JP7367981B2 - 上皮オルガノイド培養方法及び上皮オルガノイド - Google Patents

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Description

本発明は、オルガノイド培養用細胞培養培地、培養方法、及びオルガノイドに関する。
本願は、２０１６年５月１８日に、日本に出願された特願２０１６－０９９９９５号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
腸管は人体の中でも最も外界と接する面積の広い臓器であり、消化吸収など生命の維持に欠かせない機能を有している。腸管機能の大部分はその内層を覆う腸管上皮により担われている。腸管上皮は３系統の分化細胞（粘液産生細胞、吸収上皮細胞、内分泌細胞）からなる絨毛と主に未分化増殖細胞からなる陰窩の２つのコンパートメントにより構成されている。小腸陰窩では抗菌ペプチドを産生するパネート（Ｐａｎｅｔｈ）細胞が陰窩底部に存在する。最近、分子遺伝学的な細胞系譜解析により、パネート細胞に挟まれたＬｇｒ５陽性細胞（「ＣＢＣ（Ｃｒｙｐｔ ｂａｓｅ ｃｏｌｕｍｎａｒ）細胞」とも呼ばれる。）が腸管上皮幹細胞であることが明らかとなった。Ｌｇｒ５陽性腸管上皮幹細胞は、一過性増殖細胞（Ｔｒａｎｓｉｔ ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ ｃｅｌｌｓ）と呼ばれる前駆細胞を生み出すが、これらの前駆細胞は永続的な自己複製能力はなく、また、分化能も１～３系統に制限される。一過性増殖細胞は陰窩内で２～４回の分裂とともに分化していき、絨毛では終末分化を遂げる。これらの分化細胞は絨毛の頂点で剥離し、アポトーシスにより死滅する。腸管上皮は新陳代謝の速い組織であり、陰窩の幹細胞から絨毛の頂点まで４～５日で移動する。Ｐａｎｅｔｈ細胞は他の分化細胞と異なり、分化とともに陰窩底部に移動し、２ヶ月と長い細胞寿命を有する。
腸管上皮幹細胞の自己複製機序はいくつかの遺伝子改変マウスの結果からＷｎｔ（ウィント）シグナルと骨形成タンパク質（Ｂｏｎｅ Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ；ＢＭＰ）シグナルによって制御されていることが知られている。Ｗｎｔシグナルの抑制分子であるＡＰＣ（Ａｄｅｎｏｍａｔｏｕｓ ｐｏｌｙｐｏｓｉｓ ｃｏｌｉ）の腸管上皮特異的ノックアウトマウスでは、腸管上皮細胞の過増殖と腺腫形成を示す。また、ＢＭＰの阻害タンパクであるノギン（Ｎｏｇｇｉｎ）を腸管上皮細胞に過剰発現させたマウスでは、異所性の陰窩形成が観察され、ＢＭＰシグナルは腸管上皮幹細胞に対して抑制的に働いていることが示唆された。実際、Ｗｎｔシグナルは陰窩底部に活性が高く、管腔側に低くなる勾配が認められる。一方、ＢＭＰシグナルはＷｎｔシグナルとは逆の勾配を示すことが知られている。
また、腸管上皮細胞の長期培養は長らく不可能であった。これは、腸管上皮幹細胞の維持に必要な増殖因子が不明であったためと考えられる。近年、腸管上皮幹細胞を、細胞外マトリクス上に接着し、ＢＭＰ阻害剤、分裂促進増殖因子及びＷｎｔアゴニストが添加された、動物又はヒト細胞用の基本培地を含む細胞培養培地の存在下で培養することにより、長期間の腸管上皮幹細胞維持に成功している（例えば、特許文献１を参照。）。
特許第５４５８１１２号公報
特許文献１に記載の培養方法で用いられる細胞培養培地のうち、上皮増殖因子（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ；ＥＧＦ）の刺激により、上皮成長因子受容体（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＥＧＦＲ）の発現が低下することが問題であった。これに対し、ｐ３８阻害剤を添加することにより、ＥＧＦＲの発現を維持することが可能であった。しかしながら、ｐ３８阻害剤を含む培地、培養方法では、分化抑制又は細胞死を引き起こすことがあり、一部のヒトの組織、腫瘍組織の培養が不可能であった。
本発明は、上記課題を解決するために、ヒトを含む哺乳動物由来の上皮幹細胞、上皮細胞、又は上皮腫瘍細胞、或いはそれら細胞のうち少なくともいずれか一方を含む組織、又は従来では培養することができなかった組織を、長期間培養することができるオルガノイド培養用細胞培養培地を提供する。
また、本発明は、無血清で作製可能なヒト培養オルガノイドを提供する。
また、本発明は、これまで不可能であった組織から作製されたヒト培養オルガノイドを提供する。
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、ＥＧＦ及びｐ３８阻害剤を実質的に含まずに、ヒトを含む哺乳動物由来の上皮幹細胞、上皮細胞、又は上皮腫瘍細胞、或いはそれら細胞のうち少なくともいずれか一方を含む組織、又は従来では培養することができなかった組織を、長期間培養することができるオルガノイド培養用細胞培養培地の組成を見出した。
また、本発明者らは、低酸素下で、ヒトを含む哺乳動物由来の上皮幹細胞、上皮細胞、又は上皮腫瘍細胞、或いはそれら細胞のうち少なくともいずれか一方を含む組織、又は従来では培養することができなかった組織を培養することで、オルガノイドを形成可能であることを見出した。
すなわち、本発明は以下の態様を含む。
本発明の第１態様に係るオルガノイド培養用細胞培養培地は、インスリン様成長因子１（Ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ１；ＩＧＦ１）、線維芽細胞増殖因子２（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ２；ＦＧＦ２）、及びエピレグリン（Ｅｐｉｒｅｇｕｌｉｎ；ＥＲＥＧ）からなる群から選ばれる少なくとも二種、及び下記ｉ）～ｉｉｉ）の成分のうち少なくとも一種を含む。
ｉ）Ｗｎｔアゴニスト
ｉｉ）骨形成因子（ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ；ＢＭＰ）阻害剤
ｉｉｉ）形質転換増殖因子－β（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－β；ＴＧＦ－β）阻害剤
上記第１態様に係るオルガノイド培養用細胞培養培地は、ＥＧＦ及びｐ３８阻害剤を実質的に含まなくていもよい。
上記第１態様に係るオルガノイド培養用細胞培養培地は、ＩＧＦ１及びＦＧＦ２を含んでもよい。
前記Ｗｎｔアゴニストが、Ｗｎｔタンパク質、Ｒ－スポンジン、及びＧＳＫ－３β阻害剤からなる群から選択される少なくとも一種であってもよい。
前記Ｗｎｔタンパク質がその安定化物質アファミンとの複合体を形成していてもよい。
前記Ｗｎｔアゴニストが、Ｗｎｔタンパク質及びＲ－スポンジンであってもよい。
前記Ｗｎｔタンパク質が、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ９ｂ、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１、及びＷｎｔ１６からなる群から選ばれる少なくとも一種である請求項４～６のいずれか一項に記載のオルガノイド培養用細胞培養培地。
前記Ｒ－スポンジンが、Ｒ－スポンジン１、Ｒ－スポンジン２、Ｒ－スポンジン３、及びＲ－スポンジン４からなる群から選ばれる少なくとも一種であってもよい。
前記ＢＭＰ阻害剤が、ノギン、グレムリン、コーディン、コーディンドメインを含むコーディン様タンパク質、フォリスタチン、フォリスタチンドメインを含むフォリスタチン関連タンパク質、ＤＡＮ、ＤＡＮシステインノットドメインを含むＤＡＮ様タンパク質、スクレロスチン／ＳＯＳＴ、及びα－２マクログロブリンからなる群から選ばれる少なくとも一種であってもよい。
前記ＢＭＰ阻害剤がノギンであってもよい。
前記ＴＧＦ－β阻害剤が、Ａ８３－０１、ＳＢ－４３１５４２、ＳＢ－５０５１２４、ＳＢ－５２５３３４、 ＳＤ－２０８、ＬＹ－３６４９４、及びＳＪＮ－２５１１からなる群から選ばれる少なくとも一種であってもよい。
前記ＴＧＦ－β阻害剤が、Ａ８３－０１であってもよい。
本発明の第２態様に係る培養方法は、上皮幹細胞、上皮細胞、上皮腫瘍細胞、又はそれら細胞のうち少なくともいずれか一方を含む組織の培養方法であって、細胞外マトリクスを調製する細胞外マトリクス調製工程と、前記細胞外マトリクス上に上皮幹細胞、上皮細胞、上皮腫瘍細胞、又はそれら細胞のうち少なくともいずれか一方を含む組織を接着させる接着工程と、前記接着工程後に、上記第１態様に係るオルガノイド培養用細胞培養培地を添加し、前記上皮幹細胞、前記上皮細胞、前記上皮腫瘍細胞、又は前記それら細胞のうち少なくともいずれか一方を含む組織を培養し、オルガノイドを形成させるオルガノイド形成工程と、を備える培養方法である。
前記オルガノイド形成工程において、酸素濃度１５％～０．１％である低酸素下で、前記上皮幹細胞、前記上皮細胞、前記上皮腫瘍細胞、又は前記それら細胞のうち少なくともいずれか一方を含む組織で培養し、オルガノイドを形成させてもよい。
本発明の第３態様に係る分化した細胞を含むオルガノイドは、上記第２態様に係る培養方法により、得られる。
上記第３態様に係る分化した細胞を含むオルガノイドは、再生医療用であってもよい。
本発明の第４態様に係る培養方法は、上皮幹細胞、上皮細胞、上皮腫瘍細胞、又はそれら細胞のうち少なくともいずれか一方を含む組織の培養方法であって、細胞外マトリクスを調製する細胞外マトリクス調製工程と、前記細胞外マトリクス上に上皮幹細胞、上皮細胞、上皮腫瘍細胞、又はそれら細胞のうち少なくともいずれか一方を含む組織を接着させる接着工程と、前記接着工程後に、オルガノイド培養用細胞培養培地を添加し、酸素濃度１５％～０．１％である低酸素下で前記上皮幹細胞、前記上皮細胞、前記上皮腫瘍細胞、又は前記それら細胞のうち少なくともいずれか一方を含む組織を培養し、オルガノイドを形成させるオルガノイド形成工程と、を備え、前記オルガノイド培養用細胞培養培地が、Ｗｎｔアゴニスト、分裂促進増殖因子、ＢＭＰ阻害剤、ＴＧＦ－β阻害剤、及びｐ３８阻害剤からなる群から選ばれる少なくとも一種を含む培養方法である。
前記Ｗｎｔアゴニストが、Ｗｎｔタンパク質、Ｒ－スポンジン、及びＧＳＫ－３β阻害剤からなる群から選択される少なくとも一種であってもよい。
前記Ｗｎｔタンパク質がその安定化物質アファミンとの複合体を形成していてもよい。
前記Ｗｎｔアゴニストが、Ｗｎｔタンパク質及びＲ－スポンジンであってもよい。
前記Ｗｎｔタンパク質が、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ９ｂ、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１、及びＷｎｔ１６からなる群から選ばれる少なくとも一種であってもよい。
前記Ｒ－スポンジンが、Ｒ－スポンジン１、Ｒ－スポンジン２、Ｒ－スポンジン３、及びＲ－スポンジン４からなる群から選ばれる少なくとも一種であってもよい。
前記ＢＭＰ阻害剤が、ノギン、グレムリン、コーディン、コーディンドメインを含むコーディン様タンパク質、フォリスタチン、フォリスタチンドメインを含むフォリスタチン関連タンパク質、ＤＡＮ、ＤＡＮシステインノットドメインを含むＤＡＮ様タンパク質、スクレロスチン／ＳＯＳＴ、及びα－２マクログロブリンからなる群から選ばれる少なくとも一種であってもよい。
前記ＢＭＰ阻害剤がノギンであってもよい。
前記ＴＧＦ－β阻害剤が、Ａ８３－０１、ＳＢ－４３１５４２、ＳＢ－５０５１２４、ＳＢ－５２５３３４、ＳＤ－２０８、ＬＹ－３６４９４、及びＳＪＮ－２５１１からなる群より選択される少なくとも一種であってもよい。
前記ＴＧＦ－β阻害剤が、Ａ８３－０１であってもよい。
本発明の第５態様に係る分化した細胞を含むオルガノイドは、上記第４態様に係る培養方法により、得られる。
上記第５態様に係る分化した細胞を含むオルガノイドは、再生医療用であってもよい。
上記態様のオルガノイド培養用細胞培養培地によれば、ヒトを含む哺乳動物由来の上皮幹細胞、上皮細胞、又は上皮腫瘍細胞、或いはそれら細胞のうち少なくともいずれか一方を含む組織、又は従来では培養することができなかった組織を長期間培養することができる。また、前記細胞及び前記組織のうち少なくともいずれか一方から高効率でオルガノイドを形成させることができる。
実施例１における各培地中の初代培養（Ｐａｓｓａｇｅ０）の培養開始から７日目のヒト上皮腫瘍細胞の培養オルガノイドを示す画像である。ここで、ＷはＷｎ－３Ａ、 Ｎはノギン、ＲはＲ－スポンジン１、ＡはＡ８３－０１である。 実施例１における各培地中の初代培養（Ｐａｓｓａｇｅ０）の培養開始から７日目のヒト上皮腫瘍細胞のオルガノイドがウェル中に占める面積を定量化したグラフである。略号は図１と同じ。 実施例２における各酸素濃度での初代培養（Ｐａｓｓａｇｅ０）の培養開始から７日目のヒト上皮腫瘍細胞の培養オルガノイドを示す画像である。 ５５種類の大腸腫瘍から樹立したオルガノイドの最適培養条件を示す図である。 実施例３における各培地中の初代培養（Ｐａｓｓａｇｅ０）の培養開始から７日目のヒト腸管幹細胞の培養オルガノイドを示す画像である。 実施例３における各培地中の初代培養（Ｐａｓｓａｇｅ０）の培養開始から７日目のヒト腸管幹細胞のオルガノイドがウェル中に占める面積を定量化したグラフである。 実施例４における各培地中の３回目の継代（Ｐａｓｓａｇｅ３）の培養開始から６日後（合計培養日数２６日後）、４回目の継代（Ｐａｓｓａｇｅ４）の培養開始からの６日後（合計培養日数３３日後）、及び６回目の継代（Ｐａｓｓａｇｅ６）の培養開始からの６日後（合計培養日数４７日後）のヒト上皮腫瘍細胞のオルガノイドを示す画像である。 本実施形態における異なる組成のオルガノイド培養用細胞培養培地でのオルガノイドの形成効率を評価した結果を示す表である。
＜＜オルガノイド培養用細胞培養培地＞＞
本発明の第１実施形態に係るオルガノイド培養用細胞培養培地は、ＩＧＦ１、ＦＧＦ２、及びＥＲＥＧからなる群から選ばれる少なくとも二種、及び下記ｉ）～ｉｉｉ）の成分のうち少なくとも一種を含む。
ｉ）Ｗｎｔアゴニスト
ｉｉ）ＢＭＰ阻害剤
ｉｉｉ）ＴＧＦ－β阻害剤
本実施形態のオルガノイド培養用細胞培養培地によれば、ＥＧＦ及びｐ３８阻害剤を実質的に含まず、ヒトを含む哺乳動物由来の上皮幹細胞、上皮細胞、又は上皮腫瘍細胞、或いはそれら細胞のうち少なくともいずれか一方を含む組織、又は従来では培養することができなかった組織を長期間培養することができる。
また、本実施形態のオルガノイド培養用細胞培養培地によれば、ヒトを含む哺乳動物由来の上皮幹細胞、上皮細胞、又は上皮腫瘍細胞、或いはそれら細胞のうち少なくともいずれか一方を含む組織、又は従来では培養することができなかった組織から高効率でオルガノイドを形成させることができる。
また、本実施形態のオルガノイド培養用細胞培養培地を用いて培養された上皮幹細胞は、長期間分化能を維持することができ、腫瘍発生頻度が極めて低い。
本明細書において、上皮細胞とは上皮組織から取得した分化した上皮細胞及び上皮幹細胞を含む。「上皮幹細胞」とは、長期間の自己複製機能と上皮分化細胞への分化能をもつ細胞を意味し、上皮組織に由来する幹細胞を意味する。上皮組織としては、例えば、角膜、口腔粘膜、皮膚、結膜、膀胱、尿細管、腎臓、消化器官（食道、胃、十二指腸、小腸（空腸及び回腸を含む）、大腸（結腸を含む））、肝臓、膵臓、乳腺、唾液腺、涙腺、前立腺、毛根、気管、肺等を挙げられる。本実施形態のオルガノイド培養用細胞培養培地は、中でも、消化器官（食道、胃、十二指腸、小腸（空腸及び回腸を含む）、大腸（結腸を含む））、肝臓、膵臓に由来する上皮細胞の培養に用いられることが好ましい。
また、本明細書において、「上皮腫瘍細胞」とは、上述の上皮組織由来の細胞が腫瘍化したものを意味する。
本明細書において、「オルガノイド」とは、細胞を制御した空間内に高密度に集積させることにより自己組織化した立体的な細胞組織体を意味する。
本明細書において、「実質的に含まない」とは、特定成分を全く含まない、若しくは特定成分が有する機能を発揮しない程度の濃度しか含まないことを意味する。
よって、「ＥＧＦ及びｐ３８阻害剤を実質的に含まない」とは、ＥＧＦ及びｐ３８阻害剤を全く含まない、又はＥＧＦによるＥＧＦＲの発現抑制、及びｐ３８阻害剤による分化抑制及び細胞死が起きない程度の濃度しか含まないことを意味する。
本実施形態のオルガノイド培養用細胞培養培地は、ＩＧＦ１、ＦＧＦ２、及びエピレグリンからなる群から選ばれる少なくとも一種を含み、前記３種類の因子のいずれを含有するかは培養する細胞又は組織の種類等に応じて適宜選択することができる。中でも、本実施形態のオルガノイド培養用細胞培養培地は、ＩＧＦ１及びエピレグリン、ＦＧＦ２及びエピレグリン、ＩＧＦ１及びＦＧＦ２を含むことが好ましく、ＩＧＦ１及びＦＧＦ２を含むことがより好ましい。上記因子を含むことにより、ＥＧＦ及びｐ３８阻害剤を実質的に含まずとも、ヒトを含む哺乳動物由来の上皮幹細胞、上皮細胞、又は上皮腫瘍細胞、或いはそれら細胞のうち少なくともいずれか一方を含む組織、又は従来では培養することができなかった組織を長期間培養することができる。また、ヒトを含む哺乳動物由来の上皮幹細胞、上皮細胞、又は上皮腫瘍細胞、或いはそれら細胞のうち少なくともいずれか一方を含む組織、又は従来では培養することができなかった組織から高効率でオルガノイドを形成させることができる。
本実施形態のオルガノイド培養用細胞培養培地の構成成分について、以下に詳細を説明する。
＜細胞培養基本培地＞
本実施形態のオルガノイド培養用細胞培養培地には、あらゆる無血清の細胞培養基本培地が含まれる。本実施形態のオルガノイド培養用細胞培養培地は、動物細胞用又はヒト細胞用であることが好ましい。
係る無血清の細胞培養基本培地としては、例えば、炭酸系の緩衝液でｐＨ７．２以上ｐＨ７．６以下に緩衝化されている規定の合成培地等が挙げられる。より具体的には、グルタミン、インスリン、Ｂ２７ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ(Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ)、Ｎ－Ａｃｅｔｙｌ－Ｌ－ｃｙｓｔｅｉｎ(和光純薬)、ペニシリン又はストレプトマイシン、及びトランスフェリンが補充されたアドバンスト－ダルベッコ改変イーグル培地／ハムＦ－１２混合培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ－１２；ＤＭＥＭ／Ｆ１２）が挙げられる。
また、アドバンスト－ダルベッコ改変イーグル培地／ハムＦ－１２混合培地に替えてＲＰＭＩ１６４０培地（Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ １６４０ ｍｅｄｉｕｍ）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、並びに、アドバンストＲＰＭＩ培地等も挙げられる。
上記本実施形態のオルガノイド培養用細胞培養培地は、ウシ胎仔血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）又はｆｅｔａｌ ｃａｌｆ ｓｅｒｕｍ）等の不確定な成分を実質的に含まない。
また、上記オルガノイド培養用細胞培養培地に５％血清を含んでもよい。
＜Ｗｎｔアゴニスト＞
本明細書において、「Ｗｎｔアゴニスト」とは、細胞内でＴ－ｃｅｌｌ ｆａｃｔｏｒ（以下、ＴＣＦともいう。）／ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｅｎｈａｎｃｅｒ ｆａｃｔｏｒ（以下、ＬＥＦともいう。）介在性の転写を活性化する薬剤を意味する。よって、Ｗｎｔアゴニストは、Ｗｎｔファミリータンパク質に限定されず、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体ファミリーメンバーに結合して活性化するＷｎｔアゴニスト、細胞内β－カテニン分解の阻害剤、及びＴＣＦ／ＬＥＦの活性化物質を包含する。Ｗｎｔアゴニストは、Ｗｎｔタンパク質、Ｒ－スポンジン、及びＧＳＫ－３β阻害剤からなる群から選択される少なくとも一種であることが好ましい。
Ｗｎｔアゴニストは、該Ｗｎｔアゴニストの非存在下でのＷｎｔ活性のレベルと比較して、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、さらに好ましくは少なくとも５０％、特に好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは１００％、細胞においてＷｎｔ活性を刺激する。Ｗｎｔ活性は、当業者にとって公知の方法を用いて、例えばｐＴＯＰＦＬＡＳＨ及びｐＦＯＰＦＬＡＳＨ Ｔｃｆルシフェラーゼレポーターコンストラクトによって、Ｗｎｔの転写活性を測定することにより調べることができる（参考文献：Ｋｏｒｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ.，１９９７.Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７５：１７８４－１７８７）。
上皮幹細胞、上皮細胞、上皮腫瘍細胞、又はそれら細胞のうち少なくともいずれか一方を含む組織の培養においては、Ｗｎｔアゴニストが含まれることが好ましい。本実施形態のオルガノイド培養用細胞培養培地に含まれるＷｎｔアゴニストとしては、Ｗｎｔタンパク質とアファミンとの複合体が含まれることがより好ましく、Ｗｎｔタンパク質とアファミンとの複合体及びＲ－スポンジン（Ｒ－ｓｐｏｎｄｉｎ）の両方が含まれることが更に好ましい。本実施形態のオルガノイド培養用細胞培養培地において、Ｗｎｔタンパク質とアファミンとの複合体及びＲ－スポンジンを含むことで、上皮幹細胞又は上皮細胞は、オルガノイドをより高効率で形成することができる。
［Ｗｎｔタンパク質］
Ｗｎｔアゴニストの一種であるＷｎｔタンパク質としては、由来は特に限定されず、各種生物由来のＷｎｔタンパク質を用いることができる。中でも、哺乳動物由来のＷｎｔタンパク質であることが好ましい。哺乳動物としては、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ、ウサギ等が挙げられる。哺乳動物のＷｎｔタンパク質としては、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ９ｂ、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１、Ｗｎｔ１６等が挙げられる。本実施形態のオルガノイド培養用細胞培養培地において、Ｗｎｔタンパク質は複数種を組み合わせて用いてもよい。
Ｗｎｔタンパク質を製造する方法としては、例えば、Ｗｎｔタンパク質発現細胞を用いて製造する方法等が挙げられる。Ｗｎｔタンパク質発現細胞において、細胞の由来（生物種、培養形態等）は特に限定されず、Ｗｎｔタンパク質を安定発現する細胞であればよく、Ｗｎｔタンパク質を一過性に発現する細胞でもよい。Ｗｎｔタンパク質発現細胞としては、例えば、マウスＷｎｔ３ａを安定発現するＬ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－２６４７）、マウスＷｎｔ５ａを安定発現するＬ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－２８１４）等が挙げられる。また、Ｗｎｔタンパク質発現細胞は、公知の遺伝子組換え技術を用いて作製することができる。すなわち、所望のＷｎｔタンパク質をコードするＤＮＡを公知の発現ベクターに挿入し、得られた発現ベクターを適切な宿主細胞に導入することにより、Ｗｎｔタンパク質発現細胞を作製することができる。所望のＷｎｔタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ等の公知のデータベースから取得することができる。
Ｗｎｔタンパク質発現細胞により発現されるＷｎｔタンパク質は、Ｗｎｔ活性を有する限り、Ｗｎｔタンパク質のフラグメントでもよく、Ｗｎｔタンパク質のアミノ酸配列以外のアミノ酸配列を含むものでもよい。Ｗｎｔタンパク質のアミノ酸配列以外のアミノ酸配列について、特に限定はなく、例えばアフィニティータグのアミノ酸配列等が挙げられる。また、Ｗｎｔタンパク質のアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ等の公知のデータベースから取得できるアミノ酸配列と完全に一致している必要はなく、Ｗｎｔ活性を有する限り、公知のデータベースから取得できるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列であってもよい。
ＧｅｎＢａｎｋ等の公知のデータベースから取得できるＷｎｔタンパク質のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、例えば、公知のデータベースから取得できるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列等が挙げられる。
「１～数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」とは、例えば、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異ペプチド作製法等により、欠失、置換若しくは付加できる程度の数（１０個以下が好ましく、７個以下がより好ましく、６個以下がさらに好ましい。）のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されていることを意味する。
また、実質的に同一のアミノ酸配列としては、例えば、公知のデータベースから取得できるアミノ酸配列との同一性が、少なくとも８０％以上であり、好ましくは少なくとも８５％以上、より好ましくは少なくとも９０％以上、さらに好ましくは少なくとも９２％以上、特に好ましくは少なくとも９５％以上、最も好ましくは少なくとも９９％以上であるアミノ酸配列等が挙げられる。
Ｗｎｔタンパク質の活性は、例えば、ＴＣＦレポーターアッセイにより確認することができる。一般的に、ＴＣＦレポーターアッセイとは、Ｗｎｔシグナルが細胞に入ると特異的に活性化される転写因子であるＴ－ｃｅｌｌ ｆａｃｔｏｒ（ＴＣＦ）の結合配列を持つルシフェラーゼ遺伝子を導入し、Ｗｎｔタンパク質の活性の強さをルシフェラーゼの発光によって、簡便に評価する方法である（参考文献：Ｍｏｌｅｎａａｒ ｅｔ ａｌ., Ｃｅｌｌ, ８６, ３９１, １９９６.）。ＴＣＦレポーターアッセイ以外の方法としては、Ｗｎｔシグナルが入ると細胞内のβカテニンが安定化することを利用して、βカテニンの量をウエスタンブロッティグによって定量評価する方法（参考文献：Ｓｈｉｂａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ., Ｇｅｎｅ ｔｏ ｃｅｌｌｓ, ３, ６５９, １９９８.）等が挙げられる。また、Ｗｎｔ５ａ等のように、ｎｏｎ－ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｐａｔｈｗａｙを介して細胞にシグナルを与えるＷｎｔタンパク質については、細胞内アダプタータンパク質であるＤｖｌ２のリン酸化を評価することでＷｎｔタンパク質の活性を評価する方法（参考文献：Ｋｉｋｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ., ＥＭＢＯ Ｊ., ２９, ３４７０, ２０１０.）等を用いることができる。
［Ｒ－スポンジン（Ｒ－ｓｐｏｎｄｉｎ）］
Ｗｎｔアゴニストの一種であるＲ－スポンジンとしては、Ｒ－スポンジン１、Ｒ－スポンジン２、Ｒ－スポンジン３、及びＲ－スポンジン４からなるＲ－スポンジンファミリーが挙げられる。Ｒ－スポンジンファミリーは、分泌タンパク質であり、Ｗｎｔシグナル伝達経路の活性化及び制御に関わることが知られている。本実施形態のオルガノイド培養用細胞培養培地において、Ｒ－スポンジンを複数種組み合わせて用いてもよい。
Ｒ－スポンジン活性を有する限り、Ｒ－スポンジンのフラグメントでもよく、Ｒ－スポンジンのアミノ酸配列以外のアミノ酸配列を含むものでもよい。
［含有量］
本実施形態のオルガノイド培養用細胞培養培地に含まれるＷｎｔタンパク質の濃度は、５０ｎｇ／ｍＬ以上であることが好ましく、１００ｎｇ／ｍＬ以上１０μｇ／ｍＬ以下であることがより好ましく、２００ｎｇ／ｍＬ以上１μｇ／ｍＬ以下であることがさらに好ましく、３００ｎｇ／ｍＬ以上１μｇ／ｍＬ以下であることが特に好ましい。上皮幹細胞の培養中、好ましくは２日ごとにＷｎｔアゴニストを培養培地に添加し、好ましくは４日ごとにオルガノイド培養用細胞培養培地を新鮮なものに交換する。
［ＧＳＫ－３β阻害剤］
公知のＧＳＫ－３β阻害剤は、ＣＨＩＲ－９９０２１、 ＣＨＩＲ－９８０１４（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ） リチウム(Ｓｉｇｍａ)、ケンパウロン(Ｂｉｏｍｏｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ, Ｌｅｏｓｔ, Ｍ． ｅｔ ａｌ．（２０００） Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２６７, ５９８３－５９９４)、６－ブロモインジルビン－３０－アセトキシム(Ｍｅｙｅｒ, Ｌ ｅｔ ａｌ ．(２００３) Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． １０, １２５５－１２６６)、ＳＢ ２１６７６３およびＳＢ ４１５２８６（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、並びにＧＳＫ－３とａｘｉｎとの相互作用を阻止するＦＲＡＴファミリーメンバー及びＦＲＡＴ由来ペプチドを含む。概説は、参照により本明細書に組み入れられる、Ｍｅｉｊｅｒ ｅｔ ａｌ ．（２００４） Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２５, ４７１－４８０に示されている。ＧＳＫ－３β阻害のレベルを決定するための方法およびアッセイは当業者に公知であり、例えば、Ｌｉａｏ ｅｔ ａｌ．（２００４）,Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ, １４５（６） ２９４１－２９４９に記載の方法およびアッセイを含む。
＜アファミン＞
本明細書において、「アファミン」とは、アルブミンファミリーに属する糖タンパク質を意味し、血液又は体液中に存在することが知られている。細胞培養に用いる培地に通常添加される血清には、当該血清を採取した動物由来のアファミンが含まれている。血清中にはアファミン以外の不純物等を含むため、本実施形態のオルガノイド培養用細胞培養培地においては、血清を用いずに、アファミンを単独で使用することが好ましい。
本実施形態のオルガノイド培養用細胞培養培地に含まれるアファミンは、由来は特に限定されず、各種生物由来のアファミンを用いることができる。中でも、哺乳動物由来のアファミンであることが好ましい。哺乳動物としては、例えば、上述の［Ｗｎｔタンパク質］と同様のものが挙げられる。主な哺乳動物のアファミンのアミノ酸配列及びこれをコードする遺伝子の塩基配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ等の公知のデータベースから取得することができる。例えば、ＧｅｎＢａｎｋにおいて、ヒトアファミンのアミノ酸配列はＡＡＡ２１６１２、これをコードする遺伝子の塩基配列はＬ３２１４０のアクセッション番号で登録されており、ウシアファミンのアミノ酸配列はＤＡＡ２８５６９、これをコードする遺伝子の塩基配列はＧＪ０６０９６８のアクセッション番号で登録されている。
本実施形態のオルガノイド培養用細胞培養培地に含まれるアファミンは、血清等に含まれる天然のアファミンを公知の方法で精製したものでもよく、組換えアファミンであってもよい。組換えアファミンは、公知の遺伝子組換え技術を適宜用いることにより製造することができる。組換えアファミンの製造方法としては、例えば、アファミンをコードするＤＮＡを公知の発現ベクターに挿入し、得られた発現ベクターを適切な宿主細胞に導入して組換えアファミンを発現させ、公知の精製方法を用いて精製することにより製造することができる。組換えアファミンは、アフィニティータグを付加したアファミンであってもよい。付加するアフィニティータグは特に限定されず、公知のアフィニティータグから適宜選択して用いることができる。アフィニティータグとしては、特異的抗体により認識されるアフィニティータグであることが好ましく、例えば、ＦＬＡＧタブ、ＭＹＣタグ、ＨＡタグ、Ｖ５タグ等が挙げられる。
上述のＷｎｔタンパク質は、特定のセリン残基が脂肪酸（パルミトレイン酸）で修飾されているため、強い疎水性を有する。そのため、Ｗｎｔタンパク質は、水溶液中では凝集又は変性しやすいため、精製及び保存が非常に難しいことが広く知られている。
一方、この特定のセリン残基の脂肪酸による修飾は、Ｗｎｔタンパク質の生理活性に必須であり、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体ファミリーメンバーとの結合に関与することが報告されている。
また、水溶液中において、Ｗｎｔタンパク質がアファミンと１対１で結合し複合体を形成し、高い生理活性を保ちながら、可溶化する知見もある（Ａｃｔｉｖｅ ａｎｄ ｗａｔｅｒ－ｓｏｌｕｂｌｅ ｆｏｒｍ ｏｆ ｌｉｐｉｄａｔｅｄ Ｗｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｓ ｍａｉｎｔａｉｎｅｄ ｂｙ Ａ ｓｅｒｕｍ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ａｆａｍｉｎ/α－ａｌｂｕｍｉｎ. Ｍｉｈａｒａ Ｅ, Ｈｉｒａｉ Ｈ, Ｙａｍａｍｏｔｏ Ｈ, Ｔａｍｕｒａ－Ｋａｗａｋａｍｉ Ｋ, Ｍａｔａｎｏ Ｍ, Ｋｉｋｕｃｈｉ Ａ, Ｓａｔｏ Ｔ, Ｔａｋａｇｉ Ｊ. Ｅｌｉｆｅ. ２０１６ Ｆｅｂ ２３；５.）。
係る知見に基づき、Ｗｎｔタンパク質及びアファミンの両方を発現する細胞を培養する方法により、Ｗｎｔタンパク質－アファミン複合体を製造してもよく、Ｗｎｔタンパク質発現細胞とアファミン発現細胞を共培養する方法により、Ｗｎｔタンパク質－アファミン複合体を製造してもよい。Ｗｎｔタンパク質－アファミン複合体中のＷｎｔタンパク質の活性は、上述の［Ｗｎｔタンパク質］と同様の方法を用いて、評価することができる。
本実施形態のオルガノイド培養用細胞培養培地に含まれるアファミンの濃度は、特に限定されないが、５０ｎｇ／ｍＬ以上１０μｇ／ｍＬ以下であることが好ましく、１００ｎｇ／ｍＬ以上１μｇ／ｍＬ以下であることがより好ましく、３００μｇ／ｍＬ以上１μｇ／ｍＬ以下であることがさらに好ましい。
＜インスリン様成長因子１（Ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ１；ＩＧＦ１）＞
一般的に、「インスリン様成長因子１（Ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ１；ＩＧＦ１）」は、別名ソマトメジンＣとも呼ばれ、主に、肝臓で成長ホルモン（ＧＨ）による刺激により分泌される因子である。人体の殆どの細胞（特に、筋肉、骨、肝臓、腎臓、神経、皮膚及び肺等の細胞）は、ＩＧＦ１の影響を受けることが知られている。ＩＧＦ１は、インスリン様効果に加え、細胞成長（特に、神経細胞）及び発達、並びに、細胞ＤＮＡ合成を調節する機能を有する。
本実施形態のオルガノイド培養用細胞培養培地に含まれるＩＧＦ１の濃度は、特に限定されないが、５ｎｇ／ｍＬ以上１μｇ／ｍＬ以下であることが好ましく、１０ｎｇ／ｍＬ以上１μｇ／ｍＬ以下であることがより好ましく、５０ｎｇ／ｍＬ以上５００ｎｇ／ｍＬ以下であることがさらに好ましい。
本実施形態のオルガノイド培養用細胞培養培地に含まれるＩＧＦ１の濃度が上記範囲であることにより、実質的にＥＧＦ及びｐ３８阻害剤を含まずとも、ヒトを含む哺乳動物由来の上皮幹細胞、上皮細胞、又は上皮腫瘍細胞、或いはそれら細胞のうち少なくともいずれか一方を含む組織、又は従来では培養することができなかった組織を長期間培養することができる。
また、ヒトを含む哺乳動物由来の上皮幹細胞、上皮細胞、又は上皮腫瘍細胞、或いはそれら細胞のうち少なくともいずれか一方を含む組織、又は従来では培養することができなかった組織から高効率でオルガノイドを形成させることができる。
また、幹細胞の培養中、２日ごとにＩＧＦ１を培養培地に添加することが好ましく、４日ごとに培養培地を新鮮なものに交換することが好ましい。
＜線維芽細胞増殖因子２（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ２；ＦＧＦ２）＞
一般的に、「線維芽細胞増殖因子２（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ２；ＦＧＦ２）とは、塩基性の線維芽細胞増殖因子であって、線維芽細胞増殖因子受容体（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＦＧＦＲ）と結合し、血管内皮細胞の増殖促進と筒状構造への組織化、すなわち血管新生を促進する機能を有する。また、ヒトＦＧＦ２は低分子量型（ＬＷＬ）と高分子量型（ＨＷＬ）の２つのアイソフォームを持つことが知られている。ＬＷＬは主に細胞質に存在し、自己分泌（オートクリン）で作用し、一方、ＨＷＬは核内にあり、細胞内で作用するイントラクリン機構で活性を示す。
本実施形態のオルガノイド培養用細胞培養培地に含まれるＦＧＦ２の濃度は、特に限定されないが、５ｎｇ／ｍＬ以上１μｇ／ｍＬ以下であることが好ましく、１０ｎｇ／ｍＬ以上１μｇ／ｍＬ以下であることがより好ましく、５０ｎｇ／ｍＬ以上５００ｎｇ／ｍＬ以下であることがさらに好ましい。
本実施形態のオルガノイド培養用細胞培養培地に含まれるＦＧＦ２の濃度が上記範囲であることにより、実質的にＥＧＦ及びｐ３８阻害剤を含まずとも、ヒトを含む哺乳動物由来の上皮幹細胞、上皮細胞、又は上皮腫瘍細胞、或いはそれら細胞のうち少なくともいずれか一方を含む組織、又は従来では培養することができなかった組織を長期間培養することができる。
また、ヒトを含む哺乳動物由来の上皮幹細胞、上皮細胞、又は上皮腫瘍細胞、或いはそれら細胞のうち少なくともいずれか一方を含む組織、又は従来では培養することができなかった組織から高効率でオルガノイドを形成させることができる。
また、幹細胞の培養中、２日ごとにＦＧＦ２を培養培地に添加することが好ましく、４日ごとに培養培地を新鮮なものに交換することが好ましい。
＜エピレグリン（Ｅｐｉｒｅｇｕｌｉｎ；ＥＲＥＧ）＞
一般的に、「エピレグリン（Ｅｐｉｒｅｇｕｌｉｎ；ＥＲＥＧ）とは、チロシンキナーゼ（ＥｒｂＢ）ファミリー受容体（ＥｒｂＢ１～４）のうち、ＥｒｂＢ１及びＥｒｂＢ４に特異的に結合するＥＧＦ様成長因子である。ケラチン生成細胞、肝細胞、繊維芽細胞、及び血管内皮細胞の増殖を刺激することが知られている。また、ＥＲＥＧは、主に膀胱、肺、腎臓、大腸等のガン腫瘍、胎盤、及び末梢血白血球において発現している。
本実施形態のオルガノイド培養用細胞培養培地に含まれるＥＲＥＧの濃度は、特に限定されないが、５ｎｇ／ｍＬ以上１μｇ／ｍＬ以下であることが好ましく、１０ｎｇ／ｍＬ以上１μｇ／ｍＬ以下であることがより好ましく、５０ｎｇ／ｍＬ以上５００ｎｇ／ｍＬ以下であることがさらに好ましい。
本実施形態のオルガノイド培養用細胞培養培地に含まれるＥＲＥＧの濃度が上記範囲であることにより、ＥＧＦ及びｐ３８阻害剤を実質的に含まずとも、ヒトを含む哺乳動物由来の上皮幹細胞、上皮細胞、又は上皮腫瘍細胞、或いはそれら細胞のうち少なくともいずれか一方を含む組織、又は従来では培養することができなかった組織を長期間培養することができる。
また、ヒトを含む哺乳動物由来の上皮幹細胞、上皮細胞、又は上皮腫瘍細胞、或いはそれら細胞のうち少なくともいずれか一方を含む組織、又は従来では培養することができなかった組織から高効率でオルガノイドを形成させることができる。
また、幹細胞の培養中、２日ごとにＥＲＥＧを培養培地に添加することが好ましく、４日ごとに培養培地を新鮮なものに交換することが好ましい。
＜ＢＭＰ阻害剤＞
骨形成因子（ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ；ＢＭＰ）は、二量体リガンドとして二種類の異なる受容体セリン／スレオニンキナーゼ、Ｉ型及びＩＩ型受容体からなる受容体複合体に結合する。ＩＩ型受容体はＩ型受容体をリン酸化し、その結果、この受容体キナーゼが活性化される。このＩ型受容体は、続いて特異的な受容体基質（ＳＭＡＤ）をリン酸化し、その結果、シグナル伝達経路によって転写活性が導かれる。一般的に、ＢＭＰ阻害剤は、例えば、ＢＭＰ受容体へのＢＭＰ分子の結合を阻止又は阻害するものであって、ＢＭＰ活性を中和する複合体を形成するためにＢＭＰ分子に結合する薬剤である。また、ＢＭＰ阻害剤は、例えば、ＢＭＰ受容体と結合し、ＢＭＰ分子の受容体への結合を阻止又は阻害するものであって、アンタゴニスト又は逆アゴニストとして作用する薬剤である。
ＢＭＰ阻害剤は、この阻害剤の非存在下でのＢＭＰ活性レベルと比較して、好ましくは５０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、特に好ましくは、９０％以上の阻害活性を有する。ＢＭＰ阻害活性は、当業者にとって公知の方法（参考文献：Ｚｉｌｂｅｒｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ., ＢＭＣ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ, ８：４１, ２００７.）を用いて、ＢＭＰの転写活性を測定することによって、評価することができる。
本実施形態のオルガノイド培養用細胞培養培地に含まれるＢＭＰ阻害剤としては、天然のＢＭＰ結合タンパク質であることが好ましく、例えば、ノギン（Ｎｏｇｇｉｎ）、グレムリン、コーディン（Ｃｈｏｒｄｉｎ）、コーディンドメイン等のコーディン様タンパク質；ホリスタチン（Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ）、ホリスタチンドメイン等のホリスタチン関連タンパク質；ＤＡＮ、ＤＡＮシステイン－ノットドメイン等のＤＡＮ様タンパク質；スクレロスチン／ＳＯＳＴ、デコリン、α－２マクログロブリン等が挙げられる。
本実施形態のオルガノイド培養用細胞培養培地に含まれるＢＭＰ阻害剤としては、中でも、コーディン様タンパク質又はＤＡＮ様タンパク質が好ましく、コーディン様タンパク質がより好ましい。コーディン様タンパク質としては、ノギンが好ましい。コーディン様タンパク質やＤＡＮ様タンパク質は拡散性タンパク質であり、様々な親和度でＢＭＰ分子に結合し、シグナル伝達受容体へのＢＭＰ分子の接近を阻害することができる。上皮幹細胞を培養する場合において、これらのＢＭＰ阻害剤をオルガノイド培養用細胞培養培地に添加することにより、幹細胞の喪失を妨げることができる。
本実施形態のオルガノイド培養用細胞培養培地に含まれるＢＭＰ阻害剤の濃度は、１０ｎｇ／ｍＬ以上１００ｎｇ／ｍＬ以下であることが好ましく、２０ｎｇ／ｍＬ以上１００ｎｇ／ｍＬ以下であることがより好ましく、５０ｎｇ／ｍＬ以上１００ｎｇ／ｍＬ以下であることがさらに好ましい。幹細胞の培養中、２日ごとにＢＭＰ阻害剤を培養培地に添加することが好ましく、４日ごとに培養培地を新鮮なものに交換することが好ましい。
＜ＴＧＦ－β阻害剤＞
形質転換増殖因子－β（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－β；ＴＧＦ－β）は、増殖因子の一種であり、腎臓、骨髄、血小板等ほぼすべての細胞で産生される。ＴＧＦ－βには、５種類のサブタイプ（β１～β５）が存在する。また、ＴＧＦ－βは、骨芽細胞の増殖、並びに、コラーゲンのような結合組織の合成及び増殖を促進し、上皮細胞の増殖や破骨細胞に対しては抑制的に作用することが知られている。一般的に、ＴＧＦ－β阻害剤は、例えば、ＴＧＦ－β受容体へのＴＧＦ－βの結合を阻止又は阻害するものであって、ＴＧＦ－β活性を中和する複合体を形成するためにＴＧＦ－βに結合する薬剤である。また、ＴＧＦ－β阻害剤は、例えば、ＴＧＦ－β受容体と結合し、ＴＧＦ－βの受容体への結合を阻止又は阻害するものであって、アンタゴニスト又は逆アゴニストとして作用する薬剤である。
ＴＧＦ－β阻害剤は、この阻害剤の非存在下でのＴＧＦ－β活性レベルと比較して、好ましくは５０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、特に好ましくは、９０％以上の阻害活性を有する。ＴＧＦ－β阻害活性は、当業者にとって公知の方法で評価することができる。係る評価系としては、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を動かすヒトＰＡＩ－１プロモーター又はＳｍａｄ結合部位を含むレポーター構築物を用いて細胞が安定にトランスフェクトされている細胞アッセイが挙げられる（参考文献：Ｄｅ Ｇｏｕｖｉｌｌｅ ｅｔ ａｌ., Ｂｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ, １４５（２）:１６６－１７７, ２００５.）。
本実施形態のオルガノイド培養用細胞培養培地に含まれるＴＧＦ－β阻害剤としては、例えば、Ａ８３－０１（３－（６－メチルピリジン－２－イル）－１－フェニルチオカルバモイル－４－キノリン－４－イルピラゾール）、ＡＬＫ５ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｉ（３－（ピリジン－２－イル）－４－（４－キノニル）－１Ｈ－ピラゾール）、ＬＤＮ１９３１８９（４－（６－（４－（ピペラジン－１－イル）フェニル）ピラゾロ［１，５－ａ］ピリミジン－３－イル）キノリン）、ＳＢ４３１５４２（４－［４－（１，３－ベンゾジオキソール－５－イル）－５－ピリジン‐２‐イル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル］ベンズアミド）、ＳＢ－５０５１２４（２－（５－ベンゾ［１，３］ジオキソール－５－イル－２－ｔｅｒｔ－ブチル－３Ｈ－イミダゾール－４－イル）－６－メチルピリジン塩酸塩水和物）、ＳＤ－２０８（２－（５－クロロ－２－フルオロフェニル）プテリジン－４－イル）ピリジン－４－イル－アミン）、ＳＢ－５２５３３４（６－［２－（１，１－ジメチルエチル）－５－（６－メチル－２－ピリジニル）－１Ｈ－イミダゾール－４－イル］キノキサリン）、ＬＹ－３６４９４７（４－［３－（２－ピリジニル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－キノリン）、ＬＹ２１５７２９９（４－［２－（６－メチル－ピリジン－２－イル）－５，６－ジヒドロ－４Ｈ－ピロロ［１，２－ｂ］ピラゾール－３－イル］－キノリン－６－カルボン酸アミド）、ＴＧＦ－β ＲＩ Ｋｉｎａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＩＩ ６１６４５２（２－（３－（６－メチルピリジン－２－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）－１，５－ナフチリジン）、ＴＧＦ－β ＲＩ Ｋｉｎａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＩＩＩ ６１６４５３（２－（５－ベンゾ［１，３］ジオキソール－４－イル－２－ｔｅｒｔ－ブチル－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）－６－メチルピリジン， ＨＣｌ）、ＴＧＦ－β ＲＩ Ｋｉｎａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＩＸ ６１６４６３（４－（（４－（（２，６－ジメチルピリジン－３－イル）オキシ）ピリジン－２－イル）アミノ）ベンゼンスルホンアミド）、ＴＧＦ－β ＲＩ Ｋｉｎａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＶＩＩ ６１６４５８（１－（２－（（６，７－ジメトキシ－４－キノリル）オキシ）－（４，５－ジメチルフェニル）－１－エタノン）、ＴＧＦ－β ＲＩ Ｋｉｎａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＶＩＩＩ ６１６４５９（６－（２－ｔｅｒｔ－ブチル－５－（６－メチル－ピリジン－２－イル）－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）－キノキサリン）、ＡＰ１２００９（ＴＧＦ－β２アンチセンス化合物“Ｔｒａｂｅｄｅｒｓｅｎ”）、Ｂｅｌａｇｅｎｐｕｍａｔｕｃｅｌ－Ｌ（ＴＧＦ－β２アンチセンス遺伝子修飾同種異系腫瘍細胞ワクチン）、ＣＡＴ－１５２（Ｇｌａｕｃｏｍａ－ｌｅｒｄｅｌｉｍｕｍａｂ（抗－ＴＧＦ－β－２モノクローナル抗体））、ＣＡＴ－１９２（Ｍｅｔｅｌｉｍｕｍａｂ（ＴＧＦβ１を中和するヒトＩｇＧ４モノクローナル抗体）、ＧＣ－１００８（抗-ＴＧＦ－βモノクローナル抗体）等が挙げられる。本実施形態のオルガノイド培養用細胞培養培地に含まれるＴＧＦ－β阻害剤としては、中でも、Ａ８３－０１が好ましい。
本実施形態のオルガノイド培養用細胞培養培地に含まれるＴＧＦ－β阻害剤の濃度は、１００ｎＭ以上１０μＭ以下であることが好ましく、５００ｎＭ以上５μＭ以下であることがより好ましく、５００ｎＭ以上２μＭ以下であることがさらに好ましい。幹細胞の培養中、２日ごとにＴＧＦ－β阻害剤を培養培地に添加することが好ましく、４日ごとに培養培地を新鮮なものに交換することが好ましい。
＜その他成分＞
本実施形態のオルガノイド培養用細胞培養培地は、さらに、Ｒｏｃｋ（Ｒｈｏ－キナーゼ）阻害剤を含んでいてもよい。Ｒｏｃｋ阻害剤としては、例えば、Ｙ－２７６３２（（Ｒ）－（＋）－トランス－４－（１－アミノエチル）－Ｎ－（４－ピリジル）シクロヘキサンカルボキサミド二塩酸塩一水和物）、ファスジル（ＨＡ１０７７）（５－（１，４－ジアゼパン－１－イルスルホニル）イソキノリン）、Ｈ－１１５２（（Ｓ）－（＋）－２－メチル－１－［（４－メチル－５－イソキノリニル）スルホニル］－ヘキサヒドロ－１Ｈ－１，４－ジアゼピン二塩酸塩）等が挙げられる。Ｒｏｃｋ阻害剤として、Ｙ－２７６３２を用いる場合は、単細胞に分散された幹細胞の培養の最初の２日間に添加することが好ましい。本実施形態のオルガノイド培養用細胞培養培地に含まれるＹ－２７６３２は、１０μＭであることが好ましい。
本実施形態のオルガノイド培養用細胞培養培地は、さらに、ガストリン（又はＬｅｕ１５－ガストリン等の適切な代替物）が添加される。本実施形態のオルガノイド培養用細胞培養培地に含まれるガストリン（又は適切な代替物）濃度は、例えば１ｎｇ／ｍＬ以上１０μｇ／ｍＬであってよく、例えば１ｎｇ／ｍＬ以上１μｇ／ｍＬ以下であってよく、例えば５ｎｇ／ｍＬ以上１００ｎｇ／ｍＬ以下であってよい。
本実施形態のオルガノイド培養用細胞培養培地は、さらに、少なくとも１種のアミノ酸を含んでもよい。本実施形態のオルガノイド培養用細胞培養培地に含まれるアミノ酸としては、例えば、Ｌ－アラニン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－システイン、Ｌ－シスチン、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－グルタミン、Ｌ－グリシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－リジン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン、Ｌ－バリン、及びその組み合わせ等が挙げられる。一般的に、細胞培養培地に含まれるＬ－グルタミンの濃度は０．０５ｇ／Ｌ以上１ｇ／Ｌ以下（通常、０．１ｇ／Ｌ以上０．７５ｇ／Ｌ以下)である。また、細胞培養培地に含まれるその他のアミノ酸は、０．００１ｇ／Ｌ以上１ｇ／Ｌ(通常、０．０１ｇ／Ｌ以上０．１５ｇ／Ｌ以下)である。アミノ酸は合成由来でもよい。
本実施形態のオルガノイド培養用細胞培養培地は、さらに、少なくとも１種のビタミンを含んでいてもよい。本実施形態のオルガノイド培養用細胞培養培地に含まれるビタミンとしては、例えば、チアミン（ビタミンＢ１）、リボフラビン（ビタミンＢ２）、ナイアシン（ビタミンＢ３）、Ｄ－パントテン酸カルシウム（ビタミンＢ５）、ピリドキサール／ピリドキサミン／ピリドキシン（ビタミンＢ６）、葉酸（ビタミンＢ９）、シアノコバラミン（ビタミンＢ１２）、アスコルビン酸（ビタミンＣ）、カルシフェロール（ビタミンＤ２）、ＤＬ－αトコフェロール（ビタミンＥ）、ビオチン（ビタミンＨ）、メナジオン（ビタミンＫ）等が挙げられる。
本実施形態のオルガノイド培養用細胞培養培地は、さらに、少なくとも１種の無機塩を含んでいてもよい。本実施形態のオルガノイド培養用細胞培養培地に含まれる無機塩は、細胞の浸透圧平衡の維持を助けるために、および膜電位の調節を助けるためのものである。無機塩の具体例としては、カルシウム、銅、鉄、マグネシウム、カリウム、ナトリウム、亜鉛の塩が挙げられる。塩は、通常、塩化物、リン酸塩、硫酸塩、硝酸塩、及び重炭酸塩の形で用いられる。さらに具体的な塩には、ＣａＣｌ２、ＣｕＳＯ４－５Ｈ２Ｏ、Ｆｅ（ＮＯ３）－９Ｈ２Ｏ、ＦｅＳＯ４－７Ｈ２Ｏ、ＭｇＣｌ、ＭｇＳＯ４、ＫＣｌ、ＮａＨＣＯ３、ＮａＣｌ、Ｎａ２ＨＰＯ４、Ｎａ２ＨＰＯ４－Ｈ２Ｏ、ＺｎＳＯ４－７Ｈ２Ｏ等が挙げられる。
本実施形態のオルガノイド培養用細胞培養培地は、さらに、少なくとも１種の炭素エネルギー源となり得る糖を含んでいてもよい。本実施形態のオルガノイド培養用細胞培養培地に含まれる糖としては、例えば、グルコース、ガラクトース、マルトース、フルクトース等が挙げられる。中でも、糖としては、グルコースが好ましく、Ｄ－グルコース（デキストロース）が特に好ましい。本実施形態のオルガノイド培養用細胞培養培地に含まれる糖の濃度は、１ｇ／Ｌ以上１０ｇ／Ｌであることが好ましい。
本実施形態のオルガノイド培養用細胞培養培地は、さらに、少なくとも１種の微量元素を含んでいてもよい。本実施形態のオルガノイド培養用細胞培養培地に含まれる微量元素としては、例えば、バリウム、ブロミウム、コバルト、ヨウ素、マンガン、クロム、銅、ニッケル、セレン、バナジウム、チタン、ゲルマニウム、モリブデン、ケイ素、鉄、フッ素、銀、ルビジウム、スズ、ジルコニウム、カドミウム、亜鉛、アルミニウム又はこれらのイオン等が挙げられる。
本実施形態のオルガノイド培養用細胞培養培地は、さらに、少なくとも１種の付加的な薬剤を含んでいてもよい。係る薬剤としては、幹細胞培養を改善することが報告されている栄養素又は増殖因子、例えば、コレステロール／トランスフェリン／アルブミン／インシュリン／プロゲステロン、プトレシン、亜セレン酸塩／他の因子等が挙げられる。
＜＜上皮幹細胞、上皮細胞、上皮腫瘍細胞又はそれら細胞を含む組織を培養するための方法＞＞
＜第１実施形態＞
本発明の第１実施形態に係る培養方法は、上皮幹細胞、上皮細胞、上皮腫瘍細胞、又はそれら細胞のうち少なくともいずれか一方を含む組織の培養方法であって、細胞外マトリクスを調製する細胞外マトリクス調製工程と、前記細胞外マトリクス上に上皮幹細胞、上皮細胞、上皮腫瘍細胞、又はそれらの細胞を含む組織を接着させる接着工程と、前記接着工程後に、上述のオルガノイド培養用細胞培養培地を添加し、前記上皮幹細胞、前記上皮細胞、前記上皮腫瘍細胞、又は前記それらの細胞を含む組織を培養し、オルガノイドを形成させるオルガノイド形成工程と、を備える培養方法である。
本実施形態の培養方法によれば、ヒトを含む哺乳動物由来の上皮幹細胞、上皮細胞、又は上皮腫瘍細胞、或いはそれら細胞のうち少なくともいずれか一方を含む組織、又は従来では培養することができなかった組織を長期間培養することができる。また、ヒトを含む哺乳動物由来の上皮幹細胞、上皮細胞、又は上皮腫瘍細胞、或いはそれら細胞のうち少なくともいずれか一方を含む組織、又は従来では培養することができなかった組織から高効率でオルガノイドを形成させることができる。
本実施形態の培養方法における各工程について、以下に詳細に説明する。
［細胞外マトリクス調製工程］
一般的に、「細胞外マトリクス（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍａｔｒｉｘ；ＥＣＭ）」とは、生物において細胞の外に存在する超分子構造を意味する。このＥＣＭは、上皮幹細胞、上皮腫瘍細胞、又はそれらを含む組織が増殖するための足場となる。
ＥＣＭは、様々な多糖、水、エラスチン、及び糖タンパク質を含む。糖タンパク質としては、例えば、コラーゲン、エンタクチン（ナイドジェン）、フィブロネクチン、ラミニン等が挙げられる。
ＥＣＭの調製方法としては、例えば、結合組織細胞を用いる方法等が挙げられる。より具体的には、ＥＣＭ産生細胞、例えば、線維芽細胞を培養した後に、これらの細胞を取り出し、上皮幹細胞、上皮細胞、上皮腫瘍細胞、又はそれらを含む組織を添加することによって、ＥＣＭを足場として用いることができる。
ＥＣＭ産生細胞としては、例えば、主にコラーゲン及びプロテオグリカンを産生する軟骨細胞、主にＩＶ型コラーゲン、ラミニン、間質プロコラーゲン、及びフィブロネクチンを産生する線維芽細胞、主にコラーゲン（Ｉ型、ＩＩＩ型、及びＶ型)、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、ヒアルロン酸、フィブロネクチン、及びテネイシン－Ｃを産生する結腸筋線維芽細胞等が挙げられる。または、市販のＥＣＭを用いてもよい。市販のＥＣＭとしては、例えば、細胞外マトリクスタンパク質（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ－Ｈｏｌｍ－Ｓｗａｒｍ（ＥＨＳ）マウス肉腫細胞に由来する基底膜調製物（例えば、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製））等挙げられる。ＰｒｏＮｅｃｔｉｎ（ＳｉｇｍａＺ３７８６６６）等の合成ＥＣＭを用いてもよい。また、天然ＥＣＭ及び合成ＥＣＭの混合物を用いてもよい。
幹細胞を培養するためにＥＣＭを使用する場合、幹細胞の長期生存及び未分化幹細胞の継続的存在を強化することができる。ＥＣＭの非存在下では、幹細胞培養物を長期間にわたって培養することができず、未分化幹細胞の継続的存在は観察されない。さらに、ＥＣＭが存在すると、ＥＣＭの非存在下では培養することができないオルガノイドを培養することができる。
ＥＣＭは、通常、細胞が懸濁されたディッシュの底に沈んでいる。例えば、ＥＣＭが３７℃で凝固するときに、上述のオルガノイド培養用細胞培養培地を加えて、ＥＣＭの中に拡散させて用いてもよい。培地中の細胞は、ＥＣＭの表面構造と相互作用することによって、例えば、インテグリンと相互作用することによってＥＣＭに固着することができる。
ＥＣＭは培養容器等にコーティングして用いてもよい。ＥＣＭとして、フィブロネクチンを用いる場合、培養容器中にコーティングされる割合は、１μｇ／ｃｍ２以上２５０μｇ／ｃｍ２以下であることが好ましく、１μｇ／ｃｍ２以上１５０μｇ／ｃｍ２以下であることがより好ましく、８μｇ／ｃｍ２以上１２５μｇ／ｃｍ２以下であることがさらに好ましい。
［接着工程］
続いて、上皮幹細胞、上皮細胞、上皮腫瘍細胞、又はそれら細胞のうち少なくともいずれか一方を含む組織を準備する。本実施形態の培養法において用いられる、上皮幹細胞、上皮細胞、又は上皮腫瘍細胞は上述の＜＜オルガノイド培養用細胞培養培地＞＞と同様のものが挙げられる。
上皮組織から上皮細胞を単離する方法としては、当技術分野において公知の方法が挙げられる。例えば、キレート剤と単離組織とを恒温放置することによって、陰窩を単離することができる。この組織を洗浄した後、硝子スライドで上皮細胞層を粘膜下層から剥離し、細切する。この後、トリプシン又は、好ましくはＥＤＴＡ及びＥＧＴＡのうち少なくともいずれか一方を含む液中で恒温放置し、例えば、ろ過及び遠心機の少なくともいずれか一方を用いて、未消化の組織断片と陰窩由来の単一細胞とを分離する。トリプシンの代わりに、その他のタンパク質分解酵素、例えばコラゲナーゼ及びディスパーゼＩのうち少なくともいずれか一方を使用してもよい。膵臓及び胃の断片を単離するために同様の方法が使用される。
上皮組織から幹細胞を単離する方法として、当技術分野において公知の方法が挙げられる。幹細胞は、その表面上でＬｇｒ５及びＬｇｒ６のうち少なくともいずれか一方（Ｌｇｒ５及びＬｇｒ６は大型のＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）スーパーファミリーに属する）を発現する。単離方法としては、上皮組織から細胞縣濁液を調製し、この細胞縣濁液を、Ｌｇｒ５及びＬｇｒ６のうち少なくともいずれか一方と結合する化学物質に接触させ、このＬｇｒ５及びＬｇｒ６のうち少なくともいずれか一方と結合する化学物質を分離し、この結合化合物から幹細胞を単離する方法挙げられる。
Ｌｇｒ５及びＬｇｒ６のうち少なくともいずれか一方と結合する化学物質としては、例えば、抗体、より具体的には、例えばＬｇｒ５及びＬｇｒ６のうち少なくともいずれか一方を特異的に認識し、それに結合するモノクローナル抗体（例えば、マウス及びラットモノクローナル抗体を含むモノクローナル抗体等）が挙げられる。このような抗体を用いて、例えば磁性ビーズを活用して、又は蛍光活性化細胞ソーターを通じて、Ｌｇｒ５及びＬｇｒ６のうち少なくともいずれか一方を発現している幹細胞を単離することができる。
上述の方法により単離された上皮幹細胞、上皮細胞、上皮腫瘍細胞、又はそれら細胞のうち少なくともいずれか一方を含む組織を、前記調製工程で得られた細胞マトリクス上に播種し、静置する。播種された細胞は、ＥＣＭの表面構造と相互作用することによって、例えば、インテグリンと相互作用することによってＥＣＭに接着することができる。
［オルガノイド形成工程］
続いて、細胞播種後、細胞が乾かないうちに、上述のオルガノイド培養用細胞培養培地を添加し、培養する。培養温度は３０℃以上４０℃以下が好ましく、３７℃程度がより好ましい。培養時間は用いる細胞によって適宜調整することができる。培養開始からから１～２週間程度後で、オルガノイドを形成させることができる。また、従来では２～３ヶ月しか細胞維持培養することができなかった細胞に対し、本実施形態の培養方法では、３ヶ月以上の長期間（好ましくは、１０ヶ月程度）においても、細胞を維持培養することができる。本実施形態の培養方法を用いて、上皮幹細胞を培養した場合は、分化能を維持でき、腫瘍発生頻度を極めて低い状態に抑えることができる。
また、オルガノイド形成工程において、低酸素下で培養を行ってもよい。低酸素下で培養を行うことにより、ヒトを含む哺乳動物由来の上皮幹細胞、上皮細胞、又は上皮腫瘍細胞、或いはそれら細胞のうち少なくともいずれか一方を含む組織、又は従来では培養することができなかった組織から高効率でオルガノイドを形成させることができる。
本実施形態における低酸素下とは、酸素濃度が、０．１％以上１５％以下であることが好ましく、０．３％以上１０％以下であることがより好ましく、０．５％以上５％以下であることがさらに好ましい。
＜第２実施形態＞
本発明の第２実施形態に係る培養方法は、上皮幹細胞、上皮細胞、上皮腫瘍細胞、又はそれら細胞のうち少なくともいずれか一方を含む組織の培養方法であって、細胞外マトリクスを調製する細胞外マトリクス調製工程と、前記細胞外マトリクス上に上皮幹細胞、上皮細胞、上皮腫瘍細胞又はそれら細胞のうち少なくともいずれか一方を含む組織を接着させる接着工程と、前記接着工程後に、オルガノイド培養用細胞培養培地を添加し、低酸素下で前記上皮幹細胞、前記上皮細胞、前記上皮腫瘍細胞又は前記それら細胞のうち少なくともいずれか一方を含む組織を培養し、オルガノイドを形成させるオルガノイド形成工程と、を備え、前記オルガノイド培養用細胞培養培地が、Ｗｎｔタンパク質及びＲ－スポンジン（Ｒ－ｓｐｏｎｄｉｎ）からなるＷｎｔアゴニスト、分裂促進増殖因子、骨形成因子（ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ；ＢＭＰ）阻害剤、形質転換増殖因子－β（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－β；ＴＧＦ－β）阻害剤、及びｐ３８阻害剤からなる群から選ばれる少なくとも一種を含み酸素濃度が、０．１％以上１５％以下であることが好ましく、０．３％以上１０％以下であることがより好ましく、０．５％以上５％以下で培養する培養方法である。
本実施形態の培養方法によれば、ヒトを含む哺乳動物由来の上皮幹細胞、上皮細胞、上皮腫瘍細胞、或いはそれら細胞のうち少なくともいずれか一方を含む組織、又は従来では培養することができなかった組織を長期間培養することができる。また、ヒトを含む哺乳動物由来の上皮幹細胞、上皮細胞、上皮腫瘍細胞、或いはそれら細胞のうち少なくともいずれか一方を含む組織、又は従来では培養することができなかった組織から高効率でオルガノイドを形成させることができる。
本実施形態の培養方法について、各工程については、上述の第一実施形態と同様である。
また、本実施形態の培養方法において使用するオルガノイド培養用細胞培養培地は、Ｗｎｔタンパク質及びＲ－スポンジン（Ｒ－ｓｐｏｎｄｉｎ）からなるＷｎｔアゴニスト、分裂促進増殖因子、ＢＭＰ阻害剤、ＴＧＦ－β阻害剤、及びｐ３８阻害剤からなる群から選ばれる少なくとも一種を含む。
また、本実施形態の培養方法において、低酸素下及び正常酸素下（酸素濃度２０％程度）にて、組成が異なる数種類のオルガノイド培養用細胞培養培地を準備し培養することにより、培養する細胞又は組織の種類に応じて、複数の条件の中から適した条件を選択することができ、高効率でオルガノイドを形成させることができる。
Ｗｎｔアゴニスト、ＢＭＰ阻害剤、及びＴＧＦ－β阻害剤については、上述の＜＜オルガノイド培養用細胞培養培地＞＞にて例示されたものと同様のものが挙げられる。また、使用するＷｎｔタンパク質は、アファミンとの複合体を形成していることが好ましい。本実施形態の培養方法において、Ｗｎｔタンパク質とアファミンとの複合体及びＲ－スポンジンからなるＷｎｔアゴニストを含むオルガノイド培養用細胞培養培地を用いることで、ヒトを含む哺乳動物由来の上皮幹細胞、又は上皮腫瘍細胞、或いはそれら細胞のうち少なくともいずれか一方を含む組織、又は従来では培養することができなかった組織から高効率でオルガノイドを形成させることができる。
また、本実施形態の培養方法において使用するオルガノイド培養用細胞培養培地に含まれるその他の構成成分について、詳細を以下に説明する。
（分裂促進増殖因子）
本実施形態の培養方法において使用するオルガノイド培養用細胞培養培地に含まれる分裂促進増殖因子としては、例えば、上皮増殖因子（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ；ＥＧＦ）、形質転換増殖因子－α（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ－α；ＴＧＦ－α）、脳由来神経栄養因子（ｂｒａｉｎ ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ；ＢＤＮＦ）、ケラチン生成細胞増殖因子（ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ；ＫＧＦ）等の増殖因子のファミリーが挙げられる。これらの分裂促進増殖因子は複数種類を組み合わせて用いてもよい。
ＥＧＦは、様々な培養外胚葉性細胞及び中胚葉性細胞に対する強力な分裂促進因子であり、一部の繊維芽細胞の、特異的細胞の分化に顕著な影響を有する。ＥＧＦ前駆体は、タンパク質分解により切断されて、細胞を刺激する５３－アミノ酸ペプチドホルモンを生成させる、膜結合分子として存在する。
前記オルガノイド培養用細胞培養培地に含まれる分裂促進増殖因子としては、中でも、ＥＧＦが好ましい。本実施形態のオルガノイド培養用細胞培養培地に含まれるＥＧＦの濃度は、５ｎｇ／ｍＬ以上５００ｎｇ／ｍＬ以下であることが好ましく、１０ｎｇ／ｍＬ以上４００ｎｇ／ｍＬ以下であることがより好ましく、５０ｎｇ／ｍＬ以２００ｎｇ／ｍＬ以下であることがさらに好ましい。
また、前記オルガノイド培養用細胞培養培地にＫＧＦを含む場合においても、ＫＧＦと同様の含有量であることが好ましい。複数のＫＧＦ、例えばＫＧＦ１及びＫＧＦ２（ＦＧＦ７及びＦＧＦ１０としても知られている。）を使用する場合は、ＫＧＦの総含有量が上記範囲であることが好ましい。幹細胞の培養中、２日ごとに分裂促進増殖因子を培養培地に添加することが好ましく、４日ごとに培養培地を新鮮なものに交換することが好ましい。
（ｐ３８阻害剤）
本明細書において、「ｐ３８阻害剤」は、ｐ３８シグナル伝達を直接的又は間接的に負に調節する任意の阻害剤を意味する。一般的に、ｐ３８阻害剤は、例えば、ｐ３８に結合し、且つその活性を低減する。ｐ３８プロテインキナーゼは、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）ファミリーの一部である。ＭＡＰＫは、環境ストレス及び炎症サイトカイン等の細胞外刺激に応答し、遺伝子発現、有糸分裂、分化、増殖、及び細胞生存／アポトーシス等の様々な細胞活性を調節するセリン／スレオニン特異的プロテインキナーゼである。ｐ３８ ＭＡＰＫは、α、β、β２、γ、及びδアイソフォームとして存在する。また、ｐ３８阻害剤は、例えば、少なくとも１つのｐ３８アイソフォームに結合し、且つその活性を低減する薬剤でもある。
ｐ３８阻害剤は、この阻害剤の非存在下でのｐ３８活性レベルと比較して、好ましくは５０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、特に好ましくは、９０％以上の阻害活性を有する。ｐ３８阻害剤による阻害効果は、当業者にとって公知の方法で評価することできる。係る評価系としては、Ｔｈｒ１８０／Ｔｙｒ１８２リン酸化のリン酸化部位特異的抗体検出方法、生化学的組換えキナーゼアッセイ、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ－α）分泌アッセイ、ｐ３８阻害剤用のＤｉｓｃｏｖｅｒＲｘハイスループットスクリーニングプラットフォーム、ｐ３８活性アッセイキット (例えば、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製, Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製等)等が挙げられる。
本実施形態のオルガノイド培養用細胞培養培地に含まれるｐ３８阻害剤としては、例えば、ＳＢ－２０２１９０（４－（４－フルオロフェニル）－２－（４－ヒドロキシフェニル）－５－（４－ピリジル）－１Ｈ－イミダゾール）、ＳＢ－２０３５８０（４－［４－（４－フルオロフェニル）－２－［４－（メチルスルフィニル）フェニル］－１Ｈ－イミダゾール－５－イル］ピリジン）、ＶＸ－７０２（６－（Ｎ－カルバモイル－２，６－ジフルオロアニリノ）－２－（２，４－ジフルオロフェニル）ピリジン－３－カルボキシアミド）、ＶＸ－７４５（５－（２，６－ジクロロフェニル）－２－［２，４－ジフルオロフェニル）チオ］－６Ｈ－ピリミド［１，６－ｂ］ピリダジン－６－ワン）、ＰＤ－１６９３１６（４－（４－フルオロフェニル）－２－（４－ニトロフェニル）－５－（４－ピリジル）－１Ｈ－イミダゾール）、ＲＯ－４４０２２５７（６－（２，４－ジフルオロフェノキシ）－２－｛［３－ヒドロキシ－１－（２－ヒドロキシエチル）プロピル］アミノ｝－８－メチルピリド［２，３－Ｄ］ピリミジン－７（８ｈ）－ワン）、ＢＩＲＢ－７９６（１－［５－ｔｅｒｔ－ブチル－２－（４－メチルフェニル）ピラゾール－３－イル］－３－［４－（２－モルフォリン－４－イレトキシ）ナフタレン－１－イル］ウレア）等が挙げられる。
前記オルガノイド培養用細胞培養培地に含まれるｐ３８阻害剤の濃度は、５０ｎＭ以上１００μＭ以下であることが好ましく、１００ｎＭ以上５０μＭ以下であることがより好ましく、１００ｎＭ以上１０μＭ以下であることがさらに好ましい。幹細胞の培養中、２日ごとにｐ３８阻害剤を培養培地に添加することが好ましく、４日ごとに培養培地を新鮮なものに交換することが好ましい。
＜＜オルガノイド＞＞
本発明の第１実施形態に係るオルガノイドは、上述の培養方法により、得られる。
本実施形態のオルガノイドは、再生医療、上皮細胞の基礎医学研究、薬物応答のスクリーニング、疾患由来上皮オルガノイドを用いた創薬研究等に応用することができる。
＜用途＞
一実施形態において、本発明は、薬物応答のスクリーニング、毒性アッセイ、又は再生医療のための上述のオルガノイドの使用を提供する。
薬物応答のスクリーニングにおいて、上述のオルガノイドを用いる場合、オルガノイドを例えば９６ウェルプレート又は３８４ウェルプレート等のマルチウェルプレート中で培養する。分子のライブラリを使用して、このオルガノイドに影響を与える分子を同定する。ライブラリとしては、例えば、抗体断片ライブラリ、ペプチドファージディスプレイライブラリ、ペプチドライブラリ（例えばＬＯＰＡＰ（商標）、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社製）、脂質ライブラリ（ＢｉｏＭｏｌ社製）、合成化合物ライブラリ（例えばＬＯＰＡＰ（商標）、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社製）又は天然化合物ライブラリ（Ｓｐｅｃｓ、ＴｉｍＴｅｃ社製）等が挙げられる。さらに、遺伝子ライブラリを用いてもよい。遺伝子ライブラリとしては、例えば、ｃＤＮＡライブラリ、アンチセンスライブラリ、ｓｉＲＮＡ、又はその他の非コードＲＮＡライブラリ等が挙げられる。具体的な方法としては、ある一定の時間にわたり細胞を試験薬剤の複数の濃度に曝露し、曝露時間終了時に、培養物を評価する方法が挙げられる。また、本実施形態のオルガノイドは上皮腫瘍細胞を特異的に標的とするが、正常細胞からなるオルガノイドを標的としない薬物を同定するために使用することもできる。
さらに、本実施形態のオルガノイドは、新規候補薬物又は既知若しくは新規栄養補助食品の毒性アッセイにおいてＣａｃｏ－２細胞等の細胞株の使用に代わるものとなり得る。
さらに、本実施形態のオルガノイドは、現在のところ適切な組織培養又は動物モデルがないノロウイルスなどの病原体を培養するために使用することができる。
また、本実施形態のオルガノイドは、再生医療において、例えば、放射線照射後又は術後の腸上皮の修復において、クローン病及び潰瘍性大腸炎等の炎症性腸疾患に罹患している患者の腸上皮の修復において、又は短腸症候群に罹患している患者の腸上皮の修復において、有用である。さらに、本実施形態のオルガノイドは、小腸／結腸の遺伝性疾患の患者における腸上皮の修復において、有用である。また、本実施形態のオルガノイドは、再生医療において、例えば膵臓切除後の移植片又はその一部として、又はＩ型糖尿病及びＩＩ型糖尿病等の糖尿病の治療のために有用である。
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［実施例１］
（１）オルガノイド培養用細胞培養培地の調製
まず、市販のＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｃｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製）に、終濃度１μｇ／ｍＬとなるようにヒト組換えＲ－スポンジン１（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を添加し、終濃度１００ｎｇ／ｍＬとなるようにノギン（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）を添加し、終濃度５００ｎＭとなるようにＡ８３－０１（Ｔｏｃｒｉｓ社製）を添加した。さらに、Ｗｎｔ３ａの終濃度３００ｎｇ／ｍＬとなるように血清含有培地で培養したＷ－Ｗｎｔ３ａ／ＨＥＫ由来の培養上清を添加した培地（以下、「ＷＮＲＡ培地」と称する。）を用意した。
さらに、終濃度５００ｎｇ／ｍＬとなるようにＥｐｉｒｅｇｕｌｉｎ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、終濃度５００ｎｇ／ｍＬとなるようにＩＧＦ１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、又は終濃度５０ｎｇ／ｍＬとなるようにＦＧＦ２（ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）のうち少なくともいずれか１種類を添加し、構成成分が以下の組み合わせの培地となる培地を用意した。
・ＷＮＲＡ＋Ｅｐｉｒｅｇｕｌｉｎ培地
・ＷＮＲＡ＋ＩＧＦ１培地
・ＷＮＲＡ＋Ｅｐｉｒｅｇｕｌｉｎ＋ＩＧＦ１培地
・ＷＮＲＡ＋Ｅｐｉｒｅｇｕｌｉｎ＋ＦＧＦ２培地
・ＷＮＲＡ＋ＩＧＦ１＋ＦＧＦ２培地
また、コントロールとして、さらに終濃度５０ｎｇ／ｍＬとなるようにＥＧＦ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｃｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製）を添加した培地（以下、「ＷＮＲＡ＋ＥＧＦ培地」と称することがある。）を用意した。また、参考例として、さらに終濃度１０μＭとなるようにＳＢ２０２１９０（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を添加した培地（以下、「ＷＮＲＡＳ＋ＥＧＦ培地」と称することがある。）を用意した。
（２）大腸腫瘍由来の上皮腫瘍細胞の培養
慶應義塾大学医学部倫理委員会で承認された倫理研究計画にも基づき、説明と同意を得られた大腸腫瘍患者より、大腸腫瘍から少なくとも５ｃｍ以上離れた部分を正常粘膜として採取し、また、大腸腫瘍より病変組織を採取した。次いで、ヒト腫瘍組織由来の上皮腫瘍細胞を含む大腸腫瘍組織を、リベラーゼＴＨを用いて、上皮腫瘍細胞と残りの組織とに分けた。残りの組織については、トリプシンでさらにバラバラに分散した。次いで、上皮腫瘍細胞を、２５μＬのマトリゲル（登録商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）と共に、４８ウェルプレートに播種した。上皮腫瘍細胞を播種したウェルに、（１）で調製したＷＮＲＡ＋ＥＧＦ培地（従来の方法で用いられる培地）、ＷＮＲＡ＋Ｅｐｉｒｅｇｕｌｉｎ培地、ＷＮＲＡ＋ＩＧＦ１培地、ＷＮＲＡ＋Ｅｐｉｒｅｇｕｌｉｎ＋ＩＧＦ１培地、ＷＮＲＡ＋Ｅｐｉｒｅｇｕｌｉｎ＋ＦＧＦ２培地、又はＷＮＲＡ＋ＩＧＦ１＋ＦＧＦ２培地を各２５０μＬずつ添加し、３７℃で酸素濃度２０％にて培養した。培養から、２日毎に培地交換を行った。図１は、初代培養（Ｐａｓｓａｇｅ０）の培養開始から７日目の様子を示す画像である。図２は、各培地中の腸管幹細胞のオルガノイドがウェル中に占める面積を定量化したグラフである。
図１及び図２から、ＷＮＲＡ＋ＥＧＦ培地と比較して、いずれの培地を用いてもオルガノイドの面積が大きくなっており、高効率で培養できることが確かめられた。特に、ＩＧＦ１及びＦＧＦ２を含む培地である「ＷＮＲＡ＋ＩＧＦ１＋ＦＧＦ２培地」を用いた場合において、高効率でオルガノイドを培養できることが明らかとなった。
［実施例２］
（１）オルガノイド培養用細胞培養培地の調製
まず、市販のＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｃｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製）に、終濃度５０ｎｇ／ｍＬとなるようにＥＧＦ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｃｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製）を添加し、終濃度１００ｎｇ／ｍＬとなるようにノギン（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）を添加し、終濃度５００ｎＭとなるようにＡ８３－０１（Ｔｏｃｒｉｓ社製）を添加した培地（以下、「ＥＮＡ培地」と称することがある。）を用意した。
（２）大腸腫瘍由来の上皮腫瘍細胞の培養
実施例１の（２）と同様の方法を用いて、上皮腫瘍細胞を得た。次いで、上皮腫瘍細胞を、２５μＬのマトリゲル（登録商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）と共に、４８ウェルプレートに播種した。上皮腫瘍細胞を播種したウェルに、（１）で調製したＥＮＡ培地を２５０μＬ添加し、３７℃で酸素濃度１％（以下、「低酸素培養」と称することがある。）、又は酸素濃度２０％（以下、「正常酸素培養」と称することがある。）にて培養した。培養から、２日毎に培地交換を行った。図３は、初代培養（Ｐａｓｓａｇｅ０）の培養開始から７日目の培養オルガノイドを示す画像である。
図３から、今回用いた上皮腫瘍細胞では、低酸素培養条件がオルガノイドの形成に必須であることが確かめられた。
また、図４は、５５種類の大腸腫瘍から樹立したオルガノイドの最適培養条件を示す図である。図４から、正常大腸上皮オルガノイドの培養では、オルガノイド培養用細胞培養培地に含まれる構成成分として、Ｗｎｔタンパク質及びＲ－スポンジンからなるＷｎｔアゴニスト、ＥＧＦ、ｐ３８阻害剤、ノギン、及びＴＧＦ－β阻害剤の全ての構成成分が必要であるのに対し、腫瘍細胞では、少ない構成成分での培養が可能であることが明らかとなった。
しかしながら、腫瘍化に伴い、一部の構成成分（特に、ｐ３８阻害剤）が培養効率を悪化させる場合があった（図４の斜線部参照。）。また、２０％酸素条件（正常酸素条件）では、培養効率を悪化させ、一方、１％酸素条件（低酸素条件）では培養可能である場合があった（図４の横線部参照。）。ここで、大腸がんIV(M)は、転移した大腸がんである。
このため、単一の培養条件では全ての腫瘍が培養できず、予め以下に示す８つの培養条件を設定することにより、樹立効率が向上することが明らかとなった。以下において、ＷＲ（－）とは、Ｗｎｔタンパク質及びＲ－スポンジンからなるＷｎｔアゴニストを含まないことを示し、ＷＲ（＋）とは、Ｗｎｔタンパク質及びＲ－スポンジンからなるＷｎｔアゴニストを含むことを示す。
・ＥＮＡ／ＷＲ（－）培地、正常酸素培養
・ＥＮＡ／ＷＲ（＋）培地、正常酸素培養
・ＥＮＡＳ／ＷＲ（－）培地、正常酸素培養
・ＥＮＡＳ／ＷＲ（＋）培地、正常酸素培養
・ＥＮＡ／ＷＲ（－）培地、低酸素培養
・ＥＮＡ／ＷＲ（＋）培地、低酸素培養
・ＥＮＡＳ／ＷＲ（－）培地、低酸素培養
・ＥＮＡＳ／ＷＲ（＋）培地、低酸素培養
［実施例３］
（１）Ｗｎｔ３ａ－アファミン複合体の調製
Ｗｎｔ３ａ－アファミン複合体（以下、「ＷＡｆｍ」と称することがある。）は、ウシ胎児血清にウシアファミンが含まれることを利用し、Ｗｎｔ３ａのみを遺伝子導入した細胞を血清含有培地で培養し、分泌されるＷｎｔ３ａがアファミンと自動的に安定な複合体を形成することを利用して調製した。すなわち、Ｎ末端にタグ配列を有するＷｎｔ３ａを発現する細胞（Ｗ－Ｗｎｔ３ａ／ＨＥＫ）を、１０％ウシ胎児血清を含む培地中でディッシュ又は多層フラスコ等で５～７日間培養し、培養上清を回収した。続いて、回収した培養上清は遠心分離し、フィルター（０．２２μｍ）を通した。集めた培養上清のうち、２２０ｍＬを使用した。続いて、回収した２００ｍＬの培養上清に３ｍＬのＰ２０．１抗体セファロースを加え、４℃で３時間回転混和した後、培地を空のカラムに通して、セファロースを集めた。なお、Ｐ２０．１抗体はＷｎｔ３ａのＮ末端のタグ配列を特異的に認識する抗体である。続いて、カラムに集めたセファロースを３ｍＬのＴｒｉｓ ｂｕｆｆｅｒｄ ｓａｌｉｎｅ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）で洗浄し、洗浄操作を５回繰り返した。続いて、１回あたり３ｍＬのペプチド溶液（０．２ｍｇ／ｍＬ ＰＡＲ４－Ｃ８ ｐｅｐｔｉｄｅ／ＴＢＳ）を用いて溶出を行い、溶出液を回収した。溶出操作を１０回繰り返して、Ｗｎｔ３ａ－アファミン複合体を得た。Ｗｎｔ３ａの活性は、Ｗ－Ｗｎｔ３ａ／ＨＥＫの細胞上清を用いたＴＣＦレポーターアッセイにより確認し、市販のＷｎｔ３ａ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社製）と比較して、１０倍以上の高い活性を有することが確かめられた。
（２）オルガノイド培養用細胞培養培地の調製
まず、市販のＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｃｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製）に、終濃度１μｇ／ｍＬとなるようにヒト組換えＲ－スポンジン１（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を添加し、終濃度１００ｎｇ／ｍＬとなるようにノギン（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）を添加し、終濃度５００ｎＭとなるようにＡ８３－０１（Ｔｏｃｒｉｓ社製）を添加した。さらに、Ｗｎｔ３ａの終濃度３００ｎｇ／ｍＬとなるように血清含有培地で培養したＷ－Ｗｎｔ３ａ／ＨＥＫ由来の培養上清を添加し、終濃度１００ｎｇ／ｍＬとなるようにＩＧＦ１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）を添加し、終濃度５０ｎｇ／ｍＬとなるようにＦＧＦ２（ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）を添加した培地（以下、「ＷＩＦＮＲＡ培地」と称することがある。）を用意した。
また、市販のＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｃｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製）に、終濃度１μｇ／ｍＬとなるようにヒト組換えＲ－スポンジン１（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を添加し、終濃度１００ｎｇ／ｍＬとなるようにノギン（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）を添加し、終濃度５００ｎＭとなるようにＡ８３－０１（Ｔｏｃｒｉｓ社製）を添加した。さらに、終濃度３００ｎｇ／ｍＬとなるように（１）で調製したＷｎｔ３ａ－アファミン複合体を添加し、終濃度１００ｎｇ／ｍＬとなるようにＩＧＦ１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）を添加し、終濃度５０ｎｇ／ｍＬとなるようにＦＧＦ２（ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）を添加した培地（以下、「ＷＡｆｍＩＦＮＲＡ培地」と称することがある。）を用意した。
また、比較例１として、市販のＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｃｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製）に、終濃度１μｇ／ｍＬとなるようにヒト組換えＲ－スポンジン１（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を添加し、終濃度１００ｎｇ／ｍＬとなるようにノギン（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）を添加し、終濃度５００ｎＭとなるようにＡ８３－０１（Ｔｏｃｒｉｓ社製）を添加した。さらに、Ｗｎｔ３ａの終濃度３００ｎｇ／ｍＬとなるように血清含有培地で培養したＷ－Ｗｎｔ３ａ／ＨＥＫ由来の培養上清を添加し、終濃度５０ｎｇ／ｍＬとなるようにＥＧＦ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｃｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製）を添加し、終濃度１０μＭとなるようにＳＢ２０２１９０（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を添加した培地（以下、「ＷＥＮＲＡＳ培地」と称することがある。）を用意した。
また、比較例２として、市販のＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｃｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製）に、終濃度１μｇ／ｍＬとなるようにヒト組換えＲ－スポンジン１（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を添加し、終濃度１００ｎｇ／ｍＬとなるようにノギン（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）を添加し、終濃度５００ｎＭとなるようにＡ８３－０１（Ｔｏｃｒｉｓ社製）を添加した。さらに、終濃度３００ｎｇ／ｍＬとなるように（１）で調製したＷｎｔ３ａ－アファミン複合体を添加し、終濃度５０ｎｇ／ｍＬとなるようにＥＧＦ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｃｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製）を添加し、終濃度１０μＭとなるようにＳＢ２０２１９０（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を添加した培地（以下、「ＷＡｆｍＥＮＲＡＳ培地」と称することがある。）を用意した。
（３）腸管幹細胞の培養
慶應義塾大学医学部倫理委員会で承認された倫理研究計画にも基づき、説明と同意を得られた大腸腫瘍患者より、大腸腫瘍から少なくとも５ｃｍ以上離れた部分を正常粘膜として採取し、また，大腸腫瘍より病変部位を採取した。採取した組織はＥＤＴＡ又はリベラーゼＴＨにより上皮細胞を抽出し、マトリゲル（登録商標）に包埋した。
上皮細胞（以下、「腸管幹細胞」と呼ぶ。）を含むマトリゲル（登録商標）は４８ウェルプレートに播種し、培地とともに培養した。具体的には、下記の通りである。
培養した腸管幹細胞を、２５μＬのマトリゲル（登録商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）と共に、４８ウェルプレートに播種した。（２）で調製した４種類の培地（「ＷＩＦＮＲＡ培地」、「ＷＡｆｍＩＦＮＲＡ培地」、「ＷＥＮＲＡＳ培地」、及び「ＷＡｆｍＥＮＲＡＳ培地」）を各ウェルに２５０μＬずつ添加し、３７℃で酸素濃度２０％にて培養した。培養から、２日毎に培地交換を行った。図５Ａは、初代培養（Ｐａｓｓａｇｅ０）の培養開始から７日目の様子を示す画像であり、図５Ｂは、各培地中の腸管幹細胞のオルガノイドがウェル中に占める面積を定量化したグラフである。図５Ａ及び図５Ｂにおいて、「Ｗ」は血清を含むＷｎｔ３ａを示し、「ＷＡｆｍ」は無血清のＷｎｔ３ａ－アファミン複合体を示す。
図５Ａ及び図５Ｂから、従来の培養条件である「ＷＥＮＲＡＳ培地」を用いた場合では、腸管幹細胞の単一細胞からのオルガノイドの形成効率は悪く、十分な大きさまで生育しなかった。一方、「ＷＩＦＮＲＡ培地」を用いた場合では、より効率よく腸管幹細胞の単一細胞からのオルガノイドを形成させることが可能であった。さらに、従来の血清含Ｗｎｔ３Ａを、無血清のＷｎｔ３ａ－アファミン複合体に代替した場合、ＩＧＦ１＋ＦＧＦ２による単一正常上皮細胞の培養効率は飛躍的に改善した。
よって、本実施形態のオルガノイド培養用細胞培養培地が、正常上皮細胞のハイスループットスクリーニング等、単一細胞からのオルガノイドの形成効率の向上に極めて有効であることが明らかとなった。
［実施例４］
（１）Ｗｎｔ３ａ－アファミン複合体の調製
実施例３の（１）と同様の方法を用いて、Ｗｎｔ３ａ－アファミン複合体を調製した。
（２）オルガノイド培養用細胞培養培地の調製
実施例４の（２）と同様の方法を用いて、「ＷＩＦＮＲＡ培地」、「ＷＡｆｍＩＦＮＲＡ培地」、及び「ＷＥＮＲＡＳ培地」を調製した。また、比較例２として、市販のＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｃｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製）に、終濃度１μｇ／ｍＬとなるようにヒト組換えＲ－スポンジン１（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を添加し、終濃度１００ｎｇ／ｍＬとなるようにノギン（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）を添加し、終濃度５００ｎＭとなるようにＡ８３－０１（Ｔｏｃｒｉｓ社製）を添加した。さらに終濃度３００ｎｇ／ｍＬとなるように（１）で調製したＷｎｔ３ａ－アファミン複合体を添加し、終濃度１００ｎｇ／ｍＬとなるようにＩＧＦ１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）を添加し、終濃度５０ｎｇ／ｍＬとなるようにＦＧＦ２（ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）を添加し、終濃度１０μＭとなるようにＳＢ２０２１９０（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を添加した培地（以下、「ＷＡｆｍＩＦＮＲＡＳ培地」と称することがある。）を用意した。
（３）大腸腫瘍由来の上皮腫瘍細胞の培養
実施例１の（２）と同様の方法を用いて、上皮腫瘍細胞を得た。次いで、上皮腫瘍細胞を、２５μＬのマトリゲル（登録商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）と共に、４８ウェルプレートに播種した。上皮腫瘍細胞を播種したウェルに、（２）で調製した「ＷＩＦＮＲＡ培地」、「ＷＡｆｍＩＦＮＲＡ培地」、「ＷＥＮＲＡＳ培地」、及び「ＷＡｆｍＩＦＮＲＡＳ培地」を各２５０μＬずつ添加し、３７℃で酸素濃度２０％にて培養した。培養から、２日毎に培地交換を行った。図６は、３回目の継代（Ｐａｓｓａｇｅ３）の培養開始から６日後（合計培養日数２６日後）、４回目の継代（Ｐａｓｓａｇｅ４）の培養開始からの６日後（合計培養日数３３日後）、及び６回目の継代（Ｐａｓｓａｇｅ６）の培養開始からの６日後（合計培養日数４７日後）の様子を示す画像である。図６において、「Ｗ」は血清を含むＷｎｔ３ａを示し、「ＷＡｆｍ」は無血清のＷｎｔ３ａ－アファミン複合体を示す。
図６から、今回使用した大腸腫瘍由来の上皮腫瘍細胞では、ｐ３８阻害剤であるＳＢ２０２１９０に対し毒性を示し、ＳＢ２０２１９０存在下（「ＷＥＮＲＡＳ培地」、及び「ＷＡｆｍＩＦＮＲＡＳ培地」）では、発育しなかった。一方、ＩＧＦ１及びＦＧＦ２を含む培地（「ＷＩＦＮＲＡ培地」）による培養では、上皮腫瘍細胞によるオルガノイドの形成が見られた。
さらに、今回使用した大腸腫瘍由来の上皮腫瘍細胞では、Ｗｎｔタンパク質及びＲ－スポンジンＷｎｔアゴニストが必須であり、Ｗｎｔ３ａを含む培地（「ＷＩＦＮＲＡ培地」）による培養では、Ｗｎｔ３ａに含まれる血清による増殖阻害が見られ、長期培養することができなかった。一方、無血清のＷｎｔ３ａ－アファミン複合体を含む培地（「ＷＡｆｍＩＦＮＲＡ培地」）による培養では、長期培養することができた。
また、図７は、本実施形態における異なる組成のオルガノイド培養用細胞培養培地でのオルガノイドの形成効率及び長期培養可否を評価した結果を示す表である。図７において、○は、オルガノイドを形成でき、１か月程度の長期培養が可能であることが示し、◎は、オルガノイドを効率よく形成ができ、１か月程度の長期培養が可能であることが示し、◎◎は、オルガノイドを更に効率よく形成ができ、３か月程度の長期培養が可能であることが示す。また、図７において、「Ｎｏｒｍｏｘｉａ」とは、酸素濃度２０％程度での正常酸素培養条件であることを示し、「Ｈｙｐｏｘｉａ」とは、酸素濃度１％程度での低酸素培養条件であることを示す。
図７から、本実施形態のオルガノイド培養用細胞培養培地又は培養方法によれば、ヒトを含む哺乳動物由来の上皮幹細胞、又は上皮腫瘍細胞、或いはそれら細胞のうち少なくともいずれか一方を含む組織、又は従来では培養することができなかった組織について、細胞又は組織の種類を選ばず、オルガノイドを形成でき、さらに、長期培養することができることが示された。
本実施形態のオルガノイド培養用細胞培養培地によれば、ヒトを含む哺乳動物由来の上皮幹細胞、上皮細胞、又は上皮腫瘍細胞、或いはそれら細胞のうち少なくともいずれか一方を含む組織、又は従来では培養することができなかった組織を長期間培養することができる。
また、前記細胞及び前記組織のうち少なくともいずれか一方から高効率でオルガノイドを形成させることができる。
また、本実施形態のオルガノイド培養用細胞培養培地を用いて培養された上皮幹細胞は、長期間分化能を維持することができ、腫瘍発生頻度が極めて低い。
さらに、本実施形態の培養方法により得られたオルガノイドは、再生医療、上皮細胞の基礎医学研究、薬物応答のスクリーニング、疾患由来上皮オルガノイドを用いた創薬研究等に応用することができる。

Claims (17)

  1. 上皮腫瘍細胞、又は上皮腫瘍細胞を含む組織の培養方法であって、
    細胞外マトリクスを調製する細胞外マトリクス調製工程と、
    前記細胞外マトリクス上に上皮腫瘍細胞、又は上皮腫瘍細胞を含む組織を接着させる接着工程と、
    前記接着工程後に、上皮オルガノイド培養用細胞培養培地を添加し、酸素濃度０．５％以上５％以下である低酸素下で、前記上皮腫瘍細胞、又は前記上皮腫瘍細胞を含む組織を培養し、上皮オルガノイドを形成させるオルガノイド形成工程と、を備え、
    前記上皮オルガノイド培養用細胞培養培地が、Ｗｎｔアゴニスト、分裂促進増殖因子、ＢＭＰ阻害剤、ＴＧＦ－β阻害剤、及びｐ３８阻害剤からなる群から選ばれる少なくとも一種を含む、上皮オルガノイド培養方法。
  2. 上皮腫瘍細胞、又は上皮腫瘍細胞を含む組織の培養方法であって、
    細胞外マトリクスを調製する細胞外マトリクス調製工程と、
    前記細胞外マトリクス上に上皮腫瘍細胞、又は上皮腫瘍細胞を含む組織を接着させる接着工程と、
    前記接着工程後に、上皮オルガノイド培養用細胞培養培地を添加し、酸素濃度０．５％以上５％以下である低酸素下で、前記上皮腫瘍細胞、又は前記上皮腫瘍細胞を含む組織を培養し、上皮オルガノイドを形成させるオルガノイド形成工程と、を備え、
    前記上皮オルガノイド培養用細胞培養培地が、インスリン様成長因子１（Ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ１；ＩＧＦ１）、線維芽細胞増殖因子２（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ２；ＦＧＦ２）、及びエピレグリン（Ｅｐｉｒｅｇｕｌｉｎ；ＥＲＥＧ）からなる群から選ばれる少なくとも二種、及び下記ｉ）～ｉｉｉ）の成分のうち少なくとも一種を含み、ＥＧＦ及びｐ３８阻害剤を実質的に含まない、上皮オルガノイド培養方法。
    ｉ）Ｗｎｔアゴニスト
    ｉｉ）骨形成因子（ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ；ＢＭＰ）阻害剤
    ｉｉｉ）形質転換増殖因子－β（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－β；ＴＧＦ－β）阻害剤
  3. 前記上皮オルガノイド培養用細胞培養培地が、ＩＧＦ１及びＦＧＦ２を含む、請求項２に記載の上皮オルガノイド培養方法。
  4. 前記Ｗｎｔアゴニストが、Ｗｎｔタンパク質、Ｒ－スポンジン、及びＧＳＫ－３β阻害剤からなる群から選択される少なくとも一種である請求項１～３のいずれか一項に記載の上皮オルガノイド培養方法。
  5. 前記Ｗｎｔタンパク質がその安定化物質アファミンとの複合体を形成している請求項４に記載の上皮オルガノイド培養方法。
  6. 前記Ｗｎｔアゴニストが、Ｗｎｔタンパク質及びＲ－スポンジンである請求項４又は５に記載の上皮オルガノイド培養方法。
  7. 前記Ｗｎｔタンパク質が、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ９ｂ、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１、及びＷｎｔ１６からなる群から選ばれる少なくとも一種である請求項４～６のいずれか一項に記載の上皮オルガノイド培養方法。
  8. 前記Ｒ－スポンジンが、Ｒ－スポンジン１、Ｒ－スポンジン２、Ｒ－スポンジン３、及びＲ－スポンジン４からなる群から選ばれる少なくとも一種である請求項４～６のいずれか一項に記載の上皮オルガノイド培養方法。
  9. 前記ＢＭＰ阻害剤が、ノギン、グレムリン、コーディン、コーディンドメインを含むコーディン様タンパク質、フォリスタチン、フォリスタチンドメインを含むフォリスタチン関連タンパク質、ＤＡＮ、ＤＡＮシステインノットドメインを含むＤＡＮ様タンパク質、スクレロスチン／ＳＯＳＴ、及びα－２マクログロブリンからなる群から選ばれる少なくとも一種である請求項１～８のいずれか一項に記載の上皮オルガノイド培養方法。
  10. 前記ＴＧＦ－β阻害剤が、Ａ８３－０１、ＳＢ－４３１５４２、ＳＢ－５０５１２４、ＳＢ－５２５３３４、ＳＤ－２０８、ＬＹ－３６４９４、及びＳＪＮ－２５１１からなる群から選ばれる少なくとも一種である請求項１～９のいずれか一項に記載の上皮オルガノイド培養方法。
  11. 前記ＴＧＦ－β阻害剤が、Ａ８３－０１である請求項１０に記載の上皮オルガノイド培養方法。
  12. 前記ＢＭＰ阻害剤がノギンである請求項１～１１のいずれか一項に記載の上皮オルガノイド培養方法。
  13. 前記上皮オルガノイド培養用細胞培養培地が、無血清培地である請求項１～１２のいずれか一項に記載の上皮オルガノイド培養方法。
  14. 請求項１～１３のいずれか一項に記載の上皮オルガノイド培養方法で製造された上皮オルガノイド。
  15. 請求項１３に記載の上皮オルガノイド培養方法で製造された再生医療オルガノイド製剤。
  16. 請求項１４に記載の上皮オルガノイドを使用する、薬物応答スクリーニング方法。
  17. 請求項１４に記載の上皮オルガノイドを使用する、毒物アッセイ方法。
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