JP2024028791A - 上皮細胞培養用培養容器及びその使用 - Google Patents

Abstract

【課題】上皮細胞を平面培養し、頂端膜側と基底膜側の酸素分圧を簡便に制御して、より生体内に近い環境で培養する技術を提供する。【解決手段】上部容器１１０と、前記上部容器の開口部１１１と気密に嵌合する蓋部材１２０と、前記上部容器及び細胞培養培地１３０を収容する下部容器１４０と、を備え、前記上部容器の前記細胞培養培地と接する領域の少なくとも一部は前記細胞培養培地の少なくとも一部の成分を透過し細胞を透過しない膜１１３で構成されており、前記蓋部材の材質は、酸素透過係数が１．０×１０－６ｃｍ３ｃｍ／（ｃｍ２・秒・気圧）以下である、上皮細胞培養用培養容器１００。【選択図】図１

Description

本発明は、上皮細胞培養用培養容器及びその使用に関する。より具体的には、本発明は、上皮細胞培養用培養容器、上皮細胞の培養方法、及び、上皮細胞と嫌気性細菌との共培養物に関する。本願は、２０１９年５月２３日に、日本に出願された特願２０１９－０９６９０５号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。

近年のシークエンス技術の進歩により、腸内細菌の分子遺伝学的な系統分類が進んでいる。また、無菌マウスへの腸内細菌接種により、腸内細菌の機能解析が可能になってきた。しかしながら、多くの腸内細菌は依然として人為的な培養が不可能であり、クローニングができていない。このような技術的制約は、医学生物学的な腸内細菌の理解、及び、商業的な腸内細菌の製造においてボトルネックとなっている。

発明者らは、以前に、腸管上皮細胞の２Ｄオルガノイドに下痢症ウイルスを感染させることにより、ノロウイルス等の下痢症ウイルスを培養する技術を開発した（例えば、特許文献１を参照。）。特許文献１に記載しているように、腸内微生物には、腸管上皮細胞を宿主因子とすることで初めて培養可能となる例が散見される。

国際公開第２０１８／０３８０４２号

動物の腸管内は嫌気状態に保たれており、そこに常在している細菌のほとんどは嫌気条件でのみ生育できる嫌気性細菌である。これらの嫌気性細菌が宿主の腸管上皮細胞へ及ぼす生理機能を検証するためには、腸管上皮細胞を嫌気条件で培養する必要がある。しかしながら、腸管上皮細胞をはじめとする上皮細胞は、嫌気性条件では培養することができない。このため、より生体内に近い環境で上皮細胞を培養する技術を開発する需要がある。そこで、本発明は、上皮細胞を平面培養し、頂端膜側と基底膜側の酸素分圧を簡便に制御して、より生体内に近い環境で培養する技術を提供することを目的とする。

本発明は以下の態様を含む。
［１］上部容器と、前記上部容器の開口部と気密に嵌合する蓋部材と、前記上部容器及び細胞培養培地を収容する下部容器と、を備え、前記上部容器の前記細胞培養培地と接する領域の少なくとも一部は前記細胞培養培地の少なくとも一部の成分を透過し細胞を透過しない膜で構成されており、前記蓋部材の材質は、酸素透過係数が１．０×１０^－６ｃｍ^３ ｃｍ／（ｃｍ^２・秒・気圧）以下である、上皮細胞培養用培養容器。
［２］前記蓋部材又は前記上部容器が、脱酸素剤を保持する脱酸素部を更に備える、［１］に記載の上皮細胞培養用培養容器。
［３］［１］又は［２］に記載の上皮細胞培養用培養容器の前記上部容器の表面を細胞外マトリクスでコートする工程（ａ）と、前記下部容器に細胞培養培地及び前記上部容器を収容する工程（ｂ）と、前記細胞外マトリクス上に上皮細胞を播種する工程（ｃ）と、前記上皮細胞培養用培養容器を培養条件下でインキュベートし、その結果、前記細胞外マトリクス上で前記上皮細胞が２Ｄオルガノイドの層を形成する工程（ｄ）と、前記上部容器の開口部に前記蓋部材を気密に嵌合させる工程（ｅ）と、前記上皮細胞培養用培養容器を培養条件下で更にインキュベートする工程（ｆ）と、を含む、上皮細胞の培養方法。
［４］前記上皮細胞が、立体培養した上皮細胞の３Ｄオルガノイドを単一細胞に分散した細胞である、［３］に記載の培養方法。
［５］前記細胞培養培地が、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ１）、線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）及びＥＧＦ様成長因子からなる群より選択される少なくとも１種、及び、Ｗｎｔアゴニスト、骨形成因子（ＢＭＰ）阻害剤及び形質転換増殖因子－β（ＴＧＦ－β）阻害剤からなる群より選択される少なくとも１種、を含む、［３］又は［４］に記載の培養方法。
［６］前記ＥＧＦ様成長因子がエピレグリン（ＥＲＥＧ）を含む、［５］に記載の培養方法。
［７］前記ＥＧＦ様成長因子が上皮成長因子（ＥＧＦ）を含む、［５］又は［６］に記載の培養方法。
［８］前記Ｗｎｔアゴニストが、Ｗｎｔタンパク質とアファミンとの複合体を含む、［５］～［７］のいずれかに記載の培養方法。
［９］前記工程（ｅ）を低酸素雰囲気下で実施する、［３］～［８］のいずれかに記載の培養方法。
［１０］前記工程（ｄ）の後（ｅ）の前に、前記２Ｄオルガノイドの層が形成された前記上部容器に嫌気性細菌を播種する工程を更に含む、［３］～［９］のいずれかに記載の培養方法。
［１１］上皮細胞の２Ｄオルガイドと嫌気性細菌との共培養物。
［１２］［１０］に記載の培養方法により得られた、［１１］に記載の共培養物。

本発明によれば、上皮細胞を平面培養し、頂端膜側と基底膜側の酸素分圧を簡便に制御して、より生体内に近い環境で培養する技術を提供することができる。

上皮細胞培養用培養容器の一例の構造を示す模式断面図である。 （ａ）～（ｃ）は、上皮細胞培養用培養容器の具体的な一例の写真である。 （ａ）～（ｃ）は、実験例１において培養した上皮細胞の顕微鏡写真である。（ａ）は上部容器の内部及び下部容器の内部の双方を酸素雰囲気下に維持した結果であり、（ｂ）は上部容器の内部及び下部容器の内部の双方を嫌気性条件に維持した結果であり、（ｃ）は上部容器の内部を嫌気性条件に維持し、下部容器の内部を好気性条件に維持した結果である。 （ａ）及び（ｂ）は、実験例２における溶存酸素濃度の測定結果を示すグラフである。（ａ）は、上部容器内の細胞培養培地中の溶存酸素濃度の測定結果を示すグラフであり、（ｂ）は、下部容器内の細胞培養培地中の溶存酸素濃度の測定結果を示すグラフである。 （ａ）～（ｅ）は、実験例３で測定した各マーカー遺伝子の発現量の測定結果を示すグラフである。 （ａ）及び（ｂ）は、実験例３における上皮細胞の切片の免疫染色の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。（ａ）は上部容器の内部及び下部容器の内部の双方を好気性条件に維持した結果であり、（ｂ）は上部容器の内部を嫌気性条件に維持し、下部容器の内部を好気性条件に維持した結果である。 （ａ）及び（ｂ）は、実験例４における上皮細胞の免疫染色の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。 （ａ）及び（ｂ）は、実験例５において、上皮細胞及び嫌気性細菌を共培養した結果を示す顕微鏡写真である。（ａ）は、上部容器の内部を嫌気性条件に維持し、下部容器の内部を好気性条件に維持した結果である。（ｂ）は、上部容器の内部及び下部容器の内部の双方を好気性条件に維持した結果である。 （ａ）～（ｆ）は、実験例６において、上皮細胞及び嫌気性細菌を共培養した結果を示す顕微鏡写真である。 実施例７において、未分化の上皮細胞上及び成熟した上皮細胞上でそれぞれ共培養した、アッカーマンシア・ムシニフィラ（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）の増殖を定量した結果を示すグラフである。

［上皮細胞培養用培養容器］
１実施形態において、本発明は、上部容器と、前記上部容器の開口部と気密に嵌合する蓋部材と、前記上部容器及び細胞培養培地を収容する下部容器と、を備え、前記上部容器の前記細胞培養培地と接する領域の少なくとも一部は前記細胞培養培地の少なくとも一部の成分を透過し細胞を透過しない膜で構成されており、前記蓋部材の材質は、酸素透過係数が１．０×１０^－６ｃｍ^３ ｃｍ／（ｃｍ^２・秒・気圧）以下である、上皮細胞培養用培養容器を提供する。

図１は、本実施形態の上皮細胞培養用培養容器の一例の構造を示す模式断面図である。図１では、後述する培養方法により、上皮細胞を培養している状態を示す。

図１に示すように、上皮細胞培養用培養容器１００は、上部容器１１０と、上部容器１１０の開口部１１１と気密に嵌合する蓋部材１２０と、上部容器１１０及び細胞培養培地１３０を収容する下部容器１４０と、を備え、上部容器１１０の細胞培養培地と接する領域１１２の少なくとも一部は、細胞培養培地１３０の少なくとも一部の成分を透過し細胞１５０を透過しない膜１１３で構成されており、蓋部材１２０の材質は、酸素透過係数が１．０×１０^－６ｃｍ^３ ｃｍ／（ｃｍ^２・秒・気圧）以下である。上部容器１１０に収容する培地１３１は、下部容器１４０に収容する細胞培養培地１３０と同一の培地とすることもできるし、異なる培地とすることもできる。膜１１３の材質は、特に限定されず、例えばポリエステル等が挙げられる。

また、図２（ａ）～（ｃ）は、本実施形態の上皮細胞培養用培養容器の具体的な一例の写真である。図２（ａ）は、蓋部材及び上部容器の写真である。また、開口部に蓋部材を嵌合させた上部容器を下部容器に収容し蓋部材側から撮影した写真を図２（ｂ）に示し、上部容器及び下部容器の側面から撮影した写真を図２（ｃ）に示す。

実施例において後述するように、本実施形態の上皮細胞培養用培養容器により、上皮細胞を平面培養し、頂端膜側と基底膜側の酸素分圧を簡便に制御して、より生体内に近い環境で培養することができる。

なお、上皮細胞は、生体内では、例えば、消化管、呼吸器・気道、表皮等の器官に存在している。そして、上皮細胞の各器官の管腔側の細胞膜は、頂端膜と呼ばれ、血管側の細胞膜は基底膜と呼ばれる。

図１の例では、上皮細胞１５０の頂端膜側１５１は、上部容器１１０の内部空間に面している。また、上皮細胞１５０の基底膜側１５２は、上部容器１１０の表面に対向している。上皮細胞１５０の基底膜側１５２は、膜１１３に対向しているということもできるし、下部容器１４０の底面に対向しているということもできる。

実施例において後述するように、発明者らは、蓋部材１２０を上部容器１１０の開口部１１１に嵌合させた状態で、上部容器１１０の内部で上皮細胞１５０を培養し、上皮細胞１５０がコンフルエントな状態になると、上部容器１１０が隔離された状態になり、上部容器１１０の内部を嫌気性条件で維持することができることが明らかにした。一方、細胞培養培地１３０から、膜１１３を通じて上皮細胞１５０の基底膜側１５２に酸素が供給されるため、上皮細胞１５０は、永続的に生存することができる。

また、実施例において後述するように、発明者らは、嫌気性細菌を上皮細胞１５０の頂端膜側に播種することによって、酸素に触れることなく上皮細胞１５０と接触させることができることを明らかにした。本実施形態の上皮細胞培養用培養容器で上皮細胞と嫌気性細菌とを共培養することにより、嫌気性細菌は、上皮細胞の頂端膜側にアクセスし、上皮細胞が分泌するムコ多糖類等の細胞由来産物（細菌によっては栄養物）と効率的に接触することができる。その結果、上皮細胞を宿主因子として、従来培養することができなかった嫌気性細菌を容易に培養することができる。

したがって、本実施形態の上皮細胞培養用培養容器により、従来大量培養することができなかった嫌気性細菌を大量培養することができる。また、上皮細胞と嫌気性細菌との相互作用の計測、腸内細菌の栄養代謝状態の計測、嫌気性細菌による上皮細胞の遺伝子発現変化の計測等をインビトロで簡便且つ効率的に解析することができる。

本実施形態の上皮細胞培養用培養容器において、蓋部材は酸素を透過しないか、酸素透過係数が小さい材質で構成されていることが必要である。このため、蓋部材の材質としては、酸素透過係数が１．０×１０^－６ｃｍ^３ ｃｍ／（ｃｍ^２・秒・気圧）以下のものを使用する。酸素透過係数は２５℃における値を使用することが好ましい。つまり、蓋部材の材質としては、厚さを１ｃｍに換算した場合に、面積１ｃｍ^２、圧力１気圧、温度２５℃のもとで１秒当たりに透過する酸素の量が１．０×１０^－６ｃｍ^３以下である材質を使用する。

酸素透過係数が１．０×１０^－６ｃｍ^３ ｃｍ／（ｃｍ^２・秒・気圧）以下の材質としては、例えば、ブチルゴム、エチレンプロピレンゴム、パーフルオロエラストマー、スチレンブタジエンゴム、フッ素ゴム、クロロプレンゴム、ニトリルゴム等が挙げられるがこれらに限定されない。

本実施形態の上皮細胞培養用培養容器において、蓋部材１２０又は上部容器１１０が、脱酸素剤を保持する脱酸素部を更に備えていてもよい。

上部容器１１０の内部を嫌気性条件とするため、上部容器１１０の内部の培地の交換、嫌気性細菌の播種、上部容器１１０の開口部への蓋部材１２０の嵌合等を、低酸素雰囲気下で実施することが好ましい。ここで、低酸素雰囲気下とは、雰囲気中の酸素濃度が、例えば１５体積％以下、例えば１０体積％以下、例えば５体積％以下、例えば０．５体積％以下、例えば０．３体積％以下、例えば０．１体積％以下である雰囲気下をいう。このためには、例えば窒素チャンバー等の特殊な装置が必要である。しかしながら、蓋部材１２０又は上部容器１１０が、脱酸素剤を保持する脱酸素部を更に備えていることにより、窒素チャンバーがなくても、蓋部材１２０を上部容器１１０の開口部と気密に嵌合させれば、上部容器１１０の内部の酸素を脱酸素部が吸収又は除去し、上部容器１１０の内部を嫌気性条件にすることができる。

脱酸素剤としては、細胞や細菌の培養に悪影響を及ぼさないものであれば特に限定されず、鉄の酸化を利用して酸素を吸収する薬剤、糖やレダクトン等の酸化反応を利用した有機系の薬剤等を利用することができる。

［上皮細胞の培養方法］
１実施形態において、本発明は、上述した上皮細胞培養用培養容器の前記上部容器の表面を細胞外マトリクスでコートする工程（ａ）と、前記下部容器に細胞培養培地及び前記上部容器を収容する工程（ｂ）と、前記細胞外マトリクス上に上皮細胞を播種する工程（ｃ）と、前記上皮細胞用培養容器を培養条件下でインキュベートし、その結果、前記細胞外マトリクス上で前記上皮細胞が２Ｄオルガノイドの層を形成する工程（ｄ）と、前記上部容器の開口部に前記蓋部材を気密に嵌合させる工程（ｅ）と、前記上皮細胞用培養容器を培養条件下で更にインキュベートする工程（ｆ）と、を含む、上皮細胞の培養方法を提供する。

実施例において後述するように、本実施形態の培養方法により、上皮細胞を平面培養し、頂端膜側と基底膜側の酸素分圧を簡便に制御して、より生体内に近い環境で培養することができる。以下、各工程について説明する。

（工程（ａ））
まず、本工程において、上述した上皮細胞培養用培養容器の前記上部容器の表面を細胞外マトリクスでコートする。これにより、後述する２Ｄオルガノイドを形成しやすくなる。

《細胞外マトリクス》
一般的に、細胞外マトリクス（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍａｔｒｉｘ、ＥＣＭ）とは、生物において細胞の外に存在する超分子構造を意味する。このＥＣＭは、上皮細胞が増殖するための足場となる。ＥＣＭは、様々な多糖、水、エラスチン、糖タンパク質を含む。糖タンパク質としては、例えば、コラーゲン、エンタクチン（ナイドジェン）、フィブロネクチン、ラミニン等が挙げられる。

ＥＣＭとしては、例えばマトリゲル（登録商標、ＢＤバイオサイエンス社）、Ｃｅｌｌｍａｔｒｉｘ（新田ゼラチン）、細胞外マトリクスタンパク質（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、ＰｒｏＮｅｃｔｉｎ（ＳｉｇｍａＺ３７８６６６）等の市販のものを用いることができる。

あるいは、ＥＣＭを調製して用いてもよい。ＥＣＭの調製方法としては、例えば、結合組織細胞を用いる方法等が挙げられる。より具体的には、培養容器内でＥＣＭ産生細胞、例えば、線維芽細胞を培養した後に、これらの細胞を取り出すと、培養容器の表面にＥＣＭがコートされている。

ＥＣＭ産生細胞としては、例えば、主にコラーゲン及びプロテオグリカンを産生する軟骨細胞、主にＩＶ型コラーゲン、ラミニン、間質プロコラーゲン、及びフィブロネクチンを産生する線維芽細胞、主にコラーゲン（Ｉ型、ＩＩＩ型、及びＶ型)、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、ヒアルロン酸、フィブロネクチン、及びテネイシン－Ｃを産生する結腸筋線維芽細胞等が挙げられる。

（工程（ｂ））
本工程において、下部容器に細胞培養培地及び上部容器を収容する。細胞培養培地については後述する。

（工程（ｃ））
本工程において、上部容器の表面にコートした前記細胞外マトリクス上に上皮細胞を播種する。工程（ｂ）及び（ｃ）は、いずれを先に行ってもよい。最終的に、下部容器に細胞培養培地及び上部容器が収容され、上部容器に上皮細胞が播種されればよい。

《上皮細胞》
本明細書において、上皮細胞とは、上皮組織から取得した分化した上皮細胞及び上皮幹細胞を含む細胞である。「上皮幹細胞」とは、長期間の自己複製機能と上皮分化細胞への分化能をもつ細胞を意味し、上皮組織に由来する幹細胞を意味する。上皮組織としては、例えば、角膜、口腔粘膜、皮膚、結膜、膀胱、尿細管、腎臓、消化器官（食道、胃、十二指腸、小腸（空腸及び回腸を含む）、大腸（結腸を含む））、肝臓、胆管、膵臓、乳腺、唾液腺、涙腺、前立腺、毛根、気管、肺、卵管等が挙げられる。上皮細胞は、上述の上皮組織由来の細胞が腫瘍化した上皮腫瘍細胞であってもよい。

本実施形態の上皮細胞の培養方法は、生体内において嫌気性の器官に由来する上皮細胞の培養に用いられることが好ましい。例えば、消化器官（食道、胃、十二指腸、小腸（空腸及び回腸を含む）、大腸（結腸を含む））、肝臓、膵臓に由来する上皮細胞の培養に用いられることが好ましい。

本実施形態の上皮細胞の培養方法において、上皮細胞は、上皮組織から取得した上皮細胞であってもよいが、立体培養した上皮細胞の３Ｄオルガノイドを単一細胞に分散した細胞であることがより好ましい。

本明細書において、「３Ｄオルガノイド」とは、制御した空間内に細胞を高密度に集積させることにより自己組織化した立体的な細胞組織体を意味する。３Ｄオルガノイド中には、幹細胞及び分化した細胞の双方が維持されていることが好ましい。３Ｄオルガノイドの調製方法は特に限定されないが、例えば次のような方法が挙げられる。

まず、上皮細胞を細胞マトリクスに包埋してプレートに播種し静置する。上皮細胞はＬＧＲ５陽性の上皮幹細胞を含むことが好ましい。続いて、細胞播種後、細胞が乾かないうちに細胞培養培地を添加し培養する。細胞培養培地については後述する。培養温度は３０～４０℃が好ましく、３７℃程度がより好ましい。培養時間は用いる細胞によって適宜調製することができる。培養開始から１～２週間程度後に３Ｄオルガノイドが形成されることが一般的である。このようにして、３Ｄオルガノイドを調製することができる。

３Ｄオルガノイドの形成において、低酸素条件下で培養を行ってもよい。低酸素下で培養を行うことにより、３Ｄオルガノイドの形成効率を向上させることができる。低酸素条件下とは、酸素濃度が０．１～１５体積％の条件であることが好ましく、０．３～１０体積％であることがより好ましく、０．５～５体積％であることが更に好ましい。

続いて、得られた３Ｄオルガノイドを単一細胞に分散して、上皮細胞培養用培養容器の上部容器の表面にコートした前記細胞外マトリクス上に播種する。

３Ｄオルガノイドから単一細胞を調製する方法としては、特に限定されず、物理的方法、酵素処理法等が挙げられるが、細胞を傷つけない観点から酵素処理法が好ましい。酵素処理法に用いられる酵素としては、ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、トリプシン、コラゲナーゼ、ディスパーゼＩ等を用いることができる。

（工程（ｄ））
続いて、工程（ｃ）で上皮細胞を播種した上皮細胞用培養容器を培養条件下でインキュベートする。その結果、実施例において後述するように、細胞外マトリクス上で上皮細胞が単層の２Ｄオルガノイドを形成する。

培養条件としては、例えば３７℃環境下が挙げられる。また、上皮細胞用培養容器の周囲の気体の条件としては、空気、低酸素条件等が挙げられる。低酸素条件は上述したものと同様である。

２Ｄオルガノイドとは、３Ｄオルガノイドを構成する細胞と同様の機能を有する細胞が、３次元的にではなく、２次元的に配置されたオルガノイドである。２Ｄオルガノイド中には、幹細胞及び分化した細胞の双方が維持されていることが好ましい。

《細胞培養培地》
細胞培養培地としては、上皮細胞に含まれる幹細胞を未分化状態で維持することができる培地（以下、「拡大培地」という場合がある。）が好ましく用いられる。

このような培地としては、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ１）、線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）及びＥＧＦ様成長因子からなる群より選択される少なくとも１種、及び、Ｗｎｔアゴニスト、骨形成因子（ＢＭＰ）阻害剤及び形質転換増殖因子－β（ＴＧＦ－β）阻害剤からなる群より選択される少なくとも１種を含む培地が挙げられる。細胞培養培地は、ｐ３８阻害剤を更に含んでいてもよい。ＥＧＦ様成長因子としては、上皮成長因子（ＥＧＦ）、エピレグリン（ＥＲＥＧ）、ＨＢＧＦ等が挙げられる。ＷｎｔアゴニストにはＷｎｔタンパク質とアファミンとの複合体も含まれる。

発明者らは、以前に、このような培地により、従来オルガノイドの作製が困難であった組織からオルガノイドを得ることができることを明らかにした。細胞培養培地は無血清であることが好ましい。

《基本培地》
細胞培養培地は、基本培地に上記の成分を添加した培地である。基本培地としては、あらゆる無血清の細胞培養基本培地が含まれる。無血清の細胞培養基本培地としては、例えば、炭酸系の緩衝液でｐＨ７．２～７．６に緩衝化された合成培地等が挙げられる。より具体的には、グルタミン、インスリン、Ｂ２７サプリメント（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、Ｎ－Ａｃｅｔｙｌ－Ｌ－ｃｙｓｔｅｉｎ（和光純薬）、ペニシリン又はストレプトマイシン、トランスフェリンが補充された、アドバンスト－ダルベッコ改変イーグル培地／ハムＦ－１２混合培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ－１２、ＤＭＥＭ／Ｆ１２）が挙げられる。あるいは、ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ １６４０ ｍｅｄｉｕｍ）、アドバンストＲＰＭＩ培地等を基本培地としてもよい。

《ＩＧＦ１》
ＩＧＦ１は、別名ソマトメジンＣとも呼ばれるものである。細胞培養培地に含まれるＩＧＦ１の濃度は、特に限定されないが、５ｎｇ／ｍＬ～１μｇ／ｍＬであることが好ましく、１０ｎｇ／ｍＬ～１μｇ／ｍＬであることがより好ましく、５０ｎｇ／ｍＬ～５００ｎｇ／ｍＬであることが更に好ましい。

《ＦＧＦ２》
ＦＧＦ２は、塩基性の線維芽細胞増殖因子であり、線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）と結合し、血管内皮細胞の増殖促進と筒状構造への組織化、すなわち血管新生を促進する機能を有する。細胞培養培地に含まれるＦＧＦ２の濃度は、特に限定されないが、５ｎｇ／ｍＬ～１μｇ／ｍＬ以下であることが好ましく、１０ｎｇ／ｍＬ～１μｇ／ｍＬ以下であることがより好ましく、５０ｎｇ／ｍＬ～５００ｎｇ／ｍＬ以下であることが更に好ましい。

《ＥＧＦ様成長因子》
ＥＧＦ様成長因子としては、ＥＧＦ、ＥＲＥＧ、ＨＢＧＦ等が挙げられる。細胞培養培地に含まれるＥＧＦの濃度は、特に限定されないが、５ｎｇ／ｍＬ～１μｇ／ｍＬであることが好ましく、１０ｎｇ／ｍＬ～１μｇ／ｍＬであることがより好ましく、５０ｎｇ／ｍＬ～５００ｎｇ／ｍＬであることが更に好ましい。ＥＲＥＧは、チロシンキナーゼ（ＥｒｂＢ）ファミリー受容体（ＥｒｂＢ１～４）のうち、ＥｒｂＢ１及びＥｒｂＢ４に特異的に結合するＥＧＦ様成長因子である。細胞培養培地に含まれるＥＲＥＧの濃度は、特に限定されないが、５ｎｇ／ｍＬ～１μｇ／ｍＬであることが好ましく、１０ｎｇ／ｍＬ～１μｇ／ｍＬであることがより好ましく、５０ｎｇ／ｍＬ～５００ｎｇ／ｍＬであることが更に好ましい。

《ＢＭＰ阻害剤》
ＢＭＰは、二量体リガンドとして二種類の異なる受容体セリン／スレオニンキナーゼ、Ｉ型及びＩＩ型受容体からなる受容体複合体に結合する。ＩＩ型受容体はＩ型受容体をリン酸化し、その結果、この受容体キナーゼが活性化される。このＩ型受容体は、続いて特異的な受容体基質（ＳＭＡＤ）をリン酸化し、その結果、シグナル伝達経路によって転写活性が導かれる。一般的に、ＢＭＰ阻害剤は、例えば、ＢＭＰ受容体へのＢＭＰ分子の結合を阻止又は阻害するものであって、ＢＭＰ活性を中和する複合体を形成するためにＢＭＰ分子に結合する薬剤である。また、ＢＭＰ阻害剤は、例えば、ＢＭＰ受容体と結合し、ＢＭＰ分子の受容体への結合を阻止又は阻害するものであって、アンタゴニスト又は逆アゴニストとして作用する薬剤である。

ＢＭＰ阻害剤は、この阻害剤の非存在下でのＢＭＰ活性レベルと比較して、好ましくは５０％以上、より好ましくは７０％以上、更に好ましくは８０％以上、特に好ましくは、９０％以上の阻害活性を有する。ＢＭＰ阻害活性は、例えばＢＭＰの転写活性を測定することによって、評価することができる。

細胞培養培地に含まれるＢＭＰ阻害剤としては、天然のＢＭＰ結合タンパク質であることが好ましく、例えば、ノギン（Ｎｏｇｇｉｎ）、グレムリン、コーディン（Ｃｈｏｒｄｉｎ）、コーディンドメイン等のコーディン様タンパク質；ホリスタチン（Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ）、ホリスタチンドメイン等のホリスタチン関連タンパク質；ＤＡＮ、ＤＡＮシステイン－ノットドメイン等のＤＡＮ様タンパク質；スクレロスチン／ＳＯＳＴ、デコリン、α－２マクログロブリン等が挙げられる。

ＢＭＰ阻害剤としては、中でも、コーディン様タンパク質又はＤＡＮ様タンパク質が好ましく、コーディン様タンパク質がより好ましい。コーディン様タンパク質としては、ノギンが好ましい。コーディン様タンパク質やＤＡＮ様タンパク質は拡散性タンパク質であり、様々な親和度でＢＭＰ分子に結合し、シグナル伝達受容体へのＢＭＰ分子の接近を阻害することができる。

細胞培養培地に含まれるＢＭＰ阻害剤の濃度は、１０～１００ｎｇ／ｍＬであることが好ましく、２０～１００ｎｇ／ｍＬであることがより好ましく、５０～１００ｎｇ／ｍＬであることが更に好ましい。

《ＴＧＦ－β阻害剤》
形質転換増殖因子－β（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－β；ＴＧＦ－β）は、増殖因子の一種であり、腎臓、骨髄、血小板等ほぼすべての細胞で産生される。ＴＧＦ－βには、５種類のサブタイプ（β１～β５）が存在する。また、ＴＧＦ－βは、骨芽細胞の増殖、並びに、コラーゲンのような結合組織の合成及び増殖を促進し、上皮細胞の増殖や破骨細胞に対しては抑制的に作用することが知られている。一般的に、ＴＧＦ－β阻害剤は、例えば、ＴＧＦ－β受容体へのＴＧＦ－βの結合を阻止又は阻害するものであって、ＴＧＦ－β活性を中和する複合体を形成するためにＴＧＦ－βに結合する薬剤である。また、ＴＧＦ－β阻害剤は、例えば、ＴＧＦ－β受容体と結合し、ＴＧＦ－βの受容体への結合を阻止又は阻害するものであって、アンタゴニスト又は逆アゴニストとして作用する薬剤である。

ＴＧＦ－β阻害剤は、この阻害剤の非存在下でのＴＧＦ－β活性レベルと比較して、好ましくは５０％以上、より好ましくは７０％以上、更に好ましくは８０％以上、特に好ましくは、９０％以上の阻害活性を有する。

細胞培養培地に含まれるＴＧＦ－β阻害剤としては、例えば、Ａ８３－０１（３－（６－メチルピリジン－２－イル）－１－フェニルチオカルバモイル－４－キノリン－４－イルピラゾール）、ＡＬＫ５ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｉ（３－（ピリジン－２－イル）－４－（４－キノニル）－１Ｈ－ピラゾール）、ＬＤＮ１９３１８９（４－（６－（４－（ピペラジン－１－イル）フェニル）ピラゾロ［１，５－ａ］ピリミジン－３－イル）キノリン）、ＳＢ４３１５４２（４－［４－（１，３－ベンゾジオキソール－５－イル）－５－ピリジン‐２‐イル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル］ベンズアミド）、ＳＢ－５０５１２４（２－（５－ベンゾ［１，３］ジオキソール－５－イル－２－ｔｅｒｔ－ブチル－３Ｈ－イミダゾール－４－イル）－６－メチルピリジン塩酸塩水和物）、ＳＤ－２０８（２－（５－クロロ－２－フルオロフェニル）プテリジン－４－イル）ピリジン－４－イル－アミン）、ＳＢ－５２５３３４（６－［２－（１，１－ジメチルエチル）－５－（６－メチル－２－ピリジニル）－１Ｈ－イミダゾール－４－イル］キノキサリン）、ＬＹ－３６４９４７（４－［３－（２－ピリジニル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－キノリン）、ＬＹ２１５７２９９（４－［２－（６－メチル－ピリジン－２－イル）－５，６－ジヒドロ－４Ｈ－ピロロ［１，２－ｂ］ピラゾール－３－イル］－キノリン－６－カルボン酸アミド）、ＴＧＦ－β ＲＩ Ｋｉｎａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＩＩ ６１６４５２（２－（３－（６－メチルピリジン－２－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）－１，５－ナフチリジン）、ＴＧＦ－β ＲＩ Ｋｉｎａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＩＩＩ ６１６４５３（２－（５－ベンゾ［１，３］ジオキソール－４－イル－２－ｔｅｒｔ－ブチル－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）－６－メチルピリジン， ＨＣｌ）、ＴＧＦ－β ＲＩ Ｋｉｎａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＩＸ ６１６４６３（４－（（４－（（２，６－ジメチルピリジン－３－イル）オキシ）ピリジン－２－イル）アミノ）ベンゼンスルホンアミド）、ＴＧＦ－β ＲＩ Ｋｉｎａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＶＩＩ ６１６４５８（１－（２－（（６，７－ジメトキシ－４－キノリル）オキシ）－（４，５－ジメチルフェニル）－１－エタノン）、ＴＧＦ－β ＲＩ Ｋｉｎａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＶＩＩＩ ６１６４５９（６－（２－ｔｅｒｔ－ブチル－５－（６－メチル－ピリジン－２－イル）－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）－キノキサリン）、ＡＰ１２００９（ＴＧＦ－β２アンチセンス化合物「Ｔｒａｂｅｄｅｒｓｅｎ」）、Ｂｅｌａｇｅｎｐｕｍａｔｕｃｅｌ－Ｌ（ＴＧＦ－β２アンチセンス遺伝子修飾同種異系腫瘍細胞ワクチン）、ＣＡＴ－１５２（Ｇｌａｕｃｏｍａ－ｌｅｒｄｅｌｉｍｕｍａｂ（抗－ＴＧＦ－β－２モノクローナル抗体））、ＣＡＴ－１９２（Ｍｅｔｅｌｉｍｕｍａｂ（ＴＧＦβ１を中和するヒトＩｇＧ４モノクローナル抗体）、ＧＣ－１００８（抗-ＴＧＦ－βモノクローナル抗体）等が挙げられる。本実施形態のオルガノイド培養用細胞培養培地に含まれるＴＧＦ－β阻害剤としては、中でも、Ａ８３－０１が好ましい。

細胞培養培地に含まれるＴＧＦ－β阻害剤の濃度は、１００ｎＭ～１０μＭであることが好ましく、５００ｎＭ～５μＭであることがより好ましく、５００ｎＭ～２μＭであることが更に好ましい。

《Ｗｎｔアゴニスト》
本明細書において、「Ｗｎｔアゴニスト」とは、細胞内でＴ－ｃｅｌｌ ｆａｃｔｏｒ（以下、ＴＣＦともいう。）／ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｅｎｈａｎｃｅｒ ｆａｃｔｏｒ（以下、ＬＥＦともいう。）介在性の転写を活性化する薬剤を意味する。Ｗｎｔアゴニストは、Ｗｎｔファミリータンパク質に限定されず、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体ファミリーメンバーに結合して活性化するＷｎｔアゴニスト、細胞内β－カテニン分解の阻害剤、ＴＣＦ／ＬＥＦの活性化物質を包含する。Ｗｎｔアゴニストは、Ｗｎｔタンパク質、Ｒ－スポンジン、及びＧＳＫ－３β阻害剤からなる群から選択される少なくとも１種であることが好ましい。

細胞培養培地に含まれるＷｎｔアゴニストとしては、Ｗｎｔタンパク質とアファミンとの複合体がより好ましく、Ｗｎｔタンパク質とアファミンとの複合体及びＲ－スポンジン（Ｒ－ｓｐｏｎｄｉｎ）の双方が含まれることがより好ましい。

《Ｗｎｔタンパク質》
Ｗｎｔタンパク質としては、特に限定されず、各種生物由来のＷｎｔタンパク質を用いることができる。中でも、哺乳動物由来のＷｎｔタンパク質であることが好ましい。哺乳動物としては、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ、ウサギ等が挙げられる。哺乳動物のＷｎｔタンパク質としては、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ９ｂ、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１、Ｗｎｔ１６等が挙げられる。Ｗｎｔタンパク質は複数種を組み合わせて用いてもよい。

Ｗｎｔタンパク質を製造する方法としては、例えば、Ｗｎｔタンパク質発現細胞を用いて製造する方法等が挙げられる。Ｗｎｔタンパク質発現細胞において、細胞の由来（生物種、培養形態等）は特に限定されず、Ｗｎｔタンパク質を安定発現する細胞であればよく、Ｗｎｔタンパク質を一過性に発現する細胞でもよい。Ｗｎｔタンパク質発現細胞としては、例えば、マウスＷｎｔ３ａを安定発現するＬ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－２６４７）、マウスＷｎｔ５ａを安定発現するＬ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－２８１４）等が挙げられる。また、Ｗｎｔタンパク質発現細胞は、公知の遺伝子組換え技術を用いて作製することができる。すなわち、所望のＷｎｔタンパク質をコードするＤＮＡを公知の発現ベクターに挿入し、得られた発現ベクターを適切な宿主細胞に導入することにより、Ｗｎｔタンパク質発現細胞を作製することができる。所望のＷｎｔタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ等の公知のデータベースから取得することができる。

Ｗｎｔタンパク質発現細胞により発現されるＷｎｔタンパク質は、Ｗｎｔ活性を有する限り、Ｗｎｔタンパク質のフラグメントでもよく、Ｗｎｔタンパク質のアミノ酸配列以外のアミノ酸配列を含むものでもよい。Ｗｎｔタンパク質のアミノ酸配列以外のアミノ酸配列について、特に限定はなく、例えばアフィニティータグのアミノ酸配列等が挙げられる。また、Ｗｎｔタンパク質のアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ等の公知のデータベースから取得できるアミノ酸配列と完全に一致している必要はなく、Ｗｎｔ活性を有する限り、公知のデータベースから取得できるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列であってもよい。

ＧｅｎＢａｎｋ等の公知のデータベースから取得できるＷｎｔタンパク質のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、例えば、公知のデータベースから取得できるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列等が挙げられる。

１～数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列とは、例えば、部位特異的突然変異誘発法等の変異ペプチド作製法等により、欠失、置換若しくは付加できる程度の数（１０個以下が好ましく、７個以下がより好ましく、６個以下が更に好ましい。）のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されていることを意味する。

また、実質的に同一のアミノ酸配列としては、例えば、公知のデータベースから取得できるアミノ酸配列との同一性が、８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９２％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上であるアミノ酸配列等が挙げられる。

《Ｒ－スポンジン》
Ｒ－スポンジンとしては、Ｒ－スポンジン１、Ｒ－スポンジン２、Ｒ－スポンジン３、及びＲ－スポンジン４からなるＲ－スポンジンファミリーが挙げられる。Ｒ－スポンジンファミリーは、分泌タンパク質であり、Ｗｎｔシグナル伝達経路の活性化及び制御に関わることが知られている。細胞培養培地において、Ｒ－スポンジンを複数種組み合わせて用いてもよい。また、Ｒ－スポンジン活性を有する限り、Ｒ－スポンジンのフラグメントを用いてもよく、Ｒ－スポンジンのアミノ酸配列以外のアミノ酸配列を含むものでもよい。

細胞培養培地に含まれるＷｎｔタンパク質の濃度は、５０ｎｇ／ｍＬ以上であることが好ましく、１００ｎｇ／ｍＬ～１０μｇ／ｍＬであることがより好ましく、２００ｎｇ／ｍＬ～１μｇ／ｍＬであることが更に好ましく、３００ｎｇ／ｍＬ～１μｇ／ｍＬであることが特に好ましい。

《ＧＳＫ－３β阻害剤》
ＧＳＫ－３β阻害剤としては、例えば、ＣＨＩＲ－９９０２１（ＣＡＳ番号：２５２９１７－０６－９）、ＣＨＩＲ－９８０１４（ＣＡＳ番号：２５２９３５－９４－７）、リチウム（Ｓｉｇｍａ）、ケンパウロン（ＣＡＳ番号：１４２２７３－２０－９）、６－ブロモインジルビン－３０－アセトキシム、ＳＢ２１６７６３（ＣＡＳ番号：２８０７４４－０９－４）、ＳＢ４１５２８６（ＣＡＳ番号：２６４２１８－２３－７）、ＧＳＫ－３とａｘｉｎとの相互作用を阻止するＦＲＡＴファミリーメンバー及びＦＲＡＴ由来ペプチドを含む。

《ｐ３８阻害剤》
本明細書において、「ｐ３８阻害剤」は、ｐ３８シグナル伝達を直接的又は間接的に負に調節する任意の阻害剤を意味する。一般的に、ｐ３８阻害剤は、例えば、ｐ３８に結合し、且つその活性を低減する。ｐ３８プロテインキナーゼは、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）ファミリーの一部である。ＭＡＰＫは、環境ストレス及び炎症サイトカイン等の細胞外刺激に応答し、遺伝子発現、有糸分裂、分化、増殖、及び細胞生存／アポトーシス等の様々な細胞活性を調節するセリン／スレオニン特異的プロテインキナーゼである。ｐ３８ ＭＡＰＫは、α、β、β２、γ、及びδアイソフォームとして存在する。また、ｐ３８阻害剤は、例えば、少なくとも１つのｐ３８アイソフォームに結合し、且つその活性を低減する薬剤でもある。

ｐ３８阻害剤は、この阻害剤の非存在下でのｐ３８活性レベルと比較して、好ましくは５０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、特に好ましくは、９０％以上の阻害活性を有する。ｐ３８阻害剤による阻害効果は、当業者にとって公知の方法で評価することできる。係る評価系としては、Ｔｈｒ１８０／Ｔｙｒ１８２リン酸化のリン酸化部位特異的抗体検出方法、生化学的組換えキナーゼアッセイ、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ－α）分泌アッセイ、ｐ３８阻害剤用のＤｉｓｃｏｖｅｒＲｘハイスループットスクリーニングプラットフォーム、ｐ３８活性アッセイキット（例えば、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製等）等が挙げられる。

細胞培養培地に含まれるｐ３８阻害剤としては、例えば、ＳＢ－２０２１９０（４－（４－フルオロフェニル）－２－（４－ヒドロキシフェニル）－５－（４－ピリジル）－１Ｈ－イミダゾール）、ＳＢ－２０３５８０（４－［４－（４－フルオロフェニル）－２－［４－（メチルスルフィニル）フェニル］－１Ｈ－イミダゾール－５－イル］ピリジン）、ＶＸ－７０２（６－（Ｎ－カルバモイル－２，６－ジフルオロアニリノ）－２－（２，４－ジフルオロフェニル）ピリジン－３－カルボキシアミド）、ＶＸ－７４５（５－（２，６－ジクロロフェニル）－２－［２，４－ジフルオロフェニル）チオ］－６Ｈ－ピリミド［１，６－ｂ］ピリダジン－６－ワン）、ＰＤ－１６９３１６（４－（４－フルオロフェニル）－２－（４－ニトロフェニル）－５－（４－ピリジル）－１Ｈ－イミダゾール）、ＲＯ－４４０２２５７（６－（２，４－ジフルオロフェノキシ）－２－｛［３－ヒドロキシ－１－（２－ヒドロキシエチル）プロピル］アミノ｝－８－メチルピリド［２，３－Ｄ］ピリミジン－７（８ｈ）－ワン）、ＢＩＲＢ－７９６（１－［５－ｔｅｒｔ－ブチル－２－（４－メチルフェニル）ピラゾール－３－イル］－３－［４－（２－モルフォリン－４－イレトキシ）ナフタレン－１－イル］ウレア）等が挙げられる。

細胞培養培地に含まれるｐ３８阻害剤の濃度は、５０ｎＭ以上１００μＭ以下であることが好ましく、１００ｎＭ以上５０μＭ以下であることがより好ましく、１００ｎＭ以上１０μＭ以下であることがさらに好ましい。幹細胞の培養中、２日ごとにｐ３８阻害剤を培養培地に添加することが好ましく、４日ごとに培養培地を新鮮なものに交換することが好ましい。

《アファミン》
アファミンは、アルブミンファミリーに属する糖タンパク質であり、血液又は体液中に存在することが知られている。血清には、当該血清を採取した動物由来のアファミンが含まれている。血清中にはアファミン以外の不純物等を含むため、細胞培養培地は、血清を含まず、アファミンを単独で含むことが好ましい。

アファミンの由来は特に限定されず、各種生物由来のアファミンを用いることができる。中でも、哺乳動物由来のアファミンであることが好ましい。主な哺乳動物のアファミンのアミノ酸配列及びこれをコードする遺伝子の塩基配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ等の公知のデータベースから取得することができる。例えば、ＧｅｎＢａｎｋにおいて、ヒトアファミンのアミノ酸配列はＡＡＡ２１６１２、これをコードする遺伝子の塩基配列はＬ３２１４０のアクセッション番号で登録されており、ウシアファミンのアミノ酸配列はＤＡＡ２８５６９、これをコードする遺伝子の塩基配列はＧＪ０６０９６８のアクセッション番号で登録されている。

細胞培養培地に含まれるアファミンは、血清等に含まれる天然のアファミンを公知の方法で精製したものであってもよく、遺伝子組換えアファミンであってもよい。

Ｗｎｔタンパク質は、特定のセリン残基が脂肪酸（パルミトレイン酸）で修飾されているため、強い疎水性を有する。そのため、Ｗｎｔタンパク質は、水溶液中では凝集又は変性しやすいため、精製及び保存が非常に難しいことが広く知られている。一方、この特定のセリン残基の脂肪酸による修飾は、Ｗｎｔタンパク質の生理活性に必須であり、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体ファミリーメンバーとの結合に関与することが報告されている。また、水溶液中において、Ｗｎｔタンパク質がアファミンと１対１で結合し複合体を形成し、高い生理活性を保ちながら、可溶化する知見もある。

そこで、Ｗｎｔタンパク質及びアファミンの両方を発現する細胞を培養する方法により、Ｗｎｔタンパク質－アファミン複合体を製造してもよく、Ｗｎｔタンパク質発現細胞とアファミン発現細胞を共培養する方法により、Ｗｎｔタンパク質－アファミン複合体を製造してもよい。

細胞培養培地に含まれるアファミンの濃度は、特に限定されないが、５０ｎｇ／ｍＬ～１０μｇ／ｍＬであることが好ましく、１００ｎｇ／ｍＬ～１μｇ／ｍＬであることがより好ましく、３００μｇ／ｍＬ～１μｇ／ｍＬであることが更に好ましい。

《その他の成分》
本実施形態のオルガノイド培養用細胞培養培地は、さらに、Ｒｏｃｋ（Ｒｈｏ－キナーゼ）阻害剤を含んでいてもよい。Ｒｏｃｋ阻害剤としては、例えば、Ｙ－２７６３２（（Ｒ）－（＋）－トランス－４－（１－アミノエチル）－Ｎ－（４－ピリジル）シクロヘキサンカルボキサミド二塩酸塩一水和物）、ファスジル（ＨＡ１０７７）（５－（１，４－ジアゼパン－１－イルスルホニル）イソキノリン）、Ｈ－１１５２（（Ｓ）－（＋）－２－メチル－１－［（４－メチル－５－イソキノリニル）スルホニル］－ヘキサヒドロ－１Ｈ－１，４－ジアゼピン二塩酸塩）等が挙げられる。Ｒｏｃｋ阻害剤として、Ｙ－２７６３２を用いる場合は、単一細胞に分散された上皮細胞の培養の最初の２日間に添加することが好ましい。細胞培養培地に含まれるＹ－２７６３２の濃度は約１０μＭであることが好ましい。

細胞培養培地は、更にガストリン（又はＬｅｕ１５－ガストリン等の適切な代替物）が添加されていてもよい。細胞培養培地に含まれるガストリン（又は適切な代替物）の濃度は、１ｎｇ／ｍＬ～１０μｇ／ｍＬであることが好ましく、１ｎｇ／ｍＬ～１μｇ／ｍＬであることがより好ましく、５～１００ｎｇ／ｍＬであることが更に好ましい。

細胞培養培地は、さらに、少なくとも１種のアミノ酸を含んでもよい。アミノ酸としては、例えば、Ｌ－アラニン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－システイン、Ｌ－シスチン、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－グルタミン、Ｌ－グリシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－リジン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン、Ｌ－バリン、これらの組み合わせ等が挙げられる。細胞培養培地に含まれるＬ－グルタミンの濃度は０．０５～１ｇ／Ｌであることが好ましく、０．１～０．７５ｇ／Ｌであることがより好ましい。細胞培養培地に含まれるその他のアミノ酸は、０．００１～１ｇ／Ｌであることが好ましく、０．０１～０．１５ｇ／Ｌであることがより好ましい。

細胞培養培地は、更に、少なくとも１種のビタミンを含んでいてもよい。ビタミンとしては、例えば、チアミン（ビタミンＢ１）、リボフラビン（ビタミンＢ２）、ナイアシン（ビタミンＢ３）、Ｄ－パントテン酸カルシウム（ビタミンＢ５）、ピリドキサール／ピリドキサミン／ピリドキシン（ビタミンＢ６）、葉酸（ビタミンＢ９）、シアノコバラミン（ビタミンＢ１２）、アスコルビン酸（ビタミンＣ）、カルシフェロール（ビタミンＤ２）、ＤＬ－α－トコフェロール（ビタミンＥ）、ビオチン（ビタミンＨ）、メナジオン（ビタミンＫ）等が挙げられる。

細胞培養培地は、更に、少なくとも１種の無機塩を含んでいてもよい。無機塩は、細胞の浸透圧平衡の維持を助け、また、膜電位の調節を助ける機能を有する。無機塩の具体例としては、カルシウム、銅、鉄、マグネシウム、カリウム、ナトリウム、亜鉛の塩が挙げられる。塩は、通常、塩化物、リン酸塩、硫酸塩、硝酸塩、及び重炭酸塩の形で用いられる。さらに具体的な塩には、ＣａＣｌ_２、ＣｕＳＯ_４－５Ｈ_２Ｏ、Ｆｅ（ＮＯ_３）－９Ｈ_２Ｏ、ＦｅＳＯ_４－７Ｈ_２Ｏ、ＭｇＣｌ、ＭｇＳＯ_４、ＫＣｌ、ＮａＨＣＯ_３、ＮａＣｌ、Ｎａ_２ＨＰＯ_４、Ｎａ_２ＨＰＯ_４－Ｈ_２Ｏ、ＺｎＳＯ_４－７Ｈ_２Ｏ等が挙げられる。

細胞培養培地は、更に、少なくとも１種の炭素エネルギー源となり得る糖を含んでいてもよい。糖としては、例えば、グルコース、ガラクトース、マルトース、フルクトース等が挙げられる。中でも、グルコースが好ましく、Ｄ－グルコース（デキストロース）が特に好ましい。細胞培養培地に含まれる糖の濃度は、１～１０ｇ／Ｌであることが好ましい。

細胞培養培地は、更に、少なくとも１種の微量元素を含んでいてもよい。微量元素としては、例えば、バリウム、ブロミウム、コバルト、ヨウ素、マンガン、クロム、銅、ニッケル、セレン、バナジウム、チタン、ゲルマニウム、モリブデン、ケイ素、鉄、フッ素、銀、ルビジウム、スズ、ジルコニウム、カドミウム、亜鉛、アルミニウム、これらのイオン等が挙げられる。

細胞培養培地は、更に、少なくとも１種の付加的な薬剤を含んでいてもよい。薬剤としては、幹細胞培養を改善することが報告されている栄養素又は増殖因子、例えば、コレステロール、トランスフェリン、アルブミン、インスリン、プロゲステロン、プトレシン、亜セレン酸塩等が挙げられる。

（工程（ｅ））
続いて、本工程において、上部容器の開口部に前記蓋部材を気密に嵌合させる。本工程は、工程（ｃ）の後であればいつ行ってもよい。例えば、工程（ｄ）の後に行ってもよい。実施例において後述するように、工程（ｄ）において、上皮細胞がコンフルエントな２Ｄオルガノイドの層を形成した後に本工程を行った場合、上部容器が隔離される。この場合、本工程を低酸素雰囲気下で実施すれば、上部容器の内部を嫌気性条件に維持することができる。

本工程を低酸素雰囲気下で実施する方法としては、例えば窒素チャンバーの中で本工程を実施すること等が挙げられる。

また、窒素チャンバーを用いなくても、例えば、蓋部材又は上部容器が、脱酸素剤を保持する脱酸素部を更に備えている場合、脱酸素剤が上部容器の内部の酸素を吸収又は除去し、上部容器の内部を速やかに嫌気性条件にすることができる。

あるいは、窒素チャンバーを用いず、蓋部材又は上部容器が脱酸素部を備えていない場合であっても、上皮細胞が上部容器内の酸素を消費した後は、上部容器の内部が嫌気性条件（低酸素状態）に維持されることになる。

また、上皮細胞がコンフルエントな２Ｄオルガノイドの層を形成する前に上部容器の開口部に前記蓋部材を気密に嵌合させて、上皮細胞培養用培養容器を好気性条件下でインキュベートした場合、上部容器の一部に配置された、細胞培養培地の少なくとも一部の成分を透過し細胞を透過しない膜を通じて酸素が上部容器内に供給されるため、蓋部材を嵌合させた直後は上部容器の内部を嫌気性条件にすることはできない。

しかしながら、このような場合であっても、上皮細胞が増殖して、上部容器内でコンフルエントな２Ｄオルガノイドの層を形成した後は、上部容器が隔離される。更に、上皮細胞が上部容器内の酸素を消費した後は、上部容器の内部が低酸素状態に維持されることになる。

また、工程（ｄ）の後（ｅ）の前に、２Ｄオルガノイドの層が形成された上部容器に嫌気性細菌を播種する工程を更に含んでいてもよい。

工程（ｄ）で上皮細胞がコンフルエントな２Ｄオルガノイドの層を形成した後は、上部容器の内部を嫌気性条件に維持することができる。したがって、実施例において後述するように、嫌気性細菌を上皮細胞の頂端膜側に播種することによって、酸素に触れることなく上皮細胞と接触させることができる。この結果、上皮細胞と嫌気性細菌とを共培養することができる。この場合、本実施形態の上皮細胞の培養方法は、上皮細胞と嫌気性細菌とを共培養する方法であるということができる。

また、嫌気性細菌を播種する時に、上部容器の内部の培地を低酸素状態にした細菌用培地に交換してもよい。実施例において後述するように、下部容器に細胞培養用培地を収容していれば、上部容器の内部の培地を細菌培養培地に交換しても、上皮細胞を維持することができる。細菌培養培地としては、変法ＧＡＭブイヨン（ニッスイ社）、強化クロストリジウム培地、ＢＨＩ培地、ＢＬ培地、ＬＢ培地、ＥＧ培地等が挙げられる。

嫌気性細菌は、従来培養することが困難であった細菌であってもよい。嫌気性細菌は、上皮細胞を宿主因子とするものであることが好ましい。嫌気性細菌としては、特に限定されず、クロストリジウム目、バクテロイデス目、ビフィドバクテリウム目、ウェルコミクロビウム目、デスルフォビブリオ目等に属する細菌を用いることができる。

（工程（ｆ））
本工程において、上部容器の開口部に蓋部材を気密に嵌合させた上皮細胞用培養容器を培養条件下で更にインキュベートする。培養条件としては、工程（ｄ）における培養条件と同様の条件が挙げられる。

また、本工程において、下部容器に収容する細胞培養培地を、上皮細胞に含まれる幹細胞を未分化状態で維持することができる培地（以下、「拡大培地」という場合がある。）から、幹細胞の分化を誘導する培地（以下、「分化培地」という場合がある。）に交換し、上皮細胞の分化を誘導してもよい。

（上皮細胞と嫌気性細菌との共培養物）
１実施形態において、本発明は、上皮細胞の２Ｄオルガイドと嫌気性細菌との共培養物を提供する。従来、上皮細胞を嫌気性条件下で培養することはできなかった。このため、従来、上皮細胞の２Ｄオルガノイドと嫌気性細菌との共培養物を製造することはできなかった。

本実施形態の共培養物は、上述した上皮細胞の培養方法により得られたものであってもよい。

本実施形態の共培養物により、上皮細胞と嫌気性細菌との相互作用の計測、腸内細菌の栄養代謝状態の計測、嫌気性細菌による上皮細胞の遺伝子発現変化の計測、上皮細胞と嫌気性細菌との相互作用に変化を及ぼす薬物のスクリーニング等を、インビトロで簡便且つ効率的に解析することができる。

次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

［実験例１］
（上皮細胞の培養）
図２（ａ）～（ｃ）に写真を示す上皮細胞培養用培養容器を用いて上皮細胞を培養した。上部容器としては、市販のセルカルチャーインサート（商品名「ＴｈｉｎＣｅｒｔ」、Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ社）又はトランズウェル（商品名「Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ」、コーニング社）を使用した。また、蓋部材は自作した。蓋部材の材質としては、ブチルゴムを使用した。ブチルゴムの酸素透過係数は、０．９９×１０^－８ｃｍ^３ ｃｍ／（ｃｍ^２・秒・気圧）である。また、下部容器としては、市販の１２ウェルプレート又は４８ウェルプレートを使用した。

《細胞培養培地の調製》
細胞培養培地として、市販のＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｃｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製）に、終濃度１μｇ／ｍＬとなるようにヒト組換えＲ－スポンジン１（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を添加し、終濃度１００ｎｇ／ｍＬとなるようにノギン（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）を添加し、終濃度５００ｎＭとなるようにＡ８３－０１（Ｔｏｃｒｉｓ社製）を添加し、Ｗｎｔ３ａの終濃度が３００ｎｇ／ｍＬとなるように血清含有培地で培養したＷ－Ｗｎｔ３ａ／ＨＥＫ由来の培養上清を添加し、終濃度１００ｎｇ／ｍＬとなるようにＩＧＦ１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）を添加し、終濃度５０ｎｇ／ｍＬとなるようにＦＧＦ２（ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）を添加し、終濃度５０ｎｇ／ｍＬとなるようにマウス組換えＥＧＦ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を添加し、終濃度１０μＭとなるようにＹ－２７６３２（Ｒｏｃｋ阻害剤、和光純薬社製）を添加した培地を用意した。以下、この培地をＭＨＣＯ（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｈｕｍａｎ ｃｏｌｏｎｉｃ ｏｒｇａｎｏｉｄ）培地という場合がある。

《３Ｄオルガノイドの調製》
慶應義塾大学医学部倫理委員会で承認された倫理研究計画に基づき、説明と同意を得られた消化管腫瘍患者より、消化管腫瘍から少なくとも５ｃｍ以上離れた部分を正常粘膜として採取した。採取した組織はＥＤＴＡ又はリベラーゼＴＨにより腸上皮細胞を抽出し、マトリゲル（登録商標）に包埋した。続いて、腸上皮細胞を２５μＬのマトリゲル（登録商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）と共に、４８ウェルプレートに播種した。続いて、上述した細胞培養培地をウェルに１００μＬずつ添加し、３７℃で培養した。培養開始から２日毎に培地交換を行い、７日間培養し、３Ｄオルガノイドを得た。

《上皮細胞培養用培養容器の準備》
図２（ａ）～（ｃ）に写真を示す上皮細胞培養用培養容器の上部容器にＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地で希釈した５％マトリゲル（登録商標）、又は、０．１Ｍ塩酸で１０倍希釈した１０％Ｃｅｌｌｍａｔｒｉｘ ｔｙｐｅ Ｉ－Ｃ、 ｔｙｐｅ ＩＶ（新田ゼラチン）を、２４ウェルサイズの場合には５０μＬ、１２ウェルサイズの場合には２００μＬ添加し、３７℃で３０分以上インキュベートし、クリーンベンチ内で３０～６０分間乾燥させた。その後、上部容器をＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地で３回洗い、以下の細胞培養に使用した。

《２Ｄオルガノイドの調製》
上述した３ＤオルガノイドをＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて崩し、単一細胞にした。続いて、得られた単一細胞を上述したＭＨＣＯ培地に懸濁し、２４ウェルサイズの場合には２～４×１０^５個の細胞を上部容器に播種し、コンフルエントになるまで３７℃の通常酸素存在下のインキュベーター内で３～５日間培養した。複数の上皮細胞培養用培養容器に同様に細胞を播種した。

続いて、コンフルエントになった上皮細胞培養用培養容器の１つを通常酸素存在条件でインキュベートした。

また、コンフルエントになった上皮細胞培養用培養容器の１つを酸素非存在下となるように嫌気チャンバー内でインキュベートした。この結果、上部容器の内部及び下部容器の内部の双方が嫌気性条件に維持された。

また、コンフルエントになった上皮細胞培養用培養容器の１つの上部容器の培地を、予め嫌気チャンバー内で嫌気状態にした細胞培養培地に交換し、上部容器の開口部に蓋部材を嵌合させ、通常の酸素雰囲気下でインキュベートした。この結果、上部容器の内部は嫌気性条件に維持され、下部容器の内部は好気性条件に維持された。上部容器の内部は上皮細胞の頂端膜側に面し、下部容器の内部は上皮細胞の基底膜側に面する。

図３（ａ）～（ｃ）は、各上皮細胞培養用培養容器内の上皮細胞を電子顕微鏡で撮影した代表的な写真である。スケールバーは５０μｍである。図３（ａ）中、「好気条件」は上部容器の内部及び下部容器の内部の双方を酸素雰囲気下に維持した結果であることを示し、図３（ｂ）中、「嫌気条件」は、上部容器の内部及び下部容器の内部の双方を嫌気性条件に維持した結果であることを示し、図３（ｃ）中、「嫌気／好気条件」は、上部容器の内部を嫌気性条件に維持し、下部容器の内部を好気性条件に維持した結果であることを示す。図３（ａ）及び（ｃ）は、培養開始から５日後に撮影したものであり、図３（ｂ）は培養開始から６時間後に撮影したものである。

その結果、図３（ａ）に示すように、好気条件下では上皮細胞の生存を維持することができた。これに対し、図３（ｂ）に示すように、上皮細胞の頂端膜側及び基底膜側の双方を嫌気性条件に維持すると、細胞の生存を維持することができず、一部死滅して剥離した状態が観察された。一方、図３（ｃ）に示すように、上皮細胞の頂端膜側を嫌気性条件に維持しても、基底膜側を好気性条件に維持すれば、基底膜側から供給される酸素によって上皮細胞が生存を維持することができることが明らかとなった。また、後述するように、図３（ｃ）では、成熟した２Ｄオルガノイドが形成されていることが確認された。

［実験例２］
（酸素濃度の測定）
実験例１と同様にして、図２（ａ）～（ｃ）に写真を示す上皮細胞培養用培養容器で腸上皮細胞を培養した。上部容器の内部は嫌気性条件に維持し、下部容器の内部は好気性条件に維持した。また、比較のために、上皮細胞を播種しなかった点以外は、実験例１と同様の操作を行った試料、及び蓋部材を上部容器の開口部に嵌合させずに上皮細胞を培養した試料も用意した。

続いて、上皮細胞の上部容器への播種から３日後に、各群の試料について、上部容器内の細胞培養培地中の溶存酸素濃度及び下部容器内の細胞培養培地内の溶存酸素濃度を測定した。溶存酸素濃度の測定には、市販の溶存酸素計（ニードル式・非破壊酸素計、製品名「Ｍｉｃｒｏｘ４／Ｍｉｃｒｏｘ４ ｔｒａｃｅ」、ＰｒｅＳｅｎｓ社）を使用した。

図４（ａ）及び（ｂ）は、溶存酸素濃度の測定結果を示すグラフである。図４（ａ）は、上部容器内の細胞培養培地中の溶存酸素濃度の測定結果を示すグラフであり、図４（ｂ）は、下部容器内の細胞培養培地中の溶存酸素濃度の測定結果を示すグラフである。図４（ａ）及び（ｂ）中、「ｔｏｐ」は上部容器内の結果であることを示し、「ｂｏｔｔｏｍ」は下部容器内の結果であることを示し、「ｎｏ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ ＋ ａｅｒｏｂｉｃ」は上皮細胞を播種しなかった上皮細胞培養用培養容器の結果であることを示し、「ａｅｒｏｂｉｃ」は上皮細胞を播種し、蓋部材を上部容器の開口部に嵌合させなかった上皮細胞培養用培養容器の結果であることを示し、「ｈｅｍｉ－ａｎａｅｒｏｂｉｃ」は上皮細胞を播種し、蓋部材を上部容器の開口部に嵌合させた上皮細胞培養用培養容器の結果であることを示す。また、「＊＊＊＊」はｐ＜０．０００１で有意差が存在することを示し、「ｎｓ」は有意差が存在しないことを示す。

その結果、上皮細胞を播種し、蓋部材を上部容器の開口部に嵌合させた上皮細胞培養用培養容器では、上部容器内の細胞培養培地中の溶存酸素濃度が低く、嫌気性条件に維持されていることが確認された。一方、下部容器内の細胞培養培地内の溶存酸素濃度は高く、好気性条件に維持されていることが確認された。また、上皮細胞を播種しなかった場合には、上部容器内の細胞培養培地中の溶存酸素濃度は高く、嫌気性条件を維持することができないことが確認された。また、上皮細胞を播種し、蓋部材を上部容器の開口部に嵌合させなかった場合においても、上部容器内の細胞培養培地中の溶存酸素濃度は高く、嫌気性条件を維持することができないことが確認された。

以上の結果から、蓋部材を上部容器の開口部に嵌合させた場合、上部容器内の上皮細胞が２Ｄオルガノイドを形成してコンフルエントな状態になると、上部容器の内部が隔離され、嫌気性条件を維持することができることが明らかとなった。

［実験例３］
（２Ｄオルガノイドの検討１）
図２（ａ）～（ｃ）に写真を示す上皮細胞培養用培養容器を用いて、上部容器内を嫌気性条件に保ったまま腸上皮細胞を培養し、上皮幹細胞の維持が可能か否か、分化細胞の維持が可能か否かについて検討した。

まず、実験例１と同様にして、上部容器の表面にコンフルエントな２Ｄオルガノイドの層を形成した。続いて、嫌気チャンバー内で上部容器内の培地を交換した。同様の上皮細胞培養用培養容器を２組用意し、一方の上皮細胞培養用培養容器では、蓋部材を上部容器の開口部に嵌合し、もう一方には、蓋部材を上部容器の開口部に嵌合させなかった。これらの細胞を、３７℃、空気環境下でインキュベートした。この結果、上部容器の内部は嫌気性条件に維持され、下部容器の内部は好気性条件に維持された。

続いて、培地交換から３日後に、各上皮細胞を回収し、定量的ＲＴ－ＰＣＲにより、幹細胞マーカー遺伝子及び分化マーカー遺伝子の発現量を測定した。幹細胞マーカーとしては、ＬＧＲ５遺伝子、ＰＴＫ７遺伝子の発現量を測定した。また、分化マーカーとしては、杯細胞のマーカーであるＭＵＣ２遺伝子、神経内分泌細胞のマーカーであるＣＨＧＡ遺伝子、大腸細胞のマーカーであるＡＱＰ８遺伝子の発現量を測定した。

図５（ａ）～（ｅ）は、各遺伝子の発現量の測定結果を示すグラフである。図５（ａ）～（ｅ）中、縦軸は、各遺伝子の発現量の相対値を示し、「ａｅｒｏｂｉｃ」は蓋部材を上部容器の開口部に嵌合させないで培養した結果であることを示し、「ｈｅｍｉ－ａｎａｅｒｏｂｉｃ」は蓋部材を上部容器の開口部に嵌合させて培養した結果であることを示し、「ｎｓ」は有意差が存在しないことを示す。

また、図５（ａ）はＬＧＲ５遺伝子のｍＲＮＡの発現量を測定した結果を示すグラフであり、図５（ｂ）はＰＴＫ７遺伝子のｍＲＮＡの発現量を測定した結果を示すグラフであり、図５（ｃ）はＭＵＣ２遺伝子のｍＲＮＡの発現量を測定した結果を示すグラフであり、図５（ｄ）はＣＨＧＡ遺伝子のｍＲＮＡの発現量を測定した結果を示すグラフであり、図５（ｅ）はＡＱＰ８遺伝子のｍＲＮＡの発現量を測定した結果を示すグラフである。

その結果、蓋部材を上部容器の開口部に嵌合させて上皮細胞の頂端膜側を嫌気性条件に維持し、基底膜側を好気性条件に維持した場合においても、蓋部材を上部容器の開口部に嵌合させないで好気条件で培養した場合と同様に、上皮幹細胞のみならず、大腸上皮を構成する全ての機能性分化細胞を維持して培養できることが明らかになった。

図６（ａ）及び（ｂ）は、上記の上皮細胞の切片を、杯細胞のマーカーであるＭＵＣ２タンパク質に対する抗体で染色した蛍光顕微鏡写真である。対照としてファロイジンでＦ－アクチンを染色した。スケールバーは２０μｍである。図６（ａ）及び（ｂ）中、向かって上側が上端膜側であり、向かって下側が基底膜側である。また、図６（ａ）中、「好気条件」は、上部容器の内部及び下部容器の内部の双方を好気性条件に維持した結果であることを示し、図６（ｂ）中、「嫌気／好気条件」は、上部容器の内部を嫌気性条件に維持し、下部容器の内部を好気性条件に維持した結果であることを示す。

図６（ａ）の示す免疫染色の結果から、好気条件における２Ｄオルガノイド培養では、生体の腸管内同様に杯細胞から産出されるムチンによって層構造が形成されることが明らかとなった。また図６（ｂ）の示す免疫染色の結果から、上皮細胞の頂端膜側を嫌気性条件に維持し、基底膜側を好気性条件に維持した場合においても，好気条件と同様に杯細胞からのムチンによって形成される層構造が観察されることが明らかとなった。

［実験例４］
（２Ｄオルガノイドの検討２）
図２（ａ）～（ｃ）に写真を示す上皮細胞培養用培養容器で腸上皮細胞を培養し、蓋部材を上部容器の開口部に嵌合させて上皮細胞の頂端膜側を嫌気性条件に維持し、基底膜側を好気性条件に維持した場合においても、上皮細胞の維持が可能か否か、分化細胞の維持が可能か否かについて検討した。

まず、実験例１と同様にして、上部容器内にコンフルエントな２Ｄオルガノイドの層を形成した。続いて、窒素チャンバー内で上部容器内の培地を交換した。同様の上皮細胞培養用培養容器を２組用意し、一方の上皮細胞培養用培養容器では、蓋部材を上部容器の開口部に嵌合し、もう一方には、蓋部材を上部容器の開口部に嵌合させなかった。続いて、これらの細胞を、３７℃、空気環境下でインキュベートした。この結果、蓋部材を上部容器の開口部に嵌合した場合には、上部容器の内部は嫌気性条件に維持され、下部容器の内部は好気性条件に維持された。

続いて、培地交換から３日後に、各上皮細胞を免疫染色し、蛍光顕微鏡で観察した。具体的には、上皮細胞の頂端極性を検証するために、タイトジャンクションのマーカーであるＺＯ－１タンパク質に対する抗体、アドへレンスジャンクションのマーカーであるＣＤＨ１タンパク質に対する抗体、杯細胞のマーカーであるＭＵＣ２タンパク質に対する抗体、神経内分泌細胞のマーカーであるＣＨＧＡタンパク質に対する抗体で各群の細胞を染色した。また、対照としてファロイジンでＦ－アクチンを染色した。

図７（ａ）及び（ｂ）は、免疫染色の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。スケールバーは５０μｍである。図７（ａ）中、「好気条件」は、上部容器の内部及び下部容器の内部の双方を好気性条件に維持した結果であることを示し、図７（ｂ）中、「嫌気／好気条件」は、上部容器の内部を嫌気性条件に維持し、下部容器の内部を好気性条件に維持した結果であることを示す。

その結果、蓋部材を上部容器の開口部に嵌合させて上皮細胞の頂端膜側を嫌気性条件に維持し、基底膜側を好気性条件に維持した場合においても、蓋部材を上部容器の開口部に嵌合させないで好気条件で培養した場合と同様に、タイトジャンクションやアドへレンスジャンクションが正常に形成されており、頂端極性も保たれていることが明らかとなった。また、上皮細胞の頂端側のみ嫌気条件に維持した場合においても、上皮幹細胞から機能性分化細胞である杯細胞や神経内分泌細胞を分化させることができることが明らかとなった。

［実験例５］
（上皮細胞と嫌気性細菌との共培養１）
実験例１と同様にして、図２（ａ）～（ｃ）に写真を示す上皮細胞培養用培養容器で腸上皮細胞を培養し、上部容器の表面にコンフルエントな２Ｄオルガノイドの層を形成した。続いて、上皮細胞の上部容器への播種から５日後に、嫌気チャンバー内で、上部容器内の培地を捨て、嫌気状態にした細胞培養培地に懸濁したビフィドバクテリウム・アドレッセンティス（Ｂ．ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）を播種した。ビフィドバクテリウム・アドレッセンティスは偏性嫌気性細菌である。

ビフィドバクテリウム・アドレッセンティスを播種した上皮細胞培養用培養容器を２組用意し、一方の上部容器の開口部に蓋部材を嵌合させた。また、一方の上部容器の開口部には蓋部材を嵌合させず、開口したままにした。続いて、３７℃、空気環境下でインキュベートした。この結果、前者では、上部容器の内部が嫌気性条件に維持され、下部容器の内部は好気性条件に維持された。また、後者では、上部容器の内部及び下部容器の内部の双方が好気性条件に維持された。

図８（ａ）及び（ｂ）は、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティスの播種から１日後の顕微鏡写真である。スケールバーは５０μｍである。図８（ａ）中、「ａｎａｅｒｏｂｉｃ／ａｅｒｏｂｉｃ」は、上部容器の内部を嫌気性条件に維持し、下部容器の内部を好気性条件に維持した結果であることを示す。また、図８（ｂ）中、「ａｅｒｏｂｉｃ／ａｅｒｏｂｉｃ」は、上部容器の内部及び下部容器の内部の双方を好気性条件に維持した結果であることを示す。

その結果、図８（ａ）に示すように、上部容器の内部を嫌気性条件に維持し、下部容器の内部を好気性条件に維持した場合では、上皮細胞と共にビフィドバクテリウム・アドレッセンティスの増殖が観察された。図８（ａ）中、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティスのコロニーを矢印で示す。

一方、図８（ｂ）に示すように、上部容器の内部及び下部容器の内部の双方を好気性条件に維持した場合では、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティスの増殖は観察されなかった。

この結果から、上皮細胞の頂端膜側を嫌気性条件に維持し、基底膜側を好気性条件に維持し、上皮細胞の頂端膜側に嫌気性細菌を播種することにより、上皮細胞と嫌気性細菌を共培養することができることが明らかとなった。

［実験例６］
（上皮細胞と嫌気性細菌との共培養２）
実験例５と同様にして、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス以外の嫌気性細菌を上皮細胞と共培養した。嫌気性細菌としては、バクテロイデス・フラジリス（Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ）、クロストリジウム・ブチリカム（Ｃ．ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）及びアッカーマンシア・ムシニフィラ（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）を使用した。上部容器の内部を嫌気性条件に維持し、下部容器の内部を好気性条件に維持して培養した。

図９（ａ）～（ｆ）は、各嫌気性細菌の播種から１日後の顕微鏡写真である。図９（ａ）はバクテロイデス・フラジリスの結果である。スケールバーは５０μｍである。図９（ｂ）は、図９（ａ）の点線の四角で囲んだ領域を拡大した顕微鏡写真である。スケールバーは１０μｍである。

また、図９（ｃ）はクロストリジウム・ブチリカムの結果である。スケールバーは５０μｍである。また、クロストリジウム・ブチリカムのコロニーを矢印で示す。図９（ｄ）は、図９（ｃ）の点線の四角で囲んだ領域を拡大した顕微鏡写真である。スケールバーは１０μｍである。

また、図９（ｅ）はアッカーマンシア・ムシニフィラの結果である。スケールバーは２０μｍである。図９（ｆ）は、図９（ｅ）の点線の四角で囲んだ領域を拡大した顕微鏡写真である。スケールバーは１０μｍである。

この結果から、上皮細胞の頂端膜側を嫌気性条件に維持し、基底膜側を好気性条件に維持し、上皮細胞の頂端膜側に嫌気性細菌を播種することにより、バクテロイデス・フラジリス、クロストリジウム・ブチリカム及びアッカーマンシア・ムシニフィラを上皮細胞と共培養することができることが明らかとなった。この結果は、本実験例の方法により、様々な嫌気性細菌を培養することができることを示す。

特に、アッカーマンシア・ムシニフィラは、成熟した上皮細胞から産生されるムチンを生育に必要とし、嫌気性が必須の微生物であり、従来インビトロで培養することができなかった微生物である。本発明の方法によって、これまでインビトロで培養することができなかったアッカーマンシア・ムシニフィラのような腸内細菌も培養できることが明らかとなった。

［実験例７］
（上皮細胞と嫌気性細菌との共培養３）
未分化の上皮細胞では杯細胞がほとんど認められず、杯細胞からのムチンの産生が見られない。アッカーマンシア・ムシニフィラは、その生育にムチンが必須であり、嫌気性条件も必須である。

本実験例では、実験例５と同様にして、成熟した上皮細胞の２Ｄオルガノイド上で、アッカーマンシア・ムシニフィラを共培養し菌の増殖を検討した。成熟した上皮細胞の２Ｄオルガノイドは、ＭＨＣＯ培地で培養した。また、比較のために、未分化な上皮細胞の２Ｄオルガノイド上でアッカーマンシア・ムシニフィラを共培養した。

未分化な上皮細胞の２Ｄオルガノイドは、ｐ３８阻害剤及びニコチンアミドを添加した未分化培養培地を用いた、系統的分化を阻害する条件で上皮細胞の３Ｄオルガノイドを形成後、２Ｄオルガノイドにして作製した。

未分化培養培地は、終濃度３μＭのＳＢ２０２１９０（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）及び終濃度１０ｍＭのニコチンアミド（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）をＭＨＣＯ培養培地に添加して調製した。

図１０は、培養したアッカーマンシア・ムシニフィラを定量した結果を示すグラフである。図１０中、「ＭＨＣＯ」は、ＭＨＣＯ培地を用いて培養した、成熟した上皮細胞上で共培養したアッカーマンシア・ムシニフィラを定量した結果であることを示し、「Ｕｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ」は、未分化培養培地を用いて培養した、未分化の上皮細胞上で共培養したアッカーマンシア・ムシニフィラを定量した結果であることを示す。また、「＊＊」は、ｐ＜０．０１で有意差が存在することを示す。

その結果、未分化の上皮細胞上では、アッカーマンシア・ムシニフィラの増殖がほとんど認められないことが明らかとなった。これに対し、成熟した上皮細胞上では、アッカーマンシア・ムシニフィラの増殖が認められた。この結果は、本発明の方法によって、成熟した上皮細胞からなる２Ｄオルガノイド製造することができ、嫌気性の微生物を共培養できることを更に支持するものである。

本発明によれば、上皮細胞を平面培養し、頂端膜側と基底膜側の酸素分圧を簡便に制御して、より生体内に近い環境で培養する技術を提供することができる。

１００…上皮細胞培養用培養容器、１１０…上部容器、１１１…開口部、１２０…蓋部材、１３０…細胞培養培地、１４０…下部容器、１１２…領域、１１３…膜、１３０，１３１…培地、１５０…上皮細胞、１５１…頂端膜側、１５２…基底膜側。

Claims (11)

1. 上部容器と、
   前記上部容器の開口部と気密に嵌合する蓋部材と、
   前記上部容器及び細胞培養培地を収容する下部容器と、を備え、
   前記上部容器の前記細胞培養培地と接する領域の少なくとも一部は前記細胞培養培地の少なくとも一部の成分を透過し細胞を透過しない膜で構成されており、
   前記蓋部材の材質は、酸素透過係数が１．０×１０^－６ｃｍ^３ ｃｍ／（ｃｍ^２・秒・気圧）以下である、上皮細胞培養用培養容器。
2. 前記蓋部材又は前記上部容器が、脱酸素剤を保持する脱酸素部を更に備える、請求項１に記載の上皮細胞培養用培養容器。
3. 請求項１又は２に記載の上皮細胞培養用培養容器の前記上部容器の表面を細胞外マトリクスでコートする工程（ａ）と、
   前記下部容器に細胞培養培地及び前記上部容器を収容する工程（ｂ）と、
   前記細胞外マトリクス上に上皮細胞を播種する工程であって、前記上皮細胞が、立体培養した上皮細胞の３Ｄオルガノイドを単一細胞に分散した細胞である工程（ｃ）と、
   前記上皮細胞培養用培養容器を培養条件下でインキュベートし、その結果、前記細胞外マトリクス上で前記上皮細胞が２Ｄオルガノイドの層を形成する工程（ｄ）と、
   前記上部容器の開口部に前記蓋部材を気密に嵌合させる工程（ｅ）と、
   前記上皮細胞培養用培養容器を培養条件下で更にインキュベートする工程（ｆ）と、
   を含む、上皮細胞の培養方法。
4. 前記細胞培養培地が、
   インスリン様成長因子１（ＩＧＦ１）、線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）及びＥＧＦ様成長因子からなる群より選択される少なくとも１種、及び、
   Ｗｎｔアゴニスト、骨形成因子（ＢＭＰ）阻害剤及び形質転換増殖因子－β（ＴＧＦ－β）阻害剤からなる群より選択される少なくとも１種、を含む、
   請求項３に記載の培養方法。
5. 前記ＥＧＦ様成長因子がエピレグリン（ＥＲＥＧ）を含む、請求項４に記載の培養方法。
6. 前記ＥＧＦ様成長因子が上皮成長因子（ＥＧＦ）を含む、請求項４又は５に記載の培養方法。
7. 前記Ｗｎｔアゴニストが、Ｗｎｔタンパク質とアファミンとの複合体を含む、請求項４～６のいずれか一項に記載の培養方法。
8. 前記工程（ｅ）を、雰囲気中の酸素濃度が１５体積％以下である低酸素雰囲気下で実施する、請求項３～７のいずれか一項に記載の培養方法。
9. 前記工程（ｄ）の後（ｅ）の前に、前記２Ｄオルガノイドの層が形成された前記上部容器に嫌気性細菌を播種する工程を更に含む、請求項３～８のいずれか一項に記載の培養方法。
10. 立体培養した上皮細胞の３Ｄオルガノイドを単一細胞に分散した細胞から形成された、上皮細胞の２Ｄオルガイドと嫌気性細菌との共培養物。
11. 請求項９に記載の培養方法により得られた、請求項１０に記載の共培養物。

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