KR20150123805A - 상피 줄기 세포의 액체 배양 - Google Patents

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Abstract

본원에서는 액체 배양물 중에서 상피 줄기 세포 및 상피 줄기 세포를 포함하는 조직 단편을 배양하는 방법을 제공한다.

Description

상피 줄기 세포의 액체 배양 {LIQUID CULTURING OF EPITHELIAL STEM CELLS}
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2013년 2월 25일 출원된 미국 특허 출원 번호 61/769,076을 우선권 주장하며, 이 출원은 그의 전문이 참조로 포함된다.
본 발명의 분야
본원에서는 액체 배양물 중에서 상피 줄기 세포 및 상피 줄기 세포를 포함하는 조직 단편을 배양하는 방법을 제공한다.
소장 상피는 2 내지 5일마다 재생되며, 이로써 재생성이 가장 큰 포유동물 조직 중 하나가 된다. 위치 및 순환 역학에 기초하여 소장에서 2가지 유형의 줄기 세포가 기술되었다. 예컨대, 문헌 [Barkeret al., Nature 449, 1003-1007 (2007)]; [Sangiorgi, E. & Capecchi, M. R. Nature Genet. 40, 915-920 (2008)]; [Li, L. & Clevers, H. Science 327, 542-545 (2010)]을 참조할 수 있다. 고속 순환 줄기 세포는 Lgr5, Cd133 (이는 또한 Prom1로도 공지되어 있다) 및 Sox9를 비롯한 마커를 발현하고, 장 전역에 걸쳐 존재한다. 문헌 [Zhu, L. et al., Nature 457, 603-607 (2009)]; [Furuyama, K. et al., Nature Genet. 43, 34-41 (2011)]을 참조할 수 있다. 소낭선 기저 원주 세포 (CBC)로도 또한 알려져 있는 이러한 가는(slender) 세포는 3일 이내 소낭선 및 융모에 거주하고, 그를 지지하는 파네트(Paneth) 세포 중에 산재하게 된다. 문헌 [Sato, T. et al., Nature 469, 415-418 (2011)]; [Cheng, H. & Leblond, C. P., Am . J. Anat . 141, 537-561 (1974)]를 참조할 수 있다. Bmi1 또는 마우스 Tert (mTert)의 풍부한 발현을 특징으로 하는 저속 순환 줄기 세포는 더욱 희귀한 세포 집단을 나타낸다. 문헌 [Sangiorgi, E. & Capecchi, M. R. Nature Genet. 40, 915-920 (2008)]을 참조할 수 있다. 이들 세포는 장의 근위부 영역에서부터 원위부 영역으로까지 하향 구배를 형성함에 따라, 상기 세포는 결장보다는 십이지장에 더 우세하게 존재한다. 그의 희소성에도 불구하고, Bmi1을 발현하는 줄기 세포는 소낭선 유지에 중요하다.
장 상피 줄기 세포를 비롯한, 1차 상피 줄기 세포를 배양하기 위한 것으로 다양한 배양 시스템이 기술되었다 ([Bjerknes and Cheng, Methods Enzymol 419, 337-83 (2006)] 및 [Sato and et al., Nature 459, 262-265 (2009)]). 현재까지, 배양 시스템은 1차 상피 줄기 세포를 성장시키기 위해 고체 세포외 매트릭스를 사용하는 것에 의존해 왔다. 종래 연구에서는 고체 세포외 매트릭스가 상피 줄기의 분화 다능성 유지, 및 결장 또는 장으로부터 단리된 소낭선의 기본적인 소낭선-융모의 생리학적 성질을 보존하는 데 필요한 것으로 나타났다 (예컨대, WO2010/090513 참조). 줄기 세포를 배양하기 위해 ECM을 사용하는 것 또한 줄기 세포의 장기간에 걸친 생존 및 미분화된 줄기 세포의 지속적인 존재를 증진시키는 것으로 밝혀졌다. 앞서 ECM의 부재하에서 줄기 세포 배양물은 보다 장기간 동안은 배양될 수 없었고, 미분화된 줄기 세포의 지속적인 존재도 관찰되지 않았다. 추가로, ECM의 존재를 통해서는, ECM의 부재하에서는 배양이 불가능했던 3차원 조직 오르가노이드의 배양이 가능하였다. 그러나, 배양 시스템의 고체 성질 때문에, 배양 시스템을 사용하여 연구될 수 있는 진단 화합물 및 시험 유형에 있어서 크기상 한계가 있다 (예컨대, 거대 분자는 고체 매트릭스 내로 확산되지 못한다). 추가로, 세포 및 고차 구조가 고체 매트릭스에 포매됨에 따라, 세포 및 고차 구조의 분석의 용이성은 감소된다 (예컨대, 고차 구조 (예컨대, 오르가노이드)는 분석을 위해서는 고체 매트릭스 밖으로 절개되어야 한다). 시험 유형 및 진단 화합물, 및 분석의 용이성을 증가시키면서, 상피 줄기의 생리학적 구조를 보존하고, 상피 줄기의 분화 다능성을 유지하고, 오르가노이드의 기본적인 생리학적 성질을 보존하는, 더욱 우수한 상피 줄기 세포, 특히 장 상피 줄기 세포의 배양 시스템이 요구되고 있다.
본원에서는 줄기 세포를 액체 배양하는 방법을 제공한다. 특히, 본원에서는 (i) 골 형태발생 단백질 (BMP) 억제제, (ii) 유사분열촉진 성장 인자, (iii) Wnt 효능제, 및 (iv) 약 4% w/v 이상의 세포외 매트릭스 (ECM)가 첨가된, 동물 또는 인간 세포용 기초 배지를 포함하는 액체 세포 배양물 중에서 상피 줄기 세포 및/또는 상피 줄기 세포를 포함하는 단리된 상피 조직 단편을 인큐베이션시키는 것을 포함하는, (a) 상피 줄기 세포 및/또는 (b) 상피 줄기 세포를 포함하는 단리된 상피 조직 단편을 액체 배양하는 방법을 제공한다. 추가로, 본원에서는 (i) 골 형태발생 단백질 (BMP) 억제제, (ii) 유사분열촉진 성장 인자, (iii) Wnt 효능제, 및 (iv) 약 4% w/v 이상의 세포외 매트릭스 (ECM)가 첨가된, 동물 또는 인간 세포용 기초 배지를 포함하는 액체 세포 배양물 중에서 상피 줄기 세포 및/또는 단리된 조직 단편을 인큐베이션시키는 것을 포함하는, 소낭선을 수득하고/거나 성장시키는 방법을 제공한다.
상기 방법 중 임의의 것의 일부 실시양태에서, BMP 억제제는 노긴(Noggin), DAN, 및/또는 세르베루스(Cerberus) 및 그렘린(Gremlin)을 비롯한 DAN-유사 단백질이다. 일부 실시양태에서, BMP 억제제는 노긴이다. 일부 실시양태에서, BMP 억제제는 액체 세포 배양물 중 약 5 내지 약 500 ng/ml의 농도 (예컨대, 약 50 내지 약 100 ng/mL)로 존재한다.
상기 방법 중 임의의 것의 일부 실시양태에서, Wnt 효능제는 Wnt, R-스폰딘 (RSPO), 노린(Norrin) 및/또는 GSK-억제제이다. 일부 실시양태에서, Wnt 효능제는 RSPO이다. 일부 실시양태에서, Wnt 효능제는 RSPO1이다. 일부 실시양태에서, Wnt 효능제는 RSPO2이다. 일부 실시양태에서, Wnt 효능제는 RSPO3이다. 일부 실시양태에서, Wnt 효능제는 RSPO4이다. 일부 실시양태에서, Wnt 효능제는 액체 세포 배양물 중 약 500 ng/mL 내지 약 5 ㎍/ml의 농도 (예컨대, 약 500 내지 약 1500 ng/mL)로 존재한다.
상기 방법 중 임의의 것의 일부 실시양태에서, 유사분열촉진 성장 인자는 표피 성장 인자 (EGF), 형질전환 성장 인자-알파 (TGF-α), 염기성 섬유모세포 성장 인자 (bFGF), 뇌-유래 신경영양 인자 (BDNF) 및 각질세포 성장 인자 (KGF)이다. 일부 실시양태에서, 유사분열촉진 성장 인자는 EGF이다. 일부 실시양태에서, 유사분열촉진 성장 인자는 액체 세포 배양물 중 약 5 내지 약 500 ng/ml의 농도 (예컨대, 약 5 내지 약 50 ng/mL)로 존재한다.
상기 방법 중 임의의 것의 일부 실시양태에서, ECM은 성장 인자 감소된 ECM이다. 일부 실시양태에서, ECM은 매트리겔이다. 일부 실시양태에서, ECM은 액체 세포 배양물 중 약 4% w/v 내지 약 10% w/v의 농도로 존재한다. 상기 방법 중 임의의 것의 일부 실시양태에서, 본 방법은 현적 배양을 포함한다.
상기 방법 중 임의의 것의 일부 실시양태에서, 배양 배지는 추가로 로크(Rock) (Rho-키나제) 억제제를 포함한다.
상기 방법 중 임의의 것의 일부 실시양태에서, 배양 배지는 추가로 노치(Notch) 효능제를 포함한다.
상기 방법 중 임의의 것의 일부 실시양태에서, 상피 줄기 세포 및/또는 상피 조직 단편은 위장 줄기 세포 및/또는 위장 조직 단편이다. 일부 실시양태에서, 위장 줄기 세포 및/또는 위장 조직 단편은 소장 줄기 세포 및/또는 소장 조직 단편이다.
추가로 본원에서는 본원에 기술된 방법에 의해 수득가능한 소낭선, 및 약물 발견 스크린, 독성 검정 또는 재생 의학에서의 소낭선의 용도를 제공한다.
도 1A-B. (A) Lgr5 DTREGFP 마우스로부터 유래된 오르가노이드는 소낭선-유사 구조물 중 막 GFP (Lgr5 양성 줄기 세포) 및 리소자임 염색 (파네트 세포, 화살표 표시)을 나타낸다. (B) 광학 횡단면.
도 2A-D. Lgr5 DTREGFP 마우스로부터 유래된 오르가노이드를 10일 동안 디프테리아 독소 (DT)의 존재 (B, B-1, D) 또는 부재 (A, A-1, C)하에서 배양하였다. 소낭선-유사 구조물 및 리소자임 양성 세포는 DT 처리된 오르가노이드 (B, B-1)에서 보존되었다. 오르가노이드는 DT의 존재하에서 계속해서 증식하였다 (D).
도 3A-D. Lgr5 DTREGFP 마우스로부터 유래된 오르가노이드를 다양한 농도의 매트리겔 중에서 배양하였다.
I. 정의
본원에서 "폴리펩티드"라는 용어는 천연 서열 폴리펩티드, 폴리펩티드 변이체, 및 천연 서열 폴리펩티드 및 폴리펩티드 변이체의 단편 (이는 본원에서 추가로 정의된다)을 의미한다. 본원에 기술된 폴리펩티드는 다양한 공급원으로부터, 예컨대 인간 조직 유형으로부터 또는 또 다른 공급원으로부터 단리되거나, 또는 재조합 또는 합성 방법에 의해 제조된 것일 수 있다.
"천연 서열 폴리펩티드"는 자연으로부터 유래된 상응하는 폴리펩티드와 동일한 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드를 포함한다.
"폴리펩티드 변이체," 또는 그의 변이는 본원에 개시된 천연 서열의 폴리펩티드 서열 중 임의의 것과 약 80% 이상의 아미노산 서열 동일성을 가지는 것으로 본원에서 정의된 바와 같은 폴리펩티드, 일반적으로 활성 폴리펩티드를 의미한다. 상기 폴리펩티드 변이체는, 예를 들어 천연 아미노산 서열의 N- 또는 C-말단에서 하나 이상의 아미노산 잔기가 부가 또는 결실된 폴리펩티드를 포함한다. 보통, 폴리펩티드 변이체는 본원에 개시된 것과 같은 천연 서열 폴리펩티드 서열에 대하여 약 80% 이상의 아미노산 서열 동일성, 대안적으로 약 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 가질 것이다. 보통, 변이체 폴리펩티드의 길이는 약 10개 이상의 아미노산 길이, 대안적으로 적어도 약 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600개 또는 그 초과의 아미노산 길이이다. 임의로, 변이체 폴리펩티드는 천연 폴리펩티드 서열과 비교하여 1개 이하의 보존적 아미노산 치환, 대안적으로 천연 폴리펩티드 서열과 비교하여 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이하의 보존적 아미노산 치환을 가질 것이다.
"단리된"이란 폴리펩티드, 항체, 핵산 등이 그의 자연 환경의 성분으로부터 분리된 것을 의미한다. 일부 실시양태에서, 항체의 경우, 항체는 예를 들어, 전기영동 (예컨대, SDS-PAGE, 등전 포커싱 (IEF), 모세관 전기영동) 또는 크로마토그래피 (예컨대, 이온 교환 또는 역상 HPLC)에 의해 측정된 바와 같이, 95% 또는 99% 초과의 순도로 정제된다. 항체 순도 평가 방법의 리뷰를 위해, 예컨대 문헌 [Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)]을 참조할 수 있다.
본원에서 "항체"라는 용어는 가장 광범위한 의미로 사용되고, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 다중특이적 항체 (예컨대, 이중특이적 항체), 및 원하는 항원-결합 활성을 나타내는 한, 항체 단편을 포함하나, 이에 제한되지 않는 다양한 항체 구조를 포함한다.
참조 폴리펩티드 서열에 대한 "아미노산 서열 동일성(%)"은 서열을 정렬시키고, 필요할 경우, 최대 서열 동일성(%)을 달성하기 위해 갭을 도입한 후, 임의의 보존적 치환을 서열 동일성의 일부로 간주하지 않으면서, 참조 폴리펩티드 서열 내의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 아미노산 서열 동일성(%)을 측정하기 위한 정렬은 관련 기술분야 범위 내의 다양한 방법, 예를 들어 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 메갈린(Megalign) (DNASTAR) 소프트웨어를 이용하여 달성될 수 있다. 통상의 기술자는 비교할 전장의 서열에 걸쳐 최대로 정렬되도록 하는 데 필요한 임의의 알고리즘을 비롯한, 서열 정렬에 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 그러나, 본원의 목적상, 아미노산 서열 동일성(%) 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 이용하여 생성된다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨테크, 인크.(Genentech, Inc.) 소유로서, 소스 코드는 미국 저작권청(U.S. Copyright Office: 미국 20559 워싱턴 D.C.)에 사용자 문서로 제출되어 있고, 미국 저작권 등록 번호 TXU510087로 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 제넨테크, 인크. (미국 캘리포니아주 사우쓰 샌프란시스코)로부터 공개적으로 이용가능하거나, 또는 소스 코드로부터 컴파일링될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 디지털 UNIX V4.0D를 비롯한 UNIX 운영 시스템에서 사용되도록 컴파일링되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되어 있으며, 변하지 않는다.
ALIGN-2가 아미노산 서열 비교를 위해 사용되는 상황에서, 주어진 아미노산 서열 B에, 주어진 아미노산 서열 B와, 또는 주어진 아미노산 서열 B에 대한 주어진 아미노산 서열 A의 아미노산 서열 동일성(%) (대안적으로, 주어진 아미노산 서열 B에, 주어진 아미노산 서열 B와, 또는 주어진 아미노산 서열 B에 대해 특정 아미노산 서열 동일성(%)을 가지거나 이를 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로 기술될 수 있다)은 하기와 같이 계산된다:
100 x X/Y의 분율
여기서, X는 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의한 A 및 B의 프로그램 정렬시에 상기 프로그램에 의해 동일한 매치로 점수화된 아미노산 잔기의 개수이고, Y는 B 중의 전체 아미노산 잔기 개수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우, B에 대한 A의 아미노산 서열 동일성(%)은 A에 대한 B의 아미노산 서열 동일성(%)과 동일하지 않다는 것을 이해할 것이다. 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 아미노산 서열 동일성(%) 값은 바로 앞 단락에서 기술된 바와 같이, ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 이용하여 수득된다.
하이브리드화 반응의 "엄격도"는 통상의 기술자에 의해 쉽게 측정될 수 있고, 일반적으로 프로브 길이, 세척 온도 및 염 농도에 따라 실험적으로 계산된다. 일반적으로, 프로브가 길수록 적절한 어닐링을 위해서는 더 높은 온도가 요구되는 반면, 프로브가 짧을수록 더 낮은 온도가 필요하다. 하이브리드화는 일반적으로 상보성 가닥이 그의 융점 미만인 환경에 존재할 때, 변성된 DNA가 재어닐링할 수 있는 능력에 의존한다. 프로브와 하이브리드화 가능한 서열 사이의 원하는 상동성 정도가 높을수록, 사용될 수 있는 상대 온도는 더 높다. 그 결과, 더 높은 상대 온도는 반응 조건을 보다 엄격하게 만들고, 보다 낮은 온도는 덜 엄격하게 만드는 경향이 있다. 하이브리드화 반응의 엄격도에 대한 추가의 상세한 내용 및 설명에 대해 문헌 [Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995)]을 참조할 수 있다.
본원에 정의된 바와 같이, "엄격한 조건" 또는 "고 엄격도 조건"은 (1) 세척시 낮은 이온 강도 및 고온, 예를 들어 50℃에서 0.015 M 염화나트륨/0.0015 M 시트르산나트륨/0.1% 소듐 도데실 술페이트를 사용하는 것; (2) 하이브리드화 동안에 42℃에서 변성제, 예컨대 포름아미드, 예를 들어 0.1% 소 혈청 알부민/0.1% 피콜/0.1% 폴리비닐피롤리돈/750 mM 염화나트륨, 75 mM 시트르산나트륨을 함유하는 50 mM 인산나트륨 완충제 (pH 6.5)를 함유하는 50% (v/v) 포름아미드를 사용하는 것; 또는 (3) 42℃에서 50% 포름아미드, 5 x SSC (0.75 M NaCl, 0.075 M 시트르산나트륨), 50 mM 인산나트륨 (pH 6.8), 0.1% 피로인산나트륨, 5 x 덴하르트(Denhardt) 용액, 초음파처리된 연어 정자 DNA (50 ㎍/ml), 0.1% SDS 및 10% 덱스트란 술페이트를 사용하고, 42℃에서 0.2 x SSC (염화나트륨/시트르산나트륨) 중에서 10분간 세척한 후에, 55℃에서 EDTA를 함유하는 0.1 x SSC로 이루어진 고 엄격도 세척을 10분간 수행하여 용액 중에서 밤새도록 하이브리드화하는 것에 의해 확인될 수 있다.
"중간 정도의 엄격한 조건"은 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989]에 기술된 바와 같이 확인할 수 있고, 상기 기술된 것보다 엄격성이 더 낮은 세척 용액 및 하이브리드화 조건 (예컨대, 온도, 이온 강도 및 %SDS)을 사용하는 것을 포함한다. 중간 정도의 엄격한 조건의 예는 20% 포름아미드, 5 x SSC (150 mM NaCl, 15 mM 시트르산삼나트륨), 50 mM 인산나트륨 (pH 7.6), 5 x 덴하르트 용액, 10% 덱스트란 술페이트 및 20 mg/ml의 변성되고 전단된 연어 정자 DNA를 포함하는 용액 중에서 37℃에서 밤새도록 인큐베이션시킨 후, 필터를 약 37-50℃에서 1 x SSC 중에서 세척하는 것이다. 통상의 기술자는 인자, 예컨대 프로브 길이를 조정하기 위해 필요한 온도, 이온 강도 등의 조정 방법을 알 것이다.
"조직 샘플" 또는 "조직 단편"이란 대상체 또는 개체의 조직으로부터 수득된 유사한 세포의 집합을 의미한다. 조직 샘플 또는 조직 단편의 공급원은 신선하고/거나, 냉동되고/거나, 보존된 기관, 조직 샘플, 생검 및/또는 흡인물로부터의 고체 조직; 혈액 또는 임의의 혈액 구성 성분, 예컨대 혈장; 체액, 예컨대 뇌 척수액, 양수, 복수액, 또는 간질액; 대상체의 임신 또는 발생 중 임의 시점으로부터의 세포일 수 있다. 조직 샘플 또는 조직 단편은 또한 1차 또는 배양된 세포 또는 세포주일 수 있다. 임의로, 조직 샘플 또는 조직 단편은 질환 조직/기관으로부터 수득된다. 조직 샘플은 자연에서는 조직과 자연적으로 서로 혼합되지 않는 화합물, 예컨대 보존제, 항응고제, 완충제, 고정제, 영양소, 항생제 등을 함유할 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "참조 샘플," "참조 세포," "참조 조직," "대조군 샘플," "대조군 세포," 또는 "대조군 조직"이란 비교 목적을 위해 사용되는 샘플, 세포, 조직, 표준 또는 수준을 의미한다. 한 실시양태에서, 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조군 샘플, 대조군 세포, 또는 대조군 조직은 동일한 대상체 또는 개체의 건강한 및/또는 비-이환된 신체 일부 (예컨대, 조직 또는 세포)로부터 수득된다. 예를 들어, 건강한 및/또는 비-이환된 세포 또는 조직은 이환된 세포 또는 조직에 인접해 있다 (예컨대, 종양에 인접해 있는 세포 또는 조직). 또 다른 실시양태에서, 참조 샘플은 동일한 대상체 또는 개체의 신체의 비처리 조직 및/또는 세포로부터 수득된다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조군 샘플, 대조군 세포 또는 대조군 조직은 대상체 또는 개체가 아닌 개체의 건강한 및/또는 비-이환된 신체의 일부 (예컨대, 조직 또는 세포)로부터 수득된다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조군 샘플, 대조군 세포 또는 대조군 조직은 대상체 또는 개체가 아닌 개체의 신체의 비처리 조직 및/또는 세포로부터 수득된다.
본원에서 사용되는 바, "실질적으로 동일한"이라는 용어는 통상의 기술자가 두 수치 값 사이의 차이를 그 값 (예컨대, Kd 값 또는 억제)에 의해 측정된 생물학적 특징과 관련하여 생물학상 및/또는 통계학상 유의성이 거의 없거나, 전혀 없는 것으로 간주할 정도의, 두 수치 사이의 충분히 높은 정도의 유사성을 나타낸다. 두 값 사이의 차이는 참조/비교자 값의 함수로서 예를 들어, 약 50% 미만, 약 40% 미만, 약 30% 미만, 약 20% 미만, 및/또는 약 10% 미만이다.
본원에서 사용되는 바, "실질적으로 상이한"이라는 어구는 통상의 기술자가 두 수치 값 사이의 차이를 그 값 (예컨대, Kd 값 또는 억제)에 의해 측정된 생물학적 특징과 관련하여 통계학상 유의적인 것으로 간주할 정도의, 두 수치 사이의 충분히 높은 정도의 차이를 나타낸다. 두 값 사이의 차이는 참조/비교자 분자에 대한 값의 함수로서 예를 들어, 약 10% 초과, 약 20% 초과, 약 30% 초과, 약 40% 초과, 및/또는 약 50% 초과이다.
작용제의 "유효량"은 원하는 치료학적 또는 예방학적 결과를 달성하는 데 필요한 투여량에서 상기 기간 동안 효과적인 양을 의미한다.
"환자," "개체," 또는 "대상체"는 포유동물이다. 포유동물은 가축 (예컨대, 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류 (예컨대, 인간 및 비-인간 영장류, 예컨대 원숭이), 토끼, 및 설치류 (예컨대, 마우스 및 래트)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 특정 실시양태에서, 환자, 개체 또는 대상체는 인간이다.
"~을 감소시키다 또는 억제시키다"라는 것은 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 그 초과의 전반적 감소를 발생시키는 능력을 의미한다. "~을 감소시키다 또는 억제시키다"라는 것은 치료할 장애의 증상, 전이의 존재 또는 크기, 또는 원발성 종양의 크기를 의미할 수 있다.
통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이, 본원에서 "약" 값 또는 파라미터에 대한 언급은 상기 값 또는 파라미터 그 자체에 대한 실시양태를 포함한다 (그리고 그를 기술한다). 예를 들어, "약 X"를 언급하는 기술은 "X"를 기술하는 것을 포함한다.
본원에 기술된 본 발명의 측면 및 실시양태는 측면 및 실시양태로 "~로 이루어지는" 및/또는 "~로 본질적으로 이루어지는" 것을 포함하는 것으로 이해된다. 본원에서 사용되는 바, 단수 형태는 달리 명시되지 않는 한, 복수의 언급대상을 포함한다.
II. 방법 및 용도
본원에서는 줄기 세포를 액체 배양하는 방법을 제공한다. 본원에서는 미분화된 표현형 및 자가 유지 능력을 보유하는 줄기 세포의 존재를 보존하면서, 액체 중에서 상피 줄기 세포, 및 상피 줄기 세포를 포함하는, 소장, 결장, 위 및 췌장으로부터 단리된 단편을 배양하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 본원에 기술된 방법에 따라 배양된 단리된 소낭선은 융모-유사 상피가 줄지어 있는 중앙 내강을 포함하는 소낭선-융모 오르가노이드로 발생하게 된다. 생성된 오르가노이드는 다회에 걸쳐 소낭선 분열 이벤트를 거치게 된다. 놀랍게도, 본원에서 제공하는 방법을 통해 단일의 단리된 상피 줄기 세포는 저수준의 세포외 매트릭스의 존재하에 액체 배양물 중에서 소낭선-융모 오르가노이드로 성장할 수 있게 된다. 위의 유문부로부터 단리된 위 단편은 장 소낭선 오르가노이드로서 작용하였는데: 상기 유닛의 개방된 상부는 실링되었고, 내강은 아폽토시스 세포로 충전되었으며, 오르가노이드는 저수준의 세포외 매트릭스에서 중앙 내강을 포함하면서 그의 극성을 유지함과 동시에, (샘 분열을 연상시키는) 발아 이벤트가 계속적으로 이루어졌다.
특히, 본원에서는 (i) 골 형태발생 단백질 (BMP) 억제제, (ii) 유사분열촉진 성장 인자, (iii) Wnt 효능제, 및 (iv) 약 4% w/v 이상의 세포외 매트릭스 (ECM)가 첨가된, 동물 또는 인간 세포용 기초 배지를 포함하는 액체 세포 배양물 중에서 상피 줄기 세포 및/또는 상피 줄기 세포를 포함하는 단리된 상피 조직 단편을 인큐베이션시키는 것을 포함하는, (a) 상피 줄기 세포 및/또는 (b) 상피 줄기 세포를 포함하는 단리된 상피 조직 단편을 액체 배양하는 방법을 제공한다. 추가로, 본원에서는 (i) 골 형태발생 단백질 (BMP) 억제제, (ii) 유사분열촉진 성장 인자, (iii) Wnt 효능제, 및 (iv) 약 4% w/v 이상의 세포외 매트릭스 (ECM)가 첨가된, 동물 또는 인간 세포용 기초 배지를 포함하는 액체 세포 배양물 중에서 상피 줄기 세포 및/또는 단리된 조직 단편을 인큐베이션시키는 것을 포함하는, 소낭선을 수득하고/거나 성장시키는 방법을 제공한다.
줄기 세포는 동물 성체의 많은 기관에서 발견되고, 미분화된 표현형을 보유하며, 그의 자손은 적절한 조직에 존재하는 모든 계통으로 분화될 수 있고, 일생 동안 자가 유지 능력을 보유하며, 손상 후에도 적절한 조직을 재생시킬 수 있다. 줄기 세포는 줄기 세포 집단의 유지를 위해 적절한 세포-세포 접촉 및 신호를 공급하는 줄기 세포 니치인 분화된 위치에 거주한다.
상피 줄기 세포는 상피를 구성하는 독특한 세포 유형을 형성할 수 있다. 일부 상피, 예컨대 피부 또는 장은 신속한 세포 교체를 보이는데, 이는 거주하는 줄기 세포가 틀림없이 연속적으로 증식할 것이라는 것을 시사한다. 다른 상피, 예컨대 간 또는 췌장은 정상 조건하에서는 매우 느린 교체를 보인다. 소낭선은 통상의 기술자에게 공지된 프로토콜에 의해 십이지장, 소장 및 대장 (공장, 회장, 및 결장 포함), 및 위의 유문부로부터 단리될 수 있다. 예를 들어, 소낭선은 기저막 및 기질 세포 유형과의 그의 칼슘 및 마그네슘 의존성 상호작용으로부터 세포를 유리시키는 킬레이팅제와 함께 단리된 조직을 인큐베이션시킴으로써 단리될 수 있다. 조직을 세척한 후, 유리 슬라이드를 이용하여 상피 세포층을 점막하조직으로부터 스크래핑하고, 민싱(minced)한다. 이어서, 트립신, 또는 더욱 바람직하게는, EDTA 및/또는 EGTA 중에서 인큐베이션시키고, 예를 들어 여과 및/또는 원심분리 단계를 사용하여 분해되지 않은 조직 단편 및 단일 세포를 소낭선으로부터 분리한다. 다른 단백질분해 효소, 예컨대 콜라게나제 및/또는 디스파제 I이 트립신 대신 사용될 수 있다. 췌장 및 위의 단편을 단리시키는 데 유사한 방법이 사용된다.
줄기 세포를 상피 조직으로부터 단리시키는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 그의 표면 상에 거대 G 단백질-커플링된 수용체 (GPCR) 슈퍼패밀리에 속하는 Lgr5 및/또는 Lgr6을 발현하는 줄기 세포를 단리시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 상피 조직으로부터 세포 현탁액을 제조하는 단계, 상기 세포 현탁액을 Lgr5 및/또는 6 결합 화합물과 접촉시키는 단계, Lgr5 및/또는 6 결합 화합물을 단리시키는 단계, 및 줄기 세포를 상기 결합 화합물로부터 단리시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리된 소낭선으로부터 기계적으로 상피 줄기 세포를 포함하는 단일 세포 현탁액을 생성할 수 있다.
일부 실시양태에서, Lgr5 및/또는 6 결합 화합물은 항체, 예컨대 Lgr5 또는 Lgr6 중 하나의 세포외 도메인을 특이적으로 인식하고, 그에 결합하는 모노클로날 항체, 예컨대 마우스 및 래트 모노클로날 항체를 포함하는 모노클로날 항체를 포함한다. 상기 항체를 사용하여, Lgr5 및/또는 Lgr6을 발현하는 줄기 세포를 예를 들어, 자기 비드의 도움을 이용하여, 또는 형광 활성화된 세포 분류를 통해 단리시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 상피 줄기 세포는 소낭선, 위 단편 또는 췌장 단편으로부터 단리된다. 예를 들어, 상피 줄기 세포는 장으로부터 단리된 소낭선으로부터 단리된다. 일부 실시양태에서, 상피 줄기 세포는 십이지장, 공장 및 회장을 포함하는 소장, 췌장, 또는 위로부터 단리된다.
상기 방법 중 임의의 것의 일부 실시양태에서, 상피 줄기 세포 및/또는 상피 조직 단편은 위장 줄기 세포 및/또는 위장 조직 단편이다. 일부 실시양태에서, 위장 줄기 세포 및/또는 위장 조직 단편은 소장 줄기 세포 및/또는 소장 조직 단편이다.
세포 니치는 부분적으로는 줄기 세포 및 주변 세포, 및 니치 중 상기 세포에 의해 생산되는 세포외 매트릭스 (ECM)에 의해 결정된다. 일부 실시양태에서, 단리된 소낭선 또는 상피 줄기 세포는 ECM에 부착된다. ECM은 다양한 다당류, 물, 엘라스틴, 및 당단백질로 구성되며, 여기서 당단백질은 콜라겐, 엔탁틴 (니도겐), 피브로넥틴, 및 라미닌을 포함한다. ECM은 결합 조직 세포에 의해 분비된다. 상이한 유형의 당단백질 및/또는 당단백질의 상이한 조합을 비롯한 상이한 조성을 포함하는 상이한 유형의 ECM이 공지되어 있다. ECM은, ECM을 생산하는 세포, 예컨대 섬유모세포 세포의 제거 및 단리된 소낭선 또는 상피 줄기 세포의 첨가 이전에 상기 세포를 용기 중에서 배양함으로써 제공할 수 있다. 세포외 매트릭스를 생산하는 세포의 예로는 주로 콜라겐 및 프로테오글리칸을 생산하는 연골세포, 주로 IV형 콜라겐, 라미닌, 간질 프로콜라겐, 및 피브로넥틴을 생산하는 섬유모세포 세포, 및 주로 콜라겐 (I형, III형, 및 V형), 콘드로이틴 술페이트 프로테오글리칸, 히알루론산, 피브로넥틴, 및 테나신-C를 생산하는 결장 근섬유모세포가 있다. 대안적으로, ECM은 상업적으로 제공된다. 상업적으로 이용가능한 세포외 매트릭스의 예로는 세포외 매트릭스 단백질 (인비트로젠(Invitrogen)) 및 매트리겔™ (BD 바이오사이언시스(BD Biosciences))이 있다.
일부 실시양태에서, ECM은 2개 이상의 독특한 당단백질, 예컨대 2가지 상이한 유형의 콜라겐, 또는 콜라겐 및 라미닌을 포함한다. ECM은 합성 히드로겔 세포외 매트릭스 또는 자연적으로 발생된 ECM일 수 있다. 가장 바람직한 ECM은 라미닌, 엔탁틴, 및 콜라겐 IV를 포함하는, 매트리겔™ (BD 바이오사이언시스)에 의해 제공된다.
상기 방법 중 임의의 것의 일부 실시양태에서, ECM은 성장 인자 감소된 ECM이다. 일부 실시양태에서, ECM은 매트리겔이다.
상기 방법 중 임의의 것의 일부 실시양태에서, ECM은 액체 세포 배양물 중 약 4% w/v 내지 약 10% w/v, 약 4% w/v 내지 약 5% w/v, 및/또는 약 4% w/v 내지 약 15% w/v 중 대략 임의의 농도로 존재한다. 일부 실시양태에서, ECM은 약 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 및/또는 10% 중 임의의 농도보다 크고, 약 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 및/또는 10% 중 임의의 농도보다 작은 농도로 존재한다. 일부 실시양태에서, ECM은 약 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 및/또는 10% 중 임의의 농도로 존재한다.
본원에 기술된 방법에서 사용되는 세포 배양 배지는 임의의 세포 배양 배지를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포 배양 배지는 카르보네이트 기반 완충제를 이용하여 pH 7.4로 (예컨대, 7.2 내지 7.6, 또는 7.2 이상 내지 7.6 이하로) 완충처리된 한정 합성 배지이고, 세포는 5% 내지 10% CO2, 또는 5% 이상 내지 10% CO2 이하, 바람직하게는 5% CO2를 포함하는 대기 중에서 배양된다. 일부 실시양태에서, 세포 배양 배지는 글루타민, 인슐린, 페니실린/스트렙토마이신 및 트랜스페린으로 보충된 DMEM/F12 및 RPMI 1640으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 무혈청 배양용으로 최적화되고, 이미 인슐린을 포함하고 있는 어드밴스드(Advanced) DMEM/F12 또는 어드밴스드 RPMI가 사용된다. 이 경우, 어드밴스드 DMEM/F12 또는 어드밴스드 RPMI 배지는 바람직하게 글루타민 및 페니실린/스트렙토마이신으로 보충된다. 일부 실시양태에서, 세포 배양 배지는 정제된, 천연, 반합성 및/또는 합성 성장 인자로 보충되고, 비한정 성분, 예컨대 우태아 혈청 또는 송아지 태아 혈청을 포함하지 않는다. 보충제, 예컨대 B27 (인비트로젠), N-아세틸시스테인 (시그마(Sigma)) 및 N2 (인비트로젠)가 일부 세포의 증식을 자극하고, 이는 배지에 추가로 첨가될 수 있다.
일부 실시양태에서, 기초 배양 배지는 BMP 억제제를 포함한다. BMP는 이량체 리간드로서, 2개의 상이한 수용체 세린/트레오닌 키나제, I형 및 II형 수용체로 이루어진 수용체 복합체에 결합한다. II형 수용체는 I형 수용체를 인산화시켜 상기 수용체 키나제를 활성화시킨다. 이어서, I형 수용체는 특이 수용체 기질 (SMAD)을 인산화시켜 신호 전달 경로가 전사 활성을 유도하게 한다.
일부 실시양태에서, BMP 억제제는 BMP 분자에 결합하여 복합체를 형성하는 작용제로서, 여기서 BMP 활성은 예를 들어, BMP 분자의 BMP 수용체에의 결합을 방해하거나 억제시킴으로써 중화된다. 대안적으로, 억제제는 길항제 또는 역 효능제로서 작용하는 작용제이다. 이러한 유형의 억제제는 BMP 수용체와 결합하고, BMP의 수용체에의 결합을 방해한다. 후자의 작용제의 예로는 BMP 수용체에 결합하여 BMP의 항체 결합 수용체에의 결합을 방해하는 항체가 있다.
수개의 천연 BMP 결합 단백질 부류가 공지되어 있으며, 이는 노긴 (페프로텍(Peprotech)), 코르딘 및 코르딘 도메인을 포함하는 코르딘-유사 단백질 (R&D 시스템즈(R&D systems)), 폴리스타틴 및 폴리스타틴 도메인을 포함하는 폴리스타틴-관련 단백질 (R&D 시스템즈), DAN 및 DAN 시스테인-노트 도메인을 포함하는 DAN-유사 단백질 (R&D 시스템즈), 스클레로스틴/SOST (R&D 시스템즈), 데코린 (R&D 시스템즈), 및 알파-2 마크로글로불린 (R&D 시스템즈)을 포함한다. 일부 실시양태에서, BMP 억제제는 노긴, DAN, 및 세르베루스 및 그렘린 (R&D 시스템즈)을 비롯한 DAN-유사 단백질로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, BMP 억제제는 노긴이다. 일부 실시양태에서, 확산성 단백질은 다양한 친화도로 BMP 리간드에 결합할 수 있고, 그의 신호전달 수용체에의 접근을 억제시킬 수 있다. 상기 BMP 억제제 중 임의의 것을 기초 배양 배지에 첨가하면, 줄기 세포 손실을 막을 수 있는데, 첨가하지 않는다면, 줄기 세포는 배양 약 2-3주 경과 후에 손실된다.
일부 실시양태에서, BMP 억제제는 상기 억제제 부재하에서의 BMP 활성 수준과 비교하여 90% 이하, 80% 이하, 70% 이하, 50% 이하, 30% 이하, 10% 이하, 또는 0%로 세포에서 BMP 의존 활성을 억제시킨다. 일부 실시양태에서, BMP 활성은 예를 들어, 문헌 [Zilberberg et al., 2007 BMC Cell Biol 8:41]에 예시된 바와 같이, BMP의 전사 활성을 측정함으로써 측정될 수 있다.
일부 실시양태에서, BMP 억제제는 액체 세포 중 약 5 내지 500 ng/mL, 5 내지 250 ng/mL, 25 내지 150 ng/mL, 및 50 내지 100 ng/mL 중 임의의 농도로 존재한다. 일부 실시양태에서, 기초 세포 배양물 중 BMP 억제제는 약 10 ng/ml, 20 ng/ml, 50 ng/ml, 100 ng/ml 중 임의의 농도 이상으로 존재한다. 일부 실시양태에서, BMP 억제제의 농도는 약 100 ng/ml이다. 줄기 세포를 배양하는 동안, BMP 억제제는 바람직하게 이틀마다 배양 배지에 첨가되고, 배양 배지는 바람직하게 사흘마다 새로 공급된다. 일부 실시양태에서, BMP 억제제는 노긴이다.
상기 방법 중 임의의 것의 일부 실시양태에서, Wnt 효능제는 기초 배양 배지에 첨가된다. Wnt 신호전달 경로는, Wnt 단백질이 프리즐드(Frizzled) 수용체 패밀리 구성원의 세포 표면 수용체에 결합하였을 때 발생하는 일련의 이벤트에 의해 정의된다. 이를 통해 디스헤벨드(Dishevelled) 패밀리 단백질은 활성화되고, 이는 옥신, GSK-3, 및 단백질 APC를 포함하는 단백질 복합체를 억제시켜 세포내 β-카테닌을 분해한다. 생성된 풍부한 핵 β-카테닌은 TCF/LEF 패밀리 전사 인자에 의해 전사를 증진시킨다. 일부 실시양태에서, Wnt 효능제는 세포에서 TCF/LEF-매개 전사를 활성화시키는 작용제일 수 있다. 그러므로, Wnt 효능제는 Wnt 패밀리 단백질 중 임의의 것 및 모두를 비롯한, 프리즐드 수용체 패밀리 구성원에 결합하고, 그를 활성화시키는 진성 Wnt 효능제, 세포내 β-카테닌 분해 억제제, 및 TCF/LEF 활성 인자로부터 선택된다.
Wnt 효능제는 Wnt-1/Int-1, Wnt-2/Irp (예컨대, InM-관련 단백질), Wnt-2b/13, Wnt-3/Int-4, Wnt-3a (예컨대, R&D 시스템즈), Wnt-4, Wnt-5a, Wnt-5b, Wnt-6 (예컨대, Kirikoshi H et al. (2001) Biochem Biophys Res Com 283:798-805), Wnt-7a (예컨대, R&D 시스템즈). Wnt-7b, Wnt-8a/8d, Wnt-8b, Wnt-9a/14, Wnt-9b/14b/15, Wnt-10a, Wnt-10b/12, WnM 1, 및/또는 Wnt-16을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 분비된 당단백질을 포함한다. 인간 Wnt 단백질에 대한 개요는 문헌 ["THE WNT FAMILY OF SECRETED PROTEINS", R&D Systems Catalog, 2004]에 제공되어 있다. 일부 실시양태에서, Wnt 효능제는 Wnt 패밀리 구성원, R-스폰딘 1-4, 노린, 및/또는 GSK-억제제이다.
일부 실시양태에서, Wnt 효능제는 R-스폰딘 폴리펩티드이다. 분비된 단백질의 R-스폰딘 패밀리는 Wnt 신호전달 경로의 활성화 및 조절과 연루되어 있으며, 이는 4개의 구성원 (R-스폰딘 1 (예컨대, NU206, 누벨로(Nuvelo: 미국 캘리포니아주 샌 카를로스)), R-스폰딘 2 (예컨대, R&D 시스템즈), R-스폰딘 3, 및 R-스폰딘-4)을 포함한다.
일부 실시양태에서, Wnt 효능제는, 고친화도로 프리즐드-4 수용체에 결합하고, Wnt 신호전달 경로의 활성화를 유도한다는 점에서 Wnt 단백질과 유사한 기능을 하는, 분비된 조절 단백질인 노린 (놈 질환 단백질(Nome Disease Protein) 또는 NDP로도 불린다) (예컨대, R&D 시스템즈))이다 (Kestutis Planutis et al. (2007) BMC Cell Biol 8:12). Wnt 신호전달 경로의 소형 분자 효능제인 아미노피리미딘 유도체가 최근 확인되었으며, 이는 또한 Wnt 효능제로서 명확하게 포함된다 (Lin et al. (2005) Angew Chem Int Ed Engl 44:1987-90).
일부 실시양태에서, Wnt 효능제는 GSK-억제제이다. GSK-억제제의 예로는 소형 간섭 RNA (siRNA, 예컨대 셀 시그날링(Cell Signaling)), 리튬 (예컨대, 시그마), 켄파울론 (바이오몰 인터내셔널(Biomol International), Leost et al. (2000) Eur J Biochem 267, 5983-5994), 6-브로모인디루빈-30-아세톡심 (Meyer et al. (2003) Chem Biol 10, 1255-1266), SB 216763 및 SB 415286 (시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)), 및 GSK-3과 옥신과의 상호작용을 방해하는 FRAT-패밀리 구성원 및 FRAT-유도 펩티드 (Meijer et al. (2004) Trends in Pharma . Sci . 25, 471-480)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다 (상기 문헌들은 본원에서 참조로 포함된다). GSK-3 억제 수준을 측정하는 방법 및 검정은 통상의 기술자에게 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Liao et al. (2004) Endocrinology, 145(6) 2941-9]에 기술된 바와 같은 방법 및 검정을 포함한다.
일부 실시양태에서, Wnt 효능제는 세포에서 Wnt 활성을 상기 분자 부재하에서의 Wnt 활성 수준과 비교하였을 때 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 50% 이상, 70% 이상, 90% 이상, 100% 이상만큼 자극시킨다. 통상의 기술자에게 공지되어 있는 바와 같이, Wnt 활성은 예를 들어, pTOPFLASH 및 pFOPFLASH Tcf 루시페라제 수용체 구축물에 의해 Wnt의 전사 활성을 측정함으로써 측정될 수 있다 (Korinek et al. (1997) Science 275 1784-1787).
일부 실시양태에서, Wnt 효능제는 액체 세포 배양물 중 약 500 ng/mL 내지 5 ㎍/ml, 500 ng/mL 내지 5 ㎍/mL, 500 ng/mL 내지 약 1.5 ㎍/mL 중 임의의 농도 (예컨대, 약 500 내지 약 1500 ng/mL)로 존재한다. 일부 실시양태에서, Wnt 효능제는 기초 배양 배지에 약 50 ng/mL, 100 ng/mL, 200 ng/mL, 300 ng/mL, 500 ng/mL, 750 ng/mL, 1000 ng/mL, 1250 ng/mL, 및/또는 1500 ng/mL 중 임의의 농도 이상으로 첨가된다. 일부 실시양태에서, Wnt 효능제의 농도는 약 500 ng/ml이다. 줄기 세포를 배양하는 동안, Wnt 효능제는 바람직하게 이틀마다 배양 배지에 첨가되고, 배양 배지는 바람직하게 사흘마다 새로 공급된다. 일부 실시양태에서, Wnt 효능제는 R-스폰딘 1을 포함하거나, 그로 이루어진다. 일부 실시양태에서, Wnt 효능제는 R-스폰딘 2를 포함하거나, 그로 이루어진다. 일부 실시양태에서, Wnt 효능제는 R-스폰딘 3을 포함하거나, 그로 이루어진다. 일부 실시양태에서, Wnt 효능제는 R-스폰딘 4를 포함하거나, 그로 이루어진다.
일부 실시양태에서, Wnt 효능제는 R-스폰딘, Wnt-3a 및 Wnt-6으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, R-스폰딘 및 Wnt-3a 둘 모두 Wnt 효능제로서 사용된다. 일부 실시양태에서, 농도는 R-스폰딘의 경우, 약 500 ng/ml이고, Wnt3a의 경우, 약 100 ng/ml이다.
일부 실시양태에서, 기초 배양 배지는 유사분열촉진 성장 인자를 포함한다. 미토겐 성장 인자의 예로는 표피 성장 인자 (EGF, 예컨대 페프로텍), 형질전환 성장 인자-알파 (TGF-알파, 예컨대 페프로텍), 염기성 섬유모세포 성장 인자 (bFGF, 예컨대 페프로텍), 뇌-유래 신경영양 인자 (BDNF, R&D 시스템즈), 및 각질세포 성장 인자 (KGF, 페프로텍)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. EGF는 각종의 배양된 외배엽 및 중배엽 세포에 대하여 강력한 효능을 가진 유사분열촉진 인자이고, 생체내 및 시험관내에서의 특정 세포의, 및 세포 배양물 중에서의 일부 섬유모세포의 분화에 지대한 영향을 미친다. EGF 전구체는, 단백질분해에 의해 절단되어 세포를 자극하는 53-아미노산 펩티드 호르몬을 생성하는 막-결합 분자로서 존재한다.
일부 실시양태에서, 유사분열촉진 성장 인자는 기초 배양 배지에 5 내지 500 ng/ml의 농도, 또는 5 ng/ml 이상 내지 500 ng/ml 이하의 농도로 첨가된다. 일부 실시양태에서, 농도는 약 5, 10, 20, 25, 30, 40, 45, 또는 50 ng/mL 중 임의의 농도 이상 내지 약 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 또는 100 ng/mL 중 임의의 농도 이하이다. 일부 실시양태에서, 유사분열촉진 성장 인자의 농도는 약 50 ng/ml 이상 내지 약 100 ng/ml 이하이다. 일부 실시양태에서, 농도는 약 50 ng/ml이다. 일부 실시양태에서, 유사분열촉진 성장 인자는 EGF이다. 일부 실시양태에서, 유사분열촉진 성장 인자는 bFGF (예컨대, FGF10 또는 FGF7)이다. 일부 실시양태에서, FGF7 및/또는 FGF10이 사용된다. FGF7은 또한 KGF (각질세포 성장 인자)로도 알려져 있다. 일부 실시양태에서, 유사분열촉진 성장 인자의 조합, 예컨대 EGF 및 KGF, 또는 EGF 및 BDNF가 기초 배양 배지에 첨가된다. 일부 실시양태에서, 유사분열촉진 성장 인자의 조합, 예컨대 EGF 및 KGF, 또는 EGF 및 FGF10이 기초 배양 배지에 첨가된다. 1개 초과의 유사분열촉진 성장 인자, 예를 들어 FGF7 및 FGF10이 사용될 경우, 미토겐 성장 인자의 농도는 상기 정의된 바와 같고, 사용되는 미토겐 성장 인자의 총 농도를 언급한다. 일부 실시양태에서, 줄기 세포를 배양하는 동안, 유사분열촉진 성장 인자는 바람직하게 이틀마다 배양 배지에 첨가되고, 배양 배지는 바람직하게 사흘마다 새로 공급된다. bFGF 패밀리의 임의의 구성원이 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 배양 배지는 로크 (Rho-키나제) 억제제를 포함한다. 로크 억제제 첨가가 특히, 단일 줄기 세포를 배양할 때, 아노이키스를 막는 것으로 밝혀졌다. 로크 억제제는 바람직하게, R)-(+)-트랜스-4-(1-아미노에틸)-N-(4-피리딜)시클로헥산카르복스아미드 디히드로클로라이드 일수화물 (Y-27632, 예컨대 시그마-알드리치), 5-(1,4-디아제판-1-일술포닐)이소퀴놀린 (패수딜 또는 HA1077, 예컨대 케이만 케미칼(Cayman Chemical)), 및 (S)-(+)-2-메틸-1-[(4-메틸-5-이소퀴놀리닐)술포닐]-헥사히드로-1H-1,4-디아제핀 디히드로클로라이드 (H-1152, 예컨대 토크리스 바이오사이언스(Tocris Bioscience))로부터 선택된다. Rho-키나제 억제제, 예를 들어 Y-27632는 줄기 세포를 배양하는 처음 7일 동안에 이틀마다 배양 배지에 첨가될 수 있다. 일부 실시양태에서, Y27632의 농도는 10 DM이다.
일부 실시양태에서, 배양 배지는 노치 효능제를 포함한다. 노치 신호전달은 세포 운명 결정에서 뿐만 아니라, 세포 생존 및 증식에서 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌다. 노치 수용체 단백질은 델타 1, 재그드(Jagged) 1 및 2, 및 델타-유사 1, 델타-유사 3, 델타-유사 4를 포함하나, 이에 제한되지 않는, 다수의 표면-결합 또는 분비형 리간드와 상호작용할 수 있다. 리간드 결합시, 노치 수용체는 ADAM 프로테아제 패밀리의 구성원을 포함하는 일련의 절단 이벤트 뿐만 아니라, 감마 세크레타제 프레시닐린에 의해 조절되는 막내 절단에 의해 활성화된다. 그 결과, 노치의 세포내 도메인은 핵으로 전위되고, 여기서 전사에 의해 하류 유전자를 활성화시킨다. 일부 실시양태에서, 노치 효능제는 재그드 1 및 델타 1, 또는 그의 활성 단편, 또는 유도체로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 노치 효능제는 서열 CDDYYYGFGCNKFCRPR을 포함하는 DSL 펩티드이다 (Dontu et al., 2004. Breast Cancer Res 6:R605-R615). DSL 펩티드 (ANA spec)는 바람직하게 약 10 μM 내지 약 100 nM, 또는 약 10 μM 이상 내지 약 100 nM 이하의 농도로 사용된다. 특히 배양 첫주 동안 노치 효능제의 첨가는 배양률을 2-3배만큼 증가시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 노치 효능제는 줄기 세포를 배양하는 처음 7일 동안에 이틀마다 배양 배지에 첨가된다.
일부 실시양태에서, 노치 효능제는 세포에서의 노치 활성을 상기 분자 부재하에서의 노치 활성 수준과 비교하였을 때 약 10%, 20%, 30%, 50%, 70%, 90%, 및/또는 100% 중 임의의 값 이상만큼 자극시키는 분자일 수 있다. 일부 실시양태에서, 노치 활성은 노치의 전사 활성을 측정함으로써, 예를 들어 문헌 [Hsieh et al. (1996) Mol Cell . Biol . 16, 952-959]에 기술된 바와 같이, 4xwtCBF1-루시페라제 수용체 구축물에 의해 측정될 수 있다.
상기 방법 중 임의의 것의 일부 실시양태에서, 본 방법은 현적 배양을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 종래 현적 배양을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 중공구(hallow sphere)에서의 현적 배양을 포함한다 (Lee et al. Tissue Engineering 15(00) (2009)). 상기 방법 중 임의의 것의 일부 실시양태에서, 본 방법은 스캐폴드를 포함하지 않는 환경에서 배양하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 현적 배양용 플레이트에서 배양하는 것을 포함한다 (예컨대, US2011/0306122 및/또는 EP2342317 (이는 그 전문이 참조로 포함된다)에 기술된 바와 같음).
일부 실시양태에서, 상피 줄기 세포는 췌장, 위, 장, 및/또는 결장 상피 줄기 세포이다. 일부 실시양태에서, 상피 줄기 세포는 소장 줄기 세포이다. 일부 실시양태에서, 상피 줄기 세포는 배아 줄기 세포를 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 상피 줄기 세포는 성체 줄기 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 소장, 결장, 및 위로부터의 단일의 분류된 상피 줄기 세포는 또한 액체 배양물 중에서 상기 3차원 오르가노이드를 개시할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 액체 배양 방법을 통해, 분화된 세포 유형 모두가 존재하는 융모-유사 상피 도메인이 생성됨과 동시에, 단일의 소낭선이 다회에 걸쳐 소낭선 분열 이벤트를 거치게 되는 장기 배양 조건이 확립될 수 있다. 일부 실시양태에서, 배양된 소낭선은 배양된 후에는 현저한 형태학상의 변화를 겪게 된다. 일부 실시양태에서, 새로 단리된 소낭선의 상단의 개구부는 실링되고, 이 영역은 점진적으로 풍선 확장화되고, 아폽토시스 세포로 충전되고, 아폽토시스 세포와 비슷한 정도로 융모 선단에서 핀칭된다(pinched off). 일부 실시양태에서, 소낭선 영역에서는 소낭선 분열을 연상시키는 과정인, 추가의 소낭선을 생성하는 발아 이벤트가 계속적으로 이루어지는 것으로 밝혀졌다. 일부 실시양태에서, 소낭선-유사 확장부는 증식 세포, 파네트 세포, 장세포 및 배상 세포를 비롯한, 분화된 상피 세포 유형 모두를 포함한다. 일부 실시양태에서, 근섬유모세포 또는 다른 비-상피 세포는 어느 단계에서도 오르가노이드 중에서는 검출불가능하다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 액체 배양 방법을 통해 본원에서 발아 소낭선 구조물은, 융모-유사 상피가 줄지어 있는 중앙 내강 주변에 존재하고, 아폽토시스 세포체로 충전된 >40개 소낭선-유사 구조물을 포함하는, 생성된 오르가노이드로 확장될 수 있다. 일부 실시양태에서, 소낭선-융모 오르가노이드는 융모-유사 상피가 줄지어 있는 중앙 내강을 포함한다. 일부 실시양태에서, 내강은 내용물을 배지로 방출하기 위해 연속적인 시간 간격으로 개방된다. 일부 실시양태에서, 액체 배양 방법을 통해 7개월 이상, 8개월 이상, 9개월 이상, 10개월 이상의 배양 기간이 가능화된다. 일부 실시양태에서, 오르가노이드는 필수 특징을 상실하지 않으면서, 6개월 이상 동안 배양물 중에서 계대화되고, 유지될 수 있다. 일부 실시양태에서, 계대화는 오르가노이드의 수동식 단편화를 포함하고/거나, 필요로 한다.
그러므로, 한 측면에서, 본 발명은 본원에 기술되고/거나, 본원에 기술된 방법을 사용하여 수득가능한 배양 배지 중에서 상피 줄기 세포 또는 단리된 소낭선을 배양함으로써 수득되는, 융모-유사 상피가 줄지어 있는 중앙 내강을 포함하는 소낭선-융모 오르가노이드를 제공한다. 일부 실시양태에서, 오르가노이드는 위 오르가노이드이다.
고처리량으로 수행될 수 있도록 하기 위해, 소낭선-융모 오르가노이드를 예컨대, 다중웰 플레이트 중에서 배양한다. 예를 들어, 오르가노이드에 영향을 주는 분자를 확인하기 위해 분자의 96 웰 플레이트 또는 384 웰 플레이트 라이브러리가 사용된다. 바람직한 라이브러리로는 항체 단편 라이브러리, 펩티드 파지 디스플레이 라이브러리, 펩티드 라이브러리 (예컨대, LOPAP™, 시그마 알드리치), 지질 라이브러리 (BioMol), 합성 화합물 라이브러리 (예컨대, LOP AC™, 시그마 알드리치) 또는 천연 화합물 라이브러리 (Specs, TimTec)를 포함한다. 이러한 유전자 라이브러리로는 cDNA 라이브러리, 안티센스 라이브러리, 및 siRNA 또는 다른 비-코딩 RNA 라이브러리를 포함한다. 세포를 바람직하게 특정 기간 동안 다중 농도의 시험 작용제에 노출시킨다. 노출 기간 종료시, 배양물을 평가한다. "영향을 주는"이라는 용어는 증식, 형태학상 변화 및 세포 사멸의 감소, 또는 그의 손실을 포함하나, 이에 제한되지 않는 세포의 임의의 변화를 포함하는 것으로 사용된다. 소낭선-융모, 위 또는 췌장 오르가노이드는 또한 소낭선-융모, 위 또는 췌장 오르가노이드가 아닌, 상피 암종 세포를 특이적으로 표적화하는 약물을 확인하는 데 사용될 수 있다.
소낭선-융모 오르가노이드는 추가로 잠재적인 신규 약물, 또는 공지된 또는 신규 식품 보충제의 독성 검정에서 세포주, 예컨대 Caco-2 세포의 사용을 대신할 수 있다.
추가로, 소낭선-융모 오르가노이드는 병원체, 예컨대 현재 적합한 조직 배양물 또는 동물 모델이 없는 노로바이러스의 배양을 위해 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 손상된 또는 이환된 조직을 수복시키는 것을 목적으로 하는 방법에서 유전자 요법이 추가로 사용될 수 있다. 예를 들어, 유전 정보, 예컨대 DNA 및/또는 RNA를 줄기 세포에 전달하기 위해 아데노바이러스 또는 레트로바이러스 유전자 전달 비히클이 사용될 수 있다. 통상의 기술자는 유전자 요법에서 표적화된 특정 유전자를 대체하거나, 수복시킬 수 있다. 예를 들어, 정상적인 유전자를 이들 게놈 내의 비특이 위치 내로 삽입하여 비기능성 유전자를 대체할 수 있다. 또 다른 일례에서, 비정상적인 유전자 서열이 상동성 재조합을 통해 정상 유전자 대신으로 대체될 수 있다. 대안적으로, 선택적 역 돌연변이가 유전자를 그의 정상 기능으로 복귀시킬 수 있다. 추가 예로는 특정 유전자의 조절 (유전자의 전원 온 오프 정도)을 변경시키는 것이다. 바람직하게, 줄기 세포를 유전자 요법 접근법에 의해 생체외에서 처리한 후, 이어서 포유동물, 바람직하게는 처리를 필요로 하는 인간에게 전달한다.
본원에서 제공되는 폴리펩티드 (예컨대, BMP 억제제, Wnt 효능제 등)의 일부 아미노산 서열 변이체가 고려된다. 예를 들어, 항체 및/또는 결합 폴리펩티드의 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선시키는 것이 바람직할 수 있다. 항체 및/또는 결합 폴리펩티드의 아미노산 서열 변이체는 항체 및/또는 결합 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 내로 적절한 변형을 도입함으로써, 또는 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. 상기 변형은 예를 들어, 항체 및/또는 결합 폴리펩티드의 아미노산 서열로부터의 잔기 결실, 및/또는 그 내부로의 잔기 삽입, 및/또는 그안의 잔기 치환을 포함한다. 최종 구축물이 원하는 특징, 예컨대 항원-결합을 가진다면, 최종 구축물에 도달하기 위해 결실, 삽입, 및 치환으로 이루어진 임의의 조합이 이루어질 수 있다.
특정 실시양태에서, 하나 이상의 아미노산 치환을 가지는 항체 변이체 및/또는 결합 폴리펩티드 변이체를 제공한다. 치환 돌연변이유발을 위한 관심 부위로는 HVR 및 FR을 포함한다. 보존적 치환은 하기 표 1 "바람직한 치환"이라는 표제하에 제시된다. 더욱 실질적인 변이는 표 1 "예시적인 치환"이라는 표제하에, 및 아미노산 측쇄 부류를 참조로 하여 하기에 추가로 기술되는 바와 같이 제공된다. 아미노산 치환은 관심 항체 및/또는 결합 폴리펩티드에 도입될 수 있고, 생성물은 원하는 활성, 예컨대 항원 결합 유지/개선, 면역원성 감소 또는 ADCC 또는 CDC 개선에 대해 스크리닝될 수 있다.
<표 1>
Figure pct00001
아미노산은 공통적인 측쇄 특성에 따라 분류될 수 있다:
(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro;
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비-보존적 치환은 이들 부류 중의 하나의 구성원을 또 다른 부류로 교환하는 것을 수반할 것이다.
치환 변이체의 한 유형으로는 모 항체 (예컨대, 인간화된 또는 인간 항체)의 하나 이상의 초가변 영역 잔기가 치환되는 것을 수반한다. 일반적으로, 추가 연구를 위해 선택된 생성된 변이체(들)는 모 항체에 비해 특정 생물학적 특성의 변형 (예컨대, 친화도 증가, 면역원성 감소)을 가지고/거나, 모 항체의 특정 생물학적 특성을 실질적으로 유지할 것이다. 예시적인 치환 변이체는 예컨대, 본원에 기술된 것과 같은 파지 디스플레이-기반 친화도 성숙 기법을 이용하여 편리하게 생성될 수 있는 친화도 성숙 항체이다. 간략하게, 하나 이상의 HVR 잔기가 돌연변이화되고, 변이체 항체가 파지 상에 디스플레이되고, 특정한 생물학적 활성 (예컨대, 결합 친화도)에 대해 스크리닝된다.
변경 (예컨대, 치환)은 예컨대, 항체 친화도를 개선시키기 위해 HVR에서 이루어질 수 있다. 이러한 변경은 HVR "핫스팟," 즉, 체세포 성숙 과정 (예컨대, 문헌 [Chowdhury, Methods Mol . Biol . 207: 179-196 (2008)] 참조) 동안 고빈도로 돌연변이화되는 코돈에 의해 코딩되는 잔기, 및/또는 항원을 결합 친화도에 대해 시험된 생성된 변이체 VH 또는 VL과 접촉시키는 잔기에서 이루어질 수 있다. 2차 라이브러리로부터의 구축 및 재선택에 의한 친화도 성숙은 예컨대, 문헌 [Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001).)]에 기술되어 있다. 친화도 성숙의 일부 실시양태에서, 다양성은 다양한 방법들 중 임의의 것 (예컨대, 오류-유발 PCR, 쇄 셔플링, 또는 올리고뉴클레오티드-지정 돌연변이유발)에 의한 성숙을 위해 선택된 가변 유전자로 도입된다. 이어서, 2차 라이브러리가 생성된다. 이어서, 원하는 친화도를 가지는 임의의 항체 변이체를 확인하기 위해 라이브러리를 스크리닝한다. 다양성을 도입하는 또 다른 방법으로는, 수개의 HVR 잔기 (예컨대, 한번에 4-6개의 잔기)가 무작위화되는 HVR-지정 접근법을 포함한다. 항원 결합에 관여하는 HVR 잔기는 예컨대, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발법 또는 모델링을 이용하여 특이적으로 확인될 수 있다. 특히, 흔히 CDR-H3 및 CDR-L3이 표적화된다.
특정 실시양태에서, 치환, 삽입, 또는 결실은 이러한 변경이 항원에 결합하는 항체의 능력을 실질적으로 감소시키지 않는 한, 하나 이상의 HVR 내에서 일어날 수 있다. 예를 들어, 결합 친화도를 실질적으로 감소시키지 않는 보존적 변경 (예컨대, 본원에서 제공하는 바와 같은 보존적 치환)이 HVR에서 이루어질 수 있다. 이러한 변경은 예를 들어, HVR 중 항원 접촉 잔기의 외부에서 이루어질 수 있다. 상기에서 제공된 변이체 VH 및 VL 서열의 특정 실시양태에서, 각각의 HVR은 변경되지 않거나, 또는 1, 2 또는 3개 이하의 아미노산 치환을 함유한다.
문헌 [Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085]에 기술된 바와 같이, 돌연변이유발을 위해 표적화될 수 있는 항체 및/또는 결합 폴리펩티드의 잔기 또는 영역을 확인하는 데 유용한 방법은 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발"이라고 불린다. 상기 방법에서, 잔기 또는 표적 잔기의 군 (예컨대, 하전된 잔기, 예컨대 arg, asp, his, lys, 및 glu)을 확인하고, 중성 또는 음으로 하전된 아미노산 (예컨대, 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 대체하여 항체의 항원과의 상호작용에 영향에 대해 측정한다. 추가의 치환은 초기 치환에 대한 기능적 감수성을 입증하는 아미노산 위치에 도입될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 항체와 항원 사이의 접촉점을 확인하기 위한 항원-항체 복합체의 결정 구조. 상기 접촉 잔기 및 이웃한 잔기는 치환을 위한 후보로서 표적화되거나, 또는 제거될 수 있다. 변이체는 그가 원하는 특성을 함유하는 여부를 측정하기 위해 스크리닝될 수 있다.
아미노산 서열 삽입은 길이 범위가 1개의 잔기 내지 100개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드에 이르는 아미노- 및/또는 카르복실-말단 융합 뿐만 아니라, 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예로는 N-말단 메티오닐 잔기를 가지는 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 효소 (예컨대, ADEPT의 경우) 또는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드가 상기 항체의 N- 또는 C-말단에 융합된 것을 포함한다.
본 명세서에서 인용된 모든 특허 및 참조 문헌은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다.
실시예
하기는 본 발명의 방법 및 조성물의 예이다. 상기 제공된 일반적 설명에 따라 다양한 다른 실시양태를 실시할 수 있을 것으로 이해된다.
실시예 1 - 액체 배양물 중에서 성장시킨 오르가노이드
다양한 기관 조직 단편으로부터의 오르가노이드 배양물의 성장이 입증되었다. 하기는 오르가노이드의 생물학적 성질에 관한 이해를 목표로 하는 하류 적용을 실행할 수 있는 실현가능성을 최대화시키면서, 줄기 세포를 포함하는 조직 단편 (예컨대, 소장)으로부터 오르가노이드를 성장시킬 수 있는 것에 관한 기술적 설명이다.
물질 및 방법
마우스
소낭선 단리를 위해 6주령 내지 12주령된 CD-1 이계 교배된 마우스를 사용하였다.
소낭선 단리
개별 플레이팅 실험을 위해 1마리의 마우스로부터 십이지장, 공장, 및 회장을 포함하는 소장을 수거하였다. 냉 PBS를 이용하여 소장을 1회에 걸쳐 플러싱하고, 세로로 절개하였다. 세포 스크레이퍼를 이용하여 융모 구조물을 제거하여 소낭선 구조물을 작업 용액에 노출시켰다. 이어서, 장을 대략 5 mm 조각으로 절단하고, 냉 킬레이션 완충제 (5.6 mM Na2HPO4, 96.2 mM NaCl, 1.6 mM KCl, 43.4 mM 수크로스, 54.9 D-소르비톨) + 2 mM EDTA, 0.5 M DL-디티오트레이톨 중에서 30분 동안 얼음상에서 인큐베이션시켰다. 킬레이션 EDTA-DTT 완충제를 제거하고, 10 mL 피펫을 이용하여 조직 단편을 냉 킬레이션 완충제 중에 격렬하게 재현탁시켰다. 해부 현미경을 이용하여 용액 중 유리 소낭선의 출현에 대해 모니터링하였다. 유리 소낭선의 농도가 10개의 소낭선/㎕에 도달할 때까지, 보통 3회 사이클 후에, 킬레이션 EDTA-DTT 완충제 중에서의 인큐베이션 및 재현탁 프로세스를 반복하였다. 소낭선을 함유하는 상청액을 15 mL 원뿔형 관에 수집하고, 150-200 g로 3분 동안 펠릿화하고, 냉 킬레이션 완충제로 세척하였다.
플레이팅 및 배양
킬레이션 완충제 중에서 세척한 후, 소낭선을 다시 펠릿화하고, 5개의 소낭선/㎕ 농도의 성장 배지 (하기 참조) 중에 재현탁시켰다. 이어서, 소낭선을 웰당 40 ㎕ (200개의 소낭선)로 그래비티플러스(GravityPLUS) 96 웰 현적 배양용 플레이트 (인스페로(inSphero)) 상에 플레이팅하였다. 증발을 막기 위해 플레이트 바닥에 10 mL의 PBS를 첨가하고, 플레이트를 습윤화된 인큐베이터 중 37℃, 5% CO2, 및 대기 산소에서 배양하였다. 매 2일마다 각 웰로부터 배지의 절반을 제거하고, 새 배지로 교체함으로써 성장을 위해 필요한 인자 공급원이 확실히 일정하게 유지될 수 있도록 하였다.
증식 및 분화 검정
10일 배양 후, 상기 플레이트를 그래비티플러스 수용자 플레이트 (인스페로)에 커플링시키고, 150-200 g로 3분 동안 원심분리하였다. 다중채널 피펫을 이용하여 배지를 제거하고, 오르가노이드를 10 μM EdU를 포함하는 성장 배지 중에서 30분 동안 37℃에서 인큐베이션시켰다. 이어서, 오르가노이드를 실온에서 15분 동안 4% 파라포름알데히드/PBS 중에서 고정시켰다. 오르가노이드를 PBS + 3% BSA 중에서 2x 세척한 후, 실온에서 20분 동안 PBS + 0.5% 트리온(Trion) X-100 중에서 투과시켰다. 투과 후, 오르가노이드를 클릭-iT(Click-iT) EdU 반응 칵테일 중에서 인큐베이션시키고, 제조사의 프로토콜 (인비트로젠)에 따라 프로세싱하였다. 오르가노이드를 PBS + 0.1% 트리온 X-100으로 2x 세척하고, 1:3000의 토끼 항-인간 리소자임 1차 항체 중에서 밤새도록 4℃에서 인큐베이션시켰다. 다음날, 오르가노이드를 PBS + 0.1% 트리온 X-100으로 2x 세척하고, 알렉사-플루오르 488 2차에서 1시간 동안 실온에서 인큐베이션시키고, PBS + 0.1% 트리온 X-100으로 2x 세척하고, 프롤롱 골드(prolong gold) 봉입제 중에서 표본을 고정시키고, 레이카(Leica) SPE 공초점 현미경 상에서 영상화하였다.
성장 배지
페니실린/스트렙토마이신, 1 x N2 (깁코(Gibco)), 1 x B27 (깁코), 10 mM HEPES, 1 x 글루타맥스(Glutamax) (깁코), 1 mM N-아세틸시스테인, 뮤린 EGF 10-50 ng/mL (페프로텍), 뮤린 노긴 50-100 ng/mL (페프로텍), hRSPO3 1 ㎍/mL, 및 0-5% 성장 인자가 감소된 매트리겔 (BD 바이오사이언시스)로 보충된 어드밴스드 DMEM/F12.
결과
5% 매트리겔을 사용한 경우, 상기 기술된 방법을 사용하였을 때, 일관된 오르가노이드 성장이 관찰되었다. 오르가노이드 본체로부터 발아된 소낭선-유사 구조물 중 GFP 염색의 존재 및 그의 위치는 생체내 소낭선 기저에서의 Lgr5 발현의 국재화와 일치하였다 (도 1). 추가로, 오르가노이드의 소낭선-유사 구조물 중에서 리소자임 염색이 관찰되었는데, 이는 상기와 같은 제조를 통해 오르가노이드가 소화관의 분화된 세포로 활발히 분화되었다는 것을 제안하는 것이다 (도 1).
실시예 2 - 소화관 오르가노이드 중 Lgr5 양성 줄기 세포 절제
뮤린 소화관 중 Lgr5 양성 줄기 세포를 절제하였을 때, 정상적인 소화관 형태 뿐만 아니라, 분화된 세포의 정상적인 분포 및 개수를 얻었다는 것이 이전 연구에서 밝혀졌다 (Tian et al. 2011). 액체 배양된 오르가노이드가 생체내 소화관 조직의 기능적 및 형태학적 특징을 모사하는지 여부를 측정하기 위해, 하기와 같이 액체 배양된 오르가노이드 중에서 Lgr5 양성 줄기 세포를 절제하였다.
물질 및 방법
마우스
상기와 같이 소낭선을 단리시키기 위하여 원래 문헌 [Tian et al., 2011]에서 특징이 규명되어 있는 Lgr5DTREGFP /+ 마우스를 사용하였다. 상기 마우스는 EGFP 카세트를 이용하여 Lgr5를 발현하는 리포터로서의 역할을 하고, 디프테리아 독소 (DT) 투여시 Lgr5 양성 줄기 절제를 허용한다.
Lgr5 양성 줄기 세포 절제
소낭선 단리, 플레이팅, 및 배양은 상기와 같이 수행하였고, 단, 예외적으로, Lgr5 양성 줄기 세포 절제의 경우에는 소낭선을 3-7일 동안 성장시키고, 오르가노이드의 존재에 대해 시각적으로 검사하였다. 이어서, 오르가노이드를 10 ng/mL 디프테리아 독소 (DT)를 함유하는 배지로 처리하였다. DT를 함유하는 배지, 및 대조군 오르가노이드를 위해 DT를 함유하지 않는 배지를 총 10일 동안 매 2일마다 교체하였다.
오르가노이드 염색
이어서, 처리된 오르가노이드 및 대조군 오르가노이드를 수거하고, GFP로 염색하여 Lgr5 줄기 세포 절제의 효과를 모니터링하였다. 동시에, 오르가노이드를 리소자임에 대해 공동으로 염색하여 분화된 파네트 세포를 확인하였다. 오르가노이드를 PBS + 0.1% 트리온 X-100으로 2x 세척하고, 4% 파라포름알데히드/PBS 중에서 15분 동안 실온에서 고정시켰다. 오르가노이드를 PBS + 0.1% 트리온 X-100 중에서 3x 세척하고, 1시간 동안 단백질 무함유 블록 (다코(Dako))으로 차단시켰다. 오르가노이드를 닭 항-GFP (1:2000) 및 토끼 항-인간 리소자임 (1:2000) 항체와 함께 4℃에서 밤새도록 인큐베이션시켰다. 다음날, 오르가노이드를 PBS + 0.1% 트리온 X-100으로 3x 세척하고, 항-닭 IgG Cy3 () 및 항-토끼 알렉사-플루오르 488 2차에서 1시간 동안 실온에서 인큐베이션시키고, PBS + 0.1% 트리온 X-100으로 2x 세척하고, 프롤롱 골드 봉입제 중에서 표본을 고정시키고, 레이카 SPE 공초점 현미경 상에서 영상화하였다.
결과
DT 존재하에서 Lgr5DTREGFP /+ 오르가노이드를 장기간 인큐베이션시킨 결과, Lgr5 발현 세포의 절제로 인해 어떤 Lgr5 의존성 GFP 발현도 없는 정상적인 오르가노이드가 출현하였다 (도 2B). 상기 오르가노이드는 리소자임 염색에 대하여 양성을 보였는데, 이는 Lgr5 양성 세포의 부재하에서 분화가 일어났다는 것을 시사하는 것이고 (녹색 염색, 도 2B, B-1 및 D), 이는 강건한 증식을 보였다 (적색 염색, 도 2D).
요약하면, 단일의 장 줄기 세포는 위치상의 단서와는 상관없이 고체 세포외 매트릭스를 포함하는 그의 환경으로부터 작동할 수 있고, 정상적인 소화관을 연상시키는, 연속 확장형의 자가 조직화하는 상피 구조물을 생성할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 액체 배양 방법을 포함하는 기술된 배양 시스템은 줄기 세포 유래의 소낭선-융모의 생물학적 성질에 관한 연구를 간소화시킬 것이다.
실시예 3- 소화관 오르가노이드 성장을 위한 ECM ( 매트리겔 )의 요건
소화관 오르가노이드 성장에 대한 매트리겔의 요건을 결정하기 위해, 오르가노이드를 성장 배지 중에서 상이한 농도의 매트리겔을 이용하여 현적 배양 방법을 사용함으로써 성장시켰다.
마우스, 오르가노이드 제조, 및 오르가노이드 염색
본 실험을 위해 WT CD-1 마우스를 사용하였다. 소낭선 단리, 플레이팅, 및 배양은 상기와 같이 수행하였고, 단, 예외적으로, 오르가노이드를 0%, 1%, 2%, 3%, 4%, 및 5% 매트리겔의 존재하에서 성장시켰다. 소낭선 시딩 후 7일째에 오르가노이드를 함유하는 플레이트를 시각적으로 검사하였다. 상기 기술된 바와 같이 오르가노이드를 염색하고, 영상화하였다.
결과
도 3은 매트리겔 농도를 감소시키면서 소낭선을 성장 배지 중에 시딩시켰을 때의 결과를 보여주는 것이다. 5% 및 4% 매트리겔 (각각 A 및 B)을 통해서는 일관되게 크기가 큰 오르가노이드가 제조되었다. 보다 낮은 농도의 매트리겔은 오르가노이드의 강건한 성장을 지원하지 못하였으며 (C 및 D), 여기서 1% 및 0% 매트리겔을 통해서는 어떤 성장도 나타나지 않았다 (데이터는 나타내지 않음).

Claims (20)

  1. (i) 골 형태발생 단백질 (BMP) 억제제, (ii) 유사분열촉진 성장 인자, (iii) Wnt 효능제, 및 (iv) 약 4% w/v 이상의 세포외 매트릭스 (ECM)가 첨가된, 동물 또는 인간 세포용 기초 배지를 포함하는 액체 세포 배양물 중에서 상피 줄기 세포 및/또는 상피 줄기 세포를 포함하는 단리된 상피 조직 단편을 인큐베이션시키는 것을 포함하는, (a) 상피 줄기 세포 및/또는 (b) 상피 줄기 세포를 포함하는 단리된 상피 조직 단편을 액체 배양하는 방법.
  2. (i) 골 형태발생 단백질 (BMP) 억제제, (ii) 유사분열촉진 성장 인자, (iii) Wnt 효능제, 및 (iv) 약 4% w/v 이상의 세포외 매트릭스 (ECM)가 첨가된, 동물 또는 인간 세포용 기초 배지를 포함하는 액체 세포 배양물 중에서 상피 줄기 세포 및/또는 단리된 조직 단편을 인큐베이션시키는 것을 포함하는, 소낭선을 수득하고/거나 성장시키는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, BMP 억제제가 노긴(Noggin), DAN, 및/또는 세르베루스(Cerberus) 및 그렘린(Gremlin)을 비롯한 DAN-유사 단백질인 방법.
  4. 제3항에 있어서, BMP 억제제가 노긴인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, BMP 억제제가 액체 세포 배양물 중 약 5 내지 약 500 ng/ml의 농도 (예컨대, 약 50 내지 약 100 ng/mL)로 존재하는 것인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, Wnt 효능제가 Wnt, R-스폰딘 (RSPO), 노린(Norrin) 및/또는 GSK-억제제인 방법.
  7. 제6항에 있어서, Wnt 효능제가 RSPO인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, Wnt 효능제가 액체 세포 배양물 중 약 500 ng/mL 내지 약 5 ㎍/ml의 농도 (예컨대, 약 500 내지 약 1500 ng/mL)로 존재하는 것인 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 유사분열촉진 성장 인자가 표피 성장 인자 (EGF), 형질전환 성장 인자-알파 (TGF-α), 염기성 섬유모세포 성장 인자 (bFGF), 뇌-유래 신경영양 인자 (BDNF) 및 각질세포 성장 인자 (KGF)인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 유사분열촉진 성장 인자가 EGF인 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 유사분열촉진 성장 인자가 액체 세포 배양물 중 약 5 내지 약 500 ng/ml의 농도 (예컨대, 약 5 내지 약 50 ng/mL)로 존재하는 것인 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, ECM이 성장 인자 감소된 ECM인 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, ECM이 매트리겔인 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, ECM이 액체 세포 배양물 중 약 4% w/v 내지 약 10% w/v의 농도로 존재하는 것인 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 배양 배지가 로크(Rock) (Rho-키나제) 억제제를 추가로 포함하는 것인 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 배양 배지가 노치(Notch) 효능제를 추가로 포함하는 것인 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상피 줄기 세포 및/또는 상피 조직 단편이 위장 줄기 세포 및/또는 위장 조직 단편인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 위장 줄기 세포 및/또는 위장 조직 단편이 소장 줄기 세포 및/또는 소장 조직 단편인 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 방법에 의해 수득가능한 소낭선.
  20. 약물 발견 스크린, 독성 검정 또는 재생 의학에서의 제19항의 소낭선의 용도.
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KR20190040212A (ko) * 2016-08-24 2019-04-17 각고호우징 게이오기주크 인간 설사병 바이러스의 감염·증식 배양용 2d 오가노이드 및 그 사용

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