JP7105836B2 - 多能性幹細胞を使用するヒト小腸のｉｎ ｖｉｖｏモデル、並びにそれを作製、及び使用する方法 - Google Patents

Description

優先権
本出願は、『Ｉｎ ｖｉｖｏ Ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｓｍａｌｌ Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ Ｕｓｉｎｇ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ』と題する、２０１４年１０月１７日に出願された米国出願第６２，０６５，１３１号に対する優先権、及びその出願の利益を主張する。

政府支援条項
本発明は、ＤＫ０８３３２５、ＤＫ０９８３５０、ＮＳ０８０８１５、及びＤＫ０９２４５６の下での政府支援でなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。

腸などの血管が張り巡らされている中空器官の複雑性ゆえ、その研究、及び手術または病理過程後の置換のための、十分なヒトモデルの開発は、一見して不可能な課題であることが示されてきた。ヒト腸を研究するための方法は、主にｉｎ ｖｉｔｒｏ培養システムを主に必要とし、あるいは多数のトランスレーショナルな問いに取り組むために動物モデルに依存してきたが、これは必ずしもヒトでの研究においては上手く置き換えが効かない。古典的な腸上皮初代培養技術は、大概、器官培養、または幹細胞から分化細胞までの階層性を再現しない腸細胞株などの、組織培養技術に限定された。腸幹細胞、及びヒト上皮培養に適切な条件の最近の同定はこれらの障害の多くを克服したものの、粘膜傷害後にホストの間葉を露出させるモデルにおいて存在するような、支持間葉の必要性ゆえ、上皮培養のｉｎ ｖｉｖｏ移植の成功は難題であり続けている。

ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）の器官特異的サブタイプへの分化は、胚発生及び疾患経過の研究のための、並びに薬学的研究のための、また治療用移植物のための潜在的供給源としての、興奮するような道筋を、提供する。今日まで、ヒト腸に対しては限定的なｉｎ ｖｉｖｏモデルしか存在しておらず、それらの全てが、生分解性スキャフォールド上に移植された、初代上皮培養、または、間葉系細胞を含む外科生検由来の消化された組織に依存する。

現在、血管が張り巡らされている中空器官、とくに腸神経系（ＥＮＳ）腸生物学の研究のためのモデルを作製するための方法ための技術に、需要がある。さらに、機能的腸神経系を有する腸組織を作製する方法のための技術に、需要がある。現在、ヒト腸を研究するための方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養システムを主に必要とし、あるいは動物モデルに依存してきた。しかしながら、これらの研究は必ずしも上手くヒトでの研究に置き換えが効かない。腸幹細胞、及びヒト上皮培養がこれらの問題のいくらかには取り組んできたものの、上皮培養のｉｎ ｖｉｖｏ移植の成功は、支持間葉が必要であることゆえ、課題であり続けている。

ヒト腸オルガノイド（ＨＩＯ）由来の、血管が張り巡らされている中空器官を作製するための方法が開示される。ＨＩＯは、ヒト胚幹細胞（ＥＳＣ）、及び／または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から、ＨＩＯが成熟腸組織を形成するように、得られうる。機能的腸神経系（ＥＮＳ）を含有するヒト腸組織を作製するための方法も開示される。

図１Ａ～Ｅ。ＨＩＯ移植はｉｎ ｖｉｖｏで生着し、成熟腸組織を形成する。図１Ａ－ｈＰＳＣからのＨＩＯの発達、及び成熟ヒト長組織を生成するための腎被膜下への移植を表わす概要。図１Ｂ－支持間葉（白矢尻）により包囲される腸上皮（黒矢尻）からなる、３５日における２つのｉｎ ｖｉｔｒｏ ＨＩＯ。スケールバー、１００μｍ。図１Ｃ－６週間後の移植物（輪郭内）で、複雑な構造、及び確立した末梢毛細管ネットワークを有する。サイズ比較のため、マウス腎臓が移植物の下に示される。スケールバー、５ｍｍ。図１Ｄ－６週における移植物断面図で、中心内腔を有する腸構造を示す。スケールバー、５ｍｍ。図１Ｅ－移植物の内腔表面の拡大図で、各々が自身の中心毛細管を有する絨毛のシートを示す。スケールバー、５００μｍ。ｎ＝１３９移植物。 図２Ａ～Ｉ。移植された腸組織は、成人腸に類似し、ほぼ完全にヒト由来である。図２Ａ－移植されたＨＩＯのＨ&Ｅ染色後の、弱及び強拡大イメージング。低倍率イメージングは、上皮の複数部位、層状の平滑筋、及び末梢毛細管を示す。スケールバー、５００μｍ。高倍率イメージングは、陰窩－絨毛領域、並びに、粘膜固有層、粘膜筋板、粘膜下組織、及び外側平滑筋層を含む上皮下組織の適切な層を示す。図２Ｂ－移植物内の上皮のアルシアンブルー－過ヨウ素酸－Ｓｃｈｉｆｆ染色で、陰窩－絨毛軸内の分泌型細胞を表わす。黒矢尻は、陰窩底部内に存在する、ＰＡＳ標識されたパネート細胞を指す。図２Ｃ－移植物中には、腸細胞（ＶＩＬ）、杯細胞（ＭＵＣ２）、パネート細胞（ＬＹＳＯ、白矢尻、スケールバー５０μｍ）、及び腸内分泌細胞（ＣＨＧＡ）を含む４つの腸系細胞すべてが存在していた。追加の上皮染色にはＥ－カドヘリン（ＥＣＡＤ）が使用された。図２Ｄ－ダブルコルチン様キナーゼ１（ＤＣＬＫ１）で標識されるように、上皮の至る所において刷子細胞もまた見られる。図２Ｅ－マウスホスト血管内殖のｍＭＥＣＡ－３２染色。図２Ｆ－上皮の陰窩底部、及び陰窩内の増殖性区画内の活発な増殖のＥｄｕ染色。図２Ｇ－ＶＩＭに対する染色は、支持間葉の寄与を明らかにし、これはα－ＳＭＡの染色を有する層状の平滑筋（白矢尻）を含む。マージ画像は、ＶＩＭ及びα－ＳＭＡでの二重染色を示し、支持ＩＳＥＭＦの陰窩周囲鞘を示す。図２Ｈ－２Ｉ－移植物の全厚みにわたるＨｕＮｕｃ染色によって評価される、ヒト上皮細胞（図２Ｈ）、及びヒト間葉組織（図２Ｉ）の寄与。点線は、移植物を下のマウス腎臓から分離する。全スケールバーは、別に特定される箇所を除き、１００μｍである。ｎ＝１３４移植物。 図３Ａ～Ｉ。移植された組織はｉｎ ｖｉｖｏで成熟し、成熟小腸に類似する。（図３Ａ～Ｄ）ＳＩＭ（図３Ａ）、ＤＰＰＩＶ（図３Ｂ）、ＬＣＴ（図３Ｃ）を含む刷子縁酵素の成熟、及び分化した腸内分泌細胞サブタイプ（ＧＩＰ）（図３Ｄ）を示す、移植された腸組織（ｉｎ ｖｉｖｏ）の免疫染色。追加の上皮染色には、ＥＣＡＤ及びＣＤＸ２が使用された。（図３Ｅ～Ｈ）比較のため、移植物に相当するタイムポイントにおける、ＳＩＭ（図３Ｅ）、ＤＰＰＩＶ（図３Ｆ）、ＬＣＴ（図３Ｇ）、またはＧＩＰ（図３Ｈ）に対する、ｉｎ ｖｉｖｏでのＨＩＯの染色。図３Ｉ。移植された（Ｔｘｐ）ＨＩＯとの比較での、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＨＩＯにおける、ＬＣＴ、ＳＩＭ、ＤＰＰＩＶ、及びＧＩＰの相対的遺伝子発現。グラフにおける値は、ｍｅａｎ±ｓ．ｅ．ｍ．を表わし、＊Ｐは０．０５未満、＊＊Ｐは０．０１未満、ｔ検定。Ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＨＩＯ：ｎ＝４、移植物（Ｔｘｐ）：ｎ＝８。スケールバー、１００μｍ。 図４Ａ～Ｉ。マウスホストにおいては、回盲部切除後、移植されたヒト腸組織は、液性因子に応答する。（ａ）移植されたＨＩＯを有するマウスにおける切除実験を表わす、概要。図４Ｂ。シャム対ＩＣＲ群における、ネズミ上皮のＨ&Ｅ染色。シャム及びＩＣＲ群間の、マウス腸における、測定された絨毛高さ（μｍ、図４Ｃ）及び陰窩分裂のパーセンテージ（図４Ｄ）の比較。（図４Ｅ）シャム対ＩＣＲ群における、移植されたＨＩＯ上皮のＨ&Ｅ染色。シャム群対ＩＣＲ群における、移植されたＨＩＯ内の、絨毛高（図４Ｆ）及び陰窩分裂のパーセンテージ（図４Ｇ）の比較。（図４Ｈ）シャム及びＩＣＲ群における、Ｅｄｕを腸細胞増殖のマーカーとして使用する、免疫蛍光染色。ＥＣＡＤは上皮を染色するために使用される。（図４Ｉ）移植されたＨＩＯにおける、シャム及びＩＣＲ群間の、増殖指標（％）の比較。ここで、増殖指標＝Ｅｄｕ＋細胞数を腸陰窩内の合計細胞数で割ったもの。スケールバー、１００μｍ。グラフ中の値は、ｍｅａｎ±ｓ．ｅ．ｍ．を表わし、＊Ｐは０．０５未満、＊＊Ｐは０．０１未満、＊＊＊Ｐは０．００１未満、ｔ検定。シャム群：ｎ＝４、ＩＣＲ群：ｎ＝８。 図５Ａ～Ｆ。ＨＩＯ産生のタイムライン／概要、サイズ及び移植効率。（ａ）ｈＰＳＣからのＨＩＯの３５日間にわたる分化誘導を表わす概要。図５Ｂ。中心上皮、及び周囲の支持間葉（輪郭内）を表わす、移植前のＨＩＯの写真。図５Ｃ。移植前の、Ｉ型コラーゲン中に埋め込まれた１つのＨＩＯ（輪郭内）の相対サイズ。図５Ｄ。微細鉗子を使用する、腎被膜下のポケットの生成。図５Ｅ。腎被膜下に移植されたＨＩＯの写真。図５Ｆ。移植後の、６週タイムポイントにおける移植の効率を示す表。 人工多能性幹細胞からのＨＩＯは、生着し、ｉｎ ｖｉｖｏで成熟ヒト腸組織を形成する。図６Ａ。人工多能性幹細胞に由来するＨＩＯを使用する移植後６週間の移植物。図６Ｂ。絨毛及び中心毛細管を有する移植物の内腔表面を表わす、移植物の拡大画像。図６Ｃ。移植物内の上皮の拡大Ｈ&Ｅ（スケールバー１００μｍ）。陰窩－絨毛領域、並びに、粘膜固有層、粘膜筋板、粘膜下組織、及び層状の外側平滑筋層を含む上皮下組織の適切な層が存在していた。（図６Ｄ～Ｇ）。移植物中には、腸細胞（ビリン－ＶＩＬ）（スケールバー１００μｍ）（図６Ｄ）、杯細胞（ムチン－ＭＵＣ２）（図６Ｅ）、パネート細胞（リゾチーム－ＬＹＳＯ）（図６Ｆ）、及び腸内分泌細胞（クロモグラニンＡ－ＣＨＧＡ）（図６Ｇ）を含む、４つの腸系細胞すべてが存在していた。追加の上皮染色については、Ｅ－カドヘリン（ＥＣＡＤ）またはＣＤＸ２が使用された。（特定されている箇所を除き、全てのスケールバー５０μｍ）。 ６週における移植された組織の透過電子顕微鏡観察（ＴＥＭ）。図６Ａ。腸上皮表面上の刷子縁微絨毛のＴＥＭ画像。この画像においては、先端面付近に、密着及び接着結合もまた見られる（スケールバー５００ｎｍ）。図６Ｂ。ムチンを含有する分泌顆粒（白）を有する、杯細胞のＴＥＭ画像（スケールバー２μｍ）。図６Ｃ。細胞の基底側面上に放出の準備が整った分泌顆粒（暗）を有する、腸内分泌細胞のＴＥＭ画像（スケールバー２μｍ）。図６Ｄ。並行方向の平滑筋線維を有する、移植物内の平滑筋のＴＥＭ画像（スケールバー１０μｍ）。 移植されたＨＩＯ対ｉｎ ｖｉｔｒｏのＨＩＯにおける、追加の上皮及び間葉の成熟マーカー。（図８Ａ～Ｇ）ＥｐＣＡＭ（図８Ａ）、ビリン－ＶＩＬ（図８Ｂ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰＩ）（図８Ｃ）、リゾチーム（ＬＹＺ）（図８Ｄ）、クロモグラニンＡ（ＣＨＧＡ）（図８Ｅ）、ムチン（ＭＵＣ２）（図８Ｆ）、及びグルコーストランスポーター２（ＧＬＵＴ２）（図８Ｇ）を含む、上皮マーカーの相対的遺伝子発現の比較。（図８Ｈ～Ｉ）平滑筋マーカーである、デスミン（ＤＥＳ）（図８Ｈ）及び平滑筋アクチン（α－ＳＭＡ）（図８Ｉ）の相対的発現。グラフ中の値は、Ｍｅａｎ±ｓ．ｅ．ｍ．を表わし、ｎｓは、非有意。＊はｐは０．０５未満、＊＊はｐは０．０１未満、＊＊＊はｐは０．００１未満、ｉｎ ｖｉｔｒｏのＨＩＯ：ｎ＝４、移植物（Ｔｘｐ）：ｎ＝８。 移植された組織は、腸幹細胞により維持される成熟上皮を示した。（図９Ａ～Ｄ）ＬＧＲ５Ｒ５：ｅＧＦＰ ＢＡＣレポーターＥＳ株が確立され、ＬＧＲ５－ｅＧＦＰ細胞を発現するＨＩＯを作製するために使用された、図９Ａ。ＬＧＲ５－ｅＧＦＰ細胞（緑）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＨＩＯ内に、上皮の至る所に散在して見られた（図９Ｂ）。また、ＬＧＲ５－ｅＧＦＰ細胞（緑）は、移植されたヒト腸組織において、予期されるように、増殖型陰窩底部細胞中に局在している（ＫＩ６７との共局在）（図９Ｃ～Ｄ）。図９Ｅ。移植物の陰窩底部内に局在する、幹細胞マーカーＡＳＣＬ２（緑）の免疫蛍光染色。図９Ｆ。グラフは、移植前のｉｎ ｖｉｔｒｏでのＨＩＯ内の、及び移植物中における、ＬＧＲ５及びＡＳＣＬ２の、相対変化倍率を示した。図９Ｇ。組織の幹細胞性を示すため、移植された上皮からエンテロイドが作製された。図９Ｈ。パネルは、初めの播種後第１、５、及び１０日、並びに継代後における、移植物由来の上皮エンテロイドを示す。（図９Ｉ～Ｋ）。免疫蛍光染色は、ビリン（ＶＩＬ）及びＥ－カドヘリン（ＥＣＡＤ）（図９Ｉ）を有する上皮細胞の存在、並びに、パネート細胞（リゾチーム－ＬＹＳＯ）（図９Ｊ）及び刷子縁酵素（ジペプチジルペプチダーゼ４－ＤＰＰＩＶ）（図９Ｋ）の存在を明らかにした（全てのスケールバーは５０μｍ）。 移植された腸組織は、血液供給をネズミ血管の内殖から受けた。図１０Ａ。マウス特異的な汎内皮抗体（ｍＭＥＣＡ－３２）を使用して、移植物の表面のすぐ下の（図１０ｂ）、並びに移植物の内部中のネズミ血管を明らかにした（白矢尻、スケールバー５０μｍ）。図１０Ｃ。各絨毛内の血管、並びに移植物内で上皮のすぐ下の毛細管叢を有する、ｍＭＥＣＡ－３２染色された内皮（緑）の、拡大免疫蛍光画像。図１０Ｄ。マウス尾静脈によるＦＩＴＣ標識トマトレクチンの注射の後の、腎臓内移植物のホールマウント染色。輪郭内領域１及び２は、それに続く、移植物内の機能的蛍光ネズミ血管を表わす画像に対応する（スケールバー５０μｍ）。図１０Ｅ。移植物内上皮の、ネズミ特異的（ｍＭＥＣＡ－３２）及びヒト特異的（ｈＣＤ３１）染色を表わす、免疫蛍光画像。図１０Ｆ。ホールマウント移植物に対する共焦点画像は、マウス科血管とヒト血管との間の連結を示さなかった。図１０Ｇ。ネズミ特異的リンパ管マーカー（ＬＹＶＥ－１）は、ネズミホストからのリンパ管の内殖を示した。（特定される箇所を除き、全てのスケールバーは１００μｍ）。 ＮＳＧマウスにもまた、外科的切除、並びにＨＩＯ移植の後、腸の適合が起こる。図１１Ａ。切除後のマウス小腸における陰窩分裂（輪郭内）の拡大画像。（スケールバー５０μｍ）。図１１Ｂ。術後ＩＣＲ組織における、平滑筋層（筋層）の厚み増加（スケールバー５０μｍ）。図１１Ｃ。術前、シャム、及び切除（ＩＣＲ）群間の、ネズミ腸陰窩深度（μｍ）の比較。図１１Ｄ。術前、シャム、及び切除（ＩＣＲ）群間の、平滑筋層の厚み（μｍ）の比較。図１１Ｅ。シャムマウスにおけるＨＩＯ移植物中の腸上皮の拡大画像（スケールバー５０μｍ）。図１１Ｆ。ＩＣＲマウスにおけるＨＩＯ移植物中の陰窩分裂の拡大画像（スケールバー５０μｍ）。グラフ中に示される値はＭｅａｎ±ｓ．ｅ．ｍ．を表わす。ｎｓは、非有意。＊はｐは０．０５未満、＊＊はｐは０．０１未満、＊＊＊はｐは０．００１未満、術前群：ｎ＝１３、シャム群：ｎ＝１０、ＩＣＲ群：ｎ＝１１。 移植されたヒト腸組織は、消化及び吸収機能を維持した。図１２Ａ。腸アルカリホスファターゼは、ｅｘ ｖｉｖｏで活性を示した（スケールバー１００μｍ）。図１２Ｂ。Ｉｎ ｖｉｖｏで移植物に注射されたＦＩＴＣ－デキストラン（ＭＷ ４，４００）（写真は前と後に観察）は、ネズミ血清において、初めの３０分のタイムポイントから、４時間のタイムポイントと比較して、各マウス内で有意に増加した（ｎ＝７）。グラフ中に示される値はＭｅａｎ±ｓ．ｅ．ｍ．を表わし、ｎｓは、非有意、＊はｐは０．０５未満、＊＊はｐは０．０１未満、＊＊＊はｐは０．００１未満、対応のあるｔ検定。図１２Ｃ。移植物の上皮内のペプチドトランスポーター（ＰＥＰＴ１）染色を表わす、Ｄ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ－ＡＭＣＡペプチド取込み解析（スケールバー１００μｍ）。図１２Ｉ。媒体（ＤＭＥＭ溶液）、Ｄ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ－ＡＭＣＡ（ＤＭＥＭ＋標識ペプチド溶液）、及びカプトプリル＋Ｄ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ－ＡＭＣＡ（ＤＭＥＭ＋標識ペプチド溶液＋輸送溶液の競合阻害剤）の注射後の、上皮内の蛍光を表わす、追加の画像（各群についてｎ＝３）。標識ペプチド（ｉｉｉ）の注射後は蛍光が観察されたが、媒体注射（ｉｉ）では、または標識ペプチド＋カプトリル注射（ｉｖ）では、蛍光は殆どから全く観察されなかった。 ｉＰＳＣについての品質管理解析。標準的なフィーダーなしの条件で培養されたｉＰＳＣコロニーの位相コントラスト画像。図１３Ｂ。ｉＰＳＣにおける多能性マーカーＯｃｔ４及びＮａｎｏｇの免疫蛍光染色。図１３Ｃ。対象ｉＰＳＣの正常（４６、ＸＹ）核型を示す、Ｇバンド核型解析。図１３Ｄ。ｉＰＳＣ由来テラトーマのＨ&Ｅ染色切片は、３つの胚性胚葉、すなわち内胚葉、外胚葉、及び中胚葉から生じる組織を示した。対照テラトーマは、初期歯に一致する抗基底核を有する末梢上皮（外胚葉）、腸に一致する線毛円柱上皮（内胚葉）、及び軟骨細胞（中胚葉）により包囲される星状の細網細胞を示した。画像は、倍率４００倍である。 迷走神経様神経堤細胞（ＮＣＣ）の作製。１４Ａ－Ｈｏｘ遺伝子を発現する神経堤細胞を作製するためのプロトコールの略図。本方法は頭部ＮＣＣ９を生成することが報告されているが、ニューロスフェア培養の最後の４８時間の間のレチノイン酸の添加は、後部／迷走神経様ＮＣＣのマーカーである、Ｈｏｘ Ａ２、Ｂ３、Ｂ５、及びB７を誘導する。図１Ｂ－ＮＣＣは、星状の形態を示し、表面マーカーＨＮＫ－１、ｐ７５ＮＴＲ、及びＲＥＴが陽性であった。図１４Ｃ－神経板境界、及び神経堤細胞指定の調節因子の、定量的ＲＴ－ＰＣＲ解析。図１Ｄ－ニューロスフェアのＲＡでの４８時間にわたる処理は、迷走神経レベルのＨＯＸ遺伝子を発現するＮＣＣの形成をもたらす。より後部のＨＯＸ遺伝子Ｂ３、５、及び７は、用量依存的な発現レベルの上昇を示した（データ表示なし）。スケールバー１００μＭ。グラフ中の値はｍｅａｎ±ｓ．ｅ．ｍ．を表わし、＊Ｐは０．０１未満、＊＊Ｐは０．００１未満、スチューデントのｔ検定（両側、対応なし）、条件あたりｎ＝３の生物学的レプリケート、データは３つの独立な実験の代表。 図１５Ａ～Ｃ。発達中のＨＩＯ中へのＮＣＣのｉｎ ｖｉｔｒｏでの組み込み。図１５Ａ－ＨＩＯ中にＮＣＣを組み込むための概要。ＨＩＯ及びＮＣＣは別々に作製され、低速遠心法により併せられ、Ｍａｔｒｉｇｅｌ中に埋め込まれ、ｉｎ ｖｉｔｒｏで４週間育てられた。場合によっては、ＨＩＯはＮＳＧマウス中に移植され、ｉｎ ｖｉｖｏで６～８週間育てられた。図１５Ｂ－ＨＩＯのｉｎ ｖｉｔｒｏ成長。左パネル－２８ｄ ＨＩＯ＋／－ＮＣＣの明視野画像。スケールバー、１ｍｍ。中央パネル－神経（βＩＩＩ－チューブリン）及び上皮（Ｅ－カドヘリン）の免疫染色。右パネル－神経膠細胞（Ｓ１００＋）及び上皮（Ｅ－カドヘリン）の免疫染色。スケールバー、１００μｍ。データはＨＩＯをＮＣＣとｉｎ ｖｉｔｒｏで併合する１４の独立な実験の代表。図１５Ｃ－ＨＩＯ＋ＮＣＣのｉｎ ｖｉｖｏ成長。ＨＩＯ＋ＮＣＣが、ＮＳＧマウスの腎被膜下スペースへと移植され、６週間育てられた。左パネルは、直径～１ｃｍであったＨＩＯ＋ＮＣＣを示す。スケールバー、１ｍｍ。中央パネルは、ＨＩＯ－ＮＣＣ中で互いに直角に方向付けられる、筋腸間様配置での、平滑筋線維（デスミン＋）に隣接する神経形成を示し、ＥＮＳの非存在下で平滑筋の分化が起こることを示す。デスミン＋細胞の第二層は、上皮に対し粘膜下に位置する。ＨＩＯ＋ＮＣＣは、デスミン＋平滑筋層内に埋め込まれ、かつ筋腸間神経叢に非常に類似する構成を有する、神経（ＢＩＩＩ－チューブリン＋）を含有する。右パネルは、神経膠細胞（Ｓ１００＋）もまた、粘膜下層を含むＨＩＯ＋ＮＣＣの間葉層内に埋め込まれることを示す。 図１６Ａ～Ｂ。神経多様性、及びＣａｊａｌ間質細胞（ＩＣＣ）の形成。図１６Ａ。ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養されたＨＩＯ＋ＮＣＣ（上パネル）における、またｉｎ ｖｉｖｏでの移植後（下パネル）の、ＥＮＳ神経の神経化学マーカーを使用する、異なる神経細胞種の解析。ドパミン作動性神経（ＴＨ）、介在神経（ＣｈＡＴ、５－ＨＴ）、感覚神経（カルビンジン）、興奮性神経（カルレチニン）、及び抑制性神経（ｎＮＯＳ）は、いずれも、ｉｎ ｖｉｖｏ移植されたＨＩＯ＋ＮＣＣにおいて見られた。これに対し、ｉｎ ｖｉｔｒｏのＨＩＯ＋ＮＣＣは、抑制性神経（ｎＮＯＳ）を含有せず、これは本質的に胚性であったことを示唆する。図１６Ｂ。ｉｎ ｖｉｖｏでのＨＩＯ＋ＮＣＣにおけるＣａｊａｌ間質細胞（ＣＤ１７７－赤）の形成。ＮＣＣなしでのＨＩＯは、神経（ＢＩＩＩ－チューブリン－緑）を形成せず、より少ないＣＤ１１７＋細胞を有した。これは、ＩＣＣの分化には、ＮＣＣが関与しうることを示唆する。 図１７Ａ～Ｄ。ＨＩＯ＋ＮＣＣにおける神経活動のライブイメージング。図１７Ａ。ＧＣａＭＰ６ｆ発現性ＰＳＣから産生されるＮＣＣを、Ｈ１ ＰＳＣから産生されるＨＩＯと併合するための、プロトコールの略図。図１７Ｂ。神経堤由来のＥＮＳ細胞におけるＣａ２＋流動のライブイメージングは、周期的活動を示す。ＨＩＯ＋ＮＣＣ中の神経活動を示す、２０分間の低速度動画からのスナップショット。色付矢印は、ピクセル強度が経時的に測定され図１７Ｃにおいて示されるセルを指し示す。図１７Ｃ。番号付スナップショットは、図１７Ｂにおける矢尻に対応し、ＨＩＯ＋ＮＣＣ培養中の単一神経の脱分極の律動的な波を示す（最初の３つのタイムポイントのみが図１７Ｂには示された）。グラフは、Ｃａ２＋流動に関連するピクセル強度を測定する。線の色は、スナップショットにおける同色の矢尻に対応する。図１７Ｄ。ＫＣｌは、カルシウム流出の波を誘導する。ＫＣｌ実験からのピクセル強度の定量は、ＫＣｌが、速く幅広いＥＮＳ細胞の脱分極の波を誘導することを示す。 図１８Ａ～Ｃ。運動性を制御する３次元の粘膜下及び筋腸間神経叢の形成。図１８Ａ。ヒト腸、及びＨＩＯ＋ＥＮＳ組織の、ホールマウント免疫染色、及び３－Ｄイメージング。ヒト粘膜下組織及びＨＩＯ＋ＥＮＳの正面図で、平滑筋線維（デスミン）を統合し平滑筋線維（デスミン）とともに方向付けられる神経膠叢への、神経（ＢＩＩＩ－チューブリン）及び神経膠（Ｓ１００）のアレンジメントを示す。ＨＩＯ＋ＥＮＳ組織もまた、平滑筋線維とともに方向付けられる神経膠叢を含有した。図１８Ｂ－腸及び粘膜下神経叢の形成。左パネル－ｉｎ ｖｉｖｏ移植されたＨＩＯ＋ＮＣＣの正視図は、上皮（ｄａｐｉ－青）周辺での神経膠（Ｓ１００）の密接な連携を示す。右パネル－ホールマウント画像の側面図は、２つの神経叢を明確に同定する。１つは上皮粘膜と連携し（粘膜下神経叢）、もう１つは平滑筋の外層（筋腸間神経叢）と連携する。図１８Ｃ。ＨＩＯ中のＥＮＳは、蠕動様収縮を媒介する。Ｉｎ ｖｉｖｏで育てられた組織が、Ｔｙｒｏｄｅ溶液中へと外殖され、電界刺激（ＥＦＳ）にかけられた。高電圧ＥＦＳ（１００Ｖにて１ｍｓパルス）にかけられたＨＩＯ－ＥＮＳは、１つの単一収縮が起きた（ｎ＝２）。低電圧ＥＦＳ（５０Ｖにて１ｍｓパルス）にかけられたＨＩＯ＋ＥＮＳは、持続する一連の波様の収縮が起きた（ｎ＝５）。その持続する一連の波様の収縮は、組織がテトロドトキシン中で培養されると失われた（ＨＩＯ＋ＥＮＳ＋ＴＴＸ、ｎ＝２）。 図１９Ａ～Ｅ。収縮活動の、ＥＮＳ依存的、及び非依存的な制御。図６Ａ。移植されたＨＩＯ及びＨＩＯ＋ＥＮＳ組織片における、自発的収縮の記録。組織平衡化（刺激なし）後に相動性収縮が観察された。これは、Ｃａｊａｌ間質細胞（ＩＣＣ）がＨＩＯ（ｎ＝７）及びＨＩＯ＋ＥＮＳ（ｎ＝７）組織の両者に存在することを示唆する。図１９Ｂ。メチレンブルーでのＩＣＣ活性阻害が収縮性活動の喪失をもたらすことを示す記録（ｎ＝３）。図１９Ｃ－左パネルは、ＨＩＯ及びＨＩＯ＋ＥＮＳにおけるジメチルフェニルピペラジニウム（ＤＭＭＰ）刺激の、代表的な画像を示す。右パネルは、刺激前後に２分間にわたり測定された、ＤＭＰＰ（１０μＭ）刺激間の曲線下面積（ＡＵＣ）を示す（ｎ＝７）。図６Ｄ－ＥＮＳ活性化のＴＸＸ阻害。ＨＩＯ＋ＥＮＳにおける、刺激後に２分間にわたり測定された、ＤＭＰＰ刺激間の曲線下面積で、続いてテトロドトキシン（ＴＸＸ、１０μＭ）処理された（ｎ＝７）。図１９Ｅ－ＮＯ依存的メカニズムによる、ＥＮＳ依存的緩和。ＨＩＯ＋ＥＮＳにおける、刺激後２分間にわたり測定された、ＤＭＰＰ刺激間の曲線下面積で、続いてＮＧ－ニトロ－Ｌ－アルギニンメチルエステル（Ｌ－ＮＡＭＥ）処理された（ｎ＝７）。グラフ中の値はｍｅａｎ±ｓ．ｅ．ｍ．を表わし、＊Ｐは０．０５未満、＊＊Ｐは０．０１未満、Ｍａｎｎ&Ｗｈｉｔｎｅｙ検定。 発生中の神経堤細胞の特性決定。図２０Ａ。第６日の自由に浮遊しているニューロスフェアは、直径およそ５００μｍであり、ＰＡＸ６、ビメンチン、及びＳＯＸ９陽性である。これは、神経堤細胞、及び神経堤細胞が生じる外側神経板の特徴である。図２０Ｂ。ニューロスフェアはフィブロネクチン基質に接着し、明視野顕微鏡で可視である神経ロゼットを生じた。接着したニューロスフェアは広くにわたりＰＡＸ６を発現した一方、ビメンチン染色は、ＮＣＣが離層している神経ロゼットの縁にて観察された。ＮＣＣがロゼットから離れるように遊走すると、ＰＡＸ６は下方制御され、一方でＳＯＸ２発現は維持された。 ヒト及びヒヨコのＮＣＣの振る舞いの比較。（図２１Ａ及び図２１Ｂ）ヒヨコ胚からの頭部（Ｈｏｘ陰性）及び体幹（Ｈｏｘ陽性）ＮＣＣの単離及び培養、並びにＨｏｘ遺伝子発現の解析。前部ニワトリ神経管から単離されたＮＣＣはＨｏｘ遺伝子を発現しない一方、後部神経管から単離されたものはＨｏｘＢ７陽性であった。（図２１Ｃ）ニワトリ頭部ＮＣＣは、４８時間にわたり２μＭのＲＡで処理されると、迷走神経レベルのＨｏｘ遺伝子ＨｏｘＢ７及びＨｏｘＢ７を発現する。別の後部化因子であるＦＧＦ４は、Ｈｏｘ遺伝子発現には影響を及ぼさなかった。（図２１Ｄ）ヒトＰＳＣ由来のＮＣＣのニワトリ胚への移植を記す概要。ＧＦＰ標識されたヒトＮＣＣが、ＨＨ１０－１２ニワトリ胚へと体節間に卵内注入された。（図２１Ｅ）胚は、～ＨＨ３８にて解析された。ＧＦＰ標識細胞は、神経管（ＮＴ）に沿って側方に遊走し、前腸（ＦＧ）にてコロニー形成していることが見いだされた。（図２１Ｆ）ＧＦＰ標識細胞の末梢神経（ペリフェリン）への分化（背側が右、前部が上）。 頭部ＮＣＣ及びＲＡ処理ＮＣＣの分化ポテンシャル。図２２Ａ。ヒトＰＳＣ由来のＮＣＣの、神経膠系細胞、並びに間葉系細胞（骨細胞、及び軟骨細胞）へのｉｎ ｖｉｔｒｏ分化。頭部ＮＣＣ及びＲＡ処理ＮＣＣは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでは、同等に、神経膠系細胞（ペリフェリン、及びＧＦＡＰ）、骨細胞（アリザリンレッド）、及び軟骨細胞（アルシアンブルー）を形成する能力があった。図２２ｂ。頭部様ＮＣＣは、ｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏで色素上皮（矢尻）を形成し、これは神経上皮を形成する能力が維持されていることを示唆する。 ヒト腸オルガノイド（ＨＩＯ）の作製、及びＮＣＣ遊走合図の発現。図２３Ａ。ヒト多能性幹細胞の分化誘導により、ＨＩＯを作製する方法。図２３Ｂ。ＨＩＯ発生の各段階における分化マーカーの一時的発現。アクチビンＡは、胚体内胚葉（ＦＯＸＡ２及びＳＯＸ１７）への効率的な分化、ＷＮＴ活性化、並びに単一層及び自由に浮遊しているスフェロイドにおけるＦＧＦ４誘導性ＣＤＸ２発現を媒介した。Ｍａｔｒｉｇｅｌ中での４週間にわたるスフェロイドの育成は、ＣＤＸ２発現性ＨＩＯの形成をもたらした。ＨＩＯは、マウスの被膜下スペース中へと移植され、そこで６週間後には、成長して成熟し、陰窩及び絨毛を有する腸組織を形成した。ヒト特異的抗体ＨｕＮｕは、腸上皮及び間葉がヒト起源であることを示す。図２３Ｃ。Ｉｎ ｖｉｔｒｏで形成されたＨＩＯは、ＧＤＮＦ及びＥＤＮ３を発現した。グラフ中の値はｍｅａｎ±ｓ．ｅ．ｍ．を表わし、＊Ｐは０．０５未満、＊＊Ｐは０．０１未満、ｔ検定（両側、対応なし）、ｎ＝３（生物学的レプリケート）、データは２つの独立な実験の代表。 ＨＩＯ＋ＮＣＣ培養物における神経及び神経膠は、ＮＣＣ由来である。ＮＣＣが、ＧＦＰを広範に発現するＨ９－ＧＡＰＤＨ－ＧＦＰヒト胚幹細胞から作製され、Ｈ１ ＨＥＳＣから作製されたＨＩＯと併合された。ＨＩＯは、ＧＦＰ、及び汎神経マーカーＰＧＰ９．５または神経膠マーカーＳ１００で共染色された。ＨＩＯ＋ＮＣＣにおける神経膠細胞は、ＧＦＰと神経膠マーカーとの共発現により証明されるように、ＮＣＣ由来である。 神経節様構造が、ｉｎ ｖｉｖｏで育成されたＨＩＯ＋ＮＣＣにおいて形成する。（図２４Ａ）免疫染色された切片において、神経（ＢＩＩＩ－チューブリン）は筋腸間神経叢の至る所に広がっていた。また、出願人は、神経節に類似の、クラスター状の神経細胞体（ＨｕＣ／Ｄ）を観察した。（図２４Ｂ）。神経（ＢＩＩＩ－チューブリン、正面図）及び神経細胞体（ＨｕＣ／Ｄ、側面図）に対するホールマウント免疫染色は、ＨＩＯ＋ＮＣＣにおける、神経節様クラスターへと組織化された神経細胞体を示す。 移植されたＨＩＯ、及びＨＩＯ＋ＮＣＣ組織の、自発的収縮の記録。 （図２７Ａ）左パネルは、ＨＩＯ及びＨＩＯ＋ＮＣＣにおけるベラトリジン刺激の代表的な記録を示す。右パネルは、刺激の前後２分間にわたり測定された、ベラトリジン（３μＭ）刺激間の曲線下面積（ＡＵＣ）を表わす（ｎ＝５）。（図２７Ｂ）刺激の前後２分間にわたり測定された、ジメチルフェニルピペラジニウム（ＤＭＭＰ、１０μＭ）刺激間の曲線下面積を表わし、続いてテトロドトキシン（ＴＸＸ、１０μＭ）処理された（ｎ＝３）。（図２７Ｃ）刺激後２分間にわたり測定された、ＤＭＭＰ刺激間の曲線下面積を表わし、続いてＮＧ－ニトロ－Ｌ－アルギニンメチルエステル（ＬＮＡＭＥ）処理された（ｎ＝３）。（ｄ）左パネル、ＨＩＯ（ｎ＝４）及びＨＩＯ＋ＮＣＣ組織（ｎ＝１４）の両者における、ニトロプルジドナトリウム（ＳＮＰ）刺激後の代表的な記録。右パネル、刺激前後２分間にわたり測定された、ＳＮＰ刺激間の曲線下面積。グラフ中の値はｍｅａｎ±ｓ．ｅ．ｍ．を表わし、Ｍａｎｎ&Ｗｈｉｔｎｅｙ検定。

胃腸（ＧＩ）管の腸神経系（ＥＮＳ）は、運動性、上皮浸透性、及び流体交換を制御する。ＥＮＳ発生または機能における不調は一般的であるが、ＥＮＳ－腸の生物学を研究するためのヒトモデルが欠如している。

出願人は、ヒト胚幹細胞（ＥＳＣ）または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から、ｉｎ ｖｉｖｏで生着しうるヒト腸オルガノイド（ＨＩＯ）を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで作製した。これらのＨＩＯは、腸幹細胞を有する成熟腸上皮を形成する。その腸幹細胞は、陰窩絨毛構造、及び層状のヒト間葉に寄与し、その両者がマウス血管内殖により支持される。出願人は、ｉｎ ｖｉｖｏ移植が、上皮及び間葉の著しい増殖及び成熟をもたらすことを示した。これは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＨＩＯと比較した場合の、異なる腸細胞系列（腸細胞、杯細胞、パネート細胞、刷子細胞、及び腸内分泌細胞）、機能的刷子縁酵素（ラクターゼ、スクロースイソメラーゼ、及びジペプチジルペプチダーゼ４）の存在、並びに可視の上皮下及び平滑筋層により示された。出願人はさらに、移植された腸組織が、浸透性及びペプチド取込み実験により証明される、消化機能を呈することを示した。移植されたＨＩＯ由来組織は、回盲部切除後、ホストマウスからの全身性シグナルに応答することが分かった。このことは、腸の適応応答において、循環性因子が役割を有することを示唆する。

出願人はさらに、機能的ＥＮＳを有する、ヒトＰＳＣ由来の腸組織を開発した。機能的ＥＮＳを含有するヒト腸組織を作製するため、多能性幹細胞（ＰＳＣ）を用いる組織工学的手法を使用して、出願人は、ＰＳＣ由来の神経堤細胞（ＮＣＣ）を発生中のヒト腸オルガノイド（ＨＩＯ）と併合することにより、正常な腸ＥＮＳ発生を再現した。

出願人は、ＮＣＣは単独で培養された場合にはｉｎ ｖｉｔｒｏでは完全な分化ポテンシャルを有することを発見したが、ＨＩＯと併合されると、神経及び神経膠細胞へと分化した。ＮＣＣ由来のＥＮＳ神経は、発生中の腸間葉内で自己集合することが分かり、またカルシウム移行の律動的な波によって測定される神経活動を呈した。Ｉｎ ｖｉｖｏで成育されたＥＮＳ含有性ＨＩＯは、筋腸間及び粘膜下神経叢に類似する神経膠構造を形成し、Ｃａｊａｌ間質細胞を形成し、また伝播する収縮を制御する電気機械共役を有した。これは、機能的ＥＮＳを有する、ヒトＰＳＣ由来腸組織の、初めての実証である。

腸神経系（ＥＮＳ）は、ＧＩ運動性、分泌、血流、上皮バリア浸透性、及び流体交換に必須である。発生的には、ＥＮＳの大部分は、背側神経管から派生する迷走神経堤細胞（ＮＣＣ）から生じ、腹側性に遊走し、ヒトにおいては胚の第４週頃に前腸にコロニー形成する。続いて、ＮＣＣは大規模に増殖し、尾側に遊走し、ヒト妊娠７週までには全ＧＩ管にコロニー形成する。腸ＮＣＣが適切に遊走、増殖、生存、及び／またはＧＩ管において分化しそこねると、ＥＮＳの構造及び機能における欠陥が生じ、幅広い腸神経障害を有する患者が生じる。さらに、腸神経障害は、炎症性腸疾患などの消化器疾患においてよくみられ、またしばしば、パーキンソン病、糖尿病、及び加齢変性症などの疾患において二次的に起こる。腸神経障害の生理病理学的過程を研究するためのヒトＥＮＳモデルシステムの欠如は、その診断及び治療の進歩が驚くほど遅いことを説明しうる。腸神経節の先天的欠如であるヒルシュスプルング病（１：５０００生児出生）を有する患者の長年の治療は、神経節欠如性の腸部位の外科的切除を必要とし、残される正常腸は非常に少ない。残りの腸は神経節を含有するが、これらの患者の多くがなぜ腸炎及び運動障害の発作の再発に苦しむのかは未明である。多能性幹細胞（ＰＳＣ）、腸前駆細胞、またはさらにはＣＮＳ神経管細胞由来の、腸神経が、神経節欠如性ヒヨコ及びネズミＧＩの外殖物に組み込まれ、かつ機能することが示されてきた。これは、類似のアプローチが治療的にヒトで機能するかもしれないことを示唆する。

細胞ベースの治療への進歩の存在にもかかわらず、ヒトＥＮＳ発生及び疾患の我々の理解に関しては、まだ多くの仕事が残っている。腸神経障害の因果関係に関しては殆ど分かっておらず、神経多様性の形成などの、ヒトＥＮＳ発生の様々な側面を駆動するメカニズムが、はっきりしないままである。現在ヒトＥＮＳ発生を機能的に研究する方法は存在しないが、ヒト多能性幹細胞の分化誘導を使用する最近の進歩は、オルガノイドと呼ばれる複雑で生理的な３Ｄヒト器官培養物の形成をもたらした。オルガノイドモデルは、いくつか挙げるだけでも、腸、肝臓、胃、ＣＮＳ、甲状腺、及び肺について開発され、また前例のないヒトの発生生物学及び疾患の研究を可能にしてきた。オルガノイドの顕著な複雑性にもかかわらず、それらオルガノイドは、完全な器官機能に必要な細胞及び組織種が欠如している。例えば、いずれのオルガノイドシステムも、統合された末梢神経系を含有しない。

本明細書において開示されるように、出願人は、機能的腸神経系を含有する３Ｄヒト腸オルガノイド（ＨＩＯ）の開発を示した。ＰＳＣは、まず迷走神経様神経堤細胞（ＮＣＣ）へと分化させられ、それから、腸管形成からおおよそＥＮＳによる胚腸の正常なコロニー形成に対応する段階にある、発生中の腸培養物中へと導入された。生じるＨＩＯは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで８週間未満育成されてもよく、発生中の胎児腸に類似し、カルシウム移行の律動的及び刺激による波が可能である多様な神経の集団を有する。Ｉｎ ｖｉｖｏで移植されると、ＨＩＯは、粘膜下、及び筋腸間平滑筋層に囲まれた陰窩及び絨毛を有する、複雑で成熟した腸上皮を形成した。ＥＮＳを有するＨＩＯは、粘膜下及び筋腸間神経膠神経叢の両者を形成した。神経叢は、平滑筋層中へと統合される、神経節間線維のネットワークを有する、神経細胞体の束を含有した。Ｉｎ ｖｉｖｏで育成されたＥＮＳを有するＨＩＯの電界刺激は、神経毒テトロドトキシンで遮断される、伝播する運動性の波を誘発した。組織片の器官槽実験は、さらに、ＥＮＳを有するＨＩＯにおいて、機能的な一酸化窒素作動性神経－筋共役を示した。従って、出願人の発明は、完全にヒト多能性幹細胞に由来する機能的腸神経系を有するヒト腸組織のｉｎ ｖｉｔｒｏでの作製の、最初の証拠であると信じられる。

一態様においては、血管が張り巡らされている中空器官を作製する方法が開示される。この態様においては、その方法は、ａ）ヒト腸オルガノイド（ＨＩＯ）を免疫不全の生物に移植する工程を有しうる。その免疫不全の生物は、例えば哺乳類、例えば免疫反応を有さない哺乳類、例えば重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）を有する哺乳類である。ＨＩＯは、ヒト胚幹細胞（ＥＳＣ）、及び／または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から得られうる。一態様においては、移植する工程の間に、ＨＩＯが成熟腸組織を形成する。

一態様においては、ヒト腸オルガノイド（ＨＩＯ）は、コラーゲン中に埋め込まれうる。一態様においては、そのコラーゲンはＩ型コラーゲンでありうる。

移植する工程は、免疫不全生物の辞意像被膜中へのＨＩＯの移植を含みうる。その移植する工程は、少なくとも約三週間、または少なくとも約四週間、または少なくとも約五週間、または少なくとも約六週間の期間にわたり実施されうる。本工程に関する持続期間は、当業者により決定されうる。移植工程は、例えば、腸組織が１つまたはそれより多い基準を満たすまで実施されうる。そのような基準は、例えば、支持間葉により囲まれる円柱腸上皮を有すること、直径１ー３ｃｍの成長、機能的腸細胞を含有する絨毛及び陰窩の形成、平滑筋線維の粘膜下及び筋腸間層を有すること、またはこれらの組合せを含みうる。

一態様においては、機能的腸神経系（ＥＮＳ）を含有するヒト腸組織を作製する方法が開示される。本態様においては、その方法は、ａ）ヒトＥＳ細胞及び／またはｉＰＳ細胞（ｉＰＳＣ）由来の迷走神経様神経堤細胞（ＮＣＣ）を三次元のヒト腸オルガノイド（ＨＩＯ）と接触させる工程、並びにｃ）ｉｎ ｖｉｖｏで前記ＨＩＯを移植する工程を有しうる。一態様においては、ＮＣＣは、ヒトＥＳ細胞、及び／またはｉＰＳ細胞をレチノイン酸に接触させることにより得られうる。本態様においては、レチノイン酸は、後部化を引き起こすのに十分な量で、ヒトＥＳ細胞及び／またはｉＰＳ細胞に、接触させられる。いくらかの態様においては、レチノイン酸は、ヒトＥＳ細胞及び／またはｉＰＳ細胞に、約１から約２日、またはいくらかの態様においては約２日の期間にわたり、接触させらうる。レチノイン酸接触工程は、ニューロスフェア段階において約二日の期間にわたり、またはＨＯＸＢ３、ＨＯＸｂ５、及び／またはＨＯＸｂ７の十分な発現が観察されるまで、実施されうる。

一態様においては、移植する工程は、神経、及び／または神経膠の検出を可能にするのに十分な時間にわたり、実施されうる。一態様においては、神経はＢＩＩＩ－チューブリンを有しうる。更なる態様においては、神経膠はＳ１００を有する。さらに更なる態様においては、神経及び神経膠は、平滑筋層（デスミン＋細胞）中に統合しうる。一態様においては、移植する工程はｎＮＯＳ＋抑制性神経の形成を可能にするのに十分な期間にわたり実行されうる。

一態様においては、本明細書において開示される機能的腸神経系（ＥＮＳ）を含有するヒト腸組織は、収縮活動が可能でありうる。

胃腸管の一部の置換を要する患者を治療する方法がさらに開示される。その方法は、その患者の胃腸管の一部を、本明細書において開示の方法に従って作製されたヒト腸組織と置換する工程を有しうる。更なる態様においては、ヒト腸管に対する治療の効果を決定する方法が開示され、その方法は、目的である治療を、本明細書において開示の方法に従って作製されたヒト腸組織と接触させる工程を有しうる。出願人により提供されたモデルは、腸の生理学、疾患、及び／またはトランスレーショナルな研究の実験に有用でありうる。

実施例－多能性幹細胞を使用する、ヒト小腸のｉｎ ｖｉｖｏモデルの開発
ｉｎ ｖｉｖｏ ＨＩＯモデルを確立するため、出願人は、以前に開示された（Ｓｐｅｎｃｅ， ｅｔ ａｌ， Ｎａｔｕｒｅ ２０１１、ＭｃＣｒａｃｋｅｎ ｅｔ ａｌ， Ｎａｔ． Ｐｒｏｔｏｃ． ２０１１）ように、ヒトＥＳＣまたはｉＰＳＣからＨＩＯを作製した。分化プロセスは約３５日かかり（図１Ａ及び図５Ａ）、支持間葉に包囲される円柱腸上皮を有するＨＩＯを産生した（図１Ｂ及び図５Ｂ）。それから出願人は、ＨＩＯをＩ型コラーゲン中に埋め込み、それを免疫不全の非肥満糖尿病性重症複合型免疫不全症インターロイキン－２Ｒγｎｕｌｌ（ＮＳＧ）マウスの腎被膜下に移植し、６週間にわたり成熟かつ成長させた（図１Ａ及び図５Ｄ、１Ｅ）。回収時点では、ＨＩＯは大きさとしてかなり、上向きに体積が５０から１００倍大きく成長しており（図１Ｃ、図１Ｄ、並びに図５Ｃ及び図６Ａ）、高度に血管が張り巡らされていた（図１Ｃ）。とりわけ、移植されたＨＩＯの９２．４％が、腎被膜化にきちんと生着した（図５Ｆ）。組織の目視検査は、それぞれが各自の中心毛細管ネットワークを有する粘膜充満性内腔とよく発達した絨毛シートとを有する（図１Ｅ）、腸の形態を示した（図１Ｄ）。組織学的には、移植された組織は、粘膜固有層、粘膜筋板、並びに粘膜下及び外側平滑筋層を含む、陰窩－絨毛構造とその下に広がる層状の粘膜下層を有する、天然のヒト腸に類似した（図２Ａ及び図６Ｃ）。移植されたｉｎ ｖｉｖｏの組織は、そのｉｎ ｖｉｔｒｏの対照物（データ表示なし）との比較では、より成熟しかつ分化しているように見え、陰窩－絨毛軸の適切な領域内に配置される、腸細胞、杯細胞、パネート細胞、腸内分泌細胞、及び刷子細胞を含む、全ての主な腸細胞系列を有した（図２Ｂ～Ｄ、及び図６Ｄ～Ｇ）。パネート細胞は、上皮の至るところに散在するのではなく、予期されたように陰窩底部内に配置されていた（図２Ｂ、２Ｃ）。透過型電子顕微鏡図（ＴＥＭ）は、よく発達した密着結合を有する刷子縁を示し、それはｉｎ ｖｉｔｒｏのＨＩＯのそれと同様であった（図７Ａ）。しかしながら、移植物の上皮内に見られるような成熟杯細胞及び腸内分泌細胞（図７Ｂ、Ｃ）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏのＨＩＯのＴＥＭにおいては存在していなかった（データ表示なし）。上皮内において、出願人は、移植物をｉｎ ｖｉｔｒｏのＨＩＯと比較すると、上皮細胞種に特徴的な遺伝子の相対発現の増加を観察した（図８Ａ～Ｇ）。出願人は、移植物内の血管はマウス特異的汎内皮細胞抗原（ｍＭＥＣＡ－３２）について陽性染色されることを発見した（図２Ｅ）。移植された組織は、また、５－エタニル－２'－デオキシウリジン（Ｅｄｕ）取込みにより明らかになるように、個別の陰窩内において活発に増殖していた（図２Ｆ）。腸幹細胞を追跡するためにトランスジェニックのヒトＬＧＲ５レポーターＨＩＯを使用し、発明人は、活発に増殖する標識幹細胞が、ＨＩＯ内に存在し、移植物の陰窩の底部に局在することを発見した（図９Ａ～Ｄ）。さらに、移植された組織は幹細胞マーカーＡＳＣＬ２を発現し（図９Ｅ～Ｆ）、また発明人は移植物の上皮由来のエンテロイドを作製することができ、このことはさらに腸幹細胞プールの存在を示す（図９Ｇ～Ｋ）。これらのデータは、ｉｎ ｖｉｖｏでの移植の後、ＨＩＯが成熟腸組織への相当な成熟を経ることを示唆する。

隣接する間葉と腸上皮との間のクロストークは、ＧＩ発生の間、主な役割を果たすことが知られている。以前に、支持間葉はｉｎ ｖｉｔｒｏのＨＩＯの腸上皮に沿って発達し、上皮下筋線維芽細胞、線維芽細胞、及び平滑筋細胞の未熟集団を含有することが示された。出願人は、ＨＩＯ間葉が、また、ｉｎ ｖｉｖｏでの移植の後、より成熟で分化した細胞種へと発達したかを調べた。移植組織の非上皮領域は、間葉マーカーであるビメンチン（ＶＩＭ）について陽性染色され、α－平滑筋アクチン（α－ＳＭＡ）陽性の明瞭な平滑筋層を含むいくつかの層状上皮下層を含有し、このことは生着に間葉の寄与があることを示す（図２Ｇ）。更に、α－ＳＭＡとＶＩＭとの二重染色は、ヒト小腸上皮幹細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ増殖を支持することが知られる、腸上皮下筋線維芽細胞（ＩＳＥＭＦ）の陰窩周囲鞘を示した（図２Ｇ）。同様に、腸上皮は、粘膜固有層、ＩＳＥＭＦ、及び粘膜筋板を含む上皮下間葉層の発達のための適切なシグナルを伝え、上皮化組織の適切な層状化を引き起こすことが示されている（図２Ａ、２Ｇ）。平滑筋層の組織学的な成熟に加え、デスミン及びα－ＳＭＡの相対発現は、ｉｎ ｖｉｔｒｏのＨＩＯと比較してｉｎ ｖｉｖｏで移植されたＨＩＯにおいては増加していた（図８Ｈ、８Ｉ）。移植物のＴＥＭは、成人腸の場合と類似する、平行方向の平滑筋を呈した（図７Ｄ）。これらのデータは、ヒト腸組織の移植及び成熟の成功には間葉ニッチの存在が必要であるという、刊行された報告書と一致する。例えば、間葉成分の欠如は生着不成功を引き起こしたが、一方で上皮と共に間葉系細胞を含めると生着は成功した。

我々の移植物は、内皮細胞を含む様々な間葉系細胞種を含有したため、出願人は次に、どの成分がヒト起源で、どの成分がホストからであるかを調べた。予期した通り、ＨＩＯ上皮は完全にヒト起源であり、ヒト核抗原（ＨｕＮｕ）に対して陽性染色された（図２Ｈ）。さらに、粘膜固有層、粘膜筋板、粘膜下組織、及び平滑筋層を含む間葉起源の組織の大部分もまた、ＨｕＮｕに対して陽性染色された（図２Ｉ）。これに対し、血管の大部分は、ｍＭＥＣＡ－３２に陽性染色されたため、マウス由来であった（図２Ｅ）。移植されたＨＩＯの血液供給は、ＦＩＴＣ結合トマトレクチンの尾静脈注射での内皮の陽性標識により示されるように、マウス血管により支持されていた（図１０Ａ～１０Ｄ）。移植物中にヒト特異的汎内皮細胞抗原について陽性であるヒト起源の血管は殆どなく、そのような血管はマウス血管系とは連結していなかった（図１０Ｅ、１０Ｆ）。リンパ管はマウス起源であり、マウス特異的リンパ管内皮ヒアルロナン受容体１（ＬＹＶＥ－１）について陽性染色された（図１０Ｇ）。

ＰＳＣ由来の膵臓前駆細胞の移植は、ｉｎ ｖｉｖｏでの膵島細胞の発達を増強することが示されている。出願人は、ｍＲＮＡ及びタンパク質の両レベルで成熟上皮のいくつかのマーカーの発現を測定することにより、ｉｎ ｖｉｖｏ成育の、我々の６週における移植物の成熟度に対する影響を、類似のタイムポイント（３５日＋ｉｎ ｖｉｔｒｏで６週）におけるｉｎ ｖｉｔｒｏのＨＩＯと比較して、解析した。出願人は、ｉｎ ｖｉｔｒｏのＨＩＯと比較して、ジペプチジルペプチダーゼ４（ＤＰＰＩＶ）、２型グルコーストランスポーター（ＧＬＵＴ２）、スクロースイソマルターゼ（ＳＩＭ）、及びビリン（ＶＩＬ）を含む、分化した腸細胞に特徴的なマーカーのｍＲＮＡ及び／またはタンパク質発現の顕著な増加を観察した（図３Ａ、３Ｂ、３Ｅ、３Ｆ、３Ａ、図８Ｂ、８Ｇ）。さらに、出願人は、刷子縁酵素であるアルカリンホスファターゼ（ＡＬＰＩ）及びラクターゼ（ＬＣＴ）、並びに、腸内分泌（胃抑制ペプチド（ＧＩＰ）、及びクロモグラニンＡ（ＣＨＧＡ））、杯（ムチン２（ＭＵＣ２））、及びパネート細胞（ＬＹＳＯ）を含む分泌細胞種のマーカーもまた調べた。これら各マーカーについて、移植されたＨＩＯにおいては、ｍＲＮＡ及びタンパク質発現も顕著に増加していた（図３Ｃ、３Ｄ、３Ｇ、及び図８Ｃ～８Ｆ）。従って、出願人は、ｉｎ ｖｉｖｏ成育が、腸組織の成熟を促進すると結論付けた。

ｉｎ ｖｉｖｏ移植されたＨＩＯの成熟表現型をふまえ、出願人は、これらの組織が、ヒト腸のｉｎ ｖｉｖｏ生理学を研究するための新規モデルとしての意味があるかもしれないと仮定した。従って、出願人は、移植したＨＩＯが腸切除により誘発される生理学的合図に応答できるかを調べた。腸の順応応答には液性因子が関与することが示唆されてきた。血管吻合により並体結合関係にあるラットにおいて、一方のラットにおける外科的切除は並体結合パートナーにおける腸増殖をもたらした７。しかしながら、ヒト腸でこの現象を調べるために利用できるモデルは存在しない。ここで、出願人は、腸切除に応答して刺激される循環性の液性因子が、腎臓における移植されたヒト腸組織に影響を与えうるかを調べるため、移植をうけたマウスにおける回盲部切除（ＩＣＲ）のモデルを使用した。出願人は、我々の移植後６週間タイムポイントにあるＨＩＯ移植物を有するマウスを、無作為にシャム（切開、及び再吻合）またはＩＣＲ群に分け、陰窩深さ、絨毛高さ、上皮増殖、陰窩分裂、並びに輪走性及び縦走性平滑筋層（筋層）の厚さを含む、腸順応に関連する形態計測要素を定量化した（図４Ａ）。ＮＳＧマウスにおける順応が確認され、シャム及びＩＣＲ群間で、絨毛高さ、陰窩分裂（図４Ｂ～４Ｄ）、陰窩深さ、及び平滑筋層厚さ（図１１Ａ～１１Ｄ）については顕著な差が伴い、一方で、増殖指標においてはシャム及びＩＣＲ群間で差はなかった（データ表示なし）。移植されたＨＩＯにおいては、ＩＣＲは、シャム手術群と比べ、絨毛高さ、陰窩分裂（図４Ｅ～４Ｇ、及び図１１Ｅ、１１Ｆ）、及び増殖指標（図４Ｈ、Ｉ）を増加させた。これら発見は、移植されたＨＩＯが液性因子に応答するという仮説を支持する。さらに、本モデルは、腸切除後の液性順応応答における識見を提供しうる。機能的には、移植されたＨＩＯは、活性刷子縁酵素を発現し、またＦＩＴＣ－デキストランを用いる浸透性解析により示されるように、機能的腸上皮バリアを呈した（図１２Ａ、１２Ｂ）。移植されたＨＩＯはまた、ペプチド取込みが可能で、これは吸収機能の存在を反映している（図１２Ｃ）。

我々の知識では、これは、ｉｎ ｖｉｖｏでのｈＰＳＣ由来のヒト小腸についての機能的モデルの開発の最初の報告である。我々の研究は、ＥＳＣ及びｉＰＳＣ両者の、移植後に成熟する多様な細胞種及び組織層を生成する潜在能力を強調する。さらに、マウスホストにおける外科的切除後の我々のヒト移植物において見られる順応応答は、この順応応答における液性因子の役割を支持し、また更なるヒト小腸のｉｎ ｖｉｖｏ研究のための我々のモデルの使用を確証する。ＨＩＯは、「個別化」し、機能的ヒト腸を生体工学操作するための方法としての役割を果たすため、更なるトランスレーショナルな研究により、短腸症候群及び他の胃腸疾患の最終的な治療のための手段としても役立ちうる。

方法
動物
全ての実験において、８～１６週齢の免疫不全ＮＯＤ－ＳＣＩＤ ＩＬ－２Ｒγｎｕｌｌ（ＮＳＧ）マウスが使用された（Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｍｏｕｓｅ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙ、Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ、Ｏｈｉｏから入手）。全てのマウスは、Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ Ｃｈｉｌｄｅｎ'ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ （ＣＣＨＭＣ）の動物施設にて収容された。全ての実験は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ ＣＣＨＭＣの承認を伴って行われた。

ヒト腸オルガノイドの作製、及び維持
ヒト腸オルガノイドは、以前に開示されたように作製され維持された（Ｓｐｅｎｃｅ ｅｔ ａｌ， Ｎａｔｕｒｅ ２０１１、及びＭｃＣｒａｃｋｅｎ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ． Ｐｒｏｔｏｃ． ２０１１）。ヒト胚幹細胞、及び人工多能性幹細胞は、フィーダー無し条件で、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でコートされた６ウェルＮｕｎｃｌｏｎ表面プレート（Ｎｕｎｃ）中で育成され、ｍＴＥＳＲ１培地（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で維持された。胚体内胚葉（ＤＥ）の誘発については、ヒトＥＳまたはｉＰＳ細胞がＤｉｓｐａｓｅまたはＡｃｃｕｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して継代され、Ｍａｔｒｉｇｅｌコート性Ｎｕｎｃｌｏｎ表面の２４ウェルプレート中に、ウェルあたり１００，０００細胞の密度でプレートされた。Ａｃｃｕｔａｓｅで継代した細胞については、１０μＭの化合物Ｙ２７６３２（Ｓｉｇｍａ）が初日に培地に添加された。細胞は、８０～９５％のコンフルエンスに達するまで増殖させられた。それから細胞は、以前に開示されたように、１００ｎｇ ｍｌ－１のアクチビンＡで３日間処理された（Ｄ'Ａｍｏｕｒ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２００５）。ＤＥはそれから、中後腸スフェロイドの形成を誘発するために、後腸誘発培地（ＲＰＭＩ １６４０、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、２％ 非補完性ＦＢＳ、ペニシリン－ストレプトマイシン、及び１００ｎｇ ｍｌ－１ アクチビンＡ）で４日間、５００ｎｇ ｍＬ－１ ＦＧＦ４（Ｒ&Ｄ）及び３μＭ Ｃｈｉｒｏｎ９９０２１（Ｔｏｃｒｉｓ）と共に処理された。スフェロイドはそれから、ヒト腸オルガノイド（ＨＩＯ）を作製するため、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ）中にプレートされ、１００ｎｇ ｍｌ－１ ＥＧＦ（Ｒ&Ｄ）及び１００ｎｇ ｍｌ－１ Ｎｏｇｇｉｎ（Ｒ&Ｄ）で補足された腸成長培地（Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ－１２、Ｎ２、Ｂ２７、１５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、ペニシリン－ストレプトマイシン）中で維持された。培地は、第３日において交換されてＮｏｇｇｉｎが除去され、それ以降は週に１回交換された。ＨＩＯは、１４日ごとに、新しいＭａｔｒｉｇｅｌ中に再度プレートされた。

人工多能性幹細胞株の作成と特性解析
ｉＰＳＣ作製には、線維芽細胞が、リプログラミング因子Ｏｃｔ４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、ｃＭｙｃ、及びｄＴｏｍａｔｏ２８を共発現する、組換えＶＳＶ－Ｇ偽型多シストロン性レンチウィルス粒子でトランスダクションされた。ヌクレオフェクションされた線維芽細胞はそれから、ｈＥＳＣ適性Ｍａｔｒｉｇｅｌ上にプレートされ、トランスダクション後３～５日に、ＭＥＦ培地がｍＴｅＳＲ１に置換され、次いで培養物はｍＴｅＳＲ１で毎日フィードされた。～３週間後、推定上のｉＰＳＣコロニーが同定され、５分間Ｄｉｓｐａｓｅに暴露された。個別のコンロニーが手動で切り取られ、Ｍａｔｒｉｇｅｌコート性ディッシュ上でｍＴｅＳＲ１中に再度プレートされた。典型的なｈＥＳＣ様形態を有するいくつかの株がそれから、Ｍａｔｒｉｇｅｌコート性ディッシュ上でｍＴｅＳＲ１中で独立に増殖させられられた。継代には、ｉＰＳＣが５分間Ｄｉｓｐａｓｅに暴露され、洗浄され、そして再度プレートする前に穏やかにすりつぶされた。ｉＰＳＣ株は、ｍＦｒｅＳＲ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で凍結保存された。全ての培養物は、５％ ＣＯ２／空気環境中で維持された。本研究の全てのｉＰＳＣを用いる実験は、機関のＥｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｏｖｅｒｓｉｇｈｔ（ＥＳＣＲＯ）により承認された。

多能性マーカー発現の解析には、ｉＰＳＣ培養物は１０分間、室温にて３．７％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳ中で固定された。細胞はそれから、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含有するＰＢＳで１０分間、透過処理され、室温にて３０分間、ブロッキング緩衝液（１０％正常ロバ血清を含むＰＢＳ）中でインキュベートされた。ヒトＯｃｔ４（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ｓｃ－５２７９）、及びＮａｎｏｇ（Ａｂｃａｍ、ａｂ２１６２４）に対する抗体が、１：５００にてブロッキング緩衝液中で希釈され、細胞と共に一晩４℃にてインキュベートされた。蛍光標識された二次抗体とのインキュベーションの後、培養物は蛍光顕微鏡を使用して可視化された。核の対比染色には４'６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）が使用された（図１３Ａ、１３Ｂ）。ｉＰＳＣの標準的なＧバンド核型解析は、Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ'ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｍｅｄｉｃａｌ ＣｅｎｔｅｒにおけるＣｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙにて実施された。少なくとも２０の中期が解析された（図１３Ｃ）。ｉｎ ｖｉｖｏ分化能の解析は、テラトーマ解析により評価された。未分化ｉＰＳＣは、免疫不全ＮＯＤ／ＳＣＩＤ ＧＡＭＭＡ Ｃ－／－マウスへと皮下注射された。テラトーマは６～１２週間以内に形成した。テラトーマは切除され、固定され、パラフィン中に埋め込まれ、切片化され、組織学的調査のためにＨ&Ｅで染色された（図１３Ｄ）。

ＬＧＲ５：ｅＧＦＰ ＢＡＣトランスジェニックレポーターｈＥＳＣ株の作製
ＬＧＲ５：ｅＧＦＰ細菌人工染色体（ＢＡＣ）トランスジェニックレポーターｈＥＳＣ株が作製された。概要としては、ＢＡＣ ＲＰ１１－５９Ｆ１５が、Ｃｈｉｌｄｒｅｎ'ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｏａｋｌａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ｈｔｔｐ：／／ｂａｃｐａｃ．ｃｈｏｒｉ．ｏｒｇ／）から入手され、ＳＷ１０５３５細胞中で増殖された。単一コロニーがＬＢ＋ｃａｍ中で３２℃にて増殖され、組換えタンパク質が２０分間にわたる４２℃でのインキュベーションにより誘発された。組換えカセットは、ｅＧＦＰ－ＦＲＴ－ＰＧＫｇｂ２－ｎｅｏ／ｋａｎ－ＦＲＴ、ＬＧＲ５中の５０ｂｐの相同性領域、及びｐｅＧＦＰ－ＰＧＫｎｅｏに対する２０ｂｐ相同性領域からなった。相同性領域は、ＬＧＲ５のイニシエーターメチオニンをｅＧＦＰのそれと置換するように選択され、それにウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル、及び上下流がＦＲＴに隣接するカナマイシン／Ｇ４１８耐性カセットが続いた。組換えカセットはＳＷ１０５細胞中へと電気穿孔され、ｃａｍ及びカナマイシン（ｋａｎ：５０μｇ ｍｌ－１）を有するプレート上で細胞が選択された。クローンはＰＣＲにより正しく標的化されたＬＧＲ５ ＢＡＣについて解析され、シークエンシングにより確認され、Ａｍａｘａ Ｈｕｍａｎ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｓｔａｒｔｅｒ Ｋｉｔを使用して、Ｈ９ ｈＥＳＣの単細胞懸濁液中にヌクレオフェクションされた。細胞は、Ｇ４１８（２００ｎｇ ｍｌ－１）中で２週間かけて選択された。Ｇ４１８耐性細胞は、永久に抗生物質中で維持された。

ヒト腸オルガノイドの移植
ＮＳＧマウスは、抗生物質性固形飼料（２７５ｐ．ｐ．ｍ．スルファメトキサゾール、及び１３６５ｐ．ｐ．ｍ．トリメトプリム；試験飼料）で維持された。手術の前及び後に、食料及び水が適宜与えられた。３５日間ｉｎ ｖｉｔｒｏで成熟させられた単一ＨＩＯがＭａｔｒｉｇｅｌから除去され、冷リン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ、Ｇｉｂｃｏ）で洗浄され、精製Ｉ型コラーゲン（ラット尾コラーゲン、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中に手術の１２時間前に埋め込まれ、固化ゲルプラグを形成させた。これらのプラグはそれから、標準的な成長培地中に、１００ｎｇ ｍｌ－１ ＥＧＦ（Ｒ&Ｄ）で補足された腸成長培地中に（Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ－１２、Ｂ２７、１５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、ペニシリン－ストレプトマイシン）一晩配置された。ＨＩＯはそれから腎被膜下に移植された。簡潔には、マウスが２％吸入イソフルラン（Ｂｕｔｌｅｒ Ｓｃｈｅｉｎ）を用いて麻酔され、それからマウスの左側がイソプロピルアルコール及びポビドンヨードで無菌的に前調整された。小さな左後部の粘膜下切開がなされ、腎臓を露出した。被膜下ポケットが作成され、コラーゲンに埋め込まれたＨＩＯがポケット内に配置された。それから腎臓が腹腔に戻され、マウスはＺｏｓｙｎ（１００ｍｇ／ｋｇ、Ｐｆｉｚｅｒ Ｉｎｃ．）のＩＰ洗浄を受けた。皮膚は二層に封鎖され、マウスは、Ｂｕｐｒｅｎｅｘ（０．０５ｍｇ／ｋｇ、Ｍｉｄｗｅｓｔ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｓｕｐｐｌｙ）の皮下注射を受けた。移植から６週間後、それからマウスは人道的に安楽死させられ、またはさらなる実験の対象とされた。

移植されたマウスにおける腸切除
６週間前にＨＩＯが移植されたオスＮＳＧマウスが無作為に回盲部切除（ＩＣＲ）またはシャム手術に割り当てられた。マウスは、手術の２４～４８時間前に液体飼料（Ｊｅｖｉｔｙ １Ｃａｌ、Ａｂｂｏｔｔ）下に置かれ、残りの実験の間にわたり、抗生物質性固形飼料から飲料水中の液体抗生物質（２００ｍｇスルファメトキサゾール、及び４０ｇトリメトプリム経口懸濁液、５ｍＬ－１、Ｈｉ－Ｔｅｃｈ Ｐｈａｒｍａｃａｌ）（０．３ｍｇ ｍＬ－１トリメトプリム）に切り換えられた。手術は上で開示のような麻酔下で遂行され、腸を露出するため、マウスの腹が前側で切開された。以前に開示２６されたように、回盲部に加え、平均１３．６ｃｍの最遠位小腸が除去された。マウスは手術後４８時間にわたり３０℃のインキュベーター中で保管され、それから手術後第７日に安楽死させられた。

移植物由来エンテロイドの培養
ヒトエンテロイドは、以前に開示１２、２９されたように作製された。簡潔には、移植物が採取され、切開され、粘膜層を上向きにピン止めされ、それから冷ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）中で濯がれた。組織はそれから２ｍＭ ＥＤＴＡ（ＥＤＴＡ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を含むＰＢＳへと移され、氷上で３０分かけて揺すられた。ＥＤＴＡキレート化の後、組織は再び冷ＰＢＳ中で洗浄され、陰窩が、その下に広がる粘膜化組織から取り除かれ、それから１００μｍ細胞ストレーナー（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を通してフィルタリングされた。陰窩はそれからペレット化され、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で再懸濁され、ＥＧＦ（５０ｎｇ ｍＬ－１）、Ｎｏｇｇｉｎ（１００ｎｇ ｍＬ－１）、Ｒ－スポンジン１（１μｇ ｍＬ－１）（Ｒ&Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、５０％Ｗｎｔ３ａ馴化培地、１ｍＭ Ｎ－アセチルシステイン、１０ｎＭ（Ｌｅｕ１５）－ガストリン、１０ｍＭ－Ｎｉｃｏｔｉｄａｍｉｄｅ、１０μＭ ＳＢ２０２１９０（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、５００ｎＭ Ａ－８３－０１（Ｔｏｃｒｉｓ）で補足された腸成長培地（Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ－１２、Ｎ２、Ｂ２７、１５ｎＭ ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、ペニシリン－ストレプトマイシン）で覆われた。２．５μＭチアゾビビン、及び２．５μＭ ＣＨＩＲ９９０２１（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）が、最初の２日間に渡り培地に添加された。培地は３日ごとに交換された。確立したエンテロイドは、培養７日後、酵素的（ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、及び１８ゲージの針を通じての機械的解離により、時間をかけて継代された。解離されたエンテロイドはそれから、ＰＢＳ中で再懸濁され、Ｍａｔｒｉｇｅｌ中での再懸濁前にペレット化され、培養条件は上記の通りである。

腸アルカリホスファターゼ活性
凍結切片がＰＢＳ中で洗浄され、ロバ血清を用いてブロッキングされた。切片はＰｅｒｍａｎｅｎｔ Ｒｅｄの使用溶液（Ｐｅｒｍａｎｅｎｔ Ｒｅｄ基質＋Ｐｅｒｍａｎｅｎｔ Ｒｅｄ色素原、Ｄａｋｏ）で３０分間にわたり室温にてインキューベートされた。切片はそれからＰＢＳで洗浄され、イメージングのためにマウントされた。

Ｉｎ ｖｉｖｏ ＦＤ４浸透性解析
ＦＩＴＣ結合デキストラン（ＦＤ４、４４００ ＭＷ、 Ｓｉｇｍａ）が、最終濃度２０ｍｇ ｍｌ－１にて無菌水中に溶解された。それから、８週間前の移植物を有するマウスが上で開示されたように麻酔をかけられ、左の腎臓を露出するために左後部の肋骨下の切開がなされ、腸組織を移植した。それからヒト移植物が、それぞれ１００μＬのＦＤ４とともに注射された。それから、注射後３０分及び４時間のタイムポイントにおいて、ヘパリン化ヘマトクリット毛細管チューブを使用して全血が採取され、ネズミ血清中の蛍光強度が蛍光プレートリーダーを使用して解析された。それから、ＦＩＴＣ－デキストランの濃度が、水に溶解された場合のＦＩＴＣ－デキストラン標準曲線との比較により決定された。

ｉｎ ｖｉｖｏ トマトレクチン注射
フルオレセインＬｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ（トマト）レクチン（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）が、最終濃度２ｍｇ ｍｌ－１にてＰＢＳ中に再懸濁させられた。ＨＩＯ移植後８週間に、マウスは上で開示のように麻酔下におかれ、各々が尾静脈から２００μｌのトマトレクチンが注射された。それから注射から３０分後にマウスは人道的に安楽死させられ、組織がイメージングのために回収された。

ｉｎ ｖｉｖｏ Ｄ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ－ＡＭＣＡ取込み実験
Ｄ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ－７－アミド－４－メチルクマリン（Ｄ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ－ＡＭＣＡ、Ｓｉｇｍａ）が、以前に開示３０された方法に修正を加えて、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ、Ｇｉｂｃｏ）中最終濃度２５μＭとなるように調整された。マウスが上に開示のように麻酔をかけられ、移植物を露出するために左後部の肋骨下の切開がなされた。それから移植物内腔に１００μＬのＤ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ－ＡＭＣＡ注入され、マウスは二層状に封鎖された。マウスは注入後３０分に安楽死させられ、解析のために組織が回収された。比較のため、移植物に、媒体（ＤＭＥＭ溶液）のみ、またはペプチド取込みの競合阻害剤カプトプリル１ｍＭ（Ｓｉｇｍａ）と混合されたペプチド溶液もまた、注入された。

組織処理、免疫蛍光、及び顕微鏡法
組織は、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）中で２時間から一晩にわたり固定された。オルガノイド移植物はＯＣＴ中で凍結され、マウス腸組織はパラフィン中に埋め込まれた。ＯＣＴ切片は、ロバ血清（１０％血清を含む１ｘＰＢＳ＋０．５％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ）を使用して３０分かけてブロッキングされ、第一抗体と共に４℃にて一晩インキュベーションされた。それからスライドは洗浄され、ブロッキング緩衝液中の第二抗体中で室温（２３℃）にて２時間インキュベーションされた。パラフィン切片は、脱パラフィン化され、抗原賦活化を受け、ＯＣＴ切片と似たように染色が行われた。抗体及びそれぞれの希釈度のリストについては、表１を参照してください。それからスライドは、洗浄され、ＰｒｏＬｏｎｇ Ｇｏｌｄ抗褪色剤を使用してＤＡＰＩ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｎｏｌｏｇｉｅｓ）とともにマウントされた。画像は、Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔｉ上でキャプチャーされ、Ｎｉｋｏｎ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｎｉｋｏｎ）を使用して解析された。透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）については、組織は、３％グルタルアルデヒドを含む０．１７５Ｍカコジル酸ナトリウム緩衝液ｐＨ ７．４中で一晩固定された。試料はそれから、１％四酸化オスミウムを含む０．１７５Ｍカコジル酸緩衝液中で、４℃にて１時間かけて固定された。試料は、洗浄され、一連の段階的エタノール（２５、５０、７５、９５、２ｘ１００％）に通された。浸潤は２ｘ酸化プロピレエンを用いて行われ、続いてＬＸ－１１２を用いて段階的浸潤が行われた。試料は３７℃の重合化オーブン中に一晩配置され、それから６０℃にて３日間にわたり保管された。ＴＥＭ切片をイメージ化するためには、Ｈｉｔａｃｈｉ Ｈ７６００透過型電子顕微鏡が使用された。ホールマウント染色については、組織が上記と同様に処理され、それからＭｕｒｒａｙ溶液中できれいにされた。イメージングは、Ｎｉｋｏｎ Ａ１共焦点顕微鏡を用いて実施された。

ＲＮＡ単離、及びＲＴ－ｑＰＣＲ
ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、製造元のプロトコールに従って抽出された。ｃＤＮＡを合成するためには、ｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）が使用された。それからＴａｑｍａｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）遺伝子発現アッセイが、ＯｎｅＳｔｅｐサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、トリプリケートの試料に対して実施された。使用されたＴａｑｍａｎプローブのリストについては、表２を参照。

形態計測、及び統計解析
組織切片は、ヘマトキシリン及びエオジンで染色され、あるいは（上に開示のように）免疫組織化学が行われた。全ての組織試料は、盲検的に計数された。陰窩深さ、絨毛高さ、及び平滑筋層（筋層）の厚さが、最小でマウスあたり１００の、良い方向を向いている陰窩－絨毛単位または平滑筋層区画について測定され、それからＮｉｋｏｎ ＮＩＳイメージングソフトウェアを使用して平均が求められた。１匹あたり少なくとも１００の完全な形の陰窩から、分裂している陰窩のパーセンテージを決定するために、縦断面を使用して、陰窩分裂もまた同様に計算された。分裂している陰窩とは、共有される単一の陰窩－絨毛接合部を有する２つの（または場合によってはそれより多い）フラスコ形の底部を生じる二分する亀裂を有する、二叉に分かれている陰窩と定義される（図２３Ａ、Ｆ）。マウスに５－エチニル－２'－デオキシウリジン（Ｅｄｕ）を殺処分の２時間前に注射し、それから、製造元の指示に従う通例のＥｄｕ免疫組織化学を行うことにより増殖指標が決定された。増殖指標は、少なくとも１０の完全な形の陰窩内におけるＥｄｕ陽性細胞対全細胞の比を計算することにより決定された。全データはｍｅａｎ＋ｓ．ｅ．ｍ．として表わされている。ｔ検定、及び二元配置分散分析は、Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用して遂行された。決定された有意性カットオフ値はＰは０．０５未満であった。試料サイズを前もって決定するためには統計の方法は使用されなかった。

ＩＣＲ実験を除き、実験は盲検的には行われなかった。ＩＣＲ実験においては、移植を受けた動物が無作為にシャムまたはＩＣＲ群に割り当てられた。ＩＣＲ実験のための形態計測解析を除き、実験及び結果評価の際、割り当てについて研究者は盲検的ではなかった。

実施例－機能的腸システムを有する組織の発生
迷走神経堤細胞の作成
頭部及び体幹（迷走と仙髄との両方）ＮＣＣは、Ａ－Ｐ軸に沿う別々の領域から発出し、発生中の胚の異なる領域でコロニー形成する。例えばＥＮＳは、迷走ＮＣＣから派生する。従って、ＥＮＳを有するヒト腸オルガノイドを生成するには、出願人は、迷走ＮＣＣがより適切な開始起源であろうと仮説をたてた。ＰＳＣの頭部ＮＣＣへの分化を誘導するための多数の方法が報告されている９、１０ことをふまえ、出願人は、まず、通常のＮＣＣ発達を模倣する段階的方法で頭部ＮＣＣを作製することにより始めた（図１、図２０）。以前にも報告されたように、ＰＳＣから派生した頭部ＮＣＣは、胚発生の間の頭部ＮＣＣと類似の方式で、ステージ特異的な分子マーカーを発現した。それは、初期神経上皮ステージにおけるＳｏｘ２、Ｐａｘ３、及びＰａｘ７、並びに遊走神経堤細胞におけるＨＮＫ－１、Ｓｏｘ１０、Ｓｎａｉｌ２、及びビメンチンを含む。

神経管のより後部領域から来る迷走ＮＣＣを作製するため、出願人は、分化プロセス中の初期ステージにおいて後部運命を促進することが知られるシグナリング経路を操作した。出願人は、Ｍｉｃａ ｅｔ ａｌ．による観察と同様に、ニューロスフェアステージにおける２日間のレチノイン酸（ＲＡ）は、迷走神経レベルのＨｏｘ遺伝子、ＨＯＸＢ３、ＨＯＸＢ５、及びＨＯＸＢ７の強い発現を引き起こすが、ＦＧＦ４ではそのようにならない（データ表示なし）ことを発見した（図１４Ｄ）。出願人は、後部Ｈｏｘ遺伝子ｈｏｘｂ７がヒヨコ胚から単離された体幹／迷走ＮＣＣにおいて発現されていることを確認した（図２１Ａ及び２１Ｂ）。さらに、脊椎動物の発生の際の迷走ＮＣＣのパターン形成におけるＲＡの既知の役割と一致して、ＲＡは、ヒヨコ頭部ＮＣＣにおいて迷走Ｈｏｘ遺伝子発現を誘発することができた（図２１Ｃ）。

神経堤細胞の分化ポテンシャル
多能性ＮＣＣは、神経、神経膠、及びメラニン細胞を含む外胚葉派生物、並びに、骨細胞及び軟骨細胞を含む頭部中胚葉系細胞を形成しうる。ＮＣＣが多能性の分化ポテンシャルを維持したかを調べるため、出願人は、ＮＣＣの、様々な外胚葉性間葉系細胞への分化をｉｎ ｖｉｔｒｏで誘導した（図２２Ａ）。ＮＣＣは、成長因子の回収にあたり、ｉｎ ｖｉｔｒｏでペリフェリン＋神経、及びＧＦＡＰ＋神経膠細胞へと分化することができた。ＰＳＣ由来のＮＣＣは、それぞれアリザリンレッド及びアルシアンブルーについての陽性染色により示されるように、骨細胞及び軟骨細胞を含む中胚葉系細胞へと分化することもできた。出願人は、ＮＣＣのｉｎ ｖｉｔｒｏ分化ポテンシャルに対する、ＲＡ処理による大きな違いは観察しなかった。これは、ＰＳＣ由来の頭部及び迷走／Ｈｏｘ陽性ＮＣＣ集団の多能性が維持されていたことを示唆する。出願人はさらに、ヒヨコ胚へとＰＳＣ由来ＮＣＣを注射することにより、ＰＳＣ由来ＮＣＣが胚環境において神経堤細胞の振る舞いをするかどうかを調べた。ＰＳＣ由来ＮＣＣは、内因性のＮＣＣに類似の遊走経路をたどり、神経へと分化した（図２１Ｄ～２１Ｆ）。

ＮＣＣ由来の神経膠細胞を用いるヒト腸オルガノイド（ＨＩＯ）のｉｎ ｖｉｔｒｏでの作製
出願人は以前に、まずは胚体内胚葉へ、それから３Ｄ腸組織へと発展させられる中／後腸管スフェロイドへの段階的分化をたどって、ヒトＰＳＣを腸オルガノイドへと分化させるための方法を開発した（Ｓｐｅｎｃｅ ｅｔ ａｌ．， ＭｃＣｒａｃｋｅｎ ｅｔ ａｌ．（図２３））。Ｉｎ ｖｉｔｒｏでは、ＨＩＯは、全ての主な腸上皮細胞種、並びに、上皮下筋線維芽細胞及び平滑筋細胞を含有する層状間葉を含有する。ＨＩＯは、腎被膜下スペースへと移植されると、発生を続け、陰窩及び絨毛、機能的腸幹細胞、並びに平滑筋層を有する、よく分化した腸組織を形成する（図２３Ｂ）。

ＨＯＰは、発生中の腸において見られる、上皮及び間葉系細胞種の殆どを含有したが、ＥＮＳを含有しなかった。発生中のＨＩＯにＮＣＣ／ＥＮＳ前駆体を組み込むため、出願人は機械的に中／後腸スフェロイドをＰＳＣ由来ＮＣＣとともに低速遠心法により凝集させ、凝集物を３次元成長条件中に２８日間にわたり移した（図１５Ａ）。ＮＣＣ有りまたは無しのＨＩＯは、サイズは同等であった（直径１～２ｍｍ）。しかしながら出願人は、ＮＣＣと組み合わせられたＨＩＯの間葉内に埋め込まれた、たくさんのβＩＩＩ－チューブリン（ＴＵＪ１）＋神経、及びＳ１００＋神経膠を検出した。出願人は、ｉｎ ｖｉｔｒｏではＮＣＣ無しのＨＩＯにおいては、神経は稀にしか検出せず、また神経膠は全く検出しなかった。さらに、出願人は、恒常的にＧＦＰを発現するＰＳＣ株から派生したＮＣＣを使用することにより、神経膠細胞のＮＣＣ起源性を確認した（図２４）。ＨＩＯ＋ＮＣＣ中の上皮、間葉、及び神経膠細胞間の空間的関係は、ヒト胎児腸及びＥ１１．５マウス小腸にとてもよく似ていて（データ表示無し）、これはＨＩＯ中の内在性合図が発生中のＥＮＳ細胞を組織化するのを助けることを示唆する。これと一致して、ＨＩＯは、腸間葉へのＮＣＣ遊走を調節することが知られる、２つの重要な化学誘引因子であるＧＤＮＦ及びＥＤＮ３の両方を、発現した（図２３Ｃ）。このことは、ＨＩＯ間葉へのＰＳＣ由来ＮＣＣの組み込みが、正常な発生経路を活用したかもしれないことを示唆する。

ｉｎ ｖｉｖｏ成長後のＥＮＳの成熟
我々の以前の研究は、上記かつＷａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ ２０１１に開示のように、マウスに移植されｉｎ ｖｉｖｏで６～１０週間かけて成長させられたＨＩＯは、血管が張り巡らされ、直径１～３ｃｍにまで成長し、また機能的な腸幹細胞を含有する絨毛及び陰窩を有する非常に成熟した腸組織を形成することを示した（図１７Ｂ）。さらに、ＨＩＯ間葉は、平滑筋線維の粘膜下及び筋腸間層へと成熟する（図１５Ｃ）。移植されたＨＩＯ＋ＰＳＣ由来ＮＣＣの解析は、神経（βＩＩＩ－チューブリン）及び神経膠（S１００）が、平滑筋の粘膜下及び筋腸間層に近接する複数の層へと組織化されたことを明らかにした（図１５Ｃ）。出願人は、ＮＣＣ無しの移植されたＨＩＯにおいては、神経または神経膠を検出しなかった。これらの実験は迷走神経／ＨＯＸ陽性ＮＣＣ集団を用いて実施されたが、ＰＳＣ由来の頭部／ＨＯＸ陰性ＮＣＣもまた、生着しＥＮＳ神経膠細胞を形成する能力を有した。しかしながら頭部ＮＣＣは、より幅広い多能性を有することと一致して、色素上皮細胞（図２２Ｂ）、及び軟骨（表示なし）も形成した。

ＨＩＯ＋ＮＣＣにおける神経多様性及び機能
ＥＮＳは、興奮性及び抑制性の神経サブタイプ、並びに介在神経の、複雑なネットワークである。ｉｎ ｖｉｔｒｏで４週間にわたり培養されたＨＩＯ＋ＮＣＣにおける神経マーカーの調査は、顕著な度合いの神経多様性を示唆した。出願人はチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、カルビンジン、カルレチニン、及びセロトニン（５－ＨＴ）陽性細胞を観察し、これらはドーパミン作動性、興奮性、及び介在神経により発現された（図３Ａ）。しかしながら、出願人は、ｉｎ ｖｉｔｒｏではｎＮＯＳ陽性神経を検出しなかった。これに対し、ｉｎ ｖｉｖｏ移植されたＨＩＯ＋ＮＣＣは、たくさんのｎＮＯＳ＋神経を有し、これはＥＮＳがｉｎ ｖｉｖｏ成長の期間中に成熟したことを示唆する。移植されたＨＩＯ＋ＮＣＣにおいては、多くの神経が、平滑筋と連係しているようであった。さらに、ＥＮＳ神経は、Ｃａｊａｌ間質細胞（ＩＣＣ）のマーカーであるＣＤ１１７を発現している細胞と連係していた（図１６Ｂ）。ＩＣＣはＥＮＳを欠如するＨＩＯ中に存在したが、ＨＩＯ－ＮＣＣ中にはＣＤ１１７発現細胞のクラスターはより少ないように見え（データ表示なし）、このことはＥＮＳ細胞とＩＣＣとの間の発生性相互作用を示唆する。

ｉｎ ｖｉｔｒｏで成育されたＨＩＯの利用可能性は、我々がＣａ２＋センサーＧＣａＭＰ６ｆ１９を用いるライブイメージングを使用して神経の機能性を試験することを可能にした。これを行うために、出願人はＨＩＯを作製し、ＧＣａＭＰ６を含有するＰＳＣ株から派生したＮＣＣをＨＩＯに組み込んだ（図１７Ａ）。Ｉｎ ｖｉｔｒｏで８週間にわたり成育されたＨＩＯ中の神経活動のイメージングは、神経内の、幅広、自発的、かつ急速なカルシウム移行を検出した。個々の神経がモニタリングされると、３～４秒／神経の範囲のカルシウム流出の明らかな周期性が存在した（図１７Ｂ及び１７Ｃ）。神経が同調的な活動に耐えることが可能かを調べるため、出願人は、ＨＩＯ＋ＧＣａＭＰ６発現性ＮＣＣをＫＣｌ（３０ｍＭ）に露出し、神経のカルシウム流出の大きな波を観察した（図１７Ｄ）。

ｉｎ ｖｉｖｏで育成されたＨＩＯ＋ＮＣＣにおける、神経膠叢の形成
ＥＮＳ神経及び神経膠の組織学的解析は、これらがＨＩＯの平滑筋層内で神経叢を形成していることを示唆した。しかしながら、この結論は、切片化された組織の２次元の性質をふまえると、難しい。ゆえに出願人は、神経、神経膠、及び平滑筋マーカーを使用して、ホールマウント免疫蛍光により、ｉｎ ｖｉｖｏで成熟したＨＩＯ＋ＮＣＣからの組織の３次元イメージングを実施し、それらをヒト小腸と比較した（図１８）。ヒト小腸のＥＮＳは、平滑筋層（デスミン＋細胞）中へと統合される、神経（ＢＩＩＩ－チューブリン）及び神経膠（Ｓ１００）のネットワークを含有した。発達中のＨＩＯ内で形成したＥＮＳは、平滑筋線維とともに配向するように見える、神経及び神経膠の複雑な神経叢を同様に含有した（図１８Ａ）。ＨＩＯ＋ＮＣＣ試料の３Ｄ画像の側面図は、筋腸間叢（図１８Ｂ）、並びに上皮に隣接する粘膜下組織中に配置される神経叢の証拠を明確に示した（青－ｄａｐｉ）。出願人はまた、切片及び３Ｄイメージングの両方において、神経細胞体クラスターをも観察し（図２５）、これは神経節を暗示する。ヒト腸と比較すると、ＨＩＯ中の神経節はより小さく、またより発達していなかった。

ＥＮＳ媒介性の収縮性活性
ＨＩＯ＋ＥＮＳ組織中の上皮、平滑筋、神経、及び神経膠の組織化はヒト腸のそれと同様であったが、ＨＩＯ＋ＥＮＳ組織中に神経筋交信が存在したかは明らかではなかった。ＰＳＣ由来ＥＮＳがＨＩＯ組織中で機能しうるかを判断するため、出願人は、腎移植物をＴｙｒｏｄｅ溶液中に外殖し、腎移植物に電界刺激を受けさせた（図１９Ｃ）。１００Ｖ（高電圧）における単一の１ｍｓパルスが与えられたＥＮＳ無しのＨＩＯ組織は、単一の収縮を引き起こし、このことは平滑筋収縮の直接的刺激を示唆する。これに対し、５０Ｖ（低電圧）における単一の１ｍｓパルスが与えられたＥＮＳを含有するＨＩＯ組織は、持続する収縮の波を引き起こした。収縮がＥＮＳの活動ゆえであるかを決定するため、出願人は、神経上の電位作動性Ｎａ＋チャネルに結合するテトロドトキシン（ＴＴＸ）で神経活動を遮断し、アクションポテンシャルの発火を阻害した。ＴＴＸは、低電圧刺激の、ＨＩＯ＋ＮＣＣ組織において運動を引き起こす能力を完全に阻害した。

ＨＩＯ＋ＮＣＣ組織における神経筋連結
ＧＩ運動は、ＥＮＳ依存性及び非依存性の収縮と、平滑筋の弛緩との共同作用が必要とする。これらの過程をより良く分析するため、出願人は、ＨＩＯ、及びＨＩＯ＋ＮＣＣからの組織片を単離し、器官チャンバー実験を使ってその組織片を解析した。神経刺激の非存在下では、出願人は、ＨＩＯ及びＨＩＯ＋ＮＣＣ組織の両者において、両条件においてＩＣＣが存在することに一致して（図１６Ｂ）、自発的な位相性の収縮を観察した（図１９Ａ、及び図２６Ａ）。ＩＣＣ活動を阻害するメチレンブルーは、位相性収縮を消失させた（図１９Ｂ）。収縮及び弛緩におけるＥＮＳ依存的役割を同定するため、出願人は、選択的α３ニコチン性受容体ゴニストであるジメチルフェニルピペラジニウム（ＤＭＰＰ）、及び、Ｎａ＋チャネル不活性化を阻害することにより神経興奮可能性を増加させるベラトリジンを使用して、神経を活性化させた。ＥＮＳの薬学的活性化は、ＨＩＯ＋ＮＣＣ組織の弛緩を誘発したが、ＨＩＯ単独においては誘発しなかった（図６Ｃ、及び図２５Ａ）。出願人は、ＴＴＸを使用して弛緩が神経依存的であることを確認した。ＴＴＸは、ＤＭＰＰ及びまたはベラトリジンに応答して筋肉弛緩を誘発する神経の能力を阻害した（図１９Ｄ、及び図２７Ｂ）。

出願人は、ＥＮＳにより誘発された平滑筋弛緩の要因となった推定上の神経メディエーターを同定することを目指した。一酸化窒素（ＮＯ）は良く知られた腸の抑制性神経メディエーターであるため、またｎＮＯＳ発現性神経は移植されたＨＩＯ＋ＮＣＣ組織中に豊富に存在するため（図１６）、出願人は、ＮＧ－ニトロ－Ｌ－アルギニンメチルエステル（Ｌ－ＮＡＭＥ）を用いてＮＯ合成を阻害した。Ｌ－ＮＡＭＥ前処理はＤＭＰＰ刺激後の弛緩を有意に減少させた。従って、ＮＯは弛緩を誘発するために神経により生産されたことを示す（図１９Ｅ、及び図２７Ｃ）。出願人は、ニトロプルジドナトリウム（ＳＮＰ）を使用してＮＯ放出をさらに刺激し、ＨＩＰ＋ＮＣＣ組織における平滑筋の弛緩を観察した（図２７Ｄ）。

方法
細胞株、及び培養条件
ヒトＥＳ及びｉＰＳ細胞、Ｈ１（ＷＡ－０１）、Ｈ９（ＷＡ－０９）、及びＷＴＣ１１ ＡＡＶＳ１－ＣＡＧ－ＧＣａＭＰ６ｆが、未分化の状態で、フィーダー無しでＭａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で維持された。Ｈ９－ＧＡＰＤＨ－ＧＦＰ ｈＥＳＣは、ＴＡＬＥＮにより促進される相同組換え３４を組み込んだ標準的手順３３を使用して、ＧＦＰをコードする配列をＧＡＰＤＨ遺伝子の３'－ＵＴＲにターゲティングすることにより、作製された。ＧＦＰは、直近でＧＡＰＤＨのＣ末端と隣接するＴ２Ａ ３５偽融合タンパク質として発現された。

細胞は、ｍＴｅＳＲ１培地がフィードされ、Ｄｉｓｐａｓｅ ＩＩ（Ｇｉｂｃｏ）を使用して定期的に継代された。ＥＮＳを含有するＨＩＯを作製するため、ＮＣＣ及びＨＩＯが作製され、腸分化の初期ステージにおいて併合された。簡潔には、ＮＣＣ作製には（図１）、ｈＰＳＣが、コロニーを剥離するため、ｍＴｅＳＲ１中で６０分間にわたりコラゲナーゼＩＶ（５００Ｕ／ｍＬ）処理された。コラーゲンを除去するために細胞が洗浄され、それから穏やかにすりつぶされ、非ＴＣ処理ペトリ皿上で、神経誘発培地中に再懸濁された。神経誘発性培地は毎日交換され、レチノイン酸（２μＭ）が後部化のために第４及び５日に添加された。第６日の自由に浮遊しているニューロスフェアが、フィブロネクチン（３μ／ｃｍ２）上にプレートされ、ＲＡ無しの神経誘発培地が４日間フィードされた。遊離細胞は、簡単なＡｃｃｕｔａｓｅ処理（２～３分）を使用して採取され、フィブロネクチン上へと継代され、あるいはＨＩＯと併合させるためにすぐに使用された。ＮＣＣは、本質的には神経膠９及び間葉系細胞３６について開示したように分化させられた。出願人は、上で開示のプロトコールに類似する我々の以前のプロトコールと同様でＨＩＯを作製したが、とりわけ、ＷＮＴ３Ａの代わりに低分子ＣＨＩＲ９９０２１を使用した（図２２）。腸管スフェロイドの形成後、出願は、スフェロイド＋／－ＮＣＣを穏やかに遠心し、Ｍａｔｒｉｇｅｌ中に埋め込んだ。培養物は、１００ｎｇ ＥＧＦ ｍＬ－１で補足された基本的な腸培地（ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２、１ｘＢ２７サプリメント、１ｘＮ２サプリメント、１０μＭ ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１ｘＰｅｎ－Ｓｔｒｅｐ）がフィードされ、ｉｎ ｖｉｔｒｏで最大８週間維持された。

ＨＩＯのｉｎ ｖｉｖｏ移植、及び電界刺激
ＨＩＯ＋／－ＮＣＣは、上記及びＷａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．において開示のプロトコールに従い、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ－ｇａｍｍａ（ＮＳＧ）の腎被膜中へと異所的に移植された。簡潔には４～６週間のＨＩＯが、コラーゲン中に埋め込まれ、腎被膜下スペース中へと移植された。移植されたＨＩＯは、移植から６～１０週後に採取され、神経または神経膠マーカーについて解析され、あるいは電界刺激（ＥＦＳ）実験に使用された。ＥＦＳについては、ＨＩＯは、Ｔｙｒｏｄｅ溶液中へと外殖され、刺激開始におよそ５分前間、平衡化された。電気刺激は、Ｇｒａｓｓ Ｓ８８ Ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ（Ｇｒａｓｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、単一パルス、１ｍｓ持続時間、及び５０または１００Ｖの設定で、適用された。それから、ＨＩＯは、Ｔｙｒｏｄｅ溶液に希釈された１０μＭ ＴＴＸ中で５分間インキュベートされ、濯がれ、そして新しいＴｙｒｏｄｅ溶液中に戻された。それから、ＥＦＳが繰り返された。動画は、Ｌｅｉｃａ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｓｕｉｔｅソフトウェアを使用してＬｅｉｃａ解剖顕微鏡上で録画され、ＶｉｄｅｏＬＡＮ及びＨａｎｄｂｒａｋｅで１６Ｘ再生速度を達成するように処理された。

ヒヨコ胚操作
ニワトリの卵は、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒから購入され、望ましいＨａｍｂｕｒｇｅｒ及びＨａｍｉｌｔｏｎステージに達するまで３９℃にてインキュベーションされた。ニワトリＮＣＣ培養については、ＨＨ８胚の頭部または体幹領域からの背側神経管がＧａｓｔｒｏｍａｓｔｅｒにより解剖され、２４時間にわたりＮＣＣ培養培地とともにＭａｔｒｉｇｅｌコーティングされた組織培養皿上で培養された（ＢａｊＰａｉ Ｒ ｅｔ ａｌ， ２０１０）。神経管外殖物からＮＣＣが遊走して出た後、神経外胚葉はプレートからタングステン針により剥がされた。プレート上に残されたＮＣＣは、それから４ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ４または２μＭレチノイン酸とともに４８時間処理された。ＮＣＣ注射については、ＧＦＰ標識されたヒトＰＳＣ由来ＮＣＣが回収され、ＨＨ１０－１２ニワトリ胚中へ体節間に注射された。胚は、ＨＨ３８ごろに解析のため採取された。

免疫組織化学、及び顕微鏡法
ＮＣＣ細胞、細胞単一層、及び第０日スフェロイドは、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で２３℃にて１５分間固定され、洗浄され、それから直接的に染色された。４週のｉｎ ｖｉｔｒｏ ＨＩＯ、及びｉｎ ｖｉｖｏの移植物が、４％ＰＦＡ中で４℃にて１時間から一晩固定された。組織は、処理され、ＯＣＴ中に埋め込まれ、およそ１０μｍにて切片化され、それからＳｕｐｅｒｆｒｏｓｔ Ｐｌｕｓスライド（Ｆｉｓｈｅｒｂｒａｎｄ）上にはり付けられた。凍結切片及び細胞は、０．２５％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００で１０分間かけて処理され、それからＰＢＳ中の５％Ｎｏｒｍａｌ Ｄｏｎｋｅｙ Ｓｅｒｕｍ（ＮＤＳ、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）で３０分間２３℃にてブロッキングされた。ＰＢＳ中に希釈された第一抗体が、スライド及び細胞に一晩４℃にて適用され、それから洗浄され、第二抗体とともに２３℃にて２時間にわたりインキュベーションされた（抗体及び希釈度については、表３を参照）。スライドは、Ｆｌｕｒｏｍｏｕｎｔ－Ｇを使用してマウントされ、画像は、Ｚｅｉｓｓ ＡｐｏＴｏｍｅ Ｉｍａｇｅｒ Ｚ１またはＺｅｉｓｓ ＬＳＭ５１０共焦点顕微鏡を使用して得られた。ホールマウント３Ｄ画像は、４℃にて４％ＰＦＡ中で組織を一晩固定し、それから氷上で１００％メタノール中で１時間にわたり平衡化させることにより、得られた。組織は、ＰＢＳで再水和する前に、室温にて２時間かけてＤｅｎｔブリーチ（４：１：１ ＭｅＯＨ：ＤＭＳＯ：３０％Ｈ２Ｏ２）で透過処理された。組織は、室温にてＰＢＳ中５％ＮＤＳで２時間ブロッキングされ、４℃にてＰＢＳ中の第一抗体と共に一晩インキュベーションされ、洗浄され、４℃にてＰＢＳ中の第二抗体と共に一晩インキュベーションされた。染色の後、組織は一連のメタノールにより脱水され、Ｎｉｋｏｎ Ａ１倒立共焦点顕微鏡上でのイメージングの前に、Ｍｕｒｒａｙ'ｓ Ｃｌｅａｒ（２：１ 安息香酸：ベンジルアルコール）できれにされた。画像は、ＮＩＳ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ、Ｂｉｔｐｌａｎｅ Ｉｍａｒｉｓ、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｉｓｉｏｎ、及びＡｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ ＣＳ７ソフトウェアを使用して処理された。

ＲＮＡ単離、及び定量的リアルタイムＰＣＲ
細胞及びオルガノイドからの全ＲＮＡは、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ＲＮＡ単離キット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）を使用して単離された。相補的ＤＮＡは、ＲＮＡ単離の直後に、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＶＩＬＯ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して作成された。単離及び合成はともに、製造元のプロトコールに従い行われた。出願人は、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、ＢｉｏＲａｄ ＣＦＸ９６ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ上で、ｑＰＣＲを実施した。プライマー配列は、一般に、ｑＰｒｉｍｅｒＤｅｐｏｔ（ｈｔｔｐ：／／ｐｒｉｍｅｒｄｅｐｏｔ．ｎｃｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）から得られ、表４に見られる。

Ｅｘ－ｖｉｖｏ腸運動性
移植されたＨＩＯ＋／－ＮＣＣが採取され、氷冷ＨＢＳＳ中に配置された。筋肉片（４～６ｍｍ長、１～２ｍｍ幅）が移植されたＨＩＯ＋／－ＮＣＣから切り取られた。調製物は、Ｋｒｅｂｓ溶液（ＮａＣｌは１７ｍＭ、ＫＣｌは４．７ｍＭ、ＭｇＣｌ２は１．２ｍＭ、ＮａＨ２ＰＯ４は１．２ｍＭ、ＮａＨＣＯ３は２５ｍＭ、ＣａＣｌ２は２．５ｍＭ、及びグルコースは１１ｍＭ）で満たされた器官槽中で垂直に懸濁され、３７℃にて温められ、９５％Ｏ２＋５％ＣＯ２の気体が与えられた。初期張力０．５ｇにおける６０分間の平衡期間の後、筋肉の収縮応答が、ＬａｂＣｈａｒｔソフトウェア（ＡＤ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）が搭載されたコンピューターに連結される等尺性力トランスデューサー（Ｒａｄｎｏｔｉ）を用いて、８チャンバー組織器官槽を使用して、継続的に記録された。筋肉調製物は、ジメチルフェニルピペラジニウム（ＤＭＰＰ、１０μＭ、Ｓｉｇｍａ）及びベラトリジン（３μＭ、Ｓｉｇｍａ）で刺激された。化学的刺激が、１５分間隔で適用され、次いで３回洗浄された。テトロドトキシン（ＴＴＸ、１０μＭ、Ｔｏｃｒｉｓ）またはＮＧ－ニトロ－Ｌ－アルギニンメチルエステル（Ｌ－ＮＡＭＥ、５０Ｍ、Ｓｉｇｍａ）がＤＭＰＰ刺激の５分前に適用された。ＮＯＳはニトロプルジドナトリウム（ＳＮＰ、１００μＭ、Ｓｉｇｍａ）で阻害された。メチレンブルー（５０μＭ）はＩＣＣ活動を阻害するために使用された。化学的刺激の張力に対する影響は、曲線下面積（ＡＵＣ）を測定することにより評価された。データはΔＡＵＣとして表現された。ΔＡＵＣとは、つまり刺激後１２０秒後に測定れた「刺激された」ＡＵＣから刺激より１２０秒前に測定された「対照」ＡＵＣを差し引いたものである。

考察
出願人は、機能的ＥＮＳを含有するヒトＰＳＣ由来の腸組織を工学設計するため、胚の腸分化の原理を利用した。３次元成育条件中でＰＳＣ由来の腸オルガノイドと再統合されたヒトＰＳＣ由来の迷走神経様ＮＣＣは、腸間葉中へと遊走し、自己組織化し、一連のＥＮＳの神経及び神経膠細胞種へと分化した。移植及びｉｎ ｖｉｖｏでの成長の後、ＮＣＣは、筋腸間及び粘膜下神経叢の胚発生に類似する、複雑な神経節構造及び神経節間線維を形成した。出願人はさらに、ＮＣＣ由来のＥＮＳが、腸平滑筋中に機能的に統合され、ＮＯ依存的弛緩を駆動したことを示した。移植されたＨＩＯ＋ＮＣＣにおいて見られる高度な組織の組織化は、出願人がｉｎ ｖｉｔｒｏで工学設計した組織が、ＥＮＳの胚発生の間に起きる、細胞遊走の調和、増殖、細胞系列のコミットメント、及び神経叢の構築のための固有な情報を有したことを示唆する。

ＥＮＳを生じる迷走ＮＣＣは、より後部の、神経管のＨＯＸ陽性領域から派生する。ＨＯＸＢ５は例えば、腸のコロニー形成の間のヒトＮＣＣにおいて発現され、マウスにおいてはＥＮＳの形成に必要である。脊椎動物の胚における研究は、神経パターン化、及びＨＯＸ発現性ＮＣＣの形成における、Ｗｎｔ、ＦＧＦ、及びレチノイン酸（ＲＡ）シグナリングの重要性を示した。出願人は、ＲＡ誘発性の迷走神経ＨＯＸ遺伝子Ａ２、Ｂ３、Ｂ５、及びＢ７の発現を観察し、一方でＦＧＦ４での処理は殆ど影響を与えなかった（データ表示なし）。最近の発見は、Ｗｎｔシグナリングの活性化もまた、迷走／体幹ＮＣＣの特徴である、メラニン細胞を形成可能なＮＣＣの形成を促進することを観察した。また出願人も、ＲＡよりは度合いは低いが、Ｗｎｔシグナリングの活性化が後部ＮＣＣのＨＯＸ遺伝子発現を促進しうることを観察した（データ表示なし）。機能的なレベルでは、ＰＳＣ由来の頭部及び迷走ＮＣＣは、ＨＩＯ中へと組み込まれ、神経膠細胞系列を形成することが可能であった。これは、頭部ＮＣＣが効率的にＥＮＳに貢献できた、ヒヨコ－ウズラのキメラ胚において行われた研究と一致する。出願人は、頭部様ＮＣＣ＋ＨＩＯが色素細胞及び軟骨細胞も生じたという点において相違点を観察した。これは、頭部ＮＣＣの、より幅広い分化ポテンシャルと一致する。

出願人は、移植されたＨＩＯ＋ＮＣＣ中において、筋腸間神経叢に類似する構造を有する平滑筋線維と密接な関係にある神経膠叢の形成を、日常的に観察した。しかしながら、いくつかの証拠は、ＮＣＣ由来のＥＮＳは、より成熟しておらず、本質的により胎性であることを示唆する。例えば、粘膜下神経叢の発達は、ＨＩＯ＋ＮＣＣ組織中では遅れているように見え、これは、粘膜下神経叢が筋腸間神経叢の２ー３週間後に発達する、ヒト胎児腸における発生に似ているかもしれない２６。発生の未成熟度のもう一つの指標は、ＨＩＯ中の神経膠叢が、ヒト胎児腸において観察されるものにより類似する、成人ヒト腸より小さい神経束を含有したことである１６。ＨＩＯ＋ＮＣＣ組織の未熟な／胎児性の性質は、胎児の腸／ＥＮＳの成熟を調節する特異的因子を同定する機会を提供しうる。例えば、内腔の微生物叢が神経膠細胞による粘膜のコロニー形成に影響することが最近示され、ＨＩＯ＋／－ＥＮＳモデルはこの過程のメカニズム的な詳細な分析を可能にしうる。腸成熟を促進する因子は、未熟な粘膜ゆえ腸感染の高いリスクにある、未熟な乳児に臨床的に使用されうる。

出願人は、ｉｎ ｖｉｔｒｏのＨＩＯ＋ＮＣＣ組織中に、神経活動を示唆する、カルシウム流出の内在性及び誘導性の波を有する興奮性及び介在神経を含む、非常に高度な神経多様性を観察した。Ｉｎ ｖｉｖｏで成育されたＨＩＯ＋ＮＣＣ組織は、発生中のマウス胎児腸におけるより後のステージにおいて形成することが知られる、ｎＮＯＳ＋抑制性神経を伴う追加の神経多様性を獲得した。さらに、集められて筋腸間及び粘膜下神経叢を構築した神経膠細胞は、高度に分化した平滑筋層と機能的に連係した。これらの工学設計された組織の電界刺激（ＥＦＳ）は、質的に蠕動運動に類似する、ＥＮＳ依存性の運動性の波を引き起こした。しかしながら、出願人は、ＨＩＯ及びＨＩＯ＋ＮＣＣの両方に存在していた内在性ＩＣＣに依存する内因性の収縮活動も観察した。合わせると、我々のデータは、ＩＣＣは主に収縮を駆動し、筋肉の弛緩はＥＮＳ依存性で、ＨＩＯ＋ＮＣＣ組織中に存在するｎＮＯＳ＋抑制性神経により媒介されることを示唆する。ＮＯＳ抑制性神経が、コリン作動性興奮性神経よりも早く機能的になったという事実は、ＨＩＯ中のＥＮＳが本質的に胎児性であるという結論を支持する。

腸の発生、生理学、及び疾患に関しては、齧歯類とヒトとの間には、いくつもの顕著な相違点が存在する。例えば、陰窩の発生は、ヒトにおいては胎内で起こるが、マウスにおいては出生後に起こる。マウスとヒトとの間には、ＥＮＳ発生の間、ＴＮ神経の形成に違いがある。ＨＩＯ＋ＮＣＣがＴＨ陽性神経をｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで含有することをふまえると、本システムは、これらの細胞種の固有な発生に関する特徴を研究するための唯一の手段でありうる。さらに、ヒトＴＨ＋ドーパミン作動性ＥＮＳ神経を研究するための実験システムは、パーキンソン患者において見られる、この神経サブタイプの変性により引き起こされるＧＩ運動障害症状に対し見識を提供しうる。本システムの非常に扱いやすい性質ゆえ、本システムは、例えばヒルシュプルング病などのＥＮＳの発生欠陥を研究するのに特に有用であるはずである。ＮＣＣ形成、遊走、間葉中への組み込み、及び増殖における欠陥は、神経節欠如性の腸区画を生じうる。ＮＣＣと腸オルガノイドとの間の相互作用をｉｎ ｖｉｔｒｏで研究でき、またこれらの相互作用を機能的ＥＮＳの形成の最中に観察し操作できる能力は、ヒトにおけるヒルシュプルング病の既知及び新規の形態の、以前にはなかったメカニズム的な詳細な分析を可能にするはずである。

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Ｗａｔｓｏｎ， Ｃ．Ｌ．， ｅｔ ａｌｌ． Ａｎ ｉｎ ｖｉｖｏ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ ｕｓｉｎｇ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ． Ｎａｔｕｒｅ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０， １３１０－１３１４ （２０１４）．
Ｆｕ， Ｍ．， Ｔａｍ， Ｐ．Ｋ．， Ｓｈａｍ， Ｍ．Ｈ． & Ｌｕｉ， Ｖ．Ｃ． Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｇａｎｇｌｉｏｎ ｐｌｅｘｕｓｅｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒｉｃ ｌａｙｅｒ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｇｕｔ：ａ ｔｏｐｏｇｒａｐｈｉｃａｌ ｓｔｕｄｙ． Ａｎａｔｏｍｙ ａｎｄ ｅｍｂｒｙｏｌｏｇｙ ２０８， ３３－４１ （２００４）．
Ｙｏｕｎｇ， Ｈ．Ｍ．， Ｃｉａｍｐｏｌｉ， Ｄ．， Ｈｓｕａｎ， Ｊ． & Ｃａｎｔｙ， Ａ．Ｊ． Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｔ－， ｐ７５（ＮＴＲ）－， Ｐｈｏｘ２ａ－， Ｐｈｏｘ２ｂ－， ａｎｄ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ－ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｂｙ ｕｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ ｎｅｒｕａｌ ｃｒｅｓｔ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｌａｓｓｅｓ ｏｆ ｅｎｔｅｒｉｃ ｎｅｕｒｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｍｏｕｓｅ ｇｕｔ． Ｄｅｖ Ｄｙｎ ２１６， １３７－１５２ （１９９９）．
Ｙｏｕｎｇ， Ｈ．Ｍ．， ｅｔ ａｌ． ＧＤＮＦ ｉｓ ａ ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ ｆｏｒ ｅｎｔｅｒｉｃ ｎｅｒｕａｌ ｃｅｌｌｓ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｂｉｏｌｏｇｙ ２２９， ５０３－５１６ （２００１）．
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Ｈｅｕｂｓｃｈ， Ｎ．， ｅｔ ａｌ． Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｖｉｄｅｏ－Ｂａｓｅｄ Ａｎａｌａｙｓｉｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒａｃｔｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｃａｌｃｉｕｍ Ｆｌｕｘ ｉｎ Ｈｕｍａｎ－Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ Ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｏｖｅｒ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｓｐａｔｉａｌ Ｓｃａｌｅｓ． Ｔｉｓｓｕｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ． Ｐａｒｔ Ｃ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ２１， ４６７－４７９ （２０１５）．
Ｆｕ， Ｍ．， Ｌｕｉ， Ｖ．Ｃ．， Ｓｈａｍ， Ｍ．Ｈ．， Ｃｈｅｕｎｇ， Ａ．Ｎ． & Ｔａｍ， Ｐ．Ｋ． ＨＯＸＢ５ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｓ ｓｐａｔｉａｌｌｙ ａｎｄ ｔｅｍｐｏｒａｒｉｌｙ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｇｕｔ ｄｕｒｉｎｇ ｎｅｕｒａｌ ｃｒｅｓｔ ｃｅｌｌ ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｔｅｒｉｃ ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｓ． Ｄｅｖ Ｄｙｎ ２２８， １－１０ （２００３）．
Ｌｕｉ， Ｖ．Ｃ．， ｅｔ ａｌ． Ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｏｘｂ５ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ ｖａｇａｌ ｎｅｕｒａｌ ｃｒｅｓｔｓ ｄｏｗｎ－ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｒｅｔ ｌｅａｄｉｎｇ ｔｏ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｈｙｐｏｇａｎｇｌｉｏｎｏｓｉｓ ｉｎ ｍｉｃｅ． Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １３４， １１０４－１１１５ （２００８）．
Ｄｅｎｈａｍ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ． Ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ｃａｕｄａｌ ｎｅｕｒａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｔｈａｔ ｇｉｖｅ ｒｉｓｅ ｔｏ ｌｉｎｅａｇｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃｅｎｔｒａｌ ａｎｄ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ． Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ３３， １７５９－１７７０ （２０１５）．
Ｌｅ Ｄｏｕａｒｉｎ， Ｎ．Ｍ．， Ｃｒｅｕｚｅｔ， Ｓ．， Ｃｏｕｌｙ， Ｇ． & Ｄｕｐｉｎ， Ｅ． Ｎｅｕｒａｌ ｃｒｅｓｔ ｃｅｌｌ ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｉｔｓ ｌｉｍｉｔｓ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １３１， ４６３７－４６５０ （２００４）．
Ｚｈａｎｇ， Ｄ．， Ｂｒｉｎａｓ， Ｉ．Ｍ．， Ｂｉｎｄｅｒ， Ｂ．Ｊ．， Ｌａｎｄｍａｎ， Ｋ．Ａ． & Ｎｅｗｇｒｅｅｎ， Ｄ．Ｆ． Ｎｅｒｕａｌ ｃｒｅｓｔ ｒｅｇｉｏｎａｌｉｓａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｅｎｔｅｒｉｃ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ： ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｈｉｒｓｃｈｓｐｒｕｎｇ'ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｂｉｏｌｏｇｙ ３３９， ２８０－２９４ （２０１０）．
Ｗａｌｌａｃｅ， Ａ．Ｓ． & Ｂｕｒｎｓ， Ａ．Ｊ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎｔｅｒｉｃ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ， ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ａｎｄ ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｏｆ Ｃａｊａｌ ｉｎ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｔｒａｃｔ． Ｃｅｌｌ ａｎｄ ｔｉｓｓｕｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ ３１９， ３６７－３８２ （２００５）．
Ｋａｂｏｕｒｉｄｉｓ， Ｐ．Ｓ．， ｅｔ ａｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ ｃｏｎｔｒｏｌｓ ｔｈｅ ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ ｏｆ ｇｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ｇｕｔ ｌａｍｉｎａ ｐｒｏｐｒｉａ． Ｎｅｕｒｏｎ ８５， ２８９－２９５ （２０１５）．
Ｂｅｒｇｎｅｒ， Ａ．Ｊ．， ｅｔ ａｌ． Ｂｉｒｔｈｄａｔｉｎｇ ｏｆ ｍｙｅｎｔｅｒｉｃ ｎｅｕｒｏｎ ｓｕｂｔｙｐｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ． Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｏｍｐｅｒａｔｉｖｅ ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ５２２， ５１４－５２７ （２０１４）．
Ｂａｅｔｇｅ， Ｇ． & Ｇｅｒｓｈｏｎ， Ｍ．Ｄ． Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｃａｔｅｃｈｏｌａｍｉｎｅｒｇｉｃ （ＴＣ） ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ｖａｇｕｓ ｎｅｒｖｅｓ ａｎｄ ｂｏｗｅｌ ｏｆ ｆｅｔａｌ ｍｉｃｅ： ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｔｏ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｅｎｔｅｒｉｃ ｎｅｒｕｒｏｎｓ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｂｉｏｌｏｇｙ １３２， １８９－２１１ （１９８９）．
Ｂｌａｕｇｒｕｎｄ， Ｅ．， ｅｔ ａｌ． Ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｅｎｔｅｒｉｃ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ ｄｅｆｉｎｅｄ ｂｙ ｔｉｍｅ ｏｆ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ， ｓｙｍｐａｔｈｏａｄｒｅｎａｌ ｌｉｎｅａｇｅ ｍａｒｋｅｒｓ ａｎｄ Ｍａｓｈ－１－ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２２， ３０９－３２０ （１９９６）．
Ａｎｌａｕｆ， Ｍ．， Ｓｃｈａｆｅｒ， Ｍ．Ｋ．， Ｅｉｄｅｎ， Ｌ． & Ｗｅｉｈｅ， Ｅ． Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ： ｃｈｏｌｉｎｅｒｇｉｃ， ＶＩＰｅｒｇｉｃ， ａｎｄ ｃａｔｅｃｈｏｌａｍｉｎｅｒｇｉｃ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ． Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ４５９， ９０－１１１ （２００３）．
Ａｎｄｅｒｓｏｎ， Ｇ．， ｅｔ ａｌ． Ｌｏｓｓ ｏｆ ｅｎｔｅｒｉｃ ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ ｎｅｕｒｏｎｓ ａｎｄ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｃｏｌｏｎ ｍｏｔｉｌｉｔｙ ｉｎ ａｎ ＭＰＴＰ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ'ｓ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ２０７， ４－１２ （２００７）．
Ｃｏｓｔａ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ． Ａ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ． Ｎａｔｕｒｅ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ２， ７９２－７９６ （２００７）．
Ｈｏｃｋｅｍｅｙｅｒ， Ｄ．， ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ＴＡＬＥ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ． Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２９， ７３１－７３４ （２０１１）．
Ｔａｎｇ， Ｗ．， ｅｔ ａｌ． Ｆａｉｔｈｆｕｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｖｉａ ２Ａ－ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｅｌｆ－ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ： ａ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ａｎｄ ｒｅｌｉａｂｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｂｒａｉｎ ｃｉｒｃｕｉｔｓ． Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ：ｔｈｅ ｏｆｆｉｃｉａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ２９， ８６２１－８６２９ （２００９）．
Ｌｅｅ， Ｇ．， ｅｔ ａｌ． Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｕｒａｌ ｃｒｅｓｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ． Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２５， １４６８－１４７５ （２００７）．

別に示されない限り、すべてのパーセンテージ及び比は重量により計算される。

別に示されない限り、すべてのパーセンテージ及び比は組成物全体をベースに計算される。

本明細書の至る箇所において提供される最大の数的限定のそれぞれが、あらゆるより小さい数的限定を、そのようなより小さい数的限定があたかも本明細書においてはっきりと記述されているかのように、含むと理解されるべきである。本明細書の至る箇所において提供される最小の数的限定のそれぞれが、あらゆるより大きい数的限定を、そのようなより大きい数的限定があたかも本明細書においてはっきりと記述されているかのように、含むことになる。本明細書の至る箇所において提供される数的範囲のそれぞれが、そのようなより広い数的範囲内に属するあらゆるより狭い数的範囲を、そのようなより狭い数的範囲があたかも本明細書においてすべてはっきりと記述されているかのように、含むことになる。

本明細書において開示される寸法及び値は、挙げられるちょうどその数値に厳格に限定されると理解されるべきではない。代わりに、別に特定されない鍵値、そのような各寸法は、挙げられる値と、その値を包囲する機能的に同等な範囲との両方を意味することが意図される。例えば、「２０ｍｍ」と開示される寸法は、「約２０ｍｍ」を意味することが意図される。

いかなる相互参照される、または関連する特許または出願も含む、本明細書において引用される各文献は、明確に除外され、または別に限定されない限り、その全体が本参照により本明細書に組み込まれる。いかなる文献の引用も、それが本明細書で開示されるまたは特許請求の範囲に含まれるいかなる発明に関して先行技術であると、あるいは、単独で、またはいかなる他の参考文献とのいかなる組合せでも、いかなるそのような発明を、教示し、示唆し、または開示すると、認めるものではない。さらに、本文献における用語のいずれかの意味または定義が、参照により組み込まれる文献における同じ用語の意味または定義と矛盾する場合については、本文献におけるその用語に課された意味または定義が適用されるとする。

本発明の特定の実施形態が例証され記述されてきたものの、当業者にとっては、本発明の真髄及び範囲から逸脱することなく、他の様々な変更及び修正がなされるうることが明確であろう。従って、添付の特許請求の範囲においては、本発明の範囲内であるそのような全ての変更及び修正を網羅することが意図される。

Claims (7)

1. 腸オルガノイドを作製するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、
   凝集物を形成するために、ＨＯＸＢ３、ＨＯＸＢ５、およびＨＯＸＢ７を発現する迷走神経堤細胞とともに中／後腸スフェロイドを機械的に凝集させる工程と、
   腸オルガノイドを形成するために前記凝集物を培養する工程であって、前記腸オルガノイドは、神経細胞種および神経膠細胞種を含み、機能的腸神経系（ＥＮＳ）を有する、前記培養する工程と、
   を含み、
   前記迷走神経堤細胞は、ヒト胚幹細胞（ＥＳＣ）および／または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）をレチノイン酸に接触させることによって、前記ヒトＥＳＣおよび／またはｉＰＳＣを前記迷走神経堤細胞に分化して得られる、方法。
2. 請求項１記載の方法において、前記神経細胞種がＢＩＩＩ－チューブリンを含む、方法。
3. 請求項１または２記載の方法において、前記神経細胞種および神経膠細胞種が、平滑筋層に統合する、方法。
4. 請求項１～３のいずれか１項に記載の方法において、前記腸オルガノイドは、収縮活動が可能である、方法。
5. 請求項１～４のいずれか１項に記載の方法において、前記迷走神経堤細胞を得るために、約１～約２日の期間にわたって、前記ヒトＥＳＣおよび／またはｉＰＳＣをレチノイン酸に接触させる、方法。
6. 請求項１～５のいずれか１項に記載の方法において、前記中/後腸スフェロイドおよび前記迷走神経堤細胞は、遠心分離により機械的に凝集される、方法。
7. 請求項１～６のいずれか１項に記載の方法において、前記腸オルガノイドは、ヒト腸オルガノイドである、方法。

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