CN113840903A - 上皮细胞培养用培养容器及其使用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种上皮细胞培养用培养容器，其包括：上部容器；与所述上部容器的开口部气密性地嵌合的盖构件；和收容所述上部容器和细胞培养基的下部容器，所述上部容器的与所述细胞培养基接触的区域的至少一部分由透过所述细胞培养基的至少一部分的成分且不透过细胞的膜构成，所述盖构件的材质的透氧系数为1.0×10‑6cm3cm/(cm2·秒·气压)以下。

Description

上皮细胞培养用培养容器及其使用
技术领域
本发明涉及一种上皮细胞培养用培养容器及其使用。更具体而言，本发明涉及上皮细胞培养用培养容器、上皮细胞的培养方法、以及上皮细胞与厌氧性细菌的共培养物。本申请要求基于2019年5月23日在日本提交的日本特愿2019-096905号的优先权，将其内容援引于此。
背景技术
随着近年来的序列技术的进步，肠道细菌的分子遗传学的系统分类正在推进。另外，通过向无菌小鼠接种肠道细菌，从而能够进行肠道细菌的功能分析。然而，许多肠道细菌依然无法进行人工培养，不能克隆。这样的技术制约在医学生物学的肠道细菌的理解和商业的肠道细菌的制造方面成为瓶颈。
本发明的发明人们以前开发了一种技术，通过使肠道上皮细胞的2D类器官感染腹泻病毒来培养诺如病毒等腹泻病毒(例如，参见专利文献1)。如专利文献1中所述，具有在肠道微生物中通过将肠道上皮细胞作为宿主因子而能够首次培养的例子。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2018/038042号
发明内容
发明要解决的技术课题
动物的肠道内保持厌氧状态，存活在其中的细菌几乎都是只能在厌氧条件下生长的厌氧性细菌。为了验证这些厌氧性细菌对宿主的肠道上皮细胞产生的生理功能，需要在厌氧条件下培养肠道上皮细胞。然而，以肠道上皮细胞为代表的上皮细胞无法在厌氧性条件下培养。因此，需要开发一种在更接近生物体内的环境下培养上皮细胞的技术。因此，本发明的目的在于提供一种对上皮细胞进行平面培养、且简便地控制顶端膜侧与基底膜侧的氧分压从而在更接近生物体的环境下进行培养的技术。
用于解决技术课题的方案
本发明包括以下方案。
[1]一种上皮细胞培养用培养容器，包括：上部容器；与所述上部容器的开口部气密性地嵌合的盖构件；和收容所述上部容器和细胞培养基的下部容器，所述上部容器的与所述细胞培养基接触的区域的至少一部分由透过所述细胞培养基的至少一部分的成分而不透过细胞的膜构成，所述盖构件的材质的透氧系数为1.0×10-6cm3cm/(cm2·秒·气压)以下。
[2]根据[1]所述的上皮细胞培养用培养容器，其中，所述盖构件或所述上部容器还包括保持脱氧剂的脱氧部。
[3]一种上皮细胞的培养方法，包含：
工序(a)，用细胞外基质涂覆[1]或[2]所述的上皮细胞培养用培养容器的所述上部容器的表面；
工序(b)，将细胞培养基和所述上部容器收容于所述下部容器；
工序(c)，在所述细胞外基质上接种上皮细胞；
工序(d)，在培养条件下将所述上皮细胞培养用培养容器进行孵育，结果，所述上皮细胞在所述细胞外基质上形成2D类器官的层；
工序(e)，使所述盖构件气密性地嵌合于所述上部容器的开口部；和
工序(f)，在培养条件下将所述上皮细胞培养用培养容器进行进一步孵育。
[4]根据[3]所述的培养方法，其中，所述上皮细胞是将经立体培养的上皮细胞的3D类器官分散于单一细胞中而得到的细胞。
[5]根据[3]或[4]所述的培养方法，其中，所述细胞培养基包含：
选自由胰岛素样生长因子1(IGF1)、成纤维细胞生长因子2(FGF2)和EGF样生长因子构成的组中的至少一种；和，
选自由Wnt激动剂、骨形成因子(BMP)抑制剂和转化生长因子-β(TGF-β)抑制剂构成的组中的至少一种。
[6]根据[5]所述的培养方法，其中，所述EGF样生长因子包括上皮调节素(EREG)。
[7]根据[5]或[6]所述的培养方法，其中，所述EGF样生长因子包括上皮生长因子(EGF)。
[8]根据[5]～[7]中任一项所述的培养方法，其中，所述Wnt激动剂包括Wnt蛋白与Afamin的复合体。
[9]根据[3]～[8]中任一项所述的培养方法，其中，在低氧氛围下实施所述工序(e)。
[10]根据[3]～[9]中任一项所述的培养方法，其中，在所述工序(d)之后且工序(e)之前，还包含在形成有所述2D类器官的层的所述上部容器接种厌氧性细菌的工序。
[11]一种上皮细胞的2D类器官与厌氧性细菌的共培养物。
[12]根据[11]所述的共培养物，其通过上述[10]所述的培养方法而得到。
发明效果
根据本发明，能够提供一种对上皮细胞进行平面培养、且简便地控制顶端膜侧和基底膜侧的氧分压从而在更接近生物体内的环境下进行培养的技术。
附图说明
图1是示出上皮细胞培养用培养容器的一例的结构的剖面示意图。
图2的(a)～图2的(c)是上皮细胞培养用培养容器的具体一例的照片。
图3的(a)～图3的(c)是在实验例1中培养的上皮细胞的显微镜照片。图3的(a)是将上部容器的内部和下部容器的内部双方维持于有氧氛围下的结果，图3的(b)是将上部容器的内部和下部容器的内部双方维持于厌氧性条件的结果；图3的(c)是将上部容器的内部维持于厌氧性条件、且将下部容器的内部维持于需氧性条件的结果。
图4的(a)和图4的(b)是示出实验例2中的溶解氧浓度的测定结果的图表。图4的(a)是示出上部容器内的细胞培养基中的溶解氧浓度的测定结果的图表，图4的(b)是示出下部容器内的细胞培养基中的溶解氧浓度的测定结果的图表。
图5的(a)～图5的(e)是示出实验例3中测定的各标记基因的表达量的测定结果的图表。
图6的(a)和图6的(b)是示出实验例3中的上皮细胞的切片的免疫染色的结果的荧光显微镜照片。图6的(a)是将上部容器的内部和下部容器的内部双方维持于需氧性条件的结果，图6的(b)是将上部容器的内部维持于厌氧性条件、且将下部容器的内部维持于需氧性条件的结果。
图7的(a)和图7的(b)是示出实验例4中的上皮细胞的免疫染色的结果的荧光显微镜照片。
图8的(a)和图8的(b)是示出在实验例5中对上皮细胞和厌氧性细菌进行共培养的结果的显微镜照片。图8的(a)是将上部容器的内部维持于厌氧性条件、且将下部容器的内部维持于需氧性条件的结果，图8的(b)是将上部容器的内部和下部容器的内部双方维持于需氧性条件的结果。
图9的(a)～图9的(f)是示出在实验例6中对上皮细胞和厌氧性细菌进行共培养的结果的显微镜照片。
图10是示出在实施例7中对在未分化的上皮细胞上和成熟了的上皮细胞上分别进行共培养的嗜黏蛋白阿克曼菌(A.muciniphila)的增殖进行定量的结果的图表。
具体实施方式
[上皮细胞培养用培养容器]
在一实施方式中，本发明提供一种上皮细胞培养用培养容器，其包括：上部容器；与上述上部容器的开口部气密性地嵌合的盖构件；和收容上述上部容器和细胞培养基的下部容器，上述上部容器的与上述细胞培养基接触的区域的至少一部分由透过上述细胞培养基的至少一部分的成分而不透过细胞的膜构成，上述盖构件的材质的透氧系数为1.0×10- 6cm3cm/(cm2·秒·气压)以下。
图1是示出本实施方式的上皮细胞培养用培养容器的一例的结构的剖面示意图。在图1中，示出通过下文描述的培养方法培养上皮细胞的状态。
如图1所示，上皮细胞培养用培养容器100包括：上部容器110；与上部容器110的开口部111气密性地嵌合的盖构件120；收容上部容器110和细胞培养基130的下部容器140，上部容器110的与细胞培养基接触的区域112的至少一部分由透过细胞培养基130的至少一部分的成分而不透过细胞150的膜113构成，盖构件120的材质的透氧系数为1.0×10-6cm3cm/(cm2·秒·气压)以下。收容于上部容器110的培养基131与收容于下部容器140的细胞培养基130可以为相同的培养基，也可以为不同的培养基。膜113的材质没有特别限定，可举出例如聚酯等。
另外，图2的(a)～图2的(c)是本实施方式的上皮细胞培养用培养容器的具体一例的照片。图2的(a)是盖构件和上部容器的照片。另外，将使盖构件嵌合于开口部的上部容器收容于下部容器，将从盖构件侧拍摄到的照片示于图2的(b)，将从上部容器和下部容器的侧面拍摄到的照片示于图2的(c)。
如下文的实施例所述，利用本实施方式的上皮细胞培养用培养容器，能够对上皮细胞进行平面培养，且简便地控制顶端膜侧与基底膜侧的氧分压，从而在更接近生物体的环境下进行培养。
需要说明的是，上皮细胞在生物体内例如存在于消化道、呼吸道-气管、表皮等器官。并且，上皮细胞的各器官的管腔侧的细胞膜被称为顶端膜、血管侧的细胞膜被称为基底膜。
在图1的例子中，上皮细胞150的顶端膜侧151面向上部容器110的内部空间。另外，上皮细胞150的基底膜侧152与上部容器110的表面相对。上皮细胞150的基底膜侧152也可以与膜113相对，还可以与下部容器140的底面相对。
如下文的实施例所述，本发明的发明人们明确了：在使盖构件120嵌合于上部容器110的开口部111的状态下，在上部容器110的内部对上皮细胞150进行培养，上皮细胞150处于融合状态时，上部容器110处于隔离的状态，并能够以厌氧性条件维持上部容器110的内部。另一方面，从细胞培养基130通过膜113而向上皮细胞150的基底膜侧152供给氧，因此能够使上皮细胞150永久地存活。
另外，如下文的实施例所述，本发明的发明人们明确：通过在上皮细胞150的顶端膜侧接种厌氧性细菌，能够在不接触氧的情况下与上皮细胞150接触。通过在本实施方式的上皮细胞培养用培养容器中将上皮细胞和厌氧性细菌进行共培养，厌氧性细菌能够进入上皮细胞的顶端膜侧，与上皮细胞所分泌的粘多糖类等细胞来源产物(取决于细菌的营养物)有效地接触。其结果，能够将上皮细胞作为宿主因子来容易地培养以往无法培养的厌氧性细菌。
因此，利用本实施方式的上皮细胞培养用培养容器，能够大量培养以往无法大量培养的厌氧性细菌。另外，可以在体外简便且有效地分析上皮细胞与厌氧性细菌的相互作用的测量、肠道细菌的营养代谢状态的测量、基于厌氧性细菌而引起的上皮细胞的基因表达变化的测量等。
在本实施方式的上皮细胞培养用培养容器中，盖构件需要由不透过氧或透氧系数小的材质构成。因此，作为盖构件的材质，使用透氧系数为1.0×10-6cm3cm/(cm2·秒·气压)以下的材质。透氧系数优选使用25℃下的值。也就是说，作为盖构件的材质，使用在将厚度换算成1cm的情况下、在面积1cm2、压力1气压、温度25℃的条件下每1秒透过的氧的量为1.0×10-6cm3以下的材质。
作为透氧系数为1.0×10-6cm3cm/(cm2·秒·气压)以下的材质，例如，可举出丁基橡胶、乙丙二元橡胶、全氟弹性体、苯乙烯丁二烯橡胶、氟橡胶、氯丁橡胶、丁腈橡胶等，但并不限定于这些。
在本实施方式的上皮细胞培养用培养容器中，盖构件120或上部容器110可以还包括保持脱氧剂的脱氧部。
为了使上部容器110的内部为厌氧性条件，优选在低氧氛围下实施上部容器110的内部的培养基的更换、厌氧性细菌的接种、盖构件120向上部容器110的开口部的嵌合等。此处，低氧氛围下是指氛围中的氧浓度为例如15体积％以下、例如10体积％以下、例如5体积％以下、例如0.5体积％以下、例如0.3体积％以下、例如0.1体积％以下的氛围下。因此，例如需要氮气室等特殊的装置。然而，盖构件120或上部容器110还包括保持脱氧剂的脱氧部，由此即使没有氮气室，只要使盖构件120与上部容器110的开口部气密性地嵌合，脱氧部就能够吸收或去除上部容器110的内部的氧，使上部容器110的内部成为厌氧性条件。
作为脱氧剂，只要是对细胞、细菌的培养没有不良影响的物质即可，没有特别限定，可以使用利用铁的氧化来吸收氧的药剂、利用糖、还原酮等的氧化反应的有机系药剂等。
[上皮细胞的培养方法]
在一实施方式中，本发明提供一种上皮细胞的培养方法，其包含如下工序：工序(a)，用细胞外基质涂覆上述的上皮细胞培养用培养容器的上述上部容器的表面；工序(b)，将细胞培养基和上述上部容器收容于上述下部容器；工序(c)，在上述细胞外基质上接种上皮细胞；工序(d)，在培养条件下将上述上皮细胞用培养容器进行孵育，结果，上述上皮细胞在上述细胞外基质上形成2D类器官的层；工序(e)，使上述盖构件气密性地嵌合于上述上部容器的开口部；和工序(f)，在培养条件下将上述上皮细胞用培养容器进行进一步孵育。
如下文的实施例所述，利用本实施方式的培养方法，能够对上皮细胞进行平面培养，且简便地控制顶端膜侧与基底膜侧的氧分压，从而在更接近生物体的环境下进行培养。下面，对各工序进行说明。
(工序(a))
首先，在本工序中，用细胞外基质涂覆上述的上皮细胞培养用培养容器的上述上部容器的表面。由此，容易形成下文描述的2D类器官。
＜细胞外基质＞
通常情况下，细胞外基质(Extracellular Matrix、ECM)是指在生物体中存在于细胞之外的超分子结构。该ECM成为用于增殖上皮细胞的立足点。ECM包含各种各样的多糖、水、弹性蛋白、糖蛋白。作为糖蛋白，例如，可举出胶原蛋白、巢蛋白(Nidogen)、纤连蛋白、层粘连蛋白等。
作为ECM，可以使用例如Matrigel(注册商标、BD Biosciences公司)、Cellmatrix(Nitta-Gelatin)、细胞外基质蛋白(Thermo Fisher Scientific公司)、ProNectin(SigmaZ378666)等市售的ECM。
或者，也可以制备ECM来使用。作为ECM的制备方法，例如，可举出使用结缔组织细胞的方法等。更具体而言，在培养容器内培养ECM产生细胞、例如成纤维细胞之后，取出这些细胞时，在培养容器的表面涂覆有ECM。
作为ECM产生细胞，例如，可举出：主要产生胶原蛋白和蛋白多糖的软骨细胞；主要产生IV型胶原蛋白、层粘连蛋白、间质前胶原蛋白和纤连蛋白的成纤维细胞；主要产生胶原蛋白(I型、III型和V型)、硫酸软骨素蛋白多糖、透明质酸、纤连蛋白和生腱蛋白-C的结肠肌成纤维细胞等。
(工序(b))
在本工序中，将细胞培养基和上部容器收容于下部容器。在下文中描述细胞培养基。
(工序(c))
在本工序中，在涂覆于上部容器的表面的上述细胞外基质上接种上皮细胞。可以先进行工序(b)和(c)中的任一个。只要最终细胞培养基和上部容器收容于下部容器中、且上皮细胞接种于上部容器即可。
＜上皮细胞＞
在本说明书中，上皮细胞是包含由上皮组织获得的分化了的上皮细胞和上皮干细胞的细胞。“上皮干细胞”是指具有长期自我复制功能和分化成上皮分化细胞的功能的细胞，是指源于上皮组织的干细胞。作为上皮组织，例如，可举出角膜、口腔粘膜、皮肤、结膜、膀胱、肾小管、肾脏、消化器官(食管、胃、十二指肠、小肠(包含空肠和回肠)、大肠(包含结肠))、肝脏、胆管、胰腺、乳腺、唾液腺、泪腺、前列腺、毛根、气管、肺、输卵管等。上皮细胞也可以是来自上述上皮组织的细胞经肿瘤化而成的上皮肿瘤细胞。
本实施方式的上皮细胞的培养方法优选用于培养在生物体内源于厌氧性的器官的上皮细胞。例如，优选用于培养源于消化器官(食管、胃、十二指肠、小肠(包括空肠和回肠)、大肠(包括结肠))、肝脏、胰腺的上皮细胞。
在本实施方式的上皮细胞的培养方法中，上皮细胞可以是由上皮组织获得到的上皮细胞，更优选为将经立体培养的上皮细胞的3D类器官分散于单一细胞中而得到的细胞。
在本说明书中，“3D类器官”是指通过在控制的空间内使细胞高密度地累积从而自组装了的立体的细胞组织体。在3D类器官中，优选维持干细胞和已分化的细胞双方。对3D类器官的制备方法没有特别限定，例如，可举出如下方法。
首先，将上皮细胞包埋于细胞基质中，然后接种在板上并静置。上皮细胞优选包含LGR5阳性的上皮干细胞。接着，在细胞接种后，在趁细胞未干之前添加细胞培养基并进行培养。关于细胞培养基在下文中描述。培养温度优选为30℃～40℃，更优选为37℃左右。培养时间可以根据所使用的细胞来适当调节。通常在自培养开始起1～2周左右后形成3D类器官。如此能够制备3D类器官。
在3D类器官的形成中，可以在低氧条件下进行培养。通过在低氧条件下进行培养，能够提高3D类器官的形成效率。低氧条件下是指优选氧浓度为0.1～15体积％的条件，更优选为0.3～10体积％，进一步优选为0.5～5体积％。
接着，使所得到的3D类器官分散于单一细胞中，然后在涂覆于上皮细胞培养用培养容器的上部容器的表面的上述细胞外基质上进行接种。
作为由3D类器官制备单一细胞的方法，没有特别限定，可举出物理方法、酶处理法等，从不损伤细胞的观点出发，优选酶处理法。作为酶处理法中所使用的酶，可以使用TrypLE Express(Thermo Fisher Scientific公司)、胰蛋白酶、胶原酶、分散酶I等。
(工序(d))
接着，将通过工序(c)接种了上皮细胞的上皮细胞用培养容器在培养条件下进行孵育。其结果，如下文的实施例所述，上皮细胞在细胞外基质上形成单层的2D类器官。
作为培养条件，可举出例如37℃的环境下。另外，作为上皮细胞用培养容器的周围的气体的条件，可举出空气、低氧条件等。低氧条件与上述的定义相同。
2D类器官是指具有与构成3D类器官的细胞同样的功能的细胞二维配置而非三维配置而成的类器官。在2D类器官中，优选维持干细胞和已分化的细胞双方。
＜细胞培养基＞
作为细胞培养基，优选使用能够将上皮细胞中所含的干细胞维持为未分化状态的培养基(下面，有时称为“扩增培养基”)。
作为这样的培养基，可举出下述培养基，该培养基包含：选由自胰岛素样生长因子1(IGF1)、成纤维细胞生长因子2(FGF2)和EGF样生长因子构成的组中的至少一种、以及选自由Wnt激动剂、骨形成因子(BMP)抑制剂和转化生长因子-β(TGF-β)抑制剂构成的组中的至少一种。细胞培养基可以还包含p38抑制剂。作为EGF样生长因子，可举出上皮生长因子(EGF)、上皮调节素(EREG)、HBGF等。Wnt激动剂还包括Wnt蛋白与Afamin的复合体。
本发明的发明人们之前明确了：利用这样的培养基，能够从以往难以制作类器官的组织得到类器官。细胞培养基优选为无血清培养基。
＜基础培养基＞
细胞培养基是在基础培养基中添加了上述成分的培养基。作为基础培养基，包含所谓的无血清的细胞培养基础培养基。作为无血清的细胞培养基础培养基，例如，可举出用碳酸系的缓冲液缓冲至pH7.2～7.6的合成培养基等。更具体而言，可举出补充有谷氨酰胺、胰岛素、B27补充剂(Thermo Fisher Scientific公司)、N-乙酰基-L-半胱氨酸(N-Acetyl-L-cystein，和光纯药)、青霉素或链霉素、转铁蛋白的高级杜氏改良伊格尔培养基/Ham F-12混合培养基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium：Nutrient Mixture F-12、DMEM/F12)。或者，也可以将RPMI1640培养基(Roswell Park Memorial Institute 1640medium)、高级RPMI培养基等作为基础培养基。
＜IGF1＞
IGF1的别名又称为生长调节素C。细胞培养基中所含的IGF1的浓度没有特别限定，优选为5ng/mL～1μg/mL，更优选为10ng/mL～1μg/mL，进一步优选为50ng/mL～500ng/mL。
＜FGF2＞
FGF2是碱性成纤维细胞生长因子，与成纤维细胞生长因子受体(FGFR)结合，具有促进血管内皮细胞的增殖和组织化成管状结构、即促进血管新生的功能。细胞培养基中所含的FGF2的浓度没有特别限定，优选为5ng/mL～1μg/mL以下，更优选为10ng/mL～1μg/mL以下，进一步优选为50ng/mL～500ng/mL以下。
＜EGF样生长因子＞
作为EGF样生长因子，可举出EGF、EREG、HBGF等。细胞培养基中所含的EGF的浓度没有特别限定，优选为5ng/mL～1μg/mL，更优选为10ng/mL～1μg/mL，进一步优选为50ng/mL～500ng/mL。EREG是与酪氨酸激酶(ErbB)家族受体(ErbB1～4)中的ErbB1和ErbB4特异性结合的EGF样生长因子。细胞培养基中所含的EREG的浓度没有特别限定，优选为5ng/mL～1μg/mL，更优选为10ng/mL～1μg/mL，进一步优选为50ng/mL～500ng/mL。
＜BMP抑制剂＞
BMP作为二聚体配体与由两种不同的受体丝氨酸/苏氨酸激酶、I型和II型受体构成的受体复合体结合。II型受体将I型受体磷酸化，其结果，可激活该受体激酶。该I型受体接着将特异性受体基质(SMAD)磷酸化，其结果，通过信号转导通路引导转录活性。通常情况下，BMP抑制剂例如是阻止或抑制BMP分子向BMP受体结合的药剂，是为了形成中和BMP活性的复合体而与BMP分子结合的药剂。另外，BMP抑制剂例如是与BMP受体结合并阻止或抑制BMP分子向受体的结合的药剂，是作为拮抗剂或逆激动剂起作用的药剂。
与不存在BMP抑制剂时的BMP活性水平相比，BMP抑制剂具有优选50％以上、更优选70％以上、进一步优选80％以上、特别优选90％以上的抑制活性。BMP抑制活性可以通过测定例如BMP的转录活性来进行评价。
作为细胞培养基中所含的BMP抑制剂，优选天然的BMP结合蛋白，例如，可举出头蛋白(Noggin)、骨形态发生蛋白拈抗剂(Gremlin)、腱蛋白(Chordin)、腱蛋白结构域等腱蛋白样蛋白；卵泡抑素(Follistatin)、卵泡抑素结构域等卵泡抑素相关蛋白；DAN、DAN半胱氨酸-结节结构域等DAN样蛋白；硬骨素/SOST、核心蛋白聚糖(decorin)、α-2巨球蛋白等。
作为BMP抑制剂，其中，优选腱蛋白样蛋白或DAN样蛋白，更优选腱蛋白样蛋白。作为腱蛋白样蛋白，优选头蛋白。腱蛋白样蛋白或DAN样蛋白是扩散性蛋白，能够以各种各样的亲和度与BMP分子结合，并能够阻碍BMP分子向信号转导受体的接近。
细胞培养基中所含的BMP抑制剂的浓度优选为10～100ng/mL，更优选为20～100ng/mL，进一步优选为50～100ng/mL。
＜TGF-β抑制剂＞
转化生长因子-β(transforming growth factor-β；TGF-β)是生长因子的一种，在肾脏、骨髓、血小板等几乎所有细胞中产生。在TGF-β中存在五种亚型(β1～β5)。另外，已知TGF-β促进成骨细胞的增殖以及如胶原蛋白那样的结缔组织的合成和增殖，对于上皮细胞的增殖、破骨细胞有抑制性作用。通常情况下，TGF-β抑制剂例如是阻止或抑制TGF-β向TGF-β受体的结合的药剂，是为了形成中和TGF-β活性的复合体而与TGF-β结合的药剂。另外，TGF-β抑制剂例如是与TGF-β受体结合并阻止或抑制TGF-β向受体的结合的药剂，是用作拮抗剂或逆激动剂起的药剂。
与不存在该TGF-β抑制剂时的TGF-β活性水平相比，TGF-β抑制剂优选具有50％以上、更优选具有70％以上、进一步优选具有80％以上、特别优选具有90％以上的抑制活性。
作为细胞培养基中所含的TGF-β抑制剂，例如，可举出A83-01(3-(6-甲基吡啶-2-基)-1-苯基硫代氨基甲酰-4-喹啉-4-基吡唑)、ALK5 Inhibitor I(3-(吡啶-2-基)-4-(4-喹啉)-1H-吡唑)、LDN193189(4-(6-(4-(哌嗪-1-基)苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)喹啉)、SB431542(4-[4-(1,3-苯并二噁茂-5-基)-5-吡啶-2-基-1H-咪唑-2-基]苯甲酰胺)、SB-505124(2-(5-苯并[1,3]二噁茂-5-基-2-叔丁基-3H-咪唑-4-基)-6-甲基吡啶盐酸盐水合物)、SD-208(2-(5-氯-2-氟苯基)蝶啶-4-基)吡啶-4-基-胺)、SB-525334(6-[2-(1,1-二甲基乙基)-5-(6-甲基-2-吡啶基)-1H-咪唑-4-基]喹喔啉)、LY-364947(4-[3-(2-吡啶基)-1H-吡唑-4-基]-喹啉)、LY2157299(4-[2-(6-甲基-吡啶-2-基)-5,6-二氢-4H-吡咯并[1,2-b]吡唑-3-基]-喹啉-6-羧酸酰胺)、TGF-βRI Kinase Inhibitor II 616452(2-(3-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-基)-1,5-萘啶)、TGF-βRI Kinase Inhibitor III 616453(2-(5-苯并[1,3]二噁茂-4-基-2-叔丁基-1H-咪唑-4-基)-6-甲基吡啶，HCl)、TGF-βRI KinaseInhibitor IX 616463(4-((4-((2,6-二甲基吡啶-3-基)氧基)吡啶-2-基)氨基)苯磺酰胺)、TGF-βRI Kinase Inhibitor VII 616458(1-(2-((6,7-二甲氧基-4-喹啉基)氧基)-(4,5-二甲基苯基)-1-乙酮)、TGF-βRI Kinase Inhibitor VIII 616459(6-(2-叔丁基-5-(6-甲基-吡啶-2-基)-1H-咪唑-4-基)-喹喔啉)、AP12009(TGF-β2反义化合物“Trabedersen”)、Belagenpumatucel-L(TGF-β2反义基因修饰的同种异系肿瘤细胞疫苗)、CAT-152(Glaucoma-lerdelimumab(抗-TGF-β-2单克隆抗体))、CAT-192(Metelimumab(中和TGFβ1的人IgG4单克隆抗体)、GC-1008(抗-TGF-β单克隆抗体)等。作为本实施方式的类器官培养用细胞培养基中所含的TGF-β抑制剂，其中，优选为A83-01。
细胞培养基中所含的TGF-β抑制剂的浓度优选为100nM～10μM，更优选为500nM～5μM，进一步优选为500nM～2μM。
＜Wnt激动剂＞
在本说明书中，“Wnt激动剂”是指在细胞内激活T细胞因子(下面，也称为TCF)/淋巴样增强因子(下面，也称为LEF)介导性转录的药剂。Wnt激动剂并不限定于Wnt家族蛋白质，还包括与Frizzled受体家族成员结合而激活的Wnt激动剂、细胞内β-连环蛋白分解的抑制剂、TCF/LEF的激活物质。Wnt激动剂优选选自由Wnt蛋白、R-脊椎蛋白和GSK-3β抑制剂组成的组中的至少一种。
作为细胞培养基中所含的Wnt激动剂，更优选Wnt蛋白与Afamin的复合体，更优选包含Wnt蛋白与afamin的复合体和R-脊椎蛋白(R-spondin)双方。
＜Wnt蛋白＞
作为Wnt蛋白，没有特别限定，可以使用源于各种生物的Wnt蛋白。其中，优选源于哺乳动物的Wnt蛋白。作为哺乳动物，例如，可举出人、小鼠、大鼠、牛、猪、兔等。作为哺乳动物的Wnt蛋白，可举出Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt9a、Wnt9b、Wnt10a、Wnt10b、Wnt11、Wnt16等。Wnt蛋白可以组合多种进行使用。
作为制造Wnt蛋白的方法，例如，可举出使用Wnt蛋白表达细胞进行制造的方法等。在Wnt蛋白表达细胞中，细胞的由来(物种、培养方式等)没有特别限定，只要是稳定表达Wnt蛋白的细胞即可，可以是瞬时表达Wnt蛋白的细胞。作为Wnt蛋白表达细胞，例如，可举出稳定表达小鼠Wnt3a的L细胞(ATCC CRL-2647)、稳定表达小鼠Wnt5a的L细胞(ATCC CRL-2814)等。另外，Wnt蛋白表达细胞可以使用公知的基因重组技术来制作。即，通过将编码所需Wnt蛋白的DNA插入公知的表达载体并将得到的表达载体导入适当的宿主细胞，从而能够制作Wnt蛋白表达细胞。编码所需Wnt蛋白的基因的碱基序列可从例如GenBank等公知的数据库中获得。
由Wnt蛋白表达细胞表达的Wnt蛋白只要具有Wnt活性即可，可以是Wnt蛋白的片段，也可以是包含除Wnt蛋白的氨基酸序列以外的氨基酸序列的片段。关于除Wnt蛋白的氨基酸序列以外的氨基酸序列没有特别限定，例如可举出亲和标签的氨基酸序列等。另外，Wnt蛋白的氨基酸序列无需与能够从GenBank等公知的数据库中获得的氨基酸序列完全一致，只要具有Wnt活性，也可以是与能够从公知的数据库中获得的氨基酸序列实质相同的氨基酸序列。
作为与能够从GenBank等公知的数据库中获得的Wnt蛋白的氨基酸序列实质相同的氨基酸序列，例如，可举出在能够从公知的数据库中获得的氨基酸序列中缺失、取代或附加了1个～数个氨基酸的氨基酸序列等。
缺失、取代或附加了1个～数个氨基酸的氨基酸序列是指例如，通过部位特异性突然变异诱发法等的变异肽制作法等，使可缺失、取代或附加的程度的数量(优选为10个以下、更优选为7个以下、进一步优选为6个以下)的氨基酸缺失、取代或附加。
另外，作为实质相同的氨基酸序列，例如，可举出与可从公知的数据库中获得的氨基酸序列的相同性为80％以上、优选为85％以上、更优选为90％以上、进一步优选为92％以上、特别优选为95％以上、最优选为99％以上的氨基酸序列等。
＜R-脊椎蛋白＞
作为R-脊椎蛋白，可举出包含R-脊椎蛋白1、R-脊椎蛋白2、R-脊椎蛋白3和R-脊椎蛋白4的R-脊椎蛋白家族。已知R-脊椎蛋白家族是分泌蛋白质，与Wnt信号转导通路的激活和控制有关。在细胞培养基中，可以组合使用多种R-脊椎蛋白。另外，只要具有R-脊椎蛋白活性，既可以使用R-脊椎蛋白的片段，也可以包含除R-脊椎蛋白的氨基酸序列以外的氨基酸序列。
细胞培养基中所含的Wnt蛋白的浓度优选为50ng/mL以上，更优选为100ng/mL～10μg/mL，进一步优选为200ng/mL～1μg/mL，特别优选为300ng/mL～1μg/mL。
＜GSK-3β抑制剂＞
作为GSK-3β抑制剂，例如，包含CHIR-99021(CAS编号：252917-06-9)、CHIR-98014(CAS编号：252935-94-7)、锂(Sigma)、肯帕罗酮(CAS编号：142273-20-9)、6-溴靛玉红-30-丙酮肟、SB216763(CAS编号：280744-09-4)、SB415286(CAS编号：264218-23-7)、阻止GSK-3与axin的相互作用的FRAT家族成员和源自FRAT的肽。
＜p38抑制剂＞
本说明书中，“p38抑制剂”是指直接或间接地将p38信号转导调解为负的任意的抑制剂。通常情况下，p38抑制剂例如与p38结合且降低其活性。p38蛋白激酶是丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族的一部分。MAPK是响应环境应激和炎症细胞因子等细胞外刺激并调节基因表达、有丝分裂、分化、增殖和细胞存活/细胞凋亡等各种各样的细胞活性的丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白激酶。p38 MAPK以α、β、β2、γ和δ异构体的形式存在。另外，p38抑制剂也是例如与至少一种p38异构体结合且降低其活性的药剂。
与不存在p38抑制剂时的p38活性水平相比，p38抑制剂优选具有50％以上、更优选具有70％以上、进一步优选具有80％以上、特别优选具有90％以上的抑制活性。基于p38抑制剂而产生的抑制效果可以利用本领域技术人员公知的方法进行评价。作为所涉及的评价体系，可举出Thr180/Tyr182磷酸化的磷酸化位点特异性抗体检测方法、生化重组激酶测定、肿瘤坏死因子α(TNF-α)分泌测定、p38抑制剂用的DiscoverRx高通量筛选平台、p38活性测定药剂盒(例如，Millipore公司制造、Sigma-Aldrich公司制造等)等。
作为细胞培养基中所含的p38抑制剂，例如，可举出SB-202190(4-(4-氟苯基)-2-(4-羟基苯基)-5-(4-吡啶基)-1H-咪唑)、SB-203580(4-[4-(4-氟苯基)-2-[4-(甲基亚磺酰基)苯基]-1H-咪唑-5-基]吡啶)、VX-702(6-(N-氨基甲酰-2,6-二氟苯胺基)-2-(2,4-二氟苯基)吡啶-3-羧基酰胺)、VX-745(5-(2,6-二氯苯基)-2-[2,4-二氟苯基)硫基]-6H-嘧啶[1,6-b]哒嗪-6-酮)、PD-169316(4-(4-氟苯基)-2-(4-硝基苯基)-5-(4-吡啶基)-1H-咪唑)、RO-4402257(6-(2,4-二氟苯氧基)-2-{[3-羟基-1-(2-羟基乙基)丙基]氨基}-8-甲基吡啶并[2,3-D]嘧啶-7(8h)-酮)、BIRB-796(1-[5-叔丁基-2-(4-甲基苯基)吡唑-3-基]-3-[4-(2-吗啉-4-基乙氧基)萘-1-基]脲)等。
细胞培养基中所含的p38抑制剂的浓度优选为50nM以上且100μM以下，更优选为100nM以上且50μM以下，进一步优选为100nM以上且10μM以下。在干细胞的培养中，优选每两天向培养基中添加p38抑制剂，优选每四天将培养基更换成新鲜的培养基。
＜Afamin＞
Afamin是属于白蛋白家族的糖蛋白，已知存在于血液或体液中。在血清中包含源于采集了该血清的动物的Afamin。由于血清中包含除Afamin以外的不纯物等，因此细胞培养基优选不含血清而仅含Afamin。
Afamin的来源没有特别限定，可以使用源于各种生物的Afamin。其中，优选源于哺乳动物的Afamin。主要的哺乳动物的Afamin的氨基酸序列和编码它的基因的碱基序列例如可以从GenBank等公知的数据库中获得。例如，在GenBank中，人Afamin的氨基酸序列以AAA21612的登录号进行注册，编码它的基因的碱基序列以L32140的登录号进行注册，牛Afamin的氨基酸序列以DAA28569的登录号进行注册，编码它的基因的碱基序列以GJ060968的登录号进行注册。
细胞培养基中所含的Afamin既可以通过公知的方法将血清等中所含的天然的Afamin纯化而得到，也可以是基因重组Afamin。
Wnt蛋白由于特定的丝氨酸残基被脂肪酸(棕榈油酸)修饰，因此具有强的疏水性。因此，众所周知Wnt蛋白在水溶液中容易凝聚或变性，因此纯化和保存非常困难。另一方面，据报道，该特定的丝氨酸残基利用脂肪酸进行修饰对于Wnt蛋白的生理活性而言是必需的，且参加与Frizzled受体家族成员的结合。另外还发现，在水溶液中，Wnt蛋白与Afamin以一对一结合而形成复合体，在保持高的生理活性的同时还可溶解。
因此，既可以通过对表达Wnt蛋白和Afamin双方的细胞进行培养的方法，来制造Wnt蛋白-Afamin复合体，也可以通过共培养Wnt蛋白表达细胞和Afamin表达细胞的方法，来制造Wnt蛋白-Afamin复合体。
细胞培养基中所含的Afamin的浓度没有特别限定，优选为50ng/mL～10μg/mL，更优选为100ng/mL～1μg/mL，进一步优选为300μg/mL～1μg/mL。
＜其它成分＞
本实施方式的类器官培养用细胞培养基还可以包含Rock(Rho-激酶)抑制剂。作为Rock抑制剂，例如，可举出Y-27632((R)-(+)-反式-4-(1-氨基乙基)-N-(4-吡啶基)环己烷甲酰胺二盐酸盐一水合物)、FASUDIL(HA1077)(5-(1,4-二氮杂卓-1-基磺酰基)异喹啉)、H-1152((S)-(+)-2-甲基-1-[(4-甲基-5-异喹啉基)磺酰基]-六氢-1H-1,4-二氮杂卓二盐酸盐)等。作为Rock抑制剂，在使用Y-27632时，优选在分散于单一细胞的上皮细胞的培养的最初两天添加。细胞培养基中所含的Y-27632的浓度优选为约10μM。
细胞培养基中还可以添加有胃泌素(或Leu15-胃泌素等适当的替代物)。细胞培养基中所含的胃泌素(或适当的替代物)的浓度优选为1ng/mL～10μg/mL，更优选为1ng/mL～1μg/mL，进一步优选为5～100ng/mL。
细胞培养基还可以包含至少一种氨基酸。作为氨基酸，例如，可举出L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、L-胱氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-蛋氨酸、L-苯基丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、这些氨基酸的组合等。细胞培养基中所含的L-谷氨酰胺的浓度优选为0.05～1g/L，更优选为0.1～0.75g/L。细胞培养基中所含的其它氨基酸优选为0.001～1g/L，更优选为0.01～0.15g/L。
细胞培养基还可以包含至少一种维生素。作为维生素，例如，可举出硫胺素(维生素B1)、核黄素(维生素B2)、烟酸(维生素B3)、D-泛酸钙(维生素B5)、吡哆醛/吡哆胺/吡哆醇(维生素B6)、叶酸(维生素B9)、氰钴胺素(维生素B12)、抗坏血酸(维生素C)、骨化醇(维生素D2)、DL-α-生育酚(维生素E)、生物素(维生素H)、甲萘醌(维生素K)等。
细胞培养基还可以包含至少一种无机盐。无机盐具有帮助维持细胞的浸透压平衡、帮助调节膜电位的功能。作为无机盐的具体例，可举出钙、铜、铁、镁、钾、钠、锌的盐。盐通常以氯化物、磷酸盐、硫酸盐、硝酸盐和碳酸氢盐的形式使用。更具体的盐可举出CaCl2、CuSO4-5H2O、Fe(NO3)-9H2O、FeSO4-7H2O、MgCl、MgSO4、KCl、NaHCO3、NaCl、Na2HPO4、Na2HPO4-H2O、ZnSO4-7H2O等。
细胞培养基还可以包含至少一种能成为碳能源的糖。作为糖，例如，可举出葡萄糖、半乳糖、麦芽糖、果糖等。其中，优选葡萄糖，特别优选D-葡萄糖(右旋糖)。细胞培养基中所含的糖的浓度优选为1～10g/L。
细胞培养基还可以包含至少一种微量元素。作为微量元素，例如，可举出钡、溴、钴、碘、锰、铬、铜、镍、硒、钒、钛、锗、钼、硅、铁、氟、银、铷、锡、锆、镉、锌、铝、这些元素的离子等。
细胞培养基还可以包含至少一种附加的药剂。作为药剂，可举出已报道改善干细胞培养的营养素或生长因子，例如胆固醇、转铁蛋白、白蛋白、胰岛素、黄体酮、腐胺、亚硒酸盐等。
(工序(e))
接着，在本工序中，使上述盖构件气密性地嵌合于上部容器的开口部。本工序只要在工序(c)之后就可以在任意时间进行。例如，也可以在工序(d)之后进行。如下文的实施例所述，在工序(d)中，在上皮细胞形成了融合的2D类器官的层后进行本工序的情况下，上部容器被隔离。在此情况下，只要在低氧氛围下实施本工序，就能够将上部容器的内部维持于厌氧性条件。
作为在低氧氛围下实施本工序的方法，例如可举出在氮气室之中实施本工序等。
另外，即使不用氮气室，例如，在盖构件或上部容器还包括保持脱氧剂的脱氧部的情况下，脱氧剂也能够吸收或去除上部容器的内部的氧，并能够使上部容器的内部迅速成为厌氧性条件。
或者，即使在不用氮气室且盖构件或上部容器不包括脱氧部的情况下，在上皮细胞消耗掉上部容器内的氧后，上部容器的内部也维持于厌氧性条件(低氧状态)。
另外，在上皮细胞形成融合的2D类器官的层之前使上述盖构件气密性地嵌合于上部容器的开口部，从而在需氧性条件下在上皮细胞培养用培养容器进行孵育的情况下，通过配置于上部容器的一部分的、透过细胞培养基的至少一部分成分且不透过细胞的膜而也可将氧供给至上部容器内，因此在刚刚使盖构件嵌合之后不能使上部容器的内部成为厌氧性条件。
然而，即使在这样的情况下，上皮细胞增殖而在上部容器内形成融合的2D类器官的层之后，上部容器被隔离。进而，在上皮细胞消耗掉上部容器内的氧之后，上部容器的内部可维持于低氧状态。
另外，在工序(d)之后且工序(e)之前，可以还包含在形成有2D类器官的层的上部容器上接种厌氧性细菌的工序。
在工序(d)中上皮细胞形成融合的2D类器官的层之后，能够使上部容器的内部维持于厌氧性条件。因此，如下文的实施例所述，通过在上皮细胞的顶端膜侧接种厌氧性细菌，能够使厌氧性细菌在不接触氧的情况下与上皮细胞接触。其结果，能够将上皮细胞和厌氧性细菌进行共培养。在此情况下，本实施方式的上皮细胞的培养方法可以说是将上皮细胞和厌氧性细菌进行共培养的方法。
另外，在接种厌氧性细菌时，可以将上部容器的内部的培养基更换成呈低氧状态的细菌用培养基。如下文的实施例所述，只要将细胞培养用培养基收容于下部容器中，则即使将上部容器的内部的培养基更换成细菌培养基，也能够维持上皮细胞。作为细菌培养基，可举出改良GAM Bouillon(Nissui公司)、强化梭菌培养基、BHI培养基、BL培养基、LB培养基、EG培养基等。
厌氧性细菌可以是以往难以培养的细菌。厌氧性细菌优选以上皮细胞为宿主因子。作为厌氧性细菌，没有特别限定，可以使用属于梭菌目、拟杆菌目、双歧杆菌目、疣微菌目、脱硫弧菌目等的细菌。
(工序(f))
在本工序中，将使盖构件气密性地嵌合于上部容器的开口部的上皮细胞用培养容器在培养条件下进行进一步孵育。作为培养条件，可举出与工序(d)中的培养条件相同的条件。
另外，在本工序中，可以将收容于下部容器的细胞培养基从能够将上皮细胞中所含的干细胞维持为未分化状态的培养基(下面，有时称为“扩增培养基”)更换成诱导干细胞的分化的培养基(下面，有时称为“分化培养基”)，而诱导上皮细胞的分化。
(上皮细胞与厌氧性细菌的共培养物)
在一实施方式中，本发明提供一种上皮细胞的2D类器官与厌氧性细菌的共培养物。以往，无法在厌氧性条件下培养上皮细胞。因此，以往无法制造上皮细胞的2D类器官与厌氧性细菌的共培养物。
本实施方式的共培养物可以是通过上述的上皮细胞的培养方法而得到的。
利用本实施方式的共培养物，可以在体外简便且有效地分析上皮细胞与厌氧性细菌的相互作用的测量、肠道细菌的营养代谢状态的测量、基于厌氧性细菌进行的上皮细胞的基因表达变化的测量、对上皮细胞与厌氧性细菌的相互作用产生变化的药物的筛选等。
实施例
接下来，给出实施例来进一步详细地说明本发明，但本发明并不限定于以下的实施例。
实验例1
(上皮细胞的培养)
使用图2的(a)～图2的(c)中示出照片的上皮细胞培养用培养容器来培养上皮细胞。作为上部容器，使用市售的插入式细胞培养皿(商品名“ThinCert”、Greiner Bio-One公司)或细胞培养池(商品名“Transwell”、Corning公司)。另外，盖构件自制。作为盖构件的材质，使用丁基橡胶。丁基橡胶的透氧系数为0.99×10-8cm3cm/(cm2·秒·气压)。另外，作为下部容器，使用市售的12孔板或48孔板。
＜细胞培养基的制备＞
作为细胞培养基，准备如下所述的培养基：在市售的Advanced DMEM/F-12培养基(Thermo Fisher SCIENTIFIC公司制造)中，以终浓度为1μg/mL的方式添加人重组R-脊椎蛋白1(R&D systems公司制造)，以终浓度为100ng/mL的方式添加Noggin(Peprotech公司制造)，以终浓度为500nM的方式添加A83-01(Tocris公司制造)，以Wnt3a的终浓度为300ng/mL的方式添加在含血清培养基中培养的来自W-Wnt3a/HEK的培养上清，以终浓度为100ng/mL的方式添加IGF1(Biolegend公司制造)，以终浓度为50ng/mL的方式添加FGF2(peprotech公司制造)，以终浓度为50ng/mL的方式添加小鼠重组EGF(Life Technologies公司)，以终浓度为10μM的方式添加Y-27632(Rock抑制剂、和光纯药公司制造)。下面，有时将该培养基称为MHCO(Modified human colonic organoid)培养基。
＜3D类器官的制备＞
基于由庆应义塾大学医学院伦理委员会批准的伦理研究计划，从得到了说明和同意的消化道肿瘤患者中，采集到距离消化道肿瘤至少5cm以上的部分作为正常粘膜。所采集的组织通过EDTA或Liberase TH提取肠上皮细胞，并包埋于Matrigel(注册商标)。接着，将肠上皮细胞与25μL的Matrigel(注册商标)(BD Bioscience公司制造)一起接种于48孔板上。接着，在孔中添加上述的细胞培养基各100μL，并在37℃下进行培养。自培养开始起每两天进行培养基更换，培养七天，得到3D类器官。
＜上皮细胞培养用培养容器的准备＞
在图2的(a)～图2的(c)中示出照片的上皮细胞培养用培养容器的上部容器中，添加用Advanced DMEM/F-12培养基稀释了的5％Matrigel(注册商标)、或用0.1M盐酸稀释了10倍的10％Cellmatrix type I-C、type IV(Nitta-Gelatin)，在24孔规格的情况下添加50μL，在12孔规格的情况下添加200μL，并在37℃下孵育30分钟以上，在洁净工作台内干燥30～60分钟。之后，将上部容器用Advanced DMEM/F-12培养基清洗3次，用于以下的细胞培养。
＜2D类器官的制备＞
使用TrypLE Express(Thermo Fisher Scientific公司)将上述的3D类器官崩解，形成单一细胞。接着，使所得到的单一细胞悬浮于上述的MHCO培养基，在24孔规格的情况下，在上部容器上接种2×105～4×105个细胞，在37℃的通常氧存在下的孵化器内培养3～5天直至融合。在多个上皮细胞培养用培养容器上同样地接种细胞。
接着，在通常氧存在条件下对融合的上皮细胞培养用培养容器之一进行孵育。
另外，在厌氧室内以不存在氧的方式对融合的上皮细胞培养用培养容器之一进行孵育。其结果，上部容器的内部和下部容器的内部双方维持于厌氧性条件。
另外，将融合的上皮细胞培养用培养容器之一的上部容器的培养基更换成预先在厌氧室内成为厌氧状态的细胞培养基，并使盖构件嵌合于上部容器的开口部，在通常的有氧氛围下进行孵育。其结果，上部容器的内部维持于厌氧性条件，下部容器的内部维持于需氧性条件。上部容器的内部面向上皮细胞的顶端膜侧，下部容器的内部面向上皮细胞的基底膜侧。
图3的(a)～图3的(c)是用电子显微镜拍摄到的各上皮细胞培养用培养容器内的上皮细胞的代表性照片。比例尺为50μm。在图3的(a)中“需氧条件”表示是将上部容器的内部和下部容器的内部双方都维持于有氧氛围下的结果，在图3的(b)中“厌氧条件”表示是将上部容器的内部和下部容器的内部双方均维持于厌氧性条件的结果，在图3的(c)中“厌氧/需氧条件”表示是将上部容器的内部维持于厌氧性条件、且将下部容器的内部维持于需氧性条件的结果。图3的(a)和图3的(c)是自培养开始起5天后拍摄到的照片，图3的(b)是自培养开始起6小时后拍摄到的照片。
其结果，如图3的(a)所示，在需氧条件下能够维持上皮细胞的存活。相对于此，如图3的(b)所示，当将上皮细胞的顶端膜侧和基底膜侧双方都维持于厌氧性条件时，无法维持细胞的存活，可观察到部分死亡而剥离的状态。另一方面，如图3的(c)所示，即使将上皮细胞的顶端膜侧维持于厌氧性条件，如果将基底膜侧维持于需氧性条件，则利用从基底膜侧供给的氧，上皮细胞能维持存货。另外，如下文所述，在图3的(c)中，确认形成有成熟了的2D类器官。
实验例2
(氧浓度的测定)
与实验例1同样操作，用图2的(a)～图2的(c)中示出照片的上皮细胞培养用培养容器培养肠上皮细胞。上部容器的内部维持于厌氧性条件，且下部容器的内部维持于需氧性条件。另外，为了进行比较，还准备了如下试样，即，除了没有接种上皮细胞这一点以外进行了与实验例1同样的操作的试样和在没有使盖构件嵌合于上部容器的开口部的情况下培养上皮细胞的试样。
接着，在自向上部容器接种上皮细胞起3天后，关于各组的试样，测定了上部容器内的细胞培养基中的溶解氧浓度和下部容器内的细胞培养基内的溶解氧浓度。在溶解氧浓度的测定中，使用市售的溶解氧仪(针式·无损氧仪，产品名“Microx4/Microx4 trace”、PreSens公司)。
图4的(a)和图4的(b)是示出溶解氧浓度的测定结果的图表。图4的(a)是示出上部容器内的细胞培养基中的溶解氧浓度的测定结果的图表，图4的(b)是示出下部容器内的细胞培养基中的溶解氧浓度的测定结果的图表。在图4的(a)和图4的(b)中，“顶部”表示上部容器内的结果，“底部”表示下部容器内的结果，“无上皮组织+需氧”表示没有接种上皮细胞的上皮细胞培养用培养容器的结果，“需氧”表示接种上皮细胞且没有使盖构件嵌合于上部容器的开口部的上皮细胞培养用培养容器的结果，“半-需氧厌氧”表示接种上皮细胞且使盖构件嵌合于上部容器的开口部的上皮细胞培养用培养容器的结果。另外，“****”表示在p＜0.0001时存在明显差异，“ns”表示不存在明显差异。
其结果，确认在接种上皮细胞且使盖构件嵌合于上部容器的开口部的上皮细胞培养用培养容器中，上部容器内的细胞培养基中的溶解氧浓度低且维持于厌氧性条件。另一方面，可确认下部容器内的细胞培养基中的溶解氧浓度高且维持于需氧性条件。另外，确认在没有接种上皮细胞的情况下，上部容器内的细胞培养基中的溶解氧浓度高且不能维持厌氧性条件。另外，确认在接种上皮细胞且没有使盖构件嵌合于上部容器的开口部的情况下，上部容器内的细胞培养基中的溶解氧浓度也高且不能维持厌氧性条件。
由以上结果表明，在使盖构件嵌合于上部容器的开口部的情况下，当上部容器内的上皮细胞形成2D类器官而呈融合的状态时，上部容器的内部被隔离，能够维持厌氧性条件。
实验例3
(2D类器官的研究1)
使用图2的(a)～图2的(c)中示出照片的上皮细胞培养用培养容器，在将上部容器内保持于厌氧性条件的状态下培养肠上皮细胞，对于能否维持上皮干细胞、或能否维持分化细胞进行了研究。
首先，与实验例1同样操作，在上部容器的表面形成融合的2D类器官的层。接着，在厌氧室内更换上部容器内的培养基。准备两组同样的上皮细胞培养用培养容器，在一个上皮细胞培养用培养容器中，将盖构件嵌合于上部容器的开口部，而在另一个上皮细胞培养用培养容器中，没有使盖构件嵌合于上部容器的开口部。在37℃、空气环境下孵育这些细胞。其结果，上部容器的内部维持于厌氧性条件，下部容器的内部维持于需氧性条件。
接着，在自更换培养基起三天后，回收各上皮细胞，通过定量RT-PCR，测定干细胞标志物基因和分化标志物基因的表达量。作为干细胞标记，测定LGR5基因、PTK7基因的表达量。另外，作为分化标记，测定杯细胞的标志物即MUC2基因、神经内分泌细胞的标志物即CHGA基因、大肠细胞的标志物即AQP8基因的表达量。
图5的(a)～图5的(e)是示出各基因的表达量的测定结果的图表。在图5的(a)～图5的(e)中，纵坐标表示各基因的表达量的相对值，需氧”表示是以没有使盖构件嵌合于上部容器的开口部而进行培养的结果，“半-厌氧”表示是使盖构件嵌合于上部容器的开口部而进行培养的结果，“ns”表示不存在明显差异。
另外，图5的(a)是示出测定了LGR5基因的mRNA的表达量的结果的图表，图5的(b)是示出测定了PTK7基因的mRNA的表达量的结果的图表，图5的(c)是示出测定了MUC2基因的mRNA的表达量的结果的图表，图5的(d)是示出测定了CHGA基因的mRNA的表达量的结果的图表，图5的(e)是示出测定了AQP8基因的mRNA的表达量的结果的图表。
其结果表明，在使盖构件嵌合于上部容器的开口部且将上皮细胞的顶端膜侧维持于厌氧性条件、将基底膜侧维持于需氧性条件的情况下，也与在需氧条件下以没有使盖构件嵌合于上部容器的开口部而进行培养的情况同样，不仅能够维持并培养上皮干细胞，而且还能够维持并培养构成大肠上皮的所有的功能性分化细胞。
图6的(a)和图6的(b)是用针对杯细胞的标记即MUC2蛋白质的抗体对上述的上皮细胞的切片进行了染色的荧光显微镜照片。作为参照，用鬼笔环肽对F-Actin进行了染色。比例尺为20μm。在图6的(a)和图6的(b)中，向上侧为上端膜侧，向下侧为基底膜侧。另外，在图6的(a)中，“需氧条件”表示是将上部容器的内部和下部容器的内部双方维持于需氧性条件的结果，在图6(b)的中，“厌氧/需氧条件”表示是将上部容器的内部维持于厌氧性条件、且将下部容器的内部维持于需氧性条件的结果。
图6的(a)所示的免疫染色的结果表明，在需氧条件下的2D类器官培养中，与生物体的肠道内同样地通过由杯细胞产出的粘蛋白形成层结构。另外图6的(b)所示的免疫染色的结果表明，在将上皮细胞的顶端膜侧维持于厌氧性条件、且将基底膜侧维持于需氧性条件的情况下，也可观察到与需氧条件同样地通过来自杯细胞的粘蛋白而形成的层结构。
实验例4
(2D类器官的研究2)
在图2的(a)～图2的(c)中示出照片的上皮细胞培养用培养容器中培养肠上皮细胞，在使盖构件嵌合于上部容器的开口部而将上皮细胞的顶端膜侧维持于厌氧性条件、且将基底膜侧维持于需氧性条件的情况下，针对能否维持上皮干细胞、或能否维持分化细胞也进行了研究。
首先，与实验例1同样操作，在上部容器内形成了融合的2D类器官的层。接着，在氮气室内更换上部容器内的培养基。准备两组同样的上皮细胞培养用培养容器，在一个上皮细胞培养用培养容器中，将盖构件嵌合于上部容器的开口部，而在另一个中，没有使盖构件嵌合于上部容器的开口部。接着，在37℃、空气环境下孵育这些细胞。其结果，在将盖构件嵌合于上部容器的开口部的情况下，上部容器的内部维持于厌氧性条件，下部容器的内部维持于需氧性条件。
接着，在自更换培养基起三天后，对各上皮细胞进行免疫染色，并用荧光显微镜进行观察。具体而言，为了验证上皮细胞的顶端极性，用针对紧密连接的标记即ZO-1蛋白的抗体、针对粘附连接的标记即CDH1蛋白的抗体、针对杯细胞的标记即MUC2蛋白的抗体、针对神经内分泌细胞的标记即CHGA蛋白的抗体对各组的细胞进行了染色。另外，作为参照，用鬼笔环肽对F-肌动蛋白进行了染色。
图7的(a)和图7的(b)是示出免疫染色的结果的荧光显微镜照片。比例尺为50μm。在图7的(a)中，“需氧条件”表示是将上部容器的内部和下部容器的内部双方维持于需氧性条件的结果，在图7的(b)中，“厌氧/需氧条件”表示是将上部容器的内部维持于厌氧性条件、且将下部容器的内部维持于需氧性条件的结果。
其结果表明，在使盖构件嵌合于上部容器的开口部而将上皮细胞的顶端膜侧维持于厌氧性条件、且将基底膜侧维持于需氧性条件的情况下，也与在需氧条件下以没有使盖构件嵌合于上部容器的开口部而进行培养的情况同样，正常形成紧密连接、粘附连接，也保持顶端极性。另外表明，在仅上皮细胞的顶端侧维持于厌氧条件的情况下，也可以由上皮干细胞分化作为功能性分化细胞的杯细胞、神经内分泌细胞。
实验例5
(上皮细胞与厌氧性细菌的共培养1)
与实验例1同样操作，在图2的(a)～图2的(c)中示出照片的上皮细胞培养用培养容器中培养肠上皮细胞，在上部容器的表面形成了融合的2D类器官的层。接着，在自向上部容器接种上皮细胞五天后，在厌氧室内，舍弃上部容器内的培养基，在处于厌氧状态的细胞培养基中接种了悬浮的青春双歧杆菌(B.adolescentis)。青春双歧杆菌是专性厌氧性细菌。
准备两组接种了青春双歧杆菌的上皮细胞培养用培养容器，在其中一个的上部容器的开口部嵌合盖构件。另外，在另一个的上部容器的开口部没有嵌合盖构件而保持开口状态。接着，在37℃、空气环境下进行孵育。其结果，对于前者而言，上部容器的内部维持于厌氧性条件，且下部容器的内部维持于需氧性条件。另外，对于后者而言，上部容器的内部和下部容器的内部双方维持于需氧性条件。
图8的(a)和图8的(b)是自接种青春双歧杆菌起一天后的显微镜照片。比例尺为50μm。在图8的(a)中，“厌氧/需氧”表示是将上部容器的内部维持于厌氧性条件、且将下部容器的内部维持于需氧性条件的结果。另外，在图8的(b)中，“需氧/需氧”表示是将上部容器的内部和下部容器的内部双方维持于需氧性条件的结果。
其结果，如图8的(a)所示，在将上部容器的内部维持于厌氧性条件、且将下部容器的内部维持于需氧性条件的情况下，可观察到青春双歧杆菌与上皮细胞一起增殖。在图8的(a)中，用箭头表示青春双歧杆菌的菌落。
另一方面，如图8的(b)所示，在将上部容器的内部和下部容器的内部双方维持于需氧性条件的情况下，未观察到青春双歧杆菌的增殖。
由该结果表明，将上皮细胞的顶端膜侧维持于厌氧性条件，将基底膜侧维持于需氧性条件，并在上皮细胞的顶端膜侧接种厌氧性细菌，由此能够对上皮细胞与厌氧性细菌进行共培养。
实验例6
(上皮细胞与厌氧性细菌的共培养2)
与实验例5同样操作，将除青春双歧杆菌以外的厌氧性细菌与上皮细胞进行共培养。作为厌氧性细菌，使用脆弱拟杆菌(B.fragilis)、丁酸梭菌(C.butyricum)和嗜黏蛋白阿克曼菌(A.muciniphila)。将上部容器的内部维持于厌氧性条件、且将下部容器的内部维持于需氧性条件而进行培养。
图9的(a)～图9的(f)是自接种各厌氧性细菌起一天后的显微镜照片。图9的(a)是脆弱拟杆菌的结果。比例尺为50μm。图9的(b)是将图9的(a)的用虚线方块所包围的区域放大了的显微镜照片。比例尺为10μm。
另外，图9的(c)是丁酸梭菌的结果。比例尺为50μm。另外，用箭头表示丁酸梭菌的菌落。图9的(d)是将图9的(c)的用虚线方块所包围的区域放大了的显微镜照片。比例尺为10μm。
另外，图9的(e)是嗜黏蛋白阿克曼菌的结果。比例尺为20μm。图9的(f)是将图9的(e)的用虚线方块所包围的区域放大了的显微镜照片。比例尺为10μm。
由该结果表明，将上皮细胞的顶端膜侧维持于厌氧性条件，将基底膜侧维持于需氧性条件，并在上皮细胞的顶端膜侧接种厌氧性细菌，由此能够对脆弱拟杆菌、丁酸梭菌和嗜黏蛋白阿克曼菌与上皮细胞进行共培养。该结果表明，通过本实验例的方法，能够培养各种各样的厌氧性细菌。
特别是，嗜黏蛋白阿克曼菌是在其生长中必须有由成熟的上皮细胞产生的粘蛋、且需要厌氧性的微生物，是以往在体外无法培养的微生物。该结果表明，通过本发明的方法，还可以培养目前在体外无法培养的嗜黏蛋白阿克曼菌这样的肠道细菌。
实验例7
(上皮细胞与厌氧性细菌的共培养3)
在未分化的上皮细胞中几乎确认不到杯细胞，且未见由杯细胞产生的粘蛋白。嗜黏蛋白阿克曼菌的生长需要粘蛋白，还需要厌氧性条件。
在本实验例中，与实验例5同样操作，在成熟的上皮细胞的2D类器官上，共培养嗜黏蛋白阿克曼菌并研究菌的增殖。成熟的上皮细胞的2D类器官用MHCO培养基进行培养。另外，为了进行比较，在未分化的上皮细胞的2D类器官上对嗜黏蛋白阿克曼菌进行共培养。
未分化的上皮细胞的2D类器官如下制作：使用添加了p38抑制剂和烟酰胺的未分化培养基，在阻碍系统分化的条件下形成上皮细胞的3D类器官后，制成2D类器官。
在MHCO培养基中添加终浓度3μM的SB202190(Sigma-Aldrich公司)和终浓度10mM的烟酰胺(Sigma-Aldrich公司)来制备未分化培养基。
图10是示出对所培养的嗜黏蛋白阿克曼菌进行定量的结果的图表。在图10中，“MHCO”表示是对使用MHCO培养基来进行培养的、在成熟的上皮细胞上进行共培养的嗜黏蛋白阿克曼菌进行定量的结果，“未分化”表示是对使用未分化培养基来进行培养的、在未分化的上皮细胞上进行共培养的嗜黏蛋白阿克曼菌进行定量的结果。另外，“**”表示在p＜0.01下存在明显差异。
其结果表明，在未分化的上皮细胞上几乎没有确认到嗜黏蛋白阿克曼菌的增殖。相对于此，在成熟的上皮细胞上确认嗜黏蛋白阿克曼菌的增殖。该结果进一步支持：通过本发明的方法，能够制造由成熟的上皮细胞构成的2D类器官，且能够共培养厌氧性微生物。
产业上的可利用性
根据本发明，可以提供一种对上皮细胞进行平面培养、且简便地控制顶端膜侧和基底膜侧的氧分压而在更接近生物体内的环境下进行培养的技术。
附图标记说明
100···上皮细胞培养用培养容器、110···上部容器、111···开口部、120···盖构件、130···细胞培养基、140···下部容器、112···区域、113···膜、130、131···培养基、150···上皮细胞、151···顶端膜侧、152···基底膜侧。

Claims (12)

1.一种上皮细胞培养用培养容器，其中，包括：
上部容器；
与所述上部容器的开口部气密性地嵌合的盖构件；和
收容所述上部容器和细胞培养基的下部容器，
所述上部容器的与所述细胞培养基接触的区域的至少一部分由透过所述细胞培养基的至少一部分的成分且不透过细胞的膜构成，
所述盖构件的材质的透氧系数为1.0×10-6cm3cm/(cm2·秒·气压)以下。
2.根据权利要求1所述的上皮细胞培养用培养容器，其中，
所述盖构件或所述上部容器还包括保持脱氧剂的脱氧部。
3.一种上皮细胞的培养方法，其中，包含：
工序(a)，用细胞外基质涂覆权利要求1或2所述的上皮细胞培养用培养容器的所述上部容器的表面；
工序(b)，将细胞培养基和所述上部容器收容于所述下部容器；
工序(c)，在所述细胞外基质上接种上皮细胞；
工序(d)，在培养条件下将所述上皮细胞培养用培养容器进行孵育，结果，所述上皮细胞在所述细胞外基质上形成2D类器官的层；
工序(e)，使所述盖构件气密性地嵌合于所述上部容器的开口部；和
工序(f)，在培养条件下将所述上皮细胞培养用培养容器进行进一步孵育。
4.根据权利要求3所述的培养方法，其中，
所述上皮细胞是使经立体培养而成的上皮细胞的3D类器官分散于单一细胞中而得到的细胞。
5.根据权利要求3或4所述的培养方法，其中，
所述细胞培养基包含：
选自由胰岛素样生长因子1(IGF1)、成纤维细胞生长因子2(FGF2)和EGF样生长因子构成的组中的至少一种；和
选自由Wnt激动剂、骨形成因子(BMP)抑制剂和转化生长因子-β(TGF-β)抑制剂构成的组中的至少一种。
6.根据权利要求5所述的培养方法，其中，
所述EGF样生长因子包含上皮调节素(EREG)。
7.根据权利要求5或6所述的培养方法，其中，
所述EGF样生长因子包括上皮生长因子(EGF)。
8.根据权利要求5～7中任一项所述的培养方法，其中，
所述Wnt激动剂包括Wnt蛋白与Afamin的复合体。
9.根据权利要求3～8中任一项所述的培养方法，其中，
在低氧氛围下实施所述工序(e)。
10.根据权利要求3～9中任一项所述的培养方法，其中，
在所述工序(d)之后且工序(e)之前，还包括在形成有所述2D类器官的层的所述上部容器接种厌氧性细菌的工序。
11.一种上皮细胞的2D类器官与厌氧性细菌的共培养物。
12.根据权利要求11所述的共培养物，其中，
所述共培养物通过权利要求10所述的培养方法而得到。
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