WO2024080707A1 - 줄기세포 자기구조화능을 이용한 오가노이드 제조 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 오가노이드 - Google Patents

줄기세포 자기구조화능을 이용한 오가노이드 제조 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 오가노이드 Download PDF

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organoid
tissue
diameter
tissue module
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조재진
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서울대학교산학협력단
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    • C12N2513/00—3D culture

Definitions

  • the present invention relates to a novel method of producing an organoid-tissue module using self-assembly of spheroids and to an organoid-tissue module produced by the method.
  • the organoid-tissue module manufactured by the manufacturing method of the present invention has a cup-shaped shape with a concave center, so that nutrients and oxygen can be smoothly supplied to the center and can overcome limitations in organoid size. It has advantages.
  • Tissue engineering aims to restore or improve the function of organs or tissues by developing functional replacements for damaged tissues (Griffith & Naughton, 2002; Langer & Vacanti, 1993).
  • organoids organ analogues
  • stem cells are cultured using 3D culture
  • organoids which are 3D cell aggregates composed of multiple cells, are formed through self-renewal and self-organization (Kaushik et al , 2018). Because the formed organoids can mimic the structural and functional characteristics of biological tissues, they are not only used for tissue regeneration treatment, but also can be used as a miniaturized organ model for patient-specific disease modeling or a drug screening system (Kaushik et al. , 2018).
  • Embryonic stem cells ESC
  • iPSC induced pluripotent stem cells
  • ASC adult stem cells
  • ESC Embryonic stem cells
  • MSCs Mesenchymal stem cells
  • a structural support similar to an extracellular matrix is required.
  • Matrigel is the most commonly used scaffold, but its components have not been fully characterized and it contains several growth factors that are difficult to quantify, making it difficult to consistently control the environment surrounding the cells each time organoids are cultured.
  • a three-dimensional synthetic support can be used using biomaterials such as hydrogel and polyethylene glycol.
  • artificial scaffolds have the disadvantage of not being able to perfectly reproduce the extracellular matrix of living tissue (Hofer & Lutolf, 2021; Khademhosseini & Langer, 2016). Therefore, the demand for producing organoids without the help of artificial scaffolds is increasing.
  • Tissue engineering based on embryology seeks to utilize the ability of cells to synthesize extracellular matrix on their own under specific conditions to overcome this dependence on artificial scaffolds (Burdis & Kelly, 2021).
  • cells attach to self-synthesized extracellular matrix, cell-cell and cell-extracellular matrix interactions more similar to actual tissues can occur. Through these interactions, self-assembly and self-structuring can occur.
  • Biological processes such as -organization) occur.
  • Self-assembly and self-structuring processes can be induced through cell aggregation techniques. Most cell aggregation technologies are based on physical external forces such as centrifugal force and electromagnetic fields, and most have a structure close to a sphere.
  • the spherical organoids produced by these technologies are bound to have structural size limitations because oxygen and nutrients are not sufficiently supplied to the center. Therefore, a long-term culture time is required to obtain large-sized organoids, and an increase in culture time makes it difficult to control the cell composition of the organoids.
  • the present inventors developed a method for producing organoids that are not limited in size through the self-assembly and self-structuring ability of stem cells, and developed mesenchymal stem cells (Human mesenchymal stem cells) from human fat.
  • the present invention was completed by separating the cells (hMSCs), culturing them in two dimensions, and using tertiary culture technology to produce millimeter-sized organoid-tissue modules composed of mesenchymal stem cells.
  • the present inventors manufactured millimeter-sized cup-shaped cartilage-organoids in a chondrocyte differentiation environment and confirmed that the organoids had a cartilage regeneration effect by transplanting the organoids into the cartilage of damaged joints.
  • the present invention provides a method of producing organoids of several millimeters in size by mixing and culturing spheroids of different sizes and using the self-assembly ability of the spheroids.
  • the method of the present invention simplifies the complex organoid manufacturing method and provides an organoid having a cup-shaped form that can supply nutrients and oxygen to the central region.
  • the present invention provides a method of producing an organoid-tissue module by mixing and culturing spheroids of different diameters.
  • the present invention provides an organoid-tissue module manufactured by the above manufacturing method.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cartilage diseases, comprising the organoid-tissue module prepared by the above production method.
  • the spheroid may be characterized as having a diameter of 10 to 1,000 ⁇ m, and preferably may have a diameter of 50 to 500 ⁇ m.
  • spheroids with a diameter of 200 ⁇ m or less may be more than 60% of the total spheroids, preferably more than 70%, and more preferably more than 80%.
  • spheroids with a diameter exceeding 200 ⁇ m may be 40% or less of the total spheroids, preferably 30% or less, and more preferably 20% or less.
  • the number of spheroids with a diameter of 200 ⁇ m or less may be greater than the number of spheroids with a diameter of more than 200 ⁇ m.
  • the occupied space of the spheroid with a diameter of 200 ⁇ m or less may be larger than the occupied space of the spheroid with a diameter of more than 200 ⁇ m.
  • the space not occupied by the spheroid may be 5 to 40% of the total space for culturing the spheroid, and preferably, the space not occupied by the spheroid is the entire space for culturing the spheroid. It may be 10 to 35% of the total space, and more preferably 15 to 30% of the total space.
  • the organoid-tissue module may occupy 10 to 35% of the culture area, and the organoid-tissue module may have an average diameter of 2 to 4 mm.
  • the spheroids can be obtained by culturing stem cells or undifferentiated cells, and preferably the stem cells and undifferentiated cells are embryonic stem cells, pluripotent stem cells, adult stem cells, and mesenchymal stem cells. may be selected from the group consisting of, and more preferably, the stem cells may be human adipose-derived mesenchymal stem cells (hMSC).
  • hMSC human adipose-derived mesenchymal stem cells
  • the organoid-tissue module may have a cup-shaped shape.
  • the manufacturing method may not include scaffolds or artificial materials.
  • the present invention provides techniques for manufacturing organoid-tissue modules and tissue complexes free from scaffolds and xenografts.
  • the organoid-tissue module manufactured by the manufacturing method of the present invention has a cup-shaped form, so there is no problem with oxygen and nutrient supply, and the self-assembly ability of the spheroid is used to easily manufacture the organoid-tissue module in a short time. can do.
  • organoids produced by the production method of the present invention maintain the characteristics of stem cells and can be used to treat various diseases, including cartilage diseases.
  • FIG 1 is a schematic diagram showing the principle of technology for producing an organoid-tissue module (TM).
  • TM organoid-tissue module
  • Figure 2 is a photograph and graph showing the morphology of mesenchymal stem cells (hMSCs) and cell division ability according to subculture.
  • hMSCs mesenchymal stem cells
  • Figure 3 is a graph showing positive markers on the stem cell surface of hMSCs using FACS.
  • Figure 4 is a graph showing stem cell surface negative markers of hMSCs using FACS.
  • Figure 5 is a photograph confirming through a microscope that hMSCs have differentiation potential characteristics.
  • Figure 6 is a photograph of a spheroid mixture that failed to produce an organoid-tissue module.
  • Figure 7 is a photograph of a spheroid mixture that successfully created an organoid-tissue module.
  • Figure 8 is a schematic diagram of a time-lapse video recording the process of organoid-tissue module formation over 72 hours.
  • Figure 9 is a photograph showing the process in which small-sized spheroids are pulled and fused around a large-sized spheroid during the process of forming an organoid-tissue module.
  • Figure 10 is a graph showing the size distribution of spheroids produced for producing organoid-tissue modules.
  • Figure 11 is a graph showing the average diameter of spheroids in each range after classifying them into sizes less than or greater than 200 ⁇ m in diameter among the spheroid mixtures that successfully created organoid-tissue modules for successful organoid-tissue module production. .
  • Figure 12 is a graph showing the distribution of the number of spheroids according to the size of mixed spheroids produced with an organoid-tissue module and mixed spheroids not produced.
  • Figure 13 is a graph showing the distribution of spheroid occupancy space according to the size of mixed spheroids produced with organoid-tissue modules and mixed spheroids not produced.
  • Figure 14 is a graph showing the distribution of empty spaces not occupied by mixed spheroids produced with organoid-tissue modules and mixed spheroids not produced.
  • Figure 15 is a graph showing the average movement speed of spheroids over time in the process of forming an organoid-tissue module according to self-organization.
  • Figure 16 is a graph showing the deviation of the movement distance and average speed of the spheroid over time during the process of forming an organoid-tissue module according to self-organization.
  • Figure 17 is a graph showing the trajectory of the spheroid in the process of forming an organoid-tissue module according to self-organization.
  • Figure 18 is a graph showing circularity according to the organoid-tissue module formation stage, speed over time, and time to reach the initiation, condensation, lifting, and folding stages.
  • Figure 19 is a photograph and graph showing that the size of the spheroid changes when the number of cells is adjusted.
  • Figure 20 is a photograph showing the effect of the mixing ratio of two types of spheroids of different sizes on organoid-tissue module formation.
  • Figure 21 is a photograph showing the presence or absence of organoid-tissue module generation based on the percentage of area not occupied by mixed spheroids in the total culture area.
  • Figure 22 is a photograph showing the self-structuring and cup-shaped shape of organoid-tissue modules made from two types of spheroids of different sizes.
  • Figure 23 is a photograph showing the process of fusing two types of spheroids of different sizes.
  • Figure 24 is a photograph of a fluorescently stained organoid-tissue module taken with a confocal microscope.
  • Figure 25 is a photograph and graph showing the results of confirming stem cell markers and differentiation capacity of cells isolated from the organoid-tissue module.
  • Figure 26 is a photograph and graph showing the results of comparing the organoid-tissue module's resistance to apoptosis with a spherical cell aggregate.
  • Figure 27 is a photograph showing the expression and location of type 2 collagen in the organoid-tissue module that induced cartilage differentiation confirmed through immunohistological staining.
  • Figure 28 is a photograph and graph showing Aggrecan expression and the distribution of nuclei stained with SYTO16 by 3D clearing the organoid-tissue module that induced cartilage differentiation.
  • Figure 29 is a graph showing the content of glycosaminoglycan (GAG), a cartilage extracellular matrix, in an organoid-tissue module in which cartilage differentiation was induced.
  • GAG glycosaminoglycan
  • Figure 30 is a photograph showing the results of histological analysis applying various staining techniques to the organoid-tissue module that induced cartilage differentiation.
  • Figure 31 is a photograph showing the efficacy and histological analysis results of transplantation of an organoid-tissue module that induced cartilage differentiation into rabbit cartilage.
  • the organoid-tissue module manufacturing method of the present invention includes the first step of isolating mesenchymal stem cells (hMSCs) from human fat, culturing them in two dimensions, and producing spheroids using three-dimensional culture technology, and various It includes two steps to produce an organoid-tissue module, a cup-shaped organoid, by mixing and culturing spheroids of different sizes.
  • hMSCs mesenchymal stem cells
  • FIG. 1 A schematic diagram of the present invention for producing organoids several millimeters in size from single cells is shown in Figure 1.
  • the “two-dimensional culture” refers to culturing cells in a single layer in any type of culture vessel, such as a cell culture flask or a flat Petri dish.
  • the “3-dimensional culture” refers to cells being cultured while interacting with all three dimensions surrounding them, and has the characteristic of allowing cells to grow in all directions.
  • the “organoid” is a three-dimensional culture of stem cells and refers to a tissue mimic that has a form similar to actual human tissues and organs through self-structuring.
  • organoid-tissue module refers to an organoid that is not differentiated into a specific organ tissue produced through self-structuring of spheroids.
  • the “cup shape” refers to a shape with a concave groove in the middle.
  • stem cells include adult stem cells, preferably “mesenchymal stem cells”, and more preferably “mesenchymal stem cells derived from human fat.”
  • hMSCs mesenchymal stem cells
  • hMSCs human adipose-derived mesenchymal stem cells
  • HBSS Hanks® Balanced Salt solution
  • FBS fetal bovine serum
  • AA 1X antibiotic-antimycotic solution
  • the hMSCs isolated as described above have characteristics such as attachment form, multipotency, and expression of surface-specific antigens (Dominici et al., 2006), and by confirming these characteristics, the cells isolated in Example 1 are hMSCs. It was verified that it was.
  • hMSCs mesenchymal stem cells
  • 9.5x10 cells were placed in a 6-well plate and added with 10 nM Dexamethasone, 50 ⁇ g/mL Ascorbic acid, and 10 mM beta-glycerolphosphate.
  • 1mM dibutyl-cAMP (Dibutyryl-cAMP), 10% FBS and 1X AA were added to alpha minimum essential medium ( ⁇ MEM) medium.
  • ⁇ MEM alpha minimum essential medium
  • alizarin red S staining was performed to visually confirm osteocyte differentiation.
  • 1 mL of 4% paraformaldehyde (PFA) was added and the cells were fixed at room temperature.
  • the fixative was removed, washed with DPBS, and 2 mL of alizarin red S solution diluted to 1% with distilled water (DW) was dispensed and reacted at room temperature for 15 minutes.
  • 1 mL of DW was dispensed, and osteogenic differentiation was confirmed under a microscope (Olympus), as shown in Figure 5.
  • 9.5x10 cells were placed in a 6-well plate and added with 0.5 mM isobutyl-1-methylxanthine (IBMX), 100 nM dexamethasone, Culture medium prepared by adding 100 ⁇ M Indomethacin (INDO), 10 ⁇ g/mL insulin, 10% FBS, and 1 Cultured for 14 days in a CO 2 incubator. To confirm differentiation, the culture medium from the differentiated plate was removed, washed once with DPBS, and fixed with 4% PFA at room temperature.
  • IBMX isobutyl-1-methylxanthine
  • INDO Indomethacin
  • hMSCs mesenchymal stem cells
  • 9.5x10 cells were placed in a 6-well plate and added with 1X insulin transferrin selenium premix (ITS), 50 ng/mL ascorbic acid, and 40 ⁇ g. /mL 10 ng/mL of transforming growth factor (TGF- ⁇ 3) in culture medium prepared by adding ingredients such as L-proline, 100 nM dexamethasone, 10% FBS, and 1X AA in ⁇ MEM. ) was added and cultured in a 5% CO 2 incubator at 37°C for 21 days. Afterwards, the culture medium from the plate where differentiation was completed was removed, and the cells were fixed at room temperature using 4% PFA.
  • ITS insulin transferrin selenium premix
  • TGF- ⁇ 3 transforming growth factor
  • the cells were fixed, they were washed with DPBS, and the fixed cells were placed in OCT compound and frozen in an ultra-low temperature freezer (-80°C) for one day.
  • the frozen cells were cut into 8 ⁇ m-thick sections using a cryocut microtome and washed with DW.
  • a 1% alcian blue solution prepared using alcian blue reagent was added to the section, stained at room temperature for 30 minutes, washed with 0.1N HCl solution, and then washed with DW, as shown in Figure 5.
  • Chondrogenic differentiation into chondrocytes was confirmed using a microscope (Olympus).
  • organoids In general, long-term culture is required to produce organoids, and when the size increases, the supply of oxygen or nutrients to cells located at the center of the spherical organoid is limited, increasing the possibility of cell death. Therefore, in order to ensure smooth supply of oxygen and nutrients to the center, we sought to find conditions for creating cup-shaped organoid-tissue modules. After finding the conditions for creating organoid-tissue modules, we attempted to create organoids whose size increased to several millimeters in a short period of time by providing a differentiation environment during the creation process of organoid-tissue modules.
  • spheroids of various sizes were produced to produce organoid-tissue modules. Forced aggregation was induced by adding 10,000 or 15,000 hMSCs to each well of a 96-well flat or U-bottom plate and centrifuging at 500*?*g for 5 minutes. Spheroids of various sizes were created by culturing cells and culturing randomly forced aggregation of cell aggregates.
  • hMSC spheroids Large and small hMSC spheroids with a diameter of 50 to 500 ⁇ m were formed in each well, and all of the spheroids formed were collected in a 96-well plate. After removing the supernatant by centrifugation, it was resuspended in 200 ⁇ l of medium and transferred to one well of an ultra-low attachment 96-well plate. Self-assembly was induced by placing it in a 37 degree incubator.
  • the resulting spheroids ranged in size depending on the state of the bottom of the 96-well plate used (flat bottom or round bottom), and as shown in Figure 6, wells in which self-assembly did not occur and as shown in Figure 7, There was a well containing a self-assembled organoid-tissue module with a unique structure with a concave groove in the center.
  • the unique self-assembled structure with a diameter of 2 to 4 mm in a cup shape was named an organoid-tissue module.
  • the spheroids were mixed and transferred to a plate with a designated area (e.g., 96-well plate), and time-lapse images were taken for 72 hours from the time the spheroids settled to the bottom of the well (0 hours). Each time-lapse image was combined to video the spheroid self-assembly process, and then the images were analyzed. As a result, as shown in Figure 8, the spheroids move dynamically and form a cup-shaped organoid-tissue module through the initiation stage, condensation stage, and lifting & folding stage. Creation was confirmed.
  • a designated area e.g., 96-well plate
  • each spheroid had a clearly distinct interface
  • the condensation phase the stage where the spheroid moved toward the center, fused with neighboring spheroids, and continued to contract toward the core.
  • the edges of the organoid-tissue module were lifted and folded upward against gravity, creating a cup-shaped organoid-tissue module.
  • the average diameter of spheroids in each size range was 80 ⁇ m for 100 ⁇ m or less, 140 ⁇ m for 100 to 200 ⁇ m, 250 ⁇ m for 200 to 300 ⁇ m, 330 ⁇ m for 300 to 400 ⁇ m, and 430 ⁇ m for 400 to 500 ⁇ m. .
  • the average diameter of small spheroids with a diameter of less than 200 ⁇ m was 110 ⁇ m
  • the average diameter of large spheroids with a size of more than 200 ⁇ m was 110 ⁇ m.
  • the diameter was 270 ⁇ m.
  • the organoid-tissue module initiation step are of various sizes ranging from 50 to 500 ⁇ m, when the spheroids of 200 ⁇ m or less are 23%, the organoid-tissue module It was confirmed that it was not manufactured and that it was manufactured when it was 82%.
  • organoid-tissue modules were not manufactured when spheroids with a diameter exceeding 200 ⁇ m were 77%, and were manufactured when spheroids with a diameter exceeding 200 ⁇ m were 18%.
  • the results of analyzing the occupied space by size of the spheroids constituting the well (Success) in which the organoid-tissue module was successfully created are shown in Table 4 and Figure 13 below.
  • the occupied space was expressed as a percentage of the ratio of the sum of the space occupied by the spheroids in the following size range to the sum of the space occupied by all spheroids.
  • the space occupied by individual spheroids was calculated using the formula ⁇ xr 2 from the radius (r) derived from ImageJ analysis.
  • the organoid-tissue module initiation step are of various sizes ranging from 50 to 500 ⁇ m, spheroids less than 200 ⁇ m account for 6% of the space occupied by all spheroids. It was confirmed that the organoid-tissue module was not manufactured when , and that it was manufactured when it was 48%.
  • organoid-tissue modules were not manufactured when spheroids with a diameter exceeding 200 ⁇ m accounted for 94% of the space occupied by all spheroids, and were manufactured when 52% was occupied.
  • the area of the empty space is 5 to 40%, preferably 10 to 35%, and more preferably 15 to 30%.
  • bio-kinematic analysis was performed as follows.
  • the movement of the spheroid was videotaped, and based on the video, the spatiotemporal distribution of the spheroid's speed, trajectory, linearity, and coordination were analyzed and calculated. Images taken over time were used to calculate spheroid motility within a limited space while the organoid-tissue module was fabricated using the Image J program and MATLAB code based on the particle image velocimetry (PIV) algorithm.
  • PAV particle image velocimetry
  • each spheroid exhibited irregular and different motility (0-1.5 ⁇ m/min).
  • the organoid-tissue module boundary area in the condensation stage shows linear movement, while the spheroid in the central area shows a twisted movement. It seemed. During the lifting and folding steps, little movement of the spheroids was observed in the boundary region.
  • the spheroids showed random movement in the initiation stage, but in the condensation stage, it was observed that the spheroids in the border area moved linearly toward the center. Uniquely, longer trajectories and higher straightness were observed in the spheroids in the folding region than in the center. This movement is a phenomenon that generally occurs when aggregates form a stable structure, and indicates that the organoid-tissue module in the lifting folding stage has been converted into a structurally stable structure.
  • the organoid-tissue module self-structured according to each stage of initiation (0 hours), condensation (4.3 hours), lifting and folding (39 hours). You can see that it happens.
  • the culture medium contained 40 ⁇ g/ml L-proline, 100 ⁇ g/ml sodium pyruvate, and 50 ⁇ g/ml L-ascorbic acid 2.
  • DMEM containing -phosphate, 1xITS, and 1xAA was used.
  • the number ratio of the obtained 0.5K and 3K spheroids of the two sizes was placed in an ultra-low attachment 96-well plate so that the empty area of the total culture area was about 20%.
  • the mixture was arranged differently.
  • an organoid-tissue module is produced, and when the number of spheroids with a diameter of 200 ⁇ m or less is greater than the number of spheroids with a diameter of more than 200 ⁇ m, an organoid-tissue module is produced. You can see that this is well manufactured.
  • the mixed number ratio of 0.5K spheroids and 3K spheroids was fixed to 90% and 10%, respectively, and the spheroids were formed as shown in Figure 21. They were mixed and arranged so that the unoccupied and empty culture area was less than 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, and 10%, respectively.
  • the empty area was larger than 50%, self-assembly of the spheroids did not occur well, and when it was less than 40%, it was confirmed that organoid-tissue modules were well formed by self-assembly of the spheroids.
  • the area of the empty space was made to be 20% of the total culture area, and then self-structuring of the spheroids was induced through culture to produce an organoid-tissue module.
  • an organoid-tissue module was created through the self-assembly process, and it was confirmed that the cup shape was still maintained even after 7 days of culture.
  • the organoid-tissue module was generated, the spheroids fused with adjacent spheroids and condensed to form a large structure.
  • the cells constituting the spheroids are not evenly mixed and are located in the original spheroids, as shown in Figure 23. , confirmed through the stained spheroid fusion process.
  • the cup shape of the organoid-tissue module was confirmed using a confocal microscope, as shown in Figure 24.
  • the average diameter of the organoid-tissue module was approximately 2 to 4 mm (10 to 35% of the culture area), which was confirmed to be about half the size of the pineal gland (5-8 mm), the smallest organ in the human body.
  • organoid-tissue module maintains characteristics of stem cells
  • single cells were isolated from the organoid-tissue module and the expression of stem cell markers and differentiation ability were confirmed. As shown in Figure 25, it was confirmed that the cells constituting the organoid-tissue module expressed stem cell markers, differentiated into adipocytes, osteocytes, and chondrocytes, and maintained the characteristics of stem cells.
  • a spherical aggregate and an organoid-tissue module composed of the same number of cells were produced.
  • spherical cell aggregates cells were placed in a U bottom plate and centrifuged at 500xg for 5 minutes, then aggregation was induced in a 37 degree incubator and cultured for a total of 6 days under the same conditions as the organoid-tissue module culture conditions.
  • Organoid-tissue modules and spherical cell aggregates were fixed in 4% PFA for one day and embedded in paraffin blocks. Slides were prepared with a thickness of 4 ⁇ m, deparaffinized, and treated with Proteinase K to dissolve proteins in the tissue.
  • Endogenous peroxidase was removed by treatment with 3% hydrogen peroxide (H 2 O 2 ), and TUNEL (Terminal Deoxynucleotidyl Transferase dUTP Nick end Labeling) staining was performed using the ApoTag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit (Millipore). Images were acquired after counterstaining the nuclei with Methyl Green. As shown in Figure 26, increased cell death was not observed in the center of the organoid-tissue module compared to the periphery. However, in the center of the spherical cell aggregate, there were many dead cells stained with TUNEL, and an empty space was created due to necrosis.
  • the organoid-tissue module has a smooth supply of nutrients and oxygen due to its cup-shaped structural feature with a concave center, and has a technical advantage that can overcome the disadvantage of increased cell death in the center as the size increases. It is judged that there is.
  • hMSCs used in the present invention are stem cells that can differentiate into chondrocytes, they have been used as a promising cell source in cartilage tissue engineering (Somoza et al., 2014).
  • TGF- ⁇ 3 was treated to induce differentiation of the organoid-tissue modules into chondrocytes, and then the samples were recovered and incubated in 4% PFA. It was fixed for 3 days and immunohistochemistry (IHC) was performed for histological analysis.
  • the fixed sample was embedded in a paraffin block to produce a slide with a thickness of 4 ⁇ m.
  • This slide was deparaffinized in histo-clear for 30 minutes, hydrated from 100% ethanol to 70% ethanol, and washed with PBS.
  • PBS PBS solution containing 0.3% Bovine Serum Albumin
  • an appropriate concentration of Type 2 collagen primary antibody was diluted in the same solution and incubated for 12 hours at 4°C.
  • Politics lasted for more than an hour.
  • the solution was washed again with PBS, diluted with an appropriate concentration of secondary antibody in blocking solution, left at 37°C for 1 hour, washed with PBS, and reacted with DAB to develop color.
  • Korean Patent No. 10-2170076 Method for manufacturing decellularized tissue using hydrogel polymer and decellularized tissue manufactured therefrom
  • the expression of aggrecan was examined in 3D using an antibody.
  • the produced organoid-tissue module was fixed in 4% PFA for one week, washed with PBS containing 0.1% triton-X, and then washed with 6% BSA, 0.2% triton X-100, and 0.01% sodium azide.
  • the blocking process was performed at room temperature for at least 8 hours using a solution of azide) dissolved in PBS.
  • the aggrecan antibody was diluted to an appropriate concentration in blocking solution, dispensed onto the organoid-tissue module, and reacted at room temperature for 2 days.
  • washing was carried out with the washing solution used previously, and the secondary antibody and hoechest were diluted to the appropriate concentration in the blocking solution and dispensed onto the spheroids, and reacted at room temperature for 2 days. After the antibody reaction was completed through a washing process, a transparency process was performed using a solution of 25% urea and 65% sucrose dissolved in water.
  • GAG assay was performed for quantitative comparative analysis of cartilage differentiation through glycosaminoglycan (GAG), an important extracellular matrix of cartilage.
  • GAG glycosaminoglycan
  • a papain solution was prepared by adding 7.8 ⁇ L of papain to the solution adjusted to 6.4, and the sample was added and reacted in a constant temperature water bath at 65°C for 18 hours. After 18 hours, centrifugation was performed at 10,000 g for 10 minutes, and GAG content was measured according to the instructions of the sulfate glycosaminoglycan assay kit.
  • the absorbance of the sample was measured at 656 nm using a microplate reader device, and the total amount of DNA was quantified using the pico-green dsDNA assay kit to normalize the measurement results.
  • the organoid-tissue module sample was embedded in a paraffin block and sectioned to a thickness of 4 ⁇ m to prepare a slide. After deparaffinization was performed in the same manner as above, staining was performed using Hematoxylin & Eosin (H&E) solution, and synthetic collagen within the organoid-tissue module was detected using the Trichrome III Blue Staining Kit. And GAG expression was visualized using the Safranin-O/fast green kit.
  • H&E Hematoxylin & Eosin
  • a cartilage defect model was created in which the entire cartilage layer was removed from the knee of an adult New Zealand white rabbit, and the organoid-tissue module was created.
  • An experiment was conducted to transplant to the defect site. The experiment was conducted with the approval of the Institutional Animal Care and Use Committee of Seoul National University Hospital (SNUH-IACUC No. 18-0171-S1A0), and the animals were used in accordance with the National Research Corporation (NRC) Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, Article 8. The animals were maintained in a facility that has been assessed and accredited by the Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC).
  • the rabbit was anesthetized through intramuscular injection with a mixture of 5 mg/kg Xylazine and 15 mg/kg Zoletil, and a cartilage defect measuring 3 mm in diameter
  • the organoid-tissue module transplant group the organoid-tissue module was inserted and sutured, and 0.3 mL Metacam and 1 mL Cefazolin were injected subcutaneously for 3 days after surgery and treated with antibiotics and painkillers. did.
  • Animals were sacrificed 12 or 14 weeks after surgery, and prior to histological evaluation, the knees were excised and micro-computed tomography (Micro-CT) imaging was performed.
  • Micro-CT micro-computed tomography
  • the cartilage created 12 weeks after transplantation of the organoid-tissue module into the CD/OA rabbit model was thicker than the existing surrounding cartilage of the rabbit, and the organoid-tissue module was completely fused with the damaged cartilage. did.
  • the organoid-tissue module manufactured in millimeter size had an excellent regenerative effect in the CD/OA model.

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Abstract

본 발명은 스페로이드의 자가조립을 이용하여 오가노이드를 제조하는 신규한방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명의 제조 방법으로 제조된 오가노이드는 중심부가 오목한 컵 모양의 형태를 가짐으로써, 중심부까지 영양분 및 산소가 원활하게 공급될 수 있고 오가노이드 크기의 한계를 극복할 수 있는 장점을 갖는다.

Description

줄기세포 자기구조화능을 이용한 오가노이드 제조 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 오가노이드
본 발명은 스페로이드의 자가조립을 이용하여 오가노이드-조직모듈을 제조하는 신규한 방법 및 상기 방법으로 제조된 오가노이드-조직모듈에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명의 제조 방법으로 제조된 오가노이드-조직모듈은 중심부가 오목한 컵 모양의 형태를 가짐으로써, 중심부까지 영양분 및 산소가 원활하게 공급될 수 있고 오가노이드 크기의 한계를 극복할 수 있는 장점을 갖는다.
조직공학은 손상된 조직의 기능적 대체재를 개발하여 장기 혹은 조직의 기능을 회복시키거나 개선하는 것을 목표로 하고 있다(Griffith & Naughton, 2002; Langer & Vacanti, 1993). 이러한 기능적 대체재를 개발하기 위하여 인간의 장기 조직을 모사할 수 있는 오가노이드(장기유사체)에 관한 연구는 매우 중요하다. 3차원배양법으로 줄기세포를 배양하면 자기재생(Self-renewal)과 자기구조화(Self-organization)를 통해 여러 세포로 구성된 3차원 세포집합체인 오가노이드가 형성된다(Kaushik et al, 2018). 형성된 오가노이드는 생체 조직의 구조적 기능적 특성을 모방할 수 있기 때문에 조직재생치료에 이용될 뿐만 아니라 소형화된 장기 모델로 환자 맞춤형 질병모델링이나 약물스크리닝 시스템으로 활용할 수 있다(Kaushik et al., 2018).
배아줄기세포(Embryonic stem cell, ESC), 유도만능줄기세포(Induced pluripotent stem cell, iPSC), 성체줄기세포(Adult stem cell, ASC)가 오가노이드를 위한 세포공급원으로 사용되는데, 특히 성체줄기세포의 하나인 중간엽줄기세포(Mesenchymal stem cells, MSCs)는 골수 및 지방 조직과 같은 성인의 여러 조직으로부터 쉽게 분리하여 배양할 수 있기 때문에 오가노이드를 위한 세포 공급원으로 주목받고 있다(Jiang et al, 2002; Pittenger et al, 1999; Wang et al, 2014). 이러한 줄기세포를 3차원배양하기 위해서는 세포외기질(Extracellular matrix)과 유사한 구조적 지지체가 필요하다. 마트리젤(Matrigel)은 가장 일반적으로 사용되는 지지체이나 구성성분이 완전히 특징지어 지지 않았고 정량화하기 어려운 여러 성장인자를 포함하는 등 오가노이드를 배양할 때마다 세포를 둘러싼 환경을 일정하게 조절하기 어렵다. 또는 하이드로겔(Hydrogel)과 폴리에틸렌 그리콜(Polyethylene glycol)등의 바이오머티리얼(Biomaterial)로 3차원 합성지지체를 사용할 수도 있다. 하지만 인공지지체는 생체조직의 세포외기질을 완벽히 재현할 수 없다는 단점이 있다(Hofer & Lutolf, 2021; Khademhosseini & Langer, 2016). 따라서 인공지지체의 도움없이 오가노이드를 제작하려는 수요가 증가하고 있다.
발생학에 기반한 조직공학은 이러한 인공지지체의 의존을 극복하기 위하여 세포가 특정 조건에서 자체적으로 세포외기질을 합성하는 능력을 활용하려고 한다(Burdis & Kelly, 2021). 세포가 스스로 합성한 세포외기질에 부착하면 실제 조직과 더욱 유사한 세포-세포, 세포-세포외기질 간 상호작용을 할 수 있는데, 이러한 상호작용을 통해 자가조립(Self-assembly)과 자기구조화(Self-organization)와 같은 생물학적 과정이 일어난다. 자가조립 및 자기구조화 과정은 세포응집기술을 통해 유도할 수 있다. 대부분의 세포응집 기술은 원심력 전자기장 등의 물리적 외력에 기반하고 있고 대부분 구에 가까운 구조를 하고 있다. 이러한 기술들에 의한 구형의 오가노이드는 중심부까지 산소와 영양분이 충분히 공급되지 않기 때문에 구조적으로 크기 제한이 존재할 수밖에 없다. 따라서 크기가 큰 오가노이드를 얻기 위해 장기간의 배양 시간이 필요하고 배양시간의 증가는 오가노이드의 세포조성을 제어하기 어렵게 만든다.
이에 본 발명자들은 상기의 문제점을 해결하기 위하여, 줄기세포의 자가조립 및 자기구조화능을 통해 크기의 제한을 받지 않는 오가노이드의 제조 방법을 개발하였으며, 인간의 지방에서 중간엽줄기세포(Human mesenchymal stem cells, hMSCs)를 분리해 낸 후 2차원으로 배양하고 3차 배양 기술을 사용하여 중간엽줄기세포로 구성된 밀리미터 크기의 오가노이드-조직모듈을 제작함으로써 본 발명을 완성하였다.
이를 통하여, 본 발명자들은 연골세포 분화 환경에서 밀리미터 크기의 컵 모양 연골-오가노이드를 제조하여, 손상된 관절의 연골에 상기 오가노이드를 이식하여 연골재생의 효과를 갖는 것을 확인하였다.
본 발명은 크기가 다른 스페로이드를 혼합 및 배양하여 스페로이드의 자가조립능을 이용하여 수 밀리미터 크기의 오가노이드를 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법을 통하여 복잡한 오가노이드 제조방법을 단순화하고, 중심영역까지 영양분 및 산소를 공급할 수 있는 컵 모양의 형태를 갖는 오가노이드를 제공한다.
상기 기술한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 직경이 다른 스페로이드를 혼합 및 배양하여 오가노이드-조직모듈(Tissue Module)을 제조하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 오가노이드-조직모듈을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 오가노이드-조직모듈을 포함하는, 연골질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 제조방법에서 상기 스페로이드는 10 내지 1,000 μm의 직경을 갖는 것을 특징으로 할 수 있고, 바람직하게는 50 내지 500 μm의 직경일 수 있다.
상기 제조방법에서, 직경이 200 μm 이하인 스페로이드가 전체 스페로이드의 60% 이상일 수 있고, 바람직하게는 70% 이상일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 80% 이상일 수 있다.
또한, 상기 제조방법에서 직경이 200 μm 초과인 스페로이드가 전체 스페로이드의 40% 이하일 수 있고, 바람직하게는 30% 이하일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 20% 이하일 수 있다.
또한, 상기 제조방법에서 직경이 200 μm 이하인 스페로이드의 수가 직경이 200 μm 초과인 스페로이드의 수보다 많을 수 있다.
또한, 상기 제조방법에서 직경이 200 μm 이하인 스페로이드의 점유 공간이 직경이 200 μm 초과인 스페로이드의 점유 공간 보다 클 수 있다.
또한, 상기 제조방법에서 스페로이드가 점유하지 않은 공간이 스페로이드를 배양하는 전체 공간에 대하여 5 ~ 40 %일 수 있고, 바람직하게는 스페로이드가 점유하지 않은 공간이 스페로이드를 배양하는 전체 공간에 대하여 10 ~ 35 %일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 전체 공간에 대하여 15 ~ 30 %일 수 있다.
또한, 상기 제조방법에서 상기 오가노이드-조직모듈은 배양면적의 10 ~ 35%를 차지할 수 있으며, 상기 오가노이드-조직모듈은 2 내지 4 mm의 평균 직경을 가질 수 있다.
또한, 상기 제조방법에서 상기 스페로이드는 줄기세포 또는 미분화세포를 배양하여 수득될 수 있고, 바람직하게는 상기 줄기세포 및 미분화세포는 배아줄기세포, 역분화줄기세포, 성체줄기세포 및 중간엽 줄기세포로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 상기 줄기세포는 인간 지방 유래 중간엽 줄기세포(hMSC)일 수 있다.
또한, 상기 제조방법에서 상기 오가노이드-조직모듈은 컵 모양의 형태를 가질 수 있다.
또한, 상기 제조방법은 스캐폴드와 인공물질을 포함하지 않을 수 있다.
본 발명은 스캐폴드와 이종 이식으로부터 자유로운 오가노이드-조직모듈 및 조직복합체의 제조 기술을 제공한다. 본 발명의 제조방법으로 제조된 오가노이드-조직모듈은 컵 모양의 형태를 가짐으로써 산소 및 영양분 공급의 문제점을 갖지 않고, 스페로이드의 자가조립능을 이용하여 단시간 내에 쉽게 오가노이드-조직모듈을 제조할 수 있다.
또한 본 발명의 제조방법으로 제조된 오가노이드는 줄기세포의 특성을 유지하여 연골질환을 포함한 다양한 질환의 치료에 사용될 수 있다.
도 1은 오가노이드-조직모듈(Tissue module, TM)을 제작하는 기술의 원리를 나타낸 모식도이다.
도 2는 중간엽 줄기세포(Human mesenchymal stem cells, hMSCs)의 형태 및 계대배양에 따른 세포 분열능을 나타낸 사진 및 그래프이다.
도 3은 FACS를 이용하여 hMSCs의 줄기 세포 표면 양성 마커를 나타낸 그래프이다.
도 4는 FACS를 이용하여 hMSCs의 줄기 세포 표면 음성 마커를 나타낸 그래프이다.
도 5는 hMSCs가 분화능 특성을 가지고 있음을 현미경을 통해 확인한 사진이다.
도 6은 오가노이드-조직모듈 생성에 실패한 스페로이드 혼합물을 촬영한 사진이다.
도 7은 오가노이드-조직모듈 생성에 성공한 스페로이드 혼합물을 촬영한 사진이다.
도 8은 72시간 동안 오가노이드-조직모듈이 형성되는 과정을 기록한 타임랩스영상의 시간별 사진 및 모식도이다.
도 9는 오가노이드-조직모듈이 형성되는 과정동안 크기가 큰 스페로이드를 중심으로 작은 크기의 스페로이드들이 끌어당겨져 융합되는 과정을 나타낸 사진이다.
도 10은 오가노이드-조직모듈 제작을 위해 제작된 스페로이드의 크기 분포를 나타낸 그래프이다.
도 11은 성공적 오가노이드-조직모듈 제작을 위해 오가노이드-조직모듈 생성에 성공한 스페로이드 혼합물 중, 직경 200 μm 이하 크기 및 초과 크기별로 분류한 후 각 범위에 속한 스페로이드의 평균직경을 나타낸 그래프이다.
도 12는 오가노이드-조직모듈로 제작된 혼합 스페로이드들과 제작되지 않은 혼합 스페로이드들의 크기에 따른 스페로이드 개수 분포를 나타낸 그래프이다.
도 13은 오가노이드-조직모듈로 제작된 혼합 스페로이드들과 제작되지 않은 혼합 스페로이드들의 크기에 따른 스페로이드 점유 공간 분포를 나타낸 그래프이다.
도 14는 오가노이드-조직모듈로 제작된 혼합 스페로이드들과 제작되지 않은 혼합 스페로이드들이 차지하지 않고 비어 있는 공간 분포를 나타낸 그래프이다.
도 15는 자기구조화능(Self-organization)에 따라 오가노이드-조직모듈이 형성되는 과정에서, 시간의 흐름에 따른 스페로이드의 평균 운동속도를 나타낸 그래프이다.
도 16는 자기구조화능(Self-organization)에 따라 오가노이드-조직모듈이 형성되는 과정에서, 시간의 흐름에 따른 스페로이드의 이동거리 및 평균속도의 편차를 나타낸 그래프이다.
도 17은 자기구조화능(Self-organization)에 따라 오가노이드-조직모듈이 형성되는 과정에서, 스페로이드의 궤도를 나타낸 그래프이다.
도 18은 오가노이드-조직모듈 형성 단계에 따른 원형도, 시간에 따른 속도 및 개시, 응축, 리프팅 및 폴딩 단계에 도달하는 시간을 나타낸 그래프이다.
도 19는 세포수를 조절하면 스페로이드의 크기가 변화함을 나타내는 사진 및 그래프이다.
도 20은 크기가 다른 두 종류의 스페로이드 혼합 비율이 오가노이드-조직모듈 형성에 미치는 영향을 나타낸 사진이다.
도 21은 전체 배양면적에서 혼합 스페로이드가 점유하지 않는 면적 비율에 의한 오가노이드-조직모듈 생성 유무를 나타낸 사진이다.
도 22는 크기가 다른 두 종류의 스페로이드로 제작한 오가노이드-조직모듈의 자기구조화와 컵모양 형태가 유지됨을 나타낸 사진이다.
도 23은 크기가 다른 두 종류의 스페로이드가 융합되는 과정을 나타낸 사진이다.
도 24는 형광염색된 오가노이드-조직모듈을 공초점현미경으로 촬영한 사진이다.
도 25는 오가노이드-조직모듈로부터 분리한 세포의 줄기 세포 마커와 분화능을 확인한 결과를 나타낸 사진 및 그래프이다.
도 26은 오가노이드-조직모듈이 세포사멸에 내성이 있음을 구형의 세포응집체와 비교한 결과를 나타낸 사진 및 그래프이다.
도 27은 면역조직학적 염색을 통해 확인한 연골 분화를 유도한 오가노이드-조직모듈에서의 타입 2 콜라겐(Type Ⅱ collagen)의 발현 여부와 위치를 나타낸 사진이다.
도 28은 연골 분화를 유도한 오가노이드-조직모듈을 3D clearing하여 아그리칸(Aggrecan) 발현과 SYTO16으로 염색된 핵의 분포를 나타낸 사진 및 그래프이다.
도 29는 연골 분화가 유도된 오가노이드-조직모듈에서 연골 세포외기질인 글리코사미노글리칸(Glycosaminoglycan, GAG) 함량을 나타낸 그래프이다.
도 30은 연골 분화를 유도한 오가노이드-조직모듈에 다양한 염색 기법을 적용한 조직학적 분석 결과를 나타낸 사진이다.
도 31은 연골 분화를 유도한 오가노이드-조직모듈의 토끼 연골로의 이식을 통한 효능 및 조직학적 분석 결과를 나타낸 사진이다.
이하, 첨부한 도면을 참조하여 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본원의 실시태양 및 실시예를 상세히 설명한다. 그러나 본원은 여러 가지 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시태양 및 실시예에 한정되지 않는다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 “포함” 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명의 오가노이드-조직모듈 제조방법은 인간의 지방에서 중간엽 줄기 세포(hMSCs)를 분리해 낸 후, 2차원으로 배양하고 3차원 배양 기술을 사용하여 스페로이드를 제작하는 1 단계와, 다양한 크기를 갖는 스페로이드를 혼합 및 배양하여 컵모양의 오가노이드인 오가노이드-조직모듈을 제작하는 2단계를 포함한다.
수 밀리미터 크기의 오가노이드를 단일 세포로부터 제작하기 위한 본 발명의 모식도는 도 1과 같다.
상기 "2차원 배양"은 세포를 세포 배양 플라스크 또는 평평한 페트리 디쉬 등 모든 종류의 배양용기에서 단층으로 배양하는 것을 의미한다.
상기 "3차원 배양"은 세포가 자신을 둘러싸는 3차원 모두와 상호작용하면서 배양되는 것으로, 세포가 모든 방향으로 성장할 수 있는 특징을 가진다.
상기 "오가노이드"는 줄기세포를 3차원 배양한 것으로 자기구조화를 통해 실제 사람의 조직 및 장기와 유사한 형태를 띄는 조직모사체를 의미한다.
상기 "오가노이드-조직모듈(Tissue Module, TM)"은 스페로이드의 자기구조화를 통해 제작된 특정 장기조직으로 분화되지 않은 오가노이드를 의미한다.
상기 "컵 모양(Cup shape)"은 중간에 오목한 홈을 갖는 형태를 의미한다.
본 발명에서 "줄기세포"는 성체줄기세포를 포함하며, 바람직하게는 "중간엽 줄기세포"일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 "인간 지방 유래 중간엽 줄기세포"일 수 있다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 하나, 하기의 실시예는 단지 설명의 목적을 위한 것이며 본원 발명의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다.
[실시예 1]
지방조직에서의 중간엽 줄기세포(hMSCs)의 분리
본 발명의 오가노이드-조직모듈(Tissue module) 제작의 세포원으로, 비교적 용이한 분리와 높은 성장률을 가진 인간 지방 유래 중간엽 줄기 세포(Human mesenchymal stem cells, hMSCs)를 사용하였다(Meligy et al., 2012). hMSCs의 분리는 서울대학교 치과 병원의 기관평가위원회에서 승인을 받아 수행하였다.
준비된 인간 유래 지방 조직을 0.1% 콜라겐분해효소 I(Collagenase I)이 포함된 Hanks® Balanced Salt solution(HBSS)에 넣어 37℃에서 30분 동안 흔들어 세포를 분리한 후, 이를 세척하고 100 μm 나일론 메쉬로 여과하였다. 이후 10%의 소태아혈청(Fetal bovine serum, FBS)과 1X 항생항진균제(Antibiotic-antimycotic solution, AA)를 넣은 Dulbecco의 modified Eagles medium (DMEM)으로 영양분을 공급하며 37℃의 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
[실시예 2]
분리된 중간엽 줄기세포(hMSCs)의 검증
상기와 같이 분리된 hMSCs는 부착 형태, 다분화능, 표면 특이적 항원의 발현 등의 특징을 지니고 있으며(Dominici et al., 2006), 이러한 특징을 확인함으로써 상기 실시예 1에서 분리해 낸 세포가 hMSCs임을 검증하였다.
상기 세포의 형태 및 분포 특성을 확인한 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 해당 세포는 플라스틱 배양 접시에서 균질한 방추(pindle) 모양과 같은 형태로 부착하여 성장하는 모습을 나타내었으며, 2번째 계대에서 12번째 계대까지 세포의 수가 2배 되는데 걸리는 기간이 2일로 일정하게 유지되었다.
또한, 계대를 거듭하며 hMSCs의 특성을 잘 유지하는지 확인하기 위한 수단으로 줄기세포 표면 마커들의 발현을 형광을 통해 확인하고자 하였다. 3, 5, 7번째 계대에서 형광표지된 각 CD14, CD29, CD31, CD34, CD44, CD73, CD90, HLA-DR, CD45, CD79α, CD105, CD117에 대한 항체로 4℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 이후, 2%의 FBS가 함유된 Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS)을 이용하여 세척하고 isotype mouse IgG 대조군 대비 발현량을 FACS로 분석하였다.
해당 검사 결과, 95% 이상의 세포가 CD29, CD44, CD73, CD90, 및 CD105의 양성(Positive) 마커를 도 3에 나타낸 바와 같이 발현하였고, CD14, CD31, CD45, CD79α, CD117, 및 HLA-DR의 음성(Negative) 마커의 발현은 도 4에 나타낸 바와 같이, 2% 이하로 확인되었다.
[실시예 3]
분리된 중간엽줄기세포(hMSCs)의 골세포 분화능 확인
hMSCs의 골세포 분화능을 확인하기 위하여 9.5x104개의 세포를 6-well 플레이트에 넣고 10 nM 덱사메타손(Dexamethasone), 50 μg/mL 아스코르브산(Ascobic acid), 10 mM 베타-글리세롤포스페이트(β-glycerolphosphate), 1 mM 다이부틸-cAMP (Dibutyryl-cAMP), 10% FBS와 1X AA 등을 alpha minimum essential medium (α MEM) 배지에 넣어 제조한 배양 배지에서 배양하였다. 4일 후, 배양 배지를 모두 제거하고 다이부틸-cAMP가 없는 배지로 1주일에 2회씩 배양 배지를 교체하며 37℃의 5% CO2 인큐베이터에서 14일간 배양하여 hMSCs의 골세포로의 분화를 유도하였다.
이후, 시각적으로 골세포 분화를 확인하기 위하여 alizarin red S 염색을 수행하였다. 분화가 끝난 플레이트의 배양액을 제거하고 DPBS로 1회 세척한 후, 4% paraformaldehyde(PFA)를 1 mL 첨가하고 상온에서 세포를 고정하였다. 고정액을 제거하고 DPBS로 세척하고 distrilled water(DW)를 이용하여 1%로 희석한 alizarin red S 용액을 2 mL씩 분주하여 상온에서 15분 동안 반응시켰다. 이후 DW로 5회 세척한 후, 1 mL의 DW를 분주한 후, 도 5에 나타낸 바와 같이, 현미경(Olympus)으로 골세포로 분화(Osteogenic differentiation)된 것을 확인하였다.
[실시예 4]
분리된 중간엽줄기세포(hMSCs)의 지방세포 분화능 확인
지방세포 분화능을 확인하기 위하여 상기 실시예 3과 동일한 방법으로, 9.5x104개의 세포를 6-well 플레이트에 넣고 0.5 mM 아이소부틸메틸잔틴(3-isobutyl-1-methylxanthine, IBMX), 100 nM 덱사메타손, 100 μM 인도메타신(Indomethacin, INDO), 10 μg/mL 인슐린(Insulin), 10% FBS와 1X AA를 high glucose DMEM에 넣어 제조한 배양 배지로 1주일에 2회 배지 교체하며 37℃의 5% CO2 배양기에서 14일간 배양하였다. 분화 확인을 위하여 분화가 끝난 플레이트의 배양액을 제거하고 DPBS로 1회 세척한 후, 상온에서 4% PFA로 고정시켰다.
이후 시각적으로 분화를 확인하기 위하여 0.2 g oil red O 분말을 40 mL 아이소프로판올(Isopropanol)에 용해하고 0.22 μm 필터에 걸러 제조한 용액 1 mL을 첨가하여 상온에서 15분 동안 반응시키고 DW로 5회 세척한 후, 도 5에 나타낸 바와 같이, 현미경(Olympus)으로 지방세포로 분화(Adipogenic differentiation)된 것을 확인하였다.
[실시예 5]
분리된 중간엽줄기세포(hMSCs)의 연골세포 분화능 확인
연골세포 분화능을 확인하기 위하여 상기 실시예 3과 동일한 방법으로, 9.5x104개의 세포를 6-well 플레이트에 넣고 1X 인슐린 트랜스페린 셀레늄(Insulin transferrin selenium premix, ITS), 50 ng/mL 아스코르브산, 40 μg/mL L-프롤린(L-proline), 100 nM 덱사메타손 등의 성분과 10% FBS, 1X AA를 α MEM에 넣어 제조한 배양배지에 10 ng/mL의 전환성장인자(Transforming growth factor, TGF-β3)를 넣어 37℃의 5% CO2 배양기에서 21일간 배양하였다. 이후, 분화가 완료된 플레이트의 배양액을 제거하고 4% PFA를 이용하여 상온에서 세포를 고정시켰다.
세포가 고정되면 DPBS로 세척하고 고정된 세포를 OCT compound에 넣어 초저온냉동고(-80℃)에서 하루간 냉동하였다. 냉동된 세포는 cryocut microtome을 이용하여 8 μm 두께의 절편을 제작하고 DW로 세척하였다. 해당 절편에 alcian blue 시약을 이용하여 제작한 1% alcian blue 용액을 첨가하고 상온에서 30분간 염색한 후, 0.1N로 제조한 HCl 용액으로 세척하고, DW로 세척한 후, 도 5에 나타낸 바와 같이, 현미경(Olympus)으로 연골세포로 분화(Chondrogenic differentiation)된 것을 확인하였다.
상기 실시예 3 내지 5를 통해 분화능을 확인한 결과, 본 발명의 기술에 의해 인간 지방에서 분리된 세포의 순수성이 매우 높은 것을 확인하였고, 장기간 배양하는 동안에도 줄기세포로서의 특징을 갖는 것을 확인하였다.
[실시예 6]
오가노이드-조직모듈(Tissue module) 제작을 위한 선행연구
일반적으로 오가노이드를 제작하기 위해서는 장기간의 배양이 필요하며, 크기가 증가할 경우 구 형태의 오가노이드 중심에 위치한 세포로 산소 또는 영양분의 공급이 제한되어 세포 사멸의 가능성이 증가하게 된다. 따라서, 중심부로 산소 및 영양분의 공급이 원활하도록 하기 위하여 컵모양 형태의 오가노이드-조직모듈을 생성하는 조건을 찾고자 하였다. 오가노이드-조직모듈의 생성조건을 찾아낸 후, 오가노이드-조직모듈의 생성 과정 중 분화 환경을 제공하여 크기가 수 밀리미터 단위까지 증가된 오가노이드를 짧은 시간 안에 생성하고자 하였다.
상기 실시예에서 제조 및 확인된 hMSCs를 이용하여 오가노이드-조직모듈(Tissue Module)을 제작하기 위한 다양한 크기의 스페로이드를 제작하였다. 96-well 플렛(flat), 또는 U-모양바닥(U-bottom) 플레이트의 각 well에 10,000개 또는 15,000개 hMSC를 넣고 500*?*g에서 5분동안 원심분리를 하여 강제적 응집을 유도하였다. 세포를 배양하여 무작위적으로 강제응집된 세포집합체를 배양하여 다양한 크기의 스페로이드를 만들었다.
직경이 50 ~ 500 μm인 크고 작은 hMSC 스페로이드가 각 웰에 형성되었고, 96-well 플레이트에 생성된 스페로이드 전체를 수합하였다. 원심분리하여 상층액을 제거한 후, 200 μl의 배지에 재현탁하고 ultra-low attachment 96-well 플레이트의 한 well에 옮겼다. 37도 배양기에 넣어 자가조립화(self-assembly)를 유도하였다.
생성된 스페로이드는 사용한 96-well 플레이트 바닥의 상태(편평한 바닥 혹은 둥근 바닥)에 따라 크기의 범위가 달랐으며, 도 6에 나타낸 바와 같이, 자가조립화가 일어나지 않는 well과 도 7에 나타낸 바와 같이, 자가조립되어 중앙에 오목한 홈이 있는 독특한 구조의 오가노이드-조직모듈을 포함한 well이 존재하였다. 상기 직경 2 ~ 4 mm 컵 모양(Cup-shape)의 독특한 자가조립 형태의 구조물을 오가노이드-조직모듈(Tissue module)이라 명명하였다.
[실시예 7]
스페로이드의 오가노이드-조직모듈(Tissue module) 생성 영상 분석
스페로이드를 혼합하여 지정된 면적을 가진 플레이트(예시, 96-well 플레이트)에 옮겨 담고 스페로이드가 well 바닥에 가라앉은 시점 (0시간)으로부터 72시간동안 타임랩스 이미지를 찍었다. 각 타임랩스 이미지를 조합하여 스페로이드의 자가조립 과정을 동영상화한 후, 이미지를 분석하였다. 그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, 스페로이드들이 역동적으로 움직이며 개시(Initiation stage), 응축(Condensation stage), 리프팅 및 폴딩 단계(Lifting & folding stage)를 거쳐 컵모양의 오가노이드-조직모듈을 생성하는 것을 확인하였다.
스페로이드가 well 바닥에 가라앉은 시점 (0시간)을 개시 단계로, 각각의 스페로이드가 중앙으로 이동하며 응집되는 단계를 응축 단계로, 컵 모양이 형성되는 단계를 리프팅 및 폴딩 단계로 명명하였다. 개시 단계에서의 각 스페로이드는 경계면이 뚜렷하게 구별되며 응축 단계에서 스페로이드는 중심으로 이동하고 이웃 스페로이드와 융합하고 코어를 향해 지속적으로 수축하였다. 리프팅 및 폴딩 단계에서 오가노이드-조직모듈의 가장자리가 들어 올려지고 중력에 반하여 위쪽으로 접혀 컵 모양의 오가노이드-조직모듈이 생성되었다.
도 9에 나타낸 바와 같이, 크고 작은 스페로이드가 응집될 때 작은 스페로이드가 큰 스페로이드로 끌려 뭉치는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 오가노이드-조직모듈을 위한 자기구조화를 유발하기 위하여 스페로이드 크기 및 크기에 따른 비율이 중요함을 나타낸다.
[실시예 8]
오가노이드-조직모듈(Tissue module) 제작을 위한 스페로이드의 크기 분석
오가노이드-조직모듈을 제작하기 위한 스페로이드 혼합 조건을 확인하기 위하여, 오가노이드-조직모듈 생성이 성공한 well과 실패한 well에서의 개시 단계 이미지를 분석하였다.
ImageJ를 이용하여 개시 단계의 측정 가능한 스페로이드들의 직경을 구하고 하기 표 1과 도 10과 같이 각 크기 범위에 속하는 스페로이드를 분류하였다.
스페로이드 직경 (μm) 평균 스페로이드 직경 (μm)
d1 100 이하 80
d2 100 ~ 200 140
d3 200 ~ 300 250
d4 300 ~ 400 330
d5 400 ~ 500 430
각 크기 범위에 속하는 스페로이드의 평균 직경은 100 μm 이하는 80 μm, 100 ~ 200 μm는 140 μm, 200 ~ 300 μm는 250 μm, 300 ~ 400 μm는 330 μm, 400 ~ 500 μm는 430 μm이었다.
오가노이드-조직모듈이 생성된 well의 스페로이드 크기를 분석하였을 때, 도 11에 나타낸 바와 같이, 직경 200 μm 이하 크기의 작은 스페로이드 평균 직경은 110 μm이었고, 200 μm 초과 크기의 큰 스페로이드 평균 직경은 270 μm이었다.
[실시예 9]
오가노이드-조직모듈(Tissue module) 제작을 위한 크기에 따른 스페로이드의 개수 분포 분석
오가노이드-조직모듈 생성이 성공한 well(Success)을 구성하는 각 크기별 스페로이드 수를 분석한 결과를 하기 표 2 및 도 12에 나타내었다.
스페로이드 직경 (μm) 개수 (%)
d1 100 이하 31
d2 100 ~ 200 51
d3 200 ~ 300 12
d4 300 ~ 400 5
d5 400 ~ 500 1
오가노이드-조직모듈로 제작되지 못한 well(Failure)을 구성하는 다양한 크기의 스페로이드의 개수를 분석한 결과를 하기 표 3 및 도 12에 나타내었다.
스페로이드 직경 (μm) 개수 (%)
d1 100 이하 12
d2 100 ~ 200 11
d3 200 ~ 300 61
d4 300 ~ 400 16
d5 400 ~ 500 0
상기 표 2 및 3에 나타낸 바와 같이, 오가노이드-조직모듈 개시 단계에 혼합된 스페로이드 직경이 50 ~ 500 μm로 다양한 크기일 경우, 200 μm 이하인 스페로이드가 23%일 때 오가노이드-조직모듈이 제조되지 않고, 82%일 때 제조되는 것을 확인하였다.
또한, 직경이 200 μm 초과인 스페로이드가 77%일 때 오가노이드-조직모듈이 제조되지 않고, 18%일 때 제조되는 것을 확인하였다.
또한, 직경이 200 μm 이하인 스페로이드의 수가 직경이 200 μm 초과인 스페로이드의 수보다 많을 경우, 오가노이드-조직모듈이 제조되는 것을 확인하였다.
[실시예 10]
오가노이드-조직모듈(Tissue module) 제작을 위한 스페로이드의 공간 점유율 분석
오가노이드-조직모듈 제작을 위한 조건을 확인하기 위하여, 크기에 따른 스페로이드의 점유 공간 및 잔여 공간을 분석하였다.
오가노이드-조직모듈 생성이 성공한 well(Success)을 구성하는 스페로이드의 크기 별 점유 공간을 분석한 결과를 하기 표 4 및 도 13에 나타내었다. 점유 공간은 전체 스페로이드들이 차지하는 공간의 합에 대한 하기 크기 범위에 속한 스페로이드들이 차지하는 공간 합의 비율을 퍼센트로 나타내었다.
개별 스페로이드가 차지하는 공간은 ImageJ 분석으로부터 도출한 반지름(r)으로 부터 수식 π x r2을 이용하여 계산하였다.
스페로이드 직경 (μm) 평균 점유 공간 (%)
d1 100 이하 8
d2 100 ~ 200 40
d3 200 ~ 300 29
d4 300 ~ 400 20
d5 400 ~ 500 3
오가노이드-조직모듈로 제작되지 못한 well(Failure)을 구성하는 스페로이드 크기 별 스페로이드의 점유 공간을 분석한 결과를 하기 표 5 및 도 13에 나타내었다.
스페로이드 직경 (μm) 평균 점유 공간 (%)
d1 100 이하 1
d2 100 ~ 200 5
d3 200 ~ 300 69
d4 300 ~ 400 25
d5 400 ~ 500 0
상기 표 4 및 5에 나타낸 바와 같이, 오가노이드-조직모듈 개시 단계에 혼합된 스페로이드 직경이 50 ~ 500 μm로 다양한 크기일 경우, 200 μm 이하인 스페로이드가 전체 스페로이드가 점유한 공간의 6%일 때 오가노이드-조직모듈이 제조되지 않고, 48%일 때 제조되는 것을 확인하였다.
또한, 직경이 200 μm 초과인 스페로이드가 전체 스페로이드가 점유한 공간의 94%일 때 오가노이드-조직모듈이 제조되지 않고, 52%일 때 제조되는 것을 확인하였다.
Well의 바닥 면적을 100%로 가정하였을 경우, ImageJ 소프트웨어를 사용하여 스페로이드가 점유하는 공간을 제외하고 비어있는 공간(Remaining Space)를 추가로 분석하여 그 결과를 도 14 및 표 6에 나타내었다.
도 14, 표 6 및 표 7에 나타낸 바와 같이, 오가노이드-조직모듈이 제조되는 경우 전체 면적에 대한 비어있는 공간의 면적은 5 ~ 40 %인 것을 확인하였다.
결국, 오가노이드-조직모듈을 제조하기 위하여, 비어있는 공간의 면적이 5 ~ 40%, 바람직하게는 10 ~ 35 %, 더욱 바람직하게 15 ~ 30%인 것을 알 수 있다.
성공
배양면적 중 스페로이드가 차지하지 않는 면적 비율(%) 5.895642
6.08849
6.722133
11.5066
14.49116
15.20745
16.429
16.429
16.78697
19.28481
21.47
22.57241
26.86098
26.861
27.182
27.182
27.908
28.018
28.734
29.21189
29.212
30.06594
30.066
34.501
34.575
34.575
평균 22.60023
표준편차 9.838078
실패
배양면적 중 스페로이드가 차지하지 않는 면적 비율(%) 1.689717
1.864198
2.314177
2.800889
3.315151
3.636564
3.783496
42.53678
44.28159
51.57309
52.5
58.6
62.3
[실시예 11]
오가노이드-조직모듈(Tissue module) 제작의 생체운동학적(Bio-kinematic analysis) 분석
오가노이드-조직모듈의 자가조립 과정을 확인하기 위하여 하기와 같이 생체운동학적 분석(Bio-kinematic analysis)을 수행하였다.
오가노이드-조직모듈의 형성과정 동안 스페로이드의 움직임을 영상 촬영하였고, 상기 영상을 바탕으로 스페로이드의 속도, 궤적, 직선성 및 협조성 등의 시공간적 분포를 분석 및 계산하였다. 시간에 따라 촬영된 이미지들을 Image J 프로그램 및 the particle image velocimetry (PIV) 알고리즘을 기반으로 한 MATLAB 코드를 이용하여 오가노이드-조직모듈이 제작되는 동안 제한된 공간 내에서의 스페로이드 운동성을 계산하였다.
도 15에 나타낸 바와 같이, 오가노이드-조직모듈 생성의 개시 단계, 응축 단계, 리프팅 및 폴딩 단계에서 스페로이드의 움직임에 전형적인 특징이 발견되었다. 스페로이드의 평균 속도가 12시간마다 변동을 나타내는 것은 12시간마다 실시한 배양 배지의 교환 때문으로 배지 교환에 의한 운동성 변화는 분석에서 제외하였다.
개시 단계에서는 스페로이드마다 불규칙적이고 서로 다른 속도(0-1.5 μm/min)의 운동성을 나타내었다.
응축 단계에서는 오가노이드-조직모듈의 중심부의 움직임은 비교적 정적인 반면 경계 영역의 스페로이드는 여전히 동적인 운동성을 보이는 것으로 확인하였다.
리프팅 및 폴딩 단계에서는 대부분의 스페로이드 이동이 감소하여 안정화되었으며, 경계 영역에서만 약간의 반복적인 움직임이 관찰되었다.
또한, 도 16에 나타낸 바와 같이, 스페로이드의 이동 거리(경로길이) 분석에 의하면 응축단계의 오가노이드-조직모듈 경계 영역은 직선 운동을 나타내는 반면, 중앙 영역의 스페로이드는 비틀린(트위스트) 움직임을 보였다. 리프팅 및 폴딩 단계에서는 경계 영역에서 스페로이드의 움직임이 거의 확인되지 않았다.
도 17의 궤적분석에 의하면 개시 단계에서 스페로이드는 무작위의 움직임을 나타내었였으나, 응축 단계에서 경계 영역의 스페로이드가 중심을 향하여 선형으로 이동하는 것이 관찰되었다. 특이하게도 폴딩 영역의 스페로이드에서 중심보다 더 긴 궤적과 더 높은 직진성이 관찰되었다. 이러한 움직임은 일반적으로 응집체들이 안정적인 구조 형성을 할 때 나타나는 현상으로 리프팅 폴딩 단계의 오가노이드-조직모듈이 구조적으로 안정한 구조로 전환되었음을 나타낸다.
추가적으로 원형도와 같은 표현형 파라미터를 분석한 결과, 도 18에 나타낸 바와 같이, 스페로이드를 혼합하고 24시간 배양 후, 오가노이드-조직모듈의 원형도는 스페로이드의 운동성으로 일시적으로 감소되었다가, 추가 18시간 배양 후 모든 방향에서 동일한 직경을 갖는 즉 원을 뜻하는 1.0에 가까워졌다. 이와 같은 결과는 불규칙한 구조를 가진 오가노이드-조직모듈이 24시간 이내에 규칙적인 구조로 재구성되기 시작한다는 것을 의미한다.
또한, 도 18에 나타낸 바와 같이, 생체운동학적, 형태학적 분석을 통해 개시(0시간), 응축(4.3시간), 리프팅 및 폴딩(39시간)의 각 단계에 따라 오가노이드-조직모듈이 자기구조화되는 것을 알 수 있다.
[실시예 12]
최적화 조건을 이용한 오가노이드-조직모듈(Tissue module) 제작
상기 실시예 8 내지 11의 실험결과로부터, 직경이 200 μm 이하인 스페로이드와 직경이 200 μm 초과인 스페로이드의 혼합 비율, 직경이 200 μm 이하인 스페로이드와 직경이 200 μm 초과의 스페로이드의 공간 점유율, 및 오가노이드-조직모듈이 배양되는 공간에 대하여 비어있는 공간의 면적이 오가노이드-조직모듈의 생성과 직접적으로 관련이 있는 것을 확인하였다.
따라서, 상기 조건을 확인하기 위하여 다양한 조건에서 실험을 수행하였다.
AggreWell 플레이트의 각 microwell에 100, 500, 1000, 3000, 5000개의 세포가 들어 갈 수 있도록 하였고, 배양액은 40 μg/ml L-proline, 100 μg/ml sodium pyruvate, 50 μg/ml L-ascorbic acid 2-phosphate, 1xITS, 1xAA가 들어있는 DMEM을 사용하였다.
Aggrewell에 배양한 결과를 도 19에 나타내었다. 평균 직경 200 μm 이하의 스페로이드는 500개 세포로 구성된 스페로이드를 선택하였고, 평균 직경 200 μm 초과의 스페로이드는 3000개의 세포로 구성된 스페로이드를 선택하였다. 500개의 세포로 구성된 스페로이드를 0.5K라 명명하고 3000개의 세포로 구성된 스페로이드를 3K 스페로이드로 명명하였다.
상기 실시예 10에서 기술한 바와 같이, 전체 배양면적 중 비어있는 면적이 약 20%가 되도록, 상기 수득된 2가지 크기의 0.5K와 3K 스페로이드를 ultra-low attachment 96-well 플레이트에 개수 비율을 달리하여 혼합배치하였다.
먼저, 0.5K 스페로이드를 10%, 30%, 50%로 증가하였을 경우 자가조립이 일어나지 않았다. 반면, 0.5K와 3K 스페로이드 중 0.5K 스페로이드를 60% 이상, 3K 스페로이드를 40% 이하로 혼합하였을 때 도 20에 나타낸 바와 같이, 스페로이드의 자가조립을 통한 오가노이드-조직모듈이 형성되는 것을 확인하였다. 따라서, 직경이 다른 스페로이드를 혼합하여 배양할 때 오가노이드-조직모듈이 제조되며, 직경이 200 μm 이하인 스페로이드의 수가 직경이 200 μm 초과인 스페로이드의 수보다 많을 때, 오가노이드-조직모듈이 잘 제조되는 것을 알 수 있다.
오가노이드-조직모듈 형성에 있어서, 비어있는 공간이 미치는 영향을 조사하기 위하여, 0.5K 스페로이드와 3K 스페로이드의 혼합 개수 비율을 90% 및 10%로 각각 고정하고, 도 21과 같이 스페로이드가 차지하지 않고 비어있는 배양면적을 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 및 10% 미만이 되도록 각각 혼합 배치하였다. 비어있는 면적이 50%보다 클 경우 스페로이드의 자가조립이 잘 일어나지 않았고 40% 이하일 경우 스페로이드의 자가조립에 의한 오가노이드-조직모듈이 잘 형성되는 것을 확인하였다.
또 다른 실시예로, 비어있는 공간의 면적이 전체 배양 면적의 20%가 되도록 한 후, 배양을 통하여 스페로이드의 자기구조화를 유도하여 오가노이드-조직모듈을 제작하였다. 상기 자가조립 과정을 통해 도 22에 나타낸 바와 같이, 오가노이드-조직모듈이 생성되었고 배양 7일에도 여전히 컵모양이 유지되는 것을 확인하였다.
또한, 오가노이드-조직모듈이 생성되는 동안 스페로이드들은 인접한 스페로이드들과 융합되고 응축되면서 큰 구조물을 형성하였다. 스페로이드가 융합되어 오가노이드-조직모듈이 형성될 때, 서로 다른 스페로이드가 융합시 스페로이드를 구성하는 세포들이 고르게 혼합되지 않고 원래 있었던 스페로이드에 위치하는 양상을 나타내는 것을 도 23에 나타낸 바와 같이, 염색된 스페로이드 융합 과정을 통해 확인하였다. 표면형광염색 후 공초점현미경으로 도 24에 나타낸 바와 같이, 오가노이드-조직모듈의 컵모양을 확인하였다. 오가노이드-조직모듈의 평균 직경은 약 2 ~ 4 mm (배양면적의 10 ~ 35%)로 인체에서 가장 작은 기관인 송과선(Pineal gland, 5-8 mm) 절반정도의 크기인 것을 확인하였다.
[실시예 13]
제작된 오가노이드-조직모듈(Tissue module)의 hMSCs 줄기세포 특성 확인
제작된 오가노이드-조직모듈을 구성하는 hMSCs가 줄기세포로서의 특성을 유지하는지 확인하기 위하여 상기 오가노이드-조직모듈로부터 단일세포를 분리하여 줄기세포 마커의 발현과 분화능을 확인하였다. 도 25에 나타낸 바와 같이, 오가노이드-조직모듈을 구성하는 세포들이 줄기세포 마커를 발현하고 지방세포, 골세포, 연골세포로 분화하며 줄기세포로서의 특성을 유지하는 것을 확인하였다.
[실시예 14]
제작된 오가노이드-조직모듈(Tissue module)의 세포사멸 저항성 확인
제작된 오가노이드-조직모듈이 구형의 세포응집체에 비해 세포사멸에 저항성이 있는 지 확인하기 위하여, 같은 수의 세포로 구성된 구형의 응집체와 오가노이드-조직모듈을 제작하였다. 구형의 세포응집체는 세포를 U bottom 플레이트에 넣고 500xg에서 5분동안 원심분리한 후 37도 배양기에서 응집을 유도하였고 오가노이드-조직모듈의 배양조건과 동일한 조건에서 총 6일간 배양하였다. 구형의 세포응집체의 경우 세포사멸로 인해 구형체 주변에 죽은 세포조각들이 많이 존재하였으나, 도 26에 나타낸 바와 같이, 오가노이드-조직모듈은 상대적으로 매우 적은 수의 죽은 세포조각이 관찰되었다. 오가노이드-조직모듈과 구형의 세포응집체를 4% PFA에 하루동안 고정하고 파라핀 블록에 포매하였다. 4 μm 두께로 슬라이드를 제작하고 탈파라핀화한 후 프로티네이즈 K(Proteinase K)를 처리하여 조직내 단백질을 녹여내었다. 3% 과산화수소(H2O2)를 처리하여 내인성 퍼옥시데이즈(Peroxidase)을 제거하고 ApoTag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit(Millipore)를 사용하여 TUNEL(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase dUTP Nick end Labeling) 염색을 실시하였다. 메틸 그린(Methyl Green)으로 핵을 대비염색한 후 이미지를 획득하였다. 도 26에 나타낸 바와 같이, 오가노이드-조직모듈의 중심부는 주변부와 비교하여 증가된 세포사멸이 관찰되지 않았다. 그러나 구형의 세포응집체 중심부에는 TUNEL에 염색된 죽은 세포가 많이 존재하였고 괴사에 의해 비어있는 공간이 생겨 있었다. 이로부터 오가노이드-조직모듈은 중심부가 오목한 컵 모양의 구조적 특징으로 인하여 영양분과 산소의 원활한 공급이 이루어졌을 것으로 판단되며, 크기가 증가함에 따라 중심부 세포사멸이 증가하는 단점을 극복할 수 있는 기술적 장점이 있는 것으로 판단된다.
[실시예 15]
Type 2 collagen 발현 여부 확인을 통한 제작된 오가노이드-조직모듈(Tissue module)의 연골세포로의 분화 가능성 확인
본 발명에서 사용한 hMSCs는 연골세포로 분화할 수 있는 줄기세포이기 때문에 연골 조직 공학에서 유망한 세포원으로 사용되어 왔다(Somoza et al., 2014). 상기 제작된 오가노이드-조직모듈이 연골세포로 분화 가능성을 확인하기 위하여 TGF-β3를 처리하여 오가노이드-조직모듈의 연골세포로의 분화를 유도한 후, 해당 샘플을 회수하여 4% PFA에 약 3일간 고정하고 조직학적 분석을 위하여 면역조직화학염색(Immunohistochemistry, IHC)을 수행하였다.
이를 위하여 고정된 샘플을 파라핀 블록에 포매하여 4 μm 두께로 슬라이드를 제작하였다. 이 슬라이드를 histo-clear에서 30분간 탈파라핀화 하고 100% 에탄올부터 70% 에탄올까지 수화 과정을 거친 후 PBS로 세척하였다. 이후 0.3% 소혈청알부민(Bovine Serum Albumin, BSA)을 녹인 PBS 용액으로 상온에서 1시간 blocking을 거친 후 동일한 용액에 적정 농도의 2형 콜라겐(Type 2 collagen) 1차 항체를 희석하여 4℃에서 12시간 이상 정치하였다. 정치가 끝난 후 다시 PBS 세척을 거쳐 blocking 용액에 적정 농도의 2차 항체를 희석하여 37℃에서 1시간 정치하고 PBS 세척을 거쳐 DAB를 반응시켜 발색을 내었다.
상기 실험결과는 도 27에 나타내었으며, 2형 콜라겐이 큰 스페로이드에 해당하는 구형 단위의 세포에서 주로 발현되는 것을 확인하였다.
[실시예 16]
Aggrecan 확인을 통한 제작된 오가노이드-조직모듈(Tissue module)의 연골세포로의 분화 가능성 확인
연골세포 분화의 표지자인 아그리칸(Aggrecan)을 확인하기 위하여, 한국등록특허 제10-2170076호(하이드로겔 중합체를 이용한 탈세포화 조직의 탈세포화 조직의 제조방법 및 이로부터 제조된 탈세포화 조직)의 방법에 따라 3D clearing 과정을 진행하여 스페로이드를 투명화한 후, 항체를 이용하여 3D로 아그리칸의 발현을 조사하였다.
이를 위하여 제작된 오가노이드-조직모듈을 4% PFA에 1주일간 고정하고 0.1% triton-X를 녹인 PBS로 세척한 후, 6% BSA와 0.2% triton X-100, 0.01% 아지드화 나트륨(Sodium azide)를 PBS에 녹인 용액을 이용하여 상온에서 최소 8시간 이상 blocking 과정을 진행하였다. 이후, 아그리칸 항체를 blocking 용액에 적정 농도로 희석하여 오가노이드-조직모듈에 분주하고 상온에서 2일간 반응시켰다. 앞서 사용한 세척 용액으로 세척을 진행하고, blocking 용액에 2차 항체와 hoechest를 적정 농도로 희석하여 스페로이드에 분주하고 상온에서 2일간 반응시켰다. 세척 과정을 거쳐 항체 반응이 완료된 후 25% 요소(Urea)와 65% 수크로스(Sucrose)를 물에 녹인 용액을 이용하여 투명화 과정을 진행하였다.
상기 실험결과를 도 28에 나타내었으며, 아그리칸의 발현은 오가노이드-조직모듈의 가장자리에서 가장 높은 것을 확인하였다.
[실시예 17]
글리코사미노글리칸을 통한 연골 분화의 정량적 비교 분석
연골의 중요한 세포외기질인 글리코사미노글리칸(Glycosaminoglycan, GAG)을 통하여 연골 분화의 정량적 비교 분석을 위하여 GAG assay를 수행하였다.
이를 위하여 200 mM 인산 나트륨(Sodium phosphate), 100 mM 아세트산 나트륨(Sodium acetate), 10 mM 에틸렌다이아민테트라아세트산(Ethylene diamine tetraacetin acid, EDTA)과 5 mM L-시스테인(L-cysteine)을 녹이고 pH를 6.4로 조정한 용액에 7.8 μL의 파파인(Papain)을 넣어 파파인 용액을 제조하고, 샘플을 넣어 65℃ 항온 수조에서 18시간 동안 반응시켰다. 18시간 후, 10,000 g에서 10분간 원심분리하고 sulfate glycosaminoglycan assay kit의 지침에 따라 GAG 함량을 측정하였다.
시료의 흡광도는 microplate reader 기기를 이용하여 656 nm에서 측정하였으며, 측정 결과의 정규화를 위하여 pico-green dsDNA assay kit를 이용하여 총 DNA량을 정량화하였다.
상기 실험 결과를 도 29에 나타내었으며, 단일 세포와 비교하여 오가노이드-조직모듈에서 유의적으로 GAG 함량이 증가한 것을 확인하였다.
[실시예 18]
다양한 염색 기법을 이용한 연골 분화 유도된 오가노이드-조직모듈(Tissue module)의 조직학적 분석
면역조직학적 염색의 결과를 확인하기 위하여, 오가노이드-조직모듈 샘플을 파라핀 블럭으로 포매하고 4 μm의 두께로 박절하여 슬라이드를 제작하였다. 상기와 동일한 방법으로 탈파라핀화를 진행한 후, 헤마톡실린과 에오신(Hematoxylin & Eosin, H&E) 용액을 이용하여 염색하고, 오가노이드-조직모듈 내의 합성 콜라겐은 Trichrome III Blue Staining Kit를 이용하여 검출하였으며, Safranin-O/fast green kit를 이용하여 GAG 발현을 시각화하였다.
상기 실험 결과를 도 30에 나타내었으며, Masson`s trichrome 염색 결과, 콜라젠의 합성으로 인해 전체적으로 파란색으로 염색되었고 Safranin-O 염색결과 붉게 염색된 GAG가 오가노이드-조직모듈의 모든 위치에서 발현되는 것을 확인하였다. 따라서 오가노이드-조직모듈이 TGF-β3와 같은 연골분화인자에 의해 연골세포 오가노이드로 분화한 것을 확인하였다.
[실시예 19]
연골 결손 토끼 모델을 통한 오가노이드-조직모듈(Tissue module) 효능 확인
연골결손 골관절염(CD/osteoarthritis (OA)) 모델에 대한 오가노이드-조직모듈의 연골재생 효능을 확인하기 위하여 뉴질랜드 흰토끼 성체의 무릎에 연골 전층을 제거하는 연골 결손 모델을 제작하고 오가노이드-조직모듈을 결함 부위에 이식하는 실험을 진행하였다. 해당 실험은 서울대학교 병원의 기관 동물 관리 위원회의 인증을 받아 진행되었으며(SNUH-IACUC No. 18-0171-S1A0), 동물은 국립연구소(National Research Corporation, NRC)의 실험실 동물 관리 및 사용지침서 제8판에 따라 실험실 동물 관리 국제 협회(Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care, AAALAC)의 평가 및 인증을 받은 시설에서 유지 관리되었다.
5 mg/kg 자일라진(Xylazine)과 15 mg/kg 졸레틸(Zoletil)을 혼합하여 근육주사를 통해 토끼를 마취하였으며, 무균 수술 도구를 이용하여 무릎 관절에 직경 3mm x 깊이 3 mm의 연골 결손을 유도하고, 오가노이드-조직모듈 이식 그룹은 오가노이드-조직모듈을 삽입한 후 봉합하였으며, 수술 후 3일간 0.3 mL 메타캄(Metacam)과 1 mL 세파졸린(Cefazolin)을 피하주사하여 항생제와 진통제 처리하였다. 동물은 수술 후, 12주 혹은 14주에 희생하였으며, 조직학적 평가에 앞서 무릎을 절취하여 micro-computed tomography(Micro-CT) 촬영을 진행하였다.
실험 후 Micro-CT를 이용하여 토끼 연골을 촬영한 결과, 도 31에 나타낸 바와 같이, 결손 되었던 부위가 모두 완전히 충전되어 있는 것을 확인하였다. 또한, 토끼 무릎 연골 조직을 이용하여 파라핀 절편을 제작하여 H&E 염색을 진행한 결과, 결손된 연골에서 골단판의 구조의 생성이 증가된 것을 확인하였고, 오가노이드-조직모듈의 이식 부위에서 광범위한 세포외기질과 골소강의 형태를 뚜렷이 확인하였다.
또한, safranin-O 염색을 통하여 해당 부위를 확인한 결과, 도 31에 나타낸 바와 같이, 오가노이드-조직모듈 이식군에서 히알루로닉 연골의 형성을 확인하였다.
상기 실험을 통하여, CD/OA 토끼 모델에 오가노이드-조직모듈의 이식 12주 후에 생성된 연골은 토끼의 기존 주변 연골보다 두꺼웠으며, 오가노이드-조직모듈은 손상된 연골과 완전히 융합되어 있는 것을 확인하였다. 결국, 밀리미터 크기로 제작된 오가노이드-조직모듈이 CD/OA 모델에서 뛰어난 재생 효과를 갖는 것을 알 수 있었다.

Claims (22)

  1. 직경이 다른 스페로이드를 혼합 및 배양하여 오가노이드-조직모듈(Tissue Module)을 제조하는 방법
  2. 제1항에 있어서, 상기 스페로이드는 10 내지 1,000 μm의 직경을 갖는 것을 특징으로 하는, 오가노이드-조직모듈을 제조하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 스페로이드는 50 내지 500 μm의 직경을 갖는 것을 특징으로 하는, 오가노이드-조직모듈을 제조하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 직경이 200 μm 이하인 스페로이드가 전체 스페로이드의 60% 이상인 것을 특징으로 하는, 오가노이드-조직모듈을 제조하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 직경이 200 μm 이하인 스페로이드가 전체 스페로이드의 70% 이상인 것을 특징으로 하는, 오가노이드-조직모듈을 제조하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 직경이 200 μm 이하인 스페로이드가 전체 스페로이드의 80% 이상인 것을 특징으로 하는, 오가노이드-조직모듈을 제조하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 직경이 200 μm 초과인 스페로이드가 전체 스페로이드의 40% 이하인 것을 특징으로 하는, 오가노이드-조직모듈을 제조하는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 직경이 200 μm 초과인 스페로이드가 전체 스페로이드의 30% 이하인 것을 특징으로 하는, 오가노이드-조직모듈을 제조하는 방법.
  9. 제1항에 있어서, 직경이 200 μm 초과인 스페로이드가 전체 스페로이드의 20% 이하인 것을 특징으로 하는, 오가노이드-조직모듈을 제조하는 방법.
  10. 제1항에 있어서, 직경이 200 μm 이하인 스페로이드의 수가 직경이 200 μm 초과인 스페로이드의 수보다 많은 것을 특징으로 하는, 오가노이드-조직모듈을 제조하는 방법.
  11. 제1항에 있어서, 스페로이드가 점유하지 않은 공간이 스페로이드를 배양하는 전체 공간에 대하여 5 ~ 40 %인 것을 특징으로 하는, 오가노이드-조직모듈을 제조하는 방법.
  12. 제1항에 있어서, 스페로이드가 점유하지 않은 공간이 스페로이드를 배양하는 전체 공간에 대하여 10 ~ 35 %인 것을 특징으로 하는, 오가노이드-조직모듈을 제조하는 방법.
  13. 제1항에 있어서, 스페로이드가 점유하지 않은 공간이 스페로이드를 배양하는 전체 공간에 대하여 15 ~ 30 %인 것을 특징으로 하는, 오가노이드-조직모듈을 제조하는 방법.
  14. 제1항에 있어서, 상기 조직 모듈은 배양면적의 10 ~ 35%를 차지하는 것을 특징으로 하는, 오가노이드-조직모듈을 제조하는 방법.
  15. 제1항에 있어서, 상기 조직 모듈은 약 2 ~ 4 mm의 직경을 갖는 것을 특징으로 하는, 오가노이드-조직모듈을 제조하는 방법.
  16. 제1항에 있어서, 상기 스페로이드는 줄기세포 또는 미분화세포를 배양하여 수득되는 것을 특징으로 하는, 오가노이드-조직모듈을 제조하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 줄기세포 또는 미분화세포는 배아줄기세포, 역분화줄기세포, 성체줄기세포 및 중간엽 줄기세포로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 오가노이드-조직모듈을 제조하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 줄기세포는 인간 지방 유래 중간엽 줄기세포(hMSC)인 것을 특징으로 하는, 오가노이드-조직모듈을 제조하는 방법.
  19. 제1항에 있어서, 상기 오가노이드-조직모듈은 컵 모양의 형태를 갖는 것을 특징으로 하는, 오가노이드-조직모듈을 제조하는 방법.
  20. 제1항에 있어서, 상기 방법은 스캐폴드와 인공물질을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는, 오가노이드-조직모듈을 제조하는 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 제조방법으로 제조된 오가노이드-조직모듈.
  22. 제21항의 오가노이드-조직모듈을 포함하는, 연골질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101733137B1 (ko) * 2015-12-30 2017-05-08 (주)엑셀세라퓨틱스 연골조직 제조를 위한 3차원 오가노이드 블록 제작 방법
KR20190131853A (ko) * 2018-05-17 2019-11-27 한국과학기술연구원 지방줄기세포 및 간세포를 포함하는 3차원 세포집합체의 제조방법
KR20220025738A (ko) * 2019-05-31 2022-03-03 칠드런즈 호스피탈 메디칼 센터 형상화된 오가노이드 조성물 및 그의 제조 방법

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101733137B1 (ko) * 2015-12-30 2017-05-08 (주)엑셀세라퓨틱스 연골조직 제조를 위한 3차원 오가노이드 블록 제작 방법
KR20190131853A (ko) * 2018-05-17 2019-11-27 한국과학기술연구원 지방줄기세포 및 간세포를 포함하는 3차원 세포집합체의 제조방법
KR20220025738A (ko) * 2019-05-31 2022-03-03 칠드런즈 호스피탈 메디칼 센터 형상화된 오가노이드 조성물 및 그의 제조 방법

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DIMITRIOS KOUROUPIS: "Increased Mesenchymal Stem Cell Functionalization in Three-Dimensional Manufacturing Settings for Enhanced Therapeutic Applications", FRONTIERS IN BIOENGINEERING AND BIOTECHNOLOGY, FRONTIERS RESEARCH FOUNDATION, CH, vol. 9, 12 February 2021 (2021-02-12), CH , pages 621748, XP093158701, ISSN: 2296-4185, DOI: 10.3389/fbioe.2021.621748 *
GOZDE EKE: "Cell Aggregate Assembly through Microengineering for Functional Tissue Emergence", CELLS, MDPI AG, vol. 11, no. 9, 20 April 2022 (2022-04-20), pages 1394, XP093158699, ISSN: 2073-4409, DOI: 10.3390/cells11091394 *
LISE DE MOOR: "Hybrid Bioprinting of Chondrogenically Induced Human Mesenchymal Stem Cell Spheroids", FRONTIERS IN BIOENGINEERING AND BIOTECHNOLOGY, FRONTIERS RESEARCH FOUNDATION, CH, vol. 8, 25 May 2020 (2020-05-25), CH , pages 484, XP093158703, ISSN: 2296-4185, DOI: 10.3389/fbioe.2020.00484 *

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