CN109072179A - 细胞培养基、培养方法以及类器官 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种细胞培养基，通过该细胞培养基能够在无血清的情况下长时间培养上皮干细胞、上皮癌细胞或包含这些细胞中的至少任一种细胞的组织。本发明的细胞培养基包含：Wnt激动剂，其含有Wnt蛋白质与其稳定物质Afamin形成的复合物和R‑脊椎蛋白(R‑spondin)，以及选自于由促分裂生长因子、骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)抑制剂、转化生长因子‑β(transforming growth factor‑β，TGF‑β)抑制剂以及p38抑制剂所构成的组中的至少一种。

Description

细胞培养基、培养方法以及类器官
技术领域
本发明涉及一种细胞培养基、培养方法以及类器官。
本申请基于2016年2月18日在日本提出的日本特愿2016-029060号申请主张优先权，并在此援引其内容。
背景技术
肠道是人体中与外界接触面积最大的脏器，具有消化吸收等对于维持生命而言不可或缺的功能。肠道功能大部分由覆盖其内层的肠道上皮承担。肠道上皮由包含三个系统的分化细胞(产粘液细胞、吸收上皮细胞、内分泌细胞)的绒毛与主要包含未分化增殖细胞的隐窝两种划分单位构成。在小肠隐窝中，产生抗菌肽的潘氏(Paneth)细胞存在于隐窝底部。近来，通过分子遗传学细胞谱系分析表明，被潘氏细胞夹持的Lgr5阳性细胞[也称为“CBC(Crypt base columnar)细胞”]为肠道上皮干细胞。Lgr5阳性肠道上皮干细胞产生被称为短暂扩充细胞(Transit amplifying cells)的前体细胞，但这些前体细胞不具备永久自我复制能力，并且分化潜能也受到一个至三个系统的限制。短暂扩充细胞在隐窝内分裂2次至4次，同时进行分化，在绒毛内完成终末分化。这些分化细胞在绒毛的顶点剥离，通过细胞凋亡而死亡。肠道上皮是新陈代谢快速的组织，从隐窝的干细胞移动至绒毛的顶点用时4天至5天。Paneth细胞与其它分化细胞不同，在分化的同时向隐窝底部移动，具有长达两个月的细胞寿命。
由一些转基因小鼠的结果可知，肠道上皮干细胞的自我复制机制由Wnt信号和骨形态发生蛋白(Bone Morphogenetic Protein，BMP)信号进行调控。在Wnt信号的抑制分子APC(Adenomatous polyposis coli)从肠道上皮上特异性敲除的小鼠中，表现出肠道上皮细胞的过度增生及腺瘤形成。另外，在将作为BMP抑制蛋白的头蛋白(Noggin)过表达于肠道上皮细胞的小鼠中，观察到异位隐窝形成，表明BMP信号起到抑制肠道上皮干细胞的作用。实际上，发现Wnt信号具有在隐窝底部活性变高且在管腔侧变低的梯度(倾斜度)。另一方面，已知BMP信号表现出与Wnt信号相反的梯度。
另外，长期以来，无法实现肠道上皮细胞的长时间培养。一般认为其原因在于维持肠道上皮干细胞所需的生长因子尚不清楚。近来，将肠道上皮干细胞粘附在细胞外基质上，在添加有BMP抑制剂、促分裂生长因子以及Wnt激动剂且包含用于动物细胞或人细胞的基础培养基的细胞培养基存在下进行培养，由此，成功地长时间维持了肠道上皮干细胞(例如，参见专利文献1)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特许第5458112号公报
发明内容
发明所要解决的课题
在专利文献1中记载的培养方法所用的Wnt激动剂中，Wnt蛋白质可以通过将来自Wnt基因过表达的小鼠成纤维细胞的L细胞等与血清共同培养而成的上清(下面称为“含血清的Wnt上清”)而稳定地获得。含血清的Wnt上清所含的胎牛血清等动物血清是Wnt蛋白质稳定化所必需的。由含血清的Wnt上清进行纯化而成的Wnt蛋白质可以通过表面活性剂而稳定化，与含血清的Wnt上清相比，纯化Wnt蛋白质的活性显著降低。人培养类器官需要高活性的Wnt蛋白质刺激，因此必须使用含血清的Wnt上清。然而，采用包含含血清的Wnt上清的现有培养方法所得到的上皮干细胞或者包含所述上皮干细胞的类器官，由于包含源自血清的杂质等，因此难以用于再生医疗等，纯化Wnt蛋白质所含的表面活性剂具有细胞毒性。而且，在包含Wnt上清的现有培养基、培养方法中，无法进行一部分的人类组织、癌组织的培养。
为了解决上述课题，本发明的目的在于：提供一种细胞培养基，通过该细胞培养基能够在无血清的情况下长时间培养上皮干细胞、上皮癌细胞或包含这些细胞中的至少任一种细胞的组织；并且，使在无血清的情况下制作人培养类器官成为可能；并且，使以往无法实现的经由组织进行的培养成为可能。
用于解决课题的手段
为了解决上述课题，本发明人等反复潜心研究发现，血清中的Afamin蛋白质有利于Wnt蛋白质的稳定及增溶，从而完成了本发明。本发明人等着眼于可以在血清中所含Afamin的存在下在作为脂溶性蛋白质的Wnt蛋白质的水溶性培养基中实现稳定，通过使用包含Wnt蛋白质及Afamin的培养基来使本发明作为无血清且不含表面活性剂的培养基以及使用该培养基的培养方法得以完成。
即，本发明包括以下技术方案。
[1]一种细胞培养基，其特征在于，包含：
Wnt激动剂，其含有Wnt蛋白质与其稳定物质Afamin形成的复合物和R-脊椎蛋白(R-spondin)；
选自于由促分裂生长因子、骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)抑制剂、转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)抑制剂以及p38抑制剂所构成的组中的至少一种。
[2]根据[1]所述的细胞培养基，其中，所述Wnt蛋白质是选自于由Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt9a、Wnt9b、Wnt10a、Wnt10b、Wnt11以及Wnt16所构成的组中的至少一种。
[3]根据[1]或[2]所述的细胞培养基，其中，所述R-脊椎蛋白是选自于由R-脊椎蛋白1、R-脊椎蛋白2、R-脊椎蛋白3以及R-脊椎蛋白4所构成的组中的至少一种。
[4]根据[1]至[3]中任一项所述的细胞培养基，其中，所述促分裂生长因子是上皮生长因子(Epidermal Growth Factor，EGF)。
[5]根据[1]至[4]中任一项所述的细胞培养基，其中，所述BMP抑制剂是头蛋白(Noggin)。
[6]根据[1]至[5]中任一项所述的细胞培养基，其中，所述TGF-β抑制剂是A83-01。
[7]根据[1]至[6]中任一项所述的细胞培养基，其中，该培养基是无血清培养基。
[8]一种上皮干细胞、上皮癌细胞或包含这些细胞中的至少任一种细胞的组织的培养方法，其特征在于，包括：
细胞外基质制备工序，制备细胞外基质；
粘附工序，将上皮干细胞、上皮癌细胞或包含这些细胞中的至少任一种细胞的组织在所述细胞外基质上进行粘附；
类器官形成工序，在所述粘附工序之后添加[1]至[7]中任一项所述的细胞培养基，培养所述上皮干细胞、所述上皮癌细胞或包含这些细胞中的至少任一种细胞的组织，形成类器官。
[9]一种上皮干细胞或包含上皮干细胞的组织的培养方法，其特征在于，包括：
细胞外基质制备工序，制备细胞外基质；
粘附工序，将上皮干细胞或包含上皮干细胞的组织在所述细胞外基质上进行粘附；
类器官形成工序，在所述粘附工序之后添加[7]所述的细胞培养基，培养所述上皮干细胞或包含所述上皮干细胞的组织，形成类器官。
[10]一种类器官，其特征在于，通过[8]或[9]所述的培养方法来获得。
[11]根据[10]所述的类器官，其中，该类器官用于再生医疗。
[12]一种类器官，其特征在于，通过[9]所述的培养方法来获得，且用于移植。
发明效果
采用本发明的细胞培养基，能够长时间培养来自包括人类在内的哺乳动物的上皮干细胞、上皮癌细胞或包含这些细胞中的至少任一种细胞的组织、或者以往不能培养的组织。另外，还能够从所述细胞和所述组织中的至少任一种高效地形成类器官。
附图说明
图1中，(A)是表示实施例1的各培养基中肠道干细胞的原代培养(Passage0)从开始其培养起6天后的情况的图像。(B)是实施例1的各培养基中的原代培养(Passage0)从开始其培养起6天后的肠道干细胞的类器官在孔中所占的面积的量化图表。
图2中，(A)是表示实施例1的各培养基中肠道干细胞的第一次传代(Passage1)从开始其培养起6天后的情况的图像。(B)是实施例1的各培养基中第一次传代(Passage1)从开始其培养起6天后的肠道干细胞的类器官在孔中所占的面积的量化图表。
图3中，(A)是表示实施例1的各培养基中肠道干细胞的第二次传代(Passage2)从开始其培养起5天后的情况的图像。(B)是实施例1的各培养基中第二次传代(Passage2)从开始其培养起5天后的肠道干细胞的类器官在孔中所占的面积的量化图表。
图4是表示实施例3的NOG小鼠的大肠粘膜剥脱的情况的概略剖面图及图像。
图5中，左图是示意性表示向实施例3的NOG小鼠的大肠粘膜剥脱部移植人大肠类器官的情况的概略图。右图是使用内镜观察到的实施例3的NOG小鼠的移植部位移植2周后及16周后的明场及暗场下的图像。
图6中，上图是表示实施例3从移植起28天后的NOG小鼠的移植部位的组织切片的HE(Hematoxylin-Eosin，苏木精-伊红)染色结果的图像。下方的左图是表示实施例3从移植起28天后的NOG小鼠的移植部位的组织切片使用抗人细胞角蛋白抗体进行免疫染色以及使用赫斯特(Hoechst)(注册商标)进行核染色后的结果的图像。下方的右图是表示实施例3从移植起28天后的NOG小鼠的移植部位的组织切片利用原位(in situ)杂交分析进行Lgr5检测及使用赫斯特(Hoechst)(注册商标)进行核染色后的结果的图像。
具体实施方式
<<细胞培养基>>
作为一种实施方式，本发明提供一种细胞培养基，该细胞培养基包含：Wnt激动剂，其含有Wnt蛋白质与其稳定物质Afamin形成的复合物和R-脊椎蛋白(R-spondin)；选自于由促分裂生长因子、骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)抑制剂、转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)抑制剂以及p38抑制剂所构成的组中的至少一种。
本实施方式的细胞培养基在实质上不含杂质，能够长时间培养上皮干细胞、上皮癌细胞或包含这些细胞中的至少任一种细胞的组织。另外，能够从上皮干细胞、上皮癌细胞或包含这些细胞中的至少任一种细胞的组织高效地形成类器官。另外，使用本发明的细胞培养基所培养的上皮干细胞能够长期保持分化潜能，肿瘤发病频率极低。
本说明书中，“上皮干细胞”是指具有长期自我复制功能和针对上皮分化细胞的多向分化潜能的细胞，是指来自上皮组织的干细胞。作为上皮组织，例如，可举出：角膜、口腔粘膜、皮肤、结膜、膀胱、肾小管、肾脏、消化器官[食道、胃、十二指肠、小肠(包含空肠及回肠)、大肠(包括结肠)]、肝脏、胰腺、乳腺、唾液腺、泪腺、前列腺、发根、气管、肺等。本实施方式的细胞培养基优选用于培养来自上述中的消化器官[食道、胃、十二指肠、小肠(包含空肠及回肠)、大肠(包含结肠)]、肝脏、胰腺的上皮干细胞。
另外，本说明书中，“上皮癌细胞”是指来自上述上皮组织的细胞进行癌化后的细胞。
本说明书中，“类器官”是指通过将细胞高密度地积蓄在所控制的空间内并自组织而成的立体细胞组织体。
<无血清的细胞基础培养基>
本实施方式的细胞培养基中包括任何无血清的细胞基础培养基。本实施方式的细胞培养基优选用于动物细胞或人细胞。作为该无血清的细胞基础培养基，例如，可举出：通过碳酸类缓冲液进行缓冲而使pH成为7.2以上且7.6以下的规定合成培养基等。更具体而言，可举出：补充有谷氨酰胺、胰岛素、青霉素或链霉素、以及转铁蛋白而成的达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基/ham’sF-12混合培养基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium：Nutrient Mixture F-12；DMEM/F12)。另外，还可举出：补充有谷氨酰胺、胰岛素、青霉素或链霉素、以及转铁蛋白的RPMI1640培养基(Roswell Park Memorial Institute1640medium)。另外，还可举出：补充有谷氨酰胺以及青霉素或链霉素的Advanced-DMEM/F12，以及补充有谷氨酰胺以及青霉素或链霉素的AdvancedRPMI培养基等。
另外，本实施方式的细胞培养基中的无血清的细胞基础培养基可以进一步补充有纯化后的天然、半合成或合成生长因子。作为生长因子，例如，可举出：B-27Supplement(Thermo Ficher SCIENTIFIC公司制造)、N-乙酰-L-半胱氨酸(Sigma公司制造)、N-2Supplement(Thermo Ficher SCIENTIFIC公司制造)等。这些生长因子可以刺激部分细胞的增殖。需要说明的是，本实施方式的细胞培养基实质上不含胎牛血清(fetal bovineserum(FBS)或fetal calf serum)等不确定成分。
需要说明的是，本说明书中，“实质上不含不确定成分”是指如下状态：本实施方式的细胞培养基完全不含血清等不确定成分，即本实施方式的细胞培养基是无血清培养基；或者，本实施方式的细胞培养基仅包含对细胞不会造成影响的程度的量的血清等不确定成分。其中，优选本实施方式的细胞培养基是无血清培养基。
<Wnt激动剂>
本说明书中，“Wnt激动剂”是指在细胞内激活T细胞因子(T-cell factor,下面也称为TCF)/淋巴样增强因子(lymphoid enhancer factor，下面也称为LEF)介导转录的药剂。因此，Wnt激动剂不限定于Wnt家族蛋白质，其包含与Frizzled(卷曲)受体家族成员结合而激活的Wnt激动剂、细胞内β-连环蛋白降解的抑制剂以及TCF/LEF的激活物质。Wnt激动剂在细胞内刺激Wnt活性，以使得Wnt活性水平与不存在该Wnt激动剂时的Wnt活性水平相比达到至少1.1倍、优选至少1.2倍、更优选至少10倍、进一步优选至少50倍、特别优选至少100倍、最优选至少300倍。
Wnt活性可以使用本领域技术人员公知的方法、例如通过pTOPFLASH以及pFOPFLASH Tcf荧光素酶报告基因构建体测定Wnt的转录活性来进行检测(参考文献：Korinek et al.，1997.Science 275：1784-1787)。
在培养上皮干细胞、上皮癌细胞或包含这些细胞中的至少任一种细胞的组织时，必须包含Wnt激动剂。作为本实施方式的细胞培养基所含的Wnt激动剂，优选为Wnt蛋白质与Afamin形成的复合物、以及R-脊椎蛋白(R-spondin)中的至少任一者，更优选包含Wnt蛋白质与Afamin形成的复合物、以及R-脊椎蛋白两者。在本实施方式的细胞培养基中，通过包含Wnt蛋白质与Afamin形成的复合物、以及R-脊椎蛋白，上皮干细胞能够更有效地形成类器官。
[Wnt蛋白质]
Wnt蛋白质是Wnt激动剂的一种，对其来源没有特别限定，可以使用来自各种生物的Wnt蛋白质。其中，优选来自哺乳动物的Wnt蛋白质。作为哺乳动物，例如，可举出：人、小鼠、大鼠、牛、猪、兔子等。作为哺乳动物的Wnt蛋白质，可举出：Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt9a、Wnt9b、Wnt10a、Wnt10b、Wnt11、Wnt16等。在本实施方式的细胞培养基中，Wnt蛋白质可以组合多种进行使用。
作为Wnt蛋白质的制备方法，例如，可举出通过使用Wnt蛋白质表达细胞来制备的方法等。在Wnt蛋白质表达细胞中，对于细胞的来源(生物种、培养形态等)没有特别限定，只要是稳定表达Wnt蛋白质的细胞即可，可以是瞬时表达Wnt蛋白质的细胞。作为Wnt蛋白质表达细胞，例如，可举出：稳定表达小鼠Wnt3a的L细胞(ATCC CRL-2647)、稳定表达小鼠Wnt5a的L细胞(ATCC CRL-2814)等。另外，Wnt蛋白质表达细胞可以使用公知的基因重组技术来制备。即，通过将编码所需的Wnt蛋白质的DNA插入公知的表达载体中、并将得到的表达载体导入至适当的宿主细胞，能够制备Wnt蛋白质表达细胞。对于编码所需的Wnt蛋白质的基因的碱基序列而言，能够从诸如GenBank等公知的数据库获得。
由Wnt蛋白质表达细胞所表达的Wnt蛋白质，只要具有Wnt活性就可以是Wnt蛋白质的片断，也可以是包含除Wnt蛋白质的氨基酸序列以外的氨基酸序列的物质。对于除Wnt蛋白质的氨基酸序列以外的氨基酸序列，没有特别限定，例如，可举出亲和标记物的氨基酸序列等。另外，Wnt蛋白质的氨基酸序列无需完全一致于从GenBank等公知数据库中可获得的氨基酸序列，只要具有Wnt活性，就可以是与可从公知数据库中获得的氨基酸序列在实质上相同的氨基酸序列。
作为与可从GenBank等公知数据库中获得的Wnt蛋白质的氨基酸序列在实质上相同的氨基酸序列，例如，可举出：在可从公知数据库中获得的氨基酸序列中缺失、取代或添加了一个至多个氨基酸而成的氨基酸序列等。“缺失、取代或添加了一个至多个氨基酸而成的氨基酸序列”是指通过诸如定点诱变法等公知的变构肽制备方法等使氨基酸以能够缺失、取代或添加的程度的数目(优选10个以下，更优选7个以下，进一步优选6个以下)进行缺失、取代或添加而得到的氨基酸序列。另外，作为实质上相同的氨基酸序列，例如，可举出：与可从公知数据库中获得的氨基酸序列的同一性至少为80％以上、优选至少为85％以上、更优选至少为90％以上、进一步优选至少为92％以上、特别优选至少为95％以上、最优选至少为99％以上的氨基酸序列等。
Wnt蛋白质的活性可通过例如TCF报告基因实验来确认。一般而言，TCF报告基因实验是指：将具有在Wnt信号进入细胞后被特异性激活的转录因子T-cell factor(TCF)的结合序列的荧光素酶基因进行导入、并通过荧光素酶的发光简单地评价Wnt蛋白质活性强度的方法(参考文献：Molenaar et al.,Cell,86,391,1996.)。作为除TCF报告基因实验以外的方法，可举出：对于Wnt信号进入后细胞内的β连环蛋白稳定的情况加以利用而通过蛋白质印迹法对β连环蛋白的量进行定量评价的方法等(参考文献：Shibamoto et al.,Gene tocells,3,659,1998.)等。另外，关于像Wnt5a等那样经由非经典途径(non-canonicalpathway)向细胞发送信号的Wnt蛋白质，可以使用通过评价作为细胞内接头蛋白的Dvl2的磷酸化来评价Wnt蛋白质活性的方法等(参考文献：Kikuchi et al.,EMBO J.,29,3470,2010.)。
[R-脊椎蛋白(R-spondin)]
作为Wnt激动剂的一种的R-脊椎蛋白，可举出由R-脊椎蛋白1、R-脊椎蛋白2、R-脊椎蛋白3、以及R-脊椎蛋白4所构成的R-脊椎蛋白家族。R-脊椎蛋白家族是分泌蛋白，已知其与Wnt信号传导通路的激活以及调控有关。在本实施方式的细胞培养基中，可以组合多种R-脊椎蛋白进行使用。
只要具有R-脊椎蛋白活性即可，可以是R-脊椎蛋白的片断，也可以是具有除R-脊椎蛋白的氨基酸序列以外的氨基酸序列的物质。
[含量]
本实施方式的细胞培养基所含的Wnt蛋白质的浓度为50ng/mL以上，优选为100ng/mL以上且10μg/mL以下，更优选为200ng/mL以上且1μg/mL以下，进一步优选为300ng/mL以上且1μg/mL以下。上皮干细胞培养期间，优选每2天向培养用培养基添加Wnt激动剂，优选每4天更换新的细胞培养基。
<Afamin>
本说明书中，“Afamin”是指属于白蛋白家族的糖蛋白质，已知其存在于血液或体液中。通常添加在用于细胞培养的培养基中的血清含有Afamin，且该Afamin来自采集该血清的动物。由于血清中包含除Afamin以外的杂质等，因此，优选在本实施方式的细胞培养基中不使用血清而单独使用Afamin。
对于本实施方式的细胞培养基所含的Afamin的来源没有特别限定，可以使用来自各种生物的Afamin。其中，优选来自哺乳动物的Afamin。作为哺乳动物，例如，可举出与上述“Wnt蛋白质”部分中相同的动物。主要的哺乳动物的Afamin的氨基酸序列以及编码该序列的基因的碱基序列可以从诸如GenBank等公知数据库中获得。例如，在GenBank中，人Afamin的氨基酸序列以入藏登记号AAA21612进行注册，编码该氨基酸的基因的碱基序列以入藏登记号L32140进行注册；牛Afamin的氨基酸序列以入藏登记号DAA28569进行注册，编码该氨基酸的基因的碱基序列以入藏登记号GJ060968进行注册。
本实施方式的细胞培养基所含的Afamin可以是血清等所含的天然Afamin通过公知的方法纯化而成的，也可以是重组Afamin。重组Afamin可以适当使用公知的基因重组技术来制备。作为重组Afamin的制备方法，例如，可以将编码Afamin的DNA插入公知的表达载体并将得到的表达载体导入适当的宿主细胞以表达重组Afamin，并使用公知的纯化方法进行纯化从而制得重组Afamin。重组Afamin也可以是附带有亲和标记物的Afamin。对于附带的亲和标记物没有特别限定，可以从公知的亲和标记物中适当选择使用。作为亲和标记物，优选是由特异性抗体识别的亲和标记物，例如可举出：FLAG标记物、MYC标记物、HA标记物、V5标记物等。
上述Wnt蛋白质，由于特定的丝氨酸残基被脂肪酸(棕榈油酸)修饰，因此具有强疏水性。众所周知，由此Wnt蛋白质容易在水溶液中凝聚或变性，因而非常难以纯化及保存。
另一方面，有报告称，该特定的丝氨酸残基利用脂肪酸进行的修饰是Wnt蛋白质的生理活性所必需的，其参加与Frizzled受体家族成员的结合。本发明人等发现，Wnt蛋白质在水溶液中与Afamin一一对应地结合、形成复合物，在保持较高的生理活性的同时实现可溶。
基于该发现，可以通过对Wnt蛋白质和Afamin这两者进行表达的细胞的培养方法来制备Wnt蛋白质-Afamin复合物，也可以通过共培养Wnt蛋白质表达细胞和Afamin表达细胞的方法来制备Wnt蛋白质-Afamin复合物。Wnt蛋白质-Afamin复合物中的Wnt蛋白质的活性可以使用与上述[Wnt蛋白质]相同的方法进行评价。
对于本实施方式的细胞培养基所含的Afamin的浓度没有特别限定，优选为50ng/mL以上且10μg/mL以下，更优选为100ng/mL以上且1μg/mL以下，进一步优选为300μg/mL以上且1μg/mL以下。
<促分裂生长因子>
作为本实施方式的细胞培养基所含的促分裂生长因子，例如，可举出：上皮生长因子(Epidermal Growth Factor，EGF)、转化生长因子-α(Transforming Growth Factor-α，TGF-α)、碱性成纤维细胞生长因子(basic Fibroblast Growth Factor，bFGF)、脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)、角质细胞生长因子(keratinocyte growth factor，KGF)等生长因子家族。这些促分裂生长因子可以组合多种进行使用。
EGF是对于各种培养外胚层细胞以及中胚层细胞有强效的促分裂因子，对部分成纤维细胞的特异性细胞分化具有显著影响。EGF前体作为膜结合分子存在，其通过蛋白质分解而断裂，生成用于刺激细胞的53-氨基酸肽类激素。
作为本实施方式的细胞培养基所含的促分裂生长因子，其中优选EGF。本实施方式的细胞培养基所含的EGF的浓度优选为5ng/mL以上且500ng/mL以下，更优选为10ng/mL以上且400ng/mL以下，进一步优选为50ng/mL以上且200ng/mL以下。
另外，在本实施方式的细胞培养基中包含bFGF(优选FGF10或FGF7)的情况下，也优选为与EGF相同的含量。在使用多种FGF、例如FGF7和FGF10的情况下，优选FGF的总含量在上述范围内。培养干细胞期间，优选每2天向培养用培养基添加促分裂生长因子，并优选每4天更换新的培养用培养基。
<BMP抑制剂>
骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)作为二聚配体与由两种不同的受体丝氨酸/苏氨酸激酶、I型受体和II型受体所构成的受体复合物进行结合。II型受体将I型受体进行磷酸化，从而激活该受体激酶。接着，该I型受体将特异性受体底物(SMAD)进行磷酸化，从而通过信号传导通路来诱导转录活性。通常，BMP抑制剂是例如阻止或抑制BMP分子对BMP受体的结合的物质，而且是与BMP分子结合从而形成用于中和BMP活性的复合物的药剂。另外，BMP抑制剂例如是与BMP受体进行结合并阻止或抑制BMP分子对受体进行结合的物质，且是作为拮抗剂或反向激动剂起作用的药剂。
对于BMP抑制剂而言，与该BMP抑制剂不存在下的BMP活性水平相比，优选具有50％以上、更优选70％以上、进一步优选80％以上、特别优选90％以上的抑制活性。BMP抑制活性可以通过使用本领域技术人员公知的方法(参考文献：Zilberberg et al.,BMC CellBiol,8：41,2007.)测定BMP的转录活性来评价。
作为本实施方式的细胞培养基所含的BMP抑制剂，优选为天然BMP结合蛋白质，例如，可举出：头蛋白(Noggin)、腱蛋白(Chordin)、腱蛋白结构域等腱蛋白样蛋白质；卵泡抑素(Follistatin)、卵泡抑素结构域等卵泡抑素相关蛋白质；DAN、DAN半胱氨酸-结节结构域等DAN样蛋白质；硬骨素/SOST、脱氢胆酸、α-2巨球蛋白等。作为本实施方式的细胞培养基所含的BMP抑制剂，其中，优选腱蛋白样蛋白质或DAN样蛋白质，更优选腱蛋白样蛋白质。作为腱蛋白样蛋白质，优选头蛋白。腱蛋白样蛋白质或DAN样蛋白质是扩散性蛋白质，并且能够以各种亲和度与BMP分子进行结合，且抑制BMP分子靠近信号传导受体。在培养上皮干细胞时，通过向细胞培养基中添加这些BMP抑制剂，能够防止干细胞丧失。
本实施方式的细胞培养基所含的BMP抑制剂的浓度优选为10ng/mL以上且100ng/mL以下，更优选为20ng/mL以上且100ng/mL以下，进一步优选为50ng/mL以上且100ng/mL以下。干细胞培养期间，优选每2天向培养用培养基添加促分裂生长因子，更优选每4天更换新的培养用培养基。
<TGF-β抑制剂>
转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)是生长因子的一种，几乎在肾脏、骨髓、血小板等所有的细胞中产生。TGF-β存在五种亚型(β1至β5)。另外，已知TGF-β促进成骨细胞的增殖以及胶原蛋白等结缔组织的合成和增殖，对上皮细胞的增殖和破骨细胞具有抑制作用。通常，TGF-β抑制剂是阻止或抑制例如TGF-β对于TGF-β受体进行结合的物质，并且是与TGF-β结合以形成用于中和TGF-β活性的复合物的药剂。另外，TGF-β抑制剂例如是与TGF-β受体进行结合并且阻止或抑制TGF-β对受体进行结合的物质，并且是作为拮抗剂或反向激动剂起作用的药剂。
对于TGF-β抑制剂而言，与该TGF-β抑制剂不存在下的TGF-β活性水平相比，优选具有50％以上、更优选70％以上、进一步优选80％以上、特别优选90％以上的抑制活性。TGF-β抑制活性可以通过本领域技术人员公知的方法来评价。作为该评价系统，可举出细胞测定法，其中，使用启动荧光素酶报告基因的人PAI-1启动子或包含Smad结合部位的报告基因构建体，稳定地转染细胞(参考文献：De Gouville et al.,Br J Pharmacol,145(2):166-177,2005.)。
作为本实施方式的细胞培养基所含的TGF-β抑制剂，例如，可举出：A83-01(3-(6-甲基吡啶-2-基)-1-苯氨基硫甲酰基-4-喹啉-4-基吡唑)、ALK5Inhibitor I(3-(吡啶-2-基)-4-(4-醌基)-1H-吡唑)、LDN193189(4-(6-(4-(哌嗪-1-基)苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)喹啉)、SB431542(4-[4-(1,3-苯并二噁茂-5-基)-5-吡啶-2-基-1H-咪唑-2-基]苯甲酰胺)、SB-505124(2-(5-苯并[1,3]二氧杂环戊烯-5-基-2-叔丁基-3H-咪唑-4-基)-6-甲基吡啶盐酸盐水合物)、SD-208(2-(5-氯-2-氟苯基)蝶啶-4-基)吡啶-4-基-胺)、SB-525334(6-[2-(1,1-二甲基乙基)-5-(6-甲基-2-吡啶基)-1H-咪唑-4-基]喹喔啉)、LY-364947(4-[3-(2-吡啶基)-1H-吡唑-4-基]-喹啉)、LY2157299(4-[2-(6-甲基-吡啶-2-基)-5,6-二氢-4H-吡咯并[1,2-b]吡唑-3-基]-喹啉-6-羧酸酰胺)、TGF-βRI Kinase Inhibitor II616452(2-(3-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-基)-1,5-二氮杂萘)、TGF-βRI KinaseInhibitor III 616453(2-(5-苯并[1,3]二氧杂环戊烯-4-基-2-叔丁基-1H-咪唑-4-基)-6-甲基吡啶、HCl)、TGF-βRI Kinase Inhibitor IX 616463(4-((4-((2,6-二甲基吡啶-3-基)氧基)吡啶-2-基)氨基)苯磺酰胺)、TGF-βRI Kinase Inhibitor VII 616458(1-(2-((6,7-二甲氧基-4-喹啉基)氧基)-(4,5-二甲基苯基)-1-乙酮)、TGF-βRI KinaseInhibitor VIII 616459(6-(2-叔丁基-5-(6-甲基-吡啶-2-基)-1H-咪唑-4-基)-喹喔啉)、AP12009(TGF-β2反义化合物“Trabedersen”)、Belagenpumatucel-L(TGF-β2反义基因修饰同种异体肿瘤细胞疫苗)、CAT-152(Glaucoma-lerdelimumab(抗-TGF-β-2单克隆抗体))、CAT-192(Metelimumab(中和TGFβ1的人IgG4单克隆抗体)、GC-1008(抗-TGF-β单克隆抗体)等。作为本实施方式的细胞培养基所含的TGF-β抑制剂，其中优选A83-01。
本实施方式的细胞培养基所含的TGF-β抑制剂的浓度优选为100nM以上且10μM以下，更优选为500nM以上且5μM以下，进一步优选为500nM以上且2μM以下。干细胞培养期间，优选每2天向培养用培养基添加TGF-β抑制剂，优选每4天更换新的培养用培养基。
<p38抑制剂>
本说明书中，“p38抑制剂”是指直接或间接地对p38信号传导进行负调控的任意抑制剂。通常，p38抑制剂例如与p38结合并降低其活性。p38蛋白激酶是有丝分裂原激活蛋白激酶(MAPK)家族的一部分。MAPK是响应于环境应激和炎症细胞因子等细胞外刺激并且针对基因表达、有丝分裂、分化、增殖以及细胞存活/细胞凋亡等各种细胞活性进行调节的丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白激酶。p38MAPK以α、β、β2、γ以及δ亚型的方式存在。另外，p38抑制剂也是与诸如至少一个p38亚型进行结合并降低其活性的药剂。
对于p38抑制剂而言，与该p38抑制剂不存在下的p38活性水平相比，优选具有50％以上、更优选70％以上、进一步优选80％以上、特别优选90％以上的抑制活性。p38抑制剂的抑制效果可以通过本领域技术人员公知的方法来评价。作为其评价系统，可举出：Thr180/Tyr182磷酸化的磷酸化位点特异性抗体检测方法，生化重组激酶测定法，肿瘤坏死因子α(TNF-α)分泌测定法、p38抑制剂用DiscoverRx高通量筛选平台、p38活性测定试剂盒(例如、Millipore公司制备、Sigma-Aldrich公司制备等)等。
作为本实施方式的细胞培养基所含的p38抑制剂，例如，可举出：SB-202190(4-(4-氟苯基)-2-(4-羟基苯基)-5-(4-吡啶基)-1H-咪唑)、SB-203580(4-[4-(4-氟苯基)-2-[4-(甲基亚磺酰基)苯基]-1H-咪唑-5-基]吡啶)、VX-702(6-(N-氨甲酰基-2,6-二氟苯胺基)-2-(2,4-二氟苯基)吡啶-3-氨甲酰)、VX-745(5-(2,6-二氯苯基)-2-[2,4-二氟苯基)硫代]-6H-嘧啶并[1,6-b]哒嗪-6-酮)、PD-169316(4-(4-氟苯基)-2-(4-硝基苯基)-5-(4-吡啶基)-1H-咪唑)、RO-4402257(6-(2,4-二氟苯氧基)-2-{[3-羟基-1-(2-羟基乙基)丙基]氨基}-8-甲基吡啶并[2,3-D]嘧啶-7(8h)-酮)、BIRB-796(1-[5-叔丁基-2-(4-甲基苯基)吡唑-3-基]-3-[4-(2-吗啉-4-基乙氧基)萘-1-基]尿素)等。
本实施方式的细胞培养基所含的p38抑制剂的浓度优选为50nM以上且100μM以下，更优选为100nM以上且50μM以下，进一步优选为100nM以上且10μM以下。干细胞培养期间，优选每2天向培养用培养基添加p38抑制剂，更优选每4天更换新的培养用培养基。
<其它成分>
本实施方式的细胞培养基可以进一步包含Rock(Rho-激酶)抑制剂。作为Rock抑制剂，例如，可举出：Y-27632((R)-(+)-反式-4-(1-氨基乙基)-N-(4-吡啶基)环己烷甲酰胺二盐酸盐一水合物)、法舒地尔(HA1077)(5-(1,4-二氮杂环庚烷-1-基磺酰基)异喹啉)、H-1152((S)-(+)-2-甲基-1-[(4-甲基-5-异喹啉基)磺酰基]-六氢-1H-1,4-二氮杂二盐酸盐)等。在使用Y-27632作为Rock抑制剂的情况下，优选在分散为单细胞的干细胞的培养期间的最初2天添加。本实施方式的细胞培养基所含的Y-27632优选为10μM。
本实施方式的细胞培养基可以进一步包含Notch激动剂。已知Notch信号传导在细胞存活和增殖中起到重要作用。作为Notch受体蛋白质，例如，可举出：可以与多个表面结合型或分泌性配体相互作用的受体蛋白质等，包含Delta 1、Jagged 1和2、以及Delta样1、Delta样3、Delta样4。配体与受体结合之后，通过由包含ADAM蛋白酶家族成员的蛋白酶引起的连续断裂反应以及由γ分泌酶早老蛋白控制的膜内断裂来激活Notch受体。从而，Notch的胞内结构域移动至核，在此，其激活下游基因的转录。作为Notch激动剂，优选Jagged 1和Delta 1或者具有它们的活性的片段或衍生物。作为Notch激动剂，更优选DSL肽(参考文献：Dontu et al.,Breast Cancer Res,6：R605-R615,2004.)。
当本实施方式的细胞培养基所含的Notch激动剂是DSL肽的情况下，其浓度优选为10ng/mL以上且100ng/mL以下。特别是，在培养第一周期间，若添加Notch激动剂，则培养效率升高2倍至3倍。优选在该干细胞培养期间的最初7天内，每2天向培养用培养基添加该Notch激动剂。
Notch激动剂是如下所述的分子：在细胞内刺激Notch活性以使得Notch活性与Notch激动剂分子不存在下的Notch活性水平相比至少为10％、更优选至少为20％、进一步优选至少为30％、进一步优选至少为50％、特别优选至少为90％、最优选为100％的分子。Notch活性可以通过本领域技术人员所公知的方法、采用4xwtCBF1-荧光素酶报告基因构建体测定Notch的转录活性来进行评价(参考文献：Hsieh et al.,Mol Cell Biol.,16,952-959,1996.)。
γ-分泌酶抑制剂在分化期间能够对于细胞命运决定(cell fatedetermination)产生影响。本实施方式的细胞培养基所含的γ-分泌酶抑制剂的浓度，例如，可以是1ng/mL以上且10μg/mL，也可以是1ng/mL以上且1μg/mL以下，还可以是1ng/mL以上且100ng/mL以下。
本实施方式的细胞培养基进一步添加胃泌素(或Leu15-胃泌素等适当的替代物)。本实施方式的细胞培养基所含的胃泌素(或适当的替代物)的浓度，例如，可以是1ng/mL以上且10μg/mL，也可以是1ng/mL以上且1μg/mL以下，还可以是5ng/mL以上且100ng/mL以下。
本实施方式的细胞培养基可以进一步包含烟酰胺。通过包含烟酰胺，可以改善例如人结肠类器官的培养效率和寿命。本实施方式的细胞培养基所含的烟酰胺的浓度，例如，可以是1mg/mL以上且100mg/mL，也可以是5mg/mL以上且50mg/mL以下，还可以是5mg/mL以上且20mg/mL以下。
本实施方式的细胞培养基可以进一步包含至少一种氨基酸。作为本实施方式的细胞培养基所含的氨基酸，例如，可举出：L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、L-胱氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、以及它们的组合等。通常，细胞培养基所含的L-谷氨酰胺的浓度是0.05g/L以上且1g/L以下(通常为0.1g/L以上且0.75g/L以下)。细胞培养基所含的其它氨基酸是0.001g/L以上且1g/L)(通常为0.01g/L以上且0.15g/L以下)。氨基酸可以通过合成获得。
本实施方式的细胞培养基可以进一步包含至少一种维生素。作为本实施方式的细胞培养基所含的维生素，例如，可举出：硫胺素(维生素B1)、核黄素(维生素B2)、烟酸(维生素B3)、D-泛酸钙(维生素B5)、吡哆醛/吡哆胺/吡哆醇(维生素B6)、叶酸(维生素B9)、氰钴胺(维生素B12)、抗坏血酸(维生素C)、钙化醇(维生素D2)、DL-α生育酚(维生素E)、生物素(维生素H)、甲萘醌(维生素K)等。
本实施方式的细胞培养基可以进一步包含至少一种无机盐。本实施方式的细胞培养基所含的无机盐用于帮助维持细胞的渗透压平衡以及帮助调节膜电位。作为无机盐的具体例，可举出：钙、铜、铁、镁、钾、钠、锌的盐。盐通常以氯化物、磷酸盐、硫酸盐、硝酸盐以及碳酸氢盐的形式使用。更具体而言，作为盐，可举出：CaCl2、CuSO4-5H2O、Fe(NO3)-9H2O、FeSO4-7H2O、MgCl、MgSO4、KCl、NaHCO3、NaCl、Na2HPO4、Na2HPO4-H2O、ZnSO4-7H2O等。
本实施方式的细胞培养基可以进一步包含至少一种可以作为碳能源的糖。作为本实施方式的细胞培养基所含的糖，例如，可举出：葡萄糖、半乳糖、麦芽糖、果糖等。其中，作为糖，优选葡萄糖，特别优选D-葡萄糖(右旋糖)。本实施方式的细胞培养基所含的糖的浓度优选为1g/L以上且10g/L。
本实施方式的细胞培养基可以进一步包含至少一种微量元素。作为本实施方式的细胞培养基所含的微量元素，例如，可举出：钡、溴、钴、碘、锰、铬、铜、镍、硒、钒、钛、锗、钼、硅、铁、氟、银、铷、锡、锆、镉、锌、铝或它们的离子等。
本实施方式的细胞培养基可以进一步包含至少一种追加的药剂。作为该药剂，例如，可举出胆固醇/转铁蛋白/白蛋白/胰岛素/孕酮、腐胺、亚硒酸盐/其它因子等已有报告称能改善干细胞培养的营养素或生长因子。
<<用于培养上皮干细胞、上皮癌细胞或包含这些细胞的组织的方法>>
作为一种实施方式，本发明提供上皮干细胞、上皮癌细胞或包含这些细胞中的至少任一种细胞的组织的培养方法，其包括：细胞外基质制备工序，制备细胞外基质；粘附工序，将上皮干细胞、上皮癌细胞或者包含这些细胞的组织在所述细胞外基质上进行粘附；类器官形成工序，在所述粘附工序之后添加上述细胞培养基，培养所述上皮干细胞、所述上皮癌细胞或包含所述这些细胞的组织，形成类器官。
根据本实施方式的培养方法，能够长时间培养上皮干细胞、上皮癌细胞或包含这些细胞中的至少任一种细胞的组织。另外，能够从上皮干细胞、上皮癌细胞或包含这些细胞中的至少任一种细胞的组织高效地形成类器官。
下面，对本实施方式的方法进行详细说明。
[细胞外基质制备工序]
通常，“细胞外基质(Extracellular Matrix；ECM)”是指生物中存在于细胞外的超分子结构。该ECM形成用于上皮干细胞、上皮癌细胞或包含这些细胞的组织进行增殖的支架。
ECM包含各种多糖、水、弹性蛋白以及糖蛋白质。作为糖蛋白质，例如，可举出：胶原蛋白、巢蛋白(内功素)、纤连蛋白、层粘蛋白等。
作为ECM的制备方法，例如，可举出使用结缔组织细胞的方法等。更具体而言，在培养产ECM细胞(例如，成纤维细胞)后，取出这些细胞并添加上皮干细胞、上皮癌细胞或包含这些细胞的组织，由此能够将ECM用作支架。
作为产ECM细胞，例如，可举出：以产生胶原蛋白和蛋白聚糖为主的软骨细胞，以产生IV型胶原蛋白、层粘蛋白、间质前胶原以及纤连蛋白为主的成纤维细胞，以产生胶原蛋白(I型、III型以及V型)、硫酸软骨素蛋白聚糖、透明质酸、纤连蛋白以及肌腱蛋白-C为主的结肠肌成纤维细胞等。或者，也可以使用市售的ECM。作为市售的ECM，例如，可举出：来自细胞外基质蛋白质(Invitrogen公司制造)、Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤细胞的基膜制备物[例如，Matrigel(商标、BD Biosciences公司制造)]等。也可以使用ProNectin(SigmaZ378666)等合成ECM。另外，也可以使用天然ECM和合成ECM的混合物。
在使用ECM培养干细胞的情况下，能够增强干细胞的长期存活和未分化干细胞的持续存在。在不存在ECM时，无法长时间培养干细胞培养物，且未见未分化干细胞持续存在。而且，当存在ECM时，则能够培养不存在ECM时无法培养的类器官。
ECM通常沉淀至悬浮有细胞的培养皿的底部。例如，当ECM在37℃下凝固时，加入上述细胞培养基，并使其扩散在ECM中使用。对于培养基中的细胞，能够通过与ECM的表面结构相互作用(例如，与整合素相互作用)来固定于ECM。
ECM也可以涂布在培养容器等上使用。在使用纤连蛋白作为ECM的情况下，涂布在培养容器中的比例优选为1μg/cm2以上且250μg/cm2以下，更优选为1μg/cm2以上且150μg/cm2以下，进一步优选为8μg/cm2以上且125μg/cm2以下。
[粘附工序]
接着，准备上皮干细胞、上皮癌细胞或包含这些细胞中的至少任一种细胞的组织。作为用于本实施方式的培养法的上皮干细胞或上皮癌细胞，可举出与上述<<细胞培养基>>部分中的相同的细胞。
作为从上皮组织中单离细胞的方法，可举出本技术领域中公知的方法。例如，通过将螯合剂和单离组织进行恒温放置，能够单离隐窝。清洗该组织之后，在载玻片上从粘膜下层剥离上皮细胞层并切碎。然后，在胰蛋白酶或优选包含EDTA和EGTA中至少任一种的液体中进行恒温放置，例如，使用过滤器和离心机中的至少任一种方法，将未消化的组织片段和来自隐窝的单细胞分离。也可以使用其它蛋白酶(例如，胶原酶与中性蛋白酶I中的至少任一种)来代替胰蛋白酶。使用相同方法以单离胰腺和胃的片段。
作为从上皮组织中单离干细胞的方法，可举出本技术领域中公知的方法。干细胞在其表面上表达Lgr5和Lgr6中的至少任一种(Lgr5和Lgr6属于大型G蛋白偶联受体(GPCR)超家族)。作为单离方法，可举出下述方法：由上皮组织制备细胞悬浮液，使该细胞悬浮液接触与Lgr5和Lgr6中的至少任一种进行结合的化学物质，分离这些与Lgr5和Lgr6中的至少任一种进行结合的化学物质，并且将干细胞从该结合化合物中单离。
作为与Lgr5及Lgr6中的至少任一种结合的化学物质，例如可举出抗体，更具体而言，例如可举出：对于Lgr5和Lgr6中的至少任一种进行特异性识别并与其结合的单克隆抗体(例如，包含小鼠和大鼠单克隆抗体的单克隆抗体等)。通过使用这样的抗体并利用例如磁珠或凭借荧光激活细胞分选仪，能够单离对Lgr5和Lgr6中的至少任一种进行表达的干细胞。
将通过上述方法单离出的上皮干细胞、上皮癌细胞或包含这些细胞中的至少任一种细胞的组织，接种于所述制备工序中得到的细胞基质上并进行静置。接种后的细胞能够通过与ECM的表面结构相互作用(例如，与整合素相互作用)而粘附于ECM上。
[类器官形成工序]
接着，在细胞接种后，在细胞未干期间添加上述细胞培养基进行培养。培养温度优选为30℃以上且40℃以下，更优选37℃左右。培养时间可以根据所使用的细胞进行适当调整。在培养开始1周至2周左右之后，可以形成类器官。另外，对于以往仅能维持培养2个月至3个月的细胞，采用本实施方式的培养方法，可以在3个月以上的长时间(优选10个月左右)内对细胞进行维持培养。在采用本实施方式的培养方法培养上皮干细胞的情况下，可以维持分化潜能，可以将肿瘤发病频率抑制在极低的状态。
<<用于培养上皮干细胞或包含上皮干细胞的组织的方法>>
作为一种实施方式，本发明提供上皮干细胞或包含上皮干细胞的组织的培养方法，其包括：细胞外基质制备工序，制备细胞外基质；粘附工序，将上皮干细胞或包含上皮干细胞的组织在所述细胞外基质上进行粘附；类器官形成工序，在所述粘附工序之后添加上述作为无血清培养基的细胞培养基，培养所述上皮干细胞或包含所述上皮干细胞的组织，形成类器官。
基于本实施方式的培养方法，能够长时间培养上皮干细胞或包含上皮干细胞的组织。另外，能够从上皮干细胞或包含上皮干细胞的组织高效地形成类器官。
下面，对本实施方式的方法进行详细说明。
[细胞外基质制备工序]
作为ECM，可举出：与上述<<用于培养上皮干细胞、上皮癌细胞或包含这些细胞的组织的方法>>部分的[细胞外基质制备工序]中所例示的物质相同的物质。
作为ECM的制备方法，可举出：与上述<<用于培养上皮干细胞、上皮癌细胞或包含这些细胞的组织的方法>>部分的[细胞外基质制备工序]中所例示的方法相同的方法。
作为产ECM细胞，可举出：与上述<<用于培养上皮干细胞、上皮癌细胞或包含这些细胞的组织的方法>>部分的[细胞外基质制备工序]中所例示的细胞相同的细胞。作为市售的ECM，可举出：与上述<<用于培养上皮干细胞、上皮癌细胞或包含这些细胞的组织的方法>>部分的[细胞外基质制备工序]中所例示的物质相同的物质。另外，也可以使用天然ECM和合成ECM的混合物。
在使用ECM培养干细胞的情况下，可以强化干细胞的长期存活和未分化干细胞的持续存在。在不存在ECM时，不能长时间培养干细胞培养物，且未见未分化干细胞持续存在。而且，当存在ECM时，则能够培养不存在ECM时无法培养的类器官。
ECM通常沉淀至悬浮有细胞的培养皿的底部。例如，当ECM在37℃下凝固时，加入上述细胞培养基，并使其扩散在ECM中使用。对于培养基中的细胞，能够通过与ECM的表面结构相互作用(例如，与整合素相互作用)来固定于ECM。
ECM也可以涂布在培养容器等上使用。在使用纤连蛋白作为ECM的情况下，涂布在培养容器中的比例优选为1μg/cm2以上且250μg/cm2以下，更优选为1μg/cm2以上且150μg/cm2以下，进一步优选为8μg/cm2以上且125μg/cm2以下。
[粘附工序]
接着，准备上皮干细胞或包含上皮干细胞的组织。作为用于本实施方式的培养法的上皮干细胞，可举出与上述<<细胞培养基>>部分相同的上皮干细胞。
作为从上皮组织中单离干细胞的方法，可举出与上述<<用于培养上皮干细胞、上皮癌细胞或包含这些细胞的组织的方法>>部分的[粘附工序]中所例示的方法相同的方法。
将通过上述方法单离出的上皮干细胞或包含上皮干细胞的组织接种于所述制备工序中得到的细胞基质上并进行静置。接种后的细胞能够通过与ECM的表面结构相互作用(例如，与整合素相互作用)而粘附在ECM上。
[类器官形成工序]
接着，在细胞接种后，在细胞未干期间，添加上述作为无血清培养基的细胞培养基进行培养。培养温度优选为30℃以上且40℃以下，更优选37℃左右。培养时间可以根据所使用的细胞进行适当调整。在培养开始1周至2周左右之后，可以形成类器官。另外，对于以往仅能维持培养2个月至3个月的细胞，采用本实施方式的培养方法，可以在3个月以上的长时间(优选10个月左右)内对细胞进行维持培养。在采用本实施方式的培养方法培养上皮干细胞的情况下，可以维持分化潜能，可以将肿瘤发病频率抑制在极低的状态。
<<类器官>>
作为一种实施方式，本发明提供通过上述培养方法得到的类器官。
本实施方式的类器官可以用于再生医疗、上皮细胞的基础医学研究、药物反应筛选、使用疾病来源的上皮类器官的药物发现研究等。
<用途>
作为一种实施方式，本发明提供上述类器官在药物反应筛选、毒性分析或再生医疗中的用途。
在药物反应筛选中使用上述类器官的情况下，在例如96孔板或384孔板等多孔板中培养类器官。使用分子库鉴定对该类器官产生影响的分子。作为库，例如可举出：抗体片段库、肽噬菌体展示库、肽库(例如LOPAP(商标)、Sigma Aldrich公司制造)、脂质库(BioMol公司制造)、合成化合物库(例如LOPAP(商标)、Sigma Aldrich公司制造)或天然化合物库(Specs、TimTec公司制造)等。进而，也可以使用基因库。作为基因库，例如，可举出cDNA库、反义库、siRNA或其它非编码RNA库等。作为具体方法，可举出如下方法：在某一定时间内，将细胞暴露在试验药剂的多个浓度下，暴露时间结束之后，评价培养物。另外，本实施方式的类器官虽然特异性地将上皮癌细胞作为标靶，但也能够用于鉴定不将由正常细胞构成的类器官作为标靶的药物。
并且，本实施方式的类器官可以在新型候选药物或者已知或新型膳食补充剂的毒性测定中使用以替代Caco-2细胞等细胞株。
并且，本实施方式的类器官可以用于培养目前不具备合适的组织培养或动物模型的诺罗病毒(norovirus)等病原体。
另外，在再生医疗方面，本实施方式的类器官例如可以用于：辐射照射后或者手术后的肠上皮修复；患有克罗恩病和溃疡性大肠炎等炎症性肠病的患者的肠上皮修复；或者，患有短肠综合征的患者的肠上皮修复。而且，本实施方式的类器官还可以用于小肠/结肠的遗传性疾病患者的肠上皮修复。另外，在再生医疗方面，本实施方式的类器官可以用作例如胰腺切除后的移植物或移植物的一部分，或者，可以用于治疗I型糖尿病和II型糖尿病等糖尿病。
另外，作为一种实施方式，本发明提供上述类器官在移植中的用途。
通过本实施方式的<<用于培养上皮干细胞或包含上皮干细胞的组织的方法>>而得到的类器官由正常的上皮干细胞构成，保持有分化潜能，能够大幅度降低肿瘤发病频率，因此可以优选用于移植。
实施例
下面，通过实施例对本发明进行说明，但本发明下限定于下面的实施例。
[实施例1]
(1)Wnt3a-Afamin复合物的制备
利用胎牛血清中包含牛Afamin这一点，使用含血清的培养基培养仅基因转染了Wnt3a的细胞，分泌的Wnt3a与Afamin自动形成稳定的复合物，由此，制备Wnt3a-Afamin复合物。即，使用培养皿或多层烧瓶等，将表达N端具有标签序列的Wnt3a的细胞(W-Wnt3a/HEK)在包含10％胎牛血清的培养基中培养5天至7天，回收培养上清。接着，将回收的培养上清进行离心分离，并通过过滤器(0.22μm)。从收集到的培养上清中取220mL。接着，向回收的200mL培养上清中加入3mL P20.1抗体琼脂糖，在4℃下旋转混合3小时之后，使培养基通过空的柱，收集琼脂糖。需要说明的是，P20.1抗体是对Wnt3a的N端的标签序列进行特异性识别的抗体。接着，利用3mL Tris bufferd saline(20mM Tris-HCl、150mM NaCl、pH7.5)清洗收集在柱中的琼脂糖，并重复清洗操作5次。接着，每次使用3mL肽溶液(0.2mg/mL PAR4-C8peptide/TBS)进行洗脱，并回收洗脱液。反复洗脱操作10次，获得Wnt3a-Afamin复合物。通过TCF报告基因实验来确认Wnt3a的活性，TCF报告基因实验使用W-Wnt3a/HEK的细胞上清进行，并与市售的Wnt3a(R&D systems公司制造)比较后确认，具有10倍以上的高活性。
(2)细胞培养基的制备
向市售的Advanced DMEM/F-12培养基(Thermo Ficher SCIENTIFIC公司制造)中，以使最终浓度成为1μg/mL的方式添加人重组R-脊椎蛋白1(R&D systems公司制造)，以使最终浓度成为100ng/mL的方式添加头蛋白(Peprotech公司制造)，以使最终浓度成为500nM方式添加A83-01(Tocris公司制造)，以使最终浓度成为50ng/mL的方式添加EGF(ThermoFicher SCIENTIFIC公司制造)，并且以使最终浓度成为10μM的方式添加SB202190(SigmaAldrich公司制造)(ENRAS培养基)。进而，以使最终浓度成为300ng/mL或1000ng/mL的方式添加(1)中制备的Wnt3a-Afamin复合物(下面也称为“rWnt”)，或者以使最终浓度成为300ng/mL的方式添加市售的Wnt3a(R&D systems公司制造)(下面称为“R&D”)，由此，准备培养基。另外，作为对照，准备了不含Wnt3a的培养基[下面也称为“Wnt(-)”]、以及以使Wnt3a的最终浓度成为300ng/mL的方式添加用含血清的培养基进行培养的W-Wnt3a/HEK来源的培养上清而成的培养基(下面称为“Wnt CM”)。
(3)肠道干细胞的培养
根据日本庆应义塾大学医学部伦理委员会批准的伦理研究计划，向大肠肿瘤患者进行解释并获得其同意之后，采集距离大肠肿瘤至少5cm以上的部分作为正常粘膜，并且从大肠肿瘤中采集大肠癌组织。通过EDTA或释放酶TH，将上皮细胞从采集的组织中提取并包埋于基质胶(注册商标)。
包含上皮细胞(下面称为“肠道干细胞”)的基质胶(注册商标)接种至24、48或96孔板，与培养基共同培养。具体如下所述。
将培养后的肠道干细胞与10μL基质胶(注册商标)(BD Bioscience公司制造)共同接种至96孔板中。向各孔中分别添加100μL的(2)中制备的六种培养基[rWnt 300ng/mL、rWnt 1000ng/mL、R&D 300ng/mL、Wnt CM及Wnt(-)]，并在37℃下进行培养。从开始培养起，每2天更换培养基。图1(A)是表示原代培养(Passage0)从开始其培养起6天后的情况的图像，图2(A)是表示第一次传代(Passage1)从开始其培养起6天后的情况的图像，图3(A)是表示第二次传代(Passage2)从开始其培养起5天后的情况的图像。图1(B)、图2(B)以及图3(B)是各培养基中肠道干细胞的类器官在孔中所占的面积的量化图。
由图1至图3可知，包含Wnt3a-Afamin复合物(“rWnt”)的培养基可以长期传代培养肠道干细胞。另外，包含Wnt3a-Afamin复合物的培养基能够在4个月期间内对肠道干细胞进行18次以上的传代培养(相关数据未在此示出)。
[实施例2]
(1)细胞培养基的制备
向市售的Advanced DMEM/F-12培养基(Thermo Ficher SCIENTIFIC公司制造)中，以使最终浓度成为50ng/mL的方式添加EGF(Thermo Ficher SCIENTIFIC公司制造)，以使最终浓度成为100ng/mL的方式添加头蛋白(Peprotech公司制造)，以使最终浓度成为500nM的方式添加A83-01(Tocris公司制造)(下面称为“ENA培养基”)。
另外，向市售的Advanced DMEM/F-12培养基(Thermo Ficher SCIENTIFIC公司制造)中，以使最终浓度成为50ng/mL的方式添加EGF(Thermo Ficher SCIENTIFIC公司制造)，以使最终浓度成为100ng/mL的方式添加头蛋白(Peprotech公司制造)，以使最终浓度成为500nM的方式添加A83-01(Tocris公司制造)，以使最终浓度成为10μM的方式添加SB202190(Sigma Aldrich公司制造)(下面称为“ENAS培养基”)。
向ENAS培养基中分别以使最终浓度成为300ng/mL的方式添加市售的Wnt3a(R&Dsystems公司制造)，从而制得现有方法中使用的培养基。
进而，向ENA培养基和ENAS培养基中以使最终浓度成为300ng/mL的方式添加实施例1的(1)中制备的Wnt3a-Afamin复合物，从而制备本发明的细胞培养基。需要说明的是，还准备了不含Wnt3a-Afamin复合物的ENA培养基和ENAS培养基，并将其作为对照。
(2)大肠癌来源的上皮癌细胞的培养
采用与实施例1的(3)相同的方法，使用释放酶TH，将包含人肿瘤组织来源的上皮癌细胞的大肠分为上皮癌细胞和剩余组织。利用胰蛋白酶将剩余组织进一步分解成碎片。接着，将上皮癌细胞或者上皮细胞和分解成碎片的剩余组织与10μL基质胶(注册商标)(BDBioscience公司制造)共同接种至96孔板中。向接种有上皮癌细胞的孔中，添加了100μL的(2)中制备的包含市售的Wnt3a的ENAS培养基(现有方法中使用的培养基)。另外，向接种有上皮细胞和分解成碎片的剩余组织的孔中，个别地添加了100μL的(2)中制备的添加有Wnt3a-Afamin复合物的ENA培养基和ENAS培养基、不含Wnt3a的ENA培养基和ENAS培养基。
接着，利用添加了包含市售的Wnt3a的ENAS培养基(现有方法中使用的培养基)的上皮癌细胞、添加了(2)中制备的添加有Wnt3a-Afamin复合物的ENA培养基和ENAS培养基的上皮癌细胞来进行培养。
其结果，在添加有包含市售的Wnt3a的ENAS培养基(现有方法中使用的培养基)的上皮癌细胞中，大肠癌类器官的建立效率为67.5％，而在(2)中制备的添加有Wnt3a-Afamin复合物的ENA培养基和ENAS培养基中，大肠癌类器官的建立效率为100.0％。
基于以上所述可知：本发明的细胞培养基，能够在大肠癌来源的上皮癌细胞中高效地形成类器官。
[实施例3]
(1)细胞培养基的制备
首先，采用与实施例2的(1)相同的方法制备了ENRAS+Wnt3a-AFM培养基，其中，在该培养基中以使最终浓度成为300ng/mL的方式添加了实施例1的(1)中制备的Wnt3a-Afamin复合物，并且以使最终浓度成为1μg/mL的方式添加了人重组R-脊椎蛋白1(R&Dsystems公司制造)。
(2)从NOG小鼠剥离正常上皮干细胞
首先，制作前端粘贴有球囊的探头(参考文献：Fukudaet al.，Genes andDevelopment，28，1752-1757，2014)。接着，对于超免疫缺陷小鼠NOD/Shi-scid-IL2Rγnull小鼠(NOG小鼠)，在吸入麻醉下，从小鼠肛门插入探头1cm至2cm，通过使球囊膨胀来夹紧直肠的开口侧。接着，向与肛门之间形成的肠道管腔内注入加热后的EDTA(参见图4的上方的左图)，封闭管腔2分钟至3分钟。接着，拔掉球囊，使用刷子擦过直肠上皮的单侧，从而将因EDTA而变得容易剥离的上皮连通隐窝底部一同剥脱(参见图4的上方的右图及下方的左图和右图)。
(3)上皮干细胞的培养
接着，使用(1)中制备的ENRAS+Wnt3a-AFM培养基，培养人上皮干细胞，制作人大肠类器官，并培养3天至4天，使人大肠类器官增殖。
(4)向NOG小鼠移植人大肠类器官
接着，使约106至108的细胞悬浮在包含50μL至200μL的5％至20％基质胶的PBS中。然后，从粘膜剥脱后的NOG小鼠的肛门，向每只小鼠的肠内注入(灌肠)包含约106至108细胞的悬浮液，并暂时封闭肛门(参见图5的左图)。需要说明的是，人大肠类器官已预先进行GFP标记。在移植2周之后以及16周之后，采用内镜在明场和荧光模式下观察NOG小鼠的移植部位。将结果示于图5。
在图5中，从移植部位观察到GFP的荧光。由此明确，通过预先对人大肠类器官进行GFP标记，可在移植存活后进行随时间推移的观察。另外，虽然图中未示出，但可以确认到至少长期存活半年以上。
另外，使用移植28天之后的NOG小鼠，切开移植部位，观察病理组织。将结果示于图6。图6中，上图是表示组织切片的苏木精-伊红(Hematoxylin-Eosin，HE)染色结果的图像。下方的左图是表示组织切片使用抗人细胞角蛋白抗体进行免疫染色及使用赫斯特(Hoechst)(注册商标)进行核染色后的结果的图像。下方的右图是表示组织切片利用原位杂交分析进行Lgr5检测以及使用赫斯特(Hoechst)(注册商标)进行核染色后的结果的图像。
图6中，人大肠类器官移植存活而形成的隐窝，通过HE染色被识别为比小鼠隐窝大一圈的隐窝。另外，通过利用抗人细胞角蛋白抗体进行免疫染色，确认了人大肠类器官移植存活而形成的隐窝是由人细胞形成的。
而且，由原位杂交分析的Lgr5检测结果可以明确，移植后的人大肠类器官存活而形成的隐窝底部中表达有作为肠道干细胞标记物的Lgr5，受到小鼠间质的支援，同时人的肠道上皮干细胞(类器官)起作用，从而可以长期存活。
由以上结果显示，移植了本发明的类器官的动物模型可应用于再生医疗、上皮细胞的基础医学研究、药物反应的筛选、使用疾病来源的上皮类器官的药物发现研究等。
工业实用性
基于本发明的细胞培养基，能够长时间培养包括人在内的哺乳动物来源的上皮干细胞、上皮癌细胞或包含这些细胞中的至少任一种细胞的组织或者目前无法培养的组织。另外，还能够从所述细胞和所述组织中的至少任一种高效地形成类器官。另外，使用本发明的细胞培养基所培养的上皮干细胞能够长期保持分化潜能，肿瘤发病频率极低。而且，通过本发明的培养方法得到的类器官可应用于再生医疗、上皮细胞的基础医学研究、药物反应的筛选、使用疾病来源的上皮类器官的药物发现研究等。

Claims (12)

1.一种细胞培养基，其特征在于，包含：
Wnt激动剂，其含有Wnt蛋白质与其稳定物质Afamin形成的复合物和R-脊椎蛋白(R-spondin)；以及
选自于由促分裂生长因子、骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)抑制剂、转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)抑制剂以及p38抑制剂所构成的组中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的细胞培养基，其中，所述Wnt蛋白质是选自于由Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt9a、Wnt9b、Wnt10a、Wnt10b、Wnt11以及Wnt16所构成的组中的至少一种。
3.根据权利要求1或2所述的细胞培养基，其中，所述R-脊椎蛋白是选自于由R-脊椎蛋白1、R-脊椎蛋白2、R-脊椎蛋白3、以及R-脊椎蛋白4构成的组中的至少一种。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的细胞培养基，其中，所述促分裂生长因子是上皮生长因子(Epidermal Growth Factor，EGF)。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的细胞培养基，其中，所述BMP抑制剂是头蛋白(Noggin)。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的细胞培养基，其中，所述TGF-β抑制剂是A83-01。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的细胞培养基，其中，所述培养基是无血清培养基。
8.一种上皮干细胞、上皮癌细胞或包含这些细胞中的至少任一种细胞的组织的培养方法，其特征在于，包括：
细胞外基质制备工序，制备细胞外基质；
粘附工序，将上皮干细胞、上皮癌细胞或包含这些细胞中的至少任一种细胞的组织在所述细胞外基质上进行粘附；以及
类器官形成工序，在所述粘附工序之后添加权利要求1至7中任一项所述的细胞培养基，培养所述上皮干细胞、所述上皮癌细胞或包含所述这些细胞中的至少任一种细胞的组织，形成类器官。
9.一种上皮干细胞或包含上皮干细胞的组织的培养方法，其特征在于，包括：
细胞外基质制备工序，制备细胞外基质；
粘附工序，将上皮干细胞或包含上皮干细胞的组织在所述细胞外基质上进行粘附；以及
类器官形成工序，在所述粘附工序之后添加权利要求7所述的细胞培养基，培养所述上皮干细胞或包含所述上皮干细胞的组织，形成类器官。
10.一种类器官，其特征在于，通过权利要求8或9所述的培养方法来获得。
11.根据权利要求10所述的类器官，其中，该类器官用于再生医疗。
12.一种类器官，其特征在于，通过权利要求9所述的培养方法来获得，且用于移植。
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