KR20220025738A - 형상화된 오가노이드 조성물 및 그의 제조 방법 - Google Patents

형상화된 오가노이드 조성물 및 그의 제조 방법 Download PDF

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KR20220025738A
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마이클 에이. 헬름라트
맥심 미카엘 마에
홀리 엠. 폴링
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칠드런즈 호스피탈 메디칼 센터
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Abstract

본원에서는 네이티브 장기 구조와 더 밀접하게 닮은 형상화된 또는 길쭉한 모르폴로지를 형성하도록 조작되는 오가노이드 조성물이 개시된다. 이들 형상화된 오가노이드는 비형성된 오가노이드와 비교해서 예컨대 소기관 구조화를 연구하기 위한 목적 및 이식에 유리하다. 또한 본원에서는 상기 형상화된 또는 길쭉한 오가노이드 조성물을 생성하는 방법이 개시된다.

Description

형상화된 오가노이드 조성물 및 그의 제조 방법
관련 출원 상호참조
본 출원은 2019년 5월 31일에 출원된 미국 특허 가출원 번호 62/855,557, 2019년 10월 3일에 출원된 미국 특허 가출원 번호 62/909,868, 및 2020년 1월 8일에 출원된 미국 특허 가출원 번호 62/958,367의 우선권의 이익을 주장하며, 이들 가출원 각각은 그 전체가 참조로 명확히 포함된다.
연방 지원 R&D에 관한 진술
본 발명은 미국 국립보건원이 지급하는 U01DK103117 하의 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 대해 일정한 권리를 가진다.
발명의 분야
본 개시물의 측면은 일반적으로 오가노이드 조성물 및 상기 오가노이드 조성물의 제조 방법에 관한 것이다. 본원에서 개시된 오가노이드는 생체내 장기 조직과 더 밀접하게 닮은 형상화된 또는 길쭉한 구조를 가진다.
배경
오가노이드, 예컨대 장 오가노이드를 제공하는 기존 방법은 이식과 그 후의 기능성 구현에 매우 적합한 구조를 형성하는 그의 능력에서 제한된다. 구체적으로, 만능 줄기 세포, 특히 유도 만능 줄기 세포로부터 유래된 오가노이드를 얻는 현재 방법은 구형 구조를 가지는 오가노이드를 초래하고, 이것은 이식될 때 자연적으로 길쭉해지지 않고, 따라서 네이티브(native) 구조와 유사한 입체배치를 가지는 구조를 공급할 수 없다. 추가로, 축력의 존재는 오가노이드 조직의 발생에 영향을 미칠 수 있다. 기존의 위장 오가노이드는 내강을 포함하는데, 기존 방법을 사용하여 입수가능한 형상 및 크기의 제한은 임상적 구현에서의 유용성이 제한된다. 따라서, 개선된 이식 적합성 및 이식 후 개선된 기능을 가지는, 환자 예컨대 사람 환자로부터 유래된 시험관내에서 성장한 오가노이드 조직이 현재 필요하다.
요약
본 개시물의 일부 측면은 일반적으로 형상화된 위장 오가노이드 생성 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 위장 오가노이드는 내강을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 복수의 스페로이드를 미리 결정된 형상을 포함하는 수집 채널 안에 넣는 단계, 및 복수의 스페로이드를 수집 채널 안에서 배양하여 복수의 스페로이드를 미리 결정된 형상을 가지는 형상화된 위장 오가노이드로 분화시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 형상화된 위장 오가노이드는 응축된 중간엽 및 내강을 포함한다. 일부 실시양태에서, 수집 채널은 비구형 형상을 가지고, 형상화된 위장 오가노이드는 비구형 위장 오가노이드이다. 일부 실시양태에서, 수집 채널은 길쭉한 형상을 가지고, 형상화된 위장 오가노이드는 길쭉한 위장 오가노이드이다. 일부 실시양태에서, 길쭉한 위장 오가노이드는 기다란 길이 및 직경을 포함한다. 일부 실시양태에서, 기다란 길이는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50 밀리미터이거나, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50 밀리미터이거나, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50 밀리미터이거나, 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50 밀리미터, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50 밀리미터 이하이거나, 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50 밀리미터 이하이거나, 또는 전술한 길이 중 임의의 둘에 의해 정의되는 범위 내의 임의의 길이, 예를 들어 1 내지 50 mm, 10 내지 40 mm, 20 내지 30 mm, 1 내지 30 mm, 또는 20 내지 50 mm이다. 일부 실시양태에서, 직경은 0.2 μm, 1 μm, 5 μm, 10 μm, 50 μm, 100 μm, 200 μm, 300 μm, 400 μm, 500 μm, 600 μm, 700 μm, 800 μm, 900 μm, 1000 μm, 1200 μm, 1300 μm, 1400 μm, 1500 μm, 1600 μm, 1700 μm, 1800 μm, 1900 μm, 2000 μm, 2500 μm, 또는 3000 μm, 약 0.2 μm, 1 μm, 5 μm, 10 μm, 50 μm, 100 μm, 200 μm, 300 μm, 400 μm, 500 μm, 600 μm, 700 μm, 800 μm, 900 μm, 1000 μm, 1200 μm, 1300 μm, 1400 μm, 1500 μm, 1600 μm, 1700 μm, 1800 μm, 1900 μm, 2000 μm, 2500 μm, 또는 3000 μm이거나, 적어도 0.2 μm, 1 μm, 5 μm, 10 μm, 50 μm, 100 μm, 200 μm, 300 μm, 400 μm, 500 μm, 600 μm, 700 μm, 800 μm, 900 μm, 1000 μm, 1200 μm, 1300 μm, 1400 μm, 1500 μm, 1600 μm, 1700 μm, 1800 μm, 1900 μm, 2000 μm, 2500 μm, 또는 3000 μm이거나, 적어도 약 0.2 μm, 1 μm, 5 μm, 10 μm, 50 μm, 100 μm, 200 μm, 300 μm, 400 μm, 500 μm, 600 μm, 700 μm, 800 μm, 900 μm, 1000 μm, 1200 μm, 1300 μm, 1400 μm, 1500 μm, 1600 μm, 1700 μm, 1800 μm, 1900 μm, 2000 μm, 2500 μm, 또는 3000 μm이거나, 0.2 μm, 1 μm, 5 μm, 10 μm, 50 μm, 100 μm, 200 μm, 300 μm, 400 μm, 500 μm, 600 μm, 700 μm, 800 μm, 900 μm, 1000 μm, 1200 μm, 1300 μm, 1400 μm, 1500 μm, 1600 μm, 1700 μm, 1800 μm, 1900 μm, 2000 μm, 2500 μm, 또는 3000 μm 이하이거나, 또는 약 0.2 μm, 1 μm, 5 μm, 10 μm, 50 μm, 100 μm, 200 μm, 300 μm, 400 μm, 500 μm, 600 μm, 700 μm, 800 μm, 900 μm, 1000 μm, 1200 μm, 1300 μm, 1400 μm, 1500 μm, 1600 μm, 1700 μm, 1800 μm, 1900 μm, 2000 μm, 2500 μm, 또는 3000 μm 이하이거나, 또는 전술한 직경 중 임의의 둘에 의해 정의되는 범위 내의 임의의 직경, 예를 들어, 0.2 μm 내지 3000 μm, 200 μm 내지 1500 μm, 500 μm 내지 1000 μm, 0.2 μm 내지 1000 μm, 또는 500 μm 내지 3000 μm이다. 일부 실시양태에서, 직경에 대한 기다란 길이의 비는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 20000, 30000, 40000, 500000, 60000, 70000, 80000, 90000, 100000, 200000, 300000, 400000, 또는 500000이거나, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 20000, 30000, 40000, 500000, 60000, 70000, 80000, 90000, 100000, 200000, 300000, 400000, 또는 500000이거나, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 20000, 30000, 40000, 500000, 60000, 70000, 80000, 90000, 100000, 200000, 300000, 400000, 또는 500000이거나, 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 20000, 30000, 40000, 500000, 60000, 70000, 80000, 90000, 100000, 200000, 300000, 400000, 또는 500000이거나, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 20000, 30000, 40000, 500000, 60000, 70000, 80000, 90000, 100000, 200000, 300000, 400000, 또는 500000 이하이거나, 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 20000, 30000, 40000, 500000, 60000, 70000, 80000, 90000, 100000, 200000, 300000, 400000, 또는 500000 이하이거나, 또는 전술한 비 중 임의의 둘에 의해 정의되는 범위 사이의 임의의 비, 예를 들어 1 내지 500000, 100 내지 500000, 1000 내지 10000, 1 내지 500000, 또는 1000 내지 500000이다. 일부 실시양태에서, 내강은 형상화된 위장 오가노이드의 기다란 길이 전체에 걸쳐서 연속적이지 않다. 일부 실시양태에서, 형상화된 위장 오가노이드는 형상화된 사람 위장 오가노이드이다. 일부 실시양태에서, 복수의 스페로이드는 수집 채널에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 또는 60 일 동안이거나, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 또는 60 일 동안 이거나, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 또는 60 일 동안이거나, 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 또는 60 일 동안이거나, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 또는 60 일 이하 동안이거나, 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 또는 60 일 이하의 일 수 동안 배양된다. 일부 실시양태에서, 복수의 스페로이드는 복수의 스페로이드의 중간엽에서 융합한다. 일부 실시양태에서, 형상화된 위장 오가노이드는 자발적 신경분포를 겪는다. 일부 실시양태에서, 형상화된 위장 오가노이드는 장신경세포 또는 장신경전구세포를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 형상화된 위장 오가노이드는 신경세포 표식자 PGP9.5를 발현하는 세포를 포함하는 하나 이상의 근육층신경얼기를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 형상화된 위장 오가노이드는 신경세포 활성을 가진다. 일부 실시양태에서, 방법은 형상화된 위장 오가노이드 상에 기계적 변형률을 유도하는 것을 포함하고, 여기서 기계적 변형률은 형상화된 위장 오가노이드의 자발적 신경분포를 촉진하거나, 또는 형상화된 위장 오가노이드의 성숙화 시간을 감소시키거나, 또는 둘 모두를 야기할 수 있다. 일부 실시양태에서, 기계적 변형률은 일축 인장 변형률이다. 일부 실시양태에서, 형상화된 위장 오가노이드는 중간엽에 의해 둘러싸인 분극된 원주 상피를 추가로 포함하고, 여기서 중간엽은 평활근 유사 층을 포함한다. 일부 실시양태에서, 형상화된 위장 오가노이드는 음와 유사 증식대 또는 융모 유사 구조, 또는 둘 모두로 패터닝되는 상피를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 형상화된 위장 오가노이드는 적층된 종주근 및 윤주근을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 형상화된 위장 오가노이드는 평활근 또는 장 상피하 근섬유모세포, 또는 둘 모두의 표식자를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 형상화된 위장 오가노이드는 장세포, 장내분비세포, 배상세포, 파네스세포, 또는 그의 임의의 조합 중 하나 이상을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 형상화된 위장 오가노이드는 빌린, Muc2, DEFA5, CHGA, 또는 OLFM4, 또는 그의 임의의 조합 중 하나 이상을 발현하는 세포를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 형상화된 위장 오가노이드는 PBMC 세포, 생검 조직 샘플, 또는 센다이 바이러스-형질도입된 체세포로부터 리프로그래밍된 유도 만능 줄기 세포로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 형상화된 위장 오가노이드는 시험관내에서 혈관화된다. 일부 실시양태에서, 형상화된 위장 오가노이드는 개체 내에 생착시에 혈관화된다. 일부 실시양태에서, 복수의 스페로이드는 복수의 중-후장 스페로이드이고, 형상화된 위장 오가노이드는 형상화된 장 오가노이드이다. 일부 실시양태에서, 복수의 스페로이드는 복수의 후장 스페로이드이고, 형상화된 위장 오가노이드는 형상화된 결장 오가노이드이다. 일부 실시양태에서, 복수의 스페로이드는 복수의 전방 전장 스페로이드이고, 형상화된 위장 오가노이드는 식도 오가노이드이다. 일부 실시양태에서, 복수의 스페로이드는 복수의 후방 전장 스페로이드이고, 형상화된 위장 오가노이드는 위 오가노이드이다. 일부 실시양태에서, 방법은 유도 만능 줄기 세포를 유도 만능 줄기 세포를 완전 내배엽으로 분화시키기에 충분한 조건 하에서 배양하는 단계, 완전 내배엽을 완전 내배엽을 복수의 스페로이드로 분화시키기에 충분한 조건 하에서 배양하는 단계, 및 복수의 스페로이드를 수집한 후 복수의 스페로이드를 수집 채널에 넣는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 수집하는 단계는 복수의 스페로이드를 복수의 스페로이드와 결합할 수 있는 결합 재료와 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 결합 재료는 와이어(wire), 스트링(string), 및 섬유 중 하나 이상으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 복수의 스페로이드는 스캐폴드(scaffold) 가닥과 접촉한다.
본 개시물의 일부 측면은 일반적으로 손상된(compromised) 위장 기능을 가지는 개체를 치료하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 위장 오가노이드를 개체 안에 이식하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 위장 오가노이드는 본원에서 기술된 형상화된 위장 오가노이드 중 임의의 하나이다. 일부 실시양태에서, 위장 오가노이드는 개체의 자기유래이거나 또는 동종유래이다. 일부 실시양태에서, 위장 오가노이드는 개체로부터 얻은 유도 만능 줄기 세포로부터 제조된다. 일부 실시양태에서, 개체는 위장 이식을 필요로 한다. 일부 실시양태에서, 위장 기능은 장 기능이고, 위장 오가노이드는 장 오가노이드이다. 일부 실시양태에서, 위장 기능은 결장 기능이고, 위장 오가노이드는 결장 오가노이드이다. 일부 실시양태에서, 위장 기능은 식도 기능이고, 위장 오가노이드는 식도 오가노이드이다. 일부 실시양태에서, 위장 기능은 위 기능이고, 위장 오가노이드는 위 오가노이드이다.
본 개시물의 일부 측면은 일반적으로 하나 이상의 형상화된 위장 오가노이드를 배양하기 위한 형성 트레이에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 형성 트레이는 하나 이상의 복수의 스페로이드를 안에 수용하도록 구성된 하나 이상의 수집 채널을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 수집 채널은 미리 결정된 형상을 가지고, 하나 이상의 복수의 스페로이드를 함께 모으도록 구성되고, 이렇게 해서 하나 이상의 복수의 스페로이드가 미리 결정된 형상으로 수집되고, 여기서 하나 이상의 복수의 스페로이드가 미리 결정된 형상을 가지는 하나 이상의 형상화된 위장 오가노이드로 분화한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 수집 채널은 하나 이상의 복수의 스페로이드가 부착하는 것을 억제하도록 구성된 생체적합성 물질로 제조된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 수집 채널은 그 안에 위치하는 하나 이상의 복수의 스페로이드를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 수집 채널은 세포 배양 배지 또는 세포외 기질, 또는 둘 모두를 그 안에 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 수집 채널은 그 안에 위치하는 하나 이상의 위장 오가노이드를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 위장 오가노이드는 본원에 기술된 임의의 하나 이상의 형상화된 위장 오가노이드이다.
본 개시물의 일부 측면은 일반적으로 위장 오가노이드 배양 키트에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 키트는 하나 이상의 수집 채널을 포함하는 형성 트레이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 형성 트레이는 본원에서 기술된 형성 트레이 중 임의의 하나이다. 일부 실시양태에서, 키트는 하나 이상의 수집 채널 내에 수용되도록 구성된 복수의 스페로이드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는 하나 이상의 수집 채널 내에 수용되도록 구성된 세포 배양 배지를 포함한다.
본원에서 제공되는 본 발명의 실시양태는 아래의 번호를 매긴 대안에 의해 기술된다.
1.
(a) 유도 만능 줄기 세포의 원천을 완전 내배엽을 형성하기에 충분한 조건 하에서 배양하는 단계;
(b) 상기 완전 내배엽을 복수의 스페로이드가 형성될 때까지 배양하는 단계;
(c) 상기 복수의 스페로이드를 수집하는 단계;
(d) 상기 복수의 스페로이드를 수집 채널에 넣는 단계; 및
(e) 상기 수집 채널에서 상기 복수의 스페로이드로부터 응축된 중간엽 및 내강을 포함하는 사람 장 오가노이드를 형성하는 단계
를 포함하고,
여기서 상기 수집 채널이 적어도 부분적으로 관형인 구조를 가지는 적어도 하나의 영역을 가지는 것인
내강을 포함하는 길쭉한 사람 장 오가노이드를 얻는 방법.
2. 대안 1에 있어서, 상기 수집하는 단계가 상기 스페로이드를 상기 스페로이드와 결합할 수 있는 결합 재료와 접촉시키는 것을 포함하는 것인 방법.
3. 대안 2에 있어서, 상기 결합 재료가 와이어, 스트링, 및 섬유 중 하나 이상으로부터 선택되는 것인 방법.
4. 대안 1 내지 대안 3 중 어느 한 대안에 있어서, 상기 수집 채널이 길쭉한 형상을 가지는 것인 방법.
5. 대안 1 내지 대안 4 중 어느 한 대안에 있어서, 상기 수집 채널이 적어도 1 cm, 또는 적어도 2 cm, 또는 적어도 3 cm, 또는 적어도 4 cm, 또는 적어도 5 cm, 또는 약 1 cm 내지 약 100 cm의 길이를 가지는 것인 방법.
6. 대안 1 내지 대안 5 중 어느 한 대안에 있어서, 상기 방법이 스캐폴드 가닥을 가지는 장치에서 수행되는 것인 방법.
7. 대안 1 내지 대안 6 중 어느 한 대안에 있어서, 상기 복수의 스페로이드가 상기 수집 채널 안에 1 일 내지 20 일, 또는 2 일 내지 18 일, 또는 3 일 내지 17 일, 또는 4 일 내지 16 일, 또는 5 일 내지 15 일, 또는 6 일 내지 14 일의 기간 동안 있는 것인 방법.
8. 대안 1 내지 대안 7 중 어느 한 대안에 있어서, 상기 복수의 스페로이드가 상기 스페로이드의 중간엽에서 융합하는 것인 방법.
9. 대안 1에 있어서, 상기 길쭉한 장 오가노이드가 약 제14일에, 또는 약 제13일 내지 제15일, 또는 약 제12일 내지 약 제16일, 또는 약 제11일 내지 약 제17일에 숙주 안에 이식되고, 바람직하게는 여기서 상기 길쭉한 장 오가노이드가 상기 숙주의 창자에 인접하게 이식되는 것인 방법.
10. 대안 1 내지 대안 9 중 어느 한 대안에 있어서, 상기 장 오가노이드가 시험관내에서 혈액 공급을 형성하는 것인 방법.
11. 대안 1 내지 대안 10 중 어느 한 대안에 있어서, 상기 장 오가노이드가 개체에 생착 후 혈액 공급을 형성하는 것인 방법.
12. 대안 1에 있어서, 상기 길쭉한 장 오가노이드를 숙주 안에 이식하는 단계를 추가로 포함하고, 여기서 상기 숙주가 면역결핍 포유동물 및 상기 이식 단계를 필요로 하는 개체로부터 선택되는 것인 방법.
13. 대안 1 내지 대안 12 중 어느 한 대안에 있어서, 상기 스페로이드가 중장/후장 스페로이드인 방법.
14. 복수의 스페로이드가 부착하는 것을 억제하도록 구성된 생체적합성 재료로부터 형성된 베이스; 및
베이스를 통해 연장되고 복수의 스페로이드를 안에 수용하도록 구성된 수집 채널
을 포함하고, 여기서 수집 채널이 길쭉하고 복수의 스페로이드를 함께 모으도록 구성되고, 이렇게 해서 복수의 스페로이드가 복수의 스페로이드를 미리 결정된 형상을 가지는 장 오가노이드로 배양하기 위한 미리 결정된 형상을 한정하는 것인 장 오가노이드 배양용 트레이.
15. 대안 14에 있어서, 수집 채널 내에 위치하는 배양 배지를 추가로 포함하는 트레이.
16. 대안 15에 있어서, 수집 채널 내에 위치하는 복수의 스페로이드를 추가로 포함하는 트레이.
17.
수집 채널; 및
수집 채널 내에 수용되도록 구성된 배양 배지
를 포함하는 장 오가노이드 배양 키트.
18. 대안 17에 있어서, 배양 배지를 갖는 수집 채널 내에 수용되도록 구성된 복수의 스페로이드를 추가로 포함하는 키트.
19. 손상된 장 기능을 가지는 개체 안에 유도 만능 줄기 세포로부터 유래된 오가노이드를 이식하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 오가노이드가 중간엽 조직 및 내배엽 조직을 포함하는 것인, 손상된 장 기능을 가지는 개체를 치료하는 방법.
20. 대안 19에 있어서, 상기 오가노이드가 신경세포 조직을 추가로 포함하는 것인 방법.
21. 대안 19에 있어서, 상기 유도 만능 줄기 세포가 상기 개체로부터 유래된 것인 방법.
22. 대안 19에 있어서, 상기 개체가 장이식을 필요로 하는 것인 방법.
23. 대안 19 내지 22 중 어느 한 대안에 있어서, 상기 오가노이드가 센다이 바이러스 형질도입된 체세포로부터 생성된 유도 만능 줄기 세포로부터 유래된 것인 방법.
24. 대안 19 내지 23 중 어느 한 대안에 있어서, 상기 오가노이드가 평활근 유사 층을 포함하는 중간엽에 의해 둘러싸인 분극된 원주 상피를 포함하는 것인 방법.
25. 대안 19 내지 24 중 어느 한 대안에 있어서, 상기 오가노이드가 음와 유사 증식대 및 융모 유사 구조로 패터닝된 상피를 포함하는 것인 방법.
26. 대안 19 내지 25 중 어느 한 대안에 있어서, 상기 오가노이드가 적층된 종주근 및 윤주근을 포함하는 것인 방법.
27. 대안 19 내지 26 중 어느 한 대안에 있어서, 상기 오가노이드가 평활근 및 장 상피하 근섬유모세포의 표식자를 포함하는 것인 방법.
28. 대안 19 내지 27 중 어느 한 대안에 있어서, 상기 오가노이드가 장세포, 배상세포, 파네스세포, 및 장내분비세포 또는 분비세포, 내분비세포 및 흡수세포 유형을 포함하는 것인 방법.
29. 대안 19 내지 28 중 어느 한 대안에 있어서, 상기 오가노이드가 신경세포 활성을 가지는 것인 방법.
30. 대안 19 내지 29 중 어느 한 대안에 있어서, 상기 오가노이드에 장력을 가하여 성숙화 시간을 감소시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
도면의 간단한 설명
위에서 기술된 특징에 추가해서, 추가의 특징 및 변화가 다음 도면 및 전형적인 실시양태의 설명으로부터 쉽게 분명할 것이다. 이들 도면은 실시양태를 묘사하고 범위를 제한하는 것을 의도하지 않는다는 것을 이해해야 한다.
도 1a는 장부전부터 장이식술까지 임상 진행의 실시양태를 묘사한다.
도 1b는 1991년부터 2017년까지 미국에서 이식 대기 명단의 개체 수의 실시양태를 묘사한다.
도 2a는 복수의 스페로이드를 모으기 위한 복수의 수집 채널을 가지는 예시 형성 트레이의 투시도의 실시양태를 묘사한다.
도 2b는 도 2a의 단면선 2-2를 따라서 절단된 도 2a의 예시 형성 트레이의 단면도의 실시양태를 묘사한다.
도 2c는 도 2a의 단면선 3-3을 따라서 절단된 도 2a의 예시 형성 트레이의 단면도의 실시양태를 묘사한다.
도 3a는 복수의 만능 줄기 세포를 배양하는 생체적합성 용기의 도식적 투시도의 실시양태를 묘사한다.
도 3b-d는 도 3a의 생체적합성 용기의 개략적 투시도의 실시양태를 묘사하지만, (b)는 완전 내배엽으로 배양된 복수의 만능 줄기 세포를 보여주거나, (c)는 완전 내배엽 중간체로부터 복수의 스페로이드로 배양된 만능 줄기 세포를 보여주거나, 또는 (d) 스캐폴드 쓰레드(thread)로의 유인에 의해 유도된 미리 결정된 배열에 따라 배열되는 복수의 스페로이드로 배양된 복수의 만능 줄기 세포를 보여준다.
도 4는 도 2a의 형성 트레이의 확대된 정면도의 실시양태를 묘사하고, 그 안에서 복수의 수집 채널 내의 복수의 스페로이드가 제1일(d1), 제3일(d3), 또는 제5일(d5) 동안 배양된다.
도 5는 숙주 유기체(44) 안에 이식된 기다란 장 오가노이드(46)의 실시양태를 묘사한다.
도 6a는 배양물에서 비형상화된 HI0의 광학 현미경사진의 실시양태를 묘사한다. 또한, 제14일(패널 A) 및 제28일(패널 B) 비형상화된 HIO의 헤마톡실린 및 에오신 염색 절편의 실시양태를 나타낸다. 기준자 = 0.5 mm.
도 6b는 사람 태아의 장의 역사적 절편(아래)과 비교한 이식술 후 2, 4, 및 8 주에 수확된 tHIO의 헤마톡실린 및 에오신 염색 절편(위)의 실시양태를 묘사한다. tHIO에서 상피 구조화의 발생이 네이티브 조직과 유사한 방식으로 진행한다. GA: 임신 연령, Grand et al.(1976)로부터 재생된 사람 데이터.
도 7a는 길쭉한 HIO 생성 및 그 후 숙주 유기체 안으로의 이식술의 방법론의 실시양태를 묘사한다.
도 7b는 제6일(패널 A), 제14일(패널 B), 및 제28일(패널 C) 시험관내 형상화된 길쭉한 HIO(g-HIO) 구조의 헤마톡실린 및 에오신 염색 절편의 실시양태를 묘사한다. 기준자 = 1 mm. 주: 패널 B에서의 구조는 전체 길이가 아니다.
도 8a는 길쭉한 HIO의 형성 및 연속 상피를 갖는 사람 PSC-유래 관형 장 오가노이드의 성공적 생성의 실시양태를 묘사한다. 패널 A는 ABS 몰드(mold) 및 PDMS 스캐폴드 형성 트레이의 이미지를 보여준다. 패널 B는 PDMS 스캐폴드 형성 트레이의 단면(위) 및 말단(아래)의 주사 전자 현미경사진을 보여준다. 패널 C는 배양 제1일, 제3일 및 제5일에 그루브(groove) 내의 스페로이드의 시험관내 이미지를 보여준다. 패널 D는 이식술시 제14일 오가노이드 구조의 수술 이미지를 보여준다. 패널 E는 6 주의 이식 후 생착된 제14일 오가노이드 구조의 전체 이미지를 보여준다. 점선은 절개면을 나타낸다. 패널 F는 패널 E의 이식편의 헤마톡실린 및 에오신 염색 절편을 보여준다. 패널 G는 이식편의 헤마톡실린 및 에오신 염색 절편의 타일(tile) 스캔을 보여준다. 인접 마우스 조직의 영역이 표지된다. 전체 조직을 가로지르는 연속 상피가 관찰된다.
도 8b는 길쭉한 장 오가노이드 이식술 및 결과적인 혈관화의 실시양태를 묘사한다. 또는 성공적 생착 후 길쭉한 장 오가노이드의 조직학을 보여준다.
도 8c는 수확 시의 이식된 g-HIO의 이미지의 실시양태를 묘사한다. 위 패널은 면역손상된 래트의 장간막에 이식술 후 제14일 g-HIO 전체를 보여준다. 아래 패널은 면역손상된 래트의 장간막에 8 주의 이식술 후 제28일 비형상화된 HIO 전체를 보여준다. 통상적인 프로토콜을 사용하여 만든 비형상화된 HIO는 제14일에 이식될 때 면역손상된 래트에 생착하지 못했다.
도 9a-b는 생체내 이식술 시에 상당히 성장하는 HIO의 실시양태를 묘사한다. 이식된 HIO(tHIO)는 수확 시에 시험관내 HIO보다 상당히 더 크다.
도 9c는 사람 장과 닮은 이식된 HIO의 실시양태를 묘사한다. tHIO는 중간엽, 장세포(VIL1), 장내분비세포(CHGA), 배상세포(MUC2), 및 파네스 세포(DEFA5)를 포함하는 주요 장 세포 계보를 포함한다. 추가로, 그것들은 줄기 세포 활성의 표식자(OLFM4)에 대해 양성으로 염색한다.
도 9d는 장간막 이식술 모델에서 오가노이드-장 문합의 실시양태를 묘사한다. 수확 시에 마우스의 50%가 21일까지 생존하였다.
도 9e는 그루브에서 제조된 tHIO(g-tHIO)에서 이식 후 일어난 근육층신경얼기의 자발적 발생의 실시양태를 묘사한다. g-tHIO의 조직학은 수확된 조직 전체에 걸쳐서 근육층신경얼기의 견고한 망(network)을 밝힌다(패널 A, 좌측). 더 높은 배율에서는, 번들 구조가 보인다(패널 A, 우측). 범-신경세포(pan-neuronal) 표식자(PGP9.5) 및 사람 특이적 표식자(KU80)의 면역형광 염색. 이들 단백질의 공동국재화(colocalization)는 신경세포 성분의 사람 기원을 입증한다(패널 B). 장신경계를 형성하는 신경 능선 세포와 조합된 tHIO(tHIO+ENS), g-tHIO, 및 성인 사람 소장에서 범-신경세포 표식자 PGP9.5의 면역조직화학 염색(패널 C). 패널 C로부터의 근육층신경얼기(PGP9.5+세포 번들)의 정량화(패널 D). g-tHIO에서의 신경얼기 크기는 전통적인 분화 프로토콜을 사용하여 tHIO+ENS와 비교할 때 상당히 더 크다. 모든 기준자 = 100 μm.
도 10a는 시험관내 g-HIO 및 비형상화된 HIO의 전사체학적 격리의 실시양태를 묘사한다. 스페로이드, 제28일 비형상화된 HIO 및 제28일 g-HIO의 주요 성분 분석(패널 A). 제28일 비형상화된 HIO 및 g-HIO의 히트맵(heatmap)(패널 B). 제28일 비형상화된 HIO와 g-HIO 사이의 차등 발현된 유전자의 벤다이어그램(패널 C). g-HIO가 풍부한 상위 10개 생물학적 과정의 목록은 신경세포 발생과 관련있다(패널 D).
도 10b는 시험관내에서 발생하는 g-HIO의 전사체학적 프로파일의 실시양태를 묘사한다. 스페로이드, 제6일 g-HIO, 제14일 g-HIO, 및 제28일 g-HIO의 주요 성분 분석(패널 A). 스페로이드 및 g-HIO 샘플의 히트맵(패널 B).
도 10c는 g-HIO 시험관내 발생 동안에 전사체학적으로 풍부화된 생물학적 과정의 실시양태를 묘사한다. g-HIO 시험관내 발생의 제0일, 제6일, 제14일, 및 제28일에서의 풍부화 생물학적 과정이 열거된다.
상세한 설명
장부전(IF)은 보통 수술적 절제 및/또는 선천성 장 결함으로 인한 장 소실의 결과이고, 결과적으로 변경된 장 흡수 및 소화를 초래한다. 더 작은 하위군은 운동성 문제를 앓고 있고, 결과적으로 유체 및 영양소를 흡수하는 창자의 능력의 기능적 소실을 초래한다. 만성적 장부전은 장관을 통한 음식물 또는 영양소 흡수를 통해 에너지 및 영양 필요를 유지할 수 없을 때 일어나고, 따라서 그것은 장기 비경구 영양법(PN)을 필요로 한다. 장부전은 백만 명 당 약 3 - 50 명의 사람이 걸리고, 미국에서는 ~15,000 명의 사람들이 걸려 있다. 만성적 장부전에는 번호 ORPHA:294422(분류: 장애)의 희귀 질병 상태가 인정되었다.
장기 PN은 생명을 구하긴 하지만 그 자체의 일련의 심각한 합병증을 초래할 수 있다. 신생아 집단에서, PN-의존성 장부전은 재발성 혈류 감염, 반복 입원 허가 및 그 후의 대사성 뼈 문제를 포함하는 저조한 성장 및 발달을 포함하는 다수의 합병증과 관련될 수 있다. 이들 모두가 환자, 가족, 및 보건의료체계에 매우 높은 부담의 원인이 된다. 장기 PN 환자에서 생명을 위협하는 합병증 예컨대 혈전증으로 인한 접근불능 정맥, 반복 카테테르-관련 패혈증 및 담즙정체성 간 질병은 결국에는 생명을 구조하는 장이식술의 필요를 초래한다. 도 1a는 장부전부터 장이식술까지의 임상 진행을 보여준다.
장이식술은 비가역성 장부전을 갖는 환자 관리에서 확립된 치료적 양상으로 진화하였다. 장이식술은 상이한 형태로, 예컨대 단리된 장이식, 변형된 복합장기 이식, 및 완전한 복합장기 이식으로 수행될 수 있다. 비록 장이식술을 받은 환자의 수가 다른 장기 이식보다 훨씬 낮을지라도, 시술의 수는 2000년부터 2009년까지 5배 증가하였다. 지난 수 년간, 장이식의 수가 안정화되었고, 매년 100 내지 120 사례의 비율로 감소하는 추세이고, 2017년에는 47 사례의 소아 이식이 있었다. 이 추세는 장부전 환자에게 제공된 개선된 다학제 통합진료 때문이고, 이러한 추세는 아마도 향후 10년간 집단이 증가할 것이다. 새로운 개선된 치료가 이 환자 집단에 필요하다.
수술 기술이 계속 개선되지만, 장 및 복합장기 이식의 파괴적 동종면역은 계속해서 상당한 장애물이 되고, 이는 이식으로부터 이익을 얻을 수 있는 잠재적 환자의 명단 및 이식 후 이식편 유지 둘 모두를 제한한다. 이식 직전에 T-세포의 처음 완전 제거 후 T-세포의 지속적 억제 및 스테로이드 유지 배치를 초래하는 피츠버그 프로토콜의 수락이 표준 치료법(standard of care)이라고 여겨진다. 이 프로토콜은 이식편 거부 비율을 저하시키지만, 이 비율은 여전히 상당하다. 공여자-특이적 항체(DSA)는 초기 이식후 기간에는 환자의 ~30%에서 계속 쟁점이 된다. DSA의 존재는 만성적 거부 위험을 두 배 넘게 만든다.
1년 및 5년 생존률은 70%를 넘지만, 10년 및 15년 생존률은 각각 불과 42% 및 35%이다. 이것은 단기 결과는 좋지만 장기 결과는 계속 실망스럽다는 것을 지시한다. 2017년에, 장 단독 이식의 90.4%가 첫 이식인 반면, 9.6%는 재이식이었다. 조합된 간 및 장 이식편을 수혜 받은 환자의 경우, 이들 중 26.3%가 재이식이었다. 장 재이식은 지금은 장이식의 4 번째로 흔한 적응증이다.
재이식술을 받는 소아 환자가 전체로서 1차 이식술 코호트보다 더 어려지는 추세이다. 한 센터의 경험은 1차와 재이식술 사이의 평균 시간이 421일임을 보여주었다. 그들은 모든 늦게 재이식을 받은 환자보다 조기(< 90일) 재이식을 받은 모든 환자에서 생존 성향을 발견하였고, 생존률은 각각 50%, 80%였다. 소아 하위집단에서, 재이식 3년 생존률은 타이밍에 상관없이 27%였고, 이식편 생존도 동일한 백분율이었다. 제2 센터에서는, 재이식을 받은 23명 환자(성인 및 소아 둘 모두) 중에서, 15명 환자가 재이식 후 12개월의 중간기에서 사망하였다(35% 생존). 스페인의 제3 센터는 13명 환자에서 35%의 5년 재이식 소아 생존률을 보고하였다.
한 재이식 코호트(n=23)를 면밀히 특성화할 때, 재발성 심각한 거부는 재이식 후조차도 흔하였다(35%). 환자가 1차 이식에 거부를 가졌다면 이식편 거부 발생률이 재이식에서 상당히 더 높아서, 이식편 소실 및 33% 사망률을 초래하였다. 재이식을 받은 환자는 공통적으로 심각하게 면역손상되고, 골수 억제가 1차 이식의 4%에 비해 재이식술 환자의 35 %에서 관찰되었다. 추가로, 그들 재이식술 비생존자(60%)는 생존자에서의 유사한 시점에 비해 사망 전 1개월에 상당히 더 낮은 절대 림프구수 및 혈소판수를 가졌다.
장기 공여는 수요에 비해 상당한 부족을 계속 겪는다. 2019년 7월부터, 미국에서는 113,000 명이 넘는 남성, 여성 및 어린이가 국내 이식 대기 명단에 있다(도 1b). 10 분마다, 새로운 사람이 대기 명단에 추가되고, 한편으로 20명의 사람이 이식 대기 중에 사망한다. 이 부족은 1991년에 6,953명 공여자/23,198명 대기자에서 2018년에 17,554명 공여자/113,759명 대기자로 지난 27년간 단계적으로 증가하였다.
사람 장기 공여자의 이 증가하는 결핍은 연구 과학자가 다른 옵션 예컨대 이종장기이식술을 조사하거나 또는 필수 사람 이식가능 장기를 생성하는 것을 추진하게 하였다. 이 접근은 복잡한 과학적 도전을 가질 뿐만 아니라 법적 및 윤리적 쟁점을 가진다. 한 잠재적 옵션은 환자 자신의 창자로부터 얻은 시험관내 팽창된 상피 생검(엔테로이드라고 부름)의 사용이다. 이들 구조는 상피만 함유하기 때문에, 그들은 중간엽 및 신경 조직을 주로 함유하는 창자 구조의 대부분을 대체할 수 없다. 추가로, 이들 구조는 아마도 중간엽의 결여 때문에 쉽게 이식되지 않는다.
대조적으로, 본원에서 기술된 바와 같은 유도 만능 줄기 세포로부터 유래된 오가노이드는 내배엽 및 중배엽 조직 둘 모두를 함유할 수 있고, 쉽게 이식가능하고, 전체 이식편의 재생에 기여하였다. 환자 특이적 오가노이드를 생성하는 능력은 동종 면역 반응의 방지와 함께 여러 과학적 및 윤리적 염려를 피할 수 있고, 그것은 궁극적으로는 개체가 그의 이식편의 기대 수명을 연장하는 것을 돕는 해결책일 수 있고 이식 대기 명단에 다시 올리는 것을 피할 수 있다.
현재, 오가노이드는 시험관내 및 생체내 둘 모두에서 사람 질병을 연구하는 데 활용되고 있다. 본원에서 개시되는 바와 같이, 이들 iPSC-유래 조직이 생체내에서 충분히 기능할 잠재력을 가지고 따라서 장기 이식을 구하는 역할을 할 수 있다는 것을 지지하는 강한 데이터가 있다. 여러 신호전달 경로의 조합적 활성을 단계적 방식으로 조정함으로써 만능 줄기 세포(PSC)가 장 조직을 포함해서 시험관내에서 다수의 장기계로 분화하는 것을 지향할 수 있고, 태아 조직의 필요 없이 생체내 태아 장기 발생을 효과적으로 반복할 수 있다는 것을 보여주었다.
iPSC-유래 위장 오가노이드가 본원에서 개시된다. 일부 실시양태에서, 위장 오가노이드는 식도 오가노이드, 위 오가노이드, 장 오가노이드, 또는 결장 오가노이드이다. 일부 실시양태에서, 위장 오가노이드는 장 오가노이드이다. 이들 오가노이드는 신체의 모든 조직을 형성할 수 있는 PSC로 유도되는 센다이 바이러스-형질도입된 체세포로부터 생성된다. 배아 장기형성을 제어하는 인자를 조작함으로써, 배아 배엽층 제한된 오가노이드로, 그 다음에 특이적 세포 유형 예컨대 간세포, 신경세포, 근세포 및 장 조직으로 PSC의 단계적 분화를 안내하는 시험관내 방법이 개발되었다. 오가노이드 예컨대 장 오가노이드를 생성하는 방법은 미국 특허 9,719,068 및 10,174,289, 및 PCT 공개 WO 2016/061464 및 WO 2018/106628에서 발견할 수 있고, 이로써 이들 각각은 그 전체가 참고로 분명히 포함된다.
다음 상세한 설명에서는 첨부 도면을 참고하고, 도면은 본원의 일부를 형성한다. 도면에서, 유사한 기호는 문맥이 다르게 지시하지 않으면 대표적으로 유사한 성분을 확인한다. 상세한 설명, 도면 및 청구범위에서 기술된 예시 실시양태는 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 다른 실시양태가 이용될 수 있고, 본원에서 제시된 주제의 정신 또는 범위로부터 벗어남이 없이 다른 변화를 줄 수 있다. 본원에서 일반적으로 기술되고 도면에서 예시되는 본 개시물의 측면들이 폭넓은 다양한 상이한 구성으로 배열될 수 있고, 치환될 수 있고, 조합될 수 있고, 분리될 수 있고, 설계될 수 있으며, 이들 모두가 분명히 본원에서 고려된다는 것을 쉽게 이해할 것이다.
다르게 정의되지 않으면, 본원에서 사용되는 기술 및 과학 용어는 본 개시물이 속하는 분야의 통상의 기술을 가진 자가 본 개시물에 비추어 읽을 때 공통적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본 개시물의 목적상, 다음 용어를 아래에서 설명한다.
관사 "a" 및 "an"은 본원에서 관사의 문법적 목적어 중 하나 또는 하나 초과(예를 들어 적어도 하나)를 지칭한다. 예로서, "요소"는 하나의 요소 또는 하나 초과의 요소를 의미한다.
"약"은 기준 양, 수준, 값, 수, 주파수, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 비해 10% 정도 달라지는 양, 수준, 값, 수, 주파수, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다.
본 명세서 전체에 걸쳐서, 문맥이 다르게 요구하지 않으면, 단어 "포함하다", "포함한다", 및 "포함하는"이 언급된 단계 또는 요소 또는 단계들 또는 요소들의 군의 포함을 암시하지만 임의의 다른 단계 또는 요소 또는 단계들 또는 요소들의 군의 배제를 암시하지 않는다는 것을 이해할 것이다. "로 이루어지는"은 어구 "로 이루어지는" 뒤에 오는 것이 무엇이든 포함하고 그에 제한된다는 것을 의미한다. 따라서, 어구 "로 이루어지는"은 열거된 요소가 요구되거나 필수적이라는 것 및 다른 요소가 존재할 수 없다는 것을 지시한다. "로 주로 이루어지는"은 이 어구 다음에 열거되는 임의의 요소를 포함하고 열거된 요소들에 대해 개시물에 명시된 활성 또는 작용을 방해하지 않거나 또는 기여하는 다른 요소들로 제한된다는 것을 의미한다. 따라서, 어구 "로 주로 이루어지는"은 열거된 요소들이 요구되거나 또는 필수적이지만 다른 요소들은 임의적이고 그들이 열거된 요소들의 활성 또는 작용에 실질적으로 영향을 미치는지 그렇지 않는지에 의존해서 존재할 수 있거나 또는 존재할 수 없다는 것을 지시한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "개체", "대상체", 또는 "환자"는 명세서에 비추어서 이해되는 바와 같은 그들의 문언적 및 평범한 의미를 가지고, 사람 또는 비사람 포유동물, 예를 들어 개, 고양이, 마우스, 래트, 암소(cow), 양, 피그(pig), 염소, 비사람 영장류, 또는 새, 예를 들어 닭, 뿐만 아니라 임의의 다른 척추동물 또는 비척추동물을 의미한다. 용어 "포유동물"은 그의 통상의 생물학적 의미로 사용된다. 따라서, 그것은 진원류(침팬지, 유인원, 원숭이) 및 사람, 소(cattle), 말, 양, 염소, 돼지(swine), 토끼, 개, 고양이, 설치류, 래트, 마우스, 기니아피그 등을 포함하는 영장류를 구체적으로 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "유효량" 또는 "유효 용량"은 명세서에 비추어서 이해되는 바와 같은 그들의 문언적 및 평범한 의미를 가지고, 관찰가능한 효과를 초래하는 나열된 조성물 또는 화합물의 양을 지칭한다. 본원에 개시된 주제의 활성 조성물에서 활성 성분의 실제 투여량 수준은 특별한 대상체 및/또는 응용을 위한 요망되는 반응을 달성하는 데 유효한 활성 조성물 또는 화합물의 양을 투여하도록 달라질 수 있다. 선택되는 투여량 수준은 조성물의 활성, 제제, 투여 경로, 다른 약물 또는 치료와의 조합, 치료받는 병태의 심도, 및 치료받는 대상체의 신체 조건 및 이전 병력을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 인자에 의존할 것이다. 일부 실시양태에서, 최소 용량이 투여되고, 용량은 용량-제한 독성 부재 하에서 최소 유효량까지 단계적으로 증가된다. 유효 용량의 결정 및 조정, 뿐만 아니라 그러한 조정을 하는 때 및 방법의 평가가 본원에서 고려된다.
개시물의 명료성을 위해, 공간 용어 예컨대 "상부", "하부", "종방향", "횡방향", "기계 직교 방향", "안쪽으로", "바깥쪽으로" 등이 본원에서 또는 도면과 관련해서 사용되는 경우에, 그러한 용어가 전형적인 기술 목적으로만 사용되고 제한하거나 또는 절대적인 것을 의도하지 않는다는 것을 인식할 것이다. 그 점에 있어서, 본원에 개시된 것 같은 기구가 본원에서 나타내고 기술된 것으로 제한되지 않은 다양한 배향 및 위치에 이용될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
본원에서 개시된 치수 및 값이 언급된 정확한 수치로 엄밀히 제한되는 것으로 이해하지 않아야 한다. 대신, 다르게 명시되지 않으면, 각 그러한 치수는 언급된 값 및 그 값 주위의 기능적으로 동등한 범위 둘 모두를 의미하는 것을 의도한다. 예를 들어, "20 mm"로 개시된 치수는 "약 20 mm"를 의미하는 것을 의도한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "기능" 및 "기능적"은 명세서에 비추어서 이해되는 바와 같은 그들의 문언적 및 평범한 의미를 가지고, 생물학적, 효소적, 또는 치료적 기능을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "억제하다"는 명세서에 비추어서 이해되는 바와 같은 그의 문언적 및 평범한 의미를 가지고, 생물학적 활성의 감소 또는 방지를 지칭할 수 있다. 감소는 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100%, 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100%이거나, 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100%이거나, 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100%이거나, 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100%이거나, 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100%이거나, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100% 이하이거나, 또는 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100% 이하이거나, 또는 전술한 값들 중 임의의 둘에 의해 한정되는 범위 내인 양인 백분율일 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "지연"은 명세서에 비추어서 이해되는 바와 같은 그의 문언적 및 평범한 의미를 가지고, 그렇지 않으면 예상보다 더 늦은 시점까지 생물학적 사건의 늦춤(slowing), 연기, 또는 유예를 지칭한다. 지연은 0%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 약 0%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%이거나, 적어도 0%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%이거나, 적어도 약 0%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%이거나, 0%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 이하이거나, 또는 약 0%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 이하이거나, 또는 전술한 값들 중 임의의 둘에 의해 한정되는 범위 내의 양인 백분율의 지연일 수 있다. 용어 억제하다 및 지연은 반드시 100% 억제 또는 지연을 지시할 필요가 없을 수 있다. 부분 억제 또는 지연이 실현될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "단리된"은 명세서에 비추어서 이해되는 바와 같은 그의 문언적 및 평범한 의미를 가지고, (1) 처음에 생성될 때(자연에서든 및/또는 실험 상황에서든) 그것이 관련된 성분들 중 적어도 일부로부터 분리되고/거나 (2) 사람의 손에 의해 생성되고/거나, 제조되고/거나, 제작된 물질 및/또는 엔터티(entity)를 지칭한다. 단리된 물질 및/또는 엔터티는 그와 처음에 관련되었던 다른 성분들의 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 98%, 약 99%, 실질적으로 100%, 또는 100%(또는 전술한 값들을 포함하는 및/또는 포괄하는 범위)이거나, 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 98%, 약 99%, 실질적으로 100%, 또는 100%(또는 전술한 값들을 포함하는 및/또는 포괄하는 범위)이거나, 적어도 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 98%, 약 99%, 실질적으로 100%, 또는 100%(또는 전술한 값들을 포함하는 및/또는 포괄하는 범위)이거나, 적어도 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 98%, 약 99%, 실질적으로 100%, 또는 100%(또는 전술한 값들을 포함하는 및/또는 포괄하는 범위)이거나, 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 98%, 약 99%, 실질적으로 100%, 또는 100%(또는 전술한 값들을 포함하는 및/또는 포괄하는 범위) 이하이거나, 또는 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 98%, 약 99%, 실질적으로 100%, 또는 100%(또는 전술한 값들을 포함하는 및/또는 포괄하는 범위) 이하로부터 분리될 수 있다. 일부 실시양태에서, 단리된 작용제는 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 실질적으로 100%, 또는 100% 순도(또는 전술한 값들을 포함하는 및/또는 포괄하는 범위)이거나, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 실질적으로 100%, 또는 100% 순도(또는 전술한 값들을 포함하는 및/또는 포괄하는 범위)이거나, 적어도 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 실질적으로 100%, 또는 100% 순도(또는 전술한 값들을 포함하는 및/또는 포괄하는 범위)이거나, 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 실질적으로 100%, 또는 100% 순도(또는 전술한 값들을 포함하는 및/또는 포괄하는 범위)이거나, 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 실질적으로 100%, 또는 100% 이하 순도(또는 전술한 값들을 포함하는 및/또는 포괄하는 범위)이거나, 또는 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 실질적으로 100%, 또는 100% 이하 순도(또는 전술한 값들을 포함하는 및/또는 포괄하는 범위)이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "단리"될 수 있는 물질은 "순수"할(예를 들어, 다른 성분들이 실질적으로 없을) 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "단리된 세포"는 다세포 유기체 또는 조직에 함유되지 않은 세포를 지칭할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "생체내"에는 명세서에 비추어서 이해되는 바와 같은 그의 문언적 및 평범한 의미가 주어지고, 조직 추출물 또는 죽은 유기체와 반대로, 살아있는 유기체, 통상적으로 동물, 사람을 포함한 포유동물, 및 식물 내부에서 방법을 수행하는 것을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "생체외"에는 명세서에 비추어서 이해되는 바와 같은 그의 문언적 및 평범한 의미가 주어지고, 자연 조건의 변경이 거의 없이 살아있는 유기체 외부에서 방법을 수행하는 것을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "시험관내"에는 명세서에 비추어서 이해되는 바와 같은 그의 문언적 및 평범한 의미가 주어지고, 생물학적 조건 외에서, 예를 들어 페트리 접시 또는 시험관에서 방법을 수행하는 것을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "핵산" 또는 "핵산 분자"는 명세서에 비추어서 이해되는 바와 같은 그의 문언적 및 평범한 의미를 가지고, 폴리뉴클레오티드, 예컨대 데옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA), 올리고뉴클레오티드, 천연적으로 세포에서 생기는 것들, 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 생성되는 단편, 및 결찰, 절단, 내핵산분해효소 작용 및 외핵산분해효소 작용 중 임의의 것에 의해 생성되는 단편을 지칭한다. 핵산 분자는 천연 발생 뉴클레오티드(예컨대 DNA 및 RNA), 또는 천연 발생 뉴클레오티드의 유사체(예를 들어, 천연 발생 뉴클레오티드의 에난티오머 형태), 또는 둘 모두의 조합인 단량체로 구성될 수 있다. 변형된 뉴클레오티드는 당 모이어티에서 및/또는 피리미딘 또는 퓨린 염기 모이어티에서 변경을 가질 수 있다. 당 변형은 예를 들어 할로겐, 알킬기, 아민, 및 아지도기로 하나 이상의 히드록실기의 대체를 포함하거나, 또는 당이 에테르 또는 에스테르로서 작용성화될 수 있다. 게다가, 전체 당 모이어티가 입체적으로 및 전자적으로 유사한 구조, 예컨대 아자-당 및 카르보시클릭 당 유사체로 대체될 수 있다. 염기 모이어티에서 변형의 예는 알킬화 퓨린 및 피리미딘, 아실화 퓨린 또는 피리미딘, 또는 다른 잘 알려진 헤테로시클릭 치환체를 포함한다. 핵산 단량체는 포스포디에스테르 결합 또는 그러한 연결의 유사체에 의해 연결될 수 있다. 포스포디에스테르 연결의 유사체는 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로셀레노에이트, 포스포로디셀레노에이트, 포스포로아닐로티오에이트, 포스포르아닐리데이트, 또는 포스포르아미데이트를 포함한다. 용어 "핵산 분자"는 또한 이른바 "펩티드 핵산"을 포함하고, 이것은 폴리아미드 주골격에 부착된 천연 발생 또는 변형된 핵산 염기를 포함한다. 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. "올리고뉴클레오티드"는 핵산과 호환가능하게 사용될 수 있고, 이중 가닥 또는 단일 가닥 DNA 또는 RNA를 지칭할 수 있다. 핵산 또는 핵산들은 다양한 생물학적 시스템에서 핵산 또는 핵산들의 증폭 및/또는 발현에 사용될 수 있는 핵산 벡터 또는 핵산 구성체(예를 들어 플라스미드, 바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 박테리오파지, 코스미드, 포스미드, 파지미드, 세균 인공 염색체(BAC), 효모 인공 염색체(YAC), 또는 사람 인공 염색체(HAC))에 함유될 수 있다. 대표적으로, 벡터 또는 구성체는 또한 프로모터, 인핸서, 종결자, 유도자, 리보솜 결합 부위, 번역 개시 부위, 출발 코돈, 정지 코돈, 폴리아데닐화 신호, 복제 원점, 클로닝 부위, 다중 클로닝 부위, 제한 효소 부위, 에피토프, 리포터 유전자, 선택 표식자, 항생제 선택 표식자, 표적화 서열, 펩티드 정제 태그, 또는 부속 유전자, 또는 그의 임의의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는 요소를 함유할 것이다.
핵산 또는 핵산 분자는 상이한 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질을 코딩하는 하나 이상의 서열을 포함할 수 있다. 이들 하나 이상의 서열은 동일한 핵산 또는 핵산 분자에서 인접해서 또는 그 사이에 여분의 핵산, 예를 들어 링커, 반복 또는 제한 효소 부위, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 또는 300 개 염기 길이이거나, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 또는 300 개 염기 길이이거나, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 또는 300 개 염기 길이이거나, 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 또는 300 개 염기 길이이거나, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 또는 300 개 이하 염기 길이이거나, 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 또는 300 개 이하 염기 길이이거나, 또는 전술한 길이 중 임의의 둘에 의해 한정되는 범위 내의 임의의 길이인 임의의 다른 서열을 가지고 결합될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같은 핵산에서 "하류"라는 용어는 명세서에 비추어서 이해되는 바와 같은 그의 문언적 및 평범한 의미를 가지고, 핵산이 이중 가닥인 경우 인코딩 서열을 함유하는 가닥(센스 가닥)에서 선행 서열의 3'-말단 다음에 있는 서열을 지칭한다. 본원에서 사용되는 바와 같은 핵산에서 "상류"라는 용어는 명세서에 비추어서 이해되는 바와 같은 그의 문언적 및 평범한 의미를 가지고, 핵산이 이중 가닥인 경우 인코딩 서열을 함유하는 가닥(센스 가닥)에서 후행 서열의 5'-말단 앞에 있는 서열을 지칭한다. 본원에서 사용되는 바와 같은 핵산에서 "그룹화된"이라는 용어는 명세서에 비추어서 이해되는 바와 같은 그의 문언적 및 평범한 의미를 가지고, 직접적으로 또는 그 사이에 여분의 핵산, 예를 들어 링커, 반복 또는 제한 효소 부위, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 또는 300 개이거나, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 또는 300 개이거나, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 또는 300 개이거나, 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 또는 300 개이거나, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 또는 300 개 이하이거나, 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 또는 300 개 이하 염기 길이이거나, 또는 전술한 길이 중 임의의 둘에 의해 한정되는 범위 내의 임의의 길이인 임의의 다른 서열을 갖지만 일반적으로 기능성 또는 촉매적 폴리펩티드, 단백질, 또는 단백질 도메인을 코딩하는 서열을 그 사이에 갖지 않고서 근접해서 존재하는 둘 이상의 서열을 지칭한다.
본원에서 기술되는 핵산은 핵염기를 포함한다. 1차, 표준적, 천연, 또는 비변형 염기는 아데닌, 시토신, 구아닌, 티민, 및 우라실이다. 다른 핵염기는 퓨린, 피리미딘, 변형 핵염기, 5-메틸시토신, 슈도우리딘, 디히드로우리딘, 이노신, 7-메틸구아노신, 히포크산틴, 크산틴, 5,6-디히드로우라실, 5-히드록시메틸시토신, 5-브로모우라실, 이소구아닌, 이소시토신, 아미노알릴 염기, 염료 표지 염기, 형광 염기, 또는 비오틴 표지 염기를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "펩티드", "폴리펩티드", 및 "단백질"은 명세서에 비추어서 이해되는 바와 같은 그의 문언적 및 평범한 의미를 가지고, 펩티드 결합에 의해 연결된 아미노산으로 구성된 마크로분자를 지칭한다. 펩티드, 폴리펩티드 및 단백질의 많은 기능이 관련 분야에 알려져 있고, 효소, 구조, 수송, 방어, 호르몬, 또는 신호전달을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 펩티드, 폴리펩티드, 및 단백질은 항상은 아니지만 종종 핵산 템플릿을 사용하여 리보솜 복합체에 의해 생물학적으로 생성되지만, 화학적 합성도 또한 이용가능하다. 핵산 템플릿을 조작함으로써, 펩티드, 폴리펩티드, 및 단백질 돌연변이 예컨대 하나 초과의펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질의 치환, 결실, 절두, 첨가, 중복, 또는 융합이 수행될 수 있다. 하나 초과의 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질의 이들 융합은 동일한 분자에서 인접해서, 또는 그 사이에 여분의 아미노산, 예를 들어 링커, 반복, 에피토프, 또는 태그, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 또는 300개 염기 길이이거나, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 또는 300개 염기 길이이거나, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 또는 300개 염기 길이이거나, 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 또는 300개 염기 길이, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 또는 300개 이하 염기 길이이거나, 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 또는 300개 이하 염기 길이이거나, 또는 전술한 길이 중 임의의 둘에 의해 한정되는 범위 내의 임의의 길이인 임의의 다른 서열을 가지고 결합될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같은 폴리펩티드에서 "하류"라는 용어는 명세서에 비추어서 이해되는 바와 같은 그의 문언적 및 평범한 의미를 가지고, 선행 서열의 C-말단 다음에 있는 서열을 지칭한다. 본원에서 사용되는 바와 같은 폴리펩티드에서의 용어 "상류"는 명세서에 비추어서 이해되는 바와 같은 그의 문언적 및 평범한 의미를 가지고, 후행 서열의 N-말단 앞에 있는 서열을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 임의의 주어진 물질, 화합물, 또는 재료의 "순도"라는 용어는 명세서에 비추어서 이해되는 바와 같은 그의 문언적 및 평범한 의미를 가지고, 예상 존재량(abundance)에 대한 물질, 화합물, 또는 재료의 실제 존재량을 지칭한다. 예를 들어, 물질, 화합물, 또는 재료는 적어도 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% 순도일 수 있고, 그 사이의 모든 소수를 포함한다. 순도는 핵산, DNA, RNA, 뉴클레오티드, 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 아미노산, 지질, 세포막, 세포 잔해(cell debris), 작은 분자, 분해 생성물, 용매, 담체, 비히클, 또는 오염물, 또는 그의 임의의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는 원하지 않는 불순물에 의해 영향을 받을 수 있다. 일부 실시양태에서, 물질, 화합물, 또는 재료는 숙주 세포 단백질, 숙주 세포 핵산, 플라스미드 DNA, 오염 바이러스, 프로테아좀, 숙주 세포 배양물 성분, 공정 관련 성분, 마이코플라즈마, 발열질, 세균성 내독소, 및 외래성 오염인자(adventitious agent)가 실질적으로 없다. 순도는 전기영동, SDS-PAGE, 모세관 전기영동, PCR, rtPCR, qPCR, 크로마토그래피, 액체 크로마토그래피, 기체 크로마토그래피, 박층 크로마토그래피, 효소-연결 면역흡착 검정(ELISA), 분광학, 자외선-가시광선 분광법, 적외선 분광법, 질량 분광법, 핵자기 공명, 중량분석법, 또는 적정, 또는 그의 임의의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는 기술을 사용하여 측정될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같은 임의의 주어진 물질, 화합물, 또는 재료의 "수율"이라는 용어는 명세서에 비추어서 이해되는 바와 같은 그의 문언적 및 평범한 의미를 가지고, 예상 전체 양에 대한 물질, 화합물, 또는 재료의 실제 전체 양을 지칭한다. 예를 들어, 물질, 화합물, 또는 재료의 수율은 예상 전체 양의 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100%이거나, 약 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100%이거나, 적어도 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100%이거나, 적어도 약 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100%이거나, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% 이하이거나, 또는 약 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% 이하이고, 그 사이의 모든 소수를 포함한다. 수율은 반응 또는 공정, 원하지 않는 부반응, 분해, 투입 물질, 화합물, 또는 재료의 질, 또는 임의의 생성 단계 동안의 요망되는 물질, 화합물, 또는 재료의 손실에 의해 영향받을 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "% w/w" 또는 "% wt/wt"는 명세서에 비추어서 이해되는 바와 같은 그의 문언적 및 평범한 의미를 가지고, 성분 또는 작용제의 중량을 조성물의 총 중량으로 나누어서 여기에 100을 곱한 것으로 표현되는 백분율을 지칭한다. 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "%v/v" 또는 "% vol/vol"은 명세서에 비추어서 이해되는 바와 같은 그의 문언적 및 평범한 의미를 가지고, 화합물, 물질, 성분, 또는 작용제의 액체 부피를 조성물의 총 액체 부피로 나누어서 여기에 100을 곱한 것으로 표현되는 백분율을 지칭한다.
줄기 세포
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "전분화능 줄기 세포"(또한 전능 줄기 세포라고도 알려짐)는 명세서에 비추어서 이해되는 바와 같은 그의 문언적 및 평범한 의미를 가지고, 배아 및 배아외 세포 유형으로 분화할 수 있는 줄기 세포이다. 그러한 세포는 완전한 생존가능 유기체를 구성할 수 있다. 이들 세포는 난자 및 정자 세포의 융합으로부터 생성된다. 수정란의 처음 몇회 분열에 의해 생성되는 세포도 또한 전분화능이다.
본원에서 사용되는 바와 같은 흔히 ES 세포라고도 약기되는 용어 "배아 줄기 세포(ESC)"는 명세서에 비추어서 이해되는 바와 같은 그의 문언적 및 평범한 의미를 가지고, 초기 단계 배아인 포배의 내세포괴로부터 유래되는 만능 세포를 지칭한다. 본 발명의 목적상, 용어 "ESC"는 때로는 광범위하게 사용되며 배아 종자 세포도 또한 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "만능 줄기 세포(PSC)"는 명세서에 비추어서 이해되는 바와 같은 그의 문언적 및 평범한 의미를 가지고, 신체의 거의 모든 세포 유형으로 분화할 수 있는 임의의 세포 유형, 즉, 내배엽(위 내벽, 위장관, 폐), 중배엽(근육, 뼈, 혈액, 비뇨생식기), 및 외배엽(표피 조직 및 신경계)을 포함하는 세 배엽(종자 상피) 중 임의의 배엽으로부터 유래되는 세포를 포함한다. PSC는 착상전 포배의 내세포괴 세포의 자손일 수 있거나 또는 강제로 일부 유전자가 발현하게 함으로써 비만능 세포, 예컨대 성체 체세포의 유도를 통해 얻을 수 있다. 만능 줄기 세포는 임의의 적합한 원천으로부터 유래될 수 있다. 만능 줄기 세포의 원천의 예는 사람, 설치류, 돼지, 및 소를 포함하는 포유동물 원천을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 iPS 세포라고도 흔히 약기되는 용어 "유도 만능 줄기 세포(iPSC)"는 명세서에 비추어서 이해되는 바와 같은 그의 문언적 및 평범한 의미를 가지고, 일부 유전자의 "강제" 발현을 유도함으로써 정상 비만능 세포, 예컨대 성체 체세포로부터 인공적으로 유래된 만능 줄기 세포의 한 유형을 지칭한다. hiPSC는 사람 iPSC를 지칭한다. 관련 분야에 알려진 일부 방법에서는, iPSC가 비만능 세포, 예컨대 성체 섬유모세포로의 일부 줄기 세포 관련 유전자의 형질감염에 의해 유래될 수 있다. 형질감염은 바이러스 예컨대 레트로바이러스 또는 렌티바이러스를 사용하는 바이러스 형질도입을 통해 달성될 수 있다. 형질감염된 유전자는 마스터 전사 조절자 Oct-3/4(POU5F1) 및 Sox2를 포함할 수 있지만, 다른 유전자들이 유도 효율을 증진시킬 수 있다. 3-4 주 후, 적은 수의 형질감염된 세포가 만능 줄기 세포와 형태학적으로 및 생화학적으로 유사해지기 시작하고, 대표적으로 형태학적 선택, 배가 시간을 통해, 또는 리포터 유전자 및 항생제 선택을 통해 단리된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, iPSC는 1 세대 iPSC, 마우스에서의 2 세대 iPSC, 및 사람 유도 만능 줄기 세포를 포함한다. 일부 방법에서는, 레트로바이러스 시스템이 4개 중추적 유전자 Oct3/4, Sox2, Klf4, 및 c-Myc를 사용하여 사람 섬유모세포를 만능 줄기 세포로 형질전환하는 데 사용된다. 다른 방법에서는, 렌티바이러스 시스템이 체세포를 OCT4, SOX2, NANOG, 및 LIN28로 형질전환하는 데 사용된다. iPSC에서 발현이 유도되는 유전자는 Oct-3/4(POU5F1); Sox 유전자 패밀리의 일부 구성원(예를 들어, Soxl, Sox2, Sox3, 및 Sox15); Klf 패밀리의 일부 구성원(예를 들어, Klfl, Klf2, Klf4, 및 Klf5), Myc 패밀리의 일부 구성원(예를 들어, C-myc, L-myc, 및 N-myc), Nanog, LIN28, Tert, Fbx15, ERas, ECAT15-1, ECAT15-2, Tcl1, β-Catenin, ECAT1, Esg1, Dnmt3L, ECAT8, Gdf3, Fth117, Sal14, Rex1, UTF1, Stella, Stat3, Grb2, Prdm14, Nr5a1, Nr5a2, 또는 E-cadherin, 또는 그의 임의의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "전구 세포"는 명세서에 비추어서 이해되는 바와 같은 그의 문언적 및 평범한 의미를 가지고, 본원에서 기술되는 방법에서 사용될 수 있는 임의의 세포를 포함하고, 그 방법을 통해 하나 이상의 전구 세포가 그 자체를 재생하거나 또는 하나 이상의 특수화된 세포 유형으로 분화하는 능력을 획득한다. 일부 실시양태에서, 전구 세포는 만능성이거나, 또는 만능성이 될 용량을 가진다. 일부 실시양태에서, 전구 세포는 외부 인자(예를 들어, 성장 인자) 처리를 받아서 다능성을 획득한다. 일부 실시양태에서, 전구 세포는 전분화능(또는 전능) 줄기 세포; 만능 줄기 세포(유도 또는 비유도); 다능 줄기 세포; 소능 줄기 세포 및 단능 줄기 세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 전구 세포는 배아, 영아, 소아 또는 성체로부터 얻을 수 있다. 일부 실시양태에서, 전구 세포는 유전자 조작 또는 단백질/펩티드 처리를 통해 만능성이 부여되도록 처리받은 체세포일 수 있다. 전구 세포는 배아 줄기 세포(ESC), 배아 암종 세포(EC), 및 배반엽 상피 줄기 세포(EpiSC)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 한 단계는 만능성이거나 또는 만능성이 되도록 유도될 수 있는 줄기 세포를 얻는 것이다. 일부 실시양태에서, 만능 줄기 세포는 배아 줄기 세포로부터 유래되고, 배아 줄기 세포는 결국 초기 포유동물 배아의 전분화능 세포로부터 유래되고 시험관내에서 비제한된 비분화된 증식을 할 수 있다. 배아 줄기 세포는 초기 단계 배아인 포배의 내세포괴로부터 유래되는 만능 줄기 세포이다. 배세포로부터 배아 줄기 세포를 유래하는 방법은 관련 분야에 잘 알려져 있다. 사람 배아 줄기 세포 H9(H9-hESC)가 본 출원에서 기술된 전형적인 실시양태에서 사용되지만, 관련 분야의 기술자는 본원에서 기술된 방법 및 시스템이 임의의 줄기 세포에 응용가능하다는 것을 이해할 것이다.
본 발명에 따른 실시양태에서 사용될 수 있는 추가의 줄기 세포는 National Stem Cell Bank(NSCB), Human Embryonic Stem Cell Research Center at the University of California, San Francisco(UCSF); WISC cell Bank at the Wi Cell Research Institute; the University of Wisconsin Stem Cell and Regenerative Medicine Center(UW-SCRMC); Novocell, Inc.(San Diego, Calif.); Cellartis AB(Goteborg, Sweden); ES Cell International Pte Ltd(Singapore); Technion at the Israel Institute of Technology(Haifa, Israel)에 의해 관리되는 데이터베이스; 및 Princeton University and the University of Pennsylvania에 의해 관리되는 Stem Cell Database에 의해 제공되거나 또는 거기에 기술된 것들을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 본 발명에 따른 실시양태에서 사용될 수 있는 전형적인 배아 줄기 세포는 SA01(SA001); SA02(SA002); ES01(HES-1); ES02(HES-2); ES03(HES-3); ES04(HES-4); ES05(HES-5); ES06(HES-6); BG01(BGN-01); BG02(BGN-02); BG03(BGN-03); TE03(13); TE04(14); TE06(16); UCOl(HSF1); UC06(HSF6); WA01(HI); WA07(H7); WA09(H9); WA13(H13); WA14(H14)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 전형적인 사람 만능 세포주는 TkDA3-4, 1231A3, 317-D6, 317-A4, CDH1, 5-T-3, 3-34-1, NAFLD27, NAFLD77, NAFLD150, WD90, WD91, WD92, L20012, C213, 1383D6, FF, 또는 317-12 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
발생 생물학에서, 세포 분화는 덜 특수화된 세포가 더 특수화된 세포 유형이 되는 과정이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "지향성 분화"는 덜 특수화된 세포가 특별한 특수화된 표적 세포 유형이 되는 과정을 기술한다. 특수화된 표적 세포 유형의 특별성은 초기 세포의 운명을 한정하거나 또는 변경하는 데 사용될 수 있는 임의의 응용가능한 방법으로 결정될 수 있다. 전형적인 방법은 유전자 조작, 화학적 처리, 단백질 처리, 및 핵산 처리를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
일부 실시양태에서는, 아데노바이러스가 필수 4개 유전자를 수송하는 데 사용될 수 있고, 그 결과로 배아 줄기 세포와 실질적으로 동일한 iPSC를 초래한다. 아데노바이러스는 그 자체의 유전자 중 어느 것도 표적화된 숙주와 조합하지 않기 때문에, 종양을 생성하는 위험이 제거된다. 일부 실시양태에서는, 비바이러스 기반 기술이 iPSC를 생성하는 데 이용된다. 일부 실시양태에서는, 리프로그래밍이 매우 낮은 효율이긴 하지만 어떠한 바이러스 형질감염 시스템도 전혀 없이 플라스미드를 통해 달성될 수 있다. 다른 실시양태에서는, 단백질의 직접 전달이 iPSC를 생성하는 데 사용되고, 따라서 바이러스 또는 유전자 변형의 필요를 제거한다. 일부 실시양태에서는, 마우스 iPSC의 생성이 유사한 방법론을 사용하여 가능하다: 폴리-아르기닌 앵커를 통해 세포 안으로 채널링된 일부 단백질로 세포의 반복 처리가 만능성을 유도하기에 충분하였다. 일부 실시양태에서는, 만능 유도 유전자의 발현이 또한 체세포를 FGF2로 낮은 산소 조건 하에서 처리함으로써 증가될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "센다이 바이러스"는 명세서에 비추어서 이해되는 바와 같은 그의 문언적 및 평범한 의미를 가지고, 패밀리 파라믹소비리다에(Paramyxoviridae)의 외피가 있는 네가티브-센스 단일가닥 RNA 바이러스를 지칭하고, 또한 쥐류 파라인플루엔자 바이러스 유형 1 또는 일본 혈구응집 바이러스(HVJ)라고도 알려져 있다. 대표적으로는 오직 설치류에서 질병을 일으키지만, 그 바이러스는 시알산 수용체에 의해 사람 세포를 포함해서 넓은 범위의 포유동물 세포를 감염시킬 수 있다. 센다이 바이러스는 도입 유전자(transgene)를 시험관내에서 및 생체내에서 세포에 전달하는 바이러스 벡터로 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서는, 체세포를 유도 만능 줄기 세포로 리프로그래밍하기 위해, 센다이 바이러스를 줄기 세포 리프로그래밍 인자를 위한 발현 벡터를 포함하도록 조작하였다. 일부 실시양태에서는, 줄기 세포 리프로그래밍 인자가 Oct3/4, Sox2, Klf4, 및 L-Myc, 또는 그의 임의의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않지만, 또한 본원에 개시된 또는 관련 분야에 알려진 임의의 줄기 세포 리프로그래밍 인자를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서는, 이들 줄기 세포 리프로그래밍 인자의 기원이 사람이다. 일부 실시양태에서는, 센다이 바이러스 벡터가 Oct3/4, Sox2, Klf4, L-Myc, 또는 또 다른 줄기 세포 리프로그래밍 인자 중 하나 이상(예를 들어 적어도 1, 2, 3, 4, 5 개)을 위한 발현 벡터를 포함한다. 일부 실시양태에서는, 센다이 바이러스 벡터가 Klf4, Oct3/4 및 Sox2(KOS)를 위한 발현 벡터를 포함한다. 일부 실시양태에서는, 센다이 바이러스 벡터가 L-Myc를 위한 발현 벡터를 포함한다. 일부 실시양태에서는, 센다이 바이러스 벡터가 Klf4를 위한 발현 벡터를 포함한다. 일부 실시양태에서는, 하나 이상의 센다이 바이러스 벡터가 상이한 비로 조합되어 세포의 리프로그래밍을 최적화한다. 일부 실시양태에서는, 체세포를 하나 이상의 센다이 바이러스 벡터와 접촉시키는 것이 체세포를 유도 만능 줄기 세포로 성공적으로 리프로그래밍한다. RNA 바이러스로서, 센다이 바이러스는 숙주 게놈 내로의 바이로스 페이로드(payload)의 통합을 요구하지 않고 또한 그것은 (DNA 바이러스처럼) 핵 접근을 요구하지도 않는다. 이것은 렌티바이러스 및 아데노바이러스와 상이하다. 그러나, 다른 바이러스 벡터 예컨대 렌티바이러스, 아데노바이러스, 및 아데노-관련 바이러스가 본원에서 기술된 형질도입 목적에 사용될 수 있고, 여기서 센다이 바이러스가 예컨대 체세포를 줄기 세포로 리프로그래밍하는 데 사용된다는 것이 구상된다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "피더 세포"(feeder cell)는 명세서에 비추어서 이해되는 바와 같은 그의 문언적 및 평범한 의미를 가지고, 예컨대 성장 인자를 배지에 분비하거나 또는 세포 표면 상에서 전시함으로써 만능 줄기 세포의 성장을 지지하는 세포를 지칭한다. 피더 세포는 일반적으로 부착성 세포이고, 성장 정지될 수 있다. 예를 들어, 피더 세포는 조사(예를 들어 감마선), 미토마이신-C 처리, 전기 펄스, 또는 온화한 화학적 고착(예를 들어 포름알데히드 또는 글루타르알데히드 이용)에 의해 성장 정지된다. 그러나, 피더 세포는 반드시 성장 정지되어야 할 필요는 없다. 피더 세포는 성장 인자 분비, 세포 표면 상에 성장 인자 전시, 배양 배지 해독, 또는 세포외 기질 단백질 합성과 같은 목적에 쓸모가 있을 수 있다. 일부 실시양태에서, 피더 세포는 지지된 표적 줄기 세포와 동종 또는 이종이고, 이것은 하류 응용에서 영향을 미칠 수 있다. 일부 실시양태에서, 피더 세포는 마우스 세포이다. 일부 실시양태에서, 피더 세포는 사람 세포이다. 일부 실시양태에서, 피더 세포는 마우스 섬유모세포, 마우스 배아 섬유모세포, 마우스 STO 세포, 마우스 3T3 세포, 마우스 SNL 76/7 세포, 사람 섬유모세포, 사람 포피 섬유모세포, 사람 진피 섬유모세포, 사람 지방 중간엽 세포, 사람 골수 중간엽 세포, 사람 양막 중간엽 세포, 사람 양막 상피 세포, 사람 탯줄 중간엽 세포, 사람 태아 근육 세포, 사람 태아 섬유모세포, 또는 사람 성체 나팔관 상피 세포이다. 일부 실시양태에서, 피더 세포로부터 제조된 컨디셔닝된 배지가 피더 세포 공배양물 대신에 또는 피더 세포 공배양물과 조합해서 사용된다. 일부 실시양태에서는, 피더 세포가 표적 줄기 세포의 증식 동안에 사용되지 않는다.
본원에서 기술된 일부 실시양태는 유효량의 본원에서 기술된 세포 조성물 및 제약학상 허용되는 담체, 부형제, 또는 그의 조합을 포함하는, 그것으로 본질적으로 이루어지는, 또는 그것으로 이루어지는 제약 조성물에 관한 것이다. 본원에서 기술된 제약 조성물은 사람 및/또는 수의과 응용에 적합하다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "제약학상 허용되는"은 명세서에 비추어서 이해되는 바와 같은 그의 문언적 및 평범한 의미를 가지고, 이용된 투여량 및 농도에서 그에 노출된 세포 또는 포유동물에 비독성이거나 또는 허용되는 수준의 독성을 가지는 담체, 부형제, 및/또는 안정화제를 지칭한다. 본원에서 사용되는 바와 같은 "제약학상 허용되는", "희석제", "부형제", 및/또는 "담체"는 명세서에 비추어서 이해되는 바와 같은 그의 문언적 및 평범한 의미를 가지고, 사람, 고양이, 개, 또는 다른 척추동물 숙주에 투여하는 것과 상용성이 있는 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항균 및 항진균 작용제, 등장성 및 흡수 지연 작용제 등을 포함하는 것을 의도한다. 대표적으로, 제약학상 허용되는 희석제, 부형제, 및/또는 담체는 연방의 규제 기관, 주 정부, 또는 다른 규제 기관에 의해 승인된, 또는 미국 약전 또는 다른 일반적으로 인정된 약전에서 사람 뿐만 아니라 비사람 포유동물, 예컨대 고양이 및 개를 포함하는 동물에 사용하기 위한 것으로 열거된 희석제, 부형제, 및/또는 담체이다. 용어 희석제, 부형제, 및/또는 "담체"는 제약 조성물과 함께 투여되는 희석제, 보조제, 부형제, 또는 비히클을 지칭할 수 있다. 그러한 제약학상 희석제, 부형제, 및/또는 담체는 멸균 액체, 예컨대 물, 및 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원의 오일을 포함하는 오일일 수 있다. 물, 식염수 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액은 액체 희석제, 부형제, 및/또는 담체로서 특히 주사 용액에 이용될 수 있다. 적합한 제약학상 희석제 및/또는 부형제는 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 백악, 실리카겔, 스테아르산나트륨, 글리세롤 모노스테아레이트, 활석, 염화나트륨, 탈지분유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 생리학상 허용되는 담체의 비제한적 예는 수성 pH 완충 용액이다. 생리학상 허용되는 담체는 또한 다음 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 항산화제, 예컨대 아스코르브산, 저분자량(약 10 개 미만 잔기) 폴리펩티드, 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 면역글로불린, 친수성 중합체 예컨대 폴리비닐피롤리돈, 아미노산, 탄수화물 예컨대 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린, 킬레이트화제 예컨대 EDTA, 당 알콜 예컨대 만니톨 또는 소르비톨, 염 형성 반대이온 예컨대 나트륨, 및 비이온성 계면활성제 예컨대 TWEEN®, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 및 PLURONIC®. 조성물은 요망되는 경우 또한 미량의 습윤, 벌크화, 유화 작용제, 또는 pH 완충 작용제를 함유할 수 있다. 이들 조성물은 용액, 현탁액, 에멀전, 지속 방출 제제 등의 형태를 취할 수 있다. 제제는 투여 방식에 적합해야 한다.
동결보호제는 큰 얼음 결정의 형성을 방지함으로써 저온 동결보존의 효능 및 수율을 개선하는 세포 조성물 첨가제이다. 동결보호제는 DMSO, 에틸렌 글리콜, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 트레할로스, 포름아미드, 메틸-포름아미드, 디메틸-포름아미드, 글리세롤 3-포스페이트, 프롤린, 소르비톨, 디에틸 글리콜, 당, 트리에틸렌 글리콜, 폴리비닐 알콜, 폴리에틸렌 글리콜, 또는 히드록시에틸 전분을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 동결보호제는 동결보존 배지의 일부로 사용될 수 있고, 동결보존 배지는 세포의 해동후 생존가능성을 증진시키기 위해 다른 성분 예컨대 영양소(예를 들어 알부민, 혈청, 소 혈청, 태아 소 혈청 [FC])를 포함한다. 이들 동결보존 배지에서, 적어도 하나의 동결보호제가 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%이거나, 약 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%이거나, 적어도 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%이거나, 적어도 약 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%이거나, 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90% 이하이거나, 또는 약 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90% 이하이거나, 또는 전술한 숫자 중 임의의 둘에 의해 한정되는 범위 내의 임의의 백분율인 농도로 발견될 수 있다.
바람직한 특성을 갖는 추가의 부형제는 방부제, 보조제, 안정화제, 용매, 완충제, 희석제, 가용화 작용제, 세정제, 계면활성제, 킬레이트화 작용제, 항산화제, 알콜, 케톤, 알데히드, 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 시트르산, 염, 염화나트륨, 중탄산나트륨, 인산나트륨, 붕산나트륨, 시트르산나트륨, 염화칼륨, 인산칼륨, 황산마그네슘 당, 덱스트로스, 프럭토스, 만노스, 락토스, 갈락토스, 수크로스, 소르비톨, 셀룰로스, 혈청, 아미노산, 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80, 데옥시콜산나트륨, 타우로데옥시콜산나트륨, 스테아르산마그네슘, 옥틸페놀 에톡실레이트, 벤즈에토늄 클로라이드, 티메로살, 젤라틴, 에스테르, 에테르, 2-페녹시에탄올, 우레아 또는 비타민, 또는 그의 임의의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 부형제는 잔류 양일 수 있거나 또는 제작 공정으로부터의 오염물질일 수 있고, 혈청, 알부민, 난백알부민, 항생제, 불활성화 작용제, 포름알데히드, 글루타르알데히드, β-프로피오락톤, 젤라틴, 세포 잔해, 핵산, 펩티드, 아미노산, 또는 성장 배지 성분 또는 그의 임의의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 부형제의 양은 조성물에서 0%, 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100% w/w이거나, 약 0%, 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100% w/w이거나, 적어도 0%, 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100% w/w이거나, 적어도 약 0%, 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100% w/w이거나, 0%, 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100% w/w 이하이거나, 또는 약 0%, 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100% w/w 이하이거나, 또는 전술한 숫자 중 임의의 둘에 의해 한정되는 범위 내의 임의의 중량 백분율인 백분율로 발견될 수 있다.
용어 "제약학상 허용되는 염"은 명세서에 비추어서 이해되는 바와 같은 그의 문언적 및 평범한 의미를 가지고, 진통 작용제, 치료적 작용제, 다른 재료 등을 제한 없이 포함하는 조성물 또는 부형제의 상대적으로 비독성, 무기 및 유기 산 또는 염기 첨가 염을 포함한다. 제약학상 허용되는 염의 예는 광물 산, 예컨대 염산 및 황산으로부터 유래되는 것, 및 유기 산, 예컨대 에탄술폰산, 벤젠술폰산, p-톨루엔술폰산 등으로부터 유래되는 것을 포함한다. 염 형성을 위한 적합한 무기 염기의 예는 암모니아, 나트륨, 리튬, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 알루미늄, 아연 등의 수산화물, 탄산염 및 중탄산염을 포함한다. 염은 또한 비독성이고 그러한 염을 형성하기에 충분히 강한 것들을 포함하는 적합한 유기 염기와 함께 형성될 수 있다. 예를 들어, 그러한 유기 염기의 부류는 메틸아민, 디메틸아민, 및 트리에틸아민을 포함하는 모노-, 디-, 및 트리알킬아민; 모노-, 디-, 및 트리에탄올아민을 포함하는 모노-, 디-, 또는 트리히드록시알킬아민; 글리신, 아르기닌 및 리신을 포함하는 아미노산; 구아니딘; N-메틸글루코사민; N-메틸글루카민; L-글루타민; N-메틸피페라진; 모르폴린; 에틸렌디아민; N-벤질펜에틸아민; 트리히드록시메틸 아미노에탄을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다.
적절한 제제는 선택된 투여 경로에 의존한다. 본원에서 기술된 화합물의 제제화 및 투여를 위한 기술은 관련 분야의 숙련된 자에게 알려져 있다. 화합물을 투여하는 다수의 기술이 관련 분야에 존재하고, 장관, 경구, 직장, 국소, 설하, 협측, 귀내, 경막외, 에피큐테이니어스(epicutaneous), 에어로졸, 근육내, 피하, 동맥내, 정맥내, 내문, 관절내, 진피내, 복막, 척수내 주사, 경막내, 직접 심실내, 복막내, 비내 또는 안내 주사를 포함하는 비경구 전달을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 제약 조성물은 일반적으로 특정한 의도된 투여 경로에 맞출 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "담체"는 명세서에 비추어서 이해되는 바와 같은 그의 문언적 및 평범한 의미를 가지고, 세포, 조직 및/또는 신체 장기에 화합물의 통과, 전달 및/또는 혼입을 용이하게 하는 화합물, 입자, 고체, 반고체, 액체, 또는 희석제를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "희석제"는 명세서에 비추어서 이해되는 바와 같은 그의 문언적 및 평범한 의미를 가지고, 약리학상 활성이 결여되지만 제약학상 필요하거나 또는 바람직할 수 있는 제약 조성물 중의 성분을 지칭한다. 예를 들어, 희석제는 제작 및/또는 투여하기에 너무 작은 질량을 가지는 효력이 있는 약물의 벌크를 증가시키는 데 사용될 수 있다. 그것은 또한 주사, 섭취 또는 흡입에 의해 투여되는 약물의 용해를 위한 액체일 수 있다. 관련 분야에서 희석제의 공통적인 형태는 완충 수용액 예컨대 제한 없이 사람 혈액의 조성을 모방하는 인산염 완충 식염수이다.
본 발명은 일반적으로 본원에서 많은 실시양태를 기술하기 위해 긍정적 언어를 사용하여 개시된다. 본 발명은 또한 주제가 전체적으로 또는 부분적으로 배제된 실시양태, 예컨대 물질 또는 재료, 방법 단계 및 조건, 프로토콜, 또는 절차를를 포함한다.
장 장기 발생
해부학에서, 장(또는 창자)은 위에서 항문까지 연장되는 소화관의 세그먼트이고, 사람 및 다른 포유동물에서는 두 세그먼트 소장 및 대장으로 이루어진다. 사람에서, 소장은 추가로 십이지장, 공장 및 회장으로 세분되고, 한편 대장은 맹장 및 결장으로 세분된다. 장 장기의 구조는 본원에서는 한 예로서 사람 장기를 사용하여 기술된다. 관련 분야의 통상의 기술을 가진 자는 본원에서 기술된 방법 및 시스템이 모든 포유동물의 장 계통에 응용가능하다는 것을 이해할 것이다.
장관은 광범위하게는 두 상이한 부분 소장 및 대장으로 나뉠 수 있다. 회색빛이 도는 자주색이고 약 35 밀리미터(1.5 inch)의 직경을 가지는 소장이 처음에 있고 더 길며, 성인 남성에서 평균 길이가 6 내지 7 m(20 - 23 피트)이다. 더 짧고 상대적으로 땅딸막한 대장은 암적색이고 길이가 평균적으로 대충 1.5 m(5 피트)이다.
내강은 소화된 음식물이 통과하고 영양소가 흡수되는 강(cavity)이다. 두 장 모두가 전체 거트와 일반 구조를 공유하고, 여러 층으로 구성된다.
내강 내부부터 방사상으로 바깥쪽으로 감에 따라, 순서는 점막(상피 및 점막근판), 점막하, 외근육층(안쪽 윤주근 및 바깥쪽 종주근으로 구성됨), 및 마지막으로 장막이다. 상피에서 거트의 전체 길이를 따라서 배상세포가 있다. 이들은 음식물의 통과를 윤활하게 하고 거트를 소화 효소로부터 보호하는 점액을 분비한다. 음와는 점막의 함입이고, 융모는 장의 전체 표면적을 증가시키고 한편으로 또한 유미관을 함유하는 손가락모양 돌기이고, 유미관은 림프계에 연결되고 혈액 공급으로부터 지질 및 조직 유체의 제거를 돕는다. 발생 동안, 상피가 찌그러지고 함입이 일어나서 결과적으로 융기선(ridge)이 생기고, 이것은 나중에 음와-융모 아키텍처로 변한다. 미세융모가 융모의 상피에 존재하고, 흡수가 일어날 수 있는 표면적을 추가로 증가시킨다. 점막근판은 거트를 따라서 계속되는 연동운동 및 추진운동의 작용을 돕는 평활근의 층이다. 점막하는 신경(예를 들어 점막밑신경얼기), 혈관, 및 탄성 섬유를 증가된 용량으로 신장하지만 장의 형상을 유지하는 콜라겐과 함께 함유한다. 외근육층은 종주 평활근을 포함하고, 이것은 또 계속되는 연동운동 및 거트를 따라서 밖으로 소화된 재료의 이동을 돕는다. 근육의 두 층 사이에 아우어바흐신경얼기가 있다. 장막은 느슨한 결합 조직으로 구성되고, 장이 다른 조직과 맞문질러져서 생기는 마찰 손상을 방지하도록 점액으로 코팅된다. 이 모든 것을 제자리에 유지하는 것은 장간막이고, 장간막은 장을 복강에 부유시키고 사람이 신체 활동할 때 그것이 흐트러지는 것을 막는다.
PSC의 분화
일부 실시양태에서, PSC, 예컨대 ESC 및 iPSC는 단계적 방식으로 처음에 완전 내배엽(DE)으로, 그 다음에 후방/후장 상피(예를 들어, 후장 스페로이드)로, 그 다음에 장 조직으로 지향성 분화를 겪는다. 일부 실시양태에서, PSC, 예컨대 ESC 및 iPSC는 비단계적 방식으로 지향성 분화를 겪고, 여기서 DE 형성을 촉진하기 위한 분자(예를 들어, 성장 인자, 리간드) 및 그 후에 조직 형성을 위한 분자가 동시에 첨가된다.
완전 내배엽은 거트 관(gut tube)을 생기게 한다. 전방 DE는 전장, 및 그와 관련된 식도, 폐, 위, 간 및 췌장을 포함하는 장기를 형성하고, 후방 DE는 중장 및 후장을 형성하고, 이것은 소장 및 대장, 및 비뇨생식계통의 부분을 형성한다. 마우스, 병아리 및 개구리 배아를 사용한 연구는 낭배기에서 DE에서 전방-후방 패턴을 확립하는 것이 그 후의 전장 및 후장 발생을 위한 전제 조건임을 암시한다. Wnt 및 FGF 신호전달 경로는 후방 내배엽/후장 또는 전방 내배엽/전장 운명을 촉진시키는 데 결정적이다. 후장에서, 단순한 장방형 상피는 처음에 거짓중층 원주 상피로, 그 다음에 융모의 기저부에 분극된 원주 상피 및 증식대를 함유하는 융모로 발생하고, 이것은 추정 전구세포 도메인과 부합한다.
시험관내에서 장 조직으로의 DE의 분화를 지향하는 견고한 효율적 방법은 이전에 미국 특허 9,719,068에서 기술되었다. 일부 실시양태에서, 지향성 분화는 iPSC 및/또는 DE 세포에서 일부 신호전달 경로를 선택적으로 활성화함으로써 달성된다. 일부 실시양태에서, 신호전달 경로는 장 발생에서 활성인 경로이고, Wnt 신호전달 경로; Wnt/APC 신호전달 경로; FGF 신호전달 경로; TGF-베타 신호전달 경로; BMP 신호전달 경로; Notch 신호전달 경로; Hedgehog 신호전달 경로; LKB 신호전달 경로; 및 Par 극성 신호전달 경로를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
만능 세포(예를 들어, iPSC 또는 ESC)로부터 완전 내배엽을 생성하기 위한 임의의 방법이 본원에서 기술된 방법에 응용가능하다. 일부 실시양태에서, 만능 세포는 상실배로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 만능 줄기 세포는 줄기 세포이다. 이들 방법에서 사용되는 줄기 세포는 배아 줄기 세포를 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 배아 줄기 세포는 배아 내세포괴로부터 또는 배아 생식선 융기선으로부터 유래될 수 있다. 배아 줄기 세포 또는 종자 세포는 사람을 포함한 다양한 포유동물 종을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 동물 종으로부터 유래할 수 있다. 일부 실시양태에서는, 사람 배아 줄기 세포가 완전 내배엽을 생성하는 데 사용된다. 일부 실시양태에서는, 사람 배아 종자 세포가 완전 내배엽을 생성하는 데 사용된다. 일부 실시양태에서는, iPSC가 완전 내배엽을 생성하는 데 사용된다. 일부 실시양태에서는, 사람 iPSC(hiPSC)가 완전 내배엽을 생성하는 데 사용된다.
일부 실시양태에서는, 배아 줄기 세포 또는 종자 세포 또는 iPSC가 하나 이상의 작은 분자 화합물, 활성화제, 억제제, 또는 성장 인자로 6 hr, 12 hr, 18 hr, 24 hr, 36 hr, 48 hr, 60 hr, 72 hr, 84 hr, 96 hr, 120 hr, 150 hr, 180 hr, 240 hr, 300 hr. 약 6 hr, 12 hr, 18 hr, 24 hr, 36 hr, 48 hr, 60 hr, 72 hr, 84 hr, 96 hr, 120 hr, 150 hr, 180 hr, 240 hr, 300 hr이거나, 적어도 6 hr, 12 hr, 18 hr, 24 hr, 36 hr, 48 hr, 60 hr, 72 hr, 84 hr, 96 hr, 120 hr, 150 hr, 180 hr, 240 hr, 300 hr이거나, 적어도 약 6 hr, 12 hr, 18 hr, 24 hr, 36 hr, 48 hr, 60 hr, 72 hr, 84 hr, 96 hr, 120 hr, 150 hr, 180 hr, 240 hr, 300 hr이거나, 6 hr, 12 hr, 18 hr, 24 hr, 36 hr, 48 hr, 60 hr, 72 hr, 84 hr, 96 hr, 120 hr, 150 hr, 180 hr, 240 hr, 300 hr 이하이거나, 또는 약 6 hr, 12 hr, 18 hr, 24 hr, 36 hr, 48 hr, 60 hr, 72 hr, 84 hr, 96 hr, 120 hr, 150 hr, 180 hr, 240 hr, 300 hr 이하이거나, 또는 전술한 시간들 중 임의의 둘에 의해 한정되는 범위 내의 임의의 시간, 예를 들어 6 hr 내지 300 hr, 24 hr 내지 120 hr, 48 hr 내지 96 hr, 6 hr 내지 72 hr, 또는 24 hr 내지 300 hr의 시간 동안 처리된다. 일부 실시양태에서는 하나 초과의 작은 분자 화합물, 활성화제, 억제제, 또는 성장 인자가 첨가된다. 이들 경우에서는, 하나 초과의 작은 분자 화합물, 활성화제, 억제제, 또는 성장 인자가 동시에 또는 개별적으로 첨가될 수 있다.
일부 실시양태에서는, 배아 줄기 세포 또는 종자 세포 또는 iPSC가 10 ng/mL, 20 ng/mL, 50 ng/mL, 75 ng/mL, 100 ng/mL, 120 ng/mL, 150 ng/mL, 200 ng/mL, 500 ng/mL, 1000 ng/mL, 1200 ng/mL, 1500 ng/mL, 2000 ng/mL, 5000 ng/mL, 7000 ng/mL, 10000 ng/mL, 또는 15000 ng/mL이거나, 약 10 ng/mL, 20 ng/mL, 50 ng/mL, 75 ng/mL, 100 ng/mL, 120 ng/mL, 150 ng/mL, 200 ng/mL, 500 ng/mL, 1000 ng/mL, 1200 ng/mL, 1500 ng/mL, 2000 ng/mL, 5000 ng/mL, 7000 ng/mL, 10000 ng/mL, 또는 15000 ng/mL이거나, 적어도 10 ng/mL, 20 ng/mL, 50 ng/mL, 75 ng/mL, 100 ng/mL, 120 ng/mL, 150 ng/mL, 200 ng/mL, 500 ng/mL, 1000 ng/mL, 1200 ng/mL, 1500 ng/mL, 2000 ng/mL, 5000 ng/mL, 7000 ng/mL, 10000 ng/mL, 또는 15000 ng/mL이거나, 적어도 약 10 ng/mL, 20 ng/mL, 50 ng/mL, 75 ng/mL, 100 ng/mL, 120 ng/mL, 150 ng/mL, 200 ng/mL, 500 ng/mL, 1000 ng/mL, 1200 ng/mL, 1500 ng/mL, 2000 ng/mL, 5000 ng/mL, 7000 ng/mL, 10000 ng/mL, 또는 15000 ng/mL이거나, 10 ng/mL, 20 ng/mL, 50 ng/mL, 75 ng/mL, 100 ng/mL, 120 ng/mL, 150 ng/mL, 200 ng/mL, 500 ng/mL, 1000 ng/mL, 1200 ng/mL, 1500 ng/mL, 2000 ng/mL, 5000 ng/mL, 7000 ng/mL, 10000 ng/mL, 또는 15000 ng/mL 이하이거나, 또는 약 10 ng/mL, 20 ng/mL, 50 ng/mL, 75 ng/mL, 100 ng/mL, 120 ng/mL, 150 ng/mL, 200 ng/mL, 500 ng/mL, 1000 ng/mL, 1200 ng/mL, 1500 ng/mL, 2000 ng/mL, 5000 ng/mL, 7000 ng/mL, 10000 ng/mL, 또는 15000 ng/mL 이하이거나, 또는 전술한 농도 중 임의의 둘에 의해 한정되는 범위 내인 임의의 농도, 예를 들어, 10 ng/mL 내지 15000 ng/mL, 100 ng/mL 내지 5000 ng/mL, 500 ng/mL 내지 2000 ng/mL, 10 ng/mL 내지 2000 ng/mL, 또는 1000 ng/mL 내지 15000 ng/mL인 농도의 하나 이상의 작은 분자 화합물, 활성화제, 억제제, 또는 성장 인자로 처리된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 작은 분자 화합물, 활성화제, 억제제, 또는 성장 인자의 농도는 처리 전체에 걸쳐서 일정한 수준에서 유지된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 작은 분자 화합물, 활성화제, 억제제, 또는 성장 인자의 농도는 처리 과정 동안에 달라진다. 일부 실시양태에서는, 하나 초과의 작은 분자 화합물, 활성화제, 억제제, 또는 성장 인자가 첨가된다. 이 경우, 하나 초과의 작은 분자 화합물, 활성화제, 억제제, 또는 성장 인자는 농도가 상이할 수 있다.
일부 실시양태에서는, ESC, 종자 세포, 또는 iPSC가 줄기 세포의 성장을 지지하는 성장 배지에서 배양된다. 일부 실시양태에서는, ESC, 종자 세포, 또는 iPSC가 줄기 세포 성장 배지에서 배양된다. 일부 실시양태에서, 줄기 세포 성장 배지는 RPMI 1640, DMEM, DMEM/F12, Erythroid Expansion Media, Minigut 배지, StemPro 34 SFM(무혈청 배지), StemPro hESC SFM, mTeSR 1, 또는 mTeSR Plus 배지이다. 일부 실시양태에서, 줄기 세포 성장 배지는 태아 소 혈청(FBS)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 줄기 세포 성장 배지는 0%, 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 또는 20%이거나, 약 0%, 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 또는 20%이거나, 적어도 0%, 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 또는 20%이거나, 적어도 약 0%, 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 또는 20%이거나, 0%, 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 또는 20% 이하이거나, 또는 약 0%, 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 또는 20% 이하이거나, 또는 전술한 농도 중 임의의 둘에 의해 한정되는 범위 내의 임의의 백분율, 예를 들어 0% 내지 20%, 0.2% 내지 10%, 2% 내지 5%, 0% 내지 5%, 또는 2% 내지 20%인 농도의 FBS를 포함한다. 일부 실시양태에서, 줄기 세포 성장 배지는 이종 성분을 함유하지 않는다. 일부 실시양태에서, 성장 배지는 하나 이상의 작은 분자 화합물, 활성화제, 억제제, 또는 성장 인자를 포함한다.
일부 실시양태에서는, 완전 내배엽 세포가 풍부화된 세포 집단이 사용된다. 일부 실시양태에서, 완전 내배엽 세포는 단리되거나 또는 실질적으로 정제된다. 일부 실시양태에서, 단리된 또는 실질적으로 정제된 완전 내배엽 세포는 SOX17, FOXA2, 또는 CXRC4 표식자 중 하나 이상(예를 들어 적어도 1, 3 개)을 OCT4, AFP, TM, SPARC, 또는 SOX7 표식자 중 하나 이상(예를 들어 적어도 1, 3, 5 개)보다 더 큰 정도까지 발현한다.
세포 집단을 완전 내배엽으로 풍부화하는 방법이 또한 고려된다. 일부 실시양태에서, 완전 내배엽 세포는 세포를 완전 내배엽 세포의 표면에는 존재하지만 혼합된 세포 집단의 다른 세포의 표면에는 존재하지 않는 분자와 결합하는 시약과 접촉시킨 다음에 시약에 결합된 세포를 단리시킴으로써 혼합된 세포 집단으로부터 단리되거나 또는 실질적으로 정제될 수 있다. 일부 실시양태에서, 완전 내배엽 세포의 표면에 존재하는 세포 구성요소는 CXCR4이다.
일부 실시양태는 완전 내배엽 세포를 풍부화된, 단리된 또는 실질적으로 정제된 형태로 얻는 데 사용될 수 있는 CXCR4 항체, SDF-1 단백질 또는 리간드 또는 CXCR4를 위한 다른 단백질 또는 리간드에 관한 것이다. 예를 들어, CXCR4 항체, SDF-1 단백질 또는 리간드 또는 CXCR4를 위한 또 다른 단백질 또는 리간드는 시약과 결합하는 완전 내배엽 세포의 제조물을 풍부화하거나, 단리시키거나 또는 실질적으로 정제하는 방법, 예컨대 친화도-기반 분리 또는 자기-기반 분리에서 시약으로서 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서는, 완전 내배엽 세포 및 hESC가 하나 이상의 성장 인자로 처리된다. 그러한 성장 인자는 TGF-베타 슈퍼패밀리로부터의 성장 인자를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 성장 인자는 성장 인자의 TGF-베타 슈퍼패밀리의 Nodal/Activin 및/또는 BMP 하위군을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 성장 인자는 Nodal, Activin A, Activin B, BMP4, Wnt3a 또는 이들 성장 인자 중 임의의 성장 인자의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 액티빈-유도 완전 내배엽(DE)은 FGF/Wnt 유도 후방 내배엽 패터링(pattering), 후장 특성화 및 형태발생, 및 최종적으로 장 성장, 형태발생, 및 중간엽, 장세포, 배상세포, 파네스 및 장내분비세포를 포함하는 기능성 장 세포 유형으로의 세포분화를 촉진한 프로-장 배양 시스템을 추가로 겪을 수 있다. 일부 실시양태에서는, 사람 PSC가 시험관내에서 분비, 내분비 및 흡수 세포 유형을 포함하는 장 상피로 분화하도록 효율적으로 지향된다. 분자들 예컨대 성장 인자가 특별한 유형의 장 조직 형성을 촉진하기 위해 발생의 임의의 시기에 첨가될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
일부 실시양태에서는, FGF 및 Wnt 단백질 또는 리간드가 iPSC 또는 ESC로부터 발생된 DE를 지향성 분화를 통해 모든 주요 장 세포 유형을 효율적으로 생기게 하는 후장 상피로 전환시키기 위해 배양물에서 조기 후장 특성화를 모방하는 데 사용된다. 사람에서, DE의 지향성 분화는 장 발생에 중요한 일부 신호전달 경로의 선택적 활성화를 통해 달성된다.
시험관내에서 사람 장 발생은 태아 거트 발생; 내배엽 형성, 후방 내배엽 패터닝, 후장 형태발생, 태아 거트 발생, 상피 형태발생, 추정 전구체 도메인 형성, 및 장의 기능성 세포 유형으로의 분화와 비슷한 시기에서 일어난다. 예를 들어, 사람에서, Wnt 신호전달 단백질을 코딩하는 유전자는 Wnt1, Wnt2, Wnt2b, Wnt3, Wnt3a, Wnt4, Wnt5a, Wnt5b, Wnt6, Wnt7a, Wnt7b, Wnt8a, Wnt8b, Wnt9a, Wnt9b, Wnt10a, Wnt10b, Wnt11, 및 Wnt16을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
관련 분야의 기술을 가진 자는 하나 이상의 Wnt 신호전달 단백질의 농도, 발현 또는 기능을 변경시키는 것이 하나 이상의 FGF 단백질의 농도, 발현, 또는 기능을 변경시키는 것과 조합해서 본 발명에 따른 지향성 분화를 생기게 할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 일부 실시양태에서는, Wnt 및/또는 FGF 신호전달 경로와 관련된 세포 구성요소, 예를 들어 경로의 천연 억제제, 길항제, 활성화제, 또는 효능제가 Wnt 및/또는 FGF 신호전달 경로의 억제 또는 활성화를 초래하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서는, Wnt 및/또는 FGF 신호전달 경로와 관련된 siRNA 및/또는 shRNA 표적화 세포 구성요소가 이들 경로를 억제하거나 또는 활성화하는 데 사용된다.
섬유모세포 성장 인자(FGF)는 혈관형성, 상처 치유, 및 배아 발생에 관여하는 성장 인자의 패밀리이다. FGF는 헤파린-결합 단백질이고, 세포-표면 관련 헤파란 설페이트 프로테오글리칸과의 상호작용이 FGF 신호 형질도입에 필수적임이 밝혀졌다. FGF는 폭넓은 다양한 세포 및 조직의 증식 및 분화 과정에서 핵심 플레이어이다. 사람에서는, FGF 패밀리 중 22 개 구성원이 확인되었고, 그들 모두가 구조적으로 관련된 신호전달 분자이다. FGF1부터 FGF10까지 구성원은 모두 섬유모세포 성장 인자 수용체(FGFR)와 결합한다. FGF1은 또한 산성으로 알려져 있고, FGF2는 또한 염기성 섬유모세포 성장 인자(bFGF)로 알려져 있다. FGF 동종 인자 1-4(FHF1-FHF4)라고도 알려져 있는 구성원 FGF11, FGF12, FGF13, 및 FGF14는 FGF와 비교해서 다른 기능적 차이를 가진다는 것이 밝혀졌다. 이들 인자는 현저하게 유사한 서열 상동성을 지니지만, 그들은 FGFR과 결합하지 않고, FGF와 관련되지 않은 세포내 과정에 관여한다. 이 군은 또한 "iFGF"라고도 알려져 있다. FGF15부터 FGF23까지 구성원은 더 새롭고, 잘 특성화되지 않는다. FGF15는 사람 FGF19의 마우스 오토로그이다(따라서, 사람 FGF15가 없음). 사람 FGF20은 Xenopus FGF-20(XFGF-20)과의 그의 상동성에 기반하여 확인되었다. 다른 FGF의 국소 활성과 대조적으로, FGF15/FGF19, FGF21 및 FGF23은 더 많은 전신 효과를 가진다.
일부 실시양태에서, 관련 분야의 기술을 가진 자는 임의의 FGF가 Wnt 신호전달 경로로부터 단백질과 함께 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 일부 실시양태에서, 사용되는 FGF는 FGF1, FGF2, FGF3, FGF4, FGF4, FGF5, FGF6, FGF7, FGF8, FGF8, FGF9, FGF10, FGF11, FGF12, FGF13, FGF14, FGF15(FGF19, FGF15/FGF19), FGF16, FGF17, FGF18, FGF20, FGF21, FGF22, FGF23 중 하나 이상이다.
DE 배양물 및 그 다음에 다양한 중간 성숙 장 세포 유형으로의 PSC의 분화는 시기(stage) 특이적 세포 표식자의 존재에 의해 결정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 대표 세포 구성요소의 발현은 DE 형성을 결정하는 데 사용된다. 대표 세포 구성요소는 CMKOR1, CXCR4, GPR37, RTN4RL1, SLC5A9, SLC40A1, TRPA1, AGPAT3, APOA2, C20orf56, C21orf129, CALCR, CCL2, CER1, CMKOR1, CRIP1, CXCR4, CXorf1, DIO3, DIO30S, EB-1, EHHADH, ELOVL2, EPSTI1, FGF17, FLJ10970, FLJ21195, FLJ22471, FLJ23514, FOXA2, FOXQ1, GATA4, GPR37, GSC, LOC283537, MYL7, NPPB, NTN4, PRSS2, RTN4RL1, SEMA3E, SIAT8D, SLC5A9, SLC40A1, SOX17, SPOCK3, 또는 AW772192, 또는 그의 임의의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 세포 구성요소, 예컨대 전장 표식자 Pdx1 및 알부민의 부재는 지향성 후장 형성을 밝히는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서는, 하나 이상(예를 들어 적어도 1, 3 개)의 장 전사 인자 CDX2, KLF5 또는 SOX9가 장 발생을 나타내는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서는, GATA4 또는 GATA6 단백질 발현 중 하나 이상이 장 발생을 나타내는 데 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서는, 형태학적 변화가 지향성 분화의 진행을 나타내는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 스페로이드(예를 들어, 중-후장, 후장, 전방 전장, 또는 후방 전장 스페로이드)는 성숙화를 위한 3차원 배양 조건 하에 놓인다. 일부 실시양태에서, 위장 오가노이드는 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 또는 60일이거나, 약 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 또는 60일이거나, 적어도 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 또는 60일이거나, 적어도 약 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 또는 60일이거나, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 또는 60일 이하이거나, 또는 약 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 또는 60일 이하이거나, 또는 전술한 일 수 중 임의의 둘에 의해 한정되는 범위 내의 임의의 일 수, 예를 들어 6 내지 60일, 20 내지 50일, 30 내지 40일, 6 내지 50일, 또는 30 내지 60일의 일 수 내에 성숙한다. 일부 실시양태에서는, 중간엽 세포에 의해 둘러싸인 고도의 곱슬 상피가 스페로이드 형성 후에 관찰될 수 있다. 일부 실시양태에서는, 위장 오가노이드, 분극 원주 상피, 배상세포, 또는 평활근 세포가 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 또는 60일이거나, 약 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 또는 60일이거나, 적어도 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 또는 60일이거나, 적어도 약 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 또는 60일이거나, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 또는 60일 이하이거나, 또는 약 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 또는 60일 이하이거나, 또는 전술한 일 수 중 임의의 둘에 의해 한정되는 범위 내의 임의의 일 수, 예를 들어, 6 내지 60일, 20 내지 50일, 30 내지 40일, 6 내지 50일, 또는 30 내지 60일의 일 수 내에 관찰될 수 있다.
일부 실시양태에서, 만능 줄기 세포는 "1 단계" 과정을 통해 장 세포 유형으로 전환된다. 예를 들어, 만능 줄기 세포를 DE 배양물로 분화할 수 있는 하나 이상의 분자(예를 들어, Activin A)가 DE 배양물의 지향성 분화를 촉진할 수 있는 추가의 분자(예를 들어 Wnt3a 및 FGF4)와 조합되어 만능 줄기 세포를 직접적으로 처리한다.
일부 실시양태에서, 만능 줄기 세포는 체세포로부터 제조된다. 일부 실시양태에서, 만능 줄기 세포는 생검으로부터 얻은 생물학적 조직으로부터 제조된다. 일부 실시양태에서, 만능 줄기 세포는 PBMC로부터 제조된다. 일부 실시양태에서, 사람 PSC는 사람 PBMC로부터 제조된다. 일부 실시양태에서, 만능 줄기 세포는 동결보존된 PBMC로부터 제조된다. 일부 실시양태에서, PBMC는 피더 세포 기질에서 성장한다. 일부 실시양태에서, PBMC는 마우스 배아 섬유모세포(MEF) 피더 세포 기질에서 성장한다. 일부 실시양태에서, PBMC는 조사된 MEF 피더 세포 기질에서 성장한다. 일부 실시양태에서, PBMC는 0.1% 젤라틴에서 성장한다.
일부 실시양태에서, 만능 줄기 세포는 바이러스 형질도입에 의해 PBMC로부터 제조된다. 일부 실시양태에서, PBMC는 센다이 바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 또는 아데노-관련 바이러스, 또는 그의 임의의 조합으로 형질도입된다. 일부 실시양태에서, PBMC는 Oct3/4, Sox2, Klf4, 또는 L-Myc, 또는 그의 임의의 조합을 위한 발현 벡터를 포함하는 센다이 바이러스로 형질도입된다. 일부 실시양태에서, PBMC는 0, 0.1, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 또는 5.0 MOI, 약 0, 0.1, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 또는 5.0 MOI이거나, 적어도 0, 0.1, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 또는 5.0 MOI이거나, 적어도 약 0, 0.1, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 또는 5.0 MOI이거나, 0, 0.1, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 또는 5.0 MOI 이하이거나, 또는 약 0, 0.1, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 또는 5.0 MOI 이하이거나, 또는 전술한 MOI 중 임의의 둘에 의해 한정되는 범위 내의 임의의 MOI, 예를 들어 0 내지 5.0, 1.0 내지 4.0, 2.0 내지 3.0, 0 내지 3.0, 또는 1.0 내지 5.0인 MOI에서 하나 이상의 바이러스로 형질도입된다. 일부 실시양태에서, 형질도입 후, PBMC는 줄기 세포 리프로그래밍 인자를 발현한다. 일부 실시양태에서, 형질도입 후, PBMC는 iPSC로 리프로그래밍된다. 일부 실시양태에서, iPSC 는 피더 세포 기질에서 성장한다. 일부 실시양태에서, iPSC는 MEF 피더 세포 기질에서 성장한다. 일부 실시양태에서, iPSC는 조사된 MEF 피더 세포 기질에서 성장한다. 일부 실시양태에서, iPSC는 0.1% 젤라틴에서 성장한다. 일부 실시양태에서, iPSC는 RPMI 1640, DMEM, DMEM/F12, Erythroid Expansion Media, Minigut 배지, StemPro 34 SFM(무혈청 배지), StemPro hESC SFM, mTeSR 1, 또는 mTeSR Plus 배지에서 성장한다.
일부 실시양태에서, 리프로그래밍된 iPSC는 세포 배양물에서 팽창된다. 일부 실시양태에서, iPSC는 Matrigel에서 팽창된다. 일부 실시양태에서, iPSC는 ROCK 억제제(예를 들어 Y-27632)를 포함하는 세포 배양 배지에서 팽창된다. 일부 실시양태에서, iPSC는 80-95% 컨플루언스(confluence)까지 팽창된다. 일부 실시양태에서, iPSC는 완전 내배엽 세포로 분화된다. 일부 실시양태에서, iPSC는 iPSC를 Activin A와 접촉시킴으로써 완전 내배엽 세포로 분화된다. 일부 실시양태에서, iPSC는 추가로 BMP4와 접촉한다. 일부 실시양태에서, iPSC는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15 ng/mL이거나, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15 ng/mL이거나, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15 ng/mL이거나, 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15 ng/mL이거나, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15 ng/mL 이하이거나, 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15 ng/mL 이하의 BMP4인 농도의 BMP4와 접촉한다.
일부 실시양태에서, 완전 내배엽 세포는 중-후장 스페로이드로 분화된다. 일부 실시양태에서, 완전 내배엽 세포는 완전 내배엽 세포를 GSK3 억제제 또는 FGF4 중 하나 이상(예를 들어 적어도 1 또는 2개)과 접촉시킴으로써 중-후장 스페로이드로 분화된다. 일부 실시양태에서, GSK3 억제제는 CHIR99021이다. 일부 실시양태에서, FGF4는 재조합 FGF4이다. 일부 실시양태에서, 완전 내배엽 세포는 완전 내배엽 세포를 GSK3 억제제 또는 FGF4 중 하나 이상(예를 들어 적어도 1 또는 2개)과 접촉시키지 않고서 중-후장 스페로이드로 분화된다. 일부 실시양태에서, 완전 내배엽 세포는 완전 내배엽을 CHIR99021 또는 FGF4, 또는 둘 모두와 접촉시키지 않고서 중-후장 스페로이드로 분화된다. 일부 실시양태에서, 완전 내배엽 세포는 완전 내배엽 세포를 상피 성장 인자(EGF)와 접촉시킴으로써 중-후장 스페로이드로 분화된다.
일부 실시양태에서, 중-후장 스페로이드는 기저막 또는 기저막 모방체에 포매된다. 일부 실시양태에서, 중-후장 스페로이드는 Matrigel에 포매된다. 일부 실시양태에서, 중-후장 스페로이드는 기초 거트 배지에서 배양된다. 일부 실시양태에서, 중-후장 스페로이드는 기초 거트 배지에서 배양되어 중-후장 스페로이드를 장 오가노이드로 분화시킨다. 일부 실시양태에서, 기초 거트 배지는 Advanced DMEM-F12, N2 보충물, 비타민 A가 없는 B27 보충물, HEPES, L-글루타민, 페니실린-스트렙토마이신, 또는 상피 성장 인자(EGF), 또는 그의 임의의 조합 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 기초 거트 배지는 EGF를 포함한다. 일부 실시양태에서, 중-후장 스페로이드는 기공을 통해 여과된다. 일부 실시양태에서, 중-후장 스페로이드는 70 μm 기공 크기를 통해 여과된다. 일부 실시양태에서, 중-후장 스페로이드는 70 μm보다 작은 스페로이드 및 70 μm보다 큰 스페로이드로 분리된다. 일부 실시양태에서는, 70 μm보다 큰 스페로이드가 본원에서 기술된 방법에 사용된다.
일부 실시양태에서, 완전 내배엽 세포는 스페로이드로 분화된다. 일부 실시양태에서, 완전 내배엽 세포는 완전 내배엽 세포를 GSK3 억제제, FGF4, BMP 억제제, 또는 레틴산(RA) 중 하나 이상(예를 들어 적어도 1, 2, 3, 4 개)과 접촉시킴으로써 스페로이드로 분화된다. 일부 실시양태에서, GSK3 억제제는 CHIR99021이다. 일부 실시양태에서, FGF4는 재조합 FGF4이다. 일부 실시양태에서, BMP 억제제는 Noggin이다. 일부 실시양태에서, 완전 내배엽 세포는 완전 내배엽 세포를 GSK3 억제제, FGF4, BMP 억제제, 또는 RA, 또는 그의 임의의 조합 중 하나 이상(예를 들어 적어도 1, 2, 3, 4 개)과 접촉시키지 않고서 스페로이드로 분화된다. 일부 실시양태에서, 완전 내배엽 세포는 완전 내배엽을 CHIR99021, FGF4, Noggin, 또는 RA, 또는 그의 임의의 조합과 접촉시키지 않고서 스페로이드로 분화된다. 일부 실시양태에서, 완전 내배엽 세포는 완전 내배엽 세포를 상피 성장 인자(EGF)와 접촉시킴으로써 스페로이드로 분화된다.
일부 실시양태에서, 스페로이드는 기저막 또는 기저막 모방체에 포매된다. 일부 실시양태에서, 스페로이드는 Matrigel에 포매된다. 일부 실시양태에서, 스페로이드는 성장 배지에서 배양되어 스페로이드를 오가노이드로 분화시킨다. 일부 실시양태에서, 스페로이드는 기공을 통해 여과된다. 일부 실시양태에서, 스페로이드는 70 μm 기공 크기를 통해 여과된다. 일부 실시양태에서, 스페로이드는 70 μm보다 작은 스페로이드 및 70 μm보다 큰 스페로이드로 분리된다. 일부 실시양태에서는, 70 μm보다 큰 스페로이드가 본원에서 기술된 방법에 사용된다.
비형상화된 오가노이드
일부 실시양태에서, 위장 오가노이드는 식도 오가노이드, 위 오가노이드, 위기저부 오가노이드, 위 전정부 오가노이드, 소장 (장) 오가노이드, 또는 대장 (결장) 오가노이드이다. 일부 실시양태에서, 위장 오가노이드는 장 오가노이드이다. 일부 실시양태에서, 위장 오가노이드는 사람 장 오가노이드(HIO)이다. 일부 실시양태에서, 위장 오가노이드는 본원에 개시된 방법들 중 임의의 방법에 의해 형성되지 않는다. 일부 실시양태에서, 위장 오가노이드는 분극된 원주 상피를 포함하는 일반적으로 구형 3 차원 구조를 포함한다. 일부 실시양태에서, 분극된 원주 상피는 중간엽에 의해 둘러싸인다. 일부 실시양태에서, 중간엽은 평활근 유사 층을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상피는 음와 유사 증식대 및 융모 유사 구조를 포함한다. 일부 실시양태에서, 중간엽은 적층된 종주근 및 윤주근을 포함한다. 일부 실시양태에서, 위장 오가노이드는 위장 장기의 주요 기능성 세포 유형 전부를 갖는 고유판을 포함한다. 일부 실시양태에서, 일반적으로 구형 위장 오가노이드는 층상화 중간엽을 포함한다.
형상화된 오가노이드 및 그의 제조 방법
일부 실시양태에서, 위장 오가노이드는 형상화된 위장 오가노이드이다. 일부 실시양태에서, 위장 오가노이드는 형상화된 식도 오가노이드, 형상화된 위 오가노이드, 형상화된 위 기저부 오가노이드, 형상화된 위 전정부 오가노이드, 형상화된 소장 (장) 오가노이드, 또는 형상화된 대장 (결장) 오가노이드, 또는 그의 임의의 조합이다. 일부 실시양태에서, 위장 오가노이드는 장 오가노이드이다. 일부 실시양태에서, 형상화된 위장 오가노이드는 HIO이다. 일부 실시양태에서, 형상화된 위장 오가노이드는 분극된 원주 상피를 포함하는 일반적으로 관형 3 차원 구조를 포함한다. 일부 실시양태에서, 분극된 원주 상피는 중간엽에 의해 둘러싸인다. 일부 실시양태에서, 중간엽은 평활근 유사 층을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상피는 음와 유사 증식대 및 융모 유사 구조를 포함한다. 일부 실시양태에서, 중간엽은 적층된 종주근 및 윤주근을 포함한다. 일부 실시양태에서, 형상화된 위장 오가노이드는 위장 장기의 주요 기능성 세포 유형 전부를 갖는 고유판을 포함한다. 일부 실시양태에서, 형상화된 위장 오가노이드는 층상화된 중간엽을 포함한다.
일부 실시양태에서, 형상화된 위장 오가노이드는 길쭉한 위장 오가노이드이다. 일부 실시양태에서, 위장 오가노이드는 길쭉한 구조로 형성된다. 일부 실시양태에서, 위장 오가노이드는 본원에서 기술된 형성 트레이 실시양태 중 하나를 사용하여 길쭉한 구조로 형성된다. 일부 실시양태에서, 형상화된 위장 오가노이드는 곧은 또는 본질적으로 곧은 형상을 가진다. 일부 실시양태에서, 형상화된 위장 오가노이드는 적어도 하나의 치수가 곧은 또는 본질적으로 곧은 형상을 가진다. 일부 실시양태에서, 형상화된 위장 오가노이드는 모든 치수가 곧은 또는 본질적으로 곧은 형상을 가진다. 일부 실시양태에서, 형상화된 위장 오가노이드는 장방형, 입방형, 원통형, 원뿔형, 또는 각뿔형 형상을 가진다. 일부 실시양태에서, 형상화된 위장 오가노이드는 굽은 또는 본질적으로 굽은 형상을 가진다. 일부 실시양태에서, 형상화된 위장 오가노이드는 적어도 하나의 치수가 굽은 또는 본질적으로 굽은 형상을 가진다. 일부 실시양태에서, 형상화된 위장 오가노이드는 모든 치수가 굽은 또는 본질적으로 굽은 형상을 가진다. 일부 실시양태에서, 형상화된 위장 오가노이드는 구형 형상을 가진다. 일부 실시양태에서, 형상화된 위장 오가노이드는 비구형 형상을 가진다. 일부 실시양태에서, 형상화된 위장 오가노이드는 적어도 하나의 굽은 표면을 가지지만 그 밖에는 곧은 형상을 가진다. 일부 실시양태에서, 형상화된 위장 오가노이드는 굽은 장방형, 굽은 입방형, 굽은 원통형, 굽은 원뿔형, 굽은 각뿔형, 포물선형, 포물면형, 쌍곡선형, 쌍곡면형, 타원체형, 소용돌이형, 나선형, 사인파형(sine wave) 시누소이달(sinusoidal), 사문형(serpentine), 방형파형, 삼각파형, 톱니파형, 방추형, 수지형, 분지형, 또는 방사상 형상, 또는 그의 임의의 조합을 가진다. 일부 실시양태에서, 본원에서 개시된 바와 같이 제조된 스페로이드(예를 들어 중-후장 스페로이드)는 형성 트레이의 수집 채널의 그루브(groove) 안에 파종된다. 일부 실시양태에서, 스페로이드는 수집 채널 안에 수집 채널 당 100, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 또는 10000 개 스페로이드, 약 100, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 또는 10000개 스페로이드이거나, 적어도 100, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 또는 10000개 스페로이드이거나, 적어도 약 100, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 또는 10000개 스페로이드이거나, 100, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 또는 10000개 이하 스페로이드이거나, 또는 약 100, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 또는 10000개 이하 스페로이드이거나, 또는 전술한 숫자 중 임의의 둘에 의해 한정되는 범위 내의 임의의 수의 스페로이드, 예를 들어 100 내지 10000개 스페로이드, 2000 내지 8000개 스페로이드, 3000 내지 4000개 스페로이드, 100 내지 4000개 스페로이드, 또는 3000 내지 10000개 스페로이드인 스페로이드 수로 파종된다. 일부 실시양태에서, 스페로이드는 수집 채널에 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 또는 2000개 스페로이드/mm3이거나, 약 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 또는 2000개 스페로이드/mm3이거나, 적어도 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 또는 2000개 스페로이드/mm3이거나, 적어도 약 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 또는 2000개 스페로이드/mm3이거나, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 또는 2000개 이하 스페로이드/mm3이거나, 또는 약 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 또는 2000개 이하 스페로이드/mm3이거나, 또는 전술한 밀도 중 임의의 둘에 의해 한정되는 범위 내의 임의의 밀도, 예를 들어 100 내지 2000개 스페로이드/mm3, 500 내지 1500개 스페로이드/mm3, 100 내지 1000개 스페로이드/mm3, 또는 1000 내지 2000개 스페로이드/mm3인 밀도로 파종된다. 일부 실시양태에서, 형성 트레이의 수집 채널에서 또는 Tissue Train Culture Plate에서, 또는 둘 모두에서 스페로이드는 Minigut 배지에서 배양되고, Minigut 배지는 Advanced DMEM-F12, 글루타민, HEPES, 페니실린, 스트렙토마이신, N2 보충물, B27 보충물 또는 EGF, 또는 그의 임의의 조합 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, Minigut 배지는 EGF를 포함한다. 일부 실시양태에서, EGF는 재조합 EGF이다. 일부 실시양태에서, 형성 트레이의 수집 채널에서 또는 Tissue Train Culture Plate에서, 또는 둘 모두에서 스페로이드는 Matrigel에서 배양된다. 일부 실시양태에서, 형성 트레이의 수집 채널에서 또는 Tissue Train Culture Plate에서, 또는 둘 모두에서 스페로이드는 Matrigel 및 Minigut 배지의 50% 혼합물에서 배양된다. 일부 실시양태에서, 스페로이드는 수집 채널에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10일이거나, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10일이거나, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10일, 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10일이거나, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10일 이하이거나, 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10일 이하이거나, 또는 전술한 값들 중 임의의 둘의 범위, 예를 들어 1-10 일, 3-7 일, 1-5 일, 4-10 일, 6-9 일, 또는 7-10 일인 일 수 동안 성장한다. 선택되는 스페로이드의 유형은 요망되는 오가노이드에 의해 결정되고, 예를 들어, 장 오가노이드 제조를 위해서는 중-후장 스페로이드, 결장 오가노이드 제조를 위해서는 후장 스페로이드, 식도 오가노이드 제조를 위해서는 전방 전장 스페로이드, 또는 위 오가노이드 제조를 위해서는 후방 전장 스페로이드이다. 일부 실시양태에서, 스페로이드는 중-후장 스페로이드이다. 일부 실시양태에서, 스페로이드는 후장 스페로이드이다. 일부 실시양태에서, 스페로이드는 전장 스페로이드이다. 일부 실시양태에서, 스페로이드는 전방 전장 스페로이드이다. 일부 실시양태에서, 스페로이드는 후방 전장 스페로이드이다.
일부 실시양태에서, 형상화된 위장 오가노이드는 길쭉한 위장 오가노이드이다. 일부 실시양태에서, 길쭉한 위장 오가노이드는 기다란 길이, 폭, 깊이, 또는 직경, 또는 그의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 기다란 길이는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50 밀리미터이거나, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50 밀리미터이거나, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50 밀리미터이거나, 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50 밀리미터이거나, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50 밀리미터 이하이거나, 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50 밀리미터 이하이거나, 또는 전술한 길이 중 임의의 둘에 의해 한정되는 범위 내의 임의의 길이, 예를 들어, 1 내지 50 mm, 10 내지 40 mm, 20 내지 30 mm, 1 내지 30 mm, 또는 20 내지 50 mm이다. 일부 실시양태에서, 폭은 0.2 μm, 1 μm, 5 μm, 10 μm, 50 μm, 100 μm, 200 μm, 300 μm, 400 μm, 500 μm, 600 μm, 700 μm, 800 μm, 900 μm, 1000 μm, 1200 μm, 1300 μm, 1400 μm, 1500 μm, 1600 μm, 1700 μm, 1800 μm, 1900 μm, 2000 μm, 2500 μm, 또는 3000 μm, 약 0.2 μm, 1 μm, 5 μm, 10 μm, 50 μm, 100 μm, 200 μm, 300 μm, 400 μm, 500 μm, 600 μm, 700 μm, 800 μm, 900 μm, 1000 μm, 1200 μm, 1300 μm, 1400 μm, 1500 μm, 1600 μm, 1700 μm, 1800 μm, 1900 μm, 2000 μm, 2500 μm, 또는 3000 μm, 적어도 0.2 μm, 1 μm, 5 μm, 10 μm, 50 μm, 100 μm, 200 μm, 300 μm, 400 μm, 500 μm, 600 μm, 700 μm, 800 μm, 900 μm, 1000 μm, 1200 μm, 1300 μm, 1400 μm, 1500 μm, 1600 μm, 1700 μm, 1800 μm, 1900 μm, 2000 μm, 2500 μm, 또는 3000 μm, 적어도 약 0.2 μm, 1 μm, 5 μm, 10 μm, 50 μm, 100 μm, 200 μm, 300 μm, 400 μm, 500 μm, 600 μm, 700 μm, 800 μm, 900 μm, 1000 μm, 1200 μm, 1300 μm, 1400 μm, 1500 μm, 1600 μm, 1700 μm, 1800 μm, 1900 μm, 2000 μm, 2500 μm, 또는 3000 μm, 0.2 μm, 1 μm, 5 μm, 10 μm, 50 μm, 100 μm, 200 μm, 300 μm, 400 μm, 500 μm, 600 μm, 700 μm, 800 μm, 900 μm, 1000 μm, 1200 μm, 1300 μm, 1400 μm, 1500 μm, 1600 μm, 1700 μm, 1800 μm, 1900 μm, 2000 μm, 2500 μm, 또는 3000 μm 이하, 또는 약 0.2 μm, 1 μm, 5 μm, 10 μm, 50 μm, 100 μm, 200 μm, 300 μm, 400 μm, 500 μm, 600 μm, 700 μm, 800 μm, 900 μm, 1000 μm, 1200 μm, 1300 μm, 1400 μm, 1500 μm, 1600 μm, 1700 μm, 1800 μm, 1900 μm, 2000 μm, 2500 μm, 또는 3000 μm 이하, 또는 전술한 폭 중 임의의 둘에 의해 한정되는 범위 내의 임의의 폭, 예를 들어, 0.2 μm 내지 3000 μm, 200 μm 내지 1500 μm, 500 μm 내지 1000 μm, 0.2 μm 내지 1000 μm, 또는 500 μm 내지 3000 μm이다. 일부 실시양태에서, 깊이는 0.2 μm, 1 μm, 5 μm, 10 μm, 50 μm, 100 μm, 200 μm, 300 μm, 400 μm, 500 μm, 600 μm, 700 μm, 800 μm, 900 μm, 1000 μm, 1200 μm, 1300 μm, 1400 μm, 1500 μm, 1600 μm, 1700 μm, 1800 μm, 1900 μm, 2000 μm, 2500 μm, 또는 3000 μm, 약 0.2 μm, 1 μm, 5 μm, 10 μm, 50 μm, 100 μm, 200 μm, 300 μm, 400 μm, 500 μm, 600 μm, 700 μm, 800 μm, 900 μm, 1000 μm, 1200 μm, 1300 μm, 1400 μm, 1500 μm, 1600 μm, 1700 μm, 1800 μm, 1900 μm, 2000 μm, 2500 μm, 또는 3000 μm, 적어도 0.2 μm, 1 μm, 5 μm, 10 μm, 50 μm, 100 μm, 200 μm, 300 μm, 400 μm, 500 μm, 600 μm, 700 μm, 800 μm, 900 μm, 1000 μm, 1200 μm, 1300 μm, 1400 μm, 1500 μm, 1600 μm, 1700 μm, 1800 μm, 1900 μm, 2000 μm, 2500 μm, 또는 3000 μm, 적어도 약 0.2 μm, 1 μm, 5 μm, 10 μm, 50 μm, 100 μm, 200 μm, 300 μm, 400 μm, 500 μm, 600 μm, 700 μm, 800 μm, 900 μm, 1000 μm, 1200 μm, 1300 μm, 1400 μm, 1500 μm, 1600 μm, 1700 μm, 1800 μm, 1900 μm, 2000 μm, 2500 μm, 또는 3000 μm, 0.2 μm, 1 μm, 5 μm, 10 μm, 50 μm, 100 μm, 200 μm, 300 μm, 400 μm, 500 μm, 600 μm, 700 μm, 800 μm, 900 μm, 1000 μm, 1200 μm, 1300 μm, 1400 μm, 1500 μm, 1600 μm, 1700 μm, 1800 μm, 1900 μm, 2000 μm, 2500 μm, 또는 3000 μm 이하, 또는 약 0.2 μm, 1 μm, 5 μm, 10 μm, 50 μm, 100 μm, 200 μm, 300 μm, 400 μm, 500 μm, 600 μm, 700 μm, 800 μm, 900 μm, 1000 μm, 1200 μm, 1300 μm, 1400 μm, 1500 μm, 1600 μm, 1700 μm, 1800 μm, 1900 μm, 2000 μm, 2500 μm, 또는 3000 μm 이하, 또는 전술한 깊이 중 임의의 둘에 의해 한정되는 범위 내의 임의의 깊이, 예를 들어 0.2 μm 내지 3000 μm, 200 μm 내지 1500 μm, 500 μm 내지 1000 μm, 0.2 μm 내지 1000 μm, 또는 500 μm 내지 3000 μm이다. 일부 실시양태에서, 직경은 0.2 μm, 1 μm, 5 μm, 10 μm, 50 μm, 100 μm, 200 μm, 300 μm, 400 μm, 500 μm, 600 μm, 700 μm, 800 μm, 900 μm, 1000 μm, 1200 μm, 1300 μm, 1400 μm, 1500 μm, 1600 μm, 1700 μm, 1800 μm, 1900 μm, 2000 μm, 2500 μm, 또는 3000 μm, 약 0.2 μm, 1 μm, 5 μm, 10 μm, 50 μm, 100 μm, 200 μm, 300 μm, 400 μm, 500 μm, 600 μm, 700 μm, 800 μm, 900 μm, 1000 μm, 1200 μm, 1300 μm, 1400 μm, 1500 μm, 1600 μm, 1700 μm, 1800 μm, 1900 μm, 2000 μm, 2500 μm, 또는 3000 μm, 적어도 0.2 μm, 1 μm, 5 μm, 10 μm, 50 μm, 100 μm, 200 μm, 300 μm, 400 μm, 500 μm, 600 μm, 700 μm, 800 μm, 900 μm, 1000 μm, 1200 μm, 1300 μm, 1400 μm, 1500 μm, 1600 μm, 1700 μm, 1800 μm, 1900 μm, 2000 μm, 2500 μm, 또는 3000 μm, 적어도 약 0.2 μm, 1 μm, 5 μm, 10 μm, 50 μm, 100 μm, 200 μm, 300 μm, 400 μm, 500 μm, 600 μm, 700 μm, 800 μm, 900 μm, 1000 μm, 1200 μm, 1300 μm, 1400 μm, 1500 μm, 1600 μm, 1700 μm, 1800 μm, 1900 μm, 2000 μm, 2500 μm, 또는 3000 μm, 0.2 μm, 1 μm, 5 μm, 10 μm, 50 μm, 100 μm, 200 μm, 300 μm, 400 μm, 500 μm, 600 μm, 700 μm, 800 μm, 900 μm, 1000 μm, 1200 μm, 1300 μm, 1400 μm, 1500 μm, 1600 μm, 1700 μm, 1800 μm, 1900 μm, 2000 μm, 2500 μm, 또는 3000 μm 이하, 또는 약 0.2 μm, 1 μm, 5 μm, 10 μm, 50 μm, 100 μm, 200 μm, 300 μm, 400 μm, 500 μm, 600 μm, 700 μm, 800 μm, 900 μm, 1000 μm, 1200 μm, 1300 μm, 1400 μm, 1500 μm, 1600 μm, 1700 μm, 1800 μm, 1900 μm, 2000 μm, 2500 μm, 또는 3000 μm 이하, 또는 전술한 직경 중 임의의 둘에 의해 한정되는 범위 내의 임의의 직경, 예를 들어 0.2 μm 내지 3000 μm, 200 μm 내지 1500 μm, 500 μm 내지 1000 μm, 0.2 μm 내지 1000 μm, 또는 500 μm 내지 3000 μm이다. 일부 실시양태에서, 폭, 깊이, 또는 직경, 또는 그의 임의의 조합 중 하나 이상에 대한 기다란 길이의 비는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 20000, 30000, 40000, 500000, 60000, 70000, 80000, 90000, 100000, 200000, 300000, 400000, 또는 500000, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 20000, 30000, 40000, 500000, 60000, 70000, 80000, 90000, 100000, 200000, 300000, 400000, 또는 500000, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 20000, 30000, 40000, 500000, 60000, 70000, 80000, 90000, 100000, 200000, 300000, 400000, 또는 500000, 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 20000, 30000, 40000, 500000, 60000, 70000, 80000, 90000, 100000, 200000, 300000, 400000, 또는 500000, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 20000, 30000, 40000, 500000, 60000, 70000, 80000, 90000, 100000, 200000, 300000, 400000, 또는 500000 이하, 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 20000, 30000, 40000, 500000, 60000, 70000, 80000, 90000, 100000, 200000, 300000, 400000, 또는 500000 이하, 또는 전술한 비 중 임의의 둘에 의해 한정되는 범위 내의 임의의 비, 예를 들어 1 내지 500000, 100 내지 500000, 1000 내지 10000, 1 내지 500000, 또는 1000 내지 500000이다. 일부 실시양태에서, 길쭉한 위장 오가노이드의 부피는 100 μm3, 200 μm3, 300 μm3, 400 μm3, 500 μm3, 600 μm3, 700 μm3, 800 μm3, 900 μm3, 1000 μm3, 10000 μm3, 100000 μm3, 1000000 μm3, 또는 0.01 mm3, 0.1 mm3, 1 mm3, 2 mm3, 3 mm3, 4 mm3, 5 mm3, 6 mm3, 7 mm3, 8 mm3, 9 mm3, 10 mm3, 100 mm3, 1000 mm3, 1500 mm3, 또는 2000 mm3, 약 100 μm3, 200 μm3, 300 μm3, 400 μm3, 500 μm3, 600 μm3, 700 μm3, 800 μm3, 900 μm3, 1000 μm3, 10000 μm3, 100000 μm3, 1000000 μm3, 또는 0.01 mm3, 0.1 mm3, 1 mm3, 2 mm3, 3 mm3, 4 mm3, 5 mm3, 6 mm3, 7 mm3, 8 mm3, 9 mm3, 10 mm3, 100 mm3, 1000 mm3, 1500 mm3, 또는 2000 mm3, 적어도 100 μm3, 200 μm3, 300 μm3, 400 μm3, 500 μm3, 600 μm3, 700 μm3, 800 μm3, 900 μm3, 1000 μm3, 10000 μm3, 100000 μm3, 1000000 μm3, 또는 0.01 mm3, 0.1 mm3, 1 mm3, 2 mm3, 3 mm3, 4 mm3, 5 mm3, 6 mm3, 7 mm3, 8 mm3, 9 mm3, 10 mm3, 100 mm3, 1000 mm3, 1500 mm3, 또는 2000 mm3, 적어도 약 100 μm3, 200 μm3, 300 μm3, 400 μm3, 500 μm3, 600 μm3, 700 μm3, 800 μm3, 900 μm3, 1000 μm3, 10000 μm3, 100000 μm3, 1000000 μm3, 또는 0.01 mm3, 0.1 mm3, 1 mm3, 2 mm3, 3 mm3, 4 mm3, 5 mm3, 6 mm3, 7 mm3, 8 mm3, 9 mm3, 10 mm3, 100 mm3, 1000 mm3, 1500 mm3, 또는 2000 mm3, 100 μm3, 200 μm3, 300 μm3, 400 μm3, 500 μm3, 600 μm3, 700 μm3, 800 μm3, 900 μm3, 1000 μm3, 10000 μm3, 100000 μm3, 1000000 μm3, 또는 0.01 mm3, 0.1 mm3, 1 mm3, 2 mm3, 3 mm3, 4 mm3, 5 mm3, 6 mm3, 7 mm3, 8 mm3, 9 mm3, 10 mm3, 100 mm3, 1000 mm3, 1500 mm3, 또는 2000 mm3 이하, 또는 약 100 μm3, 200 μm3, 300 μm3, 400 μm3, 500 μm3, 600 μm3, 700 μm3, 800 μm3, 900 μm3, 1000 μm3, 10000 μm3, 100000 μm3, 1000000 μm3, 또는 0.01 mm3, 0.1 mm3, 1 mm3, 2 mm3, 3 mm3, 4 mm3, 5 mm3, 6 mm3, 7 mm3, 8 mm3, 9 mm3, 10 mm3, 100 mm3, 1000 mm3, 1500 mm3, 또는 2000 mm3 이하, 또는 전술한 부피 중 임의의 둘에 의해 한정되는 범위 내의 임의의 부피, 예를 들어, 100 μm3 내지 2000 mm3, 1000 μm3 내지 1000 mm3, 0.1 mm3 내지 5 mm3, 100 μm3 내지 1 mm3, 또는 1 mm3 내지 2000 mm3이다. 일부 실시양태에서, 길쭉한 위장 스페로이드는 100, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 또는 10000 개 스페로이드, 약 100, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 또는 10000 개 스페로이드, 적어도 100, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 또는 10000 개 스페로이드, 적어도 약 100, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 또는 10000 개 스페로이드, 100, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 또는 10000 개 이하 스페로이드, 또는 약 100, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 또는 10000 개 이하 스페로이드, 또는 전술한 숫자 중 임의의 둘에 의해 한정되는 범위 내의 임의의 수의 스페로이드, 예를 들어, 100 내지 10000 개 스페로이드, 2000 내지 8000 개 스페로이드, 3000 내지 4000 개 스페로이드, 100 내지 4000 개 스페로이드, 또는 3000 내지 10000 개 스페로이드인 스페로이드 수에 의해 구성되거나 또는 그로부터 형성된다. 일부 실시양태에서, 길쭉한 위장 스페로이드는 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 또는 2000 개 스페로이드/mm3, 약 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 또는 2000 개 스페로이드/mm3, 적어도 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 또는 2000 개 스페로이드/mm3, 적어도 약 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 또는 2000 개 스페로이드/mm3, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 또는 2000 개 이하 스페로이드/mm3, 또는 약 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 또는 2000 개 이하 스페로이드/mm3, 또는 전술한 밀도 중 임의의 둘에 의해 한정되는 범위 내의 임의의 밀도, 예를 들어 100 내지 2000 개 스페로이드/mm3, 500 내지 1500 개 스페로이드/mm3, 100 내지 1000 개 스페로이드/mm3, 또는 1000 내지 2000 개 스페로이드/mm3인 밀도로 모인 스페로이드에 의해 구성되거나 또는 그로부터 형성된다. 이전에 언급한 바와 같이, 선택된 스페로이드의 유형은 요망되는 오가노이드에 의해 결정되고, 예를 들어 장 오가노이드 제조를 위해서는 중-후장 스페로이드, 결장 오가노이드 제조를 위해서는 후장 스페로이드, 식도 오가노이드 제조를 위해서는 전방 전장 스페로이드, 또는 위 오가노이드 제조를 위해서는 후방 전장 스페로이드이다. 일부 실시양태에서, 스페로이드는 중-후장 스페로이드이다. 일부 실시양태에서, 스페로이드는 후장 스페로이드이다. 일부 실시양태에서, 스페로이드는 전장 스페로이드이다. 일부 실시양태에서, 스페로이드는 전방 전장 스페로이드이다. 일부 실시양태에서, 스페로이드는 후방 전장 스페로이드이다.
일부 실시양태에서, 스페로이드는 수집 채널에서 형성되는 동안에 장력을 받는다. 일부 실시양태에서, 스페로이드는 수집 채널에서 형성된 후에 장력을 받는다. 일부 실시양태에서, 수집 채널에서 형성된 스페로이드는 아래에서 더 상세히 기술되는 바와 같은 Tissue Train Culture Plate에서 성장한다. 일부 실시양태에서, Tissue Train Culture Plate는 나일론 메쉬 탭(tab) 및 형상가변 고무막을 포함한다. 일부 실시양태에서, 형상화된 형태의 스페로이드는 나일론 메쉬 탭 사이에 정렬되고, 나일론 메쉬 탭에 앵커링된다. 일부 실시양태에서, 형상가변 고무막은 형성된 스페로이드에 기계적 부하를 부여한다. 일부 실시양태에서, 형상가변 고무막은 형성된 스페로이드에 일축 변형률을 부여한다. 일부 실시양태에서, 형상가변 고무막은 0%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 또는 20% 신장, 약 0%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 또는 20% 신장, 적어도 0%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 또는 20% 신장, 적어도 약 0%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 또는 20% 신장, 0%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 또는 20% 이하 신장, 또는 약 0%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 또는 20% 이하 신장, 또는 전술한 백분율 중 임의의 둘에 의해 한정되는 범위 내의 임의의 백분율, 예를 들어, 0% 내지 20%, 5% 내지 15%, 8% 내지 12%, 0% 내지 10%, 또는 10% 내지 20%인 퍼센트 신장을 유도하는 일축 변형률을 부여한다. 일부 실시양태에서, 일축 변형률은 스페로이드의 길쭉한 구조를 증진시킨다. 일부 실시양태에서, 일축 변형률을 겪은 스페로이드는 길쭉한 위장 오가노이드로 분화된다. 선택되는 스페로이드의 유형은 요망되는 오가노이드에 의해 결정되고, 예를 들어, 장 오가노이드 제조를 위해서는 중-후장 스페로이드, 결장 오가노이드 제조를 위해서는 후장 스페로이드, 식도 오가노이드 제조를 위해서는 전방 전장 스페로이드 또는 위 오가노이드 제조를 위해서는 후방 전장 스페로이드이다. 일부 실시양태에서, 스페로이드는 중-후장 스페로이드이다. 일부 실시양태에서, 스페로이드는 후장 스페로이드이다. 일부 실시양태에서, 스페로이드는 전장 스페로이드이다. 일부 실시양태에서, 스페로이드는 전방 전장 스페로이드이다. 일부 실시양태에서, 스페로이드는 후방 전장 스페로이드이다.
일부 실시양태에서, 본원에서 기술된 위장 오가노이드는 식도 오가노이드, 위 오가노이드, 위 기저부 오가노이드, 위 전정부 오가노이드, 장 오가노이드, 또는 결장 오가노이드, 또는 그의 임의의 조합이다. 일부 실시양태에서, 본원에서 기술된 위장 오가노이드는 장 오가노이드이다. 일부 실시양태에서, 본원에서 기술된 위장 오가노이드는 HIO이다. 일부 실시양태에서, 장 오가노이드는 본원에서 기술된 방법에 따라서 생성된다. 일부 실시양태에서, 위장 오가노이드는 본원에서 기술된 방법에 따라서 생성된다. 일부 실시양태에서, 비형상화된 위장 오가노이드는 관련 분야에 알려진 방법에 따라서 생성된다. 일부 실시양태에서, 스페로이드(예를 들어 중-후장, 후장, 전방 전장, 또는 후방 전장 스페로이드) 및 비형상화된 위장 오가노이드(예를 들어 식도, 위, 위 기저부, 위 전정부, 장, 또는 결장 오가노이드) 및 그의 제조 방법은 미국 특허 9,719,068 및 10,174,289, 및 PCT 공개 WO 2016/061464, WO 2017/192997, WO 2018/106628, WO 2019/074793에서 기술되었고, 이로써 각 문헌은 각각의 비형상화된 위장 오가노이드 생성 목적으로 참고로 분명히 포함된다. 일부 실시양태에서, 본원에서 기술된 위장 오가노이드, 또는 참고된 간행물에 기술된 비형상화된 위장 오가노이드는 본원에서 기술된 하나 이상의 형성 트레이를 사용하여 형상화된 위장 오가노이드로서 제조된다. 일부 실시양태에서는, 본원에서 기술된 또는 참고된 간행물에서 기술된 스페로이드(예를 들어 중-후장, 후장, 전방 전장, 또는 후방 전장 스페로이드)가 스페로이드를 본원에서 기술된 형성 트레이의 하나 이상의 수집 채널에서 배양하여 스페로이드를 형상화된 위장 오가노이드로 분화시킴으로써 형상화된 위장 오가노이드(예를 들어 식도, 위, 위 기저부, 위 전정부, 장, 또는 결장 오가노이드)를 제조하는 데 사용된다. 일부 실시양태에서, 수집 채널에서 스페로이드의 배양은 관심을 끄는 특별한 오가노이드에 대해 참고된 간행물에 개시된 조건 하에서이다. 일부 실시양태에서, 본원에서 기술된 또는 참고된 간행물에서 기술된 스페로이드는 형상화된 장 오가노이드를 제조하는 데 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에서 기술된 또는 참고된 간행물에서 기술된 스페로이드는 형상화된 HIO를 제조하는 데 사용된다. 일부 실시양태에서는, 본원에서 기술된 하나 이상의 형성 트레이가 본원에서 기술된 하나 이상의 특징을 포함하는 형상화된 위장 오가노이드(예를 들어 식도, 위, 위 기저부, 위 전정부, 장, 또는 결장 오가노이드)를 형성하는 데 사용된다. 일부 실시양태에서는, 본원에서 기술된 하나 이상의 형성 트레이가 형상화된 장 오가노이드를 형성하는 데 사용된다. 일부 실시양태에서는, 본원에서 기술된 하나 이상의 형성 트레이가 형상화된 HIO를 형성하는 데 사용된다.
형성 트레이 실시양태
복수의 스페로이드로부터 형상화된 오가노이드 구조를 제조하는 데 사용되는 형성 트레이의 실시양태가 본원에서 개시된다. 일부 실시양태에서, 형상화된 오가노이드 구조는 예를 들어 숙주 유기체(예를 들어 사람, 마우스, 래트, 개, 고양이, 또는 다른 포유동물)에서 위장 기능 또는 이식 목적을 연구하는 데 사용하기 위한 것이다. 일부 실시양태에서, 형상화된 오가노이드 구조는 길쭉한 오가노이드 구조이다. 일부 실시양태에서 스페로이드는 중-후장 스페로이드이고, 길쭉한 오가노이드는 장 오가노이드, 예를 들어 길쭉한 HIO이다. 일부 실시양태에서, 형성 트레이(10)는 사용을 위한 요망되는 장기를 더 밀접하게 보완하도록 구성된 미리 결정된 형상을 위해 설계된 구조를 가진다. 형성 트레이(10)는 더 특히 스페로이드를 수용하고 스페로이드를 미리 결정된 형상을 한정하는 수집 배열에 따라서 모으도록 구성된 하나 이상(예를 들어 적어도 1, 3, 5, 10 개)의 수집 채널(12)을 가진다. 하나 이상의 수집 채널(12) 내에서 미리 결정된 기간의 형성 시간 동안 스페로이드의 계속된 배양은 특히 추가 배양 및/또는 이식을 위해 하나 이상의 수집 채널(12)로부터 제거시 스페로이드를 미리 결정된 형상으로 유지하도록 구성된 캐스트(cast) 상태에서 스페로이드를 서로에 대해 효과적으로 할당한다. 일부 실시양태에서, 미리 결정된 형상은 비구형의 미리 결정된 형상, 예컨대 기다란 원주형이다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 수집 채널(12)의 기다란 원주형의 미리 결정된 형상은 스페로이드의 배열을 기다란 원주형의 미리 결정된 형상으로 유지하는 캐스트 상태를 한정한다. 일부 실시양태에서, 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "캐스트 상태"는 명세서에 비추어서 그의 문언적 및 평범한 의미를 가지고, 미리 결정된 형상을 유지하고 한편으로는 약간의 이동을 허용하며 이렇게 해서 미리 결정된 형상이 탄력성 있는 가요성 또는 가단성 있는 가요성을 포함해서 여전히 가요성이도록 스페로이드가 서로에 대해 고정되는 것을 지칭한다. 일부 실시양태에서는, 캐스트 상태 및 미리 결정된 형상이 스페로이드의 배열을 강직한 고착된 상태로 제한하는 것을 의도하지 않고, 미리 결정된 형상이 요망되는 장기 기능성을 보완하고 한편으로는 임플렌테이션(implantation) 동안에 외과 의사에 의한 조작 및 요망되는 장기와의 구조적 연결을 허용하기 위해 충분히 유지될 것이라는 점이 인식될 것이다.
도 2a-c는 복수의 수집 채널(12)을 포함하는 형성 트레이(10)의 실시양태를 도시한다. 본 실시양태의 복수의 수집 채널(12) 각각은 기다란 길이(14), 폭(16), 및 깊이(18)를 가진다. 일부 실시양태에서, 기다란 길이(14)는 종방향으로 연장되고, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50 밀리미터, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50 밀리미터, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50 밀리미터, 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50 밀리미터, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50 밀리미터 이하, 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50 밀리미터 이하, 또는 전술한 길이 중 임의의 둘에 의해 한정되는 범위 내의 임의의 길이, 예를 들어, 1 내지 50 mm, 10 내지 40 mm, 20 내지 30 mm, 1 내지 30 mm, 또는 20 내지 50 mm이고, 형성 트레이(10)의 마주보는 종방향 측벽(20)에 의해 한정된다. 일부 실시양태에서, 폭(16)은 횡방향이고, 종방향에 수직으로 0.2 μm, 1 μm, 5 μm, 10 μm, 50 μm, 100 μm, 200 μm, 300 μm, 400 μm, 500 μm, 600 μm, 700 μm, 800 μm, 900 μm, 1000 μm, 1200 μm, 1300 μm, 1400 μm, 1500 μm, 1600 μm, 1700 μm, 1800 μm, 1900 μm, 2000 μm, 2500 μm, 또는 3000 μm, 약 0.2 μm, 1 μm, 5 μm, 10 μm, 50 μm, 100 μm, 200 μm, 300 μm, 400 μm, 500 μm, 600 μm, 700 μm, 800 μm, 900 μm, 1000 μm, 1200 μm, 1300 μm, 1400 μm, 1500 μm, 1600 μm, 1700 μm, 1800 μm, 1900 μm, 2000 μm, 2500 μm, 또는 3000 μm, 적어도 0.2 μm, 1 μm, 5 μm, 10 μm, 50 μm, 100 μm, 200 μm, 300 μm, 400 μm, 500 μm, 600 μm, 700 μm, 800 μm, 900 μm, 1000 μm, 1200 μm, 1300 μm, 1400 μm, 1500 μm, 1600 μm, 1700 μm, 1800 μm, 1900 μm, 2000 μm, 2500 μm, 또는 3000 μm, 적어도 약 0.2 μm, 1 μm, 5 μm, 10 μm, 50 μm, 100 μm, 200 μm, 300 μm, 400 μm, 500 μm, 600 μm, 700 μm, 800 μm, 900 μm, 1000 μm, 1200 μm, 1300 μm, 1400 μm, 1500 μm, 1600 μm, 1700 μm, 1800 μm, 1900 μm, 2000 μm, 2500 μm, 또는 3000 μm, 0.2 μm, 1 μm, 5 μm, 10 μm, 50 μm, 100 μm, 200 μm, 300 μm, 400 μm, 500 μm, 600 μm, 700 μm, 800 μm, 900 μm, 1000 μm, 1200 μm, 1300 μm, 1400 μm, 1500 μm, 1600 μm, 1700 μm, 1800 μm, 1900 μm, 2000 μm, 2500 μm, 또는 3000 μm 이하, 또는 약 0.2 μm, 1 μm, 5 μm, 10 μm, 50 μm, 100 μm, 200 μm, 300 μm, 400 μm, 500 μm, 600 μm, 700 μm, 800 μm, 900 μm, 1000 μm, 1200 μm, 1300 μm, 1400 μm, 1500 μm, 1600 μm, 1700 μm, 1800 μm, 1900 μm, 2000 μm, 2500 μm, 또는 3000 μm 이하, 또는 전술한 폭 중 임의의 둘에 의해 한정되는 범위 내의 임의의 폭, 예를 들어, 0.2 μm 내지 3000 μm, 200 μm 내지 1500 μm, 500 μm 내지 1000 μm, 0.2 μm 내지 1000 μm, 또는 500 μm 내지 3000 μm이고, 마주보는 측벽(22)에 의해 한정된다. 일부 실시양태에서, 깊이(18)는 기계 직교 방향(transverse direction)으로 연장되고, 종방향 및 횡방향에 수직으로 0.2 μm, 1 μm, 5 μm, 10 μm, 50 μm, 100 μm, 200 μm, 300 μm, 400 μm, 500 μm, 600 μm, 700 μm, 800 μm, 900 μm, 1000 μm, 1200 μm, 1300 μm, 1400 μm, 1500 μm, 1600 μm, 1700 μm, 1800 μm, 1900 μm, 2000 μm, 2500 μm, 또는 3000 μm, 약 0.2 μm, 1 μm, 5 μm, 10 μm, 50 μm, 100 μm, 200 μm, 300 μm, 400 μm, 500 μm, 600 μm, 700 μm, 800 μm, 900 μm, 1000 μm, 1200 μm, 1300 μm, 1400 μm, 1500 μm, 1600 μm, 1700 μm, 1800 μm, 1900 μm, 2000 μm, 2500 μm, 또는 3000 μm, 적어도 0.2 μm, 1 μm, 5 μm, 10 μm, 50 μm, 100 μm, 200 μm, 300 μm, 400 μm, 500 μm, 600 μm, 700 μm, 800 μm, 900 μm, 1000 μm, 1200 μm, 1300 μm, 1400 μm, 1500 μm, 1600 μm, 1700 μm, 1800 μm, 1900 μm, 2000 μm, 2500 μm, 또는 3000 μm, 적어도 약 0.2 μm, 1 μm, 5 μm, 10 μm, 50 μm, 100 μm, 200 μm, 300 μm, 400 μm, 500 μm, 600 μm, 700 μm, 800 μm, 900 μm, 1000 μm, 1200 μm, 1300 μm, 1400 μm, 1500 μm, 1600 μm, 1700 μm, 1800 μm, 1900 μm, 2000 μm, 2500 μm, 또는 3000 μm, 0.2 μm, 1 μm, 5 μm, 10 μm, 50 μm, 100 μm, 200 μm, 300 μm, 400 μm, 500 μm, 600 μm, 700 μm, 800 μm, 900 μm, 1000 μm, 1200 μm, 1300 μm, 1400 μm, 1500 μm, 1600 μm, 1700 μm, 1800 μm, 1900 μm, 2000 μm, 2500 μm, 또는 3000 μm 이하, 또는 약 0.2 μm, 1 μm, 5 μm, 10 μm, 50 μm, 100 μm, 200 μm, 300 μm, 400 μm, 500 μm, 600 μm, 700 μm, 800 μm, 900 μm, 1000 μm, 1200 μm, 1300 μm, 1400 μm, 1500 μm, 1600 μm, 1700 μm, 1800 μm, 1900 μm, 2000 μm, 2500 μm, 또는 3000 μm 이하, 또는 전술한 깊이 중 임의의 둘에 의해 한정되는 범위 내의 임의의 깊이, 예를 들어 0.2 μm 내지 3000 μm, 200 μm 내지 1500 μm, 500 μm 내지 1000 μm, 0.2 μm 내지 1000 μm, 또는 500 μm 내지 3000 μm이다. 일부 실시양태에서, 깊이(18)는 형성 트레이(10)의 상부 표면(26)의 채널 개구(24)와 형성 트레이(10)의 바닥 표면(28) 사이에서 한정된다. 일부 실시양태에서, 따라서 복수의 수집 채널(12) 각각은 각각의 종방향 측벽(20), 횡방향 측벽(22), 채널 개구(24), 및 바닥 표면(28) 사이에서 한정된다. 일부 실시양태에서, 복수의 수집 채널(12) 각각은 0.2 μm, 1 μm, 5 μm, 10 μm, 50 μm, 100 μm, 200 μm, 300 μm, 400 μm, 500 μm, 600 μm, 700 μm, 800 μm, 900 μm, 1000 μm, 1200 μm, 1300 μm, 1400 μm, 1500 μm, 1600 μm, 1700 μm, 1800 μm, 1900 μm, 2000 μm, 2500 μm, 또는 3000 μm, 약 0.2 μm, 1 μm, 5 μm, 10 μm, 50 μm, 100 μm, 200 μm, 300 μm, 400 μm, 500 μm, 600 μm, 700 μm, 800 μm, 900 μm, 1000 μm, 1200 μm, 1300 μm, 1400 μm, 1500 μm, 1600 μm, 1700 μm, 1800 μm, 1900 μm, 2000 μm, 2500 μm, 또는 3000 μm, 적어도 0.2 μm, 1 μm, 5 μm, 10 μm, 50 μm, 100 μm, 200 μm, 300 μm, 400 μm, 500 μm, 600 μm, 700 μm, 800 μm, 900 μm, 1000 μm, 1200 μm, 1300 μm, 1400 μm, 1500 μm, 1600 μm, 1700 μm, 1800 μm, 1900 μm, 2000 μm, 2500 μm, 또는 3000 μm, 적어도 약 0.2 μm, 1 μm, 5 μm, 10 μm, 50 μm, 100 μm, 200 μm, 300 μm, 400 μm, 500 μm, 600 μm, 700 μm, 800 μm, 900 μm, 1000 μm, 1200 μm, 1300 μm, 1400 μm, 1500 μm, 1600 μm, 1700 μm, 1800 μm, 1900 μm, 2000 μm, 2500 μm, 또는 3000 μm, 0.2 μm, 1 μm, 5 μm, 10 μm, 50 μm, 100 μm, 200 μm, 300 μm, 400 μm, 500 μm, 600 μm, 700 μm, 800 μm, 900 μm, 1000 μm, 1200 μm, 1300 μm, 1400 μm, 1500 μm, 1600 μm, 1700 μm, 1800 μm, 1900 μm, 2000 μm, 2500 μm, 또는 3000 μm 이하, 또는 약 0.2 μm, 1 μm, 5 μm, 10 μm, 50 μm, 100 μm, 200 μm, 300 μm, 400 μm, 500 μm, 600 μm, 700 μm, 800 μm, 900 μm, 1000 μm, 1200 μm, 1300 μm, 1400 μm, 1500 μm, 1600 μm, 1700 μm, 1800 μm, 1900 μm, 2000 μm, 2500 μm, 또는 3000 μm 이하, 또는 전술한 반경 중 임의의 둘에 의해 한정되는 범위 내의 임의의 반경, 예를 들어, 0.2 μm 내지 3000 μm, 200 μm 내지 1500 μm, 500 μm 내지 1000 μm, 0.2 μm 내지 1000 μm, 또는 500 μm 내지 3000 μm인 곡률 반경을 갖는 반구형 종방향 말단부를 가지고, 그 사이에서 0.2 μm, 1 μm, 5 μm, 10 μm, 50 μm, 100 μm, 200 μm, 300 μm, 400 μm, 500 μm, 600 μm, 700 μm, 800 μm, 900 μm, 1000 μm, 1200 μm, 1300 μm, 1400 μm, 1500 μm, 1600 μm, 1700 μm, 1800 μm, 1900 μm, 2000 μm, 2500 μm, 또는 3000 μm, 약 0.2 μm, 1 μm, 5 μm, 10 μm, 50 μm, 100 μm, 200 μm, 300 μm, 400 μm, 500 μm, 600 μm, 700 μm, 800 μm, 900 μm, 1000 μm, 1200 μm, 1300 μm, 1400 μm, 1500 μm, 1600 μm, 1700 μm, 1800 μm, 1900 μm, 2000 μm, 2500 μm, 또는 3000 μm, 적어도 0.2 μm, 1 μm, 5 μm, 10 μm, 50 μm, 100 μm, 200 μm, 300 μm, 400 μm, 500 μm, 600 μm, 700 μm, 800 μm, 900 μm, 1000 μm, 1200 μm, 1300 μm, 1400 μm, 1500 μm, 1600 μm, 1700 μm, 1800 μm, 1900 μm, 2000 μm, 2500 μm, 또는 3000 μm, 적어도 약 0.2 μm, 1 μm, 5 μm, 10 μm, 50 μm, 100 μm, 200 μm, 300 μm, 400 μm, 500 μm, 600 μm, 700 μm, 800 μm, 900 μm, 1000 μm, 1200 μm, 1300 μm, 1400 μm, 1500 μm, 1600 μm, 1700 μm, 1800 μm, 1900 μm, 2000 μm, 2500 μm, 또는 3000 μm, 0.2 μm, 1 μm, 5 μm, 10 μm, 50 μm, 100 μm, 200 μm, 300 μm, 400 μm, 500 μm, 600 μm, 700 μm, 800 μm, 900 μm, 1000 μm, 1200 μm, 1300 μm, 1400 μm, 1500 μm, 1600 μm, 1700 μm, 1800 μm, 1900 μm, 2000 μm, 2500 μm, 또는 3000 μm 이하, 또는 약 0.2 μm, 1 μm, 5 μm, 10 μm, 50 μm, 100 μm, 200 μm, 300 μm, 400 μm, 500 μm, 600 μm, 700 μm, 800 μm, 900 μm, 1000 μm, 1200 μm, 1300 μm, 1400 μm, 1500 μm, 1600 μm, 1700 μm, 1800 μm, 1900 μm, 2000 μm, 2500 μm, 또는 3000 μm 이하, 또는 전술한 반경 중 임의의 둘에 의해 한정되는 범위 내의 임의의 반경, 예를 들어 0.2 μm 내지 3000 μm, 200 μm 내지 1500 μm, 500 μm 내지 1000 μm, 0.2 μm 내지 1000 μm, 또는 500 μm 내지 3000 μm인 또 다른 곡률 반경을 갖는 일반적으로 원통형 형상이 연장된다. 일부 실시양태에서, 복수의 수집 채널(12) 각각은 100 μm3, 200 μm3, 300 μm3, 400 μm3, 500 μm3, 600 μm3, 700 μm3, 800 μm3, 900 μm3, 1000 μm3, 10000 μm3, 100000 μm3, 1000000 μm3, 또는 0.01 mm3, 0.1 mm3, 1 mm3, 2 mm3, 3 mm3, 4 mm3, 5 mm3, 6 mm3, 7 mm3, 8 mm3, 9 mm3, 10 mm3, 100 mm3, 1000 mm3, 1500 mm3, 또는 2000 mm3, 약 100 μm3, 200 μm3, 300 μm3, 400 μm3, 500 μm3, 600 μm3, 700 μm3, 800 μm3, 900 μm3, 1000 μm3, 10000 μm3, 100000 μm3, 1000000 μm3, 또는 0.01 mm3, 0.1 mm3, 1 mm3, 2 mm3, 3 mm3, 4 mm3, 5 mm3, 6 mm3, 7 mm3, 8 mm3, 9 mm3, 10 mm3, 100 mm3, 1000 mm3, 1500 mm3, 또는 2000 mm3, 적어도 100 μm3, 200 μm3, 300 μm3, 400 μm3, 500 μm3, 600 μm3, 700 μm3, 800 μm3, 900 μm3, 1000 μm3, 10000 μm3, 100000 μm3, 1000000 μm3, 또는 0.01 mm3, 0.1 mm3, 1 mm3, 2 mm3, 3 mm3, 4 mm3, 5 mm3, 6 mm3, 7 mm3, 8 mm3, 9 mm3, 10 mm3, 100 mm3, 1000 mm3, 1500 mm3, 또는 2000 mm3, 적어도 약 100 μm3, 200 μm3, 300 μm3, 400 μm3, 500 μm3, 600 μm3, 700 μm3, 800 μm3, 900 μm3, 1000 μm3, 10000 μm3, 100000 μm3, 1000000 μm3, 또는 0.01 mm3, 0.1 mm3, 1 mm3, 2 mm3, 3 mm3, 4 mm3, 5 mm3, 6 mm3, 7 mm3, 8 mm3, 9 mm3, 10 mm3, 100 mm3, 1000 mm3, 1500 mm3, 또는 2000 mm3, 100 μm3, 200 μm3, 300 μm3, 400 μm3, 500 μm3, 600 μm3, 700 μm3, 800 μm3, 900 μm3, 1000 μm3, 10000 μm3, 100000 μm3, 1000000 μm3, 또는 0.01 mm3, 0.1 mm3, 1 mm3, 2 mm3, 3 mm3, 4 mm3, 5 mm3, 6 mm3, 7 mm3, 8 mm3, 9 mm3, 10 mm3, 100 mm3, 1000 mm3, 1500 mm3, 또는 2000 mm3 이하, 또는 약 100 μm3, 200 μm3, 300 μm3, 400 μm3, 500 μm3, 600 μm3, 700 μm3, 800 μm3, 900 μm3, 1000 μm3, 10000 μm3, 100000 μm3, 1000000 μm3, 또는 0.01 mm3, 0.1 mm3, 1 mm3, 2 mm3, 3 mm3, 4 mm3, 5 mm3, 6 mm3, 7 mm3, 8 mm3, 9 mm3, 10 mm3, 100 mm3, 1000 mm3, 1500 mm3, 또는 2000 mm3 이하, 또는 전술한 부피 중 임의의 둘에 의해 한정되는 범위 내의 임의의 부피, 예를 들어, 100 μm3 내지 2000 mm3, 1000 μm3 내지 1000 mm3, 0.1 mm3 내지 5 mm3, 100 μm3 내지 1 mm3, 또는 1 mm3 내지 2000 mm3인 부피를 가진다. 일부 실시양태에서, 형성 트레이(10)는 동일한 또는 거의 동일한 길이(14), 동일한 또는 거의 동일한 폭(16), 및 동일한 또는 거의 동일한 깊이(18) 치수를 갖는 복수의 수집 채널(12) 또는 하나 이상(예를 들어 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 개)의 수집 채널(12)을 가진다. 일부 실시양태에서, 복수의 수집 채널(12) 또는 하나 이상의 수집 채널(12) 중의 수집 채널들은 반드시 동일한 또는 거의 동일한 길이(14)를 가질 필요는 없거나, 반드시 동일한 또는 거의 동일한 폭(16)을 가질 필요는 없거나, 또는 반드시 동일한 또는 거의 동일한 깊이(18) 치수를 가질 필요는 없거나, 또는 그의 임의의 조합일 수 있다. 일부 실시양태에서, 형성 트레이(10)는 서로 평행한 또는 거의 평행한 복수의 수집 채널(12) 또는 하나 이상의 수집 채널(12)을 가진다. 일부 실시양태에서, 복수의 수집 채널(12) 또는 하나 이상의 수집 채널(12) 중의 수집 채널들은 반드시 서로 평행하거나 또는 거의 평행할 필요는 없다. 일부 실시양태에서, 형성 트레이(10)는 복수의 수집 채널(12) 또는 하나 이상의 수집 채널(12) 중의 수집 채널들 중 하나 이상(예를 들어 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 개)을 덮도록 구성된 덮개를 포함한다. 일부 실시양태에서는, 하나 이상의 수집 채널(12)이 상부 표면(26)에서 개방되기보다는 오히려 봉지되도록 채널 개구(24) 없이 형성된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상(예를 들어 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 개)의 봉지된 수집 채널(12)은 관 구조 또는 호스(hose) 구조를 포함한다. 일부 실시양태에서는, 형성 트레이(10)가 도 2a-c의 실시양태에서 나타낸 또는 본원에서 기술된 특별한 수, 배열, 또는 크기의 수집 채널(12)로 불필요하게 제한되는 것을 의도하지 않는다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 수집 채널(12)은 미리 결정된 형상을 한정하는 수집 배열로 스페로이드를 함께 모으도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 수집 채널(12)은 함께 상대적으로 더 넓은 채널 개구(24)에서부터 상대적으로 더 좁은 바닥 표면(28) 쪽으로 테이퍼링된다. 도 2a-c는 형성 트레이(10)의 한 실시양태를 도시하고, 여기서는 마주보는 종방향 측벽(20)이 서로를 향해서 채널 개구(24)에서부터 바닥 표면(28)까지 테이퍼링되고, 한편으로 마주보는 횡방향 측벽(22)도 마찬가지로 서로를 향해 채널 개구(24)에서부터 바닥 표면(28)까지 테이퍼링된다. 일부 실시양태에서는, 중력이 하나 이상의 수집 채널(12) 내의 스페로이드를 기계 직교 방향에서 아래쪽으로 강제로 당기고, 한편 종방향 및 횡방향 측벽(20, 22)에 의해 스페로이드에 가해지는 반작용력이 스페로이드를 서로를 향해 위쪽으로 및 안쪽으로 향하게 해서 스페로이드를 함께 미리 결정된 형상으로 효과적으로 모은다.
일부 실시양태에서는, 하나 이상의 수집 채널(12)이 도 2a-c에 묘사된 실시양태에 의해 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서는, 하나 이상의 수집 채널이 곧은 또는 본질적으로 곧은 형상을 가진다. 일부 실시양태에서는, 하나 이상의 수집 채널이 적어도 하나의 치수가 곧은 또는 본질적으로 곧은 형상을 가진다. 일부 실시양태에서는, 하나 이상의 수집 채널이 모든 치수가 곧은 또는 본질적으로 곧은 형상을 가진다. 일부 실시양태에서는, 하나 이상의 수집 채널이 장방형, 입방형, 원통형, 원뿔형, 또는 각뿔형 형상을 가진다. 일부 실시양태에서는, 하나 이상의 수집 채널이 굽은 또는 본질적으로 굽은 형상을 가진다. 일부 실시양태에서는, 하나 이상의 수집 채널이 적어도 하나의 치수가 굽은 또는 본질적으로 굽은 형상을 가진다. 일부 실시양태에서는, 하나 이상의 수집 채널이 모든 치수가 굽은 또는 본질적으로 굽은 형상을 가진다. 일부 실시양태에서는, 하나 이상의 수집 채널이 구형 형상을 가진다. 일부 실시양태에서는, 하나 이상의 수집 채널이 비구형 형상을 가진다. 일부 실시양태에서는, 하나 이상의 수집 채널이 적어도 하나의 굽은 표면을 가지지만 그 밖에는 곧은 형상을 가진다. 일부 실시양태에서는, 하나 이상의 수집 채널이 굽은 장방형, 굽은 입방형, 굽은 원통형, 굽은 원뿔형, 굽은 각뿔형, 포물선형, 포물면형, 쌍곡선형, 쌍곡면형, 타원체형, 소용돌이형, 나선형, 사인파형, 시누소이달, 사문형, 방형파형, 삼각파형, 톱니파형, 방추형, 수지형, 분지형, 또는 방사상 형상, 또는 그의 임의의 조합을 가진다. 일부 실시양태에서, 형상화된 위장 오가노이드는 본원에서 및 다른 곳에서 기술된 하나 이상의 수집 채널의 형상들 중 임의의 하나로 적절히 형성된다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 수집 채널(12) 각각은 하나 이상의 수집 채널(12)의 부피에 적당한 스페로이드 수 및 액체 매질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 수집 채널(12) 각각은 수집 채널(12) 당 100, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 또는 10000 개 스페로이드, 약 100, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 또는 10000 개 스페로이드, 적어도 100, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 또는 10000 개 스페로이드, 적어도 약 100, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 또는 10000 개 스페로이드, 100, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 또는 10000 개 이하 스페로이드, 또는 약 100, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 또는 10000 개 이하 스페로이드, 또는 전술한 숫자 중 임의의 둘에 의해 한정되는 범위 내의 임의의 수의 스페로이드, 예를 들어 100 내지 10000 개 스페로이드, 2000 내지 8000 개 스페로이드, 3000 내지 4000 개 스페로이드, 100 내지 4000 개 스페로이드, 또는 3000 내지 10000 개 스페로이드인 스페로이드 수를 포함한다. 일부 실시양태에서, 100, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 또는 10000 개 스페로이드, 약 100, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 또는 10000 개 스페로이드, 적어도 100, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 또는 10000 개 스페로이드, 적어도 약 100, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 또는 10000 개 스페로이드, 100, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 또는 10000 개 이하 스페로이드, 또는 약 100, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 또는 10000 개 이하 스페로이드, 또는 전술한 숫자 중 임의의 둘에 의해 한정되는 범위 내의 임의의 수의 스페로이드, 예를 들어, 100 내지 10000 개 스페로이드, 2000 내지 8000 개 스페로이드, 3000 내지 4000 개 스페로이드, 100 내지 4000 개 스페로이드, 또는 3000 내지 10000 개 스페로이드인 스페로이드 수를 포함하는 하나 이상의 수집 채널(12) 각각은 10, 15 또는 20 mm, 약 10, 15 또는 20 mm, 적어도 10, 15 또는 20 mm, 적어도 약 10, 15 또는 20 mm, 10, 15 또는 20 mm 이하, 또는 약 10, 15 또는 20 mm 이하인 길이(14), 0.5 mm, 약 0.5 mm, 적어도 0.5 mm, 적어도 약 0.5 mm, 0.5 mm 이하, 또는 약 0.5 mm 이하인 폭(16), 및 0.5 mm, 약 0.5 mm, 적어도 0.5 mm, 적어도 약 0.5 mm, 0.5 mm 이하, 또는 약 0.5 mm 이하인 깊이(18)를 가진다. 일부 실시양태에서는, 스페로이드가 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 또는 2000 개 스페로이드/mm3, 약 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 또는 2000 개 스페로이드/mm3, 적어도 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 또는 2000 개 스페로이드/mm3, 적어도 약 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 또는 2000 개 스페로이드/mm3, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 또는 2000 개 이하 스페로이드/mm3, 또는 약 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 또는 2000 개 이하 스페로이드/mm3, 또는 전술한 밀도 중 임의의 둘에 의해 한정되는 범위 내의 임의의 밀도, 예를 들어 100 내지 2000 개 스페로이드/mm3, 500 내지 1500 개 스페로이드/mm3, 100 내지 1000 개 스페로이드/mm3, 또는 1000 내지 2000 개 스페로이드/mm3인 미리 결정된 밀도로 모인다.
도 2a-c에 도시된 실시양태에서, 하나 이상의 수집 채널(12)의 종방향 측벽(20), 횡방향 측벽(22), 및 바닥 표면(28)은 아치형이고, 각각은 관형 및 서로 연속이도록 하는 곡률 반경을 가진다. 일부 실시양태에서는, 종방향 측벽(20), 횡방향 측벽(22), 또는 바닥 표면(28) 중 하나 이상(예를 들어 적어도 1, 3, 5, 10 개)이 연속하지 않도록 교차한다. 일부 실시양태에서는, 따라서 하나 이상의 수집 채널(12)의 하나 이상(예를 들어 적어도 1, 3, 5, 10 개)의 측벽(20, 22) 및 하나 이상(예를 들어 적어도 1, 3, 5, 10 개)의 바닥 표면(28)이 도 2a-c의 실시양태에 나타낸 또는 본원에서 기술된 평활한 연속 표면으로 불필요하게 제한되는 것을 의도하지 않는다. 일부 실시양태에서, 하나 이상(예를 들어 적어도 1, 3, 5, 10 개)의 수집 채널(12)의 형상 및 치수는 스페로이드 예컨대 본원에서 기술된 위장 스페로이드의 유효 성장에 맞게 구성된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상(예를 들어 적어도 1, 3, 5, 10 개)의 수집 채널(12)의 형상 및 치수는 위장 스페로이드가 아닌 스페로이드의 유효 성장에 맞게 구성된다. 일부 실시양태에서는, 하나 이상의 수집 채널(12)이 도면의 실시양태에 나타낸 또는 본원에서 기술된 특별한 형상 및/또는 치수에 불필요하게 제한되는 것을 의도하지 않는다.
일부 실시양태에서, 형성 트레이(10)는 단일의 일원형(unitary) 구조를 가진다. 일부 실시양태에서, 형성 트레이(10)는 생체적합성 재료로부터 제조된다. 일부 실시양태에서, 형성 트레이(10)는 하나 이상의 수집 채널(12) 내에서 형성 트레이(10)에 스페로이드의 부착을 억제하고 한편으로 스페로이드가 위장 오가노이드 구조로 발생하는 것을 허용하는 생체적합성 재료로부터 제조된다. 일부 실시양태에서, 형성 트레이(10)는 복수의 성분으로부터 형성되고, 여기서 하나 이상의 수집 채널(12) 내의 적어도 표면이 생체적합성 재료로부터 제조된다. 일부 실시양태에서, 생체적합성 재료는 스테인리스강, 티타늄, 중합체 유리실리콘 화합물, 폴리디메틸실록산(PDMS), 유리, 플라스틱, PVC, PE, PP, PMMA, PS, PTFE, 나일론, 폴리우레탄, PET, PES, 히알루로난, 키토산, 당, 세라믹, 알루미나, 지르코니아, 생체유리, 히드록시아파타이트, 또는 그의 임의의 조합, 또는 관련 분야에 알려진 임의의 다른 생체적합성 재료를 포함하거나, 그것으로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 형성 트레이(10)는 멸균성이거나, 조직 및/또는 세포에 의한 부착에 대해 저항성이거나, 소수성 표면을 포함하거나, 개시된 조직의 형성 및 그 후의 제거 및/또는 사용을 개선하는 특징을 포함하거나, 또는 그의 임의의 조합일 수 있다. 일부 실시양태에서, 형성 트레이(10)는 성장 및/또는 분화를 촉진시키는 하나 이상(예를 들어 적어도 1, 3, 5, 10 개)의 작은 분자 화합물, 활성화제, 억제제, 성장 인자, 핵산, DNA, RNA, 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질, 또는 그의 임의의 조합을 포함한다.
도 3a-d는 형성 트레이(10)에서 배양하기 위한 복수의 미리 배열된 스페로이드(30)의 실시양태를 보여준다. 일부 실시양태에서는, 복수의 iPSC(32)가 복수의 iPSC를 복수의 완전 내배엽 세포(36)로 분화시키는 조건, 예컨대 본원에서 기술된 또는 그 밖에 관련 분야에서 알려진 조건 하에서 생체적합성 용기(34) 내에서 배양된다. 일부 실시양태에서는, 복수의 완전 내배엽 세포(36)가 생체적합성 용기(34) 내에서 복수의 완전 내배엽 세포를 복수의 스페로이드(38)로 분화시키는 조건, 예컨대 본원에서 기술된 또는 그 밖에 관련 분야에서 알려진 조건 하에서 배양된다. 일부 실시양태에서, 스페로이드(38)는 후장 스페로이드이다. 일부 실시양태에서, 스페로이드(38)는 전장 스페로이드이다. 일부 실시양태에서, 스페로이드(38)는 전방 전장 스페로이드이다. 일부 실시양태에서, 스페로이드(38)는 후방 전장 스페로이드이다. 일부 실시양태에서, 스페로이드(38)는 중-후장 스페로이드이다. 일부 실시양태에서, 스페로이드(38)는 중-후장 스페로이드가 아니다. 일부 실시양태에서는, 복수의 스페로이드(38)가 형성되고 있을 때, 스캐폴드 가닥(40)이 복수의 스페로이드(38)에 근접하게 도입된다. 일부 실시양태에서는, 스캐폴드 가닥(40)이 생체적합성 용기(34) 내에 또는 가까이에 영구적으로 또는 반영구적으로 놓이거나 또는 보관되고, 이렇게 해서 스페로이드가 형성시 스캐폴드 가닥(40)과 접촉할 수 있다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드 가닥(40)은 발생하는 스페로이드(38)를 유인하여 접촉하고 결국에는 발생하는 스페로이드(38)가 강제로 복수의 미리 배열된 스페로이드(30)가 되게 하도록 구성된 생체적합성 재료로부터 형성된다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드 가닥(40)은 수집 채널(12)과 상보적 형상을 가지고, 이렇게 해서 복수의 미리 배열된 스페로이드(30)가 더 효율적으로 생체적합성 용기(34) 내에 수집되고 생체적합성 용기(34)로부터 제거된다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드 가닥(40)은 일반적으로 선형 및 섬유형이다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드 가닥(40)은 스트링, 섬유, 와이어, 케이블, 또는 스페로이드(38)를 유인하여 배열하도록 구성된 다른 구조이다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드 가닥(40)은 스페로이드를 유인하고 한편으로 오가노이드로의 스페로이드의 발생을 허용하도록 구성된 적합한 금속성 또는 비금속성 생체적합성 재료로부터 제작된다.
일부 실시양태에서, 일단 복수의 미리 배열된 스페로이드(30)가 충분히 시드 필터링(seed filtering)되면, 미리 배열된 스페로이드(30)가 부착된 스캐폴드 가닥(40)이 제거되고, 미리 배열된 스페로이드(30)를 하나 이상의 수집 채널(12)로 옮긴다(도 4). 일부 실시양태에서는, 그 다음에 스캐폴드 가닥(40)을 폐기하여, 미리 배열된 스페로이드(30)를 미리 결정된 형상으로 남겨둘 수 있다. 일부 실시양태에서, 선형의 미리 배열된 스페로이드(30)는 상보적 형상화된 수집 채널(12) 안에 놓는 것을 단순화하지만, 그러한 스페로이드(38)는 스캐폴드 가닥(40)을 사용하지 않고서 생체적합성 용기(34)에서 배양되고 그로부터 제거될 수 있다. 도 4는 제1일(d1), 제3일(d3), 및 제5일(d5)에 하나 이상의 수집 채널(12) 내에서 배양된 미리 배열된 스페로이드(30)의 실시양태를 보여준다. 일부 실시양태에서는, 미리 배열된 스페로이드(30)가 본원에서 기술된 바와 같은(예를 들어 상기 내용 참조) 미리 결정된 기간의 형성 시간 동안 하나 이상의 수집 채널(12)에서 배양되고, 이렇게 해서 미리 배열된 스페로이드(30)의 중간엽 사이에 융합이 일어나거나, 혈액 공급이 형성되거나, 신경분포가 일어나거나, 또는 스페로이드가 미리 결정된 형상(예를 들어 본원에서 기술된 바와 같은 길쭉한 위장 오가노이드의 경우에는 기다란 원주)을 채택하거나, 또는 그의 임의의 조합일 수 있다.
일부 실시양태에서는, 미리 배열된 스페로이드를 Tissue Train Culture Plate(Flexcell International Corp., Burlington NC)에 옮긴다. 일부 실시양태에서, Tissue Train Culture Plate는 나일론 메쉬 탭 및 나일론 메쉬 탭 사이에 위치하는 형상가변 고무막을 포함한다. 일부 실시양태에서는, 미리 배열된 스페로이드가 나일론 메쉬 탭 사이의 형상가변 고무막 상에 정렬되고, 이렇게 해서 미리 배열된 스페로이드의 길이(즉, 가장 긴 치수)가 나일론 메쉬 탭 상에 및 그 사이에 위치한다. 일부 실시양태에서는, 나일론 메쉬 탭이 미리 배열된 스페로이드의 말단을 보유하는 앵커로서 쓰인다. 일부 실시양태에서는, Tissue Train Culture Plate가 형상가변 고무막 아래에 진공 챔버를 포함하고, 여기서 Tissue Train Culture Plate에 진공을 가하면, 형상가변 고무막이 진공 챔버 쪽으로 신장된다. 일부 실시양태에서는, 미리 배열된 스페로이드가 나일론 메쉬 탭 사이의 형상가변 고무막 상에 놓이고, 한편으로 진공이 Tissue Train Culture Plate에 가해진다. 일부 실시양태에서는, 그 다음에 진공을 완화하여, 형상가변 고무막을 비신장된 상태로 복귀시킨다. 일부 실시양태에서는, 비신장된 상태로의 복귀가 형상가변 고무막 상에 위치하는 미리 배열된 스페로이드에 변형률을 부여한다. 일부 실시양태에서, 변형률은 일축 변형률이다. 일부 실시양태에서, 변형률은 나일론 메쉬 탭 쪽으로 바깥쪽으로 향하는 일축 변형률이다. 일부 실시양태에서, 일축 변형률은 0%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 또는 20% 신장, 약 0%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 또는 20% 신장, 적어도 0%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 또는 20% 신장, 적어도 약 0%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 또는 20% 신장, 0%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 또는 20% 이하 신장, 또는 약 0%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 또는 20% 이하 신장, 또는 전술한 백분율 중 임의의 둘에 의해 한정되는 범위 내의 임의의 백분율, 예를 들어 0% 내지 20%, 5% 내지 15%, 8% 내지 12%, 0% 내지 10%, 또는 10% 내지 20%인 퍼센트 신장을 미리 배열된 스페로이드 상에 부여한다. 일부 실시양태에서, 형상가변 고무막에 의해 부여되는 일축 변형률은 미리 배열된 스페로이드를 길쭉한 형상으로 유지시킨다. 일부 실시양태에서, 미리 배열된 스페로이드는 Tissue Train Culture Plate에서 변형률 하에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50 일, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50 일, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50 일, 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50 일, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50 일 이하, 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50 일 이하, 또는 전술한 일 수 중 임의의 둘에 의해 한정되는 범위 내의 임의의 배양 일 수, 예를 들어, 1 내지 50 일, 10 내지 40 일, 20 내지 30 일, 1 내지 30 일, 또는 20 내지 50 일의 일 수 동안 배양된다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 수집 채널(12)의 크기 및 치수 및/또는 형상화된 위장 오가노이드의 크기 및 치수는 마우스 또는 대략 마우스의 크기인 다른 유기체에 맞게 적당하게 구성된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 수집 채널(12)의 크기 및 치수 및/또는 형상화된 위장 오가노이드의 크기 및 치수는 사람에 맞게 적당하게 구성된다. 일부 실시양태에서, 수집 채널(12)의 기다란 길이(14) 또는 형상화된 위장 오가노이드의 길이는 종방향으로 연장되고, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 또는 600 cm, 약 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 또는 600 cm, 적어도 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 또는 600 cm, 적어도 약 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 또는 600 cm, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 또는 600 cm 이하, 또는 약 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 또는 600 cm 이하, 또는 전술한 길이 중 임의의 둘에 의해 한정되는 범위 내의 임의의 길이, 예를 들어 1 내지 600 cm, 100 내지 500 cm, 200 내지 300 cm, 1 내지 300 cm, 또는 200 내지 600 cm이다. 일부 실시양태에서, 수집 채널(12)의 폭(16) 또는 형상화된 위장 오가노이드의 폭은 횡방향으로 연장되고, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30 cm, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30 cm, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30 cm, 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30 cm, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30 cm 이하, 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30 cm 이하, 또는 전술한 폭 중 임의의 둘에 의해 한정되는 범위 내의 임의의 폭, 예를 들어 1 내지 30 cm, 5 내지 25 cm, 10 내지 20 cm, 1 내지 20 cm, 또는 10 내지 30 cm이다. 일부 실시양태에서, 수집 채널(12)의 깊이(18) 또는 형상화된 위장 오가노이드의 깊이는 기계 직교 방향으로 연장되고, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30 cm, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30 cm, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30 cm, 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30 cm, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30 cm 이하, 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30 cm 이하, 또는 전술한 깊이 중 임의의 둘에 의해 한정되는 범위 내의 임의의 깊이, 예를 들어, 1 내지 30 cm, 5 내지 25 cm, 10 내지 20 cm, 1 내지 20 cm, 또는 10 내지 30 cm이다. 일부 실시양태에서, 형상화된 위장 오가노이드의 직경은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30 cm, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30 cm, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30 cm, 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30 cm, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30 cm 이하, 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30 cm 이하, 또는 전술한 직경 중 임의의 둘에 의해 한정되는 범위 내의 임의의 직경, 예를 들어 1 내지 30 cm, 5 내지 25 cm, 10 내지 20 cm, 1 내지 20 cm, 또는 10 내지 30 cm이다. 일부 실시양태에서, 수집 채널(12) 또는 형상화된 위장 오가노이드는 1, 10, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 5000, 10000, 50000, 100000, 500000, 1000000, 5000000, 또는 10000000 cm3, 약 1, 10, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 5000, 10000, 50000, 100000, 500000, 1000000, 5000000, 또는 10000000 cm3, 적어도 1, 10, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 5000, 10000, 50000, 100000, 500000, 1000000, 5000000, 또는 10000000 cm3, 적어도 약 1, 10, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 5000, 10000, 50000, 100000, 500000, 1000000, 5000000, 또는 10000000 cm3, 1, 10, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 5000, 10000, 50000, 100000, 500000, 1000000, 5000000, 또는 10000000 cm3 이하, 또는 약 1, 10, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 5000, 10000, 50000, 100000, 500000, 1000000, 5000000, 또는 10000000 cm3 이하, 또는 전술한 부피 중 임의의 둘에 의해 한정되는 범위 내인 임의의 부피, 예를 들어 1 내지 10000000 cm3, 500 내지 1000000 cm3, 10000 내지 100000 cm3, 1 내지 100000 cm3, 또는 10000 내지 10000000 cm3인 부피를 가진다. 일부 실시양태에서, 수집 채널(12)은 사람에 적당한 크기 및 치수를 갖는 형상화된 위장 오가노이드를 형성하기 위해 수집 채널의 부피에 적당한 스페로이드 수 및 액체 매질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 수집 채널(12)은 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013, 1014, 1015, 1016, 1017, 1018, 1019, 또는 1020 개 스페로이드, 약 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013, 1014, 1015, 1016, 1017, 1018, 1019, 또는 1020 개 스페로이드, 적어도 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013, 1014, 1015, 1016, 1017, 1018, 1019, 또는 1020 개 스페로이드, 적어도 약 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013, 1014, 1015, 1016, 1017, 1018, 1019, 또는 1020 개 스페로이드, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013, 1014, 1015, 1016, 1017, 1018, 1019, 또는 1020 개 이하 스페로이드, 또는 약 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013, 1014, 1015, 1016, 1017, 1018, 1019, 또는 1020 개 이하 스페로이드, 또는 전술한 숫자 중 임의의 둘에 의해 한정되는 범위 내의 임의의 수의 스페로이드, 예를 들어 102 내지 1020, 105 내지 1015, 108 내지 1012, 102 내지 1010, 또는 1010 내지 1020 개 스페로이드인 스페로이드 수를 포함한다. 일부 실시양태에서, 형상화된 위장 오가노이드는 사람에 적당한 크기 및 치수를 갖는 형상화된 위장 오가노이드를 형성하기에 적당한 스페로이드 수로부터 형성된다. 일부 실시양태에서, 형상화된 위장 오가노이드는 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013, 1014, 1015, 1016, 1017, 1018, 1019, 또는 1020 개 스페로이드, 약 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013, 1014, 1015, 1016, 1017, 1018, 1019, 또는 1020 개 스페로이드, 적어도 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013, 1014, 1015, 1016, 1017, 1018, 1019, 또는 1020 개 스페로이드, 적어도 약 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013, 1014, 1015, 1016, 1017, 1018, 1019, 또는 1020 개 스페로이드, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013, 1014, 1015, 1016, 1017, 1018, 1019, 또는 1020 개 이하 스페로이드, 또는 약 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013, 1014, 1015, 1016, 1017, 1018, 1019, 또는 1020 개 이하 스페로이드, 또는 전술한 숫자 중 임의의 둘에 의해 한정되는 범위 내의 임의의 수의 스페로이드, 예를 들어 102 내지 1020, 105 내지 1015, 108 내지 1012, 102 내지 1010, 또는 1010 내지 1020 개 스페로이드인 스페로이드 수로부터 형성된다. 일부 실시양태에서, 사람에 맞게 적당하게 구성된 형상화된 위장 오가노이드는 형상화된 식도 오가노이드, 형상화된 위 오가노이드, 형상화된 위 기저부 오가노이드, 형상화된 위 전정부 오가노이드, 형상화된 소장 (장) 오가노이드, 또는 형상화된 대장 (결장) 오가노이드이다. 일부 실시양태에서, 사람에게 맞게 적당하게 구성된 형상화된 위장 오가노이드는 형상화된 장 오가노이드이다. 일부 실시양태에서, 사람에게 맞게 적당하게 구성된 형상화된 위장 오가노이드는 형상화된 HIO이다.
본원에서 개시된 바와 같이, 일부 실시양태에서는, 스페로이드가 시험관내에서 일정한 조건 하에서 성장하는 것을 허용함으로써, PSC로부터 유래되는 형상화된 위장 오가노이드가 얻어진다. 일부 실시양태에서는, 결과적으로 얻은 형상화된 위장 오가노이드가 짧은 거트, 장부전, 괴사성 장염(NEC), 부상, 궤양, 셀리악병, 크론병, 병원성 감염, 암, 장 폐색, 또는 과민성 대장 증후군, 또는 그의 임의의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 상이한 질병 상태를 연구하거나 또는 치료하는 데 사용될 수 있는 임상적으로 유익한 조직으로서 쓰인다. 일부 실시양태에서는, 결과적으로 얻은 형상화된 위장 오가노이드가 약물 스크리닝, 신경학적 기능, 마이크로바이옴 상호작용, 또는 이식, 또는 그의 임의의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는 식도, 위, 장, 또는 결장 기능을 연구하는 데 사용된다. 일부 실시양태에서는, 결과적으로 얻은 형상화된 위장 오가노이드가 장 기능을 연구하는 데 사용된다. 일부 실시양태에서, 형상화된 위장 오가노이드는 기능성 내강을 포함한다. 일부 실시양태에서, 형상화된 위장 오가노이드는 이식술 시에 추가로 분화하는 능력을 가진다. 일부 실시양태에서는, 형상화된 위장 오가노이드가 시험관내에서 태아기로 성장하고, 이식술 시에 추가로 분화한다. 일부 실시양태에서, 형상화된 위장 오가노이드는 길쭉한 위장 오가노이드이다. 일부 실시양태에서, 형상화된 위장 오가노이드는 길쭉한 장 오가노이드이다. 일부 실시양태에서, 형상화된 위장 오가노이드는 길쭉한 HIO이다. 일부 실시양태에서, 형상화된 위장 오가노이드는 본원에서 기술된 형성 트레이 중 임의의 하나를 사용하여 본원에서 기술된 방법 중 임의의 하나에 따라서 제조된다.
본원에서는 형상화된 위장 오가노이드를 생성하는 방법이 개시된다. 일부 실시양태에서, 형상화된 위장 오가노이드는 내강을 포함한다. 일부 실시양태에서, 형상화된 위장 오가노이드는 본원에서 기술된 바와 같은 길쭉한 위장 오가노이드이다. 일부 실시양태에서, 방법은 복수의 스페로이드를 미리 결정된 형상을 포함하는 수집 채널에 넣는 단계, 및 수집 채널 내의 복수의 스페로이드를 배양하여 복수의 스페로이드를 미리 결정된 형상을 가지는 형상화된 위장 오가노이드로 분화시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 형상화된 위장 오가노이드는 중간엽 및 내강을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중간엽은 응축된 중간엽이다. 일부 실시양태에서, 형상화된 위장 오가노이드는 자발적 혈관분포를 겪는다. 일부 실시양태에서, 복수의 스페로이드는 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 또는 5000 개 스페로이드, 약 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 또는 5000 개 스페로이드, 적어도 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 또는 5000 개 스페로이드, 적어도 약 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 또는 5000 개 스페로이드, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 또는 5000 개 이하 스페로이드, 또는 약 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 또는 5000 개 이하 스페로이드, 또는 전술한 숫자 중 임의의 둘에 의해 한정되는 범위 내의 임의의 수의 스페로이드, 예를 들어, 2500 내지 5000 개 스페로이드, 3000 내지 4000 개 스페로이드, 2500 내지 4000 개 스페로이드, 또는 3000 내지 5000 개 스페로이드인 스페로이드 수를 포함한다. 일부 실시양태에서, 미리 결정된 형상은 길이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 길이는 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25 밀리미터, 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25 밀리미터, 적어도 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25 밀리미터, 적어도 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25 밀리미터, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25 밀리미터 이하, 또는 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25 밀리미터 이하, 또는 전술한 길이 중 임의의 둘에 의해 한정되는 범위 내의 임의의 길이, 예를 들어 10 내지 25 mm, 15 내지 20 mm, 10 내지 20 mm, 또는 15 내지 25 mm이다. 일부 실시양태에서, 길이는 기다란 길이이다. 일부 실시양태에서, 미리 결정된 형상은 직경을 포함한다. 일부 실시양태에서, 직경은 300 μm, 400 μm, 500 μm, 600 μm, 700 μm, 800 μm, 900 μm, 또는 1000 μm, 약 300 μm, 400 μm, 500 μm, 600 μm, 700 μm, 800 μm, 900 μm, 또는 1000 μm, 적어도 300 μm, 400 μm, 500 μm, 600 μm, 700 μm, 800 μm, 900 μm, 또는 1000 μm, 적어도 약 300 μm, 400 μm, 500 μm, 600 μm, 700 μm, 800 μm, 900 μm, 또는 1000 μm, 300 μm, 400 μm, 500 μm, 600 μm, 700 μm, 800 μm, 900 μm, 또는 1000 μm 이하, 또는 약 300 μm, 400 μm, 500 μm, 600 μm, 700 μm, 800 μm, 900 μm, 또는 1000 μm 이하, 또는 전술한 직경 중 임의의 둘에 의해 한정되는 범위 내의 임의의 직경, 예를 들어, 300 μm 내지 1000 μm, 500 μm 내지 800 μm, 300 μm 내지 600 μm, 또는 500 μm 내지 1000 μm이다. 일부 실시양태에서, 직경에 대한 길이의 비는 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100, 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100, 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100, 적어도 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100 이하, 또는 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100 이하, 또는 전술한 비 중 임의의 둘에 의해 한정되는 범위 사이의 임의의 비, 예를 들어 10 내지 100, 30 내지 80, 40 내지 60, 10 내지 50, 또는 50 내지 100이다. 일부 실시양태에서, 위장 오가노이드의 부피는 0.1 mm3, 0.5 mm3, 1 mm3, 2 mm3, 3 mm3, 4 mm3, 5 mm3, 6 mm3, 7 mm3, 8 mm3, 9 mm3, 10 mm3, 11 mm3, 12 mm3, 13 mm3, 14 mm3, 15 mm3, 16 mm3, 17 mm3, 18 mm3, 19 mm3, 20 mm3, 21 mm3, 22 mm3, 23 mm3, 24 mm3, 또는 25 mm3, 약 0.1 mm3, 0.5 mm3, 1 mm3, 2 mm3, 3 mm3, 4 mm3, 5 mm3, 6 mm3, 7 mm3, 8 mm3, 9 mm3, 10 mm3, 11 mm3, 12 mm3, 13 mm3, 14 mm3, 15 mm3, 16 mm3, 17 mm3, 18 mm3, 19 mm3, 20 mm3, 21 mm3, 22 mm3, 23 mm3, 24 mm3, 또는 25 mm3, 적어도 0.1 mm3, 0.5 mm3, 1 mm3, 2 mm3, 3 mm3, 4 mm3, 5 mm3, 6 mm3, 7 mm3, 8 mm3, 9 mm3, 10 mm3, 11 mm3, 12 mm3, 13 mm3, 14 mm3, 15 mm3, 16 mm3, 17 mm3, 18 mm3, 19 mm3, 20 mm3, 21 mm3, 22 mm3, 23 mm3, 24 mm3, 또는 25 mm3, 적어도 약 0.1 mm3, 0.5 mm3, 1 mm3, 2 mm3, 3 mm3, 4 mm3, 5 mm3, 6 mm3, 7 mm3, 8 mm3, 9 mm3, 10 mm3, 11 mm3, 12 mm3, 13 mm3, 14 mm3, 15 mm3, 16 mm3, 17 mm3, 18 mm3, 19 mm3, 20 mm3, 21 mm3, 22 mm3, 23 mm3, 24 mm3, 또는 25 mm3, 0.1 mm3, 0.5 mm3, 1 mm3, 2 mm3, 3 mm3, 4 mm3, 5 mm3, 6 mm3, 7 mm3, 8 mm3, 9 mm3, 10 mm3, 11 mm3, 12 mm3, 13 mm3, 14 mm3, 15 mm3, 16 mm3, 17 mm3, 18 mm3, 19 mm3, 20 mm3, 21 mm3, 22 mm3, 23 mm3, 24 mm3, 또는 25 mm3 이하, 또는 약 0.1 mm3, 0.5 mm3, 1 mm3, 2 mm3, 3 mm3, 4 mm3, 5 mm3, 6 mm3, 7 mm3, 8 mm3, 9 mm3, 10 mm3, 11 mm3, 12 mm3, 13 mm3, 14 mm3, 15 mm3, 16 mm3, 17 mm3, 18 mm3, 19 mm3, 20 mm3, 21 mm3, 22 mm3, 23 mm3, 24 mm3, 또는 25 mm3 이하, 또는 전술한 부피 중 임의의 둘에 의해 한정되는 범위 내의 임의의 부피, 예를 들어 0.1 mm3 내지 25 mm3, 10 mm3 내지 25 mm3, 또는 10 mm3 내지 20 mm3이다. 일부 실시양태에서, 길쭉한 위장 스페로이드는 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 또는 2000 개 스페로이드/mm3, 약 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 또는 2000 개 스페로이드/mm3, 적어도 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 또는 2000 개 스페로이드/mm3, 적어도 약 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 또는 2000 개 스페로이드/mm3, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 또는 2000 개 이하 스페로이드/mm3, 또는 약 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 또는 2000 개 이하 스페로이드/mm3, 또는 전술한 밀도 중 임의의 둘에 의해 한정되는 범위 내의 임의의 밀도, 예를 들어 100 내지 2000 개 스페로이드/mm3, 500 내지 1500 개 스페로이드/mm3, 100 내지 1000 개 스페로이드/mm3, 또는 1000 내지 2000 개 스페로이드/mm3인 밀도로 모인 스페로이드에 의해 구성되거나 또는 그것으로부터 형성된다. 일부 실시양태에서, 수집 채널은 비구형 형상을 가지고, 형상화된 위장 오가노이드는 비구형 위장 오가노이드이다. 일부 실시양태에서, 수집 채널은 길쭉한 형상을 가지고, 형상화된 위장 오가노이드는 길쭉한 위장 오가노이드이다. 일부 실시양태에서, 내강은 형상화된 위장 오가노이드의 길이 전체에 걸쳐서 연속이 아니다. 일부 실시양태에서, 형상화된 위장 오가노이드는 형상화된 사람 위장 오가노이드이다. 일부 실시양태에서, 형상화된 위장 오가노이드는 PBMC 세포, 생검 조직 샘플, 또는 센다이 바이러스-형질도입된 체세포로부터 리프로그래밍된 유도 만능 줄기 세포로부터 유래된다.
일부 실시양태에서는, 복수의 스페로이드가 수집 채널에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30 일, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30 일, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30 일, 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30 일, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30 일 이하, 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30 일 이하인 일 수 동안 배양된다. 일부 실시양태에서는, 복수의 스페로이드가 성장 배지에서 배양된다. 일부 실시양태에서, 성장 배지는 Advanced DMEM-F12이다. 일부 실시양태에서, 성장 배지는 Minigut 배지이다. 일부 실시양태에서는, 성장 배지에 EGF가 보충된다. 일부 실시양태에서는, 성장 배지에 CHIR99021 또는 FGF4, 또는 둘 모두가 보충되지 않는다. 일부 실시양태에서는, 복수의 스페로이드가 중간엽을 포함한다. 일부 실시양태에서는, 복수의 스페로이드가 복수의 스페로이드의 중간엽에서 융합한다.
일부 실시양태에서, 본원에서 기술된 방법은 형상화된 위장 오가노이드에 기계적 변형률을 유도하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 기계적 변형률은 형상화된 위장 오가노이드의 자발적 혈관분포를 촉진시킨다. 일부 실시양태에서, 기계적 변형률은 형상화된 위장 오가노이드의 성숙화 시간을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 기계적 변형률은 일축 인장 변형률이다.
일부 실시양태에서, 형상화된 위장 오가노이드는 장신경세포 또는 장신경전구세포, 또는 둘 모두를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 형상화된 위장 오가노이드는 하나 이상의 근육층신경얼기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 근육층신경얼기는 신경세포 표식자 PGP9.5를 발현하는 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 형상화된 위장 오가노이드는 신경세포 활성을 가진다. 일부 실시양태에서, 형상화된 위장 오가노이드는 중간엽에 의해 둘러싸인 분극된 원주 상피를 포함한다. 일부 실시양태에서, 중간엽은 평활근 유사 층을 포함한다. 일부 실시양태에서, 형상화된 위장 오가노이드는 음와 유사 증식대 또는 융모 유사 구조, 또는 둘 모두로 패터닝된 상피를 포함한다. 일부 실시양태에서, 형상화된 위장 오가노이드는 적층된 종주근 및 윤주근을 포함한다. 일부 실시양태에서, 형상화된 위장 오가노이드는 평활근 또는 장 상피하 근섬유모세포, 또는 둘 모두의 표식자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 형상화된 위장 오가노이드는 장세포, 장내분비세포, 배상세포, 파네스세포, 또는 그의 임의의 조합 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 형상화된 위장 오가노이드는 빌린, Muc2, DEFA5, CHGA, 또는 OLFM4, 또는 그의 임의의 조합 중 하나 이상을 발현하는 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 형상화된 위장 오가노이드는 시험관내에서 혈관화된다. 일부 실시양태에서, 형상화된 위장 오가노이드는 개체에 생착시 혈관화된다.
본원에서는 형성 트레이의 실시양태가 기술된다. 일부 실시양태에서, 형성 트레이는 하나 이상의 위장 오가노이드를 배양하는 데 사용된다. 일부 실시양태에서, 형성 트레이는 하나 이상의 형상화된 위장 오가노이드를 배양하는 데 사용된다. 일부 실시양태에서, 형성 트레이는 하나 이상의 길쭉한 위장 오가노이드를 배양하는 데 사용된다. 일부 실시양태에서, 형성 트레이는 하나 이상의 복수의 스페로이드를 안에 수용하도록 구성된 하나 이상의 수집 채널을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 수집 채널은 길쭉한 형상을 가진다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 수집 채널은 비구형 형상을 가진다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 수집 채널은 하나 이상의 복수의 스페로이드를 함께 모이도록 구성되고, 이렇게 해서 하나 이상의 복수의 스페로이드는 미리 결정된 형상을 한정한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 스페로이드는 미리 결정된 형상을 가지는 하나 이상의 위장 오가노이드로 분화한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 스페로이드는 미리 결정된 형상을 가지는 하나 이상의 길쭉한 위장 오가노이드로 분화한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 수집 채널은 하나 이상의 복수의 스페로이드가 부착하는 것을 억제하도록 구성된 생체적합성 재료로 제조된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 수집 채널은 그 안에 위치한 하나 이상의 복수의 스페로이드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 수집 채널은 세포 배양 배지 또는 세포외 기질, 또는 둘 모두를 그 안에 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 수집 채널은 그 안에 위치한 하나 이상의 위장 오가노이드를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 위장 오가노이드는 본원에서 기술된 방법 중 임의의 하나에 의해 생성되는 하나 이상의 형상화된 위장 오가노이드이다.
본원에서는 키트의 실시양태가 기술된다. 일부 실시양태에서, 키트는 위장 오가노이드를 배양하는 데 사용된다. 일부 실시양태에서, 키트는 하나 이상의 수집 채널을 포함하는 형성 트레이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 형성 트레이는 본원에서 기술된 형성 트레이 중 임의의 하나이다. 일부 실시양태에서, 키트는 형성 트레이의 하나 이상의 수집 채널 내에 수용되도록 구성된 복수의 스페로이드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는 형성 트레이의 하나 이상의 수집 채널 내에 수용되도록 구성된 세포 배양 배지를 포함한다.
이식술 및 치료 방법
일부 실시양태에서, 미리 결정된 기간의 형성 시간 및 본원에서 기술된 바와 같은 형상화된 위장 오가노이드의 생성 후에, 형상화된 위장 오가노이드는 예를 들어 본원에 기술된 바와 같이 치료 또는 실험 모델로서 숙주 유기체에 이식된다. 일부 실시양태에서, 형상화된 위장 오가노이드는 길쭉한 위장 오가노이드이다. 한 실시양태에서, 미리 결정된 기간의 형성 시간 및 형상화된 위장 오가노이드(46)의 생성 후에, 형상화된 위장 오가노이드(46)는 도 5에 나타낸 바와 같이 숙주 유기체(44)에 이식된다. 일부 실시양태에서, 이식은 오가노이드를 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50 일, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50 일, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50 일, 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50 일, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50 일 이하, 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50 일 이하, 또는 전술한 일 수 중 임의의 둘에 의해 한정되는 범위 내의 임의의 배양 일 수, 예를 들어, 1 내지 50 일, 10 내지 40 일, 20 내지 30 일, 1 내지 30 일, 또는 20 내지 50 일인 일 수 동안 배양한 후에 수행된다. 일부 실시양태에서, 이식은 오가노이드를 11, 12, 13, 14, 15, 16, 또는 17 일, 약 11, 12, 13, 14, 15, 16, 또는 17 일, 적어도 11, 12, 13, 14, 15, 16, 또는 17 일, 적어도 약 11, 12, 13, 14, 15, 16, 또는 17 일, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 또는 17 일 이하, 또는 약 11, 12, 13, 14, 15, 16, 또는 17 일 이하인 일 수 동안 배양한 후에 수행된다. 일부 실시양태에서, 형상화된 위장 오가노이드는 관련 분야에서 알려진 다른 방법에 의해 제조된 위장 오가노이드가 동일한 또는 유사한 성숙 상태가 되기 전 일 수 동안 이식술 및/또는 연구에 충분하게 성숙하고, 여기서 일 수는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 일, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 일, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 일, 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 일, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 일 이하, 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 일 이하, 또는 전술한 일 수 중 임의의 둘에 의해 한정되는 범위 내의 임의의 일 수, 예를 들어 1 내지 20 일, 5 내지 15 일, 10 내지 15 일, 1 내지 15 일, 또는 10 내지 20 일이다. 일부 실시양태에서, 숙주 유기체는 포유동물이다. 일부 실시양태에서, 숙주 유기체는 면역결핍 포유동물이다. 일부 실시양태에서, 숙주 유기체는 면역결핍 마우스이다. 일부 실시양태에서, 숙주 유기체는 원숭이, 개, 햄스터, 또는 래트이다. 일부 실시양태에서, 숙주 유기체는 면역손상된 원숭이, 개, 햄스터, 또는 래트이다. 일부 실시양태에서, 숙주 유기체는 사람이다. 일부 실시양태에서, 숙주 유기체는 면역결핍 사람이다. 일부 실시양태에서, 숙주 유기체는 정상 면역을 가진 사람이다. 일부 실시양태에서, 숙주 유기체는 면역억제제로 치료된 정상 면역을 가진 사람이다. 일부 실시양태에서, 숙주 유기체는 정상 면역을 가진 사람이고, 형상화된 위장 오가노이드는 숙주 유기체의 자기유래이다. 일부 실시양태에서, 숙주 유기체는 정상 면역을 가진 사람이고, 형상화된 위장 오가노이드는 숙주 유기체의 동종유래이다. 일부 실시양태에서, 숙주 유기체는 위장 장기 이식을 필요로 하는 포유동물이다. 일부 실시양태에서, 숙주 유기체는 위장 장기 이식을 필요로 하는 사람이다. 일부 실시양태에서는, 위장 오가노이드가 (46)으로 나타낸 또는 본원에서 기술된 형상화된 위장 오가노이드에 불필요하게 제한되는 것을 의도하지 않는다.
일부 실시양태에서, 위장 오가노이드는 일반적으로 구형 위장 오가노이드, 형상화된 위장 오가노이드, 또는 본원에서 기술된 바와 같은 길쭉한 위장 오가노이드이다. 일부 실시양태에서, 위장 오가노이드는 동물의 창자에 인접하게 임플란팅된다. 일부 실시양태에서, 위장 오가노이드는 동물의 장간막 혈관구조 위에 임플란팅된다. 일부 실시양태에서, 위장 오가노이드는 접착제로 고정된다. 일부 실시양태에서, 접착제는 시아노아크릴레이트 글루(glue)이다. 일부 실시양태에서, 위장 오가노이드는 동물의 위장관에 오가노이드-장 문합을 통해 연결된다. 일부 실시양태에서, 문합은 측부-측부 문합 또는 말단-말단 문합이다. 일부 실시양태에서, 위장 오가노이드는 동물에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 또는 60 일, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 또는 60 일, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 또는 60 일, 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 또는 60 일, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 또는 60 일 이하, 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 또는 60 일 이하의 일 수 동안 성장한다. 일부 실시양태에서, 위장 오가노이드는 동시에 제조된 시험관내 위장 오가노이드보다 더 크게 성장한다. 일부 실시양태에서, 위장 오가노이드는 숙주 유기체 조직과의 통합을 나타낸다.
일부 실시양태에서, 위장 오가노이드는 위장 세포 계보를 포함한다. 일부 실시양태에서, 위장 오가노이드는 중간엽, 점액 세포, 벽세포, 주세포(chief cell), 가스트린 세포, 폐포 세포, 장세포, 장내분비세포, 배상세포, 미세주름 세포, 컵 세포(cup cell), 터프트(tuft) 세포, 또는 파네스 세포, 또는 그의 임의의 조합 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 위장 오가노이드는 빌린, MUC2, DEFA5, CHGA, 또는 OLFM4, 또는 그의 임의의 조합 중 하나 이상(예를 들어 1, 3, 5 개)을 발현하는 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 위장 오가노이드는 위장 세포 계보를 자발적으로 발생한다.
일부 실시양태에서, 장 오가노이드는 위장 세포 계보를 포함한다. 일부 실시양태에서, 위장 오가노이드는 중간엽, 장세포, 장내분비세포, 배상세포, 또는 파네스 세포, 또는 그의 임의의 조합 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 장 오가노이드는 빌린, MUC2, DEFA5, CHGA, 또는 OLFM4, 또는 그의 임의의 조합 중 하나 이상(예를 들어 1, 3, 5 개)을 발현하는 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 장 오가노이드는 장 세포 계보를 자발적으로 발생한다.
일부 실시양태에서, 위장 오가노이드는 신경세포 구조를 포함한다. 일부 실시양태에서, 위장 오가노이드는 신경세포 표식자를 발현하는 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 위장 오가노이드는 PGP9.5를 발현하는 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 신경세포 구조 또는 신경세포 표식자를 발현하는 세포를 포함하는 위장 오가노이드는 그의 형성 동안에 임의의 신경세포 계보 세포, 예컨대 신경 능선 세포와 조합되지 않았다. 일부 실시양태에서, 위장 오가노이드는 신경세포 구조를 자발적으로 발생한다. 일부 실시양태에서, 위장 오가노이드는 자발적으로 혈관분포된다. 일부 실시양태에서, 위장 오가노이드는 기계적 변형률을 겪지 않고서 혈관분포된다. 일부 실시양태에서, 위장 오가노이드는 하나 이상의 근육층신경얼기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 위장 오가노이드는 하나 이상의 근육층신경얼기를 자발적으로 발생한다. 일부 실시양태에서, 위장 오가노이드의 근육층신경얼기 크기는 이전 방법(예를 들어 PCT 공개 WO 2016/061464에서 보이는 방법)에 따라 신경 능선 세포와 조합된 위장 오가노이드의 근육층신경얼기 크기보다 크다. 일부 실시양태에서, 위장 오가노이드는 하나 이상의 근육층신경얼기를 총 세포 밀도의 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 또는 20%, 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 또는 20%, 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 또는 20%, 적어도 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 또는 20%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 또는 20% 이하, 또는 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 또는 20% 이하, 또는 전술한 백분율 중 임의의 둘에 의해 한정되는 범위 내의 임의의 백분율, 예를 들어, 1% 내지 20%, 5% 내지 15%, 8% 내지 12%, 1% 내지 15%, 또는 10% 내지 20%인 총 세포 밀도의 백분율로 포함한다.
일부 실시양태에서, 위장 오가노이드는 혈관 또는 내피 구조를 포함한다. 일부 실시양태에서, 위장 오가노이드는 혈관 또는 내피 표식자를 발현하는 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 위장 장기는 임의의 내피 계보 세포와 조합되지 않았다. 일부 실시양태에서, 위장 오가노이드는 혈관 또는 내피 구조를 자발적으로 발생한다. 일부 실시양태에서, 위장 오가노이드는 자발적으로 혈관화된다. 일부 실시양태에서, 혈관 또는 내피 구조는 숙주 유기체로부터 기원한다.
일부 실시양태에서, 위장 오가노이드는 내강을 포함한다. 일부 실시양태에서, 위장 오가노이드는 위장 오가노이드의 총 부피의 백분율을 차지하는 내강을 포함한다. 일부 실시양태에서, 내강은 위장 오가노이드의 총 부피의 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 38%, 39%, 또는 40%, 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 38%, 39%, 또는 40%, 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 38%, 39%, 또는 40%, 적어도 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 38%, 39%, 또는 40%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 38%, 39%, 또는 40% 이하, 또는 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 38%, 39%, 또는 40% 이하, 또는 전술한 백분율 중 임의의 둘에 의해 한정되는 범위 내의 임의의 백분율, 예를 들어 1% 내지 40%, 10% 내지 30%, 15% 내지 20%, 1% 내지 20%, 또는 10% 내지 40%인 위장 오가노이드의 총 부피의 백분율을 차지한다.
일부 실시양태에서, 위장 오가노이드는 통상적인 방법에 의해 생성되는 오가노이드에 비해 유전자의 상향조절을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 위장 오가노이드는 통상적인 방법에 의해 생성되는 오가노이드에 비해 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 또는 800 개 유전자, 약 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 또는 800 개 유전자, 적어도 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 또는 800 개 유전자, 적어도 약 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 또는 800 개 유전자, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 또는 800 개 이하 유전자, 또는 약 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 또는 800 개 이하 유전자, 또는 전술한 유전자 수 중 임의의 둘에 의해 한정되는 범위 내의 임의의 유전자 수, 예를 들어 100 내지 800 개 유전자, 200 내지 600 개 유전자, 300 내지 500 개 유전자, 100 내지 400 개 유전자, 또는 400 내지 800 개 유전자인 유전자 수의 상향조절을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 위장 오가노이드는 통상적인 방법에 의해 생성되는 오가노이드에 비해 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 또는 2000 개 유전자, 약 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 또는 2000 개 유전자, 적어도 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 또는 2000 개 유전자, 적어도 약 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 또는 2000 개 유전자, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 또는 2000 개 이하 유전자, 또는 약 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 또는 2000 개 이하 유전자, 또는 전술한 유전자 수 중 임의의 둘에 의해 한정되는 범위 내의 임의의 유전자 수, 예를 들어 100 내지 2000 개 유전자, 400 내지 1500 개 유전자, 700 내지 1000 개 유전자, 100 내지 1000 개 유전자, 또는 1000 내지 2000 개 유전자인 유전자 수의 하향조절을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 상향조절되는 유전자는 신경세포 분화, 신경발생, 신경세포 생성, 신경세포 프로젝션(projection) 발생, 다세포 유기체 발생 조절, 신경세포 발생, 신경세포 프로젝션 형태발생, 세포 부착, 축삭돌기 발생, 또는 생물학적 부착, 또는 그의 임의의 조합 중 하나 이상(예를 들어, 적어도 1, 3, 5, 10 개)에 관여한다. 일부 실시양태에서, 상향조절되는 유전자는 패턴 특성화 과정, 구역화, 전방/후방 패턴 특성화, 형태발생에 관여하는 해부학상 구조 형성, 동물 장기 형태발생, 배아 발생, 관 형태발생, 상피 발생, 상피 관 형태발생, 배아 형태발생, 순환 계통 발생, 다세포 유기체 과정의 양성 조절, 다세포 유기체 발생의 조절, 관 발생, 혈관구조 발생, 세포 분화 조절, 혈관 발생, 발생 과정의 양성 조절, 소화관 발생, 세포외 기질 구조화, 세포외 구조 구조화, 염증 반응, 생물학적 부착, 세포 부착, 상처에 대한 반응, 세포 증식 조절, 방어 반응, 세포 이동 조절, 운동(locomotion) 조절, 신경세포 분화, 신경세포 생성, 신경발생, 신경세포 프로젝션 발생, 신경세포 발생, 다세포 유기체 발생 조절, 세포 부착, 생물학적 부착, 신경세포 프로젝션 형태발생, 또는 세포 프로젝션 구조화, 또는 그의 임의의 조합 중 하나 이상(예를 들어, 적어도 1, 3, 5, 10 개)에 관여한다.
본원에서는 손상된 위장 기능을 가지는 개체를 치료하거나, 또는 유해한 위장 장애를 호전시키거나 또는 억제하는 것을 필요로 하는 개체에서 손상된 위장 기능을 가지는 개체를 치료하거나, 또는 유해한 위장 장애를 호전시키거나 또는 억제하는 방법이 기술된다. 일부 실시양태에서, 방법은 위장 오가노이드를 개체에 이식하거나 또는 생착시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 위장 오가노이드는 본원에서 기술된 방법 중 임의의 하나의 위장 오가노이드이다. 일부 실시양태에서, 위장 오가노이드는 식도 오가노이드, 위 오가노이드, 위 기저부 오가노이드, 위 전정부 오가노이드, 소장 (장) 오가노이드, 또는 대장 (결장) 오가노이드이다. 일부 실시양태에서, 위장 오가노이드는 장 오가노이드이다. 일부 실시양태에서, 위장 오가노이드는 HIO이다. 일부 실시양태에서, 위장 오가노이드는 본원에서 기술된 방법 중 임의의 하나의 형상화된 위장 오가노이드이다. 일부 실시양태에서, 위장 오가노이드는 본원에서 기술된 방법 중 임의의 하나의 형상화된 또는 길쭉한 위장 오가노이드이다. 일부 실시양태에서, 위장 오가노이드는 개체의 자기유래 또는 동종유래이다. 일부 실시양태에서, 위장 오가노이드는 개체로부터 얻거나 또는 유래된 유도된 만능 세포로부터 제조된다. 일부 실시양태에서, 개체는 위장 이식을 필요로 한다. 일부 실시양태에서, 위장 오가노이드는 전체 위장 오가노이드로서 이식되거나 또는 생착된다. 일부 실시양태에서, 이식 부위는 위장 조직이다.
실시예
위에서 논의된 실시양태들의 일부 측면을 다음 실시예에서 더 상세하게 개시하고, 실시예들이 본 개시물의 범위를 제한하는 것을 결코 의도하지 않는다. 관련 분야의 종사자는 본원에서 위에서 및 청구범위에서 기술된 것처럼 많은 다른 실시양태가 또한 본 발명의 범위 내임을 인식할 것이다.
실시예 1. 사람 체조직(생검 또는 혈액)으로부터 iPSC 생성
사람 체세포를 수집해서 iPSC 생성에 이용하였다. Ficoll 원심분리에 의한 신선한 전혈로부터의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 분획 또는 해동된 동결보존 PBMC가 출발 재료였다. PBMC를 2 mL의 Erythroid Expansion Media(EEM) 중의 1 - 5 × 106 개 세포로 6-웰 접시의 단일의 웰에 도말하고, 24 hr 동안 37 ℃, 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 제2일에, 2 mL 부유액을 비부착성 세포를 선택하기 위해 새로운 6-웰 접시에 옮겼다. 비부착성 세포를 5 일 동안 37 ℃, 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 그 다음 5 일 동안, 1 mL의 신선한 EEM을 각 세포-함유 웰에 격일로 첨가하였다. 제7일에, 2 mL의 0.1% 젤라틴을 공여자 당 새로운 6-웰 플레이트에 첨가하고, 37 ℃, 5% CO2 인큐베이터에 밤새 두었다. 제8일에, 약 187,500 개 조사된 마우스 배아 섬유모세포(MEF)를 젤라틴-코팅된 6-웰 플레이트(PBMC 공여자 당 1 개 웰)에 놓았다.
제9일에, PBMC에 센다이 바이러스를 형질도입하였다. 각 샘플에 형질도입하기 위해, 3 × 105 개 세포를 14 mL 둥근 바닥 관에 500 μL 이하 부피의 EEM에 옮겼다. 사람 Klf4, Oct3/4, Sox2(KOS), 사람 L-Myc(hL-Myc), 및 사람 Klf4(hKlf4) 전이유전자(CTS CytoTune 2.1, Invitrogen)를 포함하는 센다이 바이러스 마스터 믹스를 성분비 (MOI × 세포 수)/(바이러스의 역가 × 10-3 mL/μL))로 제조하였고, 여기서 KOS의 MOI는 2.5이고, hL-Myc의 MOI는 2.5이고, hKlf4의 MOI는 1.5이다. MOI [감염 다중도]는 세포 당 세포 감염 단위(CIU)를 지칭하고, 바이러스의 역가는 바이러스의 제조물마다 다르다. 마스터 믹스를 37 ℃까지 따뜻해지게 한다. 1 mL의 센다이 바이러스 마스터 믹스를 둥근 바닥 관 내의 각 샘플에 첨가한다. 샘플을 1000×g로 30 분 동안 실온에서 원심분리한다. 원심분리 후, 1 mL의 따뜻한 EEM을 각 관에 첨가하고, 세포를 온화하게 재부유시키고, 전체 부피를 12-웰 플레이트의 하나의 웰에 도말한다. 샘플을 함유하는 플레이트를 37 ℃, 5% CO2 인큐베이터에 넣는다.
제10일에, 세포 및 배지를 12-웰 플레이트로부터 수집해서 15 mL 원뿔형 관에 옮긴다. 웰을 1 mL의 신선한 EEM으로 헹구어서 확실하게 모든 세포가 수집되게 하였다. 관을 200×g로 5 분 동안 실온에서 원심분리하여 세포로부터 센다이 바이러스를 제거한다. 원심분리 후, 상층액을 15% 표백제 소독제에 폐기하여 바이러스를 불활성화한다. 세포 펠릿을 0.5 mL의 EEM에 재부유시키고, 24-웰 플레이트의 하나의 웰에 도말한다. 세포를 48 시간 동안 37 ℃, 5% CO2에서 인큐베이션한다. 젤라틴 코팅된 6-웰 접시를 위 과정에 따라서 형질도입된 각 샘플에 대해 준비하였다.
제11일에, 젤라틴 코팅된 플레이트로부터 젤라틴을 흡인하고, 즉시 약 187,500개 조사된 MEF를 젤라틴 코팅된 플레이트 상의 MEF 배지에 도말한다. MEF를 24 hr 동안 37 ℃, 5% CO2에서 인큐베이션한다.
제12일에, MEF 배지를 제거하고, MEF 플레이트를 각 웰에 대해 2 mL의 PBS로 2 회 헹군다. 2.5 mL의 StemPro 34 SFM 배지를 각 MEF 웰에 첨가한다. 살아있는 세포 계수를 형질도입된 샘플에서 수행하여 PBMC의 총 수를 결정한다. PBMC를 MEF-코팅된 웰에 4 가지 농도(세포/웰)로 재도말한다: 5 × 103, 1 × 105, 2.5 × 105, 및 5 × 105. 세포를 24 hr 동안 37 ℃, 5% CO2에서 인큐베이션한다.
제13일 및 제15일에, 웰로부터 배지의 ~50%를 제거하고, 같은 부피의 신선한 StemPro 34 SFM 배지를 첨가함으로써 50% 배지 변화를 수행한다.
제16일에, 웰로부터 배지의 ~50%를 제거하고, 같은 부피의 StemPro hESC 배지 + bFGF(2 μg/mL)를 첨가함으로써 50% 배지 변화를 수행한다.
제17일 - 제40일에, 신선한 hESC 배지 + bFGF(2 μg/mL)로 전체 배지 변화를 매일 수행하고, 세포를 콜로니 형성에 대해 모니터링한다(일반적으로 대략 21-28 일). 일단 세포들이 요망되는 상태에 도달하면, 그들은 향후 사용을 위해 바이알 당 대략 1 - 2 백만 개 세포로 1.5 mL 동결바이알 중의 1 mL의 동결보존 배지에서 냉동될 수 있다.
실시예 2. 비형상화된 사람 장 오가노이드(HIO) 생성
hESC 또는 hiPSC일 수 있는 사람 PSC를 피더가 없는 조건에서 hESC-적격 Matrigel(Corning)로 코팅된 6-웰 Nunclon Delta 표면 처리된 조직 배양물 접시(Nunc)에서 배양하고, mTeSR1 배지(StemCell Technologies)에서 유지한다. hPSC를 먼저 "클럼프 통과"의 경우에는 Dispase(Thermo Fisher)와 함께 또는 "단일 세포 통과"의 경우에는 Accutase(Thermo Fisher)와 함께 통과시켰고, 그 다음에 mTeSR1 배지를 갖는 hESC-적격 Matrigel-코팅된 Nunclon 24-웰 플레이트에서 "높은" 또는 "낮은" 컨플루언스로 재도말한다. 단일 세포 통과를 겪은 hPSC를 위한 mTeSR1 배지에 제1일 동안에만 10 μM Y-27632 디히드로클로라이드(Rho-관련 코일드-코일(coiled-coil) 함유 단백질 키나제(ROCK) 억제제, Tocris)를 보충한다. 낮은 컨플루언스로 통과한 hPSC는 제2일의 mTeSR1 배지를 받아서 단층이 80-95% 컨플루언스에 도달하는 것을 허용하고, 반면에 높은 컨플루언스로 hPSC 통과는제1일 후에 이미 80-95% 컨플루언스가 될 것으로 예상된다.
세포는 RPMI 1640 배지(Invitrogen) 중의 100 ng/mL의 Activin A(Cell Guidance Systems)로 3 일 동안 처리함으로써 완전 내배엽으로 분화된다. RPMI 1640 배지에 1x NEAA(Invitrogen), 및 Activin A 처리 제1일, 제2일 및 제3일에 각각 0%, 0.2%, 및 2.0%의 증가하는 농도의 규정된 FBS(dFBS, Hyclone)를 보충한다. 추가로, 낮은 농도의 BMP4(1-15 ng/mL의 BMP4(R&D Systems)를 Activin A 처리 제1일에 보충할 수 있거나 또는 보충할 수 없다. 이에 뒤따라서, 그 다음에 DE 단층을 중-후장 스페로이드 유도 배지로 4 일 동안 처리한다. 중-후장 스페로이드 유도 배지는 1x NEAA 및 2.0% dFBS가 보충된 RPMI 1640 중의 3 μM CHIR99021(글리코겐 생성효소 키나제 3(GSK3) 억제제, Stemgent) 및 500 ng/mL의 FGF4(R&D Systems)를 포함한다 .
4 일의 중장-후장 스페로이드 유도 후에, 자유-부동 스페로이드를 수집해서 3D 기저막 Matrigel "돔/버블"(dome/bubble)에 포매하고, 그 다음에 뒤이어서 기초 거트 배지에서 유지한다. 기초 거트 배지는 Advanced DMEM-F12(Invitrogen), 1x N2 보충물(Invitrogen), 비타민 A가 없는 1x B27 보충물(Thermo Fisher), 15 mM HEPES(Life Technologies), 2 mM L-글루타민(Life Technologies), 및 100 units/mL(1x) 페니실린-스트렙토마이신(Life Technologies)을 포함하고, 100 ng/mL 상피 성장 인자(EGF, R&D Systems)가 보충된다. 배지를 대략 2 주 동안 3-4 일마다 또는 배지가 pH 때문에 황색으로 변할 때마다 중 어느 것이든 먼저 일어나는 시점에 교체한다. 그 다음에 HIO를 신선한 Matrigel에 Matrigel 돔 당 더 적은 오가노이드로 재도말하여 계속되는 팽창을 허용한다. 동일한 기초 거트 배지 처리 일정을 대표적으로 또 다시 2 주 동안 유지하고, 장기 배양이 가능하다.
결과적으로 얻은 HIO는 평활근 유사 층을 포함하는 중간엽에 의해 둘러싸인 분극된 원주 상피를 포함하는 3 차원 구조(도 6a)이다. 상피는 음와 유사 증식대 및 융모 유사 구조로 패터닝되고, 중간엽은 적층된 종주근 및 윤주근, 뿐만 아니라 장의 주요 기능성 세포 유형 모두를 갖는 고유판으로 패터닝된다. 추가로, 본원의 방법으로 배양된 오가노이드는 층상화 중간엽을 함유하고, 이들 조직이 장에 생착하는 능력에 필수적인 평활근 및 장 상피하 근섬유모세포의 표식자를 발현하고, 또한 태아 장 모르폴로지를 닮는다(도 6b). HIO 중간엽 분화가 상피 분화에 선행하고, 그들이 그들 자체의 벽와를 생성하고 이해한다는 것을 지시한다.
실시예 3. 형상화된 길쭉한 HIO 생성
본원에서 기술된 수집 채널 실시양태를 사용하는 시험관내 감금 프로토콜은 예컨대 면역손상된 동물 모델에의 이식술에 적합한 연속 원통형 오가노이드 구조를 생성한다. 성공적 생착 전에 시험관내에서 요구되는 시간 양이 실시예 2의 HIO 생성 프로토콜과 비교할 때 대략 14 일 감소된다는 것이 관찰된다.
도 7a는 원통형 장 오가노이드 구조를 형성하는 방법론을 묘사한다. hPSC는 배양되어, 완전 내배엽으로 유도되고, 본원에서 기술된 바와 같은 장 스페로이드로 분화된다. 스페로이드를 수집할 때, 그들을 70 μm 기공 크기를 통해 여과시켜서 70 μm보다 큰 스페로이드를 보유하고 더 작은 스페로이드를 폐기한다. 이 크기 컷오프(cutoff)가 HIO를 형성하는 더 좋은 능력을 가지는 것으로 여겨지지만, 다른 조직 유형의 경우에는 상이할 수 있다. 보유된 스페로이드를 2 mL의 Minigut 배지에 재부유시키고, 50 μL 샘플을 채취하여 현미경 관찰로 스페로이드의 수를 정량화하였다. 정량화에 기반하여, 스페로이드의 총 수를 추정하였다. Minigut 배지로 희석된 50% Matrigel 중의 수집 채널의 그루브 당 대략 3000-4000 개 스페로이드를 파종하였다. 사용되는 스페로이드의 수는 그루브의 기하학적 구조에 의존할 것이고; 스페로이드는 그루브에 빽빽하게 채워져야 한다. 본원에서 개시된 매개변수는 0.5 mm의 직경 및 15 mm의 길이를 갖는 반구 단면을 갖는 그루브를 위한 것이다.
스페로이드를 함유하는 수집 채널을 37 ℃에서 30-45 분 동안 인큐베이션하였다. 각 수집 채널에 100 ng/mL EGF가 보충된 5 mL의 Minigut 배지를 첨가하였다. 배지를 배양 제4일에 신선한 배지로 교체하였다. 배양 제6일에, Dumont #4 포셉을 사용하여 오가노이드 구조를 그루브로부터 조심스럽게 제거하였다. 오가노이드 구조를 Tissue Train Culture Plate의 웰에 넣었고, 그 구조를 나일론 메쉬 탭 사이에 정렬하였다. 200-400 μL의 성장 인자 감소(GFR) Matrigel(Corning)을 플레이트에 첨가하고, 나일론 메쉬 탭 및 그 사이의 오가노이드 둘 모두를 덮었다. 플레이트를 37 ℃에서 90 분 동안 인큐베이션하였다. 각 웰에 100 ng/mL EGF가 보충된 6 mL의 Minigut 배지를 첨가하였다. 배지를 제14일까지 1 주 2 회 신선한 배지로 교체하였다.
도 7b는 수집 채널 그루브 내에서 형상화된 길쭉한 장 오가노이드(g-HIO)의 시험관내 성장의 진행을 면역조직화학에 의해 보여준다. 제6일, 제14일, 및 제28일 g-HIO 구조의 헤마톡실린 및 에오신 염색 절편.
재료: mTeSR1 배지(StemCell Technologies); Advanced DMEM-F12(Invitrogen); RPMI 1640(Invitrogen); hESC 적격 Matrigel(Corning); 규정된 FBS(Hyclone); L-글루타민(100x)(Invitrogen); 페니실린-스트렙토마이신(100x)(Invitrogen); 50x B27 보충물(Invitrogen); HEPES 완충제(Invitrogen); Dispase(Invitrogen); Activin A(R&D Systems); FGF4(R&D Systems); CHIR99021(R&D Systems); 적당한 크기의 그루브를 갖는 폴리디메틸실록산(PDMS) 조직 배양 수집 채널 스캐폴드; GFR Matrigel, 페놀 레드 무함유(Corning); Minigut 배지: 2 mM 글루타민, 10 mM HEPES, 100 U/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신, 1x N2 보충물, 1x B27 보충물이 보충된 Advanced DMEM-F12 배지; 사람 재조합 EGF(R&D Systems); Dumont #4 포셉(Fine Science Tools); 나일론 메쉬 앵커를 갖는 Tissue Train Culture Plates(FlexCell International).
대안적 수집 채널 스캐폴드가 머시닝(machining) 가공 또는 3D 프린터를 사용하여 폭넓은 범위의 재료, 예컨대 금속, 유리, 플라스틱(예를 들어 아크릴로니트릴 부타디엔 스티렌(ABS), PLA, PP, PC, PS, PET, 나일론, PE, 폴리우레탄, PVC, PVDC, PTFE, 폴리에스테르, PMMA, PEEK, PEI)으로 제작될 수 있는 것으로 구상된다. 일부 실시양태에서는, 처음에 스캐폴드를 만들고 이것을 사용해서 몰드를 제조하고, 이렇게 해서 유사하게 형상화된 스캐폴드가 생물학적 불활성 또는 일반적으로 생물학적 불활성 재료 예컨대 PDMS 또는 다른 실리콘으로 제조될 수 있다.
실시예 4. HIO의 이식술
면역손상된 마우스를 항생제 차우(chow)(275 ppm 설파메톡사졸 및 1365 ppm 트리메토프림)로 길렀다. 음식물 및 물을 수술 전 및 후에 임의로 제공하였다. 마우스를 2% 흡입 이소플루란으로 마취시키고, 복벽을 멸균 방식으로 이소프로필 알콜 및 포비돈-아이오딘으로 수술 준비하였다. 1 - 2 cm 중간선을 절개하여 복강에 접근하였다. 맹장을 확인하고 온화하게 떼어냈고, 결장 및 소장이 뒤따랐다. 장간막을 벌리고 원위 회장 및 상행 결장을 확인하였다. 장간막 맥관을 회맹장 연접부로부터 1 - 2 아케이드(arcade) 분기시키는 위치에, 한 방울의 옥틸/부틸 시아노아크릴레이트 접착제 글루를 놓고, HIO를 글루 위에 적하하여 제자리에서 최소 3 분 동안 건조하도록 허용하였다. 오가노이드 구조를 창자에 인접해서 장간막 혈관구조보다 높게 위치시켰다. 그 다음에 장을 복강에 되돌려 놓고, 마우스에게 피페라실린/타조박탐(100 mg/kg)의 복막내 플러쉬를 주었다. 피부를 이중층으로 닫고, 마우스에게 부프레넥스(0.05 mg/kg)의 피하 주사를 주었다. 마우스의 생존을 10주까지 실행하였고, 이 시점에서 마우스를 인도적으로 안락사시켰다. 오가노이드 이식편을 절제해서 조직학을 위해 가공하였다. 오가노이드의 성공적 생착 및 사람 PSC-유래 조직과 인접하는 마우스 숙주 조직의 통합을 관찰한다(도 8a-b). 완전한 형상화된 g-HIO는 면역손상된 래트에 임플란팅될 때 성공적인 생착 및 혈관화를 보여주었다 (도 8c). 이전 방법(예를 들어 WO 2016/061464)에 따라서 제조된 비형상화된 HIO의 이식술은 면역손상된 래트에 생착하지 못했다.
HIO의 퍼센트 생착 및 크기를 측정하였다. 전체 생존률은 85%(n=17/20)였고, 82%(n=14/17)는 숙주 장간막과의 성공적 HIO 생착을 가졌다. 이식된 오가노이드(tHIO)는 시간 매칭되는(time matched) 시험관내 HIO보다 대략 46 배 더 컸다(도 9a-b). 이것의 조직학적 분석은 상피하 요소 및 근육층을 갖는 천연적으로 생기는 중간엽, 뿐만 아니라 사람 장과 유사한 중간엽, 장세포, 장내분비세포, 배상세포, 및 파네스 세포를 포함하는 주요 세포 계보가 존재하는 상피의 연속 팽창을 확인하였다(도 9c).
임의로, 마우스는 오가노이드-장 문합을 겪었다. 최초 오가노이드 이식에 뒤이은 제2 수술에서, 오가노이드 및 인접하는 작은 창자를 확인하고 복강으로부터 제거하였다. 측부-측부 문합을 9-0 나일론을 사용해서 단속된 방식으로 수행하였다. 완료시, 문합을 총 누출에 대해 평가하였고, 비틀림을 피하도록 조심하면서 장을 복강 안에 다시 놓았다. 수확시 마우스(n=6) 중 50%가 21일까지 생존하였다(도 9d).
추가 검사 후, 수집 채널에서 배양 후 NSG 마우스에 임플란팅된 길쭉한 장 오가노이드(그루브-tHIO, g-tHIO)는 생착시 신경세포 구조를 자발적으로 발생하였다(도 9e, 항-PGP9.5 항체를 범-신경세포 표식자로서 사용함). 장신경계의 신경세포의 주요 집합인 근육층신경얼기의 견고한 망을 이식된 g-tHIO 전체에 걸쳐서 관찰한다. 중-후장 스페로이드를 PSC-유래 신경 능선 세포(NCC)와 기계적으로 응집시킴으로써 장 오가노이드가 신경분포될 수 있다는 것이 이전에 밝혀졌다(WO 2016/061464 참조). 이제 본원에서는 PSC로부터 생성되고 본원에서 제공된 프로토콜에 따라서 제조된 장 오가노이드가 별도의 NCC 첨가 없이 장 신경계 구조를 발생한다는 것을 입증한다. 게다가, 임플란팅된 g-tHIO의 신경얼기 크기는 이전의 스페로이드/NCC 응집체 오가노이드에서 보이는 것보다 일관되게 더 크다.
재료: 마우스: 암컷 또는 수컷 면역손상된 NSG(NOD-scid IL2Rgammanull) 마우스를 마이크로아이솔레이터(microisolator) 시스템의 장벽 시설에 넣어 두었다. 사용된 마우스는 6 내지 14 주령이었다. 다른 면역손상된 동물 모델, 예컨대 다른 면역손상된 마우스 모델 또는 면역손상된 원숭이, 개, 햄스터, 또는 래트 모델이 구상된다. 사료: 변형된 차우 사료(Picolab Rodent Diet 20, LabDiet)에 275 ppm 설파메톡사졸 및 1365 ppm 트리메토프림(LabDiet)을 보충한다. 측부-측부 문합 수술에는 액체 사료가 사용된다(Jevity 1 Cal). 0.3 mg/mL의 275 ppm 설파메톡사졸 및 1365 ppm 트리메토프림(Bactrim)을 멸균수에서 희석시키고, 측부-측부 문합 후 임의로 주었다. 항균 약물: 100 mg/kg의 피페라실린 및 토조박탐을 멸균 식염수 용액에서 희석시키고 임의의 수술에 사용한다(ZOSYN, Pfizer). 수술 기구(Fine Science Tools): 봉합 결찰 포셉, 링 포셉, 해부용 가위, Bishop-Harmon 포셉, Halsey 니들 홀더, 멸균화 트레이. 이소플루란 및 마취 시스템. 멸균성 7-0 비흡수성 실크 봉합사(PERMA-HAND), 멸균성 4-0 코팅된 흡수성 봉합사(VICRYL RAPIDE), 테이퍼 컷 바늘을 갖는 멸균성 9-0 비흡수성 나일론 봉합사(ETHILON), 옥틸/부틸 시아노아크릴레이트 국소 조직 접착제(GLUture).
면역조직화학: 이식된 HIO를 수확하고, 4% 파라포름알데히드(PFA)에서 밤새 고착시키고, 그 다음에 가공하고 파라핀에 포매하였다. 조직의 5 μm 두께 절편의 슬라이드를 만들고 탈파라핀하였고, 그 다음에 열 유도 에피토프 복원 및 염색을 수행하였다. 일차 및 이차 항체 둘 모두의 인큐베이션은 4 ℃에서 밤새 인산염 완충 염수(PBS) 중의 1% 소 혈청 알부민에서 일어났다. 다음 일차 항체들 및 그들의 각 희석물을 사용하였다: 염소 항-빌린 (1:100), 마우스 항-HuMuc2 (1:1250), 마우스 항-DEFA5 (1:500), 마우스 항-CHGA (1:500) 및 토끼 항-OLFM4 (1:400). 다음 이차 항체를 사용하였다: 말 항-염소 비오틴 (1:1000), 말 항-마우스 비오틴 (1:1000) 및 염소 항-토끼 비오틴 (1:1000). 퍼옥시다제 기반 검출 시스템이 사용되었고, 그 다음에 핵 고속 적색(NUC)이 대비염색제로 사용되었다(Vector Labs; Polysciences, Inc).
실시예 5. 형상화된 장 오가노이드의 전사체학적 프로파일링
중장-후장 스페로이드, 비형상화된 장 오가노이드, 및 형상화된 길쭉한 장 오가노이드의 유전자 발현 프로파일을 평가하였다. 제28일 배양 g-HIO는 제28일 배양 비형상화된 HIO에 비해 499 개 상향조절된 유전자 및 1546 개 하향조절된 유전자를 나타냈고(도 10a), 수집 채널에서 오가노이드 형상화 과정이 구성 세포에서 생물학적 활성을 상당히 변경시킨다는 것을 입증한다. 신경세포 분화, 신경발생, 신경세포의 생성, 신경세포 프로젝션 발생, 다세포 유기체 발생의 조절, 신경세포 발생, 신경세포 프로젝션 형태발생, 세포 부착, 축삭돌기 발생, 및 생물학적 부착과 관련된 유전자는 g-HIO에서 자발적 신경발생 뿐만 아니라 성숙한 장기-조직 유사 상태로의 오가노이드의 발생을 지지한다.
상이한 배양 시간(제0일[스페로이드], 제6일, 제14일, 및 제28일)에서 수집 채널에서 성장한 g-HIO의 유전자 발현 프로파일을 또한 평가하였다(도 10b). 각 성장기는 상이한 생물학적 과정과 관련된 유전자의 풍부화를 나타냈다(도 10c). 제0일 스페로이드는 형태발생, 동물 장기 형태발생, 배아 발생, 관 형태발생, 상피 발생, 상피 관 형태발생, 및 배아 형태발생에 관여하는 패턴 특성화 과정, 구역화, 전방/후방 패턴 특성화, 해부학적 구조 형성과 관련되었다. 제6일 g-HIO는 순환계 발생, 다세포 유기체 과정의 양성 조절, 다세포 유기체 발생의 조절, 관 발생, 혈관구조 발생, 세포 분화의 조절, 혈관 발생, 발생 과정의 양성 조절, 및 소화관 발생과 관련되었다. 제14일 g-HIO는 세포외 기질 구조화, 세포외 구조 구조화, 염증 반응, 생물학적 부착, 세포 부착, 상처에 대한 반응, 세포 증식의 조절, 방어 반응, 세포 이동의 조절, 및 운동의 조절과 관련되었다. 제28일 g-HIO는 신경세포 분화, 신경세포의 생성, 신경발생, 신경세포 프로젝션 발생, 신경세포 발생, 다세포 유기체 발생의 조절, 세포 부착, 생물학적 부착, 신경세포 프로젝션 형태발생, 및 세포 프로젝션 구조화와 관련되었다. 이들 데이터는 상당한 발생 및 모르폴로지 변화가 오가노이드 배양 기간 동안에 일어나며, 장 조직의 생체내 발생을 닮는다는 것을 제시한다.
이전에 기술된 실시양태들 중 적어도 일부에서, 한 실시양태에서 사용되는 하나 이상의 요소는 그러한 대체가 기술적으로 실행가능하지 않지 않으면 또 다른 실시양태에서 호환가능하게 사용될 수 있다. 관련 분야의 숙련된 자는 청구된 주제의 범위에서 벗어남이 없이 위에서 기술된 방법 및 구조에 다양한 다른 생략, 첨가 및 변형을 할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 모든 그러한 변형 및 변화가 첨부된 청구범위에 의해 한정되는 주제의 범위 내인 것을 의도한다.
본원에서 실질적으로 임의의 복수 및/또는 단수 용어의 사용과 관련해서, 관련 분야의 기술을 가진 자는 문맥 및/또는 응용에 적당하게 복수를 단수로 및/또는 단수를 복수로 번역할 수 있다. 다양한 단수/복수 순열이 본원에서는 명료성을 위해 분명히 제시될 수 있다.
관련 분야의 종사자는 일반적으로 본원에서 및 특히, 첨부된 청구범위(예를 들어, 첨부된 청구범위의 본체부)에서 사용되는 용어가 일반적으로 "개방형" 용어로서 의도된다는 것을 이해할 것이다(예를 들어, 용어 "포함하는"(including)은 "포함하지만 이에 제한되지 않는"으로 해석되어야 하고, 용어 "가지는"은 "적어도 가지는"으로 해석되어야 하고, 용어 "포함한다"는 "포함하지만 이에 제한되지 않는다"는 것으로 해석되어야 하고, 기타 등등이 있다). 추가로 관련 분야의 종사자는 도입된 청구범위 나열의 특정 번호가 의도되는 경우, 그러한 의도가 청구범위에 분명히 나열될 것이고, 그러한 나열이 없는 경우에는 그러한 의도가 존재하지 않는다는 것을 추가로 이해할 것이다. 예를 들어, 이해를 돕는 것으로서, 다음 첨부된 청구범위는 청구항 나열을 도입하기 위해 도입 어구 "적어도 하나" 및 "하나 이상"의 사용을 함유할 수 있다. 그러나, 심지어 동일한 청구항이 도입 어구 "하나 이상" 또는 "적어도 하나" 및 부정관사 예컨대 " a" 및 "an"(예를 들어 "a" 및/또는 "an"은 "적어도 하나" 또는 "하나 이상"을 의미하는 것으로 해석되어야 함)을 포함할 때조차도, 그러한 어구의 사용은 부정관사 "a" 또는 "an"에 의한 청구항 나열의 도입이 그러한 도입된 청구항 나열을 함유하는 임의의 특별한 청구항을 단지 하나의 그러한 나열을 함유하는 실시양태으로 제한하는 것을 암시하는 것으로 해석되지 않아야 하고; 동일한 것이 청구항 나열을 도입하는 데 사용되는 정관사의 사용에도 유효하다. 추가로, 비록 도입된 청구항 나열의 특정한 번호가 명시적으로 나열될지라도, 관련 분야의 숙련된 자는 그러한 나열이 적어도 나열된 번호를 의미하는 것으로 해석되어야 한다는 것을 인식할 것이다(예를 들어, 다른 수식어가 없는 "2개 나열"의 가장 기본적인 나열은 적어도 2개 나열, 또는 2개 이상 나열을 의미한다). 게다가, "A, B 및 C 등 중 적어도 하나"와 유사한 관습적 표현(convention)이 사용되는 경우에서, 일반적으로 그러한 구성은 관련 분야의 기술을 가진 자가 그 관습적 표현을 이해할 것이라는 의미로 의도된다(예를 들어, "A, B, 및 C 중 적어도 하나를 가지는 시스템"은 A 단독, B 단독, C 단독, A 및 B 함께, A 및 C 함께, B 및 C 함께, 및/또는 A, B, 및 C 함께 등을 가지는 시스템을 포함하지만 이에 제한되지 않을 것이다). "A, B, 또는 C 등 중 적어도 하나"와 유사한 관습적 표현이 사용되는 경우에서, 일반적으로 그러한 구성은 관련 분야의 기술을 가진 자가 그 관습적 표현을 이해할 것이라는 의미로 의도된다(예를 들어, "A, B, 또는 C 중 적어도 하나를 가지는 시스템"은 A 단독, B 단독, C 단독, A 및 B 함께, A 및 C 함께, B 및 C 함께, 및/또는 A, B, 및 C 함께 등을 가지는 시스템을 포함하지만 이에 제한되지 않을 것이다). 관련 분야의 종사자는 명세서에서든, 청구범위에서든, 또는 도면에서든 둘 이상의 대안적 용어를 제시하는 사실상 임의의 이접 단어 및/또는 어구는 용어들 중 하나, 용어들 중 어느 하나, 또는 두 용어 모두를 포함하는 가능성을 고려하는 것으로 이해해야 한다는 것을 추가로 이해할 것이다. 예를 들어, 어구 "A 또는 B"는 "A" 또는 "B" 또는 "A 및 B"의 가능성을 포함하는 것으로 이해될 것이다.
추가로, 본 개시물의 특징 또는 측면이 마쿠시 그룹으로 기술되는 경우, 관련 분야의 숙련된 자는 개시물이 또한 그에 의해 마쿠시 그룹의 구성원들의 임의의 개별 구성원 또는 구성원들의 하위그룹으로 기술된다는 것을 인식할 것이다.
관련 분야의 숙련된 자가 이해하는 바와 같이, 임의의 및 모든 목적을 위해, 예컨대 서면 설명을 제공한다는 면에서, 본원에서 개시된 모든 범위는 또한 임의의 및 모든 가능한 하위범위 및 그의 하위범위의 조합을 포함한다. 임의의 열거된 범위는 동일한 범위가 적어도 2 등분, 3 등분, 4 등분, 5 등분, 10 등분 등으로 쪼개지는 것을 충분히 기술하고 가능하게 하는 것으로 쉽게 인식될 수 있다. 비제한적 예로서, 본원에서 논의된 각 범위는 하위 1/3, 중간 1/3 및 상위 1/3 등으로 쉽게 쪼개질 수 있다. 또한 관련 분야의 숙련된 자가 이해하는 바와 같이, 모든 언어 예컨대 "이하", "적어도", "초과", "미만" 등은 나열된 숫자를 포함하고, 위에서 논의된 바와 같이 하위범위로 나중에 쪼개질 수 있는 범위를 지칭한다. 최종적으로, 관련 분야의 숙련된 자가 이해하는 바와 같이, 범위는 각 개별 숫자를 포함한다. 따라서, 예를 들어 1-3 개 항목을 가지는 군은 1, 2, 또는 3 개 항목을 가지는 군을 지칭한다. 마찬가지로, 1-5 개 항목을 가지는 군은 1, 2, 3, 4, 또는 5개 항목을 가지는 군을 지칭하고, 기타 등등이 있다.
다양한 측면 및 실시양태가 본원에서 개시되지만, 다른 측면 및 실시양태가 관련 분야의 숙련된 자에게 분명할 것이다. 본원에서 개시된 다양한 측면 및 실시양태는 예시 목적이고 제한하는 것으로 의도되지 않으며, 진정한 범위 및 정신은 다음 청구범위에 의해 지시된다.
공개된 및 비공개된 출원, 특허, 및 참고 문헌을 포함하지만 이에 제한되지 않는 본원에서 인용된 모든 참고문헌은 그 전체가 본원에 참고로 포함되고, 이로써 본 명세서의 일부가 된다. 참고로 포함된 간행물 및 특허 또는 특허 출원이 본 명세서에 함유된 개시물과 모순될 경우, 본 명세서가 임의의 그러한 모순되는 자료를 대신하고/거나 그 자료보다 우위에 있다는 것을 의도한다.
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Claims (54)

  1. 복수의 스페로이드를 미리 결정된 형상을 포함하는 수집 채널 안에 넣는 단계; 및
    복수의 스페로이드를 수집 채널에서 배양하여 복수의 스페로이드를 미리 결정된 형상을 가지는 형상화된 위장 오가노이드로 분화시키는 단계;
    를 포함하고,
    여기서 상기 형상화된 위장 오가노이드가 응축된 중간엽 및 내강을 포함하는 것인, 내강을 포함하는 형상화된 위장 오가노이드 생성 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 수집 채널이 비구형 형상을 가지고, 형상화된 위장 오가노이드가 비구형 위장 오가노이드인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 수집 채널이 길쭉한 형상을 가지고, 형상화된 위장 오가노이드가 길쭉한 위장 오가노이드인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 길쭉한 위장 오가노이드가 기다란 길이 및 직경을 포함하는 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 기다란 길이가 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50 밀리미터이거나, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50 밀리미터이거나, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50 밀리미터이거나, 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50 밀리미터이거나, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50 밀리미터 이하이거나, 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50 밀리미터 이하이거나, 또는 전술한 길이 중 임의의 둘에 의해 한정되는 범위 내의 임의의 길이, 예를 들어 1 내지 50 mm, 10 내지 40 mm, 20 내지 30 mm, 1 내지 30 mm, 또는 20 내지 50 mm인 방법.
  6. 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 직경이 0.2 μm, 1 μm, 5 μm, 10 μm, 50 μm, 100 μm, 200 μm, 300 μm, 400 μm, 500 μm, 600 μm, 700 μm, 800 μm, 900 μm, 1000 μm, 1200 μm, 1300 μm, 1400 μm, 1500 μm, 1600 μm, 1700 μm, 1800 μm, 1900 μm, 2000 μm, 2500 μm, 또는 3000 μm이거나, 약 0.2 μm, 1 μm, 5 μm, 10 μm, 50 μm, 100 μm, 200 μm, 300 μm, 400 μm, 500 μm, 600 μm, 700 μm, 800 μm, 900 μm, 1000 μm, 1200 μm, 1300 μm, 1400 μm, 1500 μm, 1600 μm, 1700 μm, 1800 μm, 1900 μm, 2000 μm, 2500 μm, 또는 3000 μm이거나, 적어도 0.2 μm, 1 μm, 5 μm, 10 μm, 50 μm, 100 μm, 200 μm, 300 μm, 400 μm, 500 μm, 600 μm, 700 μm, 800 μm, 900 μm, 1000 μm, 1200 μm, 1300 μm, 1400 μm, 1500 μm, 1600 μm, 1700 μm, 1800 μm, 1900 μm, 2000 μm, 2500 μm, 또는 3000 μm이거나, 적어도 약 0.2 μm, 1 μm, 5 μm, 10 μm, 50 μm, 100 μm, 200 μm, 300 μm, 400 μm, 500 μm, 600 μm, 700 μm, 800 μm, 900 μm, 1000 μm, 1200 μm, 1300 μm, 1400 μm, 1500 μm, 1600 μm, 1700 μm, 1800 μm, 1900 μm, 2000 μm, 2500 μm, 또는 3000 μm이거나, 0.2 μm, 1 μm, 5 μm, 10 μm, 50 μm, 100 μm, 200 μm, 300 μm, 400 μm, 500 μm, 600 μm, 700 μm, 800 μm, 900 μm, 1000 μm, 1200 μm, 1300 μm, 1400 μm, 1500 μm, 1600 μm, 1700 μm, 1800 μm, 1900 μm, 2000 μm, 2500 μm, 또는 3000 μm 이하이거나, 또는 약 0.2 μm, 1 μm, 5 μm, 10 μm, 50 μm, 100 μm, 200 μm, 300 μm, 400 μm, 500 μm, 600 μm, 700 μm, 800 μm, 900 μm, 1000 μm, 1200 μm, 1300 μm, 1400 μm, 1500 μm, 1600 μm, 1700 μm, 1800 μm, 1900 μm, 2000 μm, 2500 μm, 또는 3000 μm 이하이거나, 또는 전술한 직경 중 임의의 둘에 의해 한정되는 범위 내의 임의의 직경, 예를 들어 0.2 μm 내지 3000 μm, 200 μm 내지 1500 μm, 500 μm 내지 1000 μm, 0.2 μm 내지 1000 μm, 또는 500 μm 내지 3000 μm인 방법.
  7. 제3항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 직경에 대한 기다란 길이의 비가 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 20000, 30000, 40000, 500000, 60000, 70000, 80000, 90000, 100000, 200000, 300000, 400000, 또는 500000이거나, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 20000, 30000, 40000, 500000, 60000, 70000, 80000, 90000, 100000, 200000, 300000, 400000, 또는 500000이거나, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 20000, 30000, 40000, 500000, 60000, 70000, 80000, 90000, 100000, 200000, 300000, 400000, 또는 500000이거나, 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 20000, 30000, 40000, 500000, 60000, 70000, 80000, 90000, 100000, 200000, 300000, 400000, 또는 500000이거나, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 20000, 30000, 40000, 500000, 60000, 70000, 80000, 90000, 100000, 200000, 300000, 400000, 또는 500000 이하이거나, 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 20000, 30000, 40000, 500000, 60000, 70000, 80000, 90000, 100000, 200000, 300000, 400000, 또는 500000 이하이거나, 또는 전술한 비 중 임의의 둘에 의해 한정되는 범위 사이의 임의의 비, 예를 들어, 1 내지 500000, 100 내지 500000, 1000 내지 10000, 1 내지 500000, 또는 1000 내지 500000인 방법.
  8. 제3항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 내강이 형상화된 위장 오가노이드의 기다란 길이 전체에 걸쳐서 연속이 아닌 것인 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 형상화된 위장 오가노이드가 형상화된 사람 위장 오가노이드인 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복수의 스페로이드가 수집 채널에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 또는 60 일이거나, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 또는 60 일이거나, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 또는 60 일이거나, 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 또는 60 일이거나, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 또는 60 일 이하이거나, 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 또는 60 일 이하의 일 수 동안 배양되는 것인 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복수의 스페로이드가 복수의 스페로이드의 중간엽에서 융합하는 것인 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 형상화된 위장 오가노이드가 자발적 신경분포를 겪는 것인 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 형상화된 위장 오가노이드가 장신경세포 또는 장신경전구세포를 추가로 포함하는 것인 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 형상화된 위장 오가노이드가 신경세포 표식자 PGP9.5를 발현하는 세포를 포함하는 하나 이상의 근육층신경얼기를 추가로 포함하는 것인 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 형상화된 위장 오가노이드가 신경세포 활성을 가지는 것인 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 형상화된 위장 오가노이드에 대해 기계적 변형률을 유도하는 단계를 추가로 포함하는 방법으로서, 여기서 상기 기계적 변형률이 형상화된 위장 오가노이드의 자발적 신경분포를 촉진시키거나, 또는 형상화된 위장 오가노이드의 성숙화 시간을 감소시키거나, 또는 둘 모두를 야기하는 것인 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기계적 변형률이 일축 인장 변형률인 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 형상화된 위장 오가노이드가 중간엽에 의해 둘러싸인 분극된 원주 상피를 추가로 포함하는 방법으로서, 여기서 상기 중간엽이 평활근 유사 층을 포함하는 것인 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 형상화된 위장 오가노이드가 음와 유사 증식대 또는 융모 유사 구조, 또는 둘 모두로 패터닝된 상피를 추가로 포함하는 것인 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 형상화된 위장 오가노이드가 적층된 종주근 및 윤주근을 추가로 포함하는 것인 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 형상화된 위장 오가노이드가 평활근, 또는 장 상피하 근섬유모세포, 또는 둘 모두의 표식자를 추가로 포함하는 것인 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 형상화된 위장 오가노이드가 장세포, 장내분비세포, 배상세포, 파네스 세포, 또는 그의 임의의 조합 중 하나 이상을 추가로 포함하는 것인 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 형상화된 위장 오가노이드가 빌린, Muc2, DEFA5, CHGA, 또는 OLFM4, 또는 그의 임의의 조합 중 하나 이상을 발현하는 세포를 추가로 포함하는 것인 방법.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 형상화된 위장 오가노이드가 PBMC 세포, 생검 조직 샘플, 또는 센다이 바이러스-형질도입된 체세포로부터 리프로그래밍된 유도 만능 줄기 세포로부터 유래되는 것인 방법.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 형상화된 위장 오가노이드가 시험관내에서 혈관화되는 것인 방법.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 형상화된 위장 오가노이드가 개체 안에 생착시 혈관화되는 것인 방법.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복수의 스페로이드가 복수의 중장-후장 스페로이드이고, 상기 형상화된 위장 오가노이드가 형상화된 장 오가노이드인 방법.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복수의 스페로이드가 복수의 후장 스페로이드이고, 상기 형상화된 위장 오가노이드가 형상화된 결장 오가노이드인 방법.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복수의 스페로이드가 복수의 전방 전장 스페로이드이고, 상기 형상화된 위장 오가노이드가 식도 오가노이드인 방법.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복수의 스페로이드가 복수의 후방 전장 스페로이드이고, 상기 형상화된 위장 오가노이드가 위 오가노이드인 방법.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서,
    유도 만능 줄기 세포를 유도 만능 줄기 세포를 완전 내배엽으로 분화시키기에 충분한 조건 하에서 배양하는 단계;
    상기 완전 내배엽을 상기 완전 내배엽을 복수의 스페로이드로 분화시키기에 충분한 조건 하에서 배양하는 단계; 및
    상기 복수의 스페로이드를 수집하는 단계
    를 상기 복수의 스페로이드를 수집 채널 안에 넣기 전에 포함하는 방법.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수집하는 단계가 상기 복수의 스페로이드를 상기 복수의 스페로이드와 결합할 수 있는 결합 재료와 접촉시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  33. 제32항에 있어서, 상기 결합 재료가 와이어, 스트링 및 섬유 중 하나 이상으로부터 선택되는 것인 방법.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복수의 스페로이드가 스캐폴드 가닥과 접촉하는 것인 방법.
  35. 위장 오가노이드를 개체 안에 이식하는 단계를 포함하는, 손상된 위장 기능을 갖는 개체를 치료하는 방법.
  36. 제35항에 있어서, 상기 위장 오가노이드가 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항의 형상화된 위장 오가노이드인 방법.
  37. 제35항 또는 제36항에 있어서, 상기 위장 오가노이드가 상기 개체의 자기유래 또는 동종유래인 방법.
  38. 제37항에 있어서, 상기 위장 오가노이드가 상기 개체로부터 얻은 유도 만능 줄기 세포로부터 제조된 것인 방법.
  39. 제35항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개체가 위장 이식을 필요로 하는 것인 방법.
  40. 제35항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 위장 기능이 장 기능이고, 상기 위장 오가노이드가 장 오가노이드인 방법.
  41. 제35항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 위장 기능이 결장 기능이고, 상기 위장 오가노이드가 결장 오가노이드인 방법.
  42. 제35항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 위장 기능이 식도 기능이고, 상기 위장 오가노이드가 식도 오가노이드인 방법.
  43. 제35항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 위장 기능이 위 기능이고, 상기 위장 오가노이드가 위 오가노이드인 방법.
  44. 하나 이상의 복수의 스페로이드를 안에 수용하도록 구성된 하나 이상의 수집 채널을 포함하는, 하나 이상의 형상화된 위장 오가노이드를 배양하기 위한 형성 트레이.
  45. 제44항에 있어서, 상기 하나 이상의 수집 채널이 미리 결정된 형상을 가지고, 하나 이상의 복수의 스페로이드를 함께 모으도록 구성되고, 이렇게 해서 상기 하나 이상의 복수의 스페로이드가 미리 결정된 형상으로 수집되고, 여기서 상기 하나 이상의 복수의 스페로이드가 미리 결정된 형상을 가지는 하나 이상의 형상화된 위장 오가노이드로 분화하는 것인 형성 트레이.
  46. 제44항 또는 제45항에 있어서, 상기 하나 이상의 수집 채널이 상기 하나 이상의 복수의 스페로이드가 거기에 부착하는 것을 억제하도록 구성된 생체적합성 재료로 제조된 것인 형성 트레이.
  47. 제44항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 수집 채널이 그 안에 위치하는 하나 이상의 복수의 스페로이드를 추가로 포함하는 것인 형성 트레이.
  48. 제44항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 수집 채널이 세포 배양 배지 또는 세포외 기질, 또는 둘 모두를 그 안에 추가로 포함하는 것인 형성 트레이.
  49. 제44항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 수집 채널이 그 안에 위치하는 하나 이상의 위장 오가노이드를 추가로 포함하는 것인 형성 트레이.
  50. 제44항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 위장 오가노이드가 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항의 하나 이상의 형상화된 위장 오가노이드인 형성 트레이.
  51. 하나 이상의 수집 채널을 포함하는 형성 트레이를 포함하는, 위장 오가노이드 배양 키트.
  52. 제51항에 있어서, 상기 형성 트레이가 제43항 내지 제49항 중 어느 한 항의 형성 트레이인 키트.
  53. 제51항 또는 제52항에 있어서, 상기 하나 이상의 수집 채널 내에 수용되도록 구성된 복수의 스페로이드를 추가로 포함하는 키트.
  54. 제51항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 수집 채널 내에 수용되도록 구성된 세포 배양 배지를 추가로 포함하는 키트.
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