JPWO2017142069A1 - 細胞培養培地、培養方法、及びオルガノイド - Google Patents

Abstract

本発明は、上皮幹細胞、上皮癌細胞、又はそれら細胞のうち少なくともいずれか一方を含む組織を無血清で、長期間培養することができる細胞培養培地を提供する。本発明の細胞培養培地は、Ｗｎｔタンパク質とその安定化物質アファミンとの複合体及びＲ−スポンジン（Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ）からなるＷｎｔアゴニストと、分裂促進増殖因子、骨形成因子（ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ；ＢＭＰ）阻害剤、形質転換増殖因子−β（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−β；ＴＧＦ−β）阻害剤、及びｐ３８阻害剤からなる群から選ばれる少なくとも一種と、を含む。

Description

本発明は、細胞培養培地、培養方法、及びオルガノイドに関する。
本願は、２０１６年２月１８日に、日本に出願された特願２０１６−０２９０６０号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。

腸管は人体の中でも最も外界と接する面積の広い臓器であり、消化吸収等、生命の維持に欠かせない機能を有している。腸管機能の大部分はその内層を覆う腸管上皮により担われている。腸管上皮は３系統の分化細胞（粘液産生細胞、吸収上皮細胞、内分泌細胞）からなる絨毛と主に未分化増殖細胞からなる陰窩の２つのコンパートメントにより構成されている。小腸陰窩では抗菌ペプチドを産生するパネート（Ｐａｎｅｔｈ）細胞が陰窩底部に存在する。最近、分子遺伝学的な細胞系譜解析により、パネート細胞に挟まれたＬｇｒ５陽性細胞（「ＣＢＣ（Ｃｒｙｐｔ ｂａｓｅ ｃｏｌｕｍｎａｒ）細胞」とも呼ばれる。）が腸管上皮幹細胞であることが明らかとなった。Ｌｇｒ５陽性腸管上皮幹細胞は、一過性増殖細胞（Ｔｒａｎｓｉｔ ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ ｃｅｌｌｓ）と呼ばれる前駆細胞を生み出すが、これらの前駆細胞は永続的な自己複製能力はなく、また、分化能も１〜３系統に制限される。一過性増殖細胞は陰窩内で２〜４回の分裂とともに分化していき、絨毛では終末分化を遂げる。これらの分化細胞は絨毛の頂点で剥離し、アポトーシスにより死滅する。腸管上皮は新陳代謝の速い組織であり、陰窩の幹細胞から絨毛の頂点まで４〜５日で移動する。Ｐａｎｅｔｈ細胞は他の分化細胞と異なり、分化とともに陰窩底部に移動し、２ヶ月と長い細胞寿命を有する。

腸管上皮幹細胞の自己複製機序はいくつかの遺伝子改変マウスの結果からＷｎｔ（ウィント）シグナルと骨形成タンパク質（Ｂｏｎｅ Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ；ＢＭＰ）シグナルとによって制御されていることが知られている。Ｗｎｔシグナルの抑制分子であるＡＰＣ（Ａｄｅｎｏｍａｔｏｕｓ ｐｏｌｙｐｏｓｉｓ ｃｏｌｉ）の腸管上皮特異的ノックアウトマウスでは、腸管上皮細胞の過増殖及び腺腫形成を示す。また、ＢＭＰの阻害タンパクであるノギン（Ｎｏｇｇｉｎ）を腸管上皮細胞に過剰発現させたマウスでは、異所性の陰窩形成が観察され、ＢＭＰシグナルは腸管上皮幹細胞に対して抑制的に働いていることが示唆された。実際、Ｗｎｔシグナルは陰窩底部に活性が高く、管腔側に低くなる勾配が認められる。一方、ＢＭＰシグナルはＷｎｔシグナルとは逆の勾配を示すことが知られている。

また、腸管上皮細胞の長期培養は長らく不可能であった。これは、腸管上皮幹細胞の維持に必要な増殖因子が不明であったためと考えられる。近年、腸管上皮幹細胞を細胞外マトリクス上に接着し、ＢＭＰ阻害剤、分裂促進増殖因子、及びＷｎｔアゴニストが添加された、動物又はヒト細胞用の基本培地を含む細胞培養培地の存在下で培養することにより、長期間の腸管上皮幹細胞維持に成功している（例えば、特許文献１を参照。）。

特許第５４５８１１２号公報

特許文献１に記載の培養方法で用いられるＷｎｔアゴニストのうち、Ｗｎｔタンパク質は、Ｗｎｔ遺伝子を過剰発現させたマウス線維芽細胞由来のＬ細胞等を血清とともに培養した上清（以下、「血清入りＷｎｔ上清」と呼ぶ。）により安定的に得ることができる。血清入りＷｎｔ上清に含まれるウシ胎児血清等の動物血清はＷｎｔタンパク質の安定化に必須である。血清入りＷｎｔ上清より精製されたＷｎｔタンパク質は界面活性剤による安定化が可能であるが、精製Ｗｎｔタンパク質は血清入りＷｎｔ上清に比して活性が著しく低下する。ヒト培養オルガノイドは高活性のＷｎｔタンパク質刺激が必要であるため、血清入りＷｎｔ上清を使用する必要がある。しかしながら、血清入りＷｎｔ上清を含む従来の培養方法で得られる上皮幹細胞又は前記上皮幹細胞を含むオルガノイドは、血清由来の不純物等を含むため再生医療等へ応用することが困難であり、精製Ｗｎｔタンパク質に含まれる界面活性剤は細胞毒性があった。さらに、Ｗｎｔ上清を含む従来の培地、培養方法では、一部のヒトの組織、癌組織の培養が不可能であった。

本発明は、上記課題を解決するために、上皮幹細胞、上皮癌細胞、又はそれら細胞のうち少なくともいずれか一方を含む組織を無血清で、長期間培養することができる細胞培養培地を提供すること、無血清でヒト培養オルガノイドの作製を可能にすること、これまで不可能であった組織からの培養を可能にすることを目的とする。

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、血清中のアファミンというタンパク質がＷｎｔタンパク質の安定化及び可溶化に寄与していることを見出し、本発明を完成させるに至った。本発明者らは、血清中に含まれるアファミン存在下で、脂溶性タンパク質であるＷｎｔタンパク質水溶性培地中で安定化できることに着目し、Ｗｎｔタンパク質及びアファミンを含む培地を使用することで、無血清で界面活性剤を含まない培地及び該培地を使用する培養方法である本発明を完成させるに至った。

すなわち、本発明は以下の態様を含む。
［１］Ｗｎｔタンパク質とその安定化物質アファミンとの複合体及びＲ−スポンジン（Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ）からなるＷｎｔアゴニストと、分裂促進増殖因子、骨形成因子（ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ；ＢＭＰ）阻害剤、形質転換増殖因子−β（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−β；ＴＧＦ−β）阻害剤、及びｐ３８阻害剤からなる群から選ばれる少なくとも一種と、を含むことを特徴とする細胞培養培地。
［２］前記Ｗｎｔタンパク質が、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ９ｂ、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１、及びＷｎｔ１６からなる群から選ばれる少なくとも一種である［１］に記載の細胞培養培地。
［３］前記Ｒ−スポンジンがＲ−スポンジン１、Ｒ−スポンジン２、Ｒ−スポンジン３、及びＲ−スポンジン４からなる群から選ばれる少なくとも一種である［１］又は［２］に記載の細胞培養培地。
［４］前記分裂促進増殖因子が上皮増殖因子（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ；ＥＧＦ）である［１］〜［３］のいずれか一つに記載の細胞培養培地。
［５］前記ＢＭＰ阻害剤がノギン（Ｎｏｇｇｉｎ）である［１］〜［４］のいずれか一つに記載の細胞培養培地。
［６］前記ＴＧＦ−β阻害剤がＡ８３−０１である［１］〜［５］のいずれか一つに記載の細胞培養培地。
［７］無血清培地である［１］〜［６］のいずれか一つに記載の細胞培養培地。［８］上皮幹細胞、上皮癌細胞、又はそれら細胞のうち少なくともいずれか一方を含む組織の培養方法であって、細胞外マトリクスを調製する細胞外マトリクス調製工程と、前記細胞外マトリクス上に上皮幹細胞、上皮癌細胞、又はそれら細胞のうち少なくともいずれか一方を含む組織を接着させる接着工程と、前記接着工程後に、［１］〜［７］のいずれか一種に記載の細胞培養培地を添加し、前記上皮幹細胞、前記上皮癌細胞、又はそれら細胞のうち少なくともいずれか一方を含む組織を培養し、オルガノイドを形成させるオルガノイド形成工程と、を備えることを特徴とする培養方法。
［９］上皮幹細胞、又は上皮幹細胞を含む組織の培養方法であって、細胞外マトリクスを調製する細胞外マトリクス調製工程と、前記細胞外マトリクス上に上皮幹細胞、又は上皮幹細胞を含む組織を接着させる接着工程と、前記接着工程後に、［７］に記載の細胞培養培地を添加し、前記上皮幹細胞、又は前記上皮幹細胞を含む組織を培養し、オルガノイドを形成させるオルガノイド形成工程と、を備えることを特徴とする培養方法。
［１０］［８］又は［９］に記載の培養方法により得られることを特徴とするオルガノイド。
［１１］再生医療用である［１０］に記載のオルガノイド。
［１２］［９］に記載の培養方法により得られ、移植用であることを特徴とするオルガノイド。

本発明の細胞培養培地によれば、ヒトを含む哺乳動物由来の上皮幹細胞、上皮癌細胞、若しくはそれら細胞のうち少なくともいずれか一方を含む組織、又は従来では培養することができなかった組織を長期間培養することができる。また、前記細胞及び前記組織のうち少なくともいずれか一方から高効率でオルガノイドを形成させることができる。

（Ａ）は、実施例１における各培地中の腸管幹細胞の初代培養（Ｐａｓｓａｇｅ０）の培養開始から６日後の様子を示す画像である。（Ｂ）は、実施例１における各培地中の初代培養（Ｐａｓｓａｇｅ０）の培養開始から６日後の腸管幹細胞のオルガノイドがウェル中に占める面積を定量化したグラフである。 （Ａ）は、実施例１における各培地中の腸管幹細胞の１回目の継代（Ｐａｓｓａｇｅ１）の培養開始から６日後の様子を示す画像である。（Ｂ）は、実施例１における各培地中の１回目の継代（Ｐａｓｓａｇｅ１）の培養開始から６日後の腸管幹細胞のオルガノイドがウェル中に占める面積を定量化したグラフである。 （Ａ）は、実施例１における各培地中の腸管幹細胞の２回目の継代（Ｐａｓｓａｇｅ２）の培養開始から５日後の様子を示す画像である。（Ｂ）は、実施例１における各培地中の２回目の継代（Ｐａｓｓａｇｅ２）の培養開始から５日後の腸管幹細胞のオルガノイドがウェル中に占める面積を定量化したグラフである。 実施例３におけるＮＯＧマウスでの大腸粘膜剥脱の様子を示す概略断面図及び画像である。 左側の図は、実施例３におけるＮＯＧマウスの大腸粘膜剥脱部へのヒト大腸オルガノイドの移植の様子を模式的に示す概略図である。右側の図は、実施例３におけるＮＯＧマウスの移植部位を移植から２週間後及び１６週間後に内視鏡を用いて観察した明視野及び暗視野での画像である。 上の図は、実施例３における移植から２８日後のＮＯＧマウスの移植部位の組織切片をヘマトキシリン−エオジン（Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ−Ｅｏｓｉｎ；ＨＥ）染色した結果を示す画像である。下の左側の図は、実施例３における移植から２８日後のＮＯＧマウスの移植部位の組織切片を抗ヒトサイトケラチン抗体を用いた免疫染色及びヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）（登録商標）を用いた核染色を行った結果を示す画像である。下の右側の図は、実施例３における移植から２８日後のＮＯＧマウスの移植部位の組織切片をｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション分析によるＬｇｒ５の検出及びヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）（登録商標）を用いた核染色を行った結果を示す画像である。

＜＜細胞培養培地＞＞
一実施形態として、本発明は、Ｗｎｔタンパク質とその安定化物質アファミンとの複合体及びＲ−スポンジン（Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ）からなるＷｎｔアゴニストと、分裂促進増殖因子、骨形成因子（ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ；ＢＭＰ）阻害剤、形質転換増殖因子−β（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−β；ＴＧＦ−β）阻害剤、及びｐ３８阻害剤からなる群から選ばれる少なくとも一種と、を含む細胞培養培地を提供する。

本実施形態の細胞培養培地は、実質的に不純物を含まず、上皮幹細胞、上皮癌細胞、又はそれら細胞のうち少なくともいずれか一方を含む組織を長期間培養することができる。また、上皮幹細胞、上皮癌細胞、又はそれら細胞のうち少なくともいずれか一方を含む組織から高効率でオルガノイドを形成させることができる。また、本発明の細胞培養培地を用いて培養された上皮幹細胞は、長期間分化能を維持することができ、腫瘍発生頻度が極めて低い。

本明細書において、「上皮幹細胞」とは、長期間の自己複製機能と上皮分化細胞への多分化能をもつ細胞を意味し、上皮組織に由来する幹細胞を意味する。上皮組織としては、例えば、角膜、口腔粘膜、皮膚、結膜、膀胱、尿細管、腎臓、消化器官（食道、胃、十二指腸、小腸（空腸及び回腸を含む）、大腸（結腸を含む））、肝臓、膵臓、乳腺、唾液腺、涙腺、前立腺、毛根、気管、肺等を挙げられる。本実施形態の細胞培養培地は、中でも、消化器官（食道、胃、十二指腸、小腸（空腸及び回腸を含む）、大腸（結腸を含む））、肝臓、膵臓に由来する上皮幹細胞の培養に用いられることが好ましい。
また、本明細書において、「上皮癌細胞」とは、上述の上皮組織由来の細胞が癌化したものを意味する。

本明細書において、「オルガノイド」とは、細胞を制御した空間内に高密度に集積させることにより自己組織化した立体的な細胞組織体を意味する。

＜無血清の細胞培養基本培地＞
本実施形態の細胞培養培地には、あらゆる無血清の細胞培養基本培地が含まれる。本実施形態の細胞培養培地は、動物細胞用又はヒト細胞用であることが好ましい。係る無血清の細胞培養基本培地としては、例えば、炭酸系の緩衝液でｐＨ７．２以上ｐＨ７．６以下に緩衝化されている規定の合成培地等が挙げられる。より具体的には、グルタミン、インスリン、ペニシリン又はストレプトマイシン、及びトランスフェリンが補充されたダルベッコ改変イーグル培地／ハムＦ−１２混合培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ−１２；ＤＭＥＭ／Ｆ１２）が挙げられる。また、グルタミン、インスリン、ペニシリン又はストレプトマイシン、及びトランスフェリンが補充されたＲＰＭＩ１６４０培地（Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ １６４０ ｍｅｄｉｕｍ）も挙げられる。また、グルタミン及びペニシリン又はストレプトマイシンが補充されたアドバンスト−ＤＭＥＭ／Ｆ１２、並びに、グルタミン及びペニシリン又はストレプトマイシンが補充されたアドバンストＲＰＭＩ培地等も挙げられる。
また、本実施形態の細胞培養培地における、無血清の細胞培養基本培地は、さらに、精製された、天然、半合成、又は合成の増殖因子が補充されていてもよい。増殖因子としては、例えば、Ｂ−２７ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｃｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製）、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（Ｓｉｇｍａ社製）、Ｎ−２ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｃｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製）等が挙げられる。これらの増殖因子は、一部の細胞の増殖を刺激することができる。なお、本実施形態の細胞培養培地は、ウシ胎仔血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）又はｆｅｔａｌ ｃａｌｆ ｓｅｒｕｍ）等の不確定な成分を実質的に含まない。
なお、本明細書において、「不確定な成分を実質的に含まない」とは、本実施形態の細胞培養培地は血清等の不確定な成分を全く含まない、すなわち、本実施形態の細胞培養培地は無血清培地である、又は本実施形態の細胞培養培地は血清等の不確定な成分を細胞に影響を与えない程度の量しか含まない状態を意味する。中でも、本実施形態のの細胞培養培地は無血清培地であることが好ましい。

＜Ｗｎｔアゴニスト＞
本明細書において、「Ｗｎｔアゴニスト」とは、細胞内でＴ−ｃｅｌｌ ｆａｃｔｏｒ（以下、ＴＣＦともいう。）／ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｅｎｈａｎｃｅｒ ｆａｃｔｏｒ（以下、ＬＥＦともいう。）介在性の転写を活性化する薬剤を意味する。よって、Ｗｎｔアゴニストは、Ｗｎｔファミリータンパク質に限定されず、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体ファミリーメンバーに結合して活性化するＷｎｔアゴニスト、細胞内β−カテニン分解の阻害剤、及びＴＣＦ／ＬＥＦの活性化物質を包含する。Ｗｎｔアゴニストは、該Ｗｎｔアゴニストの非存在下でのＷｎｔ活性のレベルと比較して、少なくとも１．１倍、好ましくは少なくとも１．２倍、より好ましくは少なくとも１０倍、さらに好ましくは少なくとも５０倍、特に好ましくは少なくとも１００倍、最も好ましくは少なくとも３００倍のＷｎｔ活性レベルとなるように、細胞においてＷｎｔ活性を刺激する。
Ｗｎｔ活性は、当業者にとって公知の方法を用いて、例えばｐＴＯＰＦＬＡＳＨ及びｐＦＯＰＦＬＡＳＨ Ｔｃｆルシフェラーゼレポーターコンストラクトによって、Ｗｎｔの転写活性を測定することにより調べることができる（参考文献：Ｋｏｒｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ.，１９９７.Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７５：１７８４−１７８７）。

上皮幹細胞、上皮癌細胞、又はそれら細胞のうち少なくともいずれか一方を含む組織の培養においては、Ｗｎｔアゴニストが含まれることが必須である。本実施形態の細胞培養培地に含まれるＷｎｔアゴニストとしては、Ｗｎｔタンパク質とアファミンとの複合体及びＲ−スポンジン（Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ）のうち少なくともいずれか一方であることが好ましく、Ｗｎｔタンパク質とアファミンとの複合体及びＲ−スポンジンの両方が含まれることがより好ましい。本実施形態の細胞培養培地において、Ｗｎｔタンパク質とアファミンとの複合体及びＲ−スポンジンを含むことで、上皮幹細胞は、オルガノイドをより高効率で形成することができる。

［Ｗｎｔタンパク質］
Ｗｎｔアゴニストの一種であるＷｎｔタンパク質としては、由来は特に限定されず、各種生物由来のＷｎｔタンパク質を用いることができる。中でも、哺乳動物由来のＷｎｔタンパク質であることが好ましい。哺乳動物としては、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ、ウサギ等が挙げられる。哺乳動物のＷｎｔタンパク質としては、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ９ｂ、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１、Ｗｎｔ１６等が挙げられる。本実施形態の細胞培養培地において、Ｗｎｔタンパク質は複数種を組み合わせて用いてもよい。

Ｗｎｔタンパク質を製造する方法としては、例えば、Ｗｎｔタンパク質発現細胞を用いて製造する方法等が挙げられる。Ｗｎｔタンパク質発現細胞において、細胞の由来（生物種、培養形態等）は特に限定されず、Ｗｎｔタンパク質を安定発現する細胞であればよく、Ｗｎｔタンパク質を一過性に発現する細胞でもよい。Ｗｎｔタンパク質発現細胞としては、例えば、マウスＷｎｔ３ａを安定発現するＬ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２６４７）、マウスＷｎｔ５ａを安定発現するＬ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２８１４）等が挙げられる。また、Ｗｎｔタンパク質発現細胞は、公知の遺伝子組換え技術を用いて作製することができる。すなわち、所望のＷｎｔタンパク質をコードするＤＮＡを公知の発現ベクターに挿入し、得られた発現ベクターを適切な宿主細胞に導入することにより、Ｗｎｔタンパク質発現細胞を作製することができる。所望のＷｎｔタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ等の公知のデータベースから取得することができる。

Ｗｎｔタンパク質発現細胞により発現されるＷｎｔタンパク質は、Ｗｎｔ活性を有する限り、Ｗｎｔタンパク質のフラグメントでもよく、Ｗｎｔタンパク質のアミノ酸配列以外のアミノ酸配列を含むものでもよい。Ｗｎｔタンパク質のアミノ酸配列以外のアミノ酸配列について、特に限定はなく、例えばアフィニティータグのアミノ酸配列等が挙げられる。また、Ｗｎｔタンパク質のアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ等の公知のデータベースから取得できるアミノ酸配列と完全に一致している必要はなく、Ｗｎｔ活性を有する限り、公知のデータベースから取得できるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列であってもよい。

ＧｅｎＢａｎｋ等の公知のデータベースから取得できるＷｎｔタンパク質のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、例えば、公知のデータベースから取得できるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列等が挙げられる。「１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列」とは、例えば、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異ペプチド作製法等により、欠失、置換、若しくは付加できる程度の数（１０個以下が好ましく、７個以下がより好ましく、６個以下がさらに好ましい。）のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されていることを意味する。また、実質的に同一のアミノ酸配列としては、例えば、公知のデータベースから取得できるアミノ酸配列との同一性が、少なくとも８０％以上であり、好ましくは少なくとも８５％以上、より好ましくは少なくとも９０％以上、さらに好ましくは少なくとも９２％以上、特に好ましくは少なくとも９５％以上、最も好ましくは少なくとも９９％以上であるアミノ酸配列等が挙げられる。

Ｗｎｔタンパク質の活性は、例えば、ＴＣＦレポーターアッセイにより確認することができる。一般的に、ＴＣＦレポーターアッセイとは、Ｗｎｔシグナルが細胞に入ると特異的に活性化される転写因子であるＴ−ｃｅｌｌ ｆａｃｔｏｒ（ＴＣＦ）の結合配列を持つルシフェラーゼ遺伝子を導入し、Ｗｎｔタンパク質の活性の強さをルシフェラーゼの発光によって、簡便に評価する方法である（参考文献：Ｍｏｌｅｎａａｒ ｅｔ ａｌ., Ｃｅｌｌ, ８６, ３９１, １９９６.）。ＴＣＦレポーターアッセイ以外の方法としては、Ｗｎｔシグナルが入ると細胞内のβカテニンが安定化することを利用して、βカテニンの量をウエスタンブロッティグによって定量評価する方法（参考文献：Ｓｈｉｂａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ., Ｇｅｎｅ ｔｏ ｃｅｌｌｓ, ３, ６５９, １９９８.）等が挙げられる。また、Ｗｎｔ５ａ等のように、ｎｏｎ−ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｐａｔｈｗａｙを介して細胞にシグナルを与えるＷｎｔタンパク質については、細胞内アダプタータンパク質であるＤｖｌ２のリン酸化を評価することでＷｎｔタンパク質の活性を評価する方法（参考文献：Ｋｉｋｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ., ＥＭＢＯ Ｊ., ２９, ３４７０, ２０１０.）等を用いることができる。

［Ｒ−スポンジン（Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ）］
Ｗｎｔアゴニストの一種であるＲ−スポンジンとしては、Ｒ−スポンジン１、Ｒ−スポンジン２、Ｒ−スポンジン３、及びＲ−スポンジン４からなるＲ−スポンジンファミリーが挙げられる。Ｒ−スポンジンファミリーは、分泌タンパク質であり、Ｗｎｔシグナル伝達経路の活性化及び制御に関わることが知られている。本実施形態の細胞培養培地において、Ｒ−スポンジンを複数種組み合わせて用いてもよい。
Ｒ−スポンジン活性を有する限り、Ｒ−スポンジンのフラグメントでもよく、Ｒ−スポンジンのアミノ酸配列以外のアミノ酸配列を含むものでもよい。

［含有量］
本実施形態の細胞培養培地に含まれるＷｎｔタンパク質の濃度は、５０ｎｇ／ｍＬ以上であり、１００ｎｇ／ｍＬ以上１０μｇ／ｍＬ以下であることが好ましく、２００ｎｇ／ｍＬ以上１μｇ／ｍＬ以下であることがより好ましく、３００ｎｇ／ｍＬ以上１μｇ／ｍＬ以下であることがさらに好ましい。上皮幹細胞の培養中、好ましくは２日ごとにＷｎｔアゴニストを培養培地に添加し、好ましくは４日ごとに細胞培養培地を新鮮なものに交換する。

＜アファミン＞
本明細書において、「アファミン」とは、アルブミンファミリーに属する糖タンパク質を意味し、血液又は体液中に存在することが知られている。細胞培養に用いる培地に通常添加される血清には、当該血清を採取した動物由来のアファミンが含まれている。血清中にはアファミン以外の不純物等を含むため、本実施形態の細胞培養培地においては、血清を用いずに、アファミンを単独で使用することが好ましい。

本実施形態の細胞培養培地に含まれるアファミンは、由来は特に限定されず、各種生物由来のアファミンを用いることができる。中でも、哺乳動物由来のアファミンであることが好ましい。哺乳動物としては、例えば、上述の［Ｗｎｔタンパク質］と同様のものが挙げられる。主な哺乳動物のアファミンのアミノ酸配列及びこれをコードする遺伝子の塩基配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ等の公知のデータベースから取得することができる。例えば、ＧｅｎＢａｎｋにおいて、ヒトアファミンのアミノ酸配列はＡＡＡ２１６１２、これをコードする遺伝子の塩基配列はＬ３２１４０のアクセッション番号で登録されており、ウシアファミンのアミノ酸配列はＤＡＡ２８５６９、これをコードする遺伝子の塩基配列はＧＪ０６０９６８のアクセッション番号で登録されている。

本実施形態の細胞培養培地に含まれるアファミンは、血清等に含まれる天然のアファミンを公知の方法で精製したものでもよく、組換えアファミンであってもよい。組換えアファミンは、公知の遺伝子組換え技術を適宜用いることにより製造することができる。組換えアファミンの製造方法としては、例えば、アファミンをコードするＤＮＡを公知の発現ベクターに挿入し、得られた発現ベクターを適切な宿主細胞に導入して組換えアファミンを発現させ、公知の精製方法を用いて精製することにより製造することができる。組換えアファミンは、アフィニティータグを付加したアファミンであってもよい。付加するアフィニティータグは特に限定されず、公知のアフィニティータグから適宜選択して用いることができる。アフィニティータグとしては、特異的抗体により認識されるアフィニティータグであることが好ましく、例えば、ＦＬＡＧタブ、ＭＹＣタグ、ＨＡタグ、Ｖ５タグ等が挙げられる。

上述のＷｎｔタンパク質は、特定のセリン残基が脂肪酸（パルミトレイン酸）で修飾されているため、強い疎水性を有する。そのため、Ｗｎｔタンパク質は、水溶液中では凝集又は変性しやすいため、精製及び保存が非常に難しいことが広く知られている。
一方、この特定のセリン残基の脂肪酸による修飾は、Ｗｎｔタンパク質の生理活性に必須であり、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体ファミリーメンバーとの結合に関与することが報告されている。本発明者らは、水溶液中において、Ｗｎｔタンパク質がアファミンと１対１で結合し複合体を形成し、高い生理活性を保ちながら、可溶化することを見出した。
係る知見に基づき、Ｗｎｔタンパク質及びアファミンの両方を発現する細胞を培養する方法により、Ｗｎｔタンパク質−アファミン複合体を製造してもよく、Ｗｎｔタンパク質発現細胞とアファミン発現細胞とを共培養する方法により、Ｗｎｔタンパク質−アファミン複合体を製造してもよい。Ｗｎｔタンパク質−アファミン複合体中のＷｎｔタンパク質の活性は、上述の［Ｗｎｔタンパク質］と同様の方法を用いて、評価することができる。

本実施形態の細胞培養培地に含まれるアファミンの濃度は、特に限定されないが、５０ｎｇ／ｍＬ以上１０μｇ／ｍＬ以下であることが好ましく、１００ｎｇ／ｍＬ以上１μｇ／ｍＬ以下であることがより好ましく、３００μｇ／ｍＬ以上１μｇ／ｍＬ以下であることがさらに好ましい。

＜分裂促進増殖因子＞
本実施形態の細胞培養培地に含まれる分裂促進増殖因子としては、例えば、上皮増殖因子（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ；ＥＧＦ）、形質転換増殖因子−α（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ−α；ＴＧＦ−α）、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂａｓｉｃ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ；ｂＦＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ｂｒａｉｎ ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ；ＢＤＮＦ）、ケラチン生成細胞増殖因子（ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ；ＫＧＦ）等の増殖因子のファミリーが挙げられる。これらの分裂促進増殖因子は複数種類を組み合わせて用いてもよい。
ＥＧＦは、様々な培養外胚葉性細胞及び中胚葉性細胞に対する強力な分裂促進因子であり、一部の繊維芽細胞の、特異的細胞の分化に顕著な影響を有する。ＥＧＦ前駆体は、タンパク質分解により切断されて、細胞を刺激する５３−アミノ酸ペプチドホルモンを生成させる、膜結合分子として存在する。
本実施形態の細胞培養培地に含まれる分裂促進増殖因子としては、中でも、ＥＧＦが好ましい。本実施形態の細胞培養培地に含まれるＥＧＦの濃度は、５ｎｇ／ｍＬ以上５００ｎｇ／ｍＬ以下であることが好ましく、１０ｎｇ／ｍＬ以上４００ｎｇ／ｍＬ以下であることがより好ましく、５０ｎｇ／ｍＬ以２００ｎｇ／ｍＬ以下であることがさらに好ましい。
また、本実施形態の細胞培養培地にｂＦＧＦ（好ましくは、ＦＧＦ１０又はＦＧＦ７）を含む場合においても、ＥＧＦと同様の含有量であることが好ましい。複数のＦＧＦ、例えばＦＧＦ７及びＦＧＦ１０を使用する場合は、ＦＧＦの総含有量が上記範囲であることが好ましい。幹細胞の培養中、２日ごとに分裂促進増殖因子を培養培地に添加することが好ましく、４日ごとに培養培地を新鮮なものに交換することが好ましい。

＜ＢＭＰ阻害剤＞
骨形成因子（ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ；ＢＭＰ）は、二量体リガンドとして二種類の異なる受容体セリン／スレオニンキナーゼ、Ｉ型及びＩＩ型受容体からなる受容体複合体に結合する。ＩＩ型受容体はＩ型受容体をリン酸化し、その結果、この受容体キナーゼが活性化される。このＩ型受容体は、続いて特異的な受容体基質（ＳＭＡＤ）をリン酸化し、その結果、シグナル伝達経路によって転写活性が導かれる。一般的に、ＢＭＰ阻害剤は、例えば、ＢＭＰ受容体へのＢＭＰ分子の結合を阻止又は阻害するものであって、ＢＭＰ活性を中和する複合体を形成するためにＢＭＰ分子に結合する薬剤である。また、ＢＭＰ阻害剤は、例えば、ＢＭＰ受容体と結合し、ＢＭＰ分子の受容体への結合を阻止又は阻害するものであって、アンタゴニスト又は逆アゴニストとして作用する薬剤である。

ＢＭＰ阻害剤は、この阻害剤の非存在下でのＢＭＰ活性レベルと比較して、好ましくは５０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、特に好ましくは９０％以上の阻害活性を有する。ＢＭＰ阻害活性は、当業者にとって公知の方法（参考文献：Ｚｉｌｂｅｒｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ., ＢＭＣ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ, ８：４１, ２００７.）を用いて、ＢＭＰの転写活性を測定することによって、評価することができる。

本実施形態の細胞培養培地に含まれるＢＭＰ阻害剤としては、天然のＢＭＰ結合タンパク質であることが好ましく、例えば、ノギン（Ｎｏｇｇｉｎ）、コーディン（Ｃｈｏｒｄｉｎ）、コーディンドメイン等のコーディン様タンパク質；ホリスタチン（Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ）、ホリスタチンドメイン等のホリスタチン関連タンパク質；ＤＡＮ、ＤＡＮシステイン−ノットドメイン等のＤＡＮ様タンパク質；スクレロスチン／ＳＯＳＴ、デコリン、α−２マクログロブリン等が挙げられる。本実施形態の細胞培養培地に含まれるＢＭＰ阻害剤としては、中でも、コーディン様タンパク質又はＤＡＮ様タンパク質が好ましく、コーディン様タンパク質がより好ましい。コーディン様タンパク質としては、ノギンが好ましい。コーディン様タンパク質やＤＡＮ様タンパク質は拡散性タンパク質であり、様々な親和度でＢＭＰ分子に結合し、シグナル伝達受容体へのＢＭＰ分子の接近を阻害することができる。上皮幹細胞を培養する場合において、これらのＢＭＰ阻害剤を細胞培養培地に添加することにより、幹細胞の喪失を妨げることができる。

本実施形態の細胞培養培地に含まれるＢＭＰ阻害剤の濃度は、１０ｎｇ／ｍＬ以上１００ｎｇ／ｍＬ以下であることが好ましく、２０ｎｇ／ｍＬ以上１００ｎｇ／ｍＬ以下であることがより好ましく、５０ｎｇ／ｍＬ以上１００ｎｇ／ｍＬ以下であることがさらに好ましい。幹細胞の培養中、２日ごとに分裂促進増殖因子を培養培地に添加することが好ましく、４日ごとに培養培地を新鮮なものに交換することが好ましい。

＜ＴＧＦ−β阻害剤＞
形質転換増殖因子−β（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−β；ＴＧＦ−β）は、増殖因子の一種であり、腎臓、骨髄、血小板等ほぼすべての細胞で産生される。ＴＧＦ−βには、５種類のサブタイプ（β１〜β５）が存在する。また、ＴＧＦ−βは、骨芽細胞の増殖、並びに、コラーゲンのような結合組織の合成及び増殖を促進し、上皮細胞の増殖や破骨細胞に対しては抑制的に作用することが知られている。一般的に、ＴＧＦ−β阻害剤は、例えば、ＴＧＦ−β受容体へのＴＧＦ−βの結合を阻止又は阻害するものであって、ＴＧＦ−β活性を中和する複合体を形成するためにＴＧＦ−βに結合する薬剤である。また、ＴＧＦ−β阻害剤は、例えば、ＴＧＦ−β受容体と結合し、ＴＧＦ−βの受容体への結合を阻止又は阻害するものであって、アンタゴニスト又は逆アゴニストとして作用する薬剤である。

ＴＧＦ−β阻害剤は、この阻害剤の非存在下でのＴＧＦ−β活性レベルと比較して、好ましくは５０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、特に好ましくは９０％以上の阻害活性を有する。ＴＧＦ−β阻害活性は、当業者にとって公知の方法で評価することができる。係る評価系としては、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を動かすヒトＰＡＩ−１プロモーター又はＳｍａｄ結合部位を含むレポーター構築物を用いて細胞が安定にトランスフェクトされている細胞アッセイが挙げられる（参考文献：Ｄｅ Ｇｏｕｖｉｌｌｅ ｅｔ ａｌ., Ｂｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ, １４５（２）:１６６−１７７, ２００５.）。

本実施形態の細胞培養培地に含まれるＴＧＦ−β阻害剤としては、例えば、Ａ８３−０１（３−（６−メチルピリジン−２−イル）−１−フェニルチオカルバモイル−４−キノリン−４−イルピラゾール）、ＡＬＫ５ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｉ（３−（ピリジン−２−イル）−４−（４−キノニル）−１Ｈ−ピラゾール）、ＬＤＮ１９３１８９（４−（６−（４−（ピペラジン−１−イル）フェニル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−３−イル）キノリン）、ＳＢ４３１５４２（４−［４−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−５−ピリジン‐２‐イル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］ベンズアミド）、ＳＢ−５０５１２４（２−（５−ベンゾ［１，３］ジオキソール−５−イル−２−ｔｅｒｔ−ブチル−３Ｈ−イミダゾール−４−イル）−６−メチルピリジン塩酸塩水和物）、ＳＤ−２０８（２−（５−クロロ−２−フルオロフェニル）プテリジン−４−イル）ピリジン−４−イル−アミン）、ＳＢ−５２５３３４（６−［２−（１，１−ジメチルエチル）−５−（６−メチル−２−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−４−イル］キノキサリン）、ＬＹ−３６４９４７（４−［３−（２−ピリジニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−キノリン）、ＬＹ２１５７２９９（４−［２−（６−メチル−ピリジン−２−イル）−５，６−ジヒドロ−４Ｈ−ピロロ［１，２−ｂ］ピラゾール−３−イル］−キノリン−６−カルボン酸アミド）、ＴＧＦ−β ＲＩ Ｋｉｎａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＩＩ ６１６４５２（２−（３−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１，５−ナフチリジン）、ＴＧＦ−β ＲＩ Ｋｉｎａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＩＩＩ ６１６４５３（２−（５−ベンゾ［１，３］ジオキソール−４−イル−２−ｔｅｒｔ−ブチル−１Ｈ−イミダゾール−４−イル）−６−メチルピリジン， ＨＣｌ）、ＴＧＦ−β ＲＩ Ｋｉｎａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＩＸ ６１６４６３（４−（（４−（（２，６−ジメチルピリジン−３−イル）オキシ）ピリジン−２−イル）アミノ）ベンゼンスルホンアミド）、ＴＧＦ−β ＲＩ Ｋｉｎａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＶＩＩ ６１６４５８（１−（２−（（６，７−ジメトキシ−４−キノリル）オキシ）−（４，５−ジメチルフェニル）−１−エタノン）、ＴＧＦ−β ＲＩ Ｋｉｎａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＶＩＩＩ ６１６４５９（６−（２−ｔｅｒｔ−ブチル−５−（６−メチル−ピリジン−２−イル）−１Ｈ−イミダゾール−４−イル）−キノキサリン）、ＡＰ１２００９（ＴＧＦ−β２アンチセンス化合物“Ｔｒａｂｅｄｅｒｓｅｎ”）、Ｂｅｌａｇｅｎｐｕｍａｔｕｃｅｌ−Ｌ（ＴＧＦ−β２アンチセンス遺伝子修飾同種異系腫瘍細胞ワクチン）、ＣＡＴ−１５２（Ｇｌａｕｃｏｍａ−ｌｅｒｄｅｌｉｍｕｍａｂ（抗−ＴＧＦ−β−２モノクローナル抗体））、ＣＡＴ−１９２（Ｍｅｔｅｌｉｍｕｍａｂ（ＴＧＦβ１を中和するヒトＩｇＧ４モノクローナル抗体）、ＧＣ−１００８（抗-ＴＧＦ−βモノクローナル抗体）等が挙げられる。本実施形態の細胞培養培地に含まれるＴＧＦ−β阻害剤としては、中でも、Ａ８３−０１が好ましい。

本実施形態の細胞培養培地に含まれるＴＧＦ−β阻害剤の濃度は、１００ｎＭ以上１０μＭ以下であることが好ましく、５００ｎＭ以上５μＭ以下であることがより好ましく、５００ｎＭ以上２μＭ以下であることがさらに好ましい。幹細胞の培養中、２日ごとにＴＧＦ−β阻害剤を培養培地に添加することが好ましく、４日ごとに培養培地を新鮮なものに交換することが好ましい。

＜ｐ３８阻害剤＞
本明細書において、「ｐ３８阻害剤」は、ｐ３８シグナル伝達を直接的又は間接的に負に調節する任意の阻害剤を意味する。一般的に、ｐ３８阻害剤は、例えば、ｐ３８に結合し、且つその活性を低減する。ｐ３８プロテインキナーゼは、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）ファミリーの一部である。ＭＡＰＫは、環境ストレス及び炎症サイトカイン等の細胞外刺激に応答し、遺伝子発現、有糸分裂、分化、増殖、及び細胞生存／アポトーシス等の様々な細胞活性を調節するセリン／スレオニン特異的プロテインキナーゼである。ｐ３８ ＭＡＰＫは、α、β、β２、γ、及びδアイソフォームとして存在する。また、ｐ３８阻害剤は、例えば、少なくとも１つのｐ３８アイソフォームに結合し、且つその活性を低減する薬剤でもある。

ｐ３８阻害剤は、この阻害剤の非存在下でのｐ３８活性レベルと比較して、好ましくは５０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、特に好ましくは９０％以上の阻害活性を有する。ｐ３８阻害剤による阻害効果は、当業者にとって公知の方法で評価することできる。係る評価系としては、Ｔｈｒ１８０／Ｔｙｒ１８２リン酸化のリン酸化部位特異的抗体検出方法、生化学的組換えキナーゼアッセイ、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）分泌アッセイ、ｐ３８阻害剤用のＤｉｓｃｏｖｅｒＲｘハイスループットスクリーニングプラットフォーム、ｐ３８活性アッセイキット (例えば、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製, Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製等)等が挙げられる。

本実施形態の細胞培養培地に含まれるｐ３８阻害剤としては、例えば、ＳＢ−２０２１９０（４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−ヒドロキシフェニル）−５−（４−ピリジル）−１Ｈ−イミダゾール）、ＳＢ−２０３５８０（４−［４−（４−フルオロフェニル）−２−［４−（メチルスルフィニル）フェニル］−１Ｈ−イミダゾール−５−イル］ピリジン）、ＶＸ−７０２（６−（Ｎ−カルバモイル−２，６−ジフルオロアニリノ）−２−（２，４−ジフルオロフェニル）ピリジン−３−カルボキシアミド）、ＶＸ−７４５（５−（２，６−ジクロロフェニル）−２−［２，４−ジフルオロフェニル）チオ］−６Ｈ−ピリミド［１，６−ｂ］ピリダジン−６−ワン）、ＰＤ−１６９３１６（４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−ニトロフェニル）−５−（４−ピリジル）−１Ｈ−イミダゾール）、ＲＯ−４４０２２５７（６−（２，４−ジフルオロフェノキシ）−２−｛［３−ヒドロキシ−１−（２−ヒドロキシエチル）プロピル］アミノ｝−８−メチルピリド［２，３−Ｄ］ピリミジン−７（８ｈ）−ワン）、ＢＩＲＢ−７９６（１−［５−ｔｅｒｔ−ブチル−２−（４−メチルフェニル）ピラゾール−３−イル］−３−［４−（２−モルフォリン−４−イレトキシ）ナフタレン−１−イル］ウレア）等が挙げられる。

本実施形態の細胞培養培地に含まれるｐ３８阻害剤の濃度は、５０ｎＭ以上１００μＭ以下であることが好ましく、１００ｎＭ以上５０μＭ以下であることがより好ましく、１００ｎＭ以上１０μＭ以下であることがさらに好ましい。幹細胞の培養中、２日ごとにｐ３８阻害剤を培養培地に添加することが好ましく、４日ごとに培養培地を新鮮なものに交換することが好ましい。

＜その他成分＞
本実施形態の細胞培養培地は、さらに、Ｒｏｃｋ（Ｒｈｏ−キナーゼ）阻害剤を含んでいてもよい。Ｒｏｃｋ阻害剤としては、例えば、Ｙ−２７６３２（（Ｒ）−（＋）−トランス−４−（１−アミノエチル）−Ｎ−（４−ピリジル）シクロヘキサンカルボキサミド二塩酸塩一水和物）、ファスジル（ＨＡ１０７７）（５−（１，４−ジアゼパン−１−イルスルホニル）イソキノリン）、Ｈ−１１５２（（Ｓ）−（＋）−２−メチル−１−［（４−メチル−５−イソキノリニル）スルホニル］−ヘキサヒドロ−１Ｈ−１，４−ジアゼピン二塩酸塩）等が挙げられる。Ｒｏｃｋ阻害剤として、Ｙ−２７６３２を用いる場合は、単細胞に分散された幹細胞の培養の最初の２日間に添加することが好ましい。本実施形態の細胞培養培地に含まれるＹ−２７６３２は、１０μＭであることが好ましい。

本実施形態の細胞培養培地は、さらに、Ｎｏｔｃｈアゴニストを含んでいてよい。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達は、細胞生存及び増殖において重要な役割を果たすことが知られている。Ｎｏｔｃｈ受容体タンパク質としては、例えば、Ｄｅｌｔａ １、Ｊａｇｇｅｄ １及び２、並びにＤｅｌｔａ様１、Ｄｅｌｔａ様３、Ｄｅｌｔａ様４を含む多くの表面結合型又は分泌性リガンドと相互作用し得る受容体タンパク質等が挙げられる。リガンドが受容体に結合すると、ＡＤＡＭプロテアーゼファミリーのメンバーを含むプロテアーゼによる連続的な切断反応、及び、γセクレターゼプレシニリンにより制御される膜内切断によって、Ｎｏｔｃｈ受容体が活性化される。この結果として、Ｎｏｔｃｈの細胞内ドメインが核に移動し、ここで、これが下流遺伝子の転写を活性化する。Ｎｏｔｃｈアゴニストとしては、Ｊａｇｇｅｄ １及びＤｅｌｔａ １、又はそれらの活性を有する断片若しくは誘導体が好ましい。Ｎｏｔｃｈアゴニストとしては、ＤＳＬペプチドがより好ましい（参考文献：Ｄｏｎｔｕ ｅｔ ａｌ., Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ, ６：Ｒ６０５−Ｒ６１５, ２００４.）。
本実施形態の細胞培養培地に含まれるＮｏｔｃｈアゴニストがＤＳＬペプチドである場合、その濃度は、１０ｎｇ／ｍＬ以上１００ｎｇ／ｍＬ以下であることが好ましい。特に培養の第一週中にＮｏｔｃｈアゴニストを添加すると、培養効率が２〜３倍上昇する。このＮｏｔｃｈアゴニストは、好ましくは、この幹細胞の培養の最初の７日間、２日ごとに培養培地に添加される。

Ｎｏｔｃｈアゴニストは、この分子の非存在下でのＮｏｔｃｈ活性レベルと比較して、少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％、さらに好ましくは少なくとも３０％、さらに好ましくは少なくとも５０％、特に好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは１００％、細胞においてＮｏｔｃｈ活性を刺激する分子である。Ｎｏｔｃｈ活性は、当業者にとって公知の方法により、４ｘｗｔＣＢＦ１−ルシフェラーゼレポーターコンストラクトを用いて、Ｎｏｔｃｈの転写活性を測定することによって、評価することができる（参考文献：Ｈｓｉｅｈ ｅｔ ａｌ., Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ., １６, ９５２−９５９, １９９６.）。

本実施形態の細胞培養培地は、さらに、ＤＡＰＴ又はＤＢＺ等のγ−セクレターゼ阻害剤を含んでいてもよい。γ−セクレターゼ阻害剤は、分化の間、細胞運命決定に影響を及ぼすことができる。本実施形態の細胞培養培地に含まれるγ−セクレターゼ阻害剤の濃度は、例えば１ｎｇ／ｍＬ以上１０μｇ／ｍＬであってよく、例えば１ｎｇ／ｍＬ以上１μｇ／ｍＬ以下であってよく、例えば１ｎｇ／ｍＬ以上１００ｎｇ／ｍＬ以下であってよい。

本実施形態の細胞培養培地は、さらに、ガストリン（又はＬｅｕ１５−ガストリン等の適切な代替物）が添加される。本実施形態の細胞培養培地に含まれるガストリン（又は適切な代替物）濃度は、例えば１ｎｇ／ｍＬ以上１０μｇ／ｍＬであってよく、例えば１ｎｇ／ｍＬ以上１μｇ／ｍＬ以下であってよく、例えば５ｎｇ／ｍＬ以上１００ｎｇ／ｍＬ以下であってよい。

本実施形態の細胞培養培地は、さらに、ニコチンアミドを含んでいてもよい。ニコチンアミドを含むことにより、例えばヒト結腸オルガノイドの培養効率及び寿命を改善することができる。本実施形態の細胞培養培地に含まれるニコチンアミドの濃度は、例えば１ｍｇ／ｍＬ以上１００ｍｇ／ｍＬであってよく、例えば５ｍｇ／ｍＬ以上５０ｍｇ／ｍＬ以下であってよく、例えば５ｍｇ／ｍＬ以上２０ｍｇ／ｍＬ以下であってよい。

本実施形態の細胞培養培地は、さらに、少なくとも１種のアミノ酸を含んでもよい。本実施形態の細胞培養培地に含まれるアミノ酸としては、例えば、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、及びその組み合わせ等が挙げられる。一般的に、細胞培養培地に含まれるＬ−グルタミンの濃度は０．０５ｇ／Ｌ以上１ｇ／Ｌ以下（通常、０．１ｇ／Ｌ以上０．７５ｇ／Ｌ以下)である。細胞培養培地に含まれるその他のアミノ酸は、０．００１ｇ／Ｌ以上１ｇ／Ｌ(通常、０．０１ｇ／Ｌ以上０．１５ｇ／Ｌ以下)である。アミノ酸は合成由来でもよい。

本実施形態の細胞培養培地は、さらに、少なくとも１種のビタミンを含んでいてもよい。本実施形態の細胞培養培地に含まれるビタミンとしては、例えば、チアミン（ビタミンＢ１）、リボフラビン（ビタミンＢ２）、ナイアシン（ビタミンＢ３）、Ｄ−パントテン酸カルシウム（ビタミンＢ５）、ピリドキサール／ピリドキサミン／ピリドキシン（ビタミンＢ６）、葉酸（ビタミンＢ９）、シアノコバラミン（ビタミンＢ１２）、アスコルビン酸（ビタミンＣ）、カルシフェロール（ビタミンＤ２）、ＤＬ−αトコフェロール（ビタミンＥ）、ビオチン（ビタミンＨ）、メナジオン（ビタミンＫ）等が挙げられる。

本実施形態の細胞培養培地は、さらに、少なくとも１種の無機塩を含んでいてもよい。本実施形態の細胞培養培地に含まれる無機塩は、細胞の浸透圧平衡の維持を助けるために、および膜電位の調節を助けるためのものである。無機塩の具体例としては、カルシウム、銅、鉄、マグネシウム、カリウム、ナトリウム、亜鉛の塩が挙げられる。塩は、通常、塩化物、リン酸塩、硫酸塩、硝酸塩、及び重炭酸塩の形で用いられる。さらに具体的な塩には、ＣａＣｌ_２、ＣｕＳＯ_４−５Ｈ_２Ｏ、Ｆｅ（ＮＯ_３）−９Ｈ_２Ｏ、ＦｅＳＯ_４−７Ｈ_２Ｏ、ＭｇＣｌ、ＭｇＳＯ_４、ＫＣｌ、ＮａＨＣＯ_３、ＮａＣｌ、Ｎａ_２ＨＰＯ_４、Ｎａ_２ＨＰＯ_４−Ｈ_２Ｏ、ＺｎＳＯ_４−７Ｈ_２Ｏ等が挙げられる。

本実施形態の細胞培養培地は、さらに、少なくとも１種の炭素エネルギー源となり得る糖を含んでいてもよい。本実施形態の細胞培養培地に含まれる糖としては、例えば、グルコース、ガラクトース、マルトース、フルクトース等が挙げられる。中でも、糖としては、グルコースが好ましく、Ｄ−グルコース（デキストロース）が特に好ましい。本実施形態の細胞培養培地に含まれる糖の濃度は、１ｇ／Ｌ以上１０ｇ／Ｌであることが好ましい。

本実施形態の細胞培養培地は、さらに、少なくとも１種の微量元素を含んでいてもよい。本実施形態の細胞培養培地に含まれる微量元素としては、例えば、バリウム、ブロミウム、コバルト、ヨウ素、マンガン、クロム、銅、ニッケル、セレン、バナジウム、チタン、ゲルマニウム、モリブデン、ケイ素、鉄、フッ素、銀、ルビジウム、スズ、ジルコニウム、カドミウム、亜鉛、アルミニウム又はこれらのイオン等が挙げられる。

本実施形態の細胞培養培地は、さらに、少なくとも１種の付加的な薬剤を含んでいてもよい。係る薬剤としては、幹細胞培養を改善することが報告されている栄養素又は増殖因子、例えば、コレステロール／トランスフェリン／アルブミン／インシュリン／プロゲステロン、プトレシン、亜セレン酸塩／他の因子等が挙げられる。

＜＜上皮幹細胞、上皮癌細胞、又はそれら細胞を含む組織を培養するための方法＞＞
一実施形態として、本発明は、上皮幹細胞、上皮癌細胞、又はそれら細胞のうち少なくともいずれか一方を含む組織の培養方法であって、細胞外マトリクスを調製する細胞外マトリクス調製工程と、前記細胞外マトリクス上に上皮幹細胞、上皮癌細胞、又はそれらの細胞を含む組織を接着させる接着工程と、前記接着工程後に、上述の細胞培養培地を添加し、前記上皮幹細胞、前記上皮癌細胞、又は前記それらの細胞を含む組織を培養し、オルガノイドを形成させるオルガノイド形成工程と、を備える培養方法を提供する。

本実施形態の培養方法によれば、上皮幹細胞、上皮癌細胞、又はそれら細胞のうち少なくともいずれか一方を含む組織を長期間培養することができる。また、上皮幹細胞、上皮癌細胞、又はそれら細胞のうち少なくともいずれか一方を含む組織から高効率でオルガノイドを形成させることができる。
本実施形態の方法について、以下に詳細に説明する。

［細胞外マトリクス調製工程］
一般的に、「細胞外マトリクス（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍａｔｒｉｘ；ＥＣＭ）」とは、生物において細胞の外に存在する超分子構造を意味する。このＥＣＭは、上皮幹細胞、上皮癌細胞、又はそれらを含む組織が増殖するための足場となる。
ＥＣＭは、様々な多糖、水、エラスチン、及び糖タンパク質を含む。糖タンパク質としては、例えば、コラーゲン、エンタクチン（ナイドジェン）、フィブロネクチン、ラミニン等が挙げられる。

ＥＣＭの調製方法としては、例えば、結合組織細胞を用いる方法等が挙げられる。より具体的には、ＥＣＭ産生細胞、例えば、線維芽細胞を培養した後に、これらの細胞を取り出し、上皮幹細胞、上皮癌細胞、又はそれらを含む組織を添加することによって、ＥＣＭを足場として用いることができる。

ＥＣＭ産生細胞としては、例えば、主にコラーゲン及びプロテオグリカンを産生する軟骨細胞、主にＩＶ型コラーゲン、ラミニン、間質プロコラーゲン、及びフィブロネクチンを産生する線維芽細胞、主にコラーゲン（Ｉ型、ＩＩＩ型、及びＶ型)、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、ヒアルロン酸、フィブロネクチン、及びテネイシン−Ｃを産生する結腸筋線維芽細胞等が挙げられる。または、市販のＥＣＭを用いてもよい。市販のＥＣＭとしては、例えば、細胞外マトリクスタンパク質（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ（ＥＨＳ）マウス肉腫細胞に由来する基底膜調製物（例えば、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製））等挙げられる。ＰｒｏＮｅｃｔｉｎ（ＳｉｇｍａＺ３７８６６６）等の合成ＥＣＭを用いてもよい。また、天然ＥＣＭ及び合成ＥＣＭの混合物を用いてもよい。

幹細胞を培養するためにＥＣＭを使用する場合、幹細胞の長期生存及び未分化幹細胞の継続的存在を強化することができる。ＥＣＭの非存在下では、幹細胞培養物を長期間にわたって培養することができず、未分化幹細胞の継続的存在は観察されない。さらに、ＥＣＭが存在すると、ＥＣＭの非存在下では培養することができないオルガノイドを培養することができる。

ＥＣＭは、通常、細胞が懸濁されたディッシュの底に沈んでいる。例えば、ＥＣＭが３７℃で凝固するときに、上述の細胞培養培地を加えて、ＥＣＭの中に拡散させて用いてもよい。培地中の細胞は、ＥＣＭの表面構造と相互作用することによって、例えば、インテグリンと相互作用することによってＥＣＭに固着することができる。

ＥＣＭは培養容器等にコーティングして用いてもよい。ＥＣＭとして、フィブロネクチンを用いる場合、培養容器中にコーティングされる割合は、１μｇ／ｃｍ^２以上２５０μｇ／ｃｍ^２以下であることが好ましく、１μｇ／ｃｍ^２以上１５０μｇ／ｃｍ^２以下であることがより好ましく、８μｇ／ｃｍ^２以上１２５μｇ／ｃｍ^２以下であることがさらに好ましい。

［接着工程］
続いて、上皮幹細胞、上皮癌細胞、又はそれら細胞のうち少なくともいずれか一方を含む組織を準備する。本実施形態の培養法において用いられる、上皮幹細胞又は上皮癌細胞は上述の＜＜細胞培養培地＞＞と同様のものが挙げられる。

上皮組織から細胞を単離する方法としては、当技術分野において公知の方法が挙げられる。例えば、キレート剤と単離組織とを恒温放置することによって、陰窩を単離することができる。この組織を洗浄した後、硝子スライドで上皮細胞層を粘膜下層から剥離し、細切する。この後、トリプシン又は、好ましくはＥＤＴＡ及びＥＧＴＡのうち少なくともいずれか一方を含む液中で恒温放置し、例えば、ろ過及び遠心機の少なくともいずれか一方を用いて、未消化の組織断片と陰窩由来の単一細胞とを分離する。トリプシンの代わりに、その他のタンパク質分解酵素、例えばコラゲナーゼ及びディスパーゼＩのうち少なくともいずれか一方を使用してもよい。膵臓及び胃の断片を単離するために同様の方法が使用される。

上皮組織から幹細胞を単離する方法としても、当技術分野において公知の方法が挙げられる。幹細胞は、その表面上でＬｇｒ５及びＬｇｒ６のうち少なくともいずれか一方（Ｌｇｒ５及びＬｇｒ６は大型のＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）スーパーファミリーに属する）を発現する。単離方法としては、上皮組織から細胞縣濁液を調製し、この細胞縣濁液を、Ｌｇｒ５及びＬｇｒ６のうち少なくともいずれか一方と結合する化学物質に接触させ、このＬｇｒ５及びＬｇｒ６のうち少なくともいずれか一方と結合する化学物質を分離し、この結合化合物から幹細胞を単離する方法挙げられる。

Ｌｇｒ５及びＬｇｒ６のうち少なくともいずれか一方と結合する化学物質としては、例えば、抗体、より具体的には、例えばＬｇｒ５及びＬｇｒ６のうち少なくともいずれか一方を特異的に認識し、それに結合するモノクローナル抗体（例えば、マウス及びラットモノクローナル抗体を含むモノクローナル抗体等）が挙げられる。このような抗体を用いて、例えば磁性ビーズを活用して、又は蛍光活性化細胞ソーターを通じて、Ｌｇｒ５及びＬｇｒ６のうち少なくともいずれか一方を発現している幹細胞を単離することができる。

上述の方法により単離された上皮幹細胞、上皮癌細胞、又はそれら細胞のうち少なくともいずれか一方を含む組織を、前記調製工程で得られた細胞マトリクス上に播種し、静置する。播種された細胞は、ＥＣＭの表面構造と相互作用することによって、例えば、インテグリンと相互作用することによってＥＣＭに接着することができる。

［オルガノイド形成工程］
続いて、細胞播種後、細胞が乾かないうちに、上述の細胞培養培地を添加し、培養する。培養温度は３０℃以上４０℃以下が好ましく、３７℃程度がより好ましい。培養時間は用いる細胞によって適宜調整することができる。培養開始からから１〜２週間程度後で、オルガノイドを形成させることができる。また、従来では２〜３ヶ月しか細胞維持培養することができなかった細胞に対し、本実施形態の培養方法では、３ヶ月以上の長期間（好ましくは、１０ヶ月程度）においても、細胞を維持培養することができる。本実施形態の培養方法を用いて、上皮幹細胞を培養した場合は、分化能を維持でき、腫瘍発生頻度を極めて低い状態に抑えることができる。

＜＜上皮幹細胞、又は上皮幹細胞を含む組織を培養するための方法＞＞
一実施形態として、本発明は、上皮幹細胞、又は上皮幹細胞を含む組織の培養方法であって、細胞外マトリクスを調製する細胞外マトリクス調製工程と、前記細胞外マトリクス上に上皮幹細胞、又は上皮幹細胞を含む組織を接着させる接着工程と、前記接着工程後に、上述の無血清培地である細胞培養培地を添加し、前記上皮幹細胞、又は前記上皮幹細胞を含む組織を培養し、オルガノイドを形成させるオルガノイド形成工程と、を備える培養方法を提供する。

本実施形態の培養方法によれば、上皮幹細胞、又は上皮幹細胞を含む組織を長期間培養することができる。また、上皮幹細胞、又は上皮幹細胞を含む組織から高効率でオルガノイドを形成させることができる。
本実施形態の方法について、以下に詳細に説明する。

［細胞外マトリクス調製工程］
ＥＣＭとしては、上述の＜＜上皮幹細胞、上皮癌細胞、又はそれら細胞を含む組織を培養するための方法＞＞の［細胞外マトリクス調製工程］において例示されたものと同様のものが挙げられる。

ＥＣＭの調製方法としては、上述の＜＜上皮幹細胞、上皮癌細胞、又はそれら細胞を含む組織を培養するための方法＞＞の［細胞外マトリクス調製工程］において例示されたものと同様のものが挙げられる。

ＥＣＭ産生細胞としては、上述の＜＜上皮幹細胞、上皮癌細胞、又はそれら細胞を含む組織を培養するための方法＞＞の［細胞外マトリクス調製工程］において例示されたものと同様のものが挙げられる。市販のＥＣＭとしては、上述の＜＜上皮幹細胞、上皮癌細胞、又はそれら細胞を含む組織を培養するための方法＞＞の［細胞外マトリクス調製工程］において例示されたものと同様のものが挙げられる。また、天然ＥＣＭ及び合成ＥＣＭの混合物を用いてもよい。

幹細胞を培養するためにＥＣＭを使用する場合、幹細胞の長期生存及び未分化幹細胞の継続的存在を強化することができる。ＥＣＭの非存在下では、幹細胞培養物を長期間にわたって培養することができず、未分化幹細胞の継続的存在は観察されない。さらに、ＥＣＭが存在すると、ＥＣＭの非存在下では培養することができないオルガノイドを培養することができる。

ＥＣＭは、通常、細胞が懸濁されたディッシュの底に沈んでいる。例えば、ＥＣＭが３７℃で凝固するときに、上述の細胞培養培地を加えて、ＥＣＭの中に拡散させて用いてもよい。培地中の細胞は、ＥＣＭの表面構造と相互作用することによって、例えば、インテグリンと相互作用することによってＥＣＭに固着することができる。

ＥＣＭは培養容器等にコーティングして用いてもよい。ＥＣＭとして、フィブロネクチンを用いる場合、培養容器中にコーティングされる割合は、１μｇ／ｃｍ^２以上２５０μｇ／ｃｍ^２以下であることが好ましく、１μｇ／ｃｍ^２以上１５０μｇ／ｃｍ^２以下であることがより好ましく、８μｇ／ｃｍ^２以上１２５μｇ／ｃｍ^２以下であることがさらに好ましい。

［接着工程］
続いて、上皮幹細胞、又は上皮幹細胞を含む組織を準備する。本実施形態の培養法において用いられる、上皮幹細胞は上述の＜＜細胞培養培地＞＞と同様のものが挙げられる。

上皮組織から幹細胞を単離する方法としては、上述の＜＜上皮幹細胞、上皮癌細胞、又はそれら細胞を含む組織を培養するための方法＞＞の［接着工程］に例示されたものと同様の方法が挙げられる。

上述の方法により単離された上皮幹細胞、又は上皮幹細胞を含む組織を、前記調製工程で得られた細胞マトリクス上に播種し、静置する。播種された細胞は、ＥＣＭの表面構造と相互作用することによって、例えば、インテグリンと相互作用することによってＥＣＭに接着することができる。

［オルガノイド形成工程］
続いて、細胞播種後、細胞が乾かないうちに、上述の無血清培地である細胞培養培地を添加し、培養する。培養温度は３０℃以上４０℃以下が好ましく、３７℃程度がより好ましい。培養時間は用いる細胞によって適宜調整することができる。培養開始からから１〜２週間程度後で、オルガノイドを形成させることができる。また、従来では２〜３ヶ月しか細胞維持培養することができなかった細胞に対し、本実施形態の培養方法では、３ヶ月以上の長期間（好ましくは、１０ヶ月程度）においても、細胞を維持培養することができる。本実施形態の培養方法を用いて、上皮幹細胞を培養した場合は、分化能を維持でき、腫瘍発生頻度を極めて低い状態に抑えることができる。

＜＜オルガノイド＞＞
一実施形態として、本発明は、上述の培養方法により、得られる、オルガノイドを提供する。

本実施形態のオルガノイドは、再生医療、上皮細胞の基礎医学研究、薬物応答のスクリーニング、疾患由来上皮オルガノイドを用いた創薬研究等に応用することができる。

＜用途＞
一実施形態として、本発明は、薬物応答のスクリーニング、毒性アッセイ、又は再生医療のための上述のオルガノイドの使用を提供する。

薬物応答のスクリーニングにおいて、上述のオルガノイドを用いる場合、オルガノイドを例えば９６ウェルプレート又は３８４ウェルプレート等のマルチウェルプレート中で培養する。分子のライブラリを使用して、このオルガノイドに影響を与える分子を同定する。ライブラリとしては、例えば、抗体断片ライブラリ、ペプチドファージディスプレイライブラリ、ペプチドライブラリ（例えばＬＯＰＡＰ（商標）、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社製）、脂質ライブラリ（ＢｉｏＭｏｌ社製）、合成化合物ライブラリ（例えばＬＯＰＡＰ（商標）、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社製）又は天然化合物ライブラリ（Ｓｐｅｃｓ、ＴｉｍＴｅｃ社製）等が挙げられる。さらに、遺伝子ライブラリを用いてもよい。遺伝子ライブラリとしては、例えば、ｃＤＮＡライブラリ、アンチセンスライブラリ、ｓｉＲＮＡ、又はその他の非コードＲＮＡライブラリ等が挙げられる。具体的な方法としては、ある一定の時間にわたり細胞を試験薬剤の複数の濃度に曝露し、曝露時間終了時に、培養物を評価する方法が挙げられる。また、本実施形態のオルガノイドは上皮癌細胞を特異的に標的とするが、正常細胞からなるオルガノイドを標的としない薬物を同定するために使用することもできる。

さらに、本実施形態のオルガノイドは、新規候補薬物又は既知若しくは新規栄養補助食品の毒性アッセイにおいてＣａｃｏ−２細胞等の細胞株の使用に代わるものとなり得る。
さらに、本実施形態のオルガノイドは、現在のところ適切な組織培養又は動物モデルがないノロウイルスなどの病原体を培養するために使用することができる。
また、本実施形態のオルガノイドは、再生医療において、例えば、放射線照射後又は術後の腸上皮の修復において、クローン病及び潰瘍性大腸炎等の炎症性腸疾患に罹患している患者の腸上皮の修復において、又は短腸症候群に罹患している患者の腸上皮の修復において、有用である。さらに、本実施形態のオルガノイドは、小腸／結腸の遺伝性疾患の患者における腸上皮の修復において、有用である。また、本実施形態のオルガノイドは、再生医療において、例えば膵臓切除後の移植片又はその一部として、又はＩ型糖尿病及びＩＩ型糖尿病等の糖尿病の治療のために有用である。

また、一実施形態として、本発明は、移植のための上述のオルガノイドの使用を提供する。

本実施形態の＜＜上皮幹細胞、又は上皮幹細胞を含む組織を培養するための方法＞＞により得られたオルガノイドは、正常な上皮幹細胞からなり、分化能が維持されており、腫瘍発生頻度を極めて低いことから、移植用として好適に用いることができる。

以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

［実施例１］
（１）Ｗｎｔ３ａ−アファミン複合体の調製
Ｗｎｔ３ａ−アファミン複合体は、ウシ胎児血清にウシアファミンが含まれることを利用し、Ｗｎｔ３ａのみを遺伝子導入した細胞を血清含有培地で培養し、分泌されるＷｎｔ３ａがアファミンと自動的に安定な複合体を形成することを利用して調製した。すなわち、Ｎ末端にタグ配列を有するＷｎｔ３ａを発現する細胞（Ｗ−Ｗｎｔ３ａ／ＨＥＫ）を、１０％ウシ胎児血清を含む培地中でディッシュ又は多層フラスコ等で５〜７日間培養し、培養上清を回収した。続いて、回収した培養上清は遠心分離し、フィルター（０．２２μｍ）を通した。集めた培養上清のうち、２２０ｍＬを使用した。続いて、回収した２００ｍＬの培養上清に３ｍＬのＰ２０．１抗体セファロースを加え、４℃で３時間回転混和した後、培地を空のカラムに通して、セファロースを集めた。なお、Ｐ２０．１抗体はＷｎｔ３ａのＮ末端のタグ配列を特異的に認識する抗体である。続いて、カラムに集めたセファロースを３ｍＬのＴｒｉｓ ｂｕｆｆｅｒｄ ｓａｌｉｎｅ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）で洗浄し、洗浄操作を５回繰り返した。続いて、１回あたり３ｍＬのペプチド溶液（０．２ｍｇ／ｍＬ ＰＡＲ４−Ｃ８ ｐｅｐｔｉｄｅ／ＴＢＳ）を用いて溶出を行い、溶出液を回収した。溶出操作を１０回繰り返して、Ｗｎｔ３ａ−アファミン複合体を得た。Ｗｎｔ３ａの活性は、Ｗ−Ｗｎｔ３ａ／ＨＥＫの細胞上清を用いたＴＣＦレポーターアッセイにより確認し、市販のＷｎｔ３ａ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社製）と比較して、１０倍以上の高い活性を有することが確かめられた。

（２）細胞培養培地の調製
市販のＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｃｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製）に、最終濃度１μｇ／ｍＬとなるようにヒト組換えＲ−スポンジン１（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を添加し、最終濃度１００ｎｇ／ｍＬとなるようにノギン（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）を添加し、最終濃度５００ｎＭとなるようにＡ８３−０１（Ｔｏｃｒｉｓ社製）を添加し、最終濃度５０ｎｇ／ｍＬとなるようにＥＧＦ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｃｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製）を添加し、更に最終濃度１０μＭとなるようにＳＢ２０２１９０（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を添加した（ＥＮＲＡＳ培地）。さらに、最終濃度３００ｎｇ／ｍＬ又は１，０００ｎｇ／ｍＬとなるように（１）で調製したＷｎｔ３ａ−アファミン複合体（以下、「ｒＷｎｔ」と呼ぶ。）、又は最終濃度３００ｎｇ／ｍＬとなるように市販のＷｎｔ３ａ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社製）（以下、「Ｒ＆Ｄ」と呼ぶ。）を添加した培地を用意した。さらに、コントロールとして、Ｗｎｔ３ａを含まない培地（以下、「Ｗｎｔ（−）」と呼ぶ。）、及びＷｎｔ３ａの最終濃度３００ｎｇ／ｍＬとなるように血清含有培地で培養したＷ−Ｗｎｔ３ａ／ＨＥＫ由来の培養上清を添加した培地（以下、「Ｗｎｔ ＣＭ」と呼ぶ。）を用意した。

（３）腸管幹細胞の培養
慶應義塾大学医学部倫理委員会で承認された倫理研究計画にも基づき、説明と同意を得られた大腸腫瘍患者より、大腸腫瘍から少なくとも５ｃｍ以上離れた部分を正常粘膜として採取し、また，大腸腫瘍より大腸癌組織を採取した。採取した組織はＥＤＴＡ又はリベラーゼＴＨにより上皮細胞を抽出し、マトリゲル（登録商標）に包埋した。
上皮細胞（以下、「腸管幹細胞」と呼ぶ。）を含むマトリゲル（登録商標）は２４、４８、又は９６ウェルプレートに播種し、培地とともに培養した。具体的には、下記の通りである。
培養した腸管幹細胞を、１０μＬのマトリゲル（登録商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）と共に、９６ウェルプレートに播種した。（２）で調製した６種類の培地（ｒＷｎｔ ３００ｎｇ／ｍＬ、ｒＷｎｔ １０００ｎｇ／ｍＬ、Ｒ＆Ｄ ３００ｎｇ／ｍＬ、Ｗｎｔ ＣＭ及びＷｎｔ（−））を各ウェルに１００μＬずつ添加し、３７℃で培養した。培養から、２日毎に培地交換を行った。図１（Ａ）は、初代培養（Ｐａｓｓａｇｅ０）の培養開始から６日後の様子を示す画像であり、図２（Ａ）は１回目の継代（Ｐａｓｓａｇｅ１）の培養開始から６日後の様子を示す画像であり、図３（Ａ）は２回目の継代（Ｐａｓｓａｇｅ２）の培養開始から５日後の様子を示す画像である。図１（Ｂ）、図２（Ｂ）、及び図３（Ｂ）は、各培地中の腸管幹細胞のオルガノイドがウェル中に占める面積を定量化したグラフである。

図１〜３から、Ｗｎｔ３ａ−アファミン複合体を含む培地では、腸管幹細胞を長期間、継代培養することができることが確認された。また、データは示さないが、Ｗｎｔ３ａ−アファミン複合体を含む培地では、腸管幹細胞を４か月の期間にわたり、１８以上の継代培養を行うことができた。

［実施例２］
（１）細胞培養培地の調製
市販のＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｃｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製）に、最終濃度５０ｎｇ／ｍＬとなるようにＥＧＦ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｃｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製）を添加し、最終濃度１００ｎｇ／ｍＬとなるようにノギン（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）を添加し、最終濃度５００ｎＭとなるようにＡ８３−０１（Ｔｏｃｒｉｓ社製）を添加した（以下、「ＥＮＡ培地」と呼ぶ。）。
また、市販のＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｃｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製）に、最終濃度５０ｎｇ／ｍＬとなるようにＥＧＦ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｃｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製）を添加し、最終濃度１００ｎｇ／ｍＬとなるようにノギン（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）を添加し、最終濃度５００ｎＭとなるようにＡ８３−０１（Ｔｏｃｒｉｓ社製）を添加し、最終濃度１０μＭとなるようにＳＢ２０２１９０（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を添加した（以下、「ＥＮＡＳ培地」と呼ぶ。）。
ＥＮＡＳ培地に、それぞれに最終濃度３００ｎｇ／ｍＬとなるように市販のＷｎｔ３ａ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を添加して、従来の方法で用いられる培地を調製した。
さらに、ＥＮＡ培地及びＥＮＡＳ培地に、最終濃度３００ｎｇ／ｍＬとなるように実施例１の（１）で調製したＷｎｔ３ａ−アファミン複合体を添加して、本発明の細胞培養培地を調製した。なお、コントロールとして、Ｗｎｔ３ａ−アファミン複合体を含まないＥＮＡ培地及びＥＮＡＳ培地も用意した。

（２）大腸癌由来の上皮癌細胞の培養
実施例１の（３）と同様の方法を用いて、ヒト腫瘍組織由来の上皮癌細胞を含む大腸を、リベラーゼＴＨを用いて、上皮癌細胞と残りの組織とに分けた。残りの組織については、トリプシンでさらにバラバラに分解した。続いて、上皮癌細胞、又は上皮細胞及びバラバラに分解した残りの組織を、１０μＬのマトリゲル（登録商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）と共に、９６ウェルプレートに播種した。上皮癌細胞を播種したウェルに、（２）で調製した市販のＷｎｔ３ａを含むＥＮＡＳ培地（従来の方法で用いられる培地）を１００μＬ添加した。また、上皮細胞及びバラバラに分解した残りの組織を播種したウェルに、（２）で調製したＷｎｔ３ａ−アファミン複合体を添加したＥＮＡ培地及びＥＮＡＳ培地、Ｗｎｔ３ａを含まないＥＮＡ培地及びＥＮＡＳ培地をそれぞれ１００μＬずつ添加した。

続いて、市販のＷｎｔ３ａを含むＥＮＡＳ培地（従来の方法で用いられる培地）を添加した上皮癌細胞、（２）で調製したＷｎｔ３ａ−アファミン複合体を添加したＥＮＡ培地及びＥＮＡＳ培地を添加した上皮癌細胞で培養した。

結果、市販のＷｎｔ３ａを含むＥＮＡＳ培地（従来の方法で用いられる培地）を添加した上皮癌細胞では、大腸癌オルガノイドの樹立効率が６７．５％であったのに対して、（２）で調製したＷｎｔ３ａ−アファミン複合体を添加したＥＮＡ培地及びＥＮＡＳ培地では、大腸癌オルガノイドの樹立効率が１００．０％であった。

以上のことから、本発明の細胞培養培地は、大腸癌由来の上皮癌細胞において、高効率でオルガノイドを形成させることができることが明らかとなった。

［実施例３］
（１）細胞培養培地の調製
まず、実施例２の（１）と同様の方法を用いて、最終濃度３００ｎｇ／ｍＬとなるように実施例１の（１）で調製したＷｎｔ３ａ−アファミン複合体と最終濃度１μｇ／ｍＬとなるようにヒト組換えＲ−スポンジン１（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社製）とを添加したＥＮＲＡＳ＋Ｗｎｔ３ａ−ＡＦＭ培地を調製した。

（２）ＮＯＧマウスからの正常上皮幹細胞の剥離
まず、先端にバルーンを貼付したゾンデを作製した（参考文献：Ｆｕｋｕｄａｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２８，１７５２−１７５７，２０１４）。次いで、超免疫不全マウスであるＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄ−ＩＬ２Ｒγ^ｎｕｌｌマウス（ＮＯＧマウス）に対し、吸引麻酔下で、マウス肛門からゾンデを１〜２ｃｍ挿入し、バルーンを膨らませることで直腸の口側をクランプした。次いで、肛門との間にできた腸管管腔に加温したＥＤＴＡを注入して（図４の上左側の図参照）、２〜３分間かけて管腔を閉鎖した。次いで、バルーンを抜去し、ブラシを用いて直腸上皮の片側を擦過することで、ＥＤＴＡにより剥離しやすくなった上皮を、陰窩底部を含めて剥脱した（図４の上右側の図及び下左右の図参照）。

（３）上皮幹細胞の培養
次いで、（１）で調製したＥＮＲＡＳ＋Ｗｎｔ３ａ−ＡＦＭ培地を用いて、ヒト上皮幹細胞を培養し、ヒト大腸オルガノイドを作製し、さらに３〜４日間培養し、ヒト大腸オルガノイドを増殖させた。

（４）ＮＯＧマウスへのヒト大腸オルガノイドの移植
次いで、約１０^６〜１０^８の細胞を５０〜２００μＬの５〜２０％マトリゲルを含むＰＢＳに懸濁した。次いで、粘膜剥脱したＮＯＧマウスの肛門から、１匹当たり約１０^６〜１０^８の細胞を含む懸濁液を注腸し、肛門を一時閉鎖した（図５の左側の図参照。）。なお、ヒト大腸オルガノイドは、予めＧＦＰ標識しておいた。移植から２週間後、及び１６週間後のＮＯＧマウスの移植部位を内視鏡を用いて明視野及び蛍光モードにて観察した。結果を図５に示す。

図５から、移植部位においてＧＦＰの蛍光が観察された。これにより、事前にヒト大腸オルガノイドをＧＦＰ標識しておくことにより、生着後の経時的な観察を行うことができることが確かめられた。また、図示していないが、少なくとも半年以上にわたる長期生着が認められた。

また、移植後２８日後のＮＯＧマウスを用いて、移植部位を切り出し、病理組織観察した。結果を図６に示す。図６において、上の図は、組織切片をヘマトキシリン−エオジン（Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ−Ｅｏｓｉｎ；ＨＥ）染色した結果を示す画像である。下の左側の図は、組織切片を、抗ヒトサイトケラチン抗体を用いた免疫染色及びヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）（登録商標）を用いた核染色を行った結果を示す画像である。下の右側の図は、組織切片をｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション分析によるＬｇｒ５の検出及びヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）（登録商標）を用いた核染色を行った結果を示す画像である。

図６から、ＨＥ染色により、マウス陰窩と比較して、ヒト大腸オルガノイドが生着し形成した陰窩は、一回り大きな陰窩として識別された。また、ヒト大腸オルガノイドが生着し形成した陰窩がヒト細胞によるものであることは、抗ヒトサイトケラチン抗体を用いた免疫染色によって、確かめられた。
さらに、ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション分析によるＬｇｒ５の検出結果から、移植したヒト大腸オルガノイドが生着し形成した陰窩底部には、腸管幹細胞マーカーであるＬｇｒ５が発現しており、マウスの間質にサポートされながら、ヒトの腸管上皮幹細胞（オルガノイド）が機能し、長期生着し得ることが明らかとなった。

以上の結果から、本発明のオルガノイドを移植された動物モデルは、再生医療、上皮細胞の基礎医学研究、薬物応答のスクリーニング、疾患由来上皮オルガノイドを用いた創薬研究等に応用できることが示唆された。

本発明の細胞培養培地によれば、ヒトを含む哺乳動物由来の上皮幹細胞、上皮癌細胞、若しくはそれら細胞のうち少なくともいずれか一方を含む組織、又は従来では培養することができなかった組織を長期間培養することができる。また、前記細胞及び前記組織のうち少なくともいずれか一方から高効率でオルガノイドを形成させることができる。また、本発明の細胞培養培地を用いて培養された上皮幹細胞は、長期間分化能を維持することができ、腫瘍発生頻度が極めて低い。さらに、本発明の培養方法により得られたオルガノイドは、再生医療、上皮細胞の基礎医学研究、薬物応答のスクリーニング、疾患由来上皮オルガノイドを用いた創薬研究等に応用することができる。

Claims (12)

1. Ｗｎｔタンパク質とその安定化物質アファミンとの複合体及びＲ−スポンジン（Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ）からなるＷｎｔアゴニストと、
   分裂促進増殖因子、骨形成因子（ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ；ＢＭＰ）阻害剤、形質転換増殖因子−β（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−β；ＴＧＦ−β）阻害剤、及びｐ３８阻害剤からなる群から選ばれる少なくとも一種と、
   を含むことを特徴とする細胞培養培地。
2. 前記Ｗｎｔタンパク質が、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ９ｂ、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１、及びＷｎｔ１６からなる群から選ばれる少なくとも一種である請求項１に記載の細胞培養培地。
3. 前記Ｒ−スポンジンがＲ−スポンジン１、Ｒ−スポンジン２、Ｒ−スポンジン３、及びＲ−スポンジン４からなる群から選ばれる少なくとも一種である請求項１又は２に記載の細胞培養培地。
4. 前記分裂促進増殖因子が上皮増殖因子（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ；ＥＧＦ）である請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞培養培地。
5. 前記ＢＭＰ阻害剤がノギン（Ｎｏｇｇｉｎ）である請求項１〜４のいずれか一項に記載の細胞培養培地。
6. 前記ＴＧＦ−β阻害剤がＡ８３−０１である請求項１〜５のいずれか一項に記載の細胞培養培地。
7. 無血清培地である請求項１〜６のいずれか一項に記載の細胞培養培地。
8. 上皮幹細胞、上皮癌細胞、又はそれら細胞のうち少なくともいずれか一方を含む組織の培養方法であって、
   細胞外マトリクスを調製する細胞外マトリクス調製工程と、
   前記細胞外マトリクス上に上皮幹細胞、上皮癌細胞、又はそれら細胞のうち少なくともいずれか一方を含む組織を接着させる接着工程と、
   前記接着工程後に、請求項１〜７のいずれか一項に記載の細胞培養培地を添加し、前記上皮幹細胞、前記上皮癌細胞、又は前記それら細胞のうち少なくともいずれか一方を含む組織を培養し、オルガノイドを形成させるオルガノイド形成工程と、を備えることを特徴とする培養方法。
9. 上皮幹細胞、又は上皮幹細胞を含む組織の培養方法であって、
   細胞外マトリクスを調製する細胞外マトリクス調製工程と、
   前記細胞外マトリクス上に上皮幹細胞、又は上皮幹細胞を含む組織を接着させる接着工程と、
   前記接着工程後に、請求項７に記載の細胞培養培地を添加し、前記上皮幹細胞、又は前記上皮幹細胞を含む組織を培養し、オルガノイドを形成させるオルガノイド形成工程と、を備えることを特徴とする培養方法。
10. 請求項８又は９に記載の培養方法により、得られることを特徴とするオルガノイド。
11. 再生医療用である、請求項１０に記載のオルガノイド。
12. 請求項９に記載の培養方法により得られ、移植用であることを特徴とするオルガノイド。