JP2016512958A - 上皮幹細胞の液体培養 - Google Patents
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Abstract
本明細書では、液体培養物中において上皮幹細胞及び上皮幹細胞を含む組織断片を培養する方法が提供される。【選択図】図1A
Description
関連出願の相互参照
本出願は、2013年2月25日に出願された米国特許出願第61/769076号の利益を主張し、参照によりその全体を援用される。
本出願は、2013年2月25日に出願された米国特許出願第61/769076号の利益を主張し、参照によりその全体を援用される。
本明細書では、液体培養物中において上皮幹細胞及び上皮幹細胞を含む組織断片を培養する方法が提供される。
小腸上皮は2〜5日毎に再生され、したがって最も修復性の高い哺乳動物組織である。位置及び循環動態に基づいて小腸には二種類の幹細胞が類型化されている。例えば、Barkeret al., Nature 449, 1003-1007 (2007); Sangiorgi, E. & Capecchi, M. R. Nature Genet. 40, 915-920 (2008); Li, L. & Clevers, H. Science 327, 542-545 (2010)を参照。循環の早い幹細胞は、Lgr5、Cd133(Prom1としても知られる)及びSox9を含むマーカーを発現し、腸全体に存在する。例えば、Zhu, L. et al., Nature 457, 603-607 (2009); Furuyama, K. et al., Nature Genet. 43, 34-41 (2011)を参照。陰窩底部柱状細胞(CBC)としても知られるこれらの細長い細胞は、3日以内に陰窩及び繊毛に集まり、それらを支持するパネート細胞中に散在する。Sato, T. et al., Nature 469, 415-418 (2011); Cheng, H. & Leblond, C. P., Am. J. Anat. 141, 537-561 (1974)を参照。Bmi1又はマウスTert(mTert)の豊かな発現を特徴とする循環の遅い幹細胞は、それよりも少ない細胞集団である。Sangiorgi, E. & Capecchi, M. R. Nature Genet. 40, 915-920 (2008)を参照。これらの細胞は、腸の近位領域から遠位領域へと漸減勾配を形成し、したがって結腸よりも十二指腸に多く存在する。少ないとはいえ、Bmi1発現幹細胞は陰窩維持に重要である。
腸上皮幹細胞を含む初代上皮幹細胞を培養するための様々な培養系が文献に記載されている(Bjerknes and Cheng, Methods Enzymol 419, 337-83 (2006) and Sato and et al., Nature 459, 262-265 (2009))。これまでの培養系は、初代上皮幹細胞を増殖するために固体細胞外マトリックスの使用に依存している。これまでの研究により、結腸又は腸管から単離された陰窩の基本的な陰窩−繊毛生理機能の保存及び上皮幹の多能性維持に、固体細胞外マトリックスが必要であることが示されている(例えば、国際公開第2010/090513号参照)。また、幹細胞を培養するためのECMの使用は、幹細胞の長期生存及び未分化幹細胞の存在の持続を増強することが示されている。これまでECMの非存在下において、幹細胞培養物を培養できない期間がもっと長く、未分化幹細胞の存在の持続は観察されなかった。加えて、ECMの存在により、ECMの非存在下では培養することができなかった三次元組織オルガノイドの培養が可能になった。しかしながら、培養系の固体の性質により、試験の種類、及び培養系を用いて調べることができる診断用化合物の種類にはサイズ的限界がある(例えば、大きな分子は固体マトリックス中に拡散させることができない)。更に、細胞及び高次構造は固体マトリックス中に埋め込まれるため、細胞及び高次構造の分析の容易性は低下する(例えば、分析のためには高次構造(例えば、オルガノイド)を固体マトリックスから切り離さなければならない)。上皮幹の生理構造を保存してその多能性を維持し且つオルガノイドの基本的生理機能を保存しながら、試験及び診断用化合物の種類と分析の容易性を増大させる、上皮幹細胞、特に腸上皮幹細胞のよりよい培養系が必要とされている。
本明細書では、幹細胞を液体培養するための方法が提供される。特に、本明細書では、(a)上皮幹細胞及び/又は(b)上皮幹細胞を含む単離された上皮組織断片を液体培養する方法であって、上皮幹細胞及び/又は単離された組織断片を、(i)骨形成タンパク質(BMP)阻害剤、(ii)分裂促進増殖因子、(iii)Wntアゴニスト、及び(iv)少なくとも約4%(w/v)の細胞外マトリックス(ECM)を加えた、動物又はヒト細胞のための基礎培地を含む液体細胞培養物中においてインキュベートすることを含む方法が提供される。更に、本明細書では、陰窩を獲得する及び/又は増殖させる方法であって、上皮幹細胞及び/又は単離された組織断片を、(i)骨形成タンパク質(BMP)阻害剤、(ii)分裂促進増殖因子、(iii)Wntアゴニスト、及び(iv)少なくとも約4%(w/v)の細胞外マトリックス(ECM)を加えた、動物又はヒト細胞のための基礎培地を含む液体細胞培養物中においてインキュベートすることを含む方法が提供される。
いずれの方法においても、いくつかの実施態様では、BMP阻害剤が、ノギン、DAN、及び/又はケルベロス及びグレムリンを含むDAN様タンパク質である。いくつかの実施態様では、BMP阻害剤はノギンである。いくつかの実施態様では、液体細胞培養物中におけるBMP阻害剤の濃度は、約5〜約500ng/ml(例えば、約50〜約100ng/mL)である。
いずれの方法においても、いくつかの実施態様では、Wntアゴニストは、Wnt、R−spondin(RSPO)、Norrin、及び/又はGSK阻害剤である。いくつかの実施態様では、WntアゴニストはRSPOである。いくつかの実施態様では、WntアゴニストはRSPO1である。いくつかの実施態様では、WntアゴニストはRSPO2である。いくつかの実施態様では、WntアゴニストはRSPO3である。いくつかの実施態様では、WntアゴニストはRSPO4である。いくつかの実施態様では、液体細胞培養物中におけるWntアゴニストの濃度は、約500ng/mL〜約5μg/ml(例えば、約500〜約1500ng/mL)である。
いずれの方法においても、いくつかの実施態様では、分裂促進増殖因子は、上皮増殖因子(EGF)、トランスフォーミング増殖因子−アルファ(TGF−α)、塩基性繊維芽細胞増殖因子(bFGF)、脳由来神経栄養因子(BDNF)、及びケラチノサイト増殖因子(KGF)である。いくつかの実施態様では、分裂促進増殖因子はEGFである。いくつかの実施態様では、液体細胞培養物中における分裂促進増殖因子の濃度は、約5〜約500ng/ml(例えば、約5〜約50ng/mL)である。
いずれの方法においても、いくつかの実施態様では、ECMは増殖因子低減ECMである。いくつかの実施態様では、ECMはマトリゲルである。いくつかの実施態様では、液体細胞培養物中におけるECMの濃度は約4%〜約10%(w/v)である。いずれの方法においても、いくつかの実施態様では、方法は、懸滴で培養することを含む。
いずれの方法においても、いくつかの実施態様では、培地はRock(Rho−キナーゼ)阻害剤を更に含む。
いずれの方法においても、いくつかの実施態様では、培地はNotchアゴニストを更に含む。
いずれの方法においても、いくつかの実施態様では、上皮幹細胞及び/又は上皮組織断片は、胃腸幹細胞及び/又は胃腸組織断片である。いくつかの実施態様では、胃腸幹細胞及び/又は胃腸組織断片は、小腸幹細胞及び/又は小腸組織断片である。
更に本明細書においては、本明細書において記載される方法により獲得可能な陰窩、及び薬物スクリーニング、毒性アッセイ、又は再生医療における陰窩の使用が提供される。
I.定義
本明細書では、用語「ポリプチド」は、天然配列ポリペプチド、ポリペプチド変異体並びに天然配列ポリペプチド及びポリペプチド変異体の断片を指す(本明細書において更に定義づける)。本明細書に記載されるポリペプチドは、例えばヒト組織型から又は別の供給源からなど、様々な供給源から単離することができ、又は組換え又は合成法により調製することができる。
本明細書では、用語「ポリプチド」は、天然配列ポリペプチド、ポリペプチド変異体並びに天然配列ポリペプチド及びポリペプチド変異体の断片を指す(本明細書において更に定義づける)。本明細書に記載されるポリペプチドは、例えばヒト組織型から又は別の供給源からなど、様々な供給源から単離することができ、又は組換え又は合成法により調製することができる。
「天然配列ポリペプチド」は、天然由来の対応するポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
「ポリペプチド変異体」、又はその変形は、本明細書に開示される天然配列ポリペプチド配列のいずれかと少なくとも約80%のアミノ酸配列同一性を有すると本明細書で定義されるポリペプチド、通常は活性ポリペプチドを意味する。このようなポリペプチド変異体は、例えば、天然アミノ酸配列のN又はC末端において、一又は複数のアミノ酸残基が付加されている又は欠失しているポリペプチドを含む。通常、ポリペプチド変異体は、本明細書に開示される天然配列ポリペプチド配列と、少なくとも約80%のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%のアミノ酸配列同一性を有する。通常、変異ポリペプチドの長さは、少なくとも約10個のアミノ酸、或いは、少なくとも約20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600個のアミノ酸かそれ以上である。場合により、変異体ポリペプチドは、天然ポリペプチド配列と比較して一以下の保存的なアミノ酸置換、或いは、天然ポリペプチド配列と比較して、約2、3、4、5、6、7、8、9、又は10以下の保存的なアミノ酸置換を有する。
「単離された」とは、その自然環境の成分から分離された、ポリペプチド、抗体、核酸などに言及するものである。抗体のいくつかの実施態様において、抗体は、例えば、電気泳動(例えば、SDS−PAGE、等電点電気泳動(IEF)、キャピラリー電気泳動)又はクロマトグラフィー(例えば、イオン交換又は逆相HPLC)により決定されるとき、95%又は99%を上回る純度に精製される。抗体純度の評価法の総説としては、例えばFlatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)を参照のこと。
用語「抗体」は最も広い意味で用いられ、様々な抗体構造を包含し、限定しないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異性抗体(例えば二重特異性抗体)、及び、所望の抗原結合活性を示す限り、抗体断片を含む。
参照ポリペプチド配列に関する「パーセント(%)アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入した後、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした、参照ポリペプチドのアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のための配列比較は、例えばBLAST、BLAST−2、ALIGN、又はMegalign(DNASTAR)ソフトウェアのような公に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用する、当業者の技量の範囲にある種々の方法で達成可能である。当業者であれば、比較される配列の完全長に対して最大の整列を達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列を整列させるための適切なパラメータを決定することができる。しかしながら、ここでの目的のためには、%アミノ酸配列同一性の値は、配列比較コンピュータプログラムALIGN−2を使用することによって生成される。ALIGN−2配列比較コンピュータプログラムはジェネンテック社によって作製され、ソースコードは米国著作権庁、ワシントンD.C.,20559に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号TXU510087の下で登録されている。また、ALIGN−2は、ジェネンテック社、サウスサンフランシスコ、カリフォルニアから公的に入手可能であるか、又はそのソースコードからコンパイルすることができる。ALIGN−2プログラムは、デジタルUNIXのV4.0Dを含む、UNIXオペレーティングシステム上での使用のためにコンパイルされるべきである。全ての配列比較パラメータは、ALIGN−2プログラムによって設定され変動しない。
アミノ酸配列比較にALIGN−2が用いられる状況では、所与のアミノ酸配列Aの、所与のアミノ酸配列Bとの、又はそれに対する%アミノ酸配列同一性(或いは、所与のアミノ酸配列Bと、又はそれに対しての%アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Aと言うこともできる)は次のように計算される:
100 × 分率X/Y
ここで、Xは、配列アラインメントプログラムALIGN−2により、そのプログラムのAとBとの配列比較において、完全一致を記録したアミノ酸残基の数であり、YはBの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと異なる場合、AのBに対する%アミノ酸配列同一性は、BのAに対する%アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。特に断らない限り、本明細書で使用されるすべての%アミノ酸配列同一性値は、ALIGN−2コンピュータプログラムを使用し、直前の段落で説明したようにして得られる。
100 × 分率X/Y
ここで、Xは、配列アラインメントプログラムALIGN−2により、そのプログラムのAとBとの配列比較において、完全一致を記録したアミノ酸残基の数であり、YはBの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと異なる場合、AのBに対する%アミノ酸配列同一性は、BのAに対する%アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。特に断らない限り、本明細書で使用されるすべての%アミノ酸配列同一性値は、ALIGN−2コンピュータプログラムを使用し、直前の段落で説明したようにして得られる。
ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」は、当業者であれば容易に決定することができ、通常はプローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に基づく経験的計算である。通常、プローブが長いほど、適切なアニーリングに高い温度が必要であり、プローブが短い程温度は低くてよい。ハイブリダイゼーションは、通常、変性DNAの、相補鎖がその溶解温度未満の環境中に存在するときに再アニーリングする能力に依存する。プローブとハイブリダイズ可能配列との間の所望の相同性度が高い程、使用可能な相対温度が高くなる。結果として、相対温度が高い程反応条件のストリンジェンシーが高まる傾向があり、低い程その傾向が小さくなる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーの更なる詳細及び説明については、Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995)を参照されたい。
本明細書に定義される「ストリンジェントな条件」又は「高ストリンジェンシー条件」は、以下のように指定される。(1)洗浄に、低いイオン強度と高い温度、例えば、50℃で、0.015Mの塩化ナトリウム/0.0015Mのクエン酸ナトリウム/0.1%のドデシル硫酸ナトリウムを用いること;(2)ハイブリダイゼーション中に、42℃で、ホルムアミドのような変性剤、例えば、0.1%のウシ血清アルブミンを含む50%(v/v)のホルムアミド/0.1%のフィコール/0.1%のポリビニルピロリドン/750mMの塩化ナトリウム、75mMのクエン酸ナトリウムを含む50mMのリン酸ナトリウムバッファー(pH6.5)を用いること;又は(3)50%のホルムアミド、5×SSC(0.75MのNaCl、0.075Mのクエン酸ナトリウム)、50mMのリン酸ナトリウム(pH6.8)、0.1%のピロリン酸ナトリウム、5×デンハート液、超音波分解したサケ精子DNA(50μg/ml)、0.1%のSDS、及び10%デキストラン硫酸塩を用いた42℃の溶液中において一晩ハイブリダイズし、0.2×SSC(塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム)中において42℃で10分間洗浄した後、55℃でEDTAを含有する0.1×SSCからなる高ストリンシー洗浄を10分間行うこと。
「中程度にストリンジェントな条件」は、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989によって記載されているように指定することができ、上述したものよりストリンジェンシーの低い洗浄溶液及びハイブリダイゼーション条件(例えば、温度、イオン強度、及び%SDS)の使用を含む。中程度にストリンジェントな条件の例は、20%のホルムアミド、5×SSC(150mMのNaCl、15mMのクエン酸三ナトリウム)、50mMのリン酸ナトリウム(pH7.6)、5×デンハート溶液、10%の硫酸デキストラン、及び20mg/mlの変性せん断サケ精子DNAを含む溶液中において37℃で一晩インキュベートした後、約37〜50℃の1×SSCでフィルタを洗浄することである。当業者であれば、プローブ長などの要因に適合させるために必要な温度、イオン強度などの調節方法を認識するであろう。
「組織試料」又は「組織断片」は、被験体又は個体の組織から得られた類似の細胞の集合を意味する。組織試料又は組織断片の供給源は、新鮮な、冷凍の、及び/又は保存された器官、組織試料、生検、及び/又は吸引物由来の固体組織;血液又は血漿のような何らかの血液成分;脳脊髄液、羊水、腹水、又は間質液のような体液;被験体の妊娠又は発育の任意の時期に由来する細胞とすることができる。組織試料又は組織断片は、初代若しくは培養細胞又は細胞株でもよい。任意選択的に、組織試料又は組織断片は疾患組織/器官から得られる。組織試料は、本質的に組織と自然に混在しない化合物、例えば、防腐剤、抗凝血剤、緩衝剤、定着剤、栄養剤、抗生物質などを含む場合がある。
本明細書で使用される「基準試料」、「基準細胞」、「基準組織」、「コントロール試料」、「コントロール細胞」、又は「コントロール組織」は、比較を目的として使用される試料、細胞、組織、標準、又はレベルを指す。一実施態様では、基準試料、基準細胞、基準組織、コントロール試料、コントロール細胞、又はコントロール組織は、同じ被験体又は個体の身体(例えば、組織又は細胞)の健常な及び/又は非疾患性の部分から得られる。例えば、健常な及び/又は非疾患性の細胞又は組織は、疾患細胞又は組織に隣接している(例えば、腫瘍に隣接する細胞又は組織)。別の実施態様では、基準試料は同じ被験体又は個体の身体の未処理組織及び/又は細胞から得られる。また別の実施態様では、基準試料、基準細胞、基準組織、コントロール試料、コントロール細胞、又はコントロール組織は、被験体又は個体ではない個体の身体(例えば、組織又は細胞)の、健常な及び/又は非疾患性の部分から得られる。さらに別の実施態様では、基準試料、基準細胞、基準組織、コントロール試料、コントロール細胞、又はコントロール組織は、被験体又は個体ではない個体の身体の未処理組織及び/又は細胞から得られる。
本明細書で用いられる用語「実質的に同じ」は、当業者が、二つの値の間の差異が、その値(例えばKd値又は阻害)によって測定される生物学的特性という文脈において、殆ど又は全く生物学的及び/又は統計学的有意性を持たないと考慮するために、二つの数値間の類似性が十分に高いことを指す。このような二つの値の間の差異は、基準/比較値に応じて、例えば約50%未満、約40%未満、約30%未満、約20%未満、及び/又は約10%未満である。
本明細書で用いられる表現「実質的に異なる」は、当業者が、二つの値の間の差異が、その値(例えばKd値又は阻害)によって測定される生物学的特性という文脈において、統計学的有意性を持つと考慮するために、二つの数値間の差異が十分に大きいことを指す。前記二つの値の間の差異は、参照/比較分子の値に応じて、例えば約10%より大きい、約20%より大きい、約30%より大きい、40%より大きい、及び/又は約50%より大きい。
薬剤の「有効量」とは、所望の治療的又は予防的結果を達成するために必要な用量及び期間において効な量を指す。
「患者」、「個体」、又は「被験体」は、哺乳動物である。哺乳動物には、限定されないが、家畜動物(例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、及びウマ)、霊長類(例えば、ヒト、及びサルなどの非ヒト霊長類)、ウサギ、並びにげっ歯類(例えば、マウス及びラット)が含まれる。特定の実施態様において、患者、個体又は被検体はヒトである。
「低減する又は阻害する」とは、20%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%又はそれ以上の全体的減少を引き起こす能力を意味する。低減する又は阻害するとは、治療する疾患の症状、転移の存在又は大きさ、又は原発腫瘍の大きさに言及することができる。
当業者によって理解されるように、本明細書において値又はパラメータ「について」という場合、その値又はパラメータ自体を対象とする実施態様を含む(記載する)。例えば、「Xについて」との記載には「X」の記載が含まれる。
本明細書に記載される本発明の態様及び実施態様は、態様及び実施態様「からなる」及び/又は「から本質的になる」ことを含む。本明細書で使用されるように、単数形の「a」、「an」及び「the」は、特に指示がない限り、複数への言及を含む。
II.方法及び使用
本明細書では、幹細胞を液体培養するための方法が提供される。本明細書では、未分化表現型及び自己保全能力を保持する幹細胞の存在を保存しながら、上皮幹細胞、及び上皮幹細胞を含む小腸、結腸、胃及び膵臓由来の単離された断片を液体中において培養する方法が提供される。例えば、本明細書に記載される方法により培養された単離された陰窩は、繊毛様上皮が並ぶ中央内腔を含む、陰窩−繊毛オルガノイドへと発達する。得られたオルガノイドは、複数回の陰窩分裂事象を生じる。驚くべきことに、本明細書に提供される方法は、低レベルの細胞外マトリックスの存在下での液体培養物において、単一の、単離された上皮幹細胞が陰窩−繊毛オルガノイドへ成長することを可能にする。胃の幽門部由来の単離された胃断片は、腸陰窩オルガノイドとしてふるまった。即ち、単位の開放上部はシールされ、内腔はアポトーシス細胞で満たされ、オルガノイドには連続的な発芽事象が生じた(腺分裂によく似た)と同時に、低レベルの細胞外マトリックス中の中央内腔においてそれらの極性は維持された。
本明細書では、幹細胞を液体培養するための方法が提供される。本明細書では、未分化表現型及び自己保全能力を保持する幹細胞の存在を保存しながら、上皮幹細胞、及び上皮幹細胞を含む小腸、結腸、胃及び膵臓由来の単離された断片を液体中において培養する方法が提供される。例えば、本明細書に記載される方法により培養された単離された陰窩は、繊毛様上皮が並ぶ中央内腔を含む、陰窩−繊毛オルガノイドへと発達する。得られたオルガノイドは、複数回の陰窩分裂事象を生じる。驚くべきことに、本明細書に提供される方法は、低レベルの細胞外マトリックスの存在下での液体培養物において、単一の、単離された上皮幹細胞が陰窩−繊毛オルガノイドへ成長することを可能にする。胃の幽門部由来の単離された胃断片は、腸陰窩オルガノイドとしてふるまった。即ち、単位の開放上部はシールされ、内腔はアポトーシス細胞で満たされ、オルガノイドには連続的な発芽事象が生じた(腺分裂によく似た)と同時に、低レベルの細胞外マトリックス中の中央内腔においてそれらの極性は維持された。
特に、本明細書では、(a)上皮幹細胞及び/又は(b)上皮幹細胞を含む単離された上皮組織断片を液体培養する方法であって、上皮幹細胞及び/又は単離された組織断片を、(i)骨形成タンパク質(BMP)阻害剤、(ii)分裂促進増殖因子、(iii)Wntアゴニスト、及び(iv)少なくとも約4%(w/v)の細胞外マトリックス(ECM)を加えた、動物又はヒト細胞のための基礎培地を含む液体細胞培養物中において培養することを含む方法が提供される。更に、本明細書では、陰窩を獲得する及び/又は増殖させる方法であって、上皮幹細胞及び/又は単離された組織断片を、(i)骨形成タンパク質(BMP)阻害剤、(ii)分裂促進増殖因子、(iii)Wntアゴニスト、及び(iv)少なくとも約4%(w/v)の細胞外マトリックス(ECM)を加えた、動物又はヒト細胞のための基礎培地を含む液体細胞培養物中において培養することを含む方法が提供される。
幹細胞は、動物成体の多数の器官に見られるもので、未分化の表現型を保持しており、それらの子孫は関連の組織中に存在するすべての系統へと分化することができ、それらは生涯にわたって自己保全能を保持し、且つ傷ついた幹細胞が特定の位置、即ち幹細胞ニッチに存在した後で関連の組織を再生することができ、これは、幹細胞集団の維持のための細胞間接触及びシグナルを供給する。
上皮幹細胞は、上皮を構成する個別の細胞型を形成することができる。皮膚又は腸といったいくつかの上皮の細胞代謝回転は速く、これは存在する幹細胞が連続的に増殖していなければならないことを示す。肝臓又は膵臓といった他の上皮の代謝回転は、通常の状態では極めて遅い。陰窩は、十二指腸と、空腸、回腸、及び結腸を含む小腸及び大腸、及び胃の幽門部から、当業者に既知の手順により単離することができる。例えば、陰窩は、基底膜及び間質細胞型とのカルシウム依存性及びマグネシウム依存性の相互作用から細胞を解放するキレート剤と共になされた、単離された組織のインキュベーションにより単離することができる。組織の洗浄後、上皮細胞層を、ガラススライドを用いて粘膜下層から掻き取ってすり潰す。この後、トリプシン、更に好ましくはEDTA及び/又はEGTA中でのインキュベーションと、陰窩からの、例えば濾過及び/又は遠心分離工程を用いた未消化組織断片及び単独細胞の分離とを行う。コラゲナーゼ及び/又はディスパーゼIといった他のタンパク質分解酵素を、トリプシンの代わりに使用することができる。同様の方法が、膵臓及び胃の断片を単離するために使用される。
上皮組織から幹細胞を単離する方法は、当該技術分野で既知である。いくつかの実施態様では、方法は、大きなGプロテイン共役受容体(GPCR)スーパーファミリーに属するLgr5及び/又はLgr6を表面上に発現する幹細胞を単離することを含む。いくつかの実施態様では、方法は、上皮組織から細胞懸濁液を調製すること、細胞懸濁液にLgr5及び/又は6結合化合物を接触させること、Lgr5及び/又は6結合化合物を単離すること、及び結合化合物から幹細胞を単離することを含む。いくつかの実施態様では、上皮幹細胞を含む単一細胞の懸濁液は、単離された陰窩から機械的に生成される。
いくつかの実施態様では、Lgr5及び/又は6結合化合物は、抗体、例えばLgr5又はLgr6の細胞外ドメインを特異的に認識して結合するモノクローナル抗体、例えばマウス及びラットのモノクローナル抗体を含むモノクローナル抗体を含む。このような抗体を使用して、Lgr5及び/又はLgr6発現幹細胞は、例えば磁気ビーズを援用して又は蛍光活性化細胞分類により単離することができる。いくつかの実施態様では、上皮幹細胞は、陰窩、胃又は膵臓の断片から単離される。例えば、上皮幹細胞は、腸から単離された陰窩から単離される。いくつかの実施態様では、上皮幹細胞は、十二指腸、空調、及び回腸を含む小腸、膵臓又は胃から単離される。
いずれの方法においても、いくつかの実施態様では、上皮幹細胞及び/又は上皮組織断片は、胃腸幹細胞及び/又は胃腸組織断片である。いくつかの実施態様では、胃腸幹細胞及び/又は胃腸組織断片は、小腸幹細胞及び/又は小腸組織断片である。
細胞のニッチは、部分的には、幹細胞と周囲細胞、及びニッチ内の細胞によって生成される細胞外マトリックス(ECM)によって決定される。いくつかの実施態様では、単離された陰窩又は上皮幹細胞はECMに付着させる。ECMは、様々な多糖類、水、エラスチン、及び糖タンパク質からなり、糖タンパク質は、コラーゲン、エンタクチン(ナイドジェン)、フィブロネクチン、及びラミニンを含む。ECMは、接続組織細胞により分泌される。複数の異なる種類のECMが既知であり、それには異なる種類の糖タンパク質及び/又は糖タンパク質の異なる組み合わせを含む異なる組成物が含まれる。ECMは、例えば繊維芽細胞といったECM生成細胞を容器内で生成した後、これらの細胞を除去し、単離された陰窩又は上皮幹細胞を加えることにより提供される。細胞外マトリックス生成細胞の例は、主にコラーゲン及びプロテオグリカンを生成する軟骨細胞、主にIV型コラーゲン、ラミニン、間質性プロコラーゲンを生成する繊維芽細胞、並びに主にコラーゲン(I、III、及びV型)、コンドロイチン硫酸塩プロテオグリカン、ヒアルロン酸、フィブロネクチン、及びテネイシンCを生成する結腸筋繊維芽細胞である。代替的に、ECMは市販のものが提供される。市販の細胞外マトリックスの例は、細胞外マトリックスタンパク質(Invitrogen)及びMatrigelTM(BD Biosciences)である。
いくつかの実施態様では、ECMは、二つの異なる種類のコラーゲン又は一つのコラーゲン及びラミニンといった少なくとも二つの別個の糖タンパク質を含む。ECMは、合成ハイドロゲル細胞外マトリックス又は天然に存在するECMとすることができる。最も好ましいECMは、MatrigelTM(BD Biosciences)によって提供されるもので、ラミニン、エンタクチン、及びコラーゲンIVを含んでいる。
いずれの方法においても、いくつかの実施態様では、ECMは増殖因子低減ECMである。いくつかの実施態様では、ECMはマトリゲルである。
いずれの方法においても、いくつかの実施態様では、ECMの濃度は、液体細胞培養物中約4%〜約10%、約4%〜約5%、及び/又は約4%〜約15%(w/v)のいずれかである。いくつかの実施態様では、ECMの濃度は、約4%、5%、6%、7%、8%、9%、及び/又は10%のいずれかを上回っており、且つ約20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、及び/又は10%のいずれかを下回っている。いくつかの実施態様では、ECMの濃度は、約4%、5%、6%、7%、8%、9%、及び/又は10%のいずれかである。
本明細書に記載される方法において使用される細胞培地は、あらゆる細胞培地を含むことができる。いくつかの実施態様では、細胞培地は、炭酸塩ベースのバッファーでpH7.4(例えば、7.2〜7.6又は7.2以上7.6以下)にバッファーリングされた限定合成培地であり、細胞は、5%〜10%のCO2、又は5%以上10%以下のCO2、好ましくは5%のCO2を含む雰囲気下で培養される。いくつかの実施態様では、細胞培地は、グルタミン、インスリン、ペニシリン/ストレプトマイシン及びトランスフェリンを補充したDMEM/F12及びRPMI1640から選択される。いくつかの実施態様では、Advanced DMEM/F12又はAdvanced RPMIが使用される。このような培地は血清を加えない培養物のために最適化されており、既にインスリンを含んでいる。この場合、Advanced DMEM/F12又はAdvanced RPMI培地には、好ましくはグルタミン及びペニシリン/ストレプトマイシンが補充される。いくつかの実施態様では、細胞培地には、精製された、天然の、半合成の、及び/又は合成の増殖因子が補充され、ウシ胎児血清又はウシ胎子血清といった非限定成分が含まれない。例えば、B27(Invitrogen)、N−アセチルシステイン(Sigma)及びN2(Invitrogen)といった補充物は、いくつかの細胞の増殖を刺激するもので、培地に更に加えることができる。
いくつかの実施態様では、基本培地はBMP阻害剤を含む。BMPは二量体のリガンドとして、二つの異なる受容体セリン/トレオニンキナーゼ、I型及びII型受容体からなる受容体複合体に結合する。II型受容体はI型受容体をリン酸化し、その結果この受容体キナーゼの活性化を引き起こす。I型受容体は、続いて特異的受容体基質(SMAD)をリン酸化し、その結果転写活性につながるシグナル伝達経路をもたらす。
いくつかの実施態様では、BMP阻害剤は、BMP分子に結合し、例えばBMP分子のBMP受容体への結合を防止又は阻害することにより、BMP活性が中和された複合体を形成する薬剤である。代替的には、阻害剤は、アンタゴニスト又はリバースアゴニストとして作用する薬剤である。この種の阻害剤は、BMP受容体と結合し、受容体に対するBMPの結合を防止する。前記薬剤の一例は、BMP受容体に結合し、抗体結合受容体に対するBMPの結合を防止する抗体である。
複数のクラスの天然のBMP結合タンパク質が既知であり、これには、ノギン(Peprotech)、コーディン及びコーディンドメインを含むコーディン様タンパク質(R&D sytems)、フォリスタチン及びフォリスタチンドメインを含むフォリスタチン関連タンパク質(R&D sytems)、DAN及びDANシステインノットドメインを含むDAN様タンパク質(R&D sytems)、スクレロスチン/SOST(R&D sytems)、デコリン(R&D sytems)、及びアルファ−2マクログロブリン(R&D sytems)が含まれる。いくつかの実施態様では、BMP阻害剤は、ノギン、DAN、及びケルベロス及びグレムリンを含むDAN様タンパク質(R&D sytems)から選択される。いくつかの実施態様では、BMP阻害剤はノギンである。いくつかの実施態様では、拡散性タンパク質は、様々な程度の親和性でBMPリガンドに結合して、シグナル伝達受容体に対するBMPリガンドの到達を阻害することができる。これらBMP阻害剤のいずれかを基本培地に添加することにより、添加しない場合には培養の約2〜3週間後に生じる幹細胞の損失が防止される。
いくつかの実施態様では、BMP阻害剤は、細胞中のBMP依存性活性を、阻害剤の非存在下におけるBMP活性のレベルの、90%以下、80%以下、70%以下、50%以下、30%以下、10%以下、又は0%に抑制する。いくつかの実施態様では、BMP活性は、例えばZilberberg et al , 2007 BMC Cell Biol 8:41に例示されているように、BMPの転写活性を測定することにより決定することができる。
いくつかの実施態様では、BMP阻害剤の液体セル中の濃度は、約5〜500ng/mL、5〜250ng/mL、25〜150ng/mL、及び50〜100ng/mLのいずれかである。いくつかの実施態様では、基本細胞培養物中のBMP阻害剤の濃度は、少なくとも約10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、100ng/mlのいずれかである。いくつかの実施態様では、BMP阻害剤の濃度は約100ng/mlである。幹細胞の培養中、BMP阻害剤は、好ましくは二日毎に培地に添加され、培地は好ましくは四日ごとに取り替えられる。いくつかの実施態様では、BMP阻害剤はノギンである。
いずれの方法においても、いくつかの実施態様では、Wntアゴニストが基本培地に添加される。Wntシグナル伝達経路は、Wntタンパク質がFrizzled受容体のファミリーメンバーの細胞表面受容体に結合するときに起こる一連の事象により規定される。これにより、アキシン、GSK−3、及びタンパク質APCを含むタンパク質の複合体を阻害するディシブルドファミリータンパク質が活性化され、細胞内β−カテニンが分解される。その結果得られる濃縮核β−カテニンは、TCF/LEFファミリー転写因子による転写を増強する。いくつかの実施態様では、Wntアゴニストは、細胞内のTCF/LEF媒介性転写を活性化する薬剤とすることができる。したがって、Wntアゴニストは、Wntファミリータンパク質のすべてを含むFrizzled受容体ファミリーメンバーに結合して活性化させる真性のWntアゴニスト、細胞内β−カテニン分解の阻害剤、及びTCF/LEFの活性化因子から選択される。
Wntアゴニストは分泌性糖タンパク質を含み、これには、限定されないが、Wnt−1/Int−1、Wnt−2/Irp(例えば、InM関連Protein)、Wnt−2b/13、Wnt−3/Int−4、Wnt−3a(例えば、R&D sytems)、Wnt−4、Wnt−5a、Wnt−5b、Wnt−6(例えば、Kirikoshi H et al. (2001) Biochem Biophys Res Com 283:798-805)、Wnt−7a(例えば、R&D sytems)、Wnt−7b、Wnt−8a/8d、Wnt−8b、Wnt−9a/14、Wnt−9b/14b/15、Wnt−10a、Wnt−10b/12、WnM1、及び/又はWnt−16が含まれる。ヒトWntタンパク質の総説は、「THE WNT FAMILY OF SECRETED PROTEINS」(R&D Systems社カタログ、2004)に提供されている。いくつかの実施態様では、Wntアゴニストは、Wntファミリーメンバー、R−spondin1−4、Norrin、及び/又はGSK阻害剤である。
いくつかの実施態様では、WntアゴニストはR−spodinポリペプチドである。分泌タンパク質のR−spondinファミリーは、Wntシグナル伝達経路の活性化及び調節に関与しており、4つのメンバー(R−spondin1(例えば、NU206、Nuvelo、San Carlos、CA)、R−spondin2(例えば、R&D sytems)、R−spondin3、及びR−spondin−4)を含む。
いくつかの実施態様では、WntアゴニストはNorrin(Nome疾患タンパク質又はNDPとも呼ばれる)(例えば、R&D sytems))であり、これは、高い親和性でFrizzled−4受容体に結合してWntシグナル伝達経路の活性化を誘導するという点でWntタンパク質のように機能する分泌調節タンパク質である(Kestutis Planutis et al. (2007) BMC Cell Biol 8:12)。Wntシグナル伝達経路の小分子アゴニストは、アミノピリミジン誘導体であり、最近同定されたもので、やはりWntアゴニストとして含まれることを明示する(Lin et al. (2005) Angew Chem Int Ed Engl 44:1987-90)。
いくつかの実施態様では、WntアゴニストはGSK阻害剤である。GSK阻害剤の例には、限定されないが、低分子干渉RNA(siRNA、例えば、Cell Signaling)、リチウム(例えば、Sigma)、ケンパウロン(Biomol International、Leost et al. (2000) Eur J Biochem 267, 5983-5994)、6−ブロモインジルビン−30−アセトキシム(Meyer et al. (2003) Chem Biol 10, 1255-1266)、SB216763及びSB415286(Sigma−Aldrich)、並びにGSK−3のアキシンとの相互作用を防止するFRAT−ファミリーメンバー及びFRAT由来ペプチド(Meijer et al. (2004) Trends in Pharma. Sci. 25, 471-480)が含まれる。これらはここで参照することにより本明細書に包含される。GSK−3阻害のレベルを決定するための方法及びアッセイは、当業者には既知であり、例えば、Liao et al. (2004) Endocrinology, 145(6) 2941-9に記載の方法及びアッセイを含む。
いくつかの実施態様では、Wntアゴニストは、細胞中のWnt活性を、分子の非存在下におけるWnt活性のレベルの、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも50%、少なくとも70%、少なくとも90%、少なくとも100%刺激する。当業者には既知であるように、Wnt活性は、Wntの転写活性を、例えばpTOPFLASH及びpFOPFLASH Tcfルシフェラーゼレポーターコンストラクト(Korinek et al. (1997) Science 275 1784-1787)により測定することによって決定することができる。
いくつかの実施態様では、Wntアゴニストの濃度は、液体細胞培養物中、約500ng/mL〜5μg/ml、500ng/mL〜5μg/mL、500ng/mL〜約1.5μg/mLのいずれか(例えば、約500〜約1500ng/mL)である。いくつかの実施態様では、Wntアゴニストは、濃度少なくとも約50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、300ng/mL、500ng/mL、750ng/mL、1000ng/mL、1250ng/mL、及び/又は1500ng/mLのいずれかで基本培地に添加される。いくつかの実施態様では、Wntアゴニストの濃度は約500ng/mlである。幹細胞の培養期間中、Wntアゴニストは、好ましくは、二日毎に培地に添加され、培地は、好ましくは、四日毎に取り替えられる。いくつかの実施態様では、WntアゴニストはR−spondin1を含む、又はR−spondin1からなる。いくつかの実施態様では、WntアゴニストはR−spondin2を含む、又はR−spondin2からなる。いくつかの実施態様では、WntアゴニストはR−spondin3を含む、又はR−spondin3からなる。いくつかの実施態様では、WntアゴニストはR−spondin4を含む、又はR−spondin4からなる。
いくつかの実施態様では、Wntアゴニストは、R−spondin、Wnt−3a及びWnt−6からなる群より選択される。いくつかの実施態様では、R−spondin及びWnt−3aの両方がWntアゴニストとして使用される。いくつかの実施態様では、濃度は、R−spondinについては約500ng/mlであり、Wnt3aについては約100ng/mlである。
いくつかの実施態様では、基本培地は分裂促進増殖因子である。マイトジェン増殖因子の例には、限定されないが、上皮増殖因子(EGF、例えば、Peprotech)、トランスフォーミング増殖因子アルファ(TGF−α、例えば、Peprotech)、塩基性繊維芽増殖因子(bFGF、例えば、Peprotech)、脳由来神経栄養因子(BDNF、R&D Systems)、及びケラチノサイト増殖因子(KGF、Peprotech)が含まれる。EGFは、様々な培養外胚葉及び中胚葉細胞の強力な分裂促進因子であり、インビボ及びインビトロでの特定の細胞の分化と、細胞培養物中における一部の繊維芽細胞の分化に対する大きな効果を有している。EGF前駆体は、タンパク質分解により切断されて、細胞を刺激する53アミノ酸ペプチドホルモンを生成する膜結合分子として存在する。
いくつかの実施態様では、分裂促進増殖因子は、5〜500ng/ml又は5以上500ng/ml以下の濃度で基本培地に添加される。いくつかの実施態様では、濃度は、約5、10、20、25、30、40、45、又は50ng/mL以上、約500、450、400、350、300、250、200、150、又は100ng/mL以下である。いくつかの実施態様では、分裂促進増殖因子の濃度は約50以上約100ng/ml以下である。いくつかの実施態様では、濃度は約50ng/mlである。いくつかの実施態様では、分裂促進増殖因子はEGFである。いくつかの実施態様では、分裂促進増殖因子はbFGF(例えば、FGF10又はFGF7)である。いくつかの実施態様では、FGF7及び/又はFGF10が使用される。FGF7もKGF(ケラチノサイト増殖因子)として知られている。何らかの実施態様では、例えば、EGFとKGF、又はEGFとBDNFといった分裂促進増殖因子の組合せが基本培地に添加される。いくつかの実施態様では、例えば、EGFとKGF、又はEGFとFGF10といった分裂促進増殖因子の組合せが、基本培地に添加される。複数の分裂促進増殖因子、例えばFGF7とFGF10が使用される場合も、分裂促進増殖因子の濃度は上述の通りであり、分裂促進増殖因子の走濃度を指す。いくつかの実施態様では、幹細胞の培養期間中、分裂促進増殖因子は二日毎に培地に添加され、培地は四日毎に取り替えられる。を指す。いくつかの実施態様では、幹細胞の培養期間中、分裂促進増殖因子は二日毎に培地に添加され、培地は四日毎に取り替えられる。bFGFファミリーのいずれのメンバーを使用してもよい。
いくつかの実施態様では、培地はRock(Rho−キナーゼ)阻害剤を含む。Rock阻害剤の添加により、特に単独幹細胞の培養時にアノイキスが防止されることが分かった。Rock阻害剤は、好ましくは、(R)−(+)−トランス−4−( l−アミノエチル)−N−(4−ピリジル)シクロヘキサンカルボキサミド二塩酸塩一水和物(Y−27632、例えば、Sigma−Aldrich)、5−( l ,4−ジアセパン−l−イルスルホニル)イソキノリン(ファスジル又はHA1077、例えば、Cayman Chemical)、及び(S)−(+)−2−メチル−l−[(4−メチル−5−イソキノリニル)スルホニル]−ヘキサヒドロ−l H−l,4−ジアゼピン二塩酸塩(H−1 152、例えば、Tocris Bioschience)から選択される。Rho−キナーゼ阻害剤、例えば、Y−27632は、幹細胞培養の最初の七日間の間、二日ごとに培地に添加される。いくつかの実施態様では、Y27632の濃度は10DMである。
いくつかの実施態様では、培地はNotchアゴニストを含む。Notchシグナル伝達は、細胞運命決定において、並びに細胞の生存及び増殖において、重要な役割を果たすことが示されている。Notch受容体タンパク質は、限定しないが、Delta1、Jagged1及び2、並びにDelta様1、Delta様3、Delta様4を含む、複数の表面結合又は分泌リガンドと相互作用することができる。リガンド結合時、Notch受容体は、ADAMプロテアーゼファミリーのメンバーに関与する一連の切断事象、並びにγセクレターゼペニシリンにより調節された膜内切断によって活性化される。結果として、Notchの細胞内ドメインが核へ転位置し、そこで転写により下流の遺伝子を活性化する。いくつかの実施態様では、Notchアゴニストは、Jagged1及びDelta1、又はその活性断片若しくは誘導体から選択される。いくつかの実施態様では、Notchアゴニストは、配列CDDYYYGFGCNKFCRPRを含むDSLペプチドである(Dontu et al., 2004. Breast がん Res 6:R605-R615)。DSLペプチド(ANA spec)は、好ましくは、約10μM〜約100nM、又は10μM以上約100nM以下の濃度で使用される。Notchアゴニストの添加は、特に培養の最初の一週間の間、培養効率を2〜3倍上昇させる。いくつかの実施態様では、Notchアゴニストは、幹細胞培養の最初の七日の間、二日毎に培地に添加される。
いくつかの実施態様では、Notchアゴニストは、細胞内のNotch活性を、分子の非存在下におけるNotch活性のレベルの少なくとも約10%、20%、30%、50%、70%、90%、及び/又は100%のいずれかだけ刺激する。いくつかの実施態様では、Notch活性は、Notchの転写活性を、例えば文献(Hsieh et al. ( 1996) Cell. Biol. 16:952-959)に記載の4xwtCBFl−ルシフェラーゼレポーターコンストラクトによって測定することにより決定することができる。
いずれの方法も、いくつかの実施態様では、懸滴で培養することを含む。いくつかの実施態様では、方法は、従来式の懸滴で培養することを含む。いくつかの実施態様では、方法は、中空球懸滴で培養することを含む(Lee et al. Tissue Engineering 15(00) (2009))。いずれの方法も、いくつかの実施態様では、スキャフォールドフリー環境で培養することを含む。いくつかの実施態様では、方法は、懸滴プレートで培養することを含む(例えば、米国特許出願公開第2011/0306122号及び/又はEP2342317に記載されており、これら文献は参照によりその全体が本明細書に包含される)。
いくつかの実施態様では、上皮幹細胞は、膵臓、胃、腸、及び/又は結腸の上皮幹細胞である。いくつかの実施態様では、上皮幹細胞は、小腸の上皮幹細胞である。いくつかの実施態様では、上皮幹細胞は、胚性幹細胞を含まない。いくつかの実施態様では、上皮幹細胞は、成体の幹細胞を含む。いくつかの実施態様では、小腸、結腸、及び胃由来の単独保存上皮幹細胞は、これらの三次元オルガノイドを液体培養物中において生じさせることができる。
いくつかの実施態様では、本明細書に記載の液体培養法は、すべての分化細胞型が存在する繊毛様上皮ドメインを同時に生成しながら、単独の陰窩に複数の陰窩分裂事象が起こる長期培養条件の確立を可能にする。いくつかの実施態様では、培養された陰窩には、培養物に入れられた後で劇的な形態変化が生じる。いくつかの実施態様では、新しく単離された陰窩の上部開口は塞がれ、この領域は徐々に外側へと膨らんでアポトーシス細胞で満たされ、絨毛先端においてアポトーシス細胞がちぎれるようになる。いくつかの実施態様では、陰窩領域は、陰窩分裂を思わせるプロセスである、さらなる陰窩を生じる連続的出芽事象を生じることが発見された。いくつかの実施態様では、陰窩様拡張は、増殖細胞、パネート細胞、腸細胞及び杯細胞を含むすべての分化上皮細胞型を含む。いくつかの実施態様では、筋繊維芽細胞又は他の非上皮細胞は、いずれの段階においてもオルガノイド中において検出不能である。
いくつかの実施態様では、本明細書に記載の液体培養法は、オルガノイドを生み出す出芽陰窩構造の拡大を可能にし、このオルガノイドは、繊毛様上皮が並び、アポトーシス細胞体で満たされた中央の内腔を囲む>40の陰窩様構造を含む。いくつかの実施態様では、陰窩−繊毛オルガノイドは、繊毛様上皮の並ぶ中央内腔を含む。いくつかの実施態様では、内腔は、連続した時間間隔で開口し、その中身を培地中に放出する。いくつかの実施態様では、液体培養法は、少なくとも七か月、少なくとも八か月、少なくとも九か月、少なくとも十か月の培養期間を可能にする。いくつかの実施態様では、オルガノイドは、その基本的特性を失うことなく、少なくとも6か月間培養物中に継代培養及び維持することができる。いくつかの実施態様では、継代培養は、オルガノイドの手作業による断片化を伴う及び/又は必要とする。
したがって、一態様では、本発明は、本明細書に記載の培地中において上皮幹細胞又は単離された陰窩を培養することにより得られた、繊毛様上皮の並ぶ中央内腔を含む陰窩−繊毛オルガノイド、及び/又は本明細書に記載の方法を用いて獲得可能な陰窩−繊毛オルガノイドを提供する。いくつかの実施態様では、オルガノイドは胃のオルガノイドである。
ハイスループットを目的として、陰窩−繊毛オルガノイドは、例えば、96ウェルプレート又は384ウェルプレートといったマルチウェルプレート内で培養される。分子のライブラリーが、オルガノイドに影響する分子を同定するために使用される。好ましいライブラリーには、抗体断片のライブラリー、ペプチドファージディスプレイライブラリー、ペプチドライブラリー(例えば、LOPAPTM、Sigma Aldrich)、脂質のライブラリー(BioMol)、合成化合物のライブラリー(例えば、LOP ACTM、Sigma Aldrich)又は天然化合物のライブラリー(Specs、TimTec)が含まれる。これら遺伝子ライブラリーには、cDNAライブラリー、アンチセンスライブラリー、及びsiRNA又はその他ノンコーディングRNAライブラリーが含まれる。好ましくは、細胞は、複数の濃度の試験剤に特定の期間曝される。培養物は、暴露期間の最後に評価される。用語「影響する(affecting)」は細胞内のあらゆる変化を網羅し、そのような変化には、限定されないが、増殖、形態変化、及び細胞死の低減、又は消失が含まれる。陰窩−繊毛、胃又は膵臓のオルガノイドは、上皮癌細胞を特異的に標的化するが、陰窩−繊毛、胃又は膵臓のオルガノイドを標的化しない薬剤を同定するために使用することができる。
陰窩−繊毛オルガノイドは更に、新規薬物候補又は既知の若しくは新規の栄養補助食品の毒性アッセイにおいて、Caco−2細胞といった細胞株の使用に取って代わることができる。
更に、陰窩−繊毛オルガノイドは、現在のところ適切な組織培養又は動物モデルを欠くノロウイルスのような病原体を培養するために使用することができる。
いくつかの実施態様では、遺伝子療法は更に、損傷又は疾病組織の補修を目的とする方法に使用することができる。例えば、DNA及び/又はRNAのような遺伝子情報を幹細胞に送達するために、アデノウイルス又はレトロウイルス遺伝子送達ビヒクルを使用することができる。当業者であれば、遺伝子療法において標的化された特定の遺伝子を置換又は修復することができる。例えば、正常な遺伝子をゲノム内部の非特異的位置に挿入して非機能性遺伝子を置き換えることができる。別の例では、相同的組換えにより、異常な遺伝子配列を正常な遺伝子配列で置き換えることができる。或いは、選択的復帰突然変異が、遺伝子をその正常機能に復帰させることができる。さらなる例は、特定の遺伝子の調節(遺伝子をオン又はオフにする程度)を変更することである。好ましくは、幹細胞は、遺伝子療法的アプローチによりエクスビボで処理された後、治療を必要とする哺乳動物、好ましくはヒトに移される。
一部では、本明細書において提供されるポリペプチドのアミノ酸配列変異体(例えば、BMP阻害剤、Wntアゴニストなど)が考慮される。例えば、抗体及び/又は結合ポリペプチドの、結合親和性及び/又は他の生物学的特性を向上させることが望ましい。抗体及び/又は結合ポリペプチドのアミノ酸配列変異体は、抗体及び/又は結合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列中に適当な修飾を導入することにより、又はペプチド合成により、調製される。このような修飾は、例えば、抗体及び/又は結合ポリペプチドのアミノ酸配列内部での残基の欠失、及び/又は挿入及び/又は置換を含む。最終コンストラクトが所望の特性、例えば、抗原結合を有していることを条件として、欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせが、最終コンストラクトに到達させるために作成されうる。
特定の実施態様では、一又は複数のアミノ酸置換を有する抗体変異体及び/又は結合ポリペプチド変異体が提供される。置換突然変異の対象となる部位は、HVR及びFRを含む。保存的置換は、表1の「望ましい置換」という見出しの列に示されている。より実質的な変更が、表1の「例示的置換」という見出しの列に与えられ、アミノ酸側鎖のクラスを参照して以下に更に説明される。アミノ酸置換は、目的の抗体及び/又は結合ポリペプチドに導入することができ、その生成物は、所望の活性、例えば、抗原結合の保持/改善、免疫原性の低下、又はADCC又はCDCの改善についてスクリーニングされる。
アミノ酸は共通の側鎖特性に従ってグループ化することができる:
(1)疎水性:ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile
(2)中性の親水性:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln
(3)酸性:Asp、Glu;
(4)塩基性:His、Lys、Arg
(5)鎖配向に影響する残基:Gly、Pro
(6)芳香族:Trp、Tyr、Phe
(1)疎水性:ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile
(2)中性の親水性:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln
(3)酸性:Asp、Glu;
(4)塩基性:His、Lys、Arg
(5)鎖配向に影響する残基:Gly、Pro
(6)芳香族:Trp、Tyr、Phe
非保存的置換は、これらのクラスの一つのメンバーを他のクラスと交換することを必要とするであろう。
一つの置換変異体の型は、親抗体(例えば、ヒト化又はヒト抗体など)の一又は複数の高頻度可変領域残基の置換を含む。一般的には、さらなる研究のために選択された変異体は、親抗体と比較して、特定の生物学的特性に修飾(例えば、改善)(例えば、親和性の上昇、免疫原性の低下)を有し、及び/又は親抗体の特定の生物学的特性を実質的に保持するであろう。例示的な置換型変異体は、親和性成熟抗体であり、例えば、本明細書に記載されるファージディスプレイに基づく親和性成熟技術を用いて、簡便に生成され得る。簡潔に言えば、一又は複数のHVR残基が変異し、変異体抗体は、ファージ上に表示され、特定の生物学的活性(例えば、結合親和性)についてスクリーニングされる。
変更(例えば、置換)は、例えば抗体の親和性を向上させるために、HVRで行うことができる。このような変更は、HVRの「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟過程中に高頻度で変異を受けるコドンにコードされた残基で(例えばChowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)を参照)、及び/又は抗原に接する残基で行うことができ、得られた変異体VH又はVLは結合親和性について試験される。二次ライブラリーから構築し選択し直すことによる親和性成熟が、例えばHoogenboom et al. in Methods in 分子 Biology 178:1-37 (O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001)に記載されている。親和性成熟のいくつかの実施態様において、多様性が、種々の方法(例えば、変異性PCR、鎖シャッフリング、又はオリゴヌクレオチドを標的とした突然変異誘発)のいずれかにより、成熟のために選択された可変遺伝子中に導入される。次いで、二次ライブラリーが作成される。次いで、ライブラリーは、所望の親和性を持つ抗体変異体を同定するためにスクリーニングされる。多様性を導入するするも別の方法は、複数のHVR残基(例えば、一度に4から6残基)がランダム化されたHVR指向のアプローチを伴う。抗原結合に関与するHVR残基は、例えばアラニンスキャニング突然変異誘発、又はモデリングを用いて、特異的に同定されうる。CDR−H3及びCDR−L3がしばしば標的にされる。
特定の実施態様では、置換、挿入、又は欠失は、 そのような変更が抗原に結合する抗体の能力を実質的に低下させない限りにおいて、一以上のHVR内で生じうる。例えば、実質的に結合親和性を低下させない保存的変更(例えば本明細書において提供される保存的置換)をHVR内で行うことができる。このような変更は、例えば、HVR内の残基に接する抗原の外側で生じる。上記変異体VH又はVL配列の特定の実施態様では、各HVRは不変であるか、又は一つ、二つ、若しくは三つを超えないアミノ酸置換を含む。
突然変異誘発の標的とすることができる抗体及び/又は結合ポリペプチドの残基又は領域を同定するための有用な方法は、Cunningham及びWells (1989) Science, 244:1081-1085に記載のように、「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれる。この方法では、標的残基の残基又はグループ(例えば、arg、asp、his、lys及びgluなどの荷電残基)が同定され、抗原と抗体との相互作用が影響を受けるかどうかを決定するために、中性又は負に荷電したアミノ酸(例えば、アラニン又はポリアラニン)により置換される。更なる置換が、最初の置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸の位置に導入されうる。代わりに、又は更に、抗原抗体複合体の結晶構造が、抗体と抗原との接触点を同定する。そのような接触残基及び隣接残基は、置換の候補として標的とされる又は排除される。変異体は、それらが所望の特性を含むかどうかを決定するためにスクリーニングされる。
アミノ酸配列挿入は、 一残基から百以上の残基を含有するポリペプチド長にわたるアミノ及び/又はカルボキシル末端融合、 並びに単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。末端挿入の例には、N末端メチオニン残基を有する抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入変異体は、酵素に対する抗体のN末端又はC末端への融合(例えばADEPTの場合)、又は抗体の血清半減期を延ばすポリペプチドへの融合を含む。
本明細書において引用されたすべての特許及び文献は、参照によりその全体が本明細書に包含される。
以下は本発明の方法及び組成物の実施例である。上記に提供された一般的な説明を前提として、他の様々な実施態様が実施されうる。
実施例1−液体培養物中におけるオルガノイド増殖
様々な器官の組織断片由来のオルガノイド培養物の増殖を実証した。後述は、オルガノイドの生物学の理解を目的とした下流でのアプリケーションの実行可能性を最大化しながら、幹細胞を含む組織断片(例えば、小腸)からのオルガノイド増殖を可能にするための技術的記述である。
様々な器官の組織断片由来のオルガノイド培養物の増殖を実証した。後述は、オルガノイドの生物学の理解を目的とした下流でのアプリケーションの実行可能性を最大化しながら、幹細胞を含む組織断片(例えば、小腸)からのオルガノイド増殖を可能にするための技術的記述である。
物質及び方法
マウス
週齢6〜12のCD−1非近交系マウスを陰窩単離に使用した。
マウス
週齢6〜12のCD−1非近交系マウスを陰窩単離に使用した。
陰窩単離
十二指腸、空腸、及び回腸を含む小腸を、個体プレーティング実験のために単一のマウスから回収した。小腸に冷PBSを一度流し、長手方向に開いた。細胞スクレーパーを用いて繊毛構造を除去し、よって陰窩構造を希釈標準溶液に暴露した。次いで腸を約5mm片に刻み、冷たいキレート化バッファー(5.6mM Na2HPO4、96.2mM NaCl、1.6mM KCl、43.4mM サッカロース、54.9 D−ソルビトール)+2mM EDTA、0.5M DL−ジチオトレイトール中において30分間氷上でインキュベートした。キレート化EDTA−DTTバッファーを除去し、組織断片を、10−mLのピペットを用いて冷たいキレート化バッファー中に勢いよく再懸濁した。溶液中における遊離陰窩の出現を、解剖顕微鏡を用いてモニタした。キレート化EDTA−DTTバッファー中でのインキュベーション工程及び再懸濁を、遊離陰窩の濃度が1μLあたり陰窩10個となるまで、通常は3サイクルにわたり、繰り返した。陰窩を含む上清を15mLの円錐管に収集し、3分間150〜200gでペレットにとり、冷キレート化バッファーを用いて洗浄した。
十二指腸、空腸、及び回腸を含む小腸を、個体プレーティング実験のために単一のマウスから回収した。小腸に冷PBSを一度流し、長手方向に開いた。細胞スクレーパーを用いて繊毛構造を除去し、よって陰窩構造を希釈標準溶液に暴露した。次いで腸を約5mm片に刻み、冷たいキレート化バッファー(5.6mM Na2HPO4、96.2mM NaCl、1.6mM KCl、43.4mM サッカロース、54.9 D−ソルビトール)+2mM EDTA、0.5M DL−ジチオトレイトール中において30分間氷上でインキュベートした。キレート化EDTA−DTTバッファーを除去し、組織断片を、10−mLのピペットを用いて冷たいキレート化バッファー中に勢いよく再懸濁した。溶液中における遊離陰窩の出現を、解剖顕微鏡を用いてモニタした。キレート化EDTA−DTTバッファー中でのインキュベーション工程及び再懸濁を、遊離陰窩の濃度が1μLあたり陰窩10個となるまで、通常は3サイクルにわたり、繰り返した。陰窩を含む上清を15mLの円錐管に収集し、3分間150〜200gでペレットにとり、冷キレート化バッファーを用いて洗浄した。
プレーティング及び培養
キレート化バッファー中で洗浄した後、陰窩を再びペレットに取り、1μLあたり陰窩5個の濃度で増殖培地(下記参照)に再懸濁した。次いで陰窩を、GravityPLUS 96ウェル懸滴プレート(inSphero)に1ウェルあたり40μL(陰窩200個)で蒔いた。10mLのPBSをプレートの底に加えてエバポレーションを防止し、プレートを加湿インキュベーター内において37℃、5%CO2、及び大気酸素で培養した。2日毎に、各ウェルから培地の半分を除去して新しい培地で置き換え、常に増殖に必要な因子源を確保した。
キレート化バッファー中で洗浄した後、陰窩を再びペレットに取り、1μLあたり陰窩5個の濃度で増殖培地(下記参照)に再懸濁した。次いで陰窩を、GravityPLUS 96ウェル懸滴プレート(inSphero)に1ウェルあたり40μL(陰窩200個)で蒔いた。10mLのPBSをプレートの底に加えてエバポレーションを防止し、プレートを加湿インキュベーター内において37℃、5%CO2、及び大気酸素で培養した。2日毎に、各ウェルから培地の半分を除去して新しい培地で置き換え、常に増殖に必要な因子源を確保した。
増殖及び分化アッセイ
培養の10日後、プレートを、GravityPLUSレシーバープレート(InSphero)に連結し、150〜200gで3分間遠心分離した。培地を、多チャネルピペットを用いて除去し、オルガノイドを増殖培地+10μMのEdU中において37℃で30分間インキュベートした。次いで、オルガノイドを4%のパラホルムアルデヒド/PBS中において15分間室温で固定した。オルガノイドを、PBS+3%のBSA中において2回洗浄し、次いでPBS+0.5%のTrion X−100中において室温で20分間透過処理した。透過後、オルガノイドを、Click−iT EdU反応カクテル中においてインキュベートし、製造元の手順(Invitrogen)に従って処理した。オルガノイドを、PBS+0.1%Trion X−100を用いて2回洗浄し、1:3000のウサギ抗ヒトリゾチーム初代抗体中において一晩4℃でインキュベートした。翌日、オルガノイドを、PBS+0.1%のTrion X−100を用いて2回洗浄し、Alexa−Fluor488二次内で1時間室温でインキュベートし、PBS+0.1%のTrion X−100で2回洗浄し、延長金マウント培地に載せ、Leica SPE共焦点顕微鏡上で画像化した。
培養の10日後、プレートを、GravityPLUSレシーバープレート(InSphero)に連結し、150〜200gで3分間遠心分離した。培地を、多チャネルピペットを用いて除去し、オルガノイドを増殖培地+10μMのEdU中において37℃で30分間インキュベートした。次いで、オルガノイドを4%のパラホルムアルデヒド/PBS中において15分間室温で固定した。オルガノイドを、PBS+3%のBSA中において2回洗浄し、次いでPBS+0.5%のTrion X−100中において室温で20分間透過処理した。透過後、オルガノイドを、Click−iT EdU反応カクテル中においてインキュベートし、製造元の手順(Invitrogen)に従って処理した。オルガノイドを、PBS+0.1%Trion X−100を用いて2回洗浄し、1:3000のウサギ抗ヒトリゾチーム初代抗体中において一晩4℃でインキュベートした。翌日、オルガノイドを、PBS+0.1%のTrion X−100を用いて2回洗浄し、Alexa−Fluor488二次内で1時間室温でインキュベートし、PBS+0.1%のTrion X−100で2回洗浄し、延長金マウント培地に載せ、Leica SPE共焦点顕微鏡上で画像化した。
増殖培地
ペニシリン/ストレプトマイシン、1×N2(Gibco)、1×B27(Gibco)、10mM HEPES、1×Glutamax(Gibco)、1mM N−アセチルシステイン、マウスEGF 10〜50ng/mL(PeproTech)、マウスノギン50〜100ng/mL(PeproTech)、hRSPO3 1μg/mL、及び0〜5%増殖因子低減マトリゲル(BD Biosciences)を補充した改良型DMEM/F12。
ペニシリン/ストレプトマイシン、1×N2(Gibco)、1×B27(Gibco)、10mM HEPES、1×Glutamax(Gibco)、1mM N−アセチルシステイン、マウスEGF 10〜50ng/mL(PeproTech)、マウスノギン50〜100ng/mL(PeproTech)、hRSPO3 1μg/mL、及び0〜5%増殖因子低減マトリゲル(BD Biosciences)を補充した改良型DMEM/F12。
結果
一貫したオルガノイドの増殖が、5%のマトリゲルで、上記方法を用いて観察された。主要なオルガノイド体から発芽した陰窩様構造内のGFP染色の存在及び位置は、インビボでの陰窩基部におけるLgr5発現の局在性と一致していた(図1)。加えて、オルガノイドの陰窩様構造内のリゾチーム染色が観察され、これはこの調製が、腸の特殊化細胞を能動的に分化するオルガノイドをもたらすことを示すものである(図1)。
一貫したオルガノイドの増殖が、5%のマトリゲルで、上記方法を用いて観察された。主要なオルガノイド体から発芽した陰窩様構造内のGFP染色の存在及び位置は、インビボでの陰窩基部におけるLgr5発現の局在性と一致していた(図1)。加えて、オルガノイドの陰窩様構造内のリゾチーム染色が観察され、これはこの調製が、腸の特殊化細胞を能動的に分化するオルガノイドをもたらすことを示すものである(図1)。
実施例2−腸オルガノイド中のLgr5陽性幹細胞のアブレーション
これまでの研究により、マウス腸内のLgr5陽性幹細胞のアブレーションは、正常な腸形態と、分化した細胞の正常な分布及び数とをもたらすことが示されている(Tian et al 2011)。液体培養されたオルガノイドが、インビボの腸組織の機能的及び形態的特性を模倣するかどうかを決定するために、Lgr5陽性幹細胞のアブレーションを、以下のようにして、液体培養されたオルガノイド中で行った。
これまでの研究により、マウス腸内のLgr5陽性幹細胞のアブレーションは、正常な腸形態と、分化した細胞の正常な分布及び数とをもたらすことが示されている(Tian et al 2011)。液体培養されたオルガノイドが、インビボの腸組織の機能的及び形態的特性を模倣するかどうかを決定するために、Lgr5陽性幹細胞のアブレーションを、以下のようにして、液体培養されたオルガノイド中で行った。
材料及び方法
マウス
最初にTian et al., 2011により特徴付けされたLgr5DTREGFP/+マウスを、上述のような陰窩の単離に使用した。これらのマウスは、EGFPカセットを利用するLgr5発現のレポーターの役割を有し、Diptheria Toxin(DT)の投与によるLgr5陽性幹細胞のアブレーションを可能にする。
マウス
最初にTian et al., 2011により特徴付けされたLgr5DTREGFP/+マウスを、上述のような陰窩の単離に使用した。これらのマウスは、EGFPカセットを利用するLgr5発現のレポーターの役割を有し、Diptheria Toxin(DT)の投与によるLgr5陽性幹細胞のアブレーションを可能にする。
Lgr5陽性幹細胞のアブレーション
陰窩を3〜7日間増殖させてオルガノイドの存在について目視検査したLgr5陽性幹細胞アブレーションの場合を例外として、陰窩の単離、プレーティング、及び培養を上述のように実行した。次いでオルガノイドを、10ng/mLのDiptheria Toxin(DT)を含む培地で処理した。DTを含む培地、コントロールオルガノイドのためのDTを含まない培地を、10日間の間、二日毎に取り替えた。
陰窩を3〜7日間増殖させてオルガノイドの存在について目視検査したLgr5陽性幹細胞アブレーションの場合を例外として、陰窩の単離、プレーティング、及び培養を上述のように実行した。次いでオルガノイドを、10ng/mLのDiptheria Toxin(DT)を含む培地で処理した。DTを含む培地、コントロールオルガノイドのためのDTを含まない培地を、10日間の間、二日毎に取り替えた。
オルガノイド染色
次いで処理済みのコントロールオルガノイドを回収し、Lgr5幹細胞アブレーションの効果をモニタするためにGFPについて染色した。同時に、オルガノイドをリゾチームについて共染色し、分化したパネート細胞を同定した。オルガノイドを、PBS+0.1% Trion X−100で2回洗浄し、4%パラホルムアルデヒド/PBS中において室温で15分間固定した。オルガノイドを、PBS+0.1% Trion X−100中で3回洗浄し、タンパク質を含まないブロック(Dako)で1時間ブロックした。オルガノイドを、ニワトリ抗GFP(1:2000)及びウサギ抗ヒトリゾチーム(1:2000)抗体と共に一晩4℃でインキュベートした。翌日、オルガノイドを、PBS+0.1% Trion X−100で3回洗浄し、抗ニワトリIgG Cy3()及び抗ウサギAlexa−fluor488二次内で1時間室温でインキュベートし、PBS+0.1% Trion X−100で2回洗浄し、延長金マウント培地に載せ、Leica SPE共焦点顕微鏡上で画像化した。
次いで処理済みのコントロールオルガノイドを回収し、Lgr5幹細胞アブレーションの効果をモニタするためにGFPについて染色した。同時に、オルガノイドをリゾチームについて共染色し、分化したパネート細胞を同定した。オルガノイドを、PBS+0.1% Trion X−100で2回洗浄し、4%パラホルムアルデヒド/PBS中において室温で15分間固定した。オルガノイドを、PBS+0.1% Trion X−100中で3回洗浄し、タンパク質を含まないブロック(Dako)で1時間ブロックした。オルガノイドを、ニワトリ抗GFP(1:2000)及びウサギ抗ヒトリゾチーム(1:2000)抗体と共に一晩4℃でインキュベートした。翌日、オルガノイドを、PBS+0.1% Trion X−100で3回洗浄し、抗ニワトリIgG Cy3()及び抗ウサギAlexa−fluor488二次内で1時間室温でインキュベートし、PBS+0.1% Trion X−100で2回洗浄し、延長金マウント培地に載せ、Leica SPE共焦点顕微鏡上で画像化した。
結果
DT存在下でのLgr5DTREGFP/+ オルガノイドの長期インキュベーションは、Lgr5発現細胞のアブレーションにより、すべてのLgr5依存性GFP発現を欠くオルガノイドの正常な出現をもたらした(図2b)。これらのオルガノイドはリゾチーム染色に陽性であり、分化がLgr5陽性細胞の非存在下で起こったもので(グリーンの染色、図2b、b’及びd)、強い増殖を示した(赤色の染色、図2d)ことが示唆された。
DT存在下でのLgr5DTREGFP/+ オルガノイドの長期インキュベーションは、Lgr5発現細胞のアブレーションにより、すべてのLgr5依存性GFP発現を欠くオルガノイドの正常な出現をもたらした(図2b)。これらのオルガノイドはリゾチーム染色に陽性であり、分化がLgr5陽性細胞の非存在下で起こったもので(グリーンの染色、図2b、b’及びd)、強い増殖を示した(赤色の染色、図2d)ことが示唆された。
まとめると、単一の腸幹細胞は、固体細胞外マトリックスを含むその環境からの位置的な合図とは関係なく作用可能であること、及びそれが正常な腸を思わせるような、拡張を続ける自己組織化上皮構造を生成できることが示された。液体培養法を含む上記培養系は、幹細胞主導の陰窩−繊毛生物学の研究を単純化するであろう。
実施例3−腸オルガノイド増殖のためのECM(マトリゲル)の必要性
腸オルガノイド増殖に対するマトリゲルの必要性を決定するため、増殖培地中に異なる濃度のマトリゲルを用いる懸滴法を使用してオルガノイドを増殖させた。
腸オルガノイド増殖に対するマトリゲルの必要性を決定するため、増殖培地中に異なる濃度のマトリゲルを用いる懸滴法を使用してオルガノイドを増殖させた。
マウス、オルガノイド調製物、及びオルガノイド染色
WT CD−1マウスをこれらの実験に使用した。陰窩の単離、プレーティング、及び培養を上記のように、但しオルガノイドを0%、1%、2%、3%、4%、及び5%のマトリゲルの存在下において増殖させて、実行した。オルガノイドを含むプレートを、陰窩の播種後7日目に目視により検査した。オルガノイドを、染色し、上記のように画像化した。
WT CD−1マウスをこれらの実験に使用した。陰窩の単離、プレーティング、及び培養を上記のように、但しオルガノイドを0%、1%、2%、3%、4%、及び5%のマトリゲルの存在下において増殖させて、実行した。オルガノイドを含むプレートを、陰窩の播種後7日目に目視により検査した。オルガノイドを、染色し、上記のように画像化した。
結果
図3は、増殖培地においてマトリゲルの濃度を低下させながら陰窩を播種した結果を示している。5%及び4%のマトリゲル(それぞれa及びb)は一貫して大きなオルガノイドを生成した。それよりも低濃度のマトリゲルは、オルガノイドの強い増殖をサポートせず(c及びd)、1%及び0%のマトリゲルはまったく増殖を示さなかった(データは示さない)。
図3は、増殖培地においてマトリゲルの濃度を低下させながら陰窩を播種した結果を示している。5%及び4%のマトリゲル(それぞれa及びb)は一貫して大きなオルガノイドを生成した。それよりも低濃度のマトリゲルは、オルガノイドの強い増殖をサポートせず(c及びd)、1%及び0%のマトリゲルはまったく増殖を示さなかった(データは示さない)。
Claims (20)
- (a)上皮幹細胞及び/又は(b)上皮幹細胞を含む単離された上皮組織断片を液体培養する方法であって、上皮幹細胞及び/又は単離された組織断片を、(i)骨形成タンパク質(BMP)阻害剤、(ii)分裂促進的増殖因子、(iii)Wntアゴニスト、及び(iv)少なくとも約4%(w/v)の細胞外マトリックス(ECM)を加えた、動物又はヒト細胞のための基礎培地を含む液体細胞培養物中において培養することを含む方法。
- 陰窩を獲得する及び/又は増殖させる方法であって、上皮幹細胞及び/又は単離された組織断片を、(i)骨形成タンパク質(BMP)阻害剤、(ii)分裂促進的増殖因子、(iii)Wntアゴニスト、及び(iv)少なくとも約4%(w/v)の細胞外マトリックス(ECM)を加えた、動物又はヒト細胞のための基礎培地を含む液体細胞培養物中において培養することを含む方法。
- BMP阻害剤が、ノギン、DAN、及び/又はケルベロス及びグレムリンを含むDAN様タンパク質である、請求項1又は2に記載の方法。
- BMP阻害剤がノギンである、請求項3に記載の方法。
- 液体細胞培養物中におけるBMP阻害剤の濃度が、約5〜約500ng/ml(例えば、約50〜約100ng/mL)である、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
- Wntアゴニストが、Wnt、R−spondin(RSPO)、Norrin、及び/又はGSK阻害剤である、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
- WntアゴニストがRSPOである、請求項6に記載の方法。
- 液体細胞培養物中におけるWntアゴニストの濃度が、約500ng/mL〜約5μg/ml(例えば、約500〜約1500ng/mL)である、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
- 分裂促進的増殖因子が、上皮増殖因子(EGF)、トランスフォーミング増殖因子−アルファ(TGF−α)、塩基性繊維芽細胞増殖因子(bFGF)、脳由来神経栄養因子(BDNF)、及びケラチノサイト増殖因子(KGF)である、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
- 分裂促進的増殖因子がEGFである、請求項9に記載の方法。
- 液体細胞培養物中における分裂促進的増殖因子の濃度が、約5〜約500ng/ml(例えば、約5〜約50ng/mL)である、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
- ECMが増殖因子低減ECMである、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
- ECMがマトリゲルである、請求項1から12のいずれか一項に記載の方法。
- 液体細胞培養物中におけるECMの濃度が、約4%〜約10%(w/v)である、請求項1から13のいずれか一項に記載の方法。
- 培地が更にRock(Rho−キナーゼ)阻害剤を含む、請求項1から14のいずれか一項に記載の方法。
- 培地が更にNotchアゴニストを含む、請求項1から15のいずれか一項に記載の方法。
- 上皮幹細胞及び/又は上皮組織断片が、胃腸幹細胞及び/又は胃腸組織断片である、請求項1から16のいずれか一項に記載の方法。
- 胃腸幹細胞及び/又は胃腸組織断片が、小腸幹細胞及び/又は小腸組織断片である、請求項17に記載の方法。
- 請求項1から18のいずれか一項に記載の方法により獲得される陰窩。
- 薬物発見スクリーニング、毒性アッセイ、又は再生医学における、請求項19に記載の陰窩の使用。
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