケートの試料に対して実施された。使用されたTaqmanプローブのリストについては、表2を参照。
組織切片は、ヘマトキシリン及びエオジンで染色され、あるいは(上に開示のように)免疫組織化学が行われた。全ての組織試料は、盲検的に計数された。陰窩深さ、絨毛高さ、及び平滑筋層(筋層)の厚さが、最小でマウスあたり100の、良い方向を向いている陰窩−絨毛単位または平滑筋層区画について測定され、それからNikon NISイメージングソフトウェアを使用して平均が求められた。1匹あたり少なくとも100の完全な形の陰窩から、分裂している陰窩のパーセンテージを決定するために、縦断面を使用して、陰窩分裂もまた同様に計算された。分裂している陰窩とは、共有される単一の陰窩−絨毛接合部を有する2つの(または場合によってはそれより多い)フラスコ形の底部を生じる二分する亀裂を有する、二叉に分かれている陰窩と定義される(図23A、F)。マウスに5−エチニル−2’−デオキシウリジン(Edu)を殺処分の2時間前に注射し、それから、製造元の指示に従う通例のEdu免疫組織化学を行うことにより増殖指標が決定された。増殖指標は、少なくとも10の完全な形の陰窩内におけるEdu陽性細胞対全細胞の比を計算することにより決定された。全データはmean+s.e.m.として表わされている。t検定、及び二元配置分散分析は、Prism(GraphPad)を使用して遂行された。決定された有意性カットオフ値はP<0.05であった。試料サイズを前もって決定するためには統計の方法は使用されなかった。
迷走神経堤細胞の作成
頭部及び体幹(迷走と仙髄との両方)NCCは、A−P軸に沿う別々の領域から発出し、発生中の胚の異なる領域でコロニー形成する。例えばENSは、迷走NCCから派生する。従って、ENSを有するヒト腸オルガノイドを生成するには、出願人は、迷走NCCがより適切な開始起源であろうと仮説をたてた。PSCの頭部NCCへの分化を誘導するための多数の方法が報告されている9、10ことをふまえ、出願人は、まず、通常のNCC発達を模倣する段階的方法で頭部NCCを作製することにより始めた(図1、図20)。以前にも報告されたように、PSCから派生した頭部NCCは、胚発生の間の頭部NCCと類似の方式で、ステージ特異的な分子マーカーを発現した。それは、初期神経上皮ステージにおけるSox2、Pax3、及びPax7、並びに遊走神経堤細胞におけるHNK−1、Sox10、Snail2、及びビメンチンを含む。
多能性NCCは、神経、神経膠、及びメラニン細胞を含む外胚葉派生物、並びに、骨細胞及び軟骨細胞を含む頭部中胚葉系細胞を形成しうる。NCCが多能性の分化ポテンシャルを維持したかを調べるため、出願人は、NCCの、様々な外胚葉性間葉系細胞への分化をin vitroで誘導した(図22A)。NCCは、成長因子の回収にあたり、in vitroでペリフェリン+神経、及びGFAP+神経膠細胞へと分化することができた。PSC由来のNCCは、それぞれアリザリンレッド及びアルシアンブルーについての陽性染色により示されるように、骨細胞及び軟骨細胞を含む中胚葉系細胞へと分化することもできた。出願人は、NCCのin vitro分化ポテンシャルに対する、RA処理による大きな違いは観察しなかった。これは、PSC由来の頭部及び迷走/Hox陽性NCC集団の多能性が維持されていたことを示唆する。出願人はさらに、ヒヨコ胚へとPSC由来NCCを注射することにより、PSC由来NCCが胚環境において神経堤細胞の振る舞いをするかどうかを調べた。PSC由来NCCは、内因性のNCCに類似の遊走経路をたどり、神経へと分化した(図21D〜21F)。
出願人は以前に、まずは胚体内胚葉へ、それから3D腸組織へと発展させられる中/後腸管スフェロイドへの段階的分化をたどって、ヒトPSCを腸オルガノイドへと分化させるための方法を開発した(Spence et al., McCracken et al.(図23))。In vitroでは、HIOは、全ての主な腸上皮細胞種、並びに、上皮下筋線維芽細胞及び平滑筋細胞を含有する層状間葉を含有する。HIOは、腎被膜下スペースへと移植されると、発生を続け、陰窩及び絨毛、機能的腸幹細胞、並びに平滑筋層を有する、よく分化した腸組織を形成する(図23B)。
我々の以前の研究は、上記かつWatson et al 2011に開示のように、マウスに移植されin vivoで6〜10週間かけて成長させられたHIOは、血管が張り巡らされ、直径1〜3cmにまで成長し、また機能的な腸幹細胞を含有する絨毛及び陰窩を有する非常に成熟した腸組織を形成することを示した(図17B)。さらに、HIO間葉は、平滑筋線維の粘膜下及び筋腸間層へと成熟する(図15C)。移植されたHIO+PSC由来NCCの解析は、神経(βIII−チューブリン)及び神経膠(S100)が、平滑筋の粘膜下及び筋腸間層に近接する複数の層へと組織化されたことを明らかにした(図15C)。出願人は、NCC無しの移植されたHIOにおいては、神経または神経膠を検出しなかった。これらの実験は迷走神経/HOX陽性NCC集団を用いて実施されたが、PSC由来の頭部/HOX陰性NCCもまた、生着しENS神経膠細胞を形成する能力を有した。しかしながら頭部NCCは、より幅広い多能性を有することと一致して、色素上皮細胞(図22B)、及び軟骨(表示なし)も形成した。
ENSは、興奮性及び抑制性の神経サブタイプ、並びに介在神経の、複雑なネットワークである。in vitroで4週間にわたり培養されたHIO+NCCにおける神経マーカーの調査は、顕著な度合いの神経多様性を示唆した。出願人はチロシンヒドロキシラーゼ(TH)、カルビンジン、カルレチニン、及びセロトニン(5−HT)陽性細胞を観察し、これらはドーパミン作動性、興奮性、及び介在神経により発現された(図3A)。しかしながら、出願人は、in vitroではnNOS陽性神経を検出しなかった。これに対し、in vivo移植されたHIO+NCCは、たくさんのnNOS+神経を有し、これはENSがin vivo成長の期間中に成熟したことを示唆する。移植されたHIO+NCCにおいては、多くの神経が、平滑筋と連係しているようであった。さらに、ENS神経は、Cajal間質細胞(ICC)のマーカーであるCD117を発現している細胞と連係していた(図16B)。ICCはENSを欠如するHIO中に存在したが、HIO−NCC中にはCD117発現細胞のクラスターはより少ないように見え(データ表示なし)、このことはENS細胞とICCとの間の発生性相互作用を示唆する。
ENS神経及び神経膠の組織学的解析は、これらがHIOの平滑筋層内で神経叢を形成していることを示唆した。しかしながら、この結論は、切片化された組織の2次元の性質をふまえると、難しい。ゆえに出願人は、神経、神経膠、及び平滑筋マーカーを使用して、ホールマウント免疫蛍光により、in vivoで成熟したHIO+NCCからの組織の3次元イメージングを実施し、それらをヒト小腸と比較した(図18)。ヒト小腸のENSは、平滑筋層(デスミン+細胞)中へと統合される、神経(BIII−チューブリン)及び神経膠(S100)のネットワークを含有した。発達中のHIO内で形成したENSは、平滑筋線維とともに配向するように見える、神経及び神経膠の複雑な神経叢を同様に含有した(図18A)。HIO+NCC試料の3D画像の側面図は、筋腸間叢(図18B)、並びに上皮に隣接する粘膜下組織中に配置される神経叢の証拠を明確に示した(青−dapi)。出願人はまた、切片及び3Dイメージングの両方において、神経細胞体クラスターをも観察し(図25)、これは神経節を暗示する。ヒト腸と比較すると、HIO中の神経節はより小さく、またより発達していなかった。
HIO+ENS組織中の上皮、平滑筋、神経、及び神経膠の組織化はヒト腸のそれと同様であったが、HIO+ENS組織中に神経筋交信が存在したかは明らかではなかった。PSC由来ENSがHIO組織中で機能しうるかを判断するため、出願人は、腎移植物をTyrode溶液中に外殖し、腎移植物に電界刺激を受けさせた(図19C)。100V(高電圧)における単一の1msパルスが与えられたENS無しのHIO組織は、単一の収縮を引き起こし、このことは平滑筋収縮の直接的刺激を示唆する。これに対し、50V(低電圧)における単一の1msパルスが与えられたENSを含有するHIO組織は、持続する収縮の波を引き起こした。収縮がENSの活動ゆえであるかを決定するため、出願人は、神経上の電位作動性Na+チャネルに結合するテトロドトキシン(TTX)で神経活動を遮断し、アクションポテンシャルの発火を阻害した。TTXは、低電圧刺激の、HIO+NCC組織において運動を引き起こす能力を完全に阻害した。
GI運動は、ENS依存性及び非依存性の収縮と、平滑筋の弛緩との共同作用が必要とする。これらの過程をより良く分析するため、出願人は、HIO、及びHIO+NCCからの組織片を単離し、器官チャンバー実験を使ってその組織片を解析した。神経刺激の非存在下では、出願人は、HIO及びHIO+NCC組織の両者において、両条件においてICCが存在することに一致して(図16B)、自発的な位相性の収縮を観察した(図19A、及び図26A)。ICC活動を阻害するメチレンブルーは、位相性収縮を消失させた(図19B)。収縮及び弛緩におけるENS依存的役割を同定するため、出願人は、選択的α3ニコチン性受容体ゴニストであるジメチルフェニルピペラジニウム(DMPP)、及び、Na+チャネル不活性化を阻害することにより神経興奮可能性を増加させるベラトリジンを使用して、神経を活性化させた。ENSの薬学的活性化は、HIO+NCC組織の弛緩を誘発したが、HIO単独においては誘発しなかった(図6C、及び図25A)。出願人は、TTXを使用して弛緩が神経依存的であることを確認した。TTXは、DMPP及びまたはベラトリジンに応答して筋肉弛緩を誘発する神経の能力を阻害した(図19D、及び図27B)。
細胞株、及び培養条件
ヒトES及びiPS細胞、H1(WA−01)、H9(WA−09)、及びWTC11 AAVS1−CAG−GCaMP6fが、未分化の状態で、フィーダー無しでMatrigel(BD Biosciences)上で維持された。H9−GAPDH−GFP hESCは、TALENにより促進される相同組換え34を組み込んだ標準的手順33を使用して、GFPをコードする配列をGAPDH遺伝子の3’−UTRにターゲティングすることにより、作製された。GFPは、直近でGAPDHのC末端と隣接するT2A 35偽融合タンパク質として発現された。
HIO+/−NCCは、上記及びWatson et al.において開示のプロトコールに従い、NOD/SCID−gamma(NSG)の腎被膜中へと異所的に移植された。簡潔には4〜6週間のHIOが、コラーゲン中に埋め込まれ、腎被膜下スペース中へと移植された。移植されたHIOは、移植から6〜10週後に採取され、神経または神経膠マーカーについて解析され、あるいは電界刺激(EFS)実験に使用された。EFSについては、HIOは、Tyrode溶液中へと外殖され、刺激開始におよそ5分前間、平衡化された。電気刺激は、Grass S88 Stimulator(Grass Technologies)を使用して、単一パルス、1ms持続時間、及び50または100Vの設定で、適用された。それから、HIOは、Tyrode溶液に希釈された10μM TTX中で5分間インキュベートされ、濯がれ、そして新しいTyrode溶液中に戻された。それから、EFSが繰り返された。動画は、Leica Application Suiteソフトウェアを使用してLeica解剖顕微鏡上で録画され、VideoLAN及びHandbrakeで16X再生速度を達成するように処理された。
ニワトリの卵は、Charles Riverから購入され、望ましいHamburger及びHamiltonステージに達するまで39℃にてインキュベーションされた。ニワトリNCC培養については、HH8胚の頭部または体幹領域からの背側神経管がGastromasterにより解剖され、24時間にわたりNCC培養培地とともにMatrigelコーティングされた組織培養皿上で培養された(BajPai R et al, 2010)。神経管外殖物からNCCが遊走して出た後、神経外胚葉はプレートからタングステン針により剥がされた。プレート上に残されたNCCは、それから4ng/mlのFGF4または2μMレチノイン酸とともに48時間処理された。NCC注射については、GFP標識されたヒトPSC由来NCCが回収され、HH10−12ニワトリ胚中へ体節間に注射された。胚は、HH38ごろに解析のため採取された。
NCC細胞、細胞単一層、及び第0日スフェロイドは、4%パラホルムアルデヒド(PFA)で23℃にて15分間固定され、洗浄され、それから直接的に染色された。4週のin vitro HIO、及びin vivoの移植物が、4%PFA中で4℃にて1時間から一晩固定された。組織は、処理され、OCT中に埋め込まれ、およそ10μmにて切片化され、それからSuperfrost Plusスライド(Fisherbrand)上にはり付けられた。凍結切片及び細胞は、0.25%Triton−X100で10分間かけて処理され、それからPBS中の5%Normal Donkey Serum(NDS、Jackson Immunoresearch)で30分間23℃にてブロッキングされた。PBS中に希釈された第一抗体が、スライド及び細胞に一晩4℃にて適用され、それから洗浄され、第二抗体とともに23℃にて2時間にわたりインキュベーションされた(抗体及び希釈度については、表3を参照)。スライドは、Fluromount−Gを使用してマウントされ、画像は、Zeiss ApoTome Imager Z1またはZeiss LSM510共焦点顕微鏡を使用して得られた。ホールマウント3D画像は、4℃にて4%PFA中で組織を一晩固定し、それから氷上で100%メタノール中で1時間にわたり平衡化させることにより、得られた。組織は、PBSで再水和する前に、室温にて2時間かけてDentブリーチ(4:1:1 MeOH:DMSO:30%H2O2)で透過処理された。組織は、室温にてPBS中5%NDSで2時間ブロッキングされ、4℃にてPBS中の第一抗体と共に一晩インキュベーションされ、洗浄され、4℃にてPBS中の第二抗体と共に一晩インキュベーションされた。染色の後、組織は一連のメタノールにより脱水され、Nikon A1倒立共焦点顕微鏡上でのイメージングの前に、Murray‘s Clear(2:1 安息香酸:ベンジルアルコール)できれにされた。画像は、NIS Elements、Bitplane Imaris、Zeiss Axiovision、及びAdobe Photoshop CS7ソフトウェアを使用して処理された。
細胞及びオルガノイドからの全RNAは、NucleoSpin RNA単離キット(Macherey−Nagel)を使用して単離された。相補的DNAは、RNA単離の直後に、SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit(Invitrogen)を使用して作成された。単離及び合成はともに、製造元のプロトコールに従い行われた。出願人は、QuantiTect SYBR Green PCR Kit(Qiagen)を使用して、BioRad CFX96 Real−Time PCR Detection System上で、qPCRを実施した。プライマー配列は、一般に、qPrimerDepot(http://primerdepot.nci.nih.gov)から得られ、表4に見られる。
移植されたHIO+/−NCCが採取され、氷冷HBSS中に配置された。筋肉片(4〜6mm長、1〜2mm幅)が移植されたHIO+/−NCCから切り取られた。調製物は、Krebs溶液(NaClは17mM、KClは4.7mM、MgCl2は1.2mM、NaH2PO4は1.2mM、NaHCO3は25mM、CaCl2は2.5mM、及びグルコースは11mM)で満たされた器官槽中で垂直に懸濁され、37℃にて温められ、95%O2+5%CO2の気体が与えられた。初期張力0.5gにおける60分間の平衡期間の後、筋肉の収縮応答が、LabChartソフトウェア(AD Instruments)が搭載されたコンピューターに連結される等尺性力トランスデューサー(Radnoti)を用いて、8チャンバー組織器官槽を使用して、継続的に記録された。筋肉調製物は、ジメチルフェニルピペラジニウム(DMPP、10μM、Sigma)及びベラトリジン(3μM、Sigma)で刺激された。化学的刺激が、15分間隔で適用され、次いで3回洗浄された。テトロドトキシン(TTX、10μM、Tocris)またはNG−ニトロ−L−アルギニンメチルエステル(L−NAME、50M、Sigma)がDMPP刺激の5分前に適用された。NOSはニトロプルジドナトリウム(SNP、100μM、Sigma)で阻害された。メチレンブルー(50μM)はICC活動を阻害するために使用された。化学的刺激の張力に対する影響は、曲線下面積(AUC)を測定することにより評価された。データはΔAUCとして表現された。ΔAUCとは、つまり刺激後120秒後に測定れた「刺激された」AUCから刺激より120秒前に測定された「対照」AUCを差し引いたものである。
出願人は、機能的ENSを含有するヒトPSC由来の腸組織を工学設計するため、胚の腸分化の原理を利用した。3次元成育条件中でPSC由来の腸オルガノイドと再統合されたヒトPSC由来の迷走神経様NCCは、腸間葉中へと遊走し、自己組織化し、一連のENSの神経及び神経膠細胞種へと分化した。移植及びin vivoでの成長の後、NCCは、筋腸間及び粘膜下神経叢の胚発生に類似する、複雑な神経節構造及び神経節間線維を形成した。出願人はさらに、NCC由来のENSが、腸平滑筋中に機能的に統合され、NO依存的弛緩を駆動したことを示した。移植されたHIO+NCCにおいて見られる高度な組織の組織化は、出願人がin vitroで工学設計した組織が、ENSの胚発生の間に起きる、細胞遊走の調和、増殖、細胞系列のコミットメント、及び神経叢の構築のための固有な情報を有したことを示唆する。
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Claims (16)
- 血管が張り巡らされている中空器官を作製する方法であって、
a)ヒト腸オルガノイド(HIO)を免疫不全の生物、好ましくは哺乳類、好ましくは免疫反応を有さない哺乳類、好ましくは重症複合免疫不全症(SCID)を有する哺乳類に移植する工程
を有し、前記HIOはヒト胚幹細胞(ESC)及び/または人工多能性幹細胞(iPSC)から得られ、
前記移植する工程の間に前記HIOが成熟腸組織を形成する、方法。 - 請求項1記載の方法において、前記ヒト腸オルガノイド(HIO)が、ヒトESC、もしくはiPSC、またはそれらの組合せから作製される、方法。
- 請求項1〜2のいずれか記載の方法において、前記移植する工程が、前記免疫不全の生物の腎被膜への前記HIOの移植を有する、方法。
- 請求項1〜3のいずれか記載の方法において、前記移植する工程が、少なくとも約3週間、少なくとも約4週間、少なくとも約5週間、もしくは少なくとも約6週間、または最大で約3ヶ月、もしくは最大で約4ヶ月、もしくは最大で約5ヶ月、もしくは最大で約6ヶ月の期間にわたり実施される、方法。
- 請求項1〜4のいずれか記載の方法において、前記移植する工程は、前記腸組織が、
支持間葉に包囲される円柱腸上皮を有すること、
直径1〜3cmの成長、
機能的腸細胞を有する絨毛及び陰窩の形成、
粘膜下及び腸筋層間に平滑筋線維層を有すること、
並びにこれらの組合せ
から選択される1つまたはそれより多い基準を満たすまで実施される、方法。 - 機能的腸神経系(ENS)を含有するヒト腸組織を作製する方法であって、
a)ヒトES細胞及び/またはiPS細胞(IPC)に由来する迷走神経様神経堤細胞(NCC)を三次元ヒト腸オルガノイド(HIO)に接触させる工程と、
c)前記HIOをin vivoで移植する工程と
を有する、方法。 - 請求項6記載の方法において、前記NCCは、後部化を引き起こすため、ヒトES細胞及び/またはiPS細胞をレチノイン酸に接触させる工程によって取得され、好ましくは、前記レチノイン酸が前記ヒトES細胞及び/またはiPS細胞と約1〜約2日間、好ましくは約2日間の期間にわたって接触される、方法。
- 請求項6または7記載の方法において、前記レチノイン酸に接触させる工程が、ニューロスフェアステージにおいて約2日間にわたって、またはHOXB3、HOXb5、及び/もしくはHOXb7の実質的な発現が観察されるまで実行される、方法。
- 請求項6〜8のいずれか記載の方法において、前記移植する工程が、神経及び/または神経膠の検出を可能にするのに十分な期間にわたって実施される、方法。
- 請求項6〜9のいずれか記載の方法において、前記神経がBIII−チューブリンを有する、方法。
- 請求項6〜10のいずれか記載の方法において、前記神経膠がS100を有する、方法。
- 請求項6〜11のいずれか記載の方法において、前記神経及び神経膠が、平滑筋層(デスミン+細胞)に統合する、方法。
- 請求項6〜12のいずれか記載の方法において、前記移植する工程が、nNOS+抑制性神経の形成を可能にするのに十分な期間にわたって実施される、方法。
- 請求項6〜13のいずれか記載の方法において、前記機能的腸神経系(ENS)を含有するヒト腸組織が、収縮活動が可能なものである、方法。
- 患者の胃腸管の一部の置換を必要とする患者を治療する方法であって、上述の方法のいずれかに従って作製されるヒト腸組織で前記一部を置換する工程を有する、方法。
- ヒト腸管に対する治療の効果を決定する方法であって、請求項1〜14のいずれか記載の方法に従って前記治療をヒト腸組織に接触させる工程を有する、方法。
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