CN114269361A - 成形类器官组合物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本文公开了被操纵以形成更接近天然器官结构的成形或细长形态的类器官组合物。与未成形的类器官相比，这些成形的类器官有利于例如研究细胞器组织和移植等目的。本文还公开了生产所述成形的或细长的类器官组合物的方法。

Description

成形类器官组合物及其制备方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2019年5月31日提交的美国临时专利申请第62/855,557号、2019年10月3日提交的美国临时专利申请第62/909,868号和2020年1月8日提交的美国临时专利申请第62/958,367号的优先权权益，将其每个申请以其全部通过引用明确并入本文。

关于联邦资助研发的声明

本发明是在美国国立卫生研究院授予的U01DK103117下由政府支持进行的。政府拥有本发明的某些权利。

发明领域

本公开的方面一般地涉及类器官组合物和制备所述类器官组合物的方法。本文公开的类器官具有更接近于体内器官组织的成形或细长结构。

背景技术

提供类器官(如肠道类器官)的现有方法在形成非常适合移植和后续功能实施的结构的能力方面受到限制。具体而言，目前获得源自多能干细胞，特别是诱导多能干细胞的类器官的方法导致类器官具有球形结构，植入时不会自然伸长，因此无法提供具有类似于天然结构的构型的结构。此外，轴向力的存在可能影响类器官组织的发育。虽然现有的胃肠类器官包括内腔，但使用现有方法可获得的形状和大小的限制对于临床实施的效用有限。因此，目前需要在体外生长的类器官组织，其源自患者，例如人类患者，其具有改进的移植适用性和移植后改进的功能。

发明内容

本公开的一些方面一般地涉及生产成形胃肠类器官的方法。在一些实施方案中，胃肠类器官包括内腔。在一些实施方案中，该方法包括将多个球状体放入包括预定形状的收集通道中，并在收集通道中培养所述多个球状体以将多个球状体分化为具有所述预定形状的成形胃肠类器官。在一些实施方案中，成形胃肠类器官包括凝聚的间充质和内腔。在一些实施方案中，收集通道具有非球形形状并且成形胃肠类器官是非球形胃肠类器官。在一些实施方案中，收集通道具有细长形状并且成形胃肠类器官是细长胃肠类器官。在一些实施方案中，细长胃肠类器官包括细长长度和直径。在一些实施方案中，细长长度是、大约是、至少是、至少大约是、不超过或不超过大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、 16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、 36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50毫米，或由上述长度中的任何两个限定的范围内的任何长度，例如，1至50mm、10至40mm、20至30mm、1至 30mm或20至50mm。在一些实施方案中，直径是、大约是、至少是、至少大约是、不超过或不超过大约0.2μm、1μm、5μm、10μm、50μm、100μm、200μm、300μm、400μm、500 μm、600μm、700μm、800μm、900μm、1000μm、1200μm、1300μm、1400μm、1500μm、 1600μm、1700μm、1800μm、1900μm、2000μm、2500μm或3000μm，或由上述直径中的任何两个限定的范围内的任何直径，例如0.2μm至3000μm、200μm至1500μm、500μm至 1000μm、0.2μm至1000μm μm或500μm至3000μm。在一些实施方案中，细长长度与直径的比率是、大约是、至少是、至少大约是、不超过或不超过大约1、2、3、4、5、6、7、8、 9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、 900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、 40000、500000、60000、70000、80000、90000、100000、200000、300000、400000或 500000，或由上述比率中的任何两个限定的范围内的任何比率，例如1到500000、100到 500000、1000到10000、1到500000或1000到500000。在一些实施方案中，内腔在成形胃肠类器官的整个细长长度上不是连续的。在一些实施方案中，成形胃肠类器官是成形人胃肠类器官。在一些实施方案中，多个球状体在收集通道中培养数天，其是、大约是、至少是、至少大约是、不超过或不超过大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、 35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、 55、56、57、58、59或60天。在一些实施方案中，多个球状体在多个球状体的间充质处融合。在一些实施方案中，成形胃肠类器官经历自发神经支配。在一些实施方案中，成形胃肠类器官还包含肠神经元细胞或肠神经元祖细胞。在一些实施方案中，成形胃肠类器官进一步包含一个或多个肠肌间神经丛，其包含表达神经元标志物PGP9.5的细胞。在一些实施方案中，成形胃肠类器官具有神经元活性。在一些实施方案中，所述方法包括在成形胃肠类器官上诱导机械应变，其中机械应变促进成形胃肠类器官的自发神经支配，或减少成形胃肠类器官的成熟时间，或两者。在一些实施方案中，机械应变是单轴拉伸应变。在一些实施方案中，成形胃肠类器官还包括被间充质包围的极化柱状上皮，其中所述间充质包括平滑肌样层。在一些实施方案中，成形胃肠类器官还包括图案化为隐窝样增殖区或绒毛样结构或两者的上皮。在一些实施方案中，成形胃肠类器官还包括层叠的纵肌和环肌。在一些实施方案中，成形胃肠类器官还包含平滑肌或肠上皮下肌成纤维细胞或两者的标志物。在一些实施方案中，成形胃肠类器官进一步包含肠细胞、肠内分泌细胞、杯形细胞、帕内特细胞中的一种或多种或其任何组合。在一些实施方案中，成形胃肠类器官进一步包含表达绒毛蛋白、 Muc2、DEFA5、CHGA或OLFM4中的一种或多种或其任何组合的细胞。在一些实施方案中，成形胃肠类器官源自从PBMC细胞、活检组织样品或仙台病毒转导的体细胞重编程的诱导多能干细胞。在一些实施方案中，成形胃肠类器官在体外被血管化。在一些实施方案中，成形胃肠类器官在植入个体后血管化。在一些实施方案中，多个球状体是多个中后肠球状体并且成形胃肠类器官是成形的肠类器官。在一些实施方案中，多个球状体是多个后肠球状体并且成形胃肠类器官是成形的结肠类器官。在一些实施方案中，多个球状体是多个前肠球状体并且成形胃肠类器官是食道类器官。在一些实施方案中，多个球状体是多个后部前肠球状体并且成形胃肠类器官是胃类器官。在一些实施方案中，该方法包括在足以将诱导多能干细胞分化为定形内胚层的条件下培养诱导多能干细胞，在足以将定形内胚层分化为多个球状体的条件下培养定形内胚层，并收集所述多个球状体，然后将多个球状体放入收集通道中。在一些实施方案中，收集步骤包括将多个球状体与能够与多个球状体结合的结合材料接触。在一些实施方案中，结合材料选自金属丝、细绳和纤维中的一种或多种。在一些实施方案中，多个球状体与支架股线接触。

本公开的一些方面一般地涉及治疗胃肠功能受损的个体的方法。在一些实施方案中，该方法包括将胃肠类器官移植到个体中。在一些实施方案中，胃肠类器官是本文所述的任何一种成形胃肠类器官。在一些实施方案中，胃肠类器官对个体而言是自体的或同种异体的。在一些实施方案中，胃肠类器官由获自个体的诱导多能干细胞制备。在一些实施方案中，个体需要胃肠移植。在一些实施方案中，胃肠功能是肠功能并且胃肠类器官是肠类器官。在一些实施方案中，胃肠功能是结肠功能并且胃肠类器官是结肠类器官。在一些实施方案中，胃肠功能是食管功能并且胃肠类器官是食管类器官。在一些实施方案中，胃肠功能是胃功能并且胃肠类器官是胃类器官。

本公开的一些方面一般地涉及用于培养一种或多种成形胃肠类器官的形成托盘。在一些实施方案中，形成托盘包括一个或多个收集通道，该收集通道被配置为在其中接收一种或多种多个球状体。在一些实施方案中，一个或多个收集通道具有预定形状并且被配置为将一种或多种多个球状体聚集在一起，使得一种或多种多个球状体聚集成预定形状，并且其中一种或多种多个球状体分化成具有预定形状的一种或多种成形胃肠类器官。在一些实施方案中，一个或多个收集通道由生物相容性材料制成，该材料被配置为抑制一种或多种多个球状体附着于其上。在一些实施方案中，一个或多个收集通道还包括位于其中的一种或多种多个球状体。在一些实施方案中，一个或多个收集通道在其中进一步包含细胞培养基或细胞外基质，或两者。在一些实施方案中，一个或多个收集通道还包括位于其中的一种或多种胃肠类器官。在一些实施方案中，一种或多种胃肠类器官是本文所述的任何一种或多种成形胃肠类器官。

本公开的一些方面一般地涉及用于培养胃肠类器官的试剂盒。在一些实施方案中，该试剂盒包括形成托盘，该形成托盘包括一个或多个收集通道。在一些实施方案中，形成托盘是本文所述的形成托盘中的任一种。在一些实施方案中，该试剂盒包括多个球状体，该球状体被配置为被接收在一个或多个收集通道内。在一些实施方案中，该试剂盒包括被配置为接收在一个或多个收集通道内的细胞培养基。

本文提供的本发明的实施方案通过以下编号的可选方案进行描述：

1.一种获得包含内腔的细长人肠类器官的方法，包括：

(a)在足以形成定形内胚层的条件下培养诱导多能干细胞的来源；

(b)培养所述定形内胚层直至形成多个球状体；

(c)收集所述多个球状体；

(d)将所述多个球状体置于收集通道中；和

(e)从所述收集通道中的所述多个球状体形成包含凝聚的间充质和内腔的人肠类器官；

其中所述收集通道具有在结构上至少部分为管状的至少一个区域。

2.根据可选方案1所述的方法，其中所述收集包括使所述球状体与能够结合到所述球状体的结合材料接触。

3.根据可选方案2所述的方法，其中所述粘合材料选自金属丝、细绳和纤维中的一种或多种。

4.根据任一前述可选方案所述的方法，其中所述收集通道具有细长形状。

5.根据任一前述可选方案所述的方法，其中所述收集通道具有至少1cm、或至少2cm、或至少3cm、或至少4cm、或至少5cm、或约1cm至约100cm的长度。

6.根据任一前述可选方案所述的方法，其中所述方法在具有支架股线的装置中进行。

7.根据任一前述替代方案所述的方法，其中所述多个球状体在所述收集通道中的时间为1天至20天、或2天至18天、或3天至17天、或4天至16天、或5天至15天、或6 天至14天。

8.根据任一前述可选方案所述的方法，其中所述多个球状体在所述球状体的间充质处融合。

9.根据可选方案1所述的方法，其中在约14天、或约13天至15天、或约12天至约 16天、或约11天至约17天将所述细长肠类器官移植到宿主中，优选地其中所述细长肠类器官被移植到所述宿主的肠附近。

10.根据任一前述可选方案所述的方法，其中所述肠类器官在体外形成血液供应。

11.根据任一前述可选方案所述的方法，其中所述肠类器官在植入个体后形成血液供应。

12.根据可选方案1所述的方法，进一步包括将所述细长肠类器官移植到宿主中的步骤，其中所述宿主选自免疫缺陷哺乳动物和需要所述移植步骤的个体。

13.根据任一前述可选方案所述的方法，其中所述球状体是中/后肠球状体。

14.一种用于培养肠类器官的托盘，其包括：

由生物相容性材料形成的基部，其被配置为抑制多个球状体附着于其上；和

收集通道，其延伸穿过所述基部并被配置为在其中接收所述多个球状体，其中所述收集通道是细长的并被配置为将所述多个球状体聚集在一起，使得所述多个球状体限定预定形状，以便将所述多个球状体培养成具有所述预定形状的肠类器官。

15.根据可选方案14所述的托盘，还包括位于所述收集通道内的培养基。

16.根据可选方案15所述的托盘，还包括位于所述收集通道内的多个球状体。

17.一种用于培养肠类器官的试剂盒，其包括：

收集通道；和

培养基，其被配置为在所述收集通道内接收。

18.根据可选方案17所述的试剂盒，进一步包括多个球状体，所述球状体被配置为与所述培养基一起被接收在所述收集通道内。

19.一种治疗肠功能受损的个体的方法，包括将源自诱导多能干细胞的类器官移植到所述个体中，其中所述类器官包括间充质组织和内胚层组织。

20.根据可选方案19所述的方法，其中所述类器官还包括神经元组织。

21.根据可选方案19所述的方法，其中所述诱导多能干细胞源自所述个体。

22.根据可选方案19所述的方法，其中所述个体需要肠移植。

23.根据可选方案19至22中任一项所述的方法，其中所述类器官源自由仙台病毒转导的体细胞产生的诱导多能干细胞。

24.根据可选方案19至23中任一项所述的方法，其中所述类器官包括被包括平滑肌样层的间充质包围的极化柱状上皮。

25.根据可选方案19至24中任一项所述的方法，其中所述类器官包括图案化为隐窝样增殖区和绒毛样结构的上皮。

26.根据可选方案19至25中任一项所述的方法，其中所述类器官包括层状、纵肌和环肌。

27.根据可选方案19至26中任一项所述的方法，其中所述类器官包括平滑肌和肠上皮下肌成纤维细胞的标志物。

28.根据可选方案19至27中任一项所述的方法，其中所述类器官包括肠细胞、杯形细胞、帕内特细胞和肠内分泌细胞，或分泌、内分泌和吸收细胞类型。

29.根据可选方案19至28中任一项所述的方法，其中所述类器官具有神经元活性。

30.根据可选方案19至29中任一项所述的方法，进一步包括向所述类器官施加张力以减少成熟时间的步骤。

附图说明

除了上述特征之外，从以下对附图和示例性实施方案的描述中，其他特征和变化也将是容易明了的。应当理解，这些附图描绘了实施方案并且不旨在限制范围。

图1A描绘了从肠衰竭到肠移植的临床进展的实施方案。

图1B描绘了1991年至2017年美国移植等待名单上的人数的实施方案。

图2A描绘了具有用于聚集多个球状体的多个收集通道的示例形成托盘的透视图的实施方案。

图2B描绘了沿图2A的剖面线2-2截取的图2A的示例形成托盘的横截面图的实施方案。

图2C描绘了沿图2A的剖面线3-3截取的图2A的示例形成托盘的横截面图的实施方案。

图3A描绘了培养多个多能干细胞的生物相容性容器的示意性透视图的实施方案。

图3B-D描绘了图3A的生物相容性容器的示意性透视图的实施方案，但(B)显示了培养成定形内胚层的多个多能干细胞，(C)显示了从定形内胚层中间体培养成多个球状体的多能干细胞，或(D)显示了培养成多个球状体的多个多能干细胞，所述球状体根据通过吸引到支架线而诱导的预定排列进行排列。

图4描绘了在第1天(d1)、第3天(d3)或第5天(d5)期间在其中培养在多个收集通道内的多个球状体的图2A的形成托盘的放大俯视图的实施方案。

图5描绘了植入宿主生物体(44)中的细长肠类器官(46)的实施方案。

图6A描绘了培养中未成形的HIO的光学显微照片的实施方案。还显示了第14天(小图A)和第28天(小图B)未成形HIO的苏木精和伊红染色切片的实施方案。比例尺＝0.5 mm。

图6B描绘了移植后2、4和8周收获的tHIO的苏木精和伊红染色切片(上部)与人胎儿肠道的历史切片(下部)相比的实施方案。tHIO中上皮结构的发育以与天然组织相似的方式进行。GA：孕龄，从Grand等人(1976)复制的人类数据。

图7A描绘了产生细长HIO并随后移植到宿主生物体中的方法的实施方案。

图7B描绘了第6天(小图A)、第14天(小图B)和第28天(小图C)体外成形细长 HIO(g-HIO)结构的苏木精和伊红染色切片的实施方案。比例尺＝1mm。注意：小图B中的结构不是全长。

图8A描绘了形成细长HIO和成功生成具有连续上皮的人PSC衍生的管状肠类器官的实施方案。小图A显示了ABS模具和PDMS支架形成托盘的图像。小图B显示了PDMS支架形成托盘的横截面(上部)和末端(下部)的扫描电子显微照片。小图C显示了培养1、3和5 天时凹槽中球状体的体外图像。小图D显示了移植时第14天类器官结构的手术图像。小图 E显示了移植六周后移植第14天的类器官结构的总体图像。虚线表示解剖平面。小图F显示了小图E的移植物的苏木精和伊红染色切片。小图G显示了移植物的苏木精和伊红染色切片的平铺扫描。标记了相邻小鼠组织的区域。观察到贯穿整个组织的连续上皮。

图8B描绘了细长肠类器官的移植和由此产生的血管化的实施方案。还显示了成功植入后细长肠类器官的组织学。

图8C描绘了收获时移植的g-HIO图像的实施方案。上图显示免疫功能受损大鼠肠系膜移植后完整第14天g-HIO。下图显示了在免疫功能受损大鼠的肠系膜中移植8周后完整第28天未成形HIO。在第14天移植时，使用传统方案制作的未成形HIO没有植入免疫功能受损的大鼠中。

图9A-B描绘了在体内移植后显著生长的HIO的实施方案。在收获时，移植的 HIO(tHIO)明显大于体外HIO。

图9C描绘了类似于人类肠道的移植HIO的实施方案。tHIO包括主要的肠道细胞系，其包括间充质、肠细胞(VIL1)、肠内分泌细胞(CHGA)、杯形细胞(MUC2)和帕内特细胞(DEFA5)。此外，它们对干细胞活性标志物(OLFM4)染色呈阳性。

图9D描绘了肠系膜移植模型中类器官-肠吻合的实施方案。50％的小鼠在收获时存活了21天。

图9E描绘了在凹槽中制备的tHIO(g-tHIO)中移植后发生的肠肌间神经丛自发发育的实施方案。g-tHIO的组织学揭示了整个收获组织中肠肌间神经丛的强大网络(小图A，左)。在更高的放大倍数下，可以看到束状结构(小图A，右)。泛神经元标志物(PGP9.5)和人类特异性标志物(KU80)的免疫荧光染色。这些蛋白质的共定位证明了神经元成分的人来源(小图 B)。与神经嵴细胞结合以形成肠神经系统的tHIO(tHIO+ENS)、g-tHIO和成人小肠中泛神经元标志物PGP9.5的免疫组织化学染色(小图C)。从小图C定量肠肌间神经丛(PGP9.5+细胞束)(小图D)。与使用传统分化方案的tHIO+ENS相比时，g-tHIO中的神经丛大小明显更大。所有比例尺＝100μm。

图10A描绘了体外g-HIO和未成形HIO的转录组分离的实施方案。球状体、第28天未成形HIO和第28天g-HIO的主成分分析(小图A)。第28天未成形HIO和g-HIO的热图 (小图B)。第28天未成形HIO和g-HIO之间差异表达基因的维恩图(小图C)。富含g-HIO的前十生物过程列表与神经元发育有关(小图D)。

图10B描绘了体外发育的g-HIO的转录组谱的实施方案。球状体、第6天g-HIO、第14天g-HIO和第28天g-HIO的主成分分析(小图A)。球状体和g-HIO样品的热图(小图B)。

图10C描绘了g-HIO体外发育期间转录富集的生物过程的实施方案。列出了g-HIO体外发育第0天、第6天、第14天和第28天的富集生物过程。

具体实施方式

肠衰竭(IF)通常是由于手术切除导致的肠道丢失和/或导致肠道吸收和消化改变的先天性肠道缺陷。较小的亚组有蠕动问题，导致肠道吸收流体和营养的能力丧失。当身体无法通过肠道吸收食物或营养来维持能量和营养需求时，发生慢性肠衰竭，因此需要长期肠外营养 (PN)。肠衰竭影响每百万人中约3-50人，在美国约15,000人受到影响。慢性肠衰竭已被授予罕见疾病状态，编号ORPHA：294422(分类：障碍)。

长期PN虽然可以挽救生命，但可能导致其自身的一系列严重并发症。在新生儿人群中，PN依赖性肠衰竭可能与多种并发症有关，包括反复血流感染、反复住院和随后的生长发育不良，包括代谢性骨骼问题。所有这些都给患者、家庭和医疗保健系统带来了非常沉重的负担。长期PN患者中危及生命的并发症，例如血栓形成导致的静脉无法进入、重复导管相关败血症和胆汁淤积性肝病，最终可能导致需要进行挽救生命的肠移植。图1A显示了从肠衰竭到肠移植的临床进展。

肠移植已发展成为治疗不可逆肠衰竭患者的既定治疗方式。肠移植的进行可以有不同的形式，如分离肠移植、改良多脏器移植和全多脏器移植。尽管接受肠移植的患者数量远低于其他器官移植，但从2000年到2009年，手术数量增加了5倍。在过去几年中，肠移植的数量趋于稳定，并呈下降趋势，每年发生100至120例，其中2017年发生了47例儿科移植。这一趋势是由于为肠衰竭患者提供的多学科护理得到改善，未来十年人群可能增加。该患者群体需要新的和改进的治疗方法。

虽然手术技术不断改进，但肠道和多脏器移植的破坏性同种异体免疫仍然是一个重大障碍，其限制了可能从移植中受益的潜在患者名单和移植后维持移植物。接受Pittsburgh方案被认为是标准护理，其在移植前立即首先完全耗尽T细胞，然后继续抑制T细胞并进行类固醇维持。该方案降低了移植排斥率，但该排斥率仍然显著。在移植后早期，约30％的患者中供体特异性抗体(DSA)仍是问题。DSA的存在使慢性排斥的风险增加了一倍以上。

一年和五年生存率超过70％，10年和15年生存率分别只有42％和35％。这表明，虽然短期结果良好，但长期结果仍然令人失望。2017年，90.4％的仅肠移植为初始移植，而9.6％为再次移植。对于那些接受联合肝肠移植的患者，其中26.3％是再次移植。肠再移植目前是肠移植的第4个最常见的指示。

接受再移植的儿科患者总体上比初次移植组更年轻。一个中心的经验表明，初次移植和再次移植之间的平均时间为421天。他们发现所有早期(<90天)再移植患者的生存率高于晚期再移植患者的偏向，生存率分别为80％至50％。在儿科亚群中，无论时间如何，再移植的3年存活率为27％，移植物存活率百分比相同。在第二个中心，在接受再移植的23名患者(成人和儿童)中，有15名患者在再移植后的12个月中位时间时死亡(35％存活率)。西班牙的第三个中心报告了13名患者的5年再移植儿科存活率为35％。

当仔细表征再移植组(n＝23)时，即使在再移植后，复发性严重排斥也常见(35％)。如果患者在初次移植时出现排斥反应导致移植物丢失和33％的死亡率，则再次移植时移植物排斥的发生率明显更高。再移植患者通常严重免疫功能受损，在35％的再移植患者中观察到骨髓抑制，而在初次移植患者中这一比例为4％。此外，与存活者的相似时间点相比，那些再移植非存活者(60％)在死亡前一个月的绝对淋巴细胞和血小板计数显著降低。

与需求相比，器官捐赠继续严重短缺。截至2019年7月，在美国，全国移植等候名单上有超过113,000名男性、女性和儿童(图1B)。每10分钟就有一个新人被添加到等候名单中，而20人在等待移植时死亡。在过去的27年中，这种短缺从1991年的6,953名捐献者/23,198名等待者升级到2018年的17,554名捐献者/113,759名等待者。

人体器官捐献者的这种日益稀缺促使研究科学家研究其他选择，如异种移植，或产生必要的人体可移植器官。这种方法不仅具有复杂的科学挑战，而且还存在法律和伦理问题。一种可能的选择是使用从患者自己的肠道获得的体外扩大的上皮活检物(称为肠样体)。由于这些结构仅包含上皮，它们不能替代主要包含间充质和神经元组织的肠道结构的大部分。此外，这些结构不容易移植，可能是由于缺乏间充质。

比较而言，如本文所述的源自诱导多能干细胞的类器官可包含内胚层和中胚层组织，易于移植，并有助于整个移植物的再生。生成患者特定类器官的能力可以避免一些科学和伦理问题，同时预防同种异体免疫反应，这最终可能成为帮助个人延长移植物预期寿命并避免重新进入移植等待名单的解决方案。

目前，类器官被用于在体外和体内研究人类疾病。如本文所公开，有强有力的数据支持这些iPSC衍生组织具有在体内完全发挥功能的潜力，并因此可用于挽救器官移植。已经表明，多能干细胞(PSC)可以通过以逐步方式调节几种信号传导途径的组合活动，在体外定向分化为多个器官系统，包括肠组织，有效地重现体内胎儿器官发育，而无需胎儿组织。

本文公开了iPSC衍生的胃肠类器官。在一些实施方案中，胃肠类器官是食道类器官、胃类器官、肠类器官或结肠类器官。在一些实施方案中，胃肠类器官是肠类器官。这些类器官是由仙台病毒转导的体细胞产生的，这些体细胞被诱导为可形成身体所有组织的PSC。通过操纵控制胚胎器官发生的因素，已经开发出体外方法来引导PSC逐步分化为胚胎胚层限制的类器官，然后是特定的细胞类型，如肝细胞、神经细胞、肌细胞和肠组织。生产类器官(例如肠类器官)的方法可以在美国专利9,719,068和10,174,289以及PCT公开WO2016/061464和WO 2018/106628中找到，它们各自通过引用整体并入本文。

在下面的详细描述中，参考了构成其一部分的附图。在附图中，除非上下文另有说明，否则相似的符号通常标识相似的组件。在详细说明、附图和权利要求中描述的说明性实施方案并不意味着是限制性的。在不脱离本文提出的主题的精神或范围的情况下，可以利用其他实施方案，并且可以做出其他改变。将容易理解，本公开的各方面，如在此一般描述的和在附图中示出的，可以以多种不同的配置进行布置、替换、组合、分离和设计，所有这些都被明确地在本文考虑。

除非另有定义，本文中使用的技术和科学术语与本公开所属领域的普通技术人员根据本公开阅读时通常理解的含义相同。出于本公开的目的，以下术语解释如下。

冠词“一个”和“一种”在本文中用于指代冠词的一个或多个(例如，至少一个)语法对象。例如，“要素”是指一个要素或一个以上的要素。

“约”是指数量、水平、值、数字、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度与参考数量、水平、值、数字、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度相差多达10％。

在本说明书中，除非上下文另有要求，否则词语“包括(comprise)”、“包括(comprises)”和“包括(comprising)”将被理解为暗示包括所陈述的步骤或要素或步骤或要素组，但不排除任何其他步骤或要素或一组步骤或要素。“由……组成”是指包括并限于短语“由……组成”之后的任何内容。因此，短语“由……组成”表示列出的要素是必需的或强制性的，并且不能存在其他要素。“基本上由……组成”是指包括在该短语之后列出的任何要素，并且限于不干扰或有助于所列出要素的公开内容中指定的活动或动作的其他要素。因此，短语“基本上由……组成”表示所列要素是必需的或强制性的，但其他要素是可选的，可能存在或不存在，这取决于它们是否对所列要素的活动或行为产生实质性影响。

如本文所用，术语“个体”、“受试者”或“患者”具有根据说明书理解的其简单和普通的含义，并且指人或非人哺乳动物，例如狗、猫、小鼠、大鼠、牛、绵羊、猪、山羊、非人灵长类动物或鸟类，例如鸡，以及任何其他脊椎动物或无脊椎动物。术语“哺乳动物”以其通常的生物学意义使用。因此，它具体包括但不限于灵长类动物，包括猿猴(黑猩猩、猿、猴)和人、牛、马、绵羊、山羊、猪、兔、狗、猫、啮齿动物、大鼠、小鼠、豚鼠或类似动物。

如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”具有根据说明书理解的其简单和普通的含义，并且指导致可观察效果的所述组合物或化合物的量。本公开主题的活性组合物中活性成分的实际剂量水平可以变化，以便施用有效实现特定受试者和/或应用的期望反应的量的活性组合物或化合物。选择的剂量水平将取决于多种因素，包括但不限于组合物的活性、制剂、施用途径、与其他药物或治疗的组合、所治疗病症的严重程度以及身体状况和接受治疗的对象的以前病史。在一些实施方案中，施用最小剂量，并且在不存在剂量限制性毒性的情况下将剂量增加至最小有效量。在本文中考虑有效剂量的确定和调整，以及何时和如何进行这样的调整的评估。

为了公开的清楚起见，就本文或在参考附图中使用诸如“上”、“下”、“纵向”、“侧向”、“横向”、“向内”、“向外”等空间术语而言，应当理解，这些术语仅用于示例性描述的目的，而不是限制性的或绝对的。在这方面，应当理解，诸如本文公开的那些器械可以以多种取向和位置使用，不限于本文所示出和描述的那些。

本文所公开的尺寸和值不应理解为严格地受限于所叙述的准确数值。相反，除非另外指明，每个此类尺寸旨在表示所述值和围绕该值的功能上等同的范围。例如，公开为“20 mm”的尺寸旨在表示“约20mm”。

如本文所用，术语“功能”和“功能性”具有根据说明书理解的其简单和普通的含义，并且指生物、酶促或治疗功能。

如本文所用，术语“抑制”具有其根据说明书理解的简单而普通的含义，并且可以指生物活性的降低或防止。降低可以是百分比，其为、大约为、至少为、至少大约为、不超过、或不超过约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，或在由上述值中的任意两个限定的范围内的量。如本文所用，术语“延迟”具有其根据说明书所理解的简单而普通的含义，并且指的是生物事件的减缓、延迟或推迟到比其他情况下预期的更晚的时间。延迟可以是百分比的延迟，其为、大约为、至少为、至少大约为、不超过、或不超过约0％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％，或在由上述值中的任意两个限定的范围内的量。术语抑制和延迟不一定表示100％抑制或延迟。可以实现部分抑制或延迟。

如本文所用，术语“分离的”具有其根据说明书所理解的简单和普通的含义，并且是指已经(1)与最初产生时(无论是在自然界和/或在实验环境中)与其相关联的至少一些组分分离的和/或(2)由人工生产、制备和/或制造的物质和/或实体。分离的物质和/或实体可以与等于、大约、至少、至少约、不超过、或不超过约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约 60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约98％、约99％、基本上100％或100％的最初与其相关的其他成分分离(或包括和/或跨越上述值的范围)。在一些实施方案中，分离的试剂为、大约为、至少为、至少大约为、不超过、或不超过约80％、约85％、约90％、约 91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、基本上 100％或100％纯(或包括和/或跨越上述值的范围)。如本文所用，“分离的”物质可以是“纯的”(例如，基本上不含其他成分)。如本文所用，术语“分离的细胞”可以指不包含在多细胞生物体或组织中的细胞。

如本文所用，“体内”被赋予其根据说明书理解的简单而普通的含义，并且指的是在活生物体(通常是动物、哺乳动物，包括人类，和植物)内执行方法，而不是组织提取物或死亡生物体内。

如本文所用，“离体”被赋予其根据说明书理解的简单且普通的含义，并且指在自然条件几乎没有改变的情况下在活生物体之外执行方法。

如本文所用，“体外”被赋予其根据说明书理解的简单且普通的含义，并且指的是在生物条件之外执行方法，例如在培养皿或试管中。

如本文所用的术语“核酸”或“核酸分子”具有根据说明书理解的其简单和普通的含义，并且指多核苷酸，例如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)、寡核苷酸、天然出现在细胞中的那些、由聚合酶链反应(PCR)产生的片段，以及由连接、断裂、核酸内切酶作用和核酸外切酶作用中的任一种产生的片段。核酸分子可以由天然存在的核苷酸(例如DNA和RNA)或天然存在的核苷酸的类似物(例如天然存在的核苷酸的对映体形式)或两者的组合的单体组成。修饰的核苷酸可以改变糖部分和/或嘧啶或嘌呤碱基部分。糖修饰包括例如用卤素、烷基、胺和叠氮基取代一个或多个羟基，或者糖可以被官能化为醚或酯。此外，整个糖部分可以被空间和电子上相似的结构取代，例如氮杂糖和碳环糖类似物。碱基部分的修饰的实例包括烷基化嘌呤和嘧啶、酰化嘌呤或嘧啶、或其他众所周知的杂环取代基。核酸单体可通过磷酸二酯键或此类键的类似物连接。磷酸二酯键的类似物包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯胺硫代磷酸酯、苯胺磷酸酯或氨基磷酸酯。术语“核酸分子”还包括所谓的“肽核酸”，其包含连接到聚酰胺骨架的天然存在的或修饰的核酸碱基。核酸可以是单链或双链的。“寡核苷酸”可以与核酸互换使用并且可以指双链或单链DNA或RNA。一种或多种核酸可以包含于核酸载体或核酸构建体，例如质粒、病毒、逆转录病毒、慢病毒、噬菌体、粘粒、fosmid、噬菌粒、细菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)、或人类人工染色体(HAC))，它们可用于在各种生物系统中扩增和/或表达所述一种或多种核酸。通常，载体或构建体还将包含元件，包括但不限于启动子、增强子、终止子、诱导子、核糖体结合位点、翻译起始位点、起始密码子、终止密码子、聚腺苷酸化信号、复制起点、克隆位点、多克隆位点、限制酶位点、表位、报告基因、选择标记、抗生素选择标记、靶向序列、肽纯化标签或辅助基因，或其任何组合。

核酸或核酸分子可包含一个或多个编码不同肽、多肽或蛋白质的序列。这些一个或多个序列可以在相同的核酸或核酸分子中相邻地连接，或者在它们之间具有额外的核酸，例如接头、重复序列或限制酶位点，或者是、大约是、至少是、至少约、不超过、或不超过约 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、 35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200或300个碱基长或者由上述长度中的任意两个定义的范围内的任意长度的任何其他序列。如本文所用，核酸上的术语“下游”具有其根据说明书理解的普通和普通含义，并且指如果核酸是双链，在包含编码序列的链(有义链)上位于先前序列的3'末端之后的序列。如本文所用，核酸上的术语“上游”具有其根据说明书理解的普通和普通含义，并且指如果核酸是双链，在包含编码序列的链(有义链)上位于后面序列的5'末端之前的序列。如本文所用，核酸上的术语“分组”具有根据说明书理解的其简单和普通的含义，是指两个或多个序列直接相邻出现或在其间具有额外的核酸，例如接头、重复序列或限制酶位点，或者是、大约是、至少是、至少约、不超过、或不超过约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、 20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200或 300个碱基长或者由上述长度中的任意两个定义的范围内的任意长度的任何其他序列，但通常其间不具有编码功能性或催化性多肽、蛋白质或蛋白质结构域的序列。

本文所述的核酸包含核碱基。主要的、经典的、天然的或未修饰的碱基是腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶。其他核碱基包括但不限于嘌呤、嘧啶、修饰的核碱基、5-甲基胞嘧啶、假尿苷、二氢尿苷、肌苷、7-甲基鸟苷、次黄嘌呤、黄嘌呤、5,6-二氢尿嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、异鸟嘌呤、异胞嘧啶、氨基烯丙基碱基、染料标记碱基、荧光碱基或生物素标记碱基。

如本文所用，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”具有其根据说明书理解的简单和普通的含义，是指由通过肽键连接的氨基酸组成的大分子。肽、多肽和蛋白质的众多功能是本领域已知的，包括但不限于酶、结构、转运、防御、激素或信号传导。肽、多肽和蛋白质通常(但不总是)由核糖体复合物使用核酸模板以生物学方式产生，尽管化学合成也是可用的。通过操纵核酸模板，可以进行肽、多肽和蛋白质突变，例如多于一种肽、多肽或蛋白质的取代、缺失、截短、添加、复制或融合。这些多于一种肽、多肽或蛋白质的融合体可以在同一分子中相邻地连接，或者在它们之间具有额外的氨基酸，例如接头、重复序列、表位或标签，或者是、大约是、至少是、至少约、不超过、或不超过约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、 11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、 75、80、85、90、95、100、150、200或300个碱基长或者由上述长度中的任意两个定义的范围内的任意长度的任何其他序列。如本文所用，多肽上的术语“下游”具有其根据说明书理解的普通和普通含义，并且指在先前序列的C-末端之后的序列。如本文所用，多肽上的术语“上游”具有其根据说明书理解的普通和普通含义，并且指在后续序列的N-末端之前的序列。

如本文所用，任何给定物质、化合物或材料的术语“纯度”具有其根据说明书理解的简单而普通的含义，并且指物质、化合物或材料相对于预期丰度的实际丰度。例如，物质、化合物或材料可以是至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％纯的，包括其间的所有小数。纯度可能受到不需要的杂质的影响，包括但不限于核酸、DNA、RNA、核苷酸、蛋白质、多肽、肽、氨基酸、脂质、细胞膜、细胞碎片、小分子、降解产物、溶剂、载体、载体，或污染物，或其任何组合。在一些实施方案中，物质、化合物或材料基本上不含宿主细胞蛋白、宿主细胞核酸、质粒DNA、污染病毒、蛋白酶体、宿主细胞培养成分、过程相关成分、支原体、热原、细菌内毒素和外来物质。可以使用包括但不限于电泳、SDS-PAGE、毛细管电泳、PCR、rtPCR、qPCR、色谱、液相色谱、气相色谱、薄层色谱、酶联免疫吸附测定(ELISA)、光谱、UV-可见光谱法、红外光谱法、质谱法、核磁共振、重量法或滴定法，或其任何组合的技术测量纯度。

如本文所用，任何给定物质、化合物或材料的术语“产量”具有其根据说明书理解的简单而普通的含义，并且指物质、化合物或材料相对于预期总量的实际总量。例如，物质、化合物或材料的产量为、大约为、至少为、至少大约为、不超过或不超过约预期总量的80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％，包括其间的所有小数。在生产的任何步骤中，反应或过程的效率、不需要的副反应、降解、输入物质、化合物或材料的质量或期望物质、化合物或材料的损失可影响产量。

如本文所用，术语“％w/w”或“％wt/wt”具有根据说明书理解的简单和普通含义，并且指以成分或试剂的重量占组合物总重量乘以100表示的百分比。如本文所用，术语“％v/v”或“％vol/vol”具有根据说明书理解的简单和普通含义，并且指以化合物、物质、成分或试剂的液体体积占组合物总液体体积乘以100表示的百分比。

干细胞

如本文所用，术语“全能干细胞”(也称为“万能干细胞”)具有其根据说明书理解的简单和一般含义，并且是能够分化成胚胎细胞和胚胎外细胞类型的干细胞。这样的细胞可以构建一个完整的、有活力的有机体。这些细胞由卵和精细胞融合产生。受精卵头几次分裂产生的细胞也是全能的。

如本文所用，术语“胚胎干细胞(ESC)”，通常也缩写为ES细胞，具有其根据说明书理解的简单和一般含义，并且是指多能的细胞，其衍生自胚泡(即早期胚胎)的内细胞团。为了本发明的目的，术语“ESC”有时被广泛用来涵盖胚胎生殖细胞。

如本文所用，术语“多能干细胞(PSC)”具有其根据说明书理解的简单和一般含义，并且涵盖可分化成几乎所有身体细胞类型的任何细胞，即衍生自三种胚层(生殖上皮)中的任一种的细胞，包括内胚层(内部胃粘膜、胃肠道、肺)，中胚层(肌肉、骨、血液、泌尿生殖)和外胚层(表皮组织和神经系统)。PSC可以是植入前胚泡的内细胞团细胞的后代，或通过诱导非多能细胞，如成体体细胞，通过强迫某些基因表达而获得。多能干细胞可来源于任何合适的来源。多能干细胞来源的实例包括哺乳动物来源，包括人、啮齿动物、猪和牛。

如本文所用，术语“诱导的多能干细胞(iPSC)”，通常也缩写为iPS细胞，具有其根据说明书理解的简单和一般含义，并且是指通过诱导某些基因的“强迫”表达而人工衍生自通常非多能细胞如成体体细胞的多能干细胞类型。hiPSC是指人iPSC。在本领域已知的一些方法中，可通过将某些干细胞相关基因转染到非多能细胞如成体成纤维细胞来获得iPSC。转染可以通过使用病毒如逆转录病毒或慢病毒的病毒转导来实现。转染基因可包括主转录调节因子Oct-3/4(POU5F1)和Sox2，尽管其他基因可提高诱导效率。3-4周后，少量转染细胞开始在形态学和生物化学上变得与多能干细胞相似，并且通常通过形态学选择，倍增时间或通过报道基因和抗生素选择来分离。如本文所用，iPSC包括小鼠的第一代iPSC、第二代iPSC和人类诱导的多能干细胞。在一些方法中，逆转录病毒系统用于使用四种关键基因(Oct3/4、 Sox2、Klf4和c-Myc)将人成纤维细胞转化为多能干细胞。在其他方法中，慢病毒系统用于用 OCT4、SOX2、NANOG和LIN28转化体细胞。在iPSC中诱导表达的基因包括但不限于 Oct-3/4(POU5F1)；Sox基因家族的某些成员(例如Soxl、Sox2、Sox3和Sox15)；Klf家族的某些成员(例如Klfl、Klf2、Klf4和Klf5)、Myc家族的某些成员(例如C-myc、L-myc和N-myc)、Nanog、LIN28、Tert、Fbx15、ERas、ECAT15-1、ECAT15-2、Tcl1、β-Catenin、ECAT1、 Esg1、Dnmt3L、ECAT8、Gdf3、Fth117、Sal14、Rex1、UTF1、Stella、Stat3、Grb2、 Prdm14、Nr5a1、Nr5a2或E-cadherin，或其任何组合。

如本文所用，术语“前体细胞”具有根据说明书理解的其简单和一般的含义，并且涵盖可用于本文所述方法的任何细胞，通过这些方法，一个或多个前体细胞获得更新自身或分化成一种或多种特定细胞类型的能力。在一些实施方案中，前体细胞是多能性的或具有成为多能性的能力。在一些实施方案中，对前体细胞进行外部因子(例如生长因子)的处理以获得多能性。在一些实施方案中，前体细胞可为全能(或万能)干细胞；多能干细胞(诱导的或非诱导的)；多潜能性干细胞；寡能干细胞和单能干细胞。在一些实施方案中，前体细胞可以来自胚胎、婴儿、儿童或成人。在一些实施方案中，前体细胞可以是经过处理的体细胞，以便通过遗传操作或蛋白质/肽处理赋予其多能性。前体细胞包括胚胎干细胞(ESC)、胚胎癌细胞 (EC)和外胚层干细胞(EpiSC)。

在一些实施方案中，一个步骤是获得多能干细胞或可以诱导成为多能干细胞。在一些实施方案中，多能干细胞衍生自胚胎干细胞，所述胚胎干细胞又衍生自早期哺乳动物胚胎的全能细胞，并且能够在体外无限地，未分化地增殖。胚胎干细胞是衍生自胚泡(即早期胚胎) 内细胞团的多能干细胞。从胚细胞衍生胚胎干细胞的方法是在所属领域中是众所周知的。人类胚胎干细胞H9(H9-hESC)用于本申请中描述的示例性实施例中，但是所属领域技术人员将理解，本文描述的方法和系统适用于任何干细胞。

可用于根据本发明的实施方案中的另外的干细胞包括不限于由旧金山加利福尼亚大学 (UCSF)的人类胚胎干细胞研究中心的国家干细胞库(NSCB)主办的数据库；Wi细胞研究所的 WISC细胞库；威斯康星大学干细胞与再生医学中心(UW-SCRMC)；Novocell公司(加利福尼亚州圣地亚哥)；Cellartis AB(瑞典哥德堡)；胚胎干细胞国际公司(新加坡)；以色列理工学院以色列理工学院(以色列海法)；以及由普林斯顿大学和宾夕法尼亚大学主办的干细胞数据库提供或描述的那些干细胞。可用于根据本发明的实施例中的示例性胚胎干细胞包括不限于 SA01(SA001)；SA02(SA002)；ES01(HES-1)；ES02(HES-2)；ES03(HES-3)；ES04(HES-4)； ES05(HES-5)；ES06(HES-6)；BG01(BGN-01)；BG02(BGN-02)；BG03(BGN-03)；TE03(13)； TE04(14)；TE06(16)；UCOl(HSF1)；UC06(HSF6)；WA01(HI)；WA07(H7)；WA09(H9)；WA13(H13)；WA14(H14)。示例性人多能细胞系包括但不限于TkDA3-4、1231A3、317-D6、 317-A4、CDH1、5-T-3、3-34-1、NAFLD27、NAFLD77、NAFLD150、WD90、WD91、 WD92、L20012、C213、1383D6、FF或317-12细胞。

在发育生物学中，细胞分化为较不特化的细胞变成较特化的细胞类型的过程。如本文所用，术语“定向分化”描述了一种过程，通过所述过程，较不特化的细胞变成特定的特化靶向细胞类型。特化靶向细胞类型的特殊性可通过可用于定义或改变初始细胞命运的任何适用方法来确定。示例性方法包括但不限于基因操纵、化学处理、蛋白质处理和核酸处理。

在一些实施方案中，腺病毒可用于运输必需的四种基因，产生与胚胎干细胞基本相同的iPSC。由于腺病毒不将其自身的任何基因与靶宿主结合，消除了产生肿瘤的危险。在一些实施方案中，采用基于非病毒的技术来生成iPSC。在一些实施方案中，重编程可以在根本没有任何病毒转染系统的情况下通过质粒来完成，尽管效率非常低。在其它实施方案中，蛋白质的直接递送用于生成iPSC，因此消除了对病毒或遗传修饰的需要。在一些实施方案中，使用类似的方法生成小鼠iPSC是可能的：用通过聚精氨酸锚导入细胞的某些蛋白来重复处理细胞足以诱导多能性。在一些实施方案中，多能性诱导基因的表达也可以通过在低氧条件下用FGF2处理体细胞来增加。

如本文所用，术语“仙台病毒”具有根据说明书理解的简单而普通的含义，是指副粘病毒科的有包膜的负义单链RNA病毒，也称为鼠副流感病毒类型1或日本血凝病毒(HVJ)。虽然通常只在啮齿动物中引起疾病，但该病毒可以通过唾液酸受体感染多种哺乳动物细胞，包括人类细胞。仙台病毒可用作病毒载体，以在体外和体内将转基因传递到细胞中。在一些实施方案中，为了将体细胞重编程为诱导性多能干细胞，仙台病毒已被改造为包含干细胞重编程因子的表达载体。在一些实施方案中，干细胞重编程因子包括但不限于Oct3/4、Sox2、 Klf4和L-Myc或其任何组合，但也可包括本文公开的或本领域已知的任何干细胞重编程因子。在一些实施方案中，这些干细胞重编程因子来源于人。在一些实施方案中，仙台病毒载体包含一种或多种(例如至少1、2、3、4、5种)Oct3/4、Sox2、Klf4、L-Myc或另一种干细胞重编程因子的表达载体。在一些实施方案中，仙台病毒载体包含Klf4、Oct3/4和Sox2(KOS) 的表达载体。在一些实施方案中，仙台病毒载体包含L-Myc的表达载体。在一些实施方案中，仙台病毒载体包含Klf4的表达载体。在一些实施方案中，一种或多种仙台病毒载体以不同比例组合以优化细胞的重编程。在一些实施方案中，使体细胞与一种或多种仙台病毒载体接触成功地将体细胞重编程为诱导多能干细胞。作为RNA病毒，仙台病毒不需要将病毒有效载荷整合到宿主基因组中，也不需要进入细胞核(如同DNA病毒)。这与慢病毒和腺病毒不同。然而，设想其他病毒载体例如慢病毒、腺病毒和腺相关病毒可用于本文所述的使用仙台病毒的转导目的，例如用于将体细胞重编程为干细胞。

如本文所用，术语“饲养细胞”具有其根据说明书理解的普通和一般含义，并且是指支持多能干细胞生长的细胞，例如通过将生长因子分泌到培养基中或展示在细胞表面上。饲养细胞通常是贴壁细胞并且可能生长停滞。例如，饲养细胞因辐照(例如伽马射线)、丝裂霉素- C处理、电脉冲或温和的化学固定(例如用甲醛或戊二醛)而生长停滞。然而，饲养细胞不一定必须生长停止。饲养细胞可用于诸如分泌生长因子、在细胞表面展示生长因子、使培养基解毒或合成细胞外基质蛋白等目的。在一些实施方案中，饲养细胞与所支持的靶干细胞是同种异体的或异种的，这可能对下游应用有影响。在一些实施方案中，饲养细胞是小鼠细胞。在一些实施方案中，饲养细胞是人类细胞。在一些实施方案中，饲养细胞是小鼠成纤维细胞、小鼠胚胎成纤维细胞、小鼠STO细胞、小鼠3T3细胞、小鼠SNL 76/7细胞、人成纤维细胞、人包皮成纤维细胞、人真皮成纤维细胞、人脂肪间充质细胞、人骨髓间充质细胞细胞、人羊膜间充质细胞、人羊膜上皮细胞、人脐带间充质细胞、人胎儿肌肉细胞、人胎儿成纤维细胞或人成人输卵管上皮细胞。在一些实施方案中，使用由饲养细胞制备的条件培养基代替饲养细胞共培养或与饲养细胞共培养组合。在一些实施方案中，在靶干细胞增殖期间不使用饲养细胞。

本文所述的一些实施方案涉及药物组合物，其包含有效量的本文所述细胞组合物和药学上可接受的载体、赋形剂或其组合，基本上由其组成或由其组成。本文所述的药物组合物适用于人类和/或兽医应用。

如本文所用，“药学上可接受的”具有根据说明书理解的简单和普通的含义，并且是指在所用剂量和浓度下对暴露于其中的细胞或哺乳动物无毒或具有可接受的毒性水平的载体、赋形剂和/或稳定剂。如本文所用的“药学上可接受的”、“稀释剂”、“赋形剂”和/或“载体”具有其根据说明书理解的简单和普通的含义，并且旨在包括与施用于人、猫、狗或其他脊椎动物宿主相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。通常，药学上可接受的稀释剂、赋形剂和/或载体是由联邦、州政府的监管机构或其他监管机构批准的，或在美国药典或其他公认的用于动物包括人类以及非人类哺乳动物如猫和狗中的药典中列出的稀释剂、赋形剂和/或载体。术语稀释剂、赋形剂和/或“载体”可以指与药物组合物一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。这种药物稀释剂、赋形剂和/或载体可以是无菌液体，例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些。水、盐水溶液和葡萄糖和甘油水溶液可用作液体稀释剂、赋形剂和/或载体，特别是对于注射溶液。合适的药物稀释剂和/或赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙二醇、水、乙醇等。生理学上可接受的载体的非限制性实例是pH缓冲水溶液。生理学上可接受的载体还可包含以下一种或多种：抗氧化剂，例如抗坏血酸，低分子量(小于约10个残基)多肽，蛋白质，例如血清白蛋白，明胶，免疫球蛋白，亲水聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮，氨基酸，碳水化合物，例如葡萄糖、甘露糖或糊精，螯合剂如EDTA，糖醇如甘露醇或山梨糖醇，成盐抗衡离子如钠，和非离子表面活性剂，例如

聚乙二醇(PEG)和

如果需要，该组合物还可包含少量润湿剂、填充剂、乳化剂或pH缓冲剂。这些组合物可以采用溶液、悬浮液、乳液、缓释制剂等形式。制剂应适合施用方式。

冷冻保护剂是细胞组合物添加剂，其通过防止形成大冰晶来提高低温冷冻保存的效率和产量。冷冻保护剂包括但不限于DMSO、乙二醇、甘油、丙二醇、海藻糖、甲酰胺、甲基甲酰胺、二甲基甲酰胺、3-磷酸甘油酯、脯氨酸、山梨糖醇、二甘醇、蔗糖、三甘醇、聚乙烯醇、聚乙二醇或羟乙基淀粉。冷冻保护剂可用作冷冻保存介质的一部分，其包括其他成分，例如营养物(例如白蛋白、血清、牛血清、胎牛血清[FCS])，以提高细胞的解冻后存活率。在这些冷冻保存介质中，可以发现至少一种冷冻保护剂的浓度为、约为、至少为、至少约为、不超过或不超过约0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、 7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％,或由上述数字中的任何两个定义的范围内的任何百分比。

具有期望特性的其他赋形剂包括但不限于防腐剂、佐剂、稳定剂、溶剂、缓冲剂、稀释剂、增溶剂、去污剂、表面活性剂、螯合剂、抗氧化剂、醇、酮、醛、乙二胺四乙酸 (EDTA)、柠檬酸、盐、氯化钠、碳酸氢钠、磷酸钠、硼酸钠、柠檬酸钠、氯化钾、磷酸钾、硫酸镁、糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、乳糖、半乳糖、蔗糖、山梨糖醇、纤维素、血清、氨基酸、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、脱氧胆酸钠、牛磺脱氧胆酸钠、硬脂酸镁、辛基苯酚乙氧基化物、苄索氯铵、硫柳汞、明胶、酯、醚、2-苯氧乙醇、尿素或维生素，或其任何组合。一些赋形剂可能是制造过程中的残留量或污染物，包括但不限于血清、白蛋白、卵清蛋白、抗生素、灭活剂、甲醛、戊二醛、β-丙内酯、明胶、细胞碎片、核酸、肽、氨基酸、或生长培养基成分或其任何组合。赋形剂的量可以以如下百分比存在于组合物中，即为、约为、至少为、至少约为、不超过或不超过约0％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、 0.7％、0.8％、0.9％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、 40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、100％w/w或由上述数字中的任意两个定义的范围内的任何重量百分比。

术语“药学上可接受的盐”具有根据说明书理解的简单和普通的含义，包括组合物或赋形剂的相对无毒的无机和有机酸或碱加成盐，包括但不限于镇痛剂、治疗剂、其他材料等。药学上可接受的盐的实例包括衍生自无机酸如盐酸和硫酸的那些，以及衍生自有机酸如乙磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸的那些，等等。用于形成盐的合适无机碱的实例包括氨、钠、锂、钾、钙、镁、铝、锌等的氢氧化物、碳酸盐和碳酸氢盐。盐也可以与合适的有机碱形成，包括无毒且强度足以形成此类盐的那些。例如，此类有机碱的类别可包括但不限于单-、二-和三烷基胺，包括甲胺、二甲胺和三乙胺；单-、二-或三羟基烷基胺，包括单-、二-和三乙醇胺；氨基酸，包括甘氨酸、精氨酸和赖氨酸；胍；N-甲基氨基葡糖；N-甲基葡糖胺；L-谷氨酰胺；N-甲基哌嗪；吗啉；乙二胺；N-苄基苯乙胺；三羟甲基氨基乙烷。

适当的制剂取决于所选择的施用途径。用于配制和施用本文所述化合物的技术是本领域技术人员已知的。本领域存在多种施用化合物的技术，包括但不限于肠内、口服、直肠、局部、舌下、口腔、耳内、硬膜外、皮外、气雾剂、肠胃外递送，包括肌肉内、皮下、动脉内、静脉内、门静脉内、关节内、皮内、腹膜内、髓内注射、鞘内、直接心室内、腹膜内、鼻内或眼内注射。药物组合物通常会根据具体的预期施用途径进行调整。

如本文所用，“载体”具有其根据说明书理解的普通和普通含义，是指促进化合物通过、递送和/或掺入至细胞、组织和/或身体器官的化合物、颗粒、固体、半固体、液体或稀释剂。

如本文所用，“稀释剂”具有其根据说明书所理解的简单而普通的含义，是指药物组合物中缺乏药理活性但可能是药学上必需或期望的成分。例如，稀释剂可用于增加质量太小而无法制造和/或施用的强效药物的体积。它也可以是用于溶解通过注射、摄入或吸入施用的药物的液体。本领域中稀释剂的常见形式是缓冲水溶液，例如但不限于模拟人血组成的磷酸盐缓冲盐水。

本发明在本文中使用肯定的语言一般地公开以描述多个实施方案。本发明还包括其中全部或部分排除主题例如物质或材料、方法步骤和条件、方案或程序的实施方案。

肠器官发育

在解剖学中，肠道(或肠)是消化道从胃延伸到肛门的部分，在人类和其他哺乳动物中，由两部分组成，小肠和大肠。在人类中，小肠进一步细分为十二指肠、空肠和回肠，而大肠又细分为盲肠和结肠。本文以人体器官为例描述肠器官的结构。本领域普通技术人员将理解，本文所述的方法和系统适用于所有哺乳动物的肠道系统。

肠道可以大致分为两个不同的部分，小肠和大肠。小肠呈灰紫色，直径约35毫米(1.5 英寸)，是第一个也是更长的，成年男性的平均长度为6至7米(20-23英尺)。大肠较短且相对粗壮，呈深红色，平均长约1.5米(5英尺)。

内腔是消化食物通过和吸收营养的空腔。两种肠与整个肠道共享一个总体结构，并由几层组成。

从内腔内径向向外，依次为粘膜(上皮和粘膜肌层)、粘膜下层、外肌层(由内环肌和外纵肌组成)，最后是浆膜。沿着上皮中肠道的整个长度是杯形细胞。这些分泌粘液润滑食物的通过并保护肠道免受消化酶的侵害。隐窝是内陷的黏膜，绒毛是指状突起，其增加肠道的整体表面积，同时还包含与淋巴系统相连的乳糜管，有助于从血液供应中去除脂质和组织液。在发育过程中，上皮发生弯曲和内陷，从而产生脊，这些脊后来分解为隐窝-绒毛结构。微绒毛存在于绒毛的上皮上，并进一步增加了可以发生吸收的表面积。粘膜肌层是一层平滑肌，其有助于沿着肠道持续蠕动和消化。黏膜下层包含神经(例如，迈斯纳神经丛)、血管和带有胶原蛋白的弹性纤维，其随着容量的增加而伸展，但保持肠道的形状。外肌层包括纵肌和平滑肌，它们再次有助于持续的蠕动和消化的物质离开肠道并沿肠道运动。在两层肌肉之间是奥尔巴赫神经丛。浆膜由松散的结缔组织组成，并涂有粘液，以防止肠道与其他组织摩擦造成摩擦损伤。将所有这些固定在适当位置的是肠系膜，它将肠子悬停在腹腔中，并在一个人身体活动时阻止其受到干扰。

PSC的分化

在一些实施方案中，PSC例如ESC和iPSC，首先以逐步的方式定向分化为定形内胚层(DE)，然后进入后/后肠上皮(例如，后肠球状体)，然后进入肠组织。在一些实施方案中，PSC，例如ESC和iPSC，以非逐步方式进行定向分化，其中同时添加用于促进DE形成的分子(例如，生长因子、配体)和用于随后组织形成的分子。

定形内胚层产生肠管。前部DE形成前肠及其相关器官，包括食道、肺、胃、肝脏和胰腺，后部DE形成中肠和后肠，其形成小肠和大肠以及泌尿生殖系统的部分。使用小鼠、鸡和青蛙胚胎的研究表明，在原肠胚阶段建立DE的前后模式是随后前肠和后肠发育的先决条件。Wnt和FGF信号传导途径对于促进后内胚层/后肠或前内胚层/前肠命运至关重要。在后肠中，简单的立方上皮首先发育为假复层柱状上皮，然后发育为含有极化柱状上皮的绒毛和绒毛底部的增殖区，其与推定的祖细胞域相对应。

先前在美国专利9,719,068中已经描述了在体外定向DE分化为肠组织的稳健且有效的过程。在一些实施方案中，定向分化是通过选择性激活iPSC和/或DE细胞中的某些信号传导途径来实现的。在一些实施方案中，信号传导途径是那些在肠道发育中活跃的信号传导途径，包括但不限于Wnt信号传导途径；Wnt/APC信号传导途径；FGF信号传导途径；TGF-β信号传导途径；BMP信号传导途径；Notch信号传导途径；Hedgehog信号传导途径；LKB信号传导途径；和Par极性信号传导途径。

由多能细胞(例如iPSC或ESC)产生定形内胚层的任何方法均适用于本文所述的方法。在一些实施方案中，多能细胞衍生自桑椹胚。在一些实施方案中，多能干细胞是干细胞。用于这些方法中的干细胞可包括但不限于胚胎干细胞。胚胎干细胞可以衍生自胚胎内细胞团或胚胎性腺嵴。胚胎干细胞或生殖细胞可以来源于各种动物物种，包括但不限于各种哺乳动物物种，包括人类。在一些实施方案中，人胚胎干细胞用于产生定形内胚层。在一些实施方案中，人胚胎生殖细胞用于产生定形内胚层。在一些实施方案中，iPSC用于产生定形内胚层。在一些实施方案中，人iPSC(hiPSC)用于产生定形内胚层。

在一些实施方案中，胚胎干细胞或生殖细胞或iPSC用一种或多种小分子化合物、激活剂、抑制剂或生长因子处理一段时间，其为、约为、至少为、至少约为、不超过或不超过约6小时、12小时、18小时、24小时、36小时、48小时、60小时、72小时、84小时、96 小时、120小时、150小时、180小时、240小时、300小时或由上述时间中的任意两个限定的范围例如6小时至300小时、24小时至120小时、48小时至96小时、6小时至72小时或24小时至300小时内的任何时间。在一些实施方案中，添加多于一种小分子化合物、激活剂、抑制剂或生长因子。在这些情况下，可以同时或分别添加多于一种的小分子化合物、激活剂、抑制剂或生长因子。

在一些实施方案中，胚胎干细胞或生殖细胞或iPSC用一种或多种小分子化合物、激活剂、抑制剂或生长因子以如下浓度处理：其为、约为、至少为、至少约为、不超过或不超过约10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、75ng/mL、100ng/mL、120ng/mL、150ng/mL、200 ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL、1200ng/mL、1500ng/mL、2000ng/mL、5000ng/mL、7000 ng/mL、10000ng/mL或15000ng/mL，或在由上述浓度中的任何两个限定的范围例如10ng/mL 至15000ng/mL、100ng/mL至5000ng/mL、500ng/mL至2000ng/mL、10ng/mL至2000ng/mL 或1000ng/mL至15000ng/mL内的任何浓度。在一些实施方案中，一种或多种小分子化合物、激活剂、抑制剂或生长因子的浓度在整个治疗期间保持在恒定水平。在一些实施方案中，一种或多种小分子化合物、激活剂、抑制剂或生长因子的浓度在治疗过程中变化。在一些实施方案中，添加多于一种小分子化合物、激活剂、抑制剂或生长因子。在这些情况下，多于一种小分子化合物、激活剂、抑制剂或生长因子的浓度可以不同。

在一些实施方案中，ESC、生殖细胞或iPSC在支持干细胞生长的生长培养基中培养。在一些实施方案中，ESC、生殖细胞或iPSC在干细胞生长培养基中培养。在一些实施方案中，干细胞生长培养基是RPMI 1640、DMEM、DMEM/F12、红细胞扩增培养基、 Minigut培养基、StemPro 34SFM(无血清培养基)、StemPro hESC SFM、mTeSR 1或mTeSR Plus培养基。在一些实施方案中，干细胞生长培养基包含胎牛血清(FBS)。在一些实施方案中，干细胞生长培养基包含以下浓度的FBS：为、约为、至少为、至少约为、不超过或不超过约0％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、2％、3％、 4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、 19％或20％，或由上述浓度中的任何两个定义的范围内例如0％至20％、0.2％至10％、2％至 5％、0％至5％或2％至20％的任何百分比。在一些实施方案中，干细胞生长培养基不含异种成分。在一些实施方案中，生长培养基包含一种或多种小分子化合物、激活剂、抑制剂或生长因子。

在一些实施方案中，使用富集定形内胚层细胞的细胞群。在一些实施方案中，分离或基本纯化定形内胚层细胞。在一些实施方案中，分离的或基本上纯化的定形内胚层细胞以比 OCT4、AFP、TM、SPARC或SOX7标志物中的一种或多种(例如至少1、3、5种)更大的程度表SOX17、FOXA2或CXRC4标志物中的一种或多种(例如至少1、3种)。

也考虑富集具有定形内胚层的细胞群的方法。在一些实施方案中，定形内胚层细胞可通过将细胞与试剂接触而从混合细胞群中分离或基本纯化，所述试剂与存在于定形内胚层细胞表面但不存在于混合细胞群中其它细胞表面的分子结合，然后分离与试剂结合的细胞。在某些实施方案中，存在于定形内胚层细胞表面的细胞成分为CXCR4。

一些实施方案涉及CXCR4抗体，SDF-1蛋白或配体或CXCR4的其他蛋白或配体可用于获得富集、分离或基本纯化形式的定形内胚层细胞。例如，CXCR4抗体、SDF-1蛋白质或配体或CXCR4的另一种蛋白质或配体可用作方法中的试剂，例如基于亲和性的分离或基于磁性的分离，以富集、分离或基本纯化与试剂结合的定形内胚层细胞的制剂。

在一些实施方案中，定形内胚层细胞和hESC用一种或多种生长因子处理。这种生长因子可以包括来自TGF-β超家族的生长因子。在一些实施方案中，所述一种或多种生长因子可包含TGF-β超家族的Nodal/激活素和/或BMP亚组。在一些实施方案中，一种或多种生长因子选自由以下组成的组：Nodal、激活素A、激活素B、BMP4、Wnt3a或任何这些生长因子的组合。

在一些实施方案中，激活素诱导的定形内胚层(DE)可以进一步经历FGF/Wnt诱导的后内胚层形成、后肠特化和形态发生，以及最终促进肠道生长、形态发生和细胞分化为功能性肠细胞类型的前肠培养系统，所述类型包括间充质、肠细胞、杯形细胞、帕内特细胞和肠内分泌细胞。在一些实施方案中，人PSC在体外被有效地定向分化为肠上皮，其包括分泌细胞、内分泌细胞和吸收细胞类型。应当理解，可以将诸如生长因子的分子添加到发育的任何阶段以促进特定类型的肠组织形成。

在一些实施方案中，FGF和Wnt蛋白质或配体用于模拟培养中的早期后肠特化，通过定向分化将从iPSC或ESC发育的DE转化为有效产生所有主要肠细胞类型的后肠上皮。在人类中，DE的定向分化是通过选择性激活某些对肠发育重要的信号传导途径而实现的。

体外人类肠道发育发生在接近以下的阶段：胎儿肠道发育；内胚层形成、后内胚层模式化、后肠形态发生、胎儿肠道发育、上皮形态发生、推定祖细胞域的形成，以及分化为肠道功能细胞类型。例如，在人类中，编码Wnt信号传导蛋白的基因包括但不限于Wnt1、 Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、 Wnt8b、Wnt9a、Wnt9b、Wnt10a、Wnt10b、Wnt11和Wnt16。

本领域技术人员将理解，改变一种或多种Wnt信号传导蛋白的浓度、表达或功能与改变一种或多种FGF蛋白的浓度、表达或功能相结合可以产生根据本发明的定向分化。在一些实施方案中，与Wnt和/或FGF信号传导途径相关的细胞成分，例如，途径的天然抑制剂、拮抗剂、激活剂或激动剂可用于导致Wnt和/或FGF信号传导途径的抑制或激活。在一些实施方案中，使用与Wnt和/或FGF信号传导途径相关联的siRNA和/或shRNA靶向细胞成分来抑制或激活这些途径。

成纤维细胞生长因子(FGF)是参与血管生成、伤口愈合和胚胎发育的生长因子家族。FGF是肝素结合蛋白，与细胞表面相关的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的相互作用已显示是FGF 信号转导所必需的。FGF是多种细胞和组织增殖和分化过程中的关键参与者。在人类中，已鉴定出FGF家族的22个成员，所有这些成员都是结构相关的信号传导分子。FGF1到FGF10成员都与成纤维细胞生长因子受体(FGFR)结合。FGF1又称酸性，FGF2又称碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。成员FGF11、FGF12、FGF13和FGF14，也称为FGF同源因子 1-4(FHF1-FHF4)，与FGF相比已显示出具有明显的功能差异。尽管这些因子具有非常相似的序列同源性，但它们不与FGFR结合并参与和FGF无关的细胞内过程。该组也称为“iFGF”。成员FGF15到FGF23较新，没有被良好表征。FGF15是人类FGF19的小鼠直系同源物(因此没有人类FGF15)。基于其与非洲爪蟾(Xenopus)FGF-20(XFGF-20)的同源性鉴定了人FGF20。与其他FGF的局部活性相反，FGF15/FGF19、FGF21和FGF23具有更多的全身作用。

在一些实施方案中，本领域技术人员可以理解，任何FGF都可以与来自Wnt信号传导途径的蛋白质联合使用。在一些实施方案中，所用的FGF是FGF1、FGF2、FGF3、 FGF4、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF8、FGF9、FGF10、FGF11、FGF12、 FGF13、FGF14、FGF15(FGF19、FGF15/FGF19)、FGF16、FGF17、FGF18、FGF20、 FGF21、FGF22、FGF23中的一种或多种。

PSC分化为DE培养物，随后分化为各种中间成熟肠细胞类型，可以通过阶段特异性细胞标志物的存在来确定。在一些实施方案中，代表性细胞成分的表达用于确定DE形成。代表性细胞成分包括但不限于CMKOR1、CXCR4、GPR37、RTN4RL1、SLC5A9、 SLC40A1、TRPA1、AGPAT3、APOA2、C20orf56、C21orf129、CALCR、CCL2、CER1、 CMKOR1、CRIP1、CXCR4、CXorf1、DIO3、DIO30S、EB-1、EHHADH、ELOVL2、 EPSTI1、FGF17、FLJ10970、FLJ21195、FLJ22471、FLJ23514、FOXA2、FOXQ1、 GATA4、GPR37、GSC、LOC283537、MYL7、NPPB、NTN4、PRSS2、RTN4RL1、SEMA3E、SIAT8D、SLC5A9、SLC40A1、SOX17、SPOCK3、TMOD1、TRPA1、TTN、 AW166727、AI821586、BF941609、AI916532、BC034407、N63706或AW772192，或其任何组合。在一些实施方案中，细胞成分例如前肠标志物Pdx1和白蛋白的缺乏可用于揭示定向的后肠形成。在一些实施方案中，可以使用一种或多种(例如至少1、3种)肠转录因子 CDX2、KLF5或SOX9来代表肠发育。在一些实施方案中，GATA4或GATA6蛋白表达的一种或多种可用于代表肠发育。

在一些实施方案中，形态变化可用于表示定向分化的进展。在一些实施方案中，球状体(例如，中后肠、后肠、前部前肠或后部前肠球状体)经受3维培养条件以使其成熟。在一些实施方案中，胃肠类器官成熟的天数是、大约是、至少是、至少大约是、不超过或不超过大约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、 25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60天，或由上述天数中的任何两个限定的范围例如6至60天、20至50天、30至40天、6至50天或30至60 天内的任何天数。在一些实施方案中，在球状体形成后可以观察到被间充质细胞包围的高度卷绕的上皮。在一些实施方案中，胃肠类器官、极化柱状上皮、杯形细胞或平滑肌细胞可在数天内观察到，天数是、大约是、至少是、至少大约是、不超过或不超过大约6、7、8、 9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、 29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、 49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60天，或由上述天数中的任何两个限定的范围例如6至60天、20至50天、30至40天、6至50天或30至60天内的任何天数。

在一些实施方案中，多能干细胞通过“一步”法转化为肠细胞类型。例如，一种或多种可将多能干细胞分化为DE培养物的分子(例如激活素A)与可促进DE培养物定向分化的其他分子(例如Wnt3a和FGF4)组合以直接处理多能干细胞。

在一些实施方案中，多能干细胞由体细胞制备。在一些实施方案中，多能干细胞是从活检获得的生物组织制备的。在一些实施方案中，多能干细胞从PBMC制备。在一些实施方案中，人PSC由人PBMC制备。在一些实施方案中，多能干细胞由冷冻保存的PBMC制备。在一些实施方案中，PBMC在饲养细胞基底上生长。在一些实施方案中，PBMC在小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)饲养细胞基底上生长。在一些实施方案中，PBMC在经辐照的MEF饲养细胞基底上生长。在一些实施方案中，PBMC在0.1％明胶上生长。

在一些实施方案中，多能干细胞是通过病毒转导从PBMC制备的。在一些实施方案中，PBMC用仙台病毒、慢病毒、腺病毒或腺相关病毒或其任何组合转导。在一些实施方案中，PBMC用包含Oct3/4、Sox2、Klf4或L-Myc或其任何组合的表达载体的仙台病毒转导。在一些实施方案中，PBMC用一种或多种病毒以MOI转导，所述MOI为、约为、至少为、至少约为、不超过或不超过约0、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5或 5.0MOI，或由上述MOI中的任意两个限定的范围例如0至5.0、1.0至4.0、2.0至3.0、0至 3.0或1.0至5.0内的任何MOI。在一些实施方案中，转导后，PBMC表达干细胞重编程因子。在一些实施方案中，转导后，PBMC被重编程为iPSC。在一些实施方案中，iPSC在饲养细胞基底上生长。在一些实施方案中，iPSC在MEF饲养细胞基底上生长。在一些实施方案中，iPSC在经辐照的MEF饲养细胞基底上生长。在一些实施方案中，iPSC在0.1％明胶上生长。在一些实施方案中，iPSC在RPMI1640、DMEM、DMEM/F12、红细胞扩增培养基、 Minigut培养基、StemPro 34SFM(无血清培养基)、StemPro hESC SFM、mTeSR 1或mTeSR Plus培养基中生长。

在一些实施方案中，重编程的iPSC在细胞培养物中扩增。在一些实施方案中，iPSC在基质胶(Matrigel)中扩增。在一些实施方案中，iPSC在包含ROCK抑制剂(例如Y-27632)的细胞培养基中扩增。在一些实施方案中，iPSC被扩增直到80-95％汇合。在一些实施方案中，iPSC分化为定形内胚层细胞。在一些实施方案中，iPSC通过使iPSC与激活素A接触而分化成定形内胚层细胞。在一些实施方案中，iPSC进一步与BMP4接触。在一些实施方案中，iPSC与浓度为以下的BMP4接触：其是、大约是、至少是、至少大约是、不超过或不超过大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15ng/mL的BMP4。

在一些实施方案中，定形内胚层细胞分化为中后肠球状体。在一些实施方案中，通过使定形内胚层细胞与一种或多种(例如至少1或2种)GSK3抑制剂或FGF4接触，使定形内胚层细胞分化为中后肠球状体。在一些实施方案中，GSK3抑制剂是CHIR99021。在一些实施方案中，FGF4是重组FGF4。在一些实施方案中，在不使定形内胚层细胞与一种或多种(例如至少1或2种)GSK3抑制剂或FGF4接触的情况下使定形内胚层细胞分化为中后肠球状体。在一些实施方案中，在不使定形内胚层与CHIR99021或FGF4或两者接触的情况下使定形内胚层细胞分化为中后肠球状体。在一些实施方案中，通过使定形内胚层细胞与表皮生长因子(EGF)接触，使定形内胚层细胞分化成中后肠球状体。

在一些实施方案中，将中后肠球状体包埋在基底膜或基底膜模拟物中。在一些实施方案中，中后肠球状体包埋在基质胶中。在一些实施方案中，中后肠球状体在基础肠培养基中培养。在一些实施方案中，中后肠球状体在基础肠道培养基中培养以将中后肠球状体区分为肠类器官。在一些实施方案中，基础肠道培养基包含高级DMEM-F12、N2补充剂、不含维生素A的B27补充剂、HEPES、L-谷氨酰胺、青霉素-链霉素、或表皮生长因子(EGF)中的一种或多种，或其任何组合。在一些实施方案中，基础肠道培养基包含EGF。在一些实施方案中，中后肠球状体通过孔过滤。在一些实施方案中，中后肠球状体通过70μm孔径过滤。在一些实施方案中，中后肠球状体被分成小于70μm的球状体和大于70μm的球状体。在一些实施方案中，大于70μm的球状体用于本文所述的方法。

在一些实施方案中，定形内胚层细胞分化为球状体。在一些实施方案中，通过使定形内胚层细胞与GSK3抑制剂、FGF4、BMP抑制剂或视黄酸(RA)中的一种或多种(例如至少 1、2、3、4种)接触，使定形内胚层细胞分化为球状体。在一些实施方案中，GSK3抑制剂是CHIR99021。在一些实施方案中，FGF4是重组FGF4。在一些实施方案中，BMP抑制剂是Noggin。在一些实施方案中，在不使定形内胚层细胞与GSK3抑制剂、FGF4、BMP抑制剂或RA中的一种或多种(例如至少1、2、3、4种)接触的情况下，使定形内胚层细胞分化为球状体。在一些实施方案中，在不使定形内胚层与CHIR99021、FGF4、Noggin或RA或其任何组合接触的情况下使定形内胚层细胞分化成球状体。在一些实施方案中，通过使定形内胚层细胞与表皮生长因子(EGF)接触，使定形内胚层细胞分化成球状体。

在一些实施方案中，将球状体包埋在基底膜或基底膜模拟物中。在一些实施方案中，球状体包埋在基质胶中。在一些实施方案中，球状体在生长培养基中培养以将球状体分化为类器官。在一些实施方案中，球状体通过孔过滤。在一些实施方案中，球状体通过70μm孔径过滤。在一些实施方案中，球状体被分成小于70μm的球状体和大于70μm的球状体。在一些实施方案中，大于70μm的球状体用于本文所述的方法。

未成形的类器官

在一些实施方案中，胃肠类器官是食道类器官、胃类器官、胃底类器官、胃窦类器官、小肠(肠)类器官或大肠(结肠)类器官。在一些实施方案中，胃肠类器官是肠类器官。在一些实施方案中，胃肠类器官是人肠类器官(HIO)。在一些实施方案中，胃肠类器官不是通过本文公开的任何方法形成。在一些实施方案中，胃肠类器官包括大体球形的三维结构，其包括极化的柱状上皮。在一些实施方案中，极化的柱状上皮被间充质包围。在一些实施方案中，间充质包括平滑肌样层。在一些实施方案中，上皮包括隐窝样增殖区和绒毛样结构。在一些实施方案中，间充质包括层叠的纵肌和环肌。在一些实施方案中，胃肠类器官包含具有胃肠器官的所有主要功能细胞类型的固有层。在一些实施方案中，大体球形的胃肠类器官包含分层的间充质。

成形类器官及其制造方法

在一些实施方案中，胃肠类器官是成形胃肠类器官。在一些实施方案中，胃肠类器官是成形食道类器官、成形胃类器官、成形胃底类器官、成形胃窦类器官、成形小肠(肠)类器官或成形大肠(结肠)类器官，或其任何组合。在一些实施方案中，胃肠类器官是肠类器官。在一些实施方案中，成形胃肠类器官是HIO。在一些实施方案中，成形胃肠类器官包括大致管状的三维结构，其包括极化的柱状上皮。在一些实施方案中，极化的柱状上皮被间充质包围。在一些实施方案中，间充质包括平滑肌样层。在一些实施方案中，上皮包括隐窝样增殖区和绒毛样结构。在一些实施方案中，间充质包括层叠的纵肌和环肌。在一些实施方案中，成形胃肠类器官包含具有胃肠器官的所有主要功能细胞类型的固有层。在一些实施方案中，成形胃肠类器官包含分层的间充质。

在一些实施方案中，成形胃肠类器官是细长胃肠类器官。在一些实施方案中，胃肠类器官形成细长结构。在一些实施方案中，使用本文所述的形成托盘实施方案之一将胃肠类器官形成细长结构。在一些实施方案中，成形胃肠类器官具有直的或基本上直的形状。在一些实施方案中，成形胃肠类器官具有至少一个维度是直的或基本上直的形状。在一些实施方案中，成形胃肠类器官具有所有维度都是直的或基本直的形状。在一些实施方案中，成形胃肠类器官具有长方体、立方体、圆柱体、圆锥体或锥体形状。在一些实施方案中，成形胃肠类器官具有弯曲的或基本上弯曲的形状。在一些实施方案中，成形胃肠类器官具有至少一个维度是弯曲的或基本弯曲的形状。在一些实施方案中，成形胃肠类器官具有所有维度都是弯曲的或基本上弯曲的形状。在一些实施方案中，成形胃肠类器官具有球形形状。在一些实施方案中，成形胃肠类器官具有非球形形状。在一些实施方案中，成形胃肠类器官的形状具有至少一个弯曲的表面但否则将是直的。在一些实施方案中，成形胃肠类器官具有弯曲的长方体、弯曲的立方体、弯曲的圆柱形、弯曲的圆锥形、弯曲的金字塔形、抛物线形、抛物面形、双曲线形、双曲面形、椭圆形、螺盘形、螺旋形、正弦波、正弦形、蛇形、方波、三角形波、锯齿波、梭形、树枝状、分支状或放射状，或它们的任何组合。在一些实施方案中，将如本文公开制备的球状体(例如中后肠球状体)接种到形成托盘的收集通道的凹槽中。在一些实施方案中，将球状体以以下球状体数量接种到收集通道中：每个收集通道中其是、大约是、至少是、至少大约是、不超过或不超过大约100、500、1000、1500、2000、2500、 3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000或 10000个球状体，或者由上述数量中的任何两个限定的范围例如100到10000个球状体、 2000到8000个球状体、3000到4000个球状体、100到4000个球状体或3000到10000个球状体内的任何数量。在一些实施方案中，将球状体以如下密度接种到收集通道中，所述密度是、大约是、至少是、至少大约是、不超过或不超过大约100、200、300、400、500、 600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900 或2000个球状体/mm³,或者由上述密度中的任何两个限定的范围例如100至2000个球状体 /mm³、500至1500个球状体/mm³、100至1000个球状体/mm³或1000至2000个球状体/mm³内的任何密度。在一些实施方案中，形成托盘的收集通道或组织培养板或两者中的球状体在 Minigut培养基中培养，其包含高级DMEM-F12、谷氨酰胺、HEPES、青霉素、链霉素、N2 补充剂、B27补充剂或EGF，或其任何组合。在一些实施方案中，Minigut培养基包含EGF。在一些实施方案中，EGF是重组EGF。在一些实施方案中，形成托盘的收集通道中或组织培养板中或两者中的球状体在基质胶中培养。在一些实施方案中，形成托盘的收集通道中或组织培养板中或两者中的球状体在基质胶和Minigut培养基的50％混合物中培养。在一些实施方案中，球状体在收集通道中生长的天数是、大约是、至少是、至少大约是、不超过或不超过大约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10天，或上述任意两个值的范围，例如1-10天、3- 7天、1-5天、4-10天、6-9天或7-10天。选择的球状体类型由期望的类器官决定，例如，中后肠球状体用于制备肠类器官、后肠球状体用于制备结肠类器官、前部前肠球状体用于制备食管类器官、或后部前肠球状体用于制备胃类器官。在一些实施方案中，球状体是中后肠球状体。在一些实施方案中，球状体是后肠球状体。在一些实施方案中，球状体是前肠球状体。在一些实施方案中，球状体是前部前肠球状体。在一些实施方案中，球状体是后部前肠球状体。

在一些实施方案中，成形胃肠类器官是细长胃肠类器官。在一些实施方案中，细长胃肠类器官包括细长长度、宽度、深度或直径，或它们的任何组合。在一些实施方案中，细长长度是、大约是、至少是、至少大约是、不超过或不超过大约1、2、3、4、5、6、7、8、 9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、 29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、 49或50毫米，或由上述长度中的任何两个限定的范围内的任何长度，例如，1至50mm、 10至40mm、20至30mm、1至30mm或20至50mm。在一些实施方案中，宽度是、大约是、至少是、至少大约是、不超过或不超过大约0.2μm、1μm、5μm、10μm、50μm、 100μm、200μm、300μm、400μm、500μm、600μm、700μm、800μm、900μm、1000μm、 1200μm、1300μm、1400μm、1500μm、1600μm、1700μm、1800μm、1900μm、2000μm、 2500μm或3000μm，或由上述宽度中的任何两个限定的范围内的任何宽度，例如0.2μm至 3000μm、200μm至1500μm、500μm至1000μm、0.2μm至1000μm μm或500μm至3000μm。在一些实施方案中，深度是、大约是、至少是、至少大约是、不超过或不超过大约0.2μm、 1μm、5μm、10μm、50μm、100μm、200μm、300μm、400μm、500μm、600μm、700μm、 800μm、900μm、1000μm、1200μm、1300μm、1400μm、1500μm、1600μm、1700μm、 1800μm、1900μm、2000μm、2500μm或3000μm，或由上述深度中的任何两个限定的范围内的任何深度，例如0.2μm至3000μm、200μm至1500μm、500μm至1000μm、0.2μm至1000μm μm或500μm至3000μm。在一些实施方案中，直径是、大约是、至少是、至少大约是、不超过或不超过大约0.2μm、1μm、5μm、10μm、50μm、100μm、200μm、300μm、400 μm、500μm、600μm、700μm、800μm、900μm、1000μm、1200μm、1300μm、1400μm、 1500μm、1600μm、1700μm、1800μm、1900μm、2000μm、2500μm或3000μm，或由上述直径中的任何两个限定的范围内的任何直径，例如0.2μm至3000μm、200μm至1500μm、 500μm至1000μm、0.2μm至1000μm μm或500μm至3000μm。在一些实施方案中，细长长度与宽度、深度或直径中的一个或多个(例如1、2、3个)或其任何组合的比率是、大约是、至少是、至少大约是、不超过或不超过大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、 50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、500000、 60000、70000、80000、90000、100000、200000、300000、400000或500000，或由上述比率中的任何两个限定的范围内的任何比率，例如1到500000、100到500000、1000到10000、1到500000或1000到500000。在一些实施方案中，细长胃肠类器官的体积是、大约是、至少是、至少大约是、不超过或不超过大约100μm³、200μm³、300μm³、400μm³、 500μm³、600μm³、700μm³、800μm³、900μm³、1000μm³、10000μm³、100000μm³、1000000 μm³，或0.01mm³、0.1mm³、1mm³、2mm³、3mm³、4mm³、5mm³、6mm³、7mm³、8mm³、9 mm³、10mm³、100mm³、1000mm³、1500mm³或2000mm³，或由上述体积中的任何两个限定的范围内例如100μm³至2000mm³、1000μm³至1000mm³、0.1mm³至5mm³、100μm³至1mm³或1mm³至2000mm³的任何体积。在一些实施方案中，细长胃肠球状体由以下球状体数量构成或形成：其是、大约是、至少是、至少大约是、不超过或不超过大约100、500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、 8000、8500、9000或10000个球状体，或者由上述数量中的任何两个限定的范围例如100 至10000个球状体、2000至8000个球状体、3000至4000个球状体、100至4000个球状体或3000至10000个球状体内的任何数量。在一些实施方案中，细长胃肠球状体由以如下密度聚集的球状体构成或形成，所述密度是、大约是、至少是、至少大约是、不超过或不超过大约100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、 1500、1600、1700、1800、1900或2000个球状体/mm³,或者由上述密度中的任何两个限定的范围例如100至2000个球状体/mm³、500至1500个球状体/mm³、100至1000个球状体/mm³或1000至2000个球状体/mm³内的任何密度。如前所述，选择的球状体类型由期望的类器官决定，例如，中后肠球状体用于制备肠类器官、后肠球状体用于制备结肠类器官、前部前肠球状体用于制备食管类器官、或后部前肠球状体用于制备胃类器官。在一些实施方案中，球状体是中后肠球状体。在一些实施方案中，球状体是后肠球状体。在一些实施方案中，球状体是前肠球状体。在一些实施方案中，球状体是前部前肠球状体。在一些实施方案中，球状体是后部前肠球状体。

在一些实施方案中，球状体在收集通道中形成时受到张力。在一些实施方案中，球状体在收集通道中形成之后经受张力。在一些实施方案中，在收集通道中形成的球状体在如本文更详细描述的组织培养板中生长。在一些实施方案中，组织培养板包括尼龙网片和可变形橡胶膜。在一些实施方案中，成形形式的球状体在尼龙网片之间对齐并锚定到尼龙网片。在一些实施方案中，可变形橡胶膜在形成的球状体上施加机械载荷。在一些实施方案中，可变形橡胶膜对形成的球状体施加单轴应变。在一些实施方案中，可变形橡胶膜赋予单轴应变，该应变引起伸长百分比，其为、约为、至少为、至少约为、不超过或不超过约0％、1％、 2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％的伸长率，或由上述百分比中的任何两个限定的范围例如0％至20％、5％至15％、8％至12％、0％至10％或10％至20％内的任何百分比。在一些实施方案中，单轴应变增强了球状体的细长结构。在一些实施方案中，经历单轴应变的球状体分化成细长胃肠类器官。选择的球状体类型由期望的类器官决定，例如，中后肠球状体用于制备肠类器官、后肠球状体用于制备结肠类器官、前部前肠球状体用于制备食管类器官、或后部前肠球状体用于制备胃类器官。在一些实施方案中，球状体是中后肠球状体。在一些实施方案中，球状体是后肠球状体。在一些实施方案中，球状体是前肠球状体。在一些实施方案中，球状体是前部前肠球状体。在一些实施方案中，球状体是后部前肠球状体。

在一些实施方案中，本文所述的胃肠类器官是食管类器官、胃类器官、胃底类器官、胃窦类器官、肠类器官或结肠类器官，或其任何组合。在一些实施方案中，本文所述的胃肠类器官是肠类器官。在一些实施方案中，本文所述的胃肠类器官是HIO。在一些实施方案中，根据本文所述的方法产生肠类器官。在一些实施方案中，根据本文所述的方法产生胃肠类器官。在一些实施方案中，未成形胃肠类器官根据本领域已知的方法产生。在一些实施方案中，球状体(例如中后肠、后肠、前部前肠或后部前肠球状体)和未成形胃肠类器官(例如食道、胃、胃底、胃窦、肠或结肠类器官)及其制造方法已经在美国专利9,719,068和 10,174,289以及PCT公开WO 2016/061464、WO 2017/192997、WO 2018/106628、WO 2019/074793中描述，其中每一篇通过引用明确地并入本文，用于产生相应未成形胃肠类器官的目的。在一些实施方案中，本文所述的胃肠类器官或参考出版物中所述的未成形胃肠类器官使用本文所述的一个或多个形成托盘制备为成形胃肠类器官。在一些实施方案中，通过在本文所述的形成托盘的一个或多个收集通道中培养球状体以将球状体分化为成形胃肠类器官，本文所述或参考出版物中所述的球状体(例如中后肠、后肠、前部前肠或后部前肠球状体)用于制备成形胃肠类器官(例如食道、胃、胃底、胃窦、肠或结肠类器官)。在一些实施方案中，收集通道中的球状体的培养在参考出版物中针对感兴趣的特定类器官公开的条件下进行。在一些实施方案中，本文所述或参考出版物中所述的球状体用于制备成形肠类器官。在一些实施方案中，本文所述或参考出版物中所述的球状体用于制备成形HIO。在一些实施方案中，本文所述的一个或多个形成托盘用于形成包含本文所述的一个或多个特征的成形胃肠类器官(例如食道、胃、胃底、胃窦、肠或结肠类器官)。在一些实施方案中，本文所述的一个或多个形成托盘用于形成成形肠类器官。在一些实施方案中，本文所述的一个或多个形成托盘用于形成成形HIO。

形成托盘实施方案

本文公开了用于从多个球状体制备成形类器官结构的形成托盘的实施方案。在一些实施方案中，成形类器官结构用于例如研究胃肠功能或移植到宿主生物体(例如人、小鼠、大鼠、狗、猫或其他哺乳动物)中的目的。在一些实施方案中，成形类器官结构是细长类器官结构。在一些实施方案中，球状体是中后肠球状体并且细长类器官是肠类器官，例如细长 HIO。在一些实施方案中，形成托盘(10)具有为预定形状设计的结构，该结构被配置为更紧密地弥补期望的器官以使用。形成托盘(10)更具体地具有一个或多个(例如至少1、3、5、10 个)收集通道(12)，其被配置为接收球状体并根据限定预定形状的总体布置来聚集球状体。在一个或多个收集通道(12)内持续培养球状体一段预定的形成时间有效地将球状体相对于彼此分配为浇铸状态(cast state)，该状态配置为将球状体保持在预定形状，尤其是在从一个或多个收集通道(12)移出球状体以用于进一步培养和/或植入后。在一些实施方案中，预定形状是非球形的预定形状，例如细长柱。在一些实施方案中，一个或多个收集通道(12)的细长柱预定形状限定所述浇铸状态以维持细长柱预定形状中的球状体的排列。在一些实施方案中，根据说明书，本文所用的术语“浇铸状态”具有其平常的和普通的含义，并且指的是球状体相对于彼此固定以保持预定形状，同时允许一些运动，使得预定形状保持柔性，包括但不限于弹性柔性或延展性柔性。在一些实施方案中，浇铸状态和预定形状不旨在将球状体的布置限制为刚性、固定状态，并且应当理解，预定形状将被充分保持以弥补期望器官功能，同时允许外科医生在植入过程中操纵和结构连接至期望器官。

图2A-C图示了包括多个收集通道(12)的形成托盘(10)的实施方案。本实施方案的多个收集通道(12)中的每一个都具有细长长度(14)、宽度(16)和深度(18)。在一些实施方案中，细长长度(14)在纵向方向上延伸，其是、大约是、至少是、至少大约是、不超过或不超过大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、 22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、 42、43、44、45、46、47、48、49或50毫米，或由上述长度中的任何两个限定的范围例如 1至50mm、10至40mm、20至30mm、1至30mm或20至50mm内的任何长度，并且由形成托盘(10)的相对纵向侧壁(20)限定。在一些实施方案中，宽度(16)在侧向方向上延伸，其是、大约是、至少是、至少大约是、不超过或不超过大约0.2μm、1μm、5μm、10μm、 50μm、100μm、200μm、300μm、400μm、500μm、600μm、700μm、800μm、900μm、1000 μm、1200μm、1300μm、1400μm、1500μm、1600μm、1700μm、1800μm、1900μm、 2000μm、2500μm或3000μm，或由上述宽度中的任何两个限定的范围例如0.2μm至 3000μm、200μm至1500μm、500μm至1000μm、0.2μm至1000μm μm或500μm至3000μm内的任何宽度，其垂直于纵向并由相对的横向侧壁(22)限定。在一些实施方案中，深度(18)在横向方向上延伸，其是、大约是、至少是、至少大约是、不超过或不超过大约0.2μm、 1μm、5μm、10μm、50μm、100μm、200μm、300μm、400μm、500μm、600μm、700μm、 800μm、900μm、1000μm、1200μm、1300μm、1400μm、1500μm、1600μm、1700μm、 1800μm、1900μm、2000μm、2500μm或3000μm，或由上述深度中的任何两个限定的范围例如0.2μm至3000μm、200μm至1500μm、500μm至1000μm、0.2μm至1000μm μm或500μm 至3000μm内的任何深度，其垂直于纵向和侧向。在一些实施方案中，深度(18)限定在形成托盘(10)的上表面(26)中的通道开口(24)和形成托盘(10)的下表面(28)之间。在一些实施方案中，多个收集通道(12)中的每一个因此被限定在相应的纵向侧壁(20)、侧向侧壁(22)、通道开口(24)和下表面(28)之间。在一些实施方案中，多个收集通道(12)中的每一个具有半球形纵向端部，其曲率半径是、大约是、至少是、至少大约是、不超过或不超过大约0.2μm、1 μm、5μm、10μm、50μm、100μm、200μm、300μm、400μm、500μm、600μm、700μm、 800μm、900μm、1000μm、1200μm、1300μm、1400μm、1500μm、1600μm、1700μm、 1800μm、1900μm、2000μm、2500μm或3000μm，或由上述半径中的任意两个限定的范围例如0.2μm至3000μm、200μm至1500μm、500μm至1000μm、0.2μm至1000μm或500μm至 3000μm内的任何半径，其中在其间延伸的大体圆柱形形状的另一曲率半径是、大约是、至少是、至少大约是、不超过或不超过大约0.2μm、1μm、5μm、10μm、50μm、100μm、 200μm、300μm、400μm、500μm、600μm、700μm、800μm、900μm、1000μm、1200 μm、1300μm、1400μm、1500μm、1600μm、1700μm、1800μm、1900μm、2000μm、2500μm或3000μm，或由上述半径中的任意两个限定的范围例如0.2μm至3000μm、200μm至 1500μm、500μm至1000μm、0.2μm至1000μm或500μm至3000μm内的任何半径。在一些实施方案中，多个收集通道(12)中的每一个的体积是、大约是、至少是、至少大约是、不超过或不超过大约100μm³、200μm³、300μm³、400μm³、500μm³、600μm³、700μm³、800 μm³、900μm³、1000μm³、10000μm³、100000μm³、1000000μm³，或0.01mm³、0.1mm³、1 mm³、2mm³、3mm³、4mm³、5mm³、6mm³、7mm³、8mm³、9mm³、10mm³、100mm³、1000 mm³、1500mm³或2000mm³，或由上述体积中的任何两个限定的范围内例如100μm³至 2000mm³、1000μm³至1000mm³、0.1mm³至5mm³、100μm³至1mm³或1mm³至2000mm³的任何体积。在一些实施方案中，形成托盘(10)具有具有相同或大致相同的长度(14)、相同或大致相同的宽度(16)和相同或大致相同的深度(18)尺寸的多个收集通道(12)或一个或多个(例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)收集通道(12)。在一些实施方案中，多个收集通道 (12)或一个或多个收集通道(12)中的收集通道不必具有相同或大约相同的长度(14)，不必具有相同或大约相同的宽度(16)，或不必具有相同或大约相同的深度(18)尺寸，或其任何组合。在一些实施方案中，形成托盘(10)具有彼此平行或大致平行的多个收集通道(12)或一个或多个收集通道(12)。在一些实施方案中，多个收集通道(12)或一个或多个收集通道(12)中的收集通道不必彼此平行或大致平行。在一些实施方案中，形成托盘(10)包括盖，该盖被配置为覆盖多个收集通道(12)或一个或多个收集通道(12)中的一个或多个(例如至少1、2、3、 4、5、6、7、8、9、10个)收集通道。在一些实施方案中，一个或多个收集通道(12)形成为没有通道开口(24)以便被封装而不是在上表面(26)处开口。在一些实施方案中，一个或多个 (例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)封装的收集通道(12)包括管结构或软管结构。在一些实施方案中，形成托盘(10)并非旨在不必要地限于图2A-C的实施例中所示或本文所述的特定数量、布置或尺寸的收集通道(12)。

在一些实施方案中，一个或多个收集通道(12)被配置为将球状体聚集在一起为限定预定形状的总体布置。在一些实施方案中，一个或多个收集通道(12)从相对较宽的通道开口(24) 朝向相对较窄的下表面(28)逐渐变细。图2A-C图示了形成托盘(10)的实施方案，其中相对的纵向侧壁(20)从通道开口(24)到下表面(28)朝向彼此逐渐变细，而相对的侧向侧壁(22)类似地从通道开口(24)到下表面(28)朝向彼此逐渐变细。在一些实施方案中，重力迫使一个或多个收集通道(12)中的球状体沿横向向下，而由纵向和侧向侧壁(20、22)施加到球状体的反作用力引导球状体向上和向内朝向彼此以有效地将球状体以预定形状聚集在一起。

在一些实施方案中，一个或多个收集通道(12)不受图2A-C中描绘的实施方案的限制。在一些实施方案中，一个或多个收集通道具有直的或基本上直的形状。在一些实施方案中，一个或多个收集通道具有至少一个维度是直的或基本上直的形状。在一些实施方案中，一个或多个收集通道具有所有尺寸都是直的或基本上直的形状。在一些实施方案中，一个或多个收集通道具有长方体、立方体、圆柱体、圆锥体或棱锥体形状。在一些实施方案中，一个或多个收集通道具有弯曲的或基本弯曲的形状。在一些实施方案中，一个或多个收集通道具有至少一个维度弯曲或基本弯曲的形状。在一些实施方案中，一个或多个收集通道具有所有尺寸都是弯曲的或基本弯曲的形状。在一些实施方案中，一个或多个收集通道具有球形形状。在一些实施方案中，一个或多个收集通道具有非球形形状。在一些实施方案中，一个或多个收集通道的形状具有至少一个弯曲的表面但否则将是直的。在一些实施方案中，一个或多个收集通道具有弯曲的长方体、弯曲的立方体、弯曲的圆柱形、弯曲的圆锥形、弯曲的金字塔形、抛物线形、抛物面形、双曲线形、双曲面形、椭圆形、螺盘形、螺旋形、正弦波、正弦形、蛇形、方波、三角形波、锯齿波、梭形、树枝状、分支状或放射状，或它们的任何组合。在一些实施方案中，成形胃肠类器官以此处和别处描述的一个或多个收集通道的任何一种形状适当地形成。

在一些实施方案中，一个或多个收集通道(12)中的每一个都包括适合于一个或多个收集通道(12)的体积的多个球状体和液体培养基。在一些实施方案中，一个或多个收集通道(12) 中的每一个包含的球状体数量是、大约是、至少是、至少大约是、不超过或不超过大约 100、500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、 6500、7000、7500、8000、8500、9000或10000个球状体，或者由上述数量中的任何两个限定的范围例如每个收集通道(12)100至10000个球状体、2000至8000个球状体、3000至4000个球状体、100至4000个球状体或3000至10000个球状体内的任何数量。在一些实施方案中，包含的球状体数量是、大约是、至少是、至少大约是、不超过或不超过大约100、 500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、 7000、7500、8000、8500、9000或10000个球状体，或者由上述数量中的任何两个限定的范围例如100至10000个球状体、2000至8000个球状体、3000至4000个球状体、100至 4000个球状体或3000至10000个球状体内的任何数量的一个或多个收集通道(12)中的每一个具有的长度(14)是、大约是、至少是、至少大约是、不超过或不超过大约10、15或20 mm，宽度(16)是、大约是、至少是、至少大约是、不超过或不超过大约0.5mm，并且深度 (18)是、大约是、至少是、至少大约是、不超过或不超过大约0.5mm。在一些实施方案中，球状体以预定密度聚集，所述预定密度是、大约是、至少是、至少大约是、不超过或不超过大约100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、 1500、1600、1700、1800、1900或2000个球状体/mm³,或者由上述密度中的任何两个限定的范围例如100至2000个球状体/mm³、500至1500个球状体/mm³、100至1000个球状体/mm³或1000至2000个球状体/mm³内的任何密度。

在图2A-C所示的实施方案中，一个或多个收集通道(12)的纵向侧壁(20)、侧向侧壁 (22)和下表面(28)是弓形的，每个具有曲率半径，以便为管状，且彼此连续。在一些实施方案中，纵向侧壁(20)、侧向侧壁(22)或下表面(28)中的一个或多个(例如至少1、3、5、10个) 相交以不连续。在一些实施方案中，一个或多个收集通道(12)中的一个或多个(例如至少1、 3、5、10个)侧壁(20、22)和一个或多个(例如至少1、3、5、10个)下表面(28)因此并非旨在不必要地限于图2A-C的实施方案中所示或本文所述的光滑、连续的表面。在一些实施方案中，一个或多个(例如至少1、3、5、10个)收集通道(12)的形状和尺寸被配置用于球状体例如本文所述的胃肠球状体的有效生长。在一些实施方案中，一个或多个(例如至少1、3、5、10个)收集通道(12)的形状和尺寸被配置用于不是胃肠球状体的球状体的有效生长。在一些实施方案中，一个或多个收集通道(12)无意被不必要地限制于附图的实施方案中所示或本文所述的特定形状和/或尺寸。

在一些实施方案中，形成托盘(10)具有单一整体结构。在一些实施方案中，形成托盘 (10)由生物相容性材料制造。在一些实施方案中，形成托盘(10)由生物相容性材料制造，该材料抑制球状体在一个或多个收集通道(12)内附着至形成托盘(10)，同时允许球状体发育成胃肠类器官结构。在一些实施方案中，形成托盘(10)由多个组件形成，其中一个或多个收集通道(12)内的至少表面由生物相容性材料制成。在一些实施方案中，生物相容性材料包括、基本上由或由以下组成：不锈钢、钛、聚合有机硅化合物、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、玻璃、塑料、PVC、PE、PP、PMMA、PS、PTFE、尼龙、聚氨酯、PET、PES、透明质酸、壳聚糖、糖、陶瓷、氧化铝、氧化锆、生物玻璃、羟基磷灰石或其任何组合，或本领域已知的任何其他生物相容性材料。在一些实施方案中，形成托盘(10)是无菌的、抗组织和/或细胞粘附的，包括疏水表面，包括改善所公开组织的形成以及随后的移除和/或使用的特征，或其任何组合。在一些实施方案中，形成托盘(10)包含促进生长和/或分化的一种或多种(例如至少1、3、5、10种)小分子化合物、激活剂、抑制剂、生长因子、核酸、DNA、RNA、肽、多肽或蛋白质，或其任何组合。

图3A-D显示了用于在形成托盘(10)中培养的多个预先布置的球状体(30)的实施方案。在一些实施方案中，在将多个iPSC分化为多个定形内胚层细胞(36)的条件下，例如本文描述的或本领域中以其他方式已知的条件下，在生物相容性容器(34)内培养多个iPSC(32)。在一些实施方案中，多个定形内胚层细胞(36)在生物相容性容器(34)内的多个定形内胚层细胞分化成多个球状体(38)的条件下培养，例如在本文描述的或本领域中以其他方式已知的条件下。在一些实施方案中，球状体(38)是后肠球状体。在一些实施方案中，球状体(38)是前肠球状体。在一些实施方案中，球状体(38)是前部前肠球状体。在一些实施方案中，球状体 (38)是后部前肠球状体。在一些实施方案中，球状体(38)是中后肠球状体。在一些实施方案中，球状体(38)不是中后肠球状体。在一些实施方案中，随着多个球状体(38)的形成，支架股线(40)被引入靠近多个球状体(38)。在一些实施方案中，支架股线(40)永久地或半永久地放置或容纳在生物相容性容器(34)内或附近，使得球状体能够在形成时接触支架股线(40)。在一些实施方案中，支架股线(40)由生物相容性材料形成，该材料被配置为吸引和接触发育中的球状体(38)，并且进而将发育中的球状体(38)推入多个预先布置的球状体(30)中。在一些实施方案中，支架股线(40)具有与收集通道(12)互补的形状，使得多个预先布置的球状体 (30)更有效地收集在生物相容容器(34)内和从生物相容容器(34)中移除。在一些实施方案中，支架股线(40)通常是线性和纤维状的。在一些实施方案中，支架股线(40)是绳、纤维、线、缆或被配置成吸引和布置球状体(38)的其他结构。在一些实施方案中，支架股线(40)由合适的金属或非金属生物相容性材料构成，该材料被配置为吸引球状体同时允许球状体发育成类器官。

在一些实施方案中，一旦多个预先布置的球状体(30)被充分地种子过滤(seedfilter)，具有附接到其上的预先布置的球状体(30)的支架股线(40)被移除并且预先布置的球状体(30)被转移进入一个或多个收集通道(12)(图4)。在一些实施方案中，然后可以丢弃支架股线(40)，留下预定形状的预先布置的球状体(30)。在一些实施方案中，虽然线性预先布置的球状体(30) 简化了进入互补形状的收集通道(12)中的放置，但可以在不使用支架股线(40)的情况下培养此类球状体(38)并将其从生物相容性容器(34)中移除。图4显示了在第一天(d1)、第三天(d3) 和第五天(d5)在一个或多个收集通道(12)内培养的预先布置的球状体(30)的实施方案。在一些实施方案中，预先布置的球状体(30)在一个或多个收集通道(12)中培养预定的形成时间段，如本文所述(参见，例如上文)，使得融合发生在预先布置的球状体(30)的间充质之间、血液供应形成、神经支配发生或球状体采用预定形状(例如，如本文所述的细长胃肠类器官的细长柱)，或其任何组合。

在一些实施方案中，预先布置的球状体被转移到组织培养板(FlexcellInternational Corp.，Burlington NC)。在一些实施方案中，组织培养板包括尼龙网片和位于尼龙网片之间的可变形橡胶膜。在一些实施方案中，预先布置的球状体在尼龙网片之间的可变形橡胶膜上对齐，使得预先布置的球状体的长度(即最长尺寸)位于尼龙网片上和其间。在一些实施方案中，尼龙网片用作锚定器以保持预先布置的球状体的端部。在一些实施方案中，组织培养板包括位于可变形橡胶膜下方的真空室，其中向组织培养板施加真空，可变形橡胶膜朝向真空室拉伸。在一些实施方案中，将预先布置的球状体放置在尼龙网片之间的可变形橡胶膜上，同时对组织培养板施加真空。在一些实施方案中，然后释放真空，使可变形橡胶膜返回到未拉伸状态。在一些实施方案中，返回到未拉伸状态对位于可变形橡胶膜顶部的预先布置的球状体施加应变。在一些实施方案中，应变是单轴应变。在一些实施方案中，应变是向外指向尼龙网片的单轴应变。在一些实施方案中，单轴应变赋予预先布置的球状体百分比伸长率为、约为、至少为、至少约为、不超过或不超过约0％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、 7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％的伸长率，或由上述百分比中的任何两个限定的范围例如0％至20％、5％至15％、8％至12％、0％至10％或10％至20％内的任何百分比。在一些实施方案中，由可变形橡胶膜赋予的单轴应变使预先布置的球状体保持细长形状。在一些实施方案中，预先布置的球状体在组织培养板中在应变下培养的天数是、大约是、至少是、至少大约是、不超过或不超过大约1、2、3、 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、 45、46、47、48、49或50天，或由上述天数中的任何两个限定的范围例如1至50天、10 至40天、20至30天、1至30天或20至50天内的任何培养天数。

在一些实施方案中，一个或多个收集通道(12)的尺寸和维度和/或成形胃肠类器官的尺寸和维度被适当地配置用于小鼠或近似小鼠尺寸的其他生物体。在一些实施方案中，一个或多个收集通道(12)的尺寸和维度和/或成形胃肠类器官的尺寸和维度被适当地配置用于人。在一些实施方案中，收集通道(12)的细长长度(14)或成形胃肠类器官的长度在纵向方向上延伸为、约为、至少为、至少约为、不超过或不超过约1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、 240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、 560、570、580、590或600cm，或由上述长度中的任何两个限定的范围例如1到600cm、 100到500cm、200到300cm、1到300cm或200到600cm内的任何长度。在一些实施方案中，收集通道(12)的宽度(16)或成形胃肠类器官的宽度在侧向方向上延伸为、约为、至少为、至少约为、不超过或不超过约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、 15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30cm，或由上述宽度中的任何两个限定的范围例如1至30cm、5至25cm、10至20cm、1到20cm或10到30 cm内的任何宽度。在一些实施方案中，收集通道(12)的深度(18)或成形胃肠类器官的深度在横向方向上延伸为、约为、至少为、至少约为、不超过或不超过约1、2、3、4、5、6、7、 8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、 28、29或30cm，或由上述深度中的任何两个限定的范围例如1至30cm、5至25cm、10至 20cm、1到20cm或10到30cm内的任何深度。在一些实施方案中，成形胃肠类器官的直径为、约为、至少为、至少约为、不超过或不超过约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、 11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30 cm，或由上述直径中的任何两个限定的范围例如1至30cm、5至25cm、10至20cm、1至20cm或10至30cm内的任何直径。在一些实施方案中，收集通道(12)或成形胃肠类器官的体积为、约为、至少为、至少约为、不超过或不超过约1、10、100、200、300、400、 500、600、700、800、900、1000、5000、10000、50000、100000、500000、1000000、 5000000或10000000cm³，或者由上述体积的任何两个限定的范围例如1至10000000cm³、 500至1000000cm³、10000至100000cm³、1至100000cm³或10000至10000000cm³内的任何体积。在一些实施方案中，收集通道(12)包括多个球状体和适合收集通道体积的液体培养基，以形成具有适合人类的尺寸和维度的成形胃肠类器官。在一些实施方案中，收集通道 (12)包括的球状体数量是、大约是、至少是、至少大约是、不超过或不超过大约10²、10³、 10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰、10¹¹、10¹²、10¹³、10¹⁴、10¹⁵、10¹⁶、10¹⁷、10¹⁸、10¹⁹或 10²⁰个球状体，或由上述数字中的任意两个限定的范围例如10²到10²⁰、10⁵到10¹⁵、10⁸到 10¹²、10²到10¹⁰或10¹⁰到10²⁰个球状体内的任意数量的球状体。在一些实施方案中，成形胃肠类器官由许多球状体形成，这些球状体适于形成具有适合人类的尺寸和维度的的成形胃肠类器官。在一些实施方案中，成形胃肠类器官由以下数量的球状体形成，其是、大约是、至少是、至少大约是、不超过或不超过大约10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰、 10¹¹、10¹²、10¹³、10¹⁴、10¹⁵、10¹⁶、10¹⁷、10¹⁸、10¹⁹或10²⁰个球状体，或由上述数字中的任意两个限定的范围例如10²到10²⁰、10⁵到10¹⁵、10⁸到10¹²、10²到10¹⁰或10¹⁰到10²⁰个球状体内的任意数量的球状体。在一些实施方案中，合适配置用于人的成形胃肠类器官是成形食道类器官、成形胃类器官、成形胃底类器官、成形胃窦类器官、成形小肠(肠)类器官或成形大肠 (结肠)类器官。在一些实施方案中，合适配置用于人的成形胃肠类器官是成形肠类器官。在一些实施方案中，合适配置用于人的成形胃肠类器官是成形HIO。

如本文在一些实施方案中所公开的，通过允许球状体在某些条件下在体外生长，获得了源自PSC的成形胃肠类器官。在一些实施方案中，所得成形胃肠类器官用作临床有益组织，其可用于研究或治疗多种不同的疾病状态，包括但不限于短肠、肠衰竭、坏死性小肠结肠炎(NEC)、损伤、溃疡、乳糜泻、克罗恩病、病原体感染、癌症、肠梗阻或肠易激综合征，或其任何组合。在一些实施方案中，所得成形胃肠类器官用于研究食道、胃、肠或结肠功能，包括但不限于药物筛选、神经功能、微生物组相互作用或移植，或其任何组合。在一些实施方案中，所得成形胃肠类器官用于研究肠功能。在一些实施方案中，成形胃肠类器官包括功能性内腔。在一些实施方案中，成形胃肠类器官具有在移植后进一步分化的能力。在一些实施方案中，成形胃肠类器官在体外生长至胎儿阶段，并且在移植时进一步分化。在一些实施方案中，成形胃肠类器官是细长胃肠类器官。在一些实施方案中，成形胃肠类器官是细长肠类器官。在一些实施方案中，成形胃肠类器官是细长HIO。在一些实施方案中，根据本文所述的任何一种方法使用本文所述的形成托盘中的任一种制备成形胃肠类器官。

本文公开了产生成形胃肠类器官的方法。在一些实施方案中，成形胃肠类器官包括内腔。在一些实施方案中，成形胃肠类器官是如本文所述的细长胃肠类器官。在一些实施方案中，该方法包括将多个球状体放入包括预定形状的收集通道中，并在收集通道中培养所述多个球状体以将多个球状体分化为具有所述预定形状的成形胃肠类器官。在一些实施方案中，成形胃肠类器官包括间充质和内腔。在一些实施方案中，间充质是凝聚的间充质。在一些实施方案中，成形胃肠类器官经历自发神经支配。在一些实施方案中，多个球状体包括的球状体数量是、大约是、至少是、至少大约是、不超过或不超过大约2500、3000、3500、4000、4500或5000个球状体或由上述数字中的任何两个限定的范围例如2500至5000个球状体、3000至4000个球状体、2500至4000个球状体或3000至5000个球状体内的任何数量的球状体。在一些实施方案中，预定形状包括长度。在一些实施方案中，长度是、大约是、至少是、至少大约是、不超过或不超过大约10、11、12、13、14、15、16、17、18、 19、20、21、22、23、24或25毫米，或由上述长度中的任何两个限定的范围例如10至25 mm、15至20mm、10至20mm或15至25mm内的任何长度。在一些实施方案中，长度是细长长度。在一些实施方案中，预定形状包括直径。在一些实施方案中，直径直径是、大约是、至少是、至少大约是、不超过或不超过大约300μm、400μm、500μm、600μm、700μm、 800μm、900μm或1000μm，或由上述直径中的任意两个限定的范围例如300μm至1000μm、 500μm至800μm、300μm至600μm或500μm至1000μm内的任何直径。在一些实施方案中，长度与直径的比率是、大约是、至少是、至少大约是、不超过或不超过大约10、20、30、 40、50、60、70、80、90或100，或由上述比率中的任何两个限定的范围例如10到100、 30到80、40到60、10到50或50到100之间的任何比率。在一些实施方案中，胃肠类器官的体积是、大约是、至少是、至少大约是、不超过或不超过大约0.1mm³、0.5mm³、1mm³、2mm³、3mm³、4mm³、5mm³、6mm³、7mm³、8mm³、9mm³、10mm³、11mm³、12 mm³、13mm³、14mm³、15mm³、16mm³、17mm³、18mm³、19mm³、20mm³、21mm³、22 mm³、23mm³、24mm³或25mm³，或由上述体积中的任意两个限定的范围例如0.1mm³至25 mm³、10mm³至25mm³或10mm³至20mm³内的任何体积。在一些实施方案中，细长胃肠球状体由以如下密度聚集的球状体构成或形成，所述密度是、大约是、至少是、至少大约是、不超过或不超过大约100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、 1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900或2000个球状体/mm³,或者由上述密度中的任何两个限定的范围例如100至2000个球状体/mm³、500至1500个球状体/mm³、100 至1000个球状体/mm³或1000至2000个球状体/mm³内的任何密度。在一些实施方案中，收集通道具有非球形形状并且成形胃肠类器官是非球形胃肠类器官。在一些实施方案中，收集通道具有细长形状并且成形胃肠类器官是细长胃肠类器官。在一些实施方案中，内腔在成形胃肠类器官的整个长度上不是连续的。在一些实施方案中，成形胃肠类器官是成形人胃肠类器官。在一些实施方案中，成形胃肠类器官源自从PBMC细胞、活检组织样品或仙台病毒转导的体细胞重编程的诱导多能干细胞。

在一些实施方案中，多个球状体在收集通道中培养数天，其是、大约是、至少是、至少大约是、不超过或不超过大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、 16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30天。在一些实施方案中，多个球状体在生长培养基中培养。在一些实施方案中，生长培养基是Advanced DMEM- F12。在一些实施方案中，生长培养基是Minigut培养基。在一些实施方案中，生长培养基补充有EGF。在一些实施方案中，生长培养基不补充CHIR99021或FGF4，或两者。在一些实施方案中，多个球状体包含间充质。在一些实施方案中，多个球状体在多个球状体的间充质处融合。

在一些实施方案中，本文所述的方法进一步包括在成形胃肠类器官上诱导机械应变。在一些实施方案中，机械应变促进成形胃肠器官的自发神经支配。在一些实施方案中，机械应变减少成形胃肠类器官的成熟时间。在一些实施方案中，机械应变是单轴拉伸应变。

在一些实施方案中，成形胃肠类器官还包含肠神经元细胞或肠神经元祖细胞，或两者。在一些实施方案中，成形胃肠类器官包括一个或多个肠肌间神经丛。在一些实施方案中，一个或多个肠肌间神经丛包含表达神经元标志物PGP9.5的细胞。在一些实施方案中，成形胃肠类器官具有神经元活性。在一些实施方案中，成形胃肠类器官包括被间充质包围的极化柱状上皮。在一些实施方案中，间充质包括平滑肌样层。在一些实施方案中，成形胃肠类器官包括图案化为隐窝样增殖区或绒毛样结构或两者的上皮。在一些实施方案中，成形胃肠类器官包括层叠的纵肌和环肌。在一些实施方案中，成形胃肠类器官包含平滑肌或肠上皮下肌成纤维细胞或两者的标志物。在一些实施方案中，成形胃肠类器官包含肠细胞、肠内分泌细胞、杯形细胞、帕内特细胞中的一种或多种或其任何组合。在一些实施方案中，成形胃肠类器官包含表达绒毛蛋白、Muc2、DEFA5、CHGA或OLFM4中的一种或多种或其任何组合的细胞。在一些实施方案中，成形胃肠类器官在体外被血管化。在一些实施方案中，成形胃肠类器官在植入个体后血管化。

本文描述的是形成托盘的实施方案。在一些实施方案中，形成托盘用于培养一种或多种胃肠类器官。在一些实施方案中，形成托盘用于培养一种或多种成形胃肠类器官。在一些实施方案中，形成托盘用于培养一种或多种细长胃肠类器官。在一些实施方案中，形成托盘包括一个或多个收集通道，该收集通道被配置为在其中接收一种或多种多个球状体。在一些实施方案中，一个或多个收集通道具有细长形状。在一些实施方案中，一个或多个收集通道具有非球形形状。在一些实施方案中，一个或多个收集通道被配置成将一种或多种多个球状体聚集在一起，使得一种或多种多个球状体限定预定形状。在一些实施方案中，一种或多种球状体分化成具有预定形状的一种或多种胃肠类器官。在一些实施方案中，一种或多种球状体分化成具有预定形状的一种或多种细长胃肠类器官。在一些实施方案中，一个或多个收集通道由生物相容性材料制成，该材料被配置为抑制一种或多种多个球状体附着于其上。在一些实施方案中，一个或多个收集通道包括位于其中的一种或多种多个球状体。在一些实施方案中，一个或多个收集通道在其中包含细胞培养基或细胞外基质，或两者。在一些实施方案中，一个或多个收集通道还包括位于其中的一种或多种胃肠类器官。在一些实施方案中，一种或多种胃肠类器官是通过本文所述的任何一种方法产生的一种或多种成形胃肠类器官。

本文描述的是试剂盒的实施方案。在一些实施方案中，该试剂盒用于培养胃肠类器官。在一些实施方案中，该试剂盒包括成形托盘，该成形托盘包括一个或多个收集通道。在一些实施方案中，形成托盘是本文所述的形成托盘中的任一种。在一些实施方案中，该试剂盒包括多个球状体，该球状体被配置为被接收在形成托盘的一个或多个收集通道内。在一些实施方案中，该试剂盒包括被配置为接收在形成托盘的一个或多个收集通道内的细胞培养基。

移植和治疗方法

在一些实施方案中，在如本文所述的成形胃肠类器官的预定形成时间和产生之后，将所述成形胃肠类器官移植到例如作为治疗或实验模型的宿主生物体中，如本文所述。在一些实施方案中，成形胃肠类器官是细长胃肠类器官。在一个实施方案中，在成形胃肠类器官 (46)的预定形成时间和产生之后，将成形胃肠类器官(46)移植到宿主生物体(44)中，如图5所示。在一些实施方案中，在将类器官培养以下天数后进行移植，所述天数是、大约是、至少是、至少大约是、不超过或不超过大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、 14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、 34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50天，或由上述天数中的任何两个限定的范围例如1至50天、10至40天、20至30天、1至30天或20至 50天内的任何培养天数。在一些实施方案中，在将类器官培养以下天数后进行移植，所述天数是、大约是、至少是、至少大约是、不超过或不超过大约11、12、13、14、15、16或 17天。在一些实施方案中，成形胃肠类器官在通过本领域已知的其他方法制备的胃肠类器官处于相同或相似成熟状态之前以下天数成熟而足以用于移植和/或研究，其中所述天数是、大约是、至少是、至少大约是、不超过或不超过大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天，或由上述天数中的任何两个限定的范围例如1至20天、5至15天、10至15天、1到15天或10到20天内的任何天数。在一些实施方案中，宿主生物体是哺乳动物。在一些实施方案中，宿主生物体是免疫缺陷哺乳动物。在一些实施方案中，宿主生物体是免疫缺陷小鼠。在一些实施方案中，宿主生物体是猴、狗、仓鼠或大鼠。在一些实施方案中，宿主生物体是免疫受损的猴、狗、仓鼠或大鼠。在一些实施方案中，宿主生物是人。在一些实施方案中，宿主生物体是免疫缺陷的人。在一些实施方案中，宿主生物体是具有免疫活性的人。在一些实施方案中，宿主生物体是用免疫抑制剂治疗的具有免疫活性的人。在一些实施方案中，宿主生物体是具有免疫活性的人并且成形胃肠类器官对于宿主生物体是自体的。在一些实施方案中，宿主生物体是具有免疫活性的人并且成形胃肠类器官对于宿主生物体是同种异体的。在一些实施方案中，宿主生物体是需要胃肠类器官移植的哺乳动物。在一些实施方案中，宿主生物体是需要胃肠类器官移植的人。在一些实施方案中，胃肠类器官并非旨在不必要地限于如(46)所示或本文所述的成形胃肠类器官。

在一些实施方案中，胃肠类器官是如本文所述的大致球形的胃肠类器官、成形胃肠类器官或细长胃肠类器官。在一些实施方案中，将胃肠类器官植入到动物肠道附近。在一些实施方案中，胃肠类器官被植入动物的肠系膜脉管系统的顶部。在一些实施方案中，胃肠类器官用粘合剂固定。在一些实施方案中，粘合剂是氰基丙烯酸酯胶。在一些实施方案中，胃肠类器官通过器官-肠吻合连接到动物的胃肠道。在一些实施方案中，吻合是侧对侧吻合或端对端吻合。在一些实施方案中，胃肠类器官在动物体内生长的天数是、大约是、至少是、至少大约是、不超过或不超过大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、 16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、 36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、 56、57、58、59或60天。在一些实施方案中，该胃肠类器官比同时制备的体外胃肠类器官生长得更大。在一些实施方案中，胃肠类器官表现出与宿主生物组织的整合。

在一些实施方案中，胃肠类器官包括胃肠细胞系。在一些实施方案中，胃肠类器官包含间充质、粘液细胞、壁细胞、主细胞、胃泌素细胞、肺泡细胞、肠细胞、肠内分泌细胞、杯形细胞、微褶细胞、杯状细胞、簇状细胞或帕内特细胞中的一种或多种，或其任何组合。在一些实施方案中，胃肠类器官包含表达VILLIN、MUC2、DEFA5、CHGA或OLFM4中的一种或多种(例如1、3、5种)或其任何组合的细胞。在一些实施方案中，胃肠类器官自发地发育胃肠细胞系。

在一些实施方案中，肠类器官包含胃肠细胞系。在一些实施方案中，胃肠类器官包含间充质、肠细胞、肠内分泌细胞、杯形细胞或帕内特细胞中的一种或多种，或其任何组合。在一些实施方案中，肠类器官包含表达VILLIN、MUC2、DEFA5、CHGA或OLFM4中的一种或多种(例如1、3、5种)或其任何组合的细胞。在一些实施方案中，肠类器官自发地发展肠细胞系。

在一些实施方案中，胃肠类器官包括神经元结构。在一些实施方案中，胃肠类器官包含表达神经元标志物的细胞。在一些实施方案中，胃肠类器官包含表达PGP9.5的细胞。在一些实施方案中，包含神经元结构或表达神经元标志物的细胞的胃肠类器官在其形成过程中不与任何神经元系细胞例如神经嵴细胞结合。在一些实施方案中，胃肠类器官自发地发育神经元结构。在一些实施方案中，胃肠类器官自发地受到神经支配。在一些实施方案中，胃肠类器官在不经历机械应变的情况下变得受神经支配。在一些实施方案中，胃肠类器官包括一个或多个肠肌间神经丛。在一些实施方案中，胃肠类器官自发地形成一个或多个肠肌间神经丛。在一些实施方案中，胃肠类器官的肠肌间神经丛大小大于根据先前方法(例如见于PCT 公开WO 2016/061464中的方法)与神经嵴细胞组合的胃肠类器官的肠肌间神经丛大小。在一些实施方案中，胃肠类器官包含一个或多个肠肌间神经丛，其占总细胞密度的百分比为、约为、至少为、至少约为、不超过或不超过约总细胞密度的1％、2％、3％、4％、5％、6％、 7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％，或由上述百分比中的任何两个限定的范围例如1％至20％、5％至15％、8％至12％、1％至15％或10％至20％内的任何百分比。

在一些实施方案中，胃肠类器官包括血管或内皮结构。在一些实施方案中，胃肠类器官包含表达血管或内皮标志物的细胞。在一些实施方案中，胃肠类器官不与任何内皮谱系细胞组合。在一些实施方案中，胃肠类器官自发地形成血管或内皮结构。在一些实施方案中，胃肠类器官自发地血管化。在一些实施方案中，血管或内皮结构源自宿主生物。

在一些实施方案中，胃肠类器官包括内腔。在一些实施方案中，胃肠类器官包括占据胃肠类器官总体积的一定百分比的内腔。在一些实施方案中，内腔占据胃肠类器官的总体积的百分比为、约为、至少为、至少约为、不超过或不超过约胃肠类器官的总体积的1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、 17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、 31％、32％、33％、34％、35％、36％、38％、39％或40％，或由上述百分比中的任何两个限定的范围例如1％至40％、10％至30％、15％至20％、1％至20％或10％至40％内的任何百分比。

在一些实施方案中，胃肠类器官相对于通过常规方法产生的类器官表现出基因的上调。在一些实施方案中，相对于通过常规方法产生的类器官，该胃肠类器官表现出以下数量基因的上调，所述数量是、大约是、至少是、至少大约是、不超过或不超过大约100、 150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750或800个基因，或由上述基因数量的任意两个限定的范围例如100到800个基因、200到600个基因、300到 500个基因、100到400个基因或400到800个基因内的任意基因数量。在一些实施方案中，相对于通过常规方法产生的类器官，该胃肠类器官表现出以下数量基因的下调，所述数量是、大约是、至少是、至少大约是、不超过或不超过大约100、150、200、250、300、 350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1100、 1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900或2000个基因，或由上述基因数量的任意两个限定的范围例如100到2000个基因、400到1500个基因、700到1000个基因、 100到1000个基因或1000到2000个基因内的任意基因数量。在一些实施方案中，被上调的基因涉及神经元分化、神经发生、神经元的产生、神经元投射发育、多细胞生物体发育的调节、神经元发育、神经元投射形态发生、细胞粘附、轴突发育或生物粘附中的一种或多种 (例如，至少1、3、5、10种)，或其任何组合。在一些实施方案中，被上调的基因涉及模式规范过程、区域化、前/后模式规范、涉及形态发生的解剖结构形成、动物器官形态发生、胚胎发育、管形态发生、上皮发育、上皮管形态发生、胚胎形态发生、循环系统发育、多细胞生物过程的正调节、多细胞生物发育的调节、管发育、脉管系统发育、细胞分化的调节、血管发育、发育过程的正调节、消化道发育、细胞外基质组织、细胞外结构组织、炎症反应、生物粘附、细胞粘附、创伤反应、细胞增殖调节、防御反应、细胞迁移调节、运动调节、神经元分化、神经元的产生、神经发生、神经元投射发育、神经元发育、多细胞生物体发育的调节、细胞粘附、生物粘附、神经元投射形态发生或细胞投射组织中的一种或多种 (例如，至少1、3、5、10种)，或其任何组合。

本文描述了治疗具有受损胃肠功能的个体或在有需要的个体中改善或抑制有害的胃肠病症的方法。在一些实施方案中，该方法包括将胃肠类器官移植或植入到个体中。在一些实施方案中，胃肠类器官是本文描述的任何一种方法的胃肠类器官。在一些实施方案中，胃肠类器官是食道类器官、胃类器官、胃底类器官、胃窦类器官、小肠(肠)类器官或大肠(结肠) 类器官。在一些实施方案中，胃肠类器官是肠类器官。在一些实施方案中，胃肠类器官是 HIO。在一些实施方案中，胃肠类器官是本文描述的任何一种方法的成形胃肠类器官。在一些实施方案中，胃肠类器官是本文描述的任何一种方法的成形或细长的胃肠类器官。在一些实施方案中，胃肠类器官对个体而言是自体的或同种异体的。在一些实施方案中，胃肠类器官由从个体获得或衍生的诱导多能细胞制备。在一些实施方案中，个体需要胃肠移植。在一些实施方案中，胃肠类器官作为完整的胃肠类器官被移植或植入。在一些实施方案中，移植部位是胃肠组织。

实施例

在以下实施例中更详细地公开了上述实施方案的一些方面，这些实施例绝不旨在限制本公开的范围。本领域技术人员将理解，许多其他实施方案也落入本发明的范围内，如上文和权利要求中所述。

实施例1.从人的体组织(活检或血液)中生成iPSC

收集人类体细胞并用于iPSC生成。通过Ficoll离心来自新鲜全血的外周血单核细胞 (PBMC)部分或解冻的冷冻保存的PBMC是起始材料。将PBMC以在2mL红细胞扩增培养基(EEM)中1-5×10⁶个细胞接种入6孔培养皿的单个孔中，并在37℃、5％CO₂下温育24小时。在第2天，将2mL悬浮液转移到新的6孔培养皿中以选择非贴壁细胞。将非贴壁细胞在37℃、5％CO₂下培养5天。在接下来的5天内，每隔一天将1mL新鲜EEM添加到每个含有细胞的孔中。在第7天，将2mL 0.1％明胶添加到每个供体的新6孔板中，并置于 37℃、5％CO₂培养箱中过夜。在第8天，将约187,500个受辐射的小鼠胚胎成纤维细胞 (MEF)置于涂有明胶的6孔板(每个PBMC供体1孔)上。

在第9天，用仙台病毒转导PBMC。对于每个要转导的样品，将3×10⁵个细胞转移到体积不超过500μL EEM的14mL圆底管中。包含人Klf4、Oct3/4、Sox2(KOS)、人L-Myc (hL-Myc)和人Klf4(hKlf4)转基因(CTS CytoTune 2.1，Invitrogen)的仙台病毒母料预混物以(MOI×细胞数)/(病毒滴度×10^-3(mL/μL))的组分比率制备，其中KOS的MOI为2.5，hL-Myc的MOI 为2.5，hKlf4的MOI为1.5。MOI[感染复数]是指每个细胞的细胞感染单位(CIU)，病毒的效价因病毒制剂而异。将母料预混物加热至37℃。将1mL仙台病毒母料预混物添加到圆底管中的每个样品中。样品在室温下以1000×g离心30分钟。离心后，每管加入1mL温热的 EEM，轻轻重悬细胞，将整个体积接种到12孔板的孔中。将含有样品的板置于37℃、5％ CO₂培养箱中。

在第10天，从12孔板中收集细胞和培养基并转移到15mL锥形管中。用1mL新鲜 EEM冲洗孔，以确保收集到所有细胞。将管在室温下以200×g离心5分钟以从细胞中去除仙台病毒。离心后，将上清液倒入15％漂白消毒剂中以灭活病毒。将细胞沉淀重新悬浮在 0.5mL的EEM中，并铺在24孔板的孔上。细胞在37℃、5％CO₂下温育48小时。为根据上述过程转导的每个样品制备明胶包被的6孔培养皿。

在第11天，从明胶包被的板上吸出明胶，并立即将约187,500个经辐照的MEF在MEF培养基中接种到明胶包被的板上。MEF在37℃、5％CO₂下温育24小时。

在第12天，MEF培养基被移除，MEF板用2mL PBS每孔冲洗两次。将2.5mL的 StemPro34SFM培养基添加到每个MEF孔中。对转导样品进行活细胞计数以确定PBMC的总数。将PBMC以4种浓度(细胞/孔)重新接种到MEF包被的孔中：5×10³、1×10⁵、2.5× 10⁵和5×10⁵。细胞在37℃、5％CO₂下温育24小时。

在第13天和第15天，通过从孔中取出约50％的培养基并添加等体积的新鲜StemPro 34SFM培养基，进行50％的培养基更换。

在第16天，通过从孔中移除约50％的培养基并添加等体积的StemPro hESC培养基+ bFGF(2μg/mL)，进行50％的培养基更换。

在第17-40天，每天使用新鲜的hESC培养基+bFGF(2μg/mL)进行完整的培养基更换，并监测细胞的集落形成(通常在21-28天左右)。一旦细胞达到期望状态，就可以将它们冷冻在1mL冷冻保存介质的1.5mL冷冻瓶中，每瓶大约有1-2百万个细胞，以备将来使用。

实施例2.未成形的人肠类器官(HIO)的生成

将人PSC，其可以是hESC或hiPSC，在无饲养细胞条件下培养在6孔Nunclon Delta表面处理的组织培养皿(Nunc)中，该培养皿涂有hESC合格的基质胶(Corning)并保持在mTeSR1培养基(StemCell Technologies)中。将hPSC首先用Dispase(Thermo Fisher)进行“团块传代”或用Accutase(Thermo Fisher)进行“单细胞传代”，然后在“高”或“低”汇合处重新接种到具有 mTeSR1培养基的hESC合格的基质胶包被的Nunclon 24孔板中。用于进行单细胞传代的hPSC的mTeSR1培养基仅在第一天补充有10μM Y-27632二盐酸盐(一种Rho相关的卷曲螺旋，含蛋白激酶(ROCK)抑制剂，Tocris)。在低汇合处传代的hPSC接受第二天的mTeSR1培养基，使单层达到80-95％的汇合，而在高汇合下传代的hPSC在第一天后预计已经达到80- 95％的汇合。

通过在RPMI 1640培养基(Invitrogen)中用100ng/mL激活素A(Cell GuidanceSystems)处理三天，将细胞分化为定形内胚层。RPMI 1640培养基在激活素A处理的第一天、第二天和第三天分别补充有1x NEAA(Invitrogen)和浓度增加的特定FBS(dFBS，Hyclone)，浓度分别为 0％、0.2％和2.0％。此外，在激活素A处理的第一天，可能会或可能不会补充低浓度的 BMP4(1-15ng/mL的BMP4(R&D Systems)。在此之后，将DE单层然后用中后肠球状体诱导培养基处理四天。中后肠球状体诱导培养基在补充以1x NEAA和2.0％dFBS的RPMI1640中包含3μM CHIR99021(一种糖原合酶激酶3(GSK3)抑制剂，Stemgent)和500ng/mL的FGF4(R&D Systems)。

经过四天的中后肠球状体诱导后，自由漂浮的球状体被收集并包埋入3D基底膜基质胶“圆顶/气泡”中，然后维持在基础肠道培养基中。基础肠道培养基包括Advanced DMEM-F12(Invitrogen)、1x N2补充剂(Invitrogen)、不含维生素A的1x B27补充剂(ThermoFisher)、15 mM HEPES(Life Technologies)、2mM L-谷氨酰胺(Life Technologies)和补充有100ng/mL表皮生长因子(EGF,R&D Systems)的100单位/mL(1x)青霉素-链霉素(LifeTechnologies)。大约两周内，每3-4天或当培养基因pH值而变黄时(以先发生者为准)更换一次培养基。然后将HIO重新铺在新鲜的基质胶中，每个基质胶圆顶的类器官较少，以允许持续扩增。相同的基础肠道培养基处理方案通常再维持两周，可能延长培养时间。

产生的HIO是三维结构(图6A)，其包括被间充质包围的极化柱状上皮，该间充质包括平滑肌样层。上皮被图案化为隐窝样增殖区和绒毛样结构，间充质图案化为层状纵肌和环肌以及具有肠道所有主要功能细胞类型的固有层。此外，用本文方法培养的类器官含有分层间充质并表达平滑肌和肠上皮下肌成纤维细胞的标志物，这些细胞对这些组织在肠中的移植能力至关重要，并且也类似于胎儿肠形态(图6B)。HIO间充质分化先于上皮分化，表明它们创造并了解自己的生态位。

实施例3.成形细长HIO的生成

使用本文描述的收集通道实施方案的体外限制方案产生适合移植的连续圆柱形类器官结构，例如移植到免疫功能受损的动物模型中。观察到，与实施例2的HIO生成方案相比，成功植入之前所需的体外时间减少了大约14天。

图7A描绘了形成圆柱形肠类器官结构的方法。如本文所述，培养hPSC，将其诱导为定形内胚层，并分化为肠球状体。收集球状体后，将它们通过70μm孔径过滤，保留大于70μm的球状体并丢弃较小的球状体。该尺寸截断值似乎具有更好的形成HIO的能力，但对于其他组织类型可能有所不同。将保留的球状体重新悬浮在2mL的Minigut培养基中，并取 50μL样品通过显微镜量化球状体的数量。基于量化，估计球状体的总数。在用Minigut培养基稀释的50％基质胶中，在收集通道的每个凹槽中接种大约3000-4000个球状体。使用的球状体数量取决于凹槽的几何形状；球状体应密集地填充在凹槽中。此处公开的参数是针对具有直径为0.5mm且长度为15mm的半球形横截面的凹槽。

包含球状体的收集通道在37℃下温育30-45分钟。向每个收集通道添加5mLMinigut 培养基，并添加100ng/mL EGF。将培养基在培养第4天更换为新鲜培养基。在培养的第六天，使用Dumont#4镊子小心地从凹槽中取出类器官结构。将类器官结构放入组织训练培养板的孔中，对齐尼龙网片之间的结构。将200-400μL生长因子减少(GFR)基质胶(Corning)添加到板上，覆盖尼龙网片和介于其间的类器官结构。将板在37℃温育90分钟。向每个孔中加入6mL Minigut培养基，并添加100ng/mL EGF。每周两次更换新鲜培养基直至第14天。

图7B显示了通过免疫组织化学在收集通道凹槽(g-HIO)中成形的细长肠类器官的体外生长进程。第6天、第14天和第28天g-HIO结构的苏木精和伊红染色切片。

材料：mTeSR1培养基(StemCell Technologies)Advanced DMEM-F12(Invitrogen)；RPMI 1640(Invitrogen)；hESC合格基质胶(Corning)；特定FBS(Hyclone)；L-谷氨酰胺 (100x)(Invitrogen)；青霉素-链霉素(100x)(Invitrogen)；50x B27补充剂(Invitrogen)；HEPES缓冲液(Invitrogen)；Dispase(Invitrogen)；激活素A(R&DSystems)；FGF4(R&D Systems)； CHIR99021(R&D Systems)；聚二甲基硅氧烷(PDMS)组织培养收集通道支架，带有适当大小的凹槽；GFR基质胶，不含酚红(Corning)；Minigut培养基：Advanced DMEM-F12培养基，补充有2mM谷氨酰胺、10mM HEPES、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、1x N2补充剂、1x B27补充剂；人重组EGF(R&D Systems)；Dumont#4镊子(FineScience Tools)；带有尼龙网锚固件的组织培养板(FlexCell International)。

可以设想，可以使用机加工工艺或3D打印机构建替代的收集通道支架，使用的材料范围广泛，例如金属、玻璃、塑料(例如丙烯腈丁二烯苯乙烯(ABS)、PLA、PP、PC、PS、 PET、尼龙、PE、聚氨酯、PVC、PVDC、PTFE、聚酯、PMMA、PEEK、PEI)。在一些实施方案中，支架最初被制造并用于制备模具，使得类似形状的支架可由生物惰性或通常生物惰性材料例如PDMS或其他硅树脂制成。

实施例4.HIO的移植

给免疫功能受损的小鼠吃抗生素食物(275ppm磺胺甲噁唑和1365ppm甲氧苄啶)。手术前后随意提供食物和水。将小鼠用2％吸入式异氟醚麻醉，腹壁用异丙醇和聚维酮碘以无菌方式准备。做一个1-2cm的中线切口以进入腹腔。盲肠被识别并轻轻拉出，然后是结肠和小肠。肠系膜被张开，识别出回肠远端和升结肠。在距回盲肠交界处1-2拱形的分叉肠系膜血管的位置，放置一滴氰基丙烯酸辛酯/丁酯粘合剂，然后将HIO滴在胶上并使其在适当的位置干燥至少3分钟。类器官结构位于肠上方肠系膜脉管系统附近。然后将肠放回腹腔，给小鼠腹膜内冲洗哌拉西林/他唑巴坦(100mg/kg)。将皮肤封闭成双层，给小鼠皮下注射布诺啡 (Buprenex)(0.05mg/kg)。小鼠的存活被追踪至10周，此时小鼠被人道地安乐死。切除类器官移植物并进行组织学处理。观察到类器官的成功植入和人类PSC衍生组织与相邻小鼠宿主组织的整合(图8A-B)。当植入免疫功能受损的大鼠时，整体成形g-HIO显示出成功的植入和血管化(图8C)。根据以前的方法(例如在WO 2016/061464中)制备的未成形HIO的移植没有移植到免疫功能受损的大鼠中。

测量了HIO的植入百分比和大小。总存活率为85％(n＝17/20)，82％(n＝14/17)HIO成功植入宿主肠系膜。移植的类器官(tHIO)比时间匹配的体外HIO大了大约46倍(图9A-B)。对这种证实具有上皮下成分和肌肉层的天然出现间充质的组织学分析，以及在主要细胞系(包括间充质、肠细胞、肠内分泌细胞、杯形细胞和帕内特细胞)的存在下上皮细胞不断扩增，类似于人类肠(图9C)。

任选地，小鼠经历了类器官到肠道的吻合。在初始类器官移植后的第二次手术中，类器官和相邻的小肠被识别并从腹腔中取出。使用9-0尼龙以间断方式进行侧对侧吻合。完成后，评估吻合口是否有严重渗漏，并将肠放入腹腔，注意避免扭转。50％的小鼠(n＝6)在收获时存活至21天(图9D)。

在额外检查后，在收集通道(凹槽-tHIO，g-tHIO)中培养后植入NSG小鼠的细长肠类器官在植入后自发地形成神经元结构(图9E，使用抗PGP9.5抗体作为泛神经元标志物)。在整个移植的g-tHIO中观察到强大的肠肌间神经丛网络，其是肠神经系统的主要神经元集合。先前已经表明，肠类器官可以通过用PSC衍生的神经嵴细胞(NCC)机械聚集中后肠球状体来进行神经支配(参见WO 2016/061464)。现在在这里证明，由PSC产生并根据本文提供的方案制备的肠类器官在不添加单独的NCC的情况下发育了肠神经系统结构。此外，植入的g-tHIO的丛大小始终大于在以前的球状体/NCC聚合类器官中看到的那些。

材料：小鼠：将雌性或雄性免疫功能受损的NSG(NOD-scid IL2Rgamma^null)小鼠在阻挡设施中容纳在微型隔离系统中。使用的小鼠年龄在6至14周之间。可以设想其他免疫功能受损的动物模型，例如其他免疫功能受损的小鼠模型或免疫功能受损的猴子、狗、仓鼠或大鼠模型。饮食：改良的咀嚼食物(Picolab Rodent Diet 20，LabDiet)补充了275ppm磺胺甲噁唑和1365ppm甲氧苄啶(LabDiet)。流质饮食用于侧对侧吻合手术(Jevity 1Cal)。将0.3mg/mL的 275ppm磺胺甲噁唑和1365ppm甲氧苄啶(Bactrim)在无菌水中稀释，并在侧对侧吻合后随意给予。抗菌药物：100mg/kg的哌拉西林和他唑巴坦在无菌盐水溶液中稀释，用于任何手术 (ZOSYN，Pfizer)。手术器械(Fine Science Tools)：缝合钳、环钳、解剖剪刀、Bishop-Harmon 钳、Halsey持针器、消毒托盘。异氟醚和麻醉系统。无菌7-0不可吸收缝合丝线(PERMA- HAND)、无菌4-0涂层的可吸收缝合线(VICRYL RAPIDE)、无菌9-0不可吸收尼龙缝合线(带锥形切割针)(ETHILON)、氰基丙烯酸辛酯/丁酯局部组织粘合剂(GLUture)。

免疫组织化学：收获移植的HIO，并在4％多聚甲醛(PFA)中固定过夜，然后加工并包埋在石蜡中。制作5μm厚的组织切片并脱蜡，然后进行热诱导表位修复和染色。一抗和二抗的温育均在4℃下在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的1％牛血清白蛋白中温育过夜。使用以下一抗及其各自的稀释物：山羊抗绒毛蛋白(1:100)、小鼠抗HuMuc2(1:1250)、小鼠抗 DEFA5(1:500)、小鼠抗CHGA(1:500)和兔抗OLFM4(1:400)。使用了以下二抗：马抗山羊生物素(1:1000)、马抗小鼠生物素(1:1000)和山羊抗兔生物素(1:1000)。使用基于过氧化物酶的检测系统，然后使用核固红(NUC)作为复染剂(Vector Labs；Polysciences，Inc)。

实施例5.成形肠类器官的转录组学分析

评估了中后肠球状体、未成形的肠类器官和成形的细长肠类器官的基因表达谱。相对于第28天培养未成形的HIO，第28天培养g-HIO表现出499个上调基因和1546个下调基因(图10A)，表明收集通道中的类器官成形过程显著改变了组成细胞的生物活性。与神经元分化、神经发生、神经元生成、神经元投射发育、多细胞有机体发育调节、神经元发育、神经元投射形态发生、细胞粘附、轴突发育和生物粘附相关的基因支持对g-HIO中自发神经发生的观察，以及类器官发育成成熟的器官组织样状态。

还评估了在不同培养时间(第0天[球状体]、第6天、第14天和第28天)在收集通道中生长的g-HIO的基因表达谱(图10B)。每个生长阶段都表现出与不同生物过程相关的基因的富集(图10C)。第0天球状体与涉及形态发生、动物器官形态发生、胚胎发育、管形态发生、上皮发育、上皮管形态发生和胚胎形态发生的模式规范过程、区域化、前/后模式规范、解剖结构形成相关。第6天g-HIO与循环系统发育、多细胞生物过程的正调节、多细胞生物发育的调节、管发育、脉管系统发育、细胞分化的调节、血管发育、发育过程的正调节和消化道发育有关。第14天g-HIO与细胞外基质组织、细胞外结构组织、炎症反应、生物粘附、细胞粘附、创伤反应、细胞增殖调节、防御反应、细胞迁移调节和运动调节有关。第 28天g-HIO与神经元分化、神经元生成、神经发生、神经元投射发育、神经元发育、多细胞有机体发育的调节、细胞粘附、生物粘附、神经元投射形态发生和细胞投射组织相关。这些数据表明在类器官培养期间发生了显著的发育和形态变化，类似于肠道组织的体内发育。

在至少一些先前描述的实施方案中，一个实施方案中使用的一个或多个元件可以互换地用于另一个实施方案中，除非这种替换在技术上不可行。本领域技术人员将理解，在不脱离要求保护的主题的范围的情况下，可以对上文描述的方法和结构进行各种其他省略、添加和修改。所有这些修改和变化都旨在落入由所附权利要求定义的主题范围内。

关于本文中基本上任何复数和/或单数术语的使用，本领域技术人员可以根据上下文和/或应用从复数转换为单数和/或从单数转换为复数。为了清楚起见，本文可以明确地阐述各种单数/复数排列。

本领域技术人员将理解，一般而言，本文使用的术语，尤其是所附权利要求书(例如，所附权利要求书的主体)中使用的术语通常旨在作为“开放”术语(例如，术语“包括”应解释为“包括但不限于”，术语“具有”应解释为“至少具有”，术语“包含”应解释为“包含但不限于”等)。本领域技术人员将进一步理解，如果打算引入特定数量的权利要求引述，则在权利要求中将明确引述这样的意图，并且在没有这样的引述的情况下不存在这样的意图。例如，为了帮助理解，以下所附权利要求可能包含使用介绍性短语“至少一个”和“一个或多个”来引入权利要求引述。然而，此类短语的使用不应被解释为暗示通过不定冠词“一个”或“一种”引入权利要求引述将包含此类引入的权利要求引述的任何特定权利要求限制为仅包含一个此类引述的实施方案，即使当同一权利要求包括引入性短语“一个或多个”或“至少一个”和不定冠词例如“一个”或“一种”(例如，“一个”和/或“一种”应解释为“至少一个”或“一个或多个”)；这同样适用于用于引入权利要求引述的定冠词的使用。此外，即使明确记载了引入的权利要求引述的具体次数，本领域技术人员也将认识到，这种引述应被解释为至少表示所引述的次数(例如，“两次引述”的没有其他修饰语的裸述是指至少两次引述，或两次或更多次引述)。此外，在那些使用类似于“A、B和C等中的至少一个”的约定的情况下，一般而言，这样的构造旨在在本领域技术人员将理解该约定的意义上(例如，“具有A、B和C中的至少一个的系统”将包括但不限于以下系统：仅具有A、仅具有B、仅具有C、A和B一起、A和C一起、B和 C一起，和/或A、B和C一起，等等)。在那些使用类似于“A、B或C等中的至少一个”的约定的情况下，一般而言，这样的构造旨在在本领域技术人员将理解该约定的意义上(例如，“具有A、B或C中的至少一个的系统”将包括但不限于以下系统：仅具有A、仅具有B、仅具有C、A和B一起、A和C一起、B和C一起，和/或A、B和C一起，等等)。本领域技术人员将进一步理解，实际上任何呈现两个或多个替代性术语的分离词和/或短语，无论是在说明书、权利要求或附图中，都应被理解为考虑包括术语之一、术语中任一个或两个术语的可能性。例如，短语“A或B”将被理解为包括“A”或“B”或“A和B”的可能性。

此外，在根据马库什组描述本公开的特征或方面的情况下，本领域技术人员将认识到，因此也根据马库什组的任何个体成员或成员子组来描述本公开。

如本领域技术人员将理解的，对于任何和所有目的，例如在提供书面描述方面，本文公开的所有范围还包括其任何和所有可能的子范围及其子范围的组合。任何列出的范围都可以容易地被识别为充分描述并能够将相同的范围分解为至少相等的一半、三分之一、四分之一、五分之一、十分之一等。作为非限制性示例，这里讨论的每个范围都可以容易地分解为下三分之一、中三分之一和上三分之一等。如本领域技术人员还将理解的，所有语言，例如“高达”、“至少”、“大于”、“小于”和类似词，包括所列举的数字，并且指的是可以随后分解成如上面讨论的子范围的范围。最后，如本领域技术人员将理解的，范围包括每个单独的成员。因此，例如，具有1-3个物品的组是指具有1、2或3个物品的组。类似地，具有1-5个物品的组是指具有1、2、3、4或5个物品的组，以此类推。

虽然本文已经公开了各个方面和实施方案，但其他方面和实施方案对于本领域技术人员来说将是显而易见的。本文公开的各个方面和实施方案是为了说明的目的而不是限制性的，真实范围和精神由所附权利要求指示。

本文引用的所有参考文献，包括但不限于已公开和未公开的申请、专利和文献参考，均通过引用整体并入本文，并由此成为本说明书的一部分。如果通过引用并入的出版物和专利或专利申请与包含在说明书中的公开内容相矛盾，则说明书旨在取代和/或优先于任何此类矛盾材料。

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Claims (54)

1.一种产生包含内腔的成形胃肠类器官的方法，包括：

将多个球状体放入具有预定形状的收集通道中；和

在所述收集通道中培养所述多个球状体以将所述多个球状体分化为具有所述预定形状的成形胃肠类器官；

其中所述成形胃肠类器官包括凝聚的间充质和内腔。

2.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述收集通道具有非球形形状并且所述成形胃肠类器官是非球形胃肠类器官。

3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述收集通道具有细长形状并且所述成形胃肠类器官是细长胃肠类器官。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述细长胃肠类器官包括细长长度和直径。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述细长长度是、大约是、至少是、至少大约是、不超过或不超过大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50毫米，或由上述长度中的任何两个限定的范围例如1至50mm、10至40mm、20至30mm、1至30mm或20至50mm内的任何长度。

6.根据权利要求3-5中任一项所述的方法，其中所述直径是、大约是、至少是、至少大约是、不超过或不超过大约0.2μm、1μm、5μm、10μm、50μm、100μm、200μm、300μm、400μm、500μm、600μm、700μm、800μm、900μm、1000μm、1200μm、1300μm、1400μm、1500μm、1600μm、1700μm、1800μm、1900μm、2000μm、2500μm或3000μm，或由上述直径中的任何两个限定的范围例如0.2μm至3000μm、200μm至1500μm、500μm至1000μm、0.2μm至1000μmμm或500μm至3000μm内的任何直径。

7.根据权利要求3-6中任一项所述的方法，其中所述细长长度与所述直径的比率是、大约是、至少是、至少大约是、不超过或不超过大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、500000、60000、70000、80000、90000、100000、200000、300000、400000或500000，或由上述比率中的任何两个限定的范围例如1到500000、100到500000、1000到10000、1到500000或1000到500000内的任何比率。

8.根据权利要求3-7中任一项所述的方法，其中所述内腔在所述成形胃肠类器官的整个细长长度上不连续。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述成形胃肠类器官是成形人胃肠类器官。

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多个球状体在所述收集通道中培养的天数是、大约是、至少是、至少大约是、不超过或不超过大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60天。

11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多个球状体在所述多个球状体的间充质处融合。

12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述成形胃肠类器官经历自发神经支配。

13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述成形胃肠类器官进一步包含肠神经元细胞或肠神经元祖细胞。

14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述成形胃肠类器官进一步包含一个或多个肠肌间神经丛，其包含表达神经元标志物PGP9.5的细胞。

15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述成形胃肠类器官具有神经元活性。

16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，还包括在所述成形胃肠类器官上诱导机械应变，其中所述机械应变促进所述成形胃肠类器官的自发神经支配，或减少所述成形胃肠类器官的成熟时间，或两者。

17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述机械应变是单轴拉伸应变。

18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述成形胃肠类器官还包括被间充质包围的极化柱状上皮，其中所述间充质包括平滑肌样层。

19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述成形胃肠类器官还包括图案化为隐窝样增殖区或绒毛样结构或两者的上皮。

20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述成形胃肠类器官还包括层叠的纵肌和环肌。

21.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述成形胃肠类器官进一步包含平滑肌或肠上皮下肌成纤维细胞或两者的标志物。

22.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述成形胃肠类器官进一步包含肠细胞、肠内分泌细胞、杯形细胞、帕内特细胞中的一种或多种或其任何组合。

23.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述成形胃肠类器官进一步包含表达绒毛蛋白、Muc2、DEFA5、CHGA或OLFM4中的一种或多种或其任何组合的细胞。

24.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述成形胃肠类器官源自从PBMC细胞、活检组织样品或仙台病毒转导的体细胞重编程的诱导多能干细胞。

25.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述成形胃肠类器官在体外被血管化。

26.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述成形胃肠类器官在植入到个体中时被血管化。

27.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多个球状体是多个中后肠球状体并且所述成形胃肠类器官是成形肠类器官。

28.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多个球状体是多个后肠球状体并且所述成形胃肠类器官是成形结肠类器官。

29.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多个球状体是多个前部前肠球状体并且所述成形胃肠类器官是食管类器官。

30.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多个球状体是多个后部前肠球状体并且所述成形胃肠类器官是胃类器官。

31.根据前述权利要求中任一项所述的方法，包括：

在足以将诱导多能干细胞分化为定形内胚层的条件下培养诱导多能干细胞；

在足以将所述定形内胚层分化成所述多个球状体的条件下培养所述定形内胚层；和

收集所述多个球状体；

然后将所述多个球状体放入所述收集通道中。

32.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述收集步骤包括将所述多个球状体与能够与所述多个球状体结合的结合材料接触。

33.根据权利要求32所述的方法，其中所述结合材料选自金属丝、细绳和纤维中的一种或多种。

34.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多个球状体与支架股线接触。

35.一种治疗胃肠功能受损的个体的方法，包括将胃肠类器官移植到所述个体中。

36.根据权利要求35所述的方法，其中所述胃肠类器官是前述权利要求中任一项所述的成形胃肠类器官。

37.根据权利要求35或36所述的方法，其中所述胃肠类器官对个体而言是自体的或同种异体的。

38.根据权利要求37所述的方法，其中所述胃肠类器官由获自所述个体的诱导多能干细胞制备。

39.根据权利要求35-38中任一项所述的方法，其中所述个体需要胃肠移植。

40.根据权利要求35-39中任一项所述的方法，其中所述胃肠功能是肠功能并且所述胃肠类器官是肠类器官。

41.根据权利要求35-39中任一项所述的方法，其中所述胃肠功能是结肠功能并且所述胃肠类器官是结肠类器官。

42.根据权利要求35-39中任一项所述的方法，其中所述胃肠功能是食管功能并且所述胃肠类器官是食管类器官。

43.根据权利要求35-39中任一项所述的方法，其中所述胃肠功能是胃功能并且所述胃肠类器官是胃类器官。

44.一种用于培养一个或多个成形胃肠类器官的形成托盘，其包括一个或多个收集通道，所述收集通道被配置为在其中接收一种或多种多个球状体。

45.根据权利要求44所述的形成托盘，其中所述一个或多个收集通道具有预定形状并且被配置为将所述一种或多种多个球状体聚集在一起，使得所述一种或多种多个球状体聚集成所述预定形状，并且其中所述一种或多种多个球状体分化成具有所述预定形状的一种或多种成形胃肠类器官。

46.根据权利要求44或45所述的形成托盘，其中所述一个或多个收集通道由生物相容性材料制成，该材料被配置为抑制所述一种或多种多个球状体附着于其上。

47.根据权利要求44-46中任一项所述的形成托盘，其中所述一个或多个收集通道还包括位于其中的一种或多种多个球状体。

48.根据权利要求44-47中任一项所述的形成托盘，其中所述一个或多个收集通道在其中进一步包含细胞培养基或细胞外基质，或两者。

49.根据权利要求44-48中任一项所述的形成托盘，其中所述一个或多个收集通道还包括位于其中的所述一种或多种胃肠类器官。

50.根据权利要求44-49中任一项所述的形成托盘，其中所述一种或多种胃肠类器官是前述权利要求中任一项所述的一种或多种成形胃肠类器官。

51.一种用于培养胃肠类器官的试剂盒，其包括包含一个或多个收集通道的形成托盘。

52.根据权利要求51所述的试剂盒，其中所述形成托盘是权利要求43-49中任一项所述的形成托盘。

53.根据权利要求51或52所述的试剂盒，还包括多个球状体，该球状体被配置为被接收在所述一个或多个收集通道内。

54.根据权利要求51-53中任一项所述的试剂盒，还包括被配置为接收在所述一个或多个收集通道内的细胞培养基。

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