CN107794223A - 细胞共培养装置及模拟体内厌氧菌与需氧细胞相互作用的体外研究模型及方法 - Google Patents

细胞共培养装置及模拟体内厌氧菌与需氧细胞相互作用的体外研究模型及方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种细胞共培养装置及模拟体内厌氧菌与需氧细胞相互作用的体外研究模型及方法。该细胞共培养装置的第一培养容器内设有用于盛放除氧剂的除氧腔室，除氧腔室与第一培养容器的第一培养腔连通。该细胞共培养装置及模拟体内厌氧菌与需氧细胞相互作用的体外研究模型和方法，可以在体外模拟体内真实环境，用于厌氧细菌与其他细胞的相互作用研究，如可以用于厌氧细菌与其定植处细胞及体内其他系统的相互作用研究。该细胞共培养装置可实现对共培养系统中各成分的精确控制，从细胞水平乃至分子水平对共培养系统的基因组、蛋白质组、代谢组等进行精确分析，为体内厌氧菌群、药物等的临床研究提供可靠的验证方法。

Description

细胞共培养装置及模拟体内厌氧菌与需氧细胞相互作用的体 外研究模型及方法
技术领域
本发明涉及细胞生物学研究领域，尤其是涉及一种用于厌氧细菌与需氧细胞相互作用研究的细胞共培养装置及模拟体内厌氧菌与需氧细胞相互作用的体外研究模型及方法。
背景技术
人体内存在大量的厌氧菌群，包括肠道菌群、阴道菌群、口腔菌群等。厌氧菌群对人体的微生态的平衡具有重要作用。其中，肠道菌群中微生物数量达到1012～1014个，是人体自身细胞数目的10倍，其所包含的基因数目是人体自身基因数目的100倍。肠道菌群与宿主之间具有信息交流，能够消耗、贮藏和重新分配能量；调控具有代谢重要性的化学转换过程；能够通过自身复制来维持和修复自身，具有人体自身不具备的代谢功能。目前研究发现，健康肠道菌群移植不但可以治疗肠道、肝脏等消化系统疾病，同时还对人体的免疫系统、神经系统、心血管系统等具有重大影响。肠道菌群紊乱会造成各系统疾病。同样，阴道菌群的紊乱也容易引起多种妇科疾病，并且还易诱发早产；口腔菌群紊乱除了会引起牙龈炎等疾病外，还与心血管疾病以及结肠癌有直接关系。
目前对厌氧菌群的研究除了其厌氧培养条件、无菌动物模型等限制，同时还存在很多问题，使得厌氧菌与体内相互作用的研究受到限制而无法开展。以肠道菌群为例，针对肠道菌群对体内的影响研究一般以无菌动物为研究模型。然而，无菌动物从获得到饲养均需要较高的实验室条件费用昂贵，同时，研究只能从动物整体水平至组织水平进行，无法进行更细致的研究；且动物个体的差异较大，不同动物个体会影响实验结果，导致对肠道菌群的研究进展缓慢。
肠道菌群为厌氧菌或兼性厌氧菌，需要特定的厌氧培养环境。然而肠道上皮细胞尽管可以和肠道菌群处于相同的厌氧环境，但其在体内有血液供氧，因此其是需氧的培养条件。由于对氧气需求的不同，目前尚无模拟体内环境的体外模型建立，导致两者的相互作用的研究长期处在模糊状态，无法实现精确的实验设计及研究。其次，厌氧菌群不但对其所处部位有影响，同时还对身体各个系统均有影响，而其对其他系统的所有影响均为厌氧菌群与其所处部位细胞相互作用后发生的，目前亦无合适的体外模型、方法研究厌氧菌群与其所处部位细胞相互作用后对体内其他系统的影响。
发明内容
基于此，有必要提供一种能够用于研究厌氧细菌与需氧细胞相互作用以及研究该相互作用对其他系统影响的细胞共培养装置及模拟体内厌氧菌与需氧细胞相互作用的体外研究模型及方法。
一种细胞共培养装置，包括第一培养容器和第二培养容器；
所述第一培养容器具有第一培养腔，所述第一培养容器还具有与所述第一培养腔直接连通的第一加样口，该第一加样口处设有用于密封该第一加样口的第一密封塞，所述第一培养容器的底部设有与所述第一培养腔连通的开口且该开口由多孔滤膜封住，所述第一培养容器内设有用于盛放除氧剂的除氧腔室，所述除氧腔室具有第二加样口，该第二加样口处设有用于密封该第二加样口的第二密封塞，所述除氧腔室与所述第一培养腔连通；
所述第二培养容器具有第二培养腔，所述第二培养容器还具有所述第二培养腔连通的开口，所述第一培养容器的底部能够从该开口伸入至所述第二培养腔中，且当所述第一培养容器伸入至所述第二培养容器中后，所述第一培养容器能够架在所述第二培养容器上并使所述第一培养容器的底部与所述第二培养容器的底部之间具有间隙。
一种模拟体内厌氧菌与需氧细胞相互作用的体外研究方法，其使用上述细胞共培养装置，所述体外研究方法包括如下步骤：
在所述第一培养容器的第一培养腔内接种第一需氧细胞，所述第一需氧细胞在所述多孔滤膜上贴壁生长，保持所述第一密封塞为打开状态，进行有氧培养；
在所述第二培养容器的第二培养腔内接种第二需氧细胞，进行有氧培养；
待所述第一需氧细胞培养至所需状态时，在所述除氧腔室内添加除氧剂，并塞上所述第二密封塞，经由第一加样口吸弃所述第一需氧细胞的培养基，清洗后注入厌氧培养基，并塞上所述第一密封塞，待所述厌氧培养基中的氧含量指示剂显示所述第一培养腔内无氧气时，在所述第一培养腔内经由所述第一密封塞注入厌氧细菌，并将所述第一培养容器架在第二培养容器上，进行共培养。
在其中一个实施例中，所述第一需氧细胞为肠道上皮细胞，所述厌氧细菌为肠道菌群细菌；或
所述第一需氧细胞为阴道上皮细胞，所述厌氧细菌为阴道菌群细菌；或
所述第一需氧细胞为牙周细胞或口腔上皮细胞，所述厌氧细菌为口腔菌群细菌。
在其中一个实施例中，所述第二需氧细胞为免疫系统的细胞、消化系统的细胞、神经系统的细胞或心血管系统的细胞。
在其中一个实施例中，所述除氧剂是焦没食子酸与强碱、或者是柠檬酸盐与碳酸氢盐、或者是硼氢化钠、水与钯触媒。
在其中一个实施例中，所述在所述除氧腔室内添加除氧剂包括如下步骤：先打开所述第二密封塞，加入所述除氧剂中的部分成分，再闭上所述第二密封塞，后续在所述厌氧培养基注入完后，经由所述第二密封塞注入所述除氧剂的余下成分。
在其中一个实施例中，所述氧含量指示剂为亚甲基美兰或刃天青。
在其中一个实施例中，所述第二培养容器的底部包被有多聚氨基酸。
在其中一个实施例中，所述多聚氨基酸为多聚赖氨酸。
一种模拟体内厌氧菌与需氧细胞相互作用的体外研究模型，其采用上述任一实施例所述的模拟体内厌氧菌与需氧细胞相互作用的体外研究方法构建得到。
上述细胞共培养装置及模拟体内厌氧菌与需氧细胞相互作用的体外研究模型和方法，可以在体外模拟体内真实环境，用于厌氧细菌与其他细胞的相互作用研究，如可以用于厌氧细菌与其定植处细胞及体内其他系统的相互作用研究。该细胞共培养装置可实现对共培养系统中各成分的精确控制，从细胞水平乃至分子水平对共培养系统的基因组、蛋白质组、代谢组等进行精确分析，为体内厌氧菌群、药物等临床研究提供可靠的验证方法。
附图说明
图1为一实施方式的细胞共培养装置的结构示意图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
需要说明的是，当元件被称为“固定于”另一个元件，它可以直接在另一个元件上或者也可以存在居中的元件。当一个元件被认为是“连接”另一个元件，它可以是直接连接到另一个元件或者可能同时存在居中元件。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
如图1所示，一实施方式的细胞共培养装置10包括第一培养容器100和第二培养容器200。
第一培养容器100具有第一培养腔102。第一培养容器100还具有与第一培养腔102直接连通的第一加样口(图中未标示)。该第一加样口处设有用于密封该第一加样口的第一密封塞110。第一培养容器100的底部设有与第一培养腔102连通的开口且该开口由多孔滤膜120封住。第一培养容器100内设有用于盛放除氧剂的除氧腔室104。除氧腔室104具有第二加样口(图中未标示)。该第二加样口处设有用于密封该第二加样口的第二密封塞130。除氧腔室104与第一培养腔102连通。
第二培养容器200具有第二培养腔202。第二培养容器200还具有第二培养腔连通的开口204。第一培养容器100的底部能够从该开口伸入至第二培养腔202中。当第一培养容器100伸入至第二培养容器200中后，第一培养容器100能够架在第二培养容器200上并使第一培养容器100的底部与第二培养容器200的底部之间具有间隙。
在图示所示实施例中，第一培养容器100为圆台体结构，且顶部为底面积较大的一端，底部为底面积较小的一端，设有多孔滤膜120。具体的，在一个实施例中，该圆台体结构的顶部直径为16mm，底部内径为8mm，高度为15mm。第二培养容器为圆柱体结构，如内径是16mm的圆柱体，高度15mm。
在一个实施例中，第一培养容器100的外壁上设有用于支撑在第二培养容器200的开口端的支撑柱140。支撑柱140有多个，如2个、3个或4个等，多个支撑柱140均匀分布在第一培养容器100的外壁上。在图示所示实施例中，四个支撑柱位于第一培养容器100的靠近上方的位置，具体是距离顶部6mm处。第一培养容器100通过支撑柱140架在第二培养容器200的上方，第一培养容器100的外周壁与第二培养容器200之间有间隙，从而不会形成密封，可使空气或氧气等进入第二培养容器200中。在其他实施例中，第一培养容器100也可以通过其他方式架在第二培养容器200中，不限于上面所述。
在图示所示实施例中，第一加样口和第二加样口均位于第一培养容器100的顶部，不易造成污染，加样方便。在其他实施例中，第一加样口和第二加样口的设置位置不限于位于第一培养容器100的顶部，第一加样口与第二加样口可以其中之一或者都位于第一培养容器100的顶部。
除氧腔室104可以是但不限于圆柱体形状，如在图示所示实施例中，除氧腔室104是一个内径为6mm、高度5mm的圆柱体结构。在一个实施例中，除氧腔室104的腔壁上具有气孔(图未示)。除氧腔室104通过气孔与第一培养腔102连通。气孔的孔径优选但不限于2mm，气孔的数量如可以是4个，4个气孔围绕除氧腔室104均匀分布。进一步，在一个实施例中，气孔靠近第二密封塞130设置。除氧腔室104内可以预装除氧剂的一部分，如可以预装焦没食子酸等，在需要除氧时，通过第二密封塞130注入如氢氧化钠、氢氧化钾等强碱溶液反应即可。
在一个实施例中，第一密封塞110与第二密封塞130为橡胶塞。为保证密封性能，在针穿刺后，可以在针刺位置贴上贴纸，以封闭注射孔。
在一个实施例中，多孔滤膜120的滤孔孔径为0.4μm。多孔滤膜120可以是但不限于半透明的PC膜或PE膜等。
进一步，在一个实施例中，多个第二培养容器200可以集成在一起构成多孔板结构，以便于实验对比和同步操作。
本文所述厌氧细菌可以是健康人或病人(如各类消化道疾病患者、各类癌症患者、各类神经系统疾病患者或各类免疫系统疾病患者等)、或动物(如实验、畜牧、养殖、野生的各种动物，如小鼠、大鼠、兔、狗、猴、牛、羊、鸡、鸭、鹅、鱼、虾、树等)的肠道菌群细菌、阴道菌群细菌(如有)、口腔菌群细菌(如有)等。所培养的厌氧细菌可以是单一的细菌，也可以是混合的细菌等。
本文所述的第一需氧细胞优选是但不限于厌氧细菌的定植处细胞，如肠道菌群细菌对应的第一需氧细胞是肠道上皮细胞。第一需氧细胞可以是正常细胞，也可以是病变细胞。第一需氧细胞的供体及供体的状态同上述厌氧细菌的供体。
本文所述的第二需氧细胞可以是各类细胞，如消化系统、神经系统、心血管系统、免疫系统等各类系统的细胞，具体的，如用于研究免疫系统的外周血单个核细胞，用于研究神经系统的神经细胞等。第二需氧细胞可以是正常细胞，也可以是病变细胞。第二需氧细胞的供体及供体的状态同上述厌氧细菌的供体。
上述细胞共培养装置10可以用于厌氧细菌与多种细胞之间相互作用的研究，如可以先在第一培养腔102内的多孔滤膜120上接种第一需氧细胞，在第二培养容器200内培养第二需氧细胞，在第一需氧细胞培养至所需的状态(合适的密度和形态，如肠道上皮细胞分化为肠道上皮样状态)后，对第一培养容器100进行除氧操作，具体的可以是在除氧腔室104内添加除氧剂，并密封第一密封塞110和第二密封塞130，通过注射针等注射装置向第一培养腔102内注液或吸液，在厌氧培养基中的氧含量指示剂指示第一培养腔102内无氧气时，通过注射装置接种厌氧细菌。最后，将接种有厌氧细菌且多孔滤膜120上贴壁生长有第一需氧细胞的第一培养容器100架在第二培养容器200上进行共培养。
在第二培养容器200培养第二需氧细胞之前，可以先对第二培养容器200的底部进行包被修饰，如使用多聚赖氨酸等多聚氨基酸进行包被，以培养各种需氧细胞，如外周血单个细胞PBMC，以研究肠道菌群等厌氧细菌对于免疫细胞的影响；培养各种肿瘤细胞，以研究厌氧细菌对各系统肿瘤的影响；培养神经细胞，以研究厌氧细菌对神经系统的影响等。
本实施方式还提供了一种模拟体内厌氧菌与需氧细胞相互作用的体外研究方法，其使用上述细胞共培养装置，具体包括如下步骤：
在第一培养容器的第一培养腔内接种第一需氧细胞，第一需氧细胞在多孔滤膜上贴壁生长，保持第一密封塞为打开状态，进行有氧培养；
在第二培养容器的第二培养腔内接种第二需氧细胞，进行有氧培养；
待第一需氧细胞培养至所需状态时，在除氧腔室内添加除氧剂，并塞上第二密封塞，经由第一加样口吸弃第一需氧细胞的培养基，清洗后注入厌氧培养基，并塞上第一密封塞，待厌氧培养基中的氧含量指示剂显示第一培养腔内无氧气时，在第一培养腔内经由第一密封塞注入厌氧细菌，并将第一培养容器架在第二培养容器上，进行共培养。
第一需氧细胞、厌氧细菌及第二需氧细胞如上面所述，如在一个实施例中，第一需氧细胞为肠道上皮细胞，厌氧细菌为肠道菌群细菌，或第一需氧细胞为阴道上皮细胞，厌氧细菌为阴道菌群细菌，或第一需氧细胞为牙周细胞或口腔上皮细胞，厌氧细菌为口腔菌群细菌；相应地的，第二需氧细胞为免疫系统的细胞、消化系统的细胞、神经系统的细胞或心血管系统的细胞。
除氧剂可以是但不限于焦没食子酸与强碱、或者是柠檬酸盐与碳酸氢盐、或者是硼氢化钠、水与钯触媒。在一个实施例中，在除氧腔室内添加除氧剂包括如下步骤：先打开第二密封塞，加入除氧剂中的部分成分，再闭上第二密封塞，后续在厌氧培养基注入完后，经由第二密封塞注入除氧剂的余下成分。
氧含量指示剂为亚甲基美兰或刃天青。
在一个实施例中，第二培养容器的底部包被有多聚氨基酸。进一步，在其中一个实施例中，该多聚氨基酸为多聚赖氨酸。
此外，本实施方式还提供了一种模拟体内厌氧菌与需氧细胞相互作用的体外研究模型，其采用上述任一实施例的模拟体内厌氧菌与需氧细胞相互作用的体外研究方法构建得到。
以下为实施例部分
实施例1溃疡性结肠炎病人肠道菌群对免疫系统的影响研究
1.肠道上皮细胞的3D培养
培养基：DMEM高糖培养基，10％胎牛血清，10mM HEPES，1％非必需氨基酸，2mM L-谷氨酰胺。
将Caco-2细胞用PBS洗两次，加入1ml 0.25％含EDTA胰酶，消化2min，加入含血清培养基1ml，吹打制成单细胞悬液。1000rpm离心5min，弃上清，加入1ml培养基，细胞计数板计数。每孔接种2×105个细胞至第一培养容器中，隔天换液，置于37℃，5％CO2培养箱培养21天至分化状态。
TEER测定单层细胞的跨膜电阻值。测定方法：首先将电极放入预热至37℃的HBSS中，平衡20分钟；移走培养板中的培养基，加入预热的HBSS，在AP侧每孔加0.5ml，BL侧每孔加1.5ml，37℃平衡20分钟，同时洗去细胞表面的杂质；移走HBSS，重新加入预热的HBSS，测定跨膜电阻值；用1个空白载体重复上述步骤以获得空白值；TEER＝(测定电阻值-空白值)单层表面积(cm2)。Caco-2细胞单层在12天后TEER值达到最大值，21天后细胞分化完成，形成紧密单层，TEER为(450±15)Ω·cm2>350Ω·cm2。
2.人外周血单核细胞的分离与培养
细胞培养基配置：RPMI 1640、10％胎牛血清、1％双抗。
细胞冻存液：胎牛血清、10％DMSO。
将10ml全血转入50ml离心管中，加入10ml PBS溶液稀释，轻轻混匀。取两支15ml离心管，先加入5ml淋巴细胞分离液。然后将稀释的血液轻轻加到两支离心管的淋巴细胞分离液上层，2,000rpm，20min离心。轻轻将PBMC所在的白色细胞层吸出至另一干净的15ml离心管中。加入PBS至10-15ml，1,500rpm，10min离心后去掉上清，再加入10～15ml培养基，1,500rpm离心10min，弃上清，加入5～10ml培养基重悬细胞。细胞计数板计数，第二培养容器中每孔接种106个PBMC，37℃，5％CO2培养箱培养。剩余细胞加入细胞冻存液冻存。
3.厌氧培养基的配置
GAM肉汤液体培养基：大豆胨3g，口胨10g，消化血清粉13.5g，酵母浸膏5g，牛肉膏2.2k，牛肝膏1.2g，葡萄糖3g，KH2PO42.5g，可溶性淀粉5g，L-半胱胺酸盐0.3g，硫乙醇酸钠0.3g，肉汤1000ml，调pH 7.2-7.4，115℃高压灭菌15分钟，室温冷却备用。培养基中还原剂硫乙醇酸钠也可以是L-盐酸半胱氨酸、葡萄糖、抗坏血酸等还原剂。
指示剂：0.015％美兰溶液/0.001％刃天青溶液。
GAM肉汤固体培养基：琼脂2g/L，GAM肉汤液体培养基1L，115℃高压灭菌15分钟。
厌氧培养基不限于GAM肉汤培养基，还可以是TGC、AC肉汤等其他厌氧培养基、针对某种厌氧菌的特殊培养基等。
4.第一培养容器的预处理
称取除氧剂焦没食子酸0.1g置于除氧腔室中，盖好第二密封塞。用注射器注入0.1ml 10％NaOH至除氧剂上。用贴纸将注射针孔密封。
除氧还可以使用柠檬酸钠与碳酸氢钠反应生成二氧化碳以及硼氢化钠在有水环境中经钯触媒的作用，与氧气反应生成水，从而达到厌氧环境。
5.肠道菌群的制备
用于重悬肠道菌群的PBS经过高温煮沸并冷却至室温备用，另加入0.3g L-半胱氨酸/1L。
取病人及健康人的新鲜粪便1g，加入1ml PBS剧烈震荡10min，离心3000rpm，5min。弃上清，再加入1mlPBS重悬后，用200目细胞筛过滤去除食物残渣等杂质，3000rpm离心5min，弃上清，最后加入200μl厌氧培养基重悬。吸弃第一培养容器上层Caco-2细胞培养基，并用PBS洗两次，吸除PBS。菌液由第一加样口注射入第一培养容器的上层。
将第一培养容器置入第二培养容器中，并盖好上盖，于37℃5％CO2培养箱中培养。
6.肠道菌群多样性及丰度检测
收集溃疡性结肠炎病人及健康人群粪便标本及不同培养时间点的菌群悬液，采用高通量测序的方法对菌群16s rDNA V3-V4保守区进行测序，应用PCR-DGGE技术建立DGGE指纹图谱；对图谱中特异性和优势序列进行测序，应用Blast、ClustalX 2.0.11和MEGA 3.1进行序列比对和系统进化分析。
7.Caco-2细胞屏障功能研究
将共培养时间分为0、6、12、24、48、72h。
直接检测细胞屏障完整性。
TEER测定每个时间点的电阻值，用以分析肠道菌群对细胞屏障的通透性的影响(方法见1.肠道上皮细胞培养)。
免疫荧光方法检测细胞间连接蛋白Occludin蛋白。
1)将长有Caco-2细胞的上层培养装置的膜剪下，放在24孔板中，PBS洗三遍。
2)4％冷的多聚甲醛固定20分钟，PBS洗三遍。
3)0.2％Triton X－100通透10分钟，PBS洗三遍。
4)10％山羊血清封闭30分钟，PBS洗三遍。
5)Occludin蛋白鼠抗人一抗4度孵育过夜，PBS洗三遍。
6)羊抗鼠FITC荧光二抗37℃孵育2小时(避光)，PBS洗三遍。
7)1ug/ml DAPI染色5秒，PBS洗三遍，甘油封片，荧光显微镜拍照。
间接检测细胞屏障的完整性。
取培养装置第二层细胞培养液，采用市售试剂盒进行LPS、D-乳酸、二胺氧化酶含量的检测，间接分析细胞屏障的完整性。
8.肠道菌群对免疫细胞分泌细胞因子的影响研究
采用ELISA的方法，对促炎细胞因子肿瘤坏死因子-A、干扰素-C、白细胞介素(IL)-2、IL-6及IL-17、IL-23以及抗炎细胞因子IL-4、IL-10、IL-13、转化生长因子-B等水平进行检测，分析肠道菌群通过与肠道细胞的相互作用对细胞因子分泌量的影响。
9.肠道菌群对淋巴细胞的影响研究
对淋巴细胞进行双染色，采用流式细胞术分析T、B、NK细胞的绝对值及比值，从而研究肠道菌群通过与肠道细胞的相互作用对淋巴细胞的影响。
10.转录组分析。
采用二代测序方法，分析肠道菌群对肠道细胞以及肠道菌群通过与肠道细胞的相互作用淋巴细胞的转录组进行测序分析。
实施例2癫痫病人肠道菌群对神经系统影响研究
1.肠道上皮细胞的3D培养
培养基：DMEM高糖培养基，10％胎牛血清，10mM HEPES，1％非必需氨基酸，2mM L-谷氨酰胺。
将Caco-2细胞用PBS洗两次，加入1ml 0.25％含EDTA胰酶，消化2min，加入含血清培养基1ml，吹打制成单细胞悬液。1000rpm离心5min，弃上清，加入1ml培养基，细胞计数板计数。每孔接种2×105个细胞至第一培养容器中，隔天换液，置于37℃，5％CO2培养箱培养21天至分化状态。
TEER测定单层细胞的跨膜电阻值。测定方法：首先将电极放入预热至37℃的HBSS中，平衡20分钟；移走培养板中的培养基，加入预热的HBSS，在AP侧每孔加0.5ml，BL侧每孔加1.5ml，37℃平衡20分钟，同时洗去细胞表面的杂质；移走HBSS，重新加入预热的HBSS，测定跨膜电阻值；用1个空白载体重复上述步骤以获得空白值；TEER＝(测定电阻值-空白值)单层表面积(cm2)。Caco-2细胞单层在12天后TEER值达到最大值，21天后细胞分化完成，形成紧密单层，TEER为(450±15)Ω·cm2>350Ω·cm2。
2.SD大鼠的海马神经元癫痫细胞模型建立
1)SD大鼠海马神经元分离培养
将新生24h内SD大鼠断头取脑，分离出海马神经元剪成细小碎块，用4℃PBS清洗2次，加入1ml 0.125％胰蛋白酶消化液，放入37℃、5％CO2培养箱消化，每5min摇晃1次，20min后，加入1ml含10％胎牛血清的DMEM培养液进行吹打，反复10次后冰上沉淀2min，吸取上清液。吸取微量细胞悬液与台盼蓝9:1混合染色，3min内显微镜下计数，根据需要将细胞铺在多聚赖氨酸处理的放有细胞爬片的培养皿中，置于37℃、5％CO2培养箱中培养4h，之后更换含2％B-27及0，5μM的L-谷氨酰胺的Neurobasal培养基进行培养。每隔2天半量换液法换液。培养期间在显微镜下观察神经元形态、轮廓、突起及细胞密度等生长情况。
2)无镁处理法建造癫痫细胞模型
SD大鼠海马神经元细胞育培养至12天，吸出培养基，更换为无镁Hank’s平衡盐溶液(HBSS：145mM氯化钠，2.5mM氯化钾，10mM HEPES，2mM氯化钙，10mM葡萄糖，0.002mM甘氨酸，pH7.3)，培养箱中孵育3h，将HBSS溶液再次更换为含镁Neurobasal培养基继续培养。膜片钳记录电生理特性。
3.厌氧培养基的配置
GAM肉汤液体培养基：大豆胨3g，口胨10g，消化血清粉13.5g，酵母浸膏5g，牛肉膏2.2k，牛肝膏1.2g，葡萄糖3g，KH2PO42.5g，可溶性淀粉5g，L-半胱胺酸盐0.3g，硫乙醇酸钠0.3g，肉汤1000ml，调Ph7.2-7.4，115℃高压灭菌15分钟，室温冷却备用。
指示剂：0.015％美兰溶液/0.001％刃天青溶液。
GAM肉汤固体培养基：琼脂2g/L，GAM肉汤液体培养基1L，115℃高压灭菌15分钟。
厌氧培养基不限于GAM肉汤培养基，还可以是TGC、AC肉汤等其他厌氧培养基、针对某种厌氧菌的特殊培养基等。
4.第一培养容器的预处理
称取除氧剂焦没食子酸0.1g置于除氧剂放置处，盖好密封盖。用注射器注入0.1ml10％NaOH至除氧剂上。用贴纸将注射针孔密封。
除氧还可以使用柠檬酸钠与碳酸氢钠反应生成二氧化碳以及硼氢化钠在有水环境中经钯触媒的作用，与氧气反应生成水，从而达到厌氧环境。
5.肠道菌群的制备
用于重悬肠道菌群的PBS经过高温煮沸并冷却至室温备用，另加入0.3g L-半胱氨酸/1L。
取癫痫病人及健康人的新鲜粪便1g，加入1mlPBS剧烈震荡10min，离心3000rpm，5min。弃上清，再加入1mlPBS重悬后，用200目细胞筛过滤去除食物残渣等杂质，3000rpm离心5min，弃上清，最后加入200μl厌氧培养基重悬。吸弃第一培养容器Caco-2细胞培养基，并用PBS洗两次，吸除PBS。菌液由第一加样口注射入第一培养容器内。
将第一培养容器置入第二培养容器中，并盖好上盖，于37℃5％CO2培养箱中培养。
6.肠道菌群多样性及丰度检测
收集病人及健康人群粪便标本及不同培养时间点的菌群悬液，采用高通量测序的方法对菌群16s rDNA V3-V4保守区进行测序，应用PCR-DGGE技术建立DGGE指纹图谱；对图谱中特异性和优势序列进行测序，应用Blast、ClustalX 2.0.11和MEGA 3.1进行序列比对和系统进化分析。
7.Caco-2细胞屏障功能研究
将共培养时间分为0、6、12、24、48、72h。
直接检测细胞屏障完整性。
TEER测定每个时间点的电阻值，用以分析肠道菌群对细胞屏障的通透性的影响(方法见1.肠道上皮细胞培养)。
免疫荧光方法检测细胞间连接蛋白Occludin蛋白。
将长有Caco-2细胞的上层培养装置的膜剪下，放在24孔板中，PBS洗三遍。
4％冷的多聚甲醛固定20分钟，PBS洗三遍。
0.2％Triton X－100通透10分钟，PBS洗三遍。
10％山羊血清封闭30分钟，PBS洗三遍。
Occludin蛋白鼠抗人一抗4度孵育过夜，PBS洗三遍。
羊抗鼠FITC荧光二抗37℃孵育2小时(避光)，PBS洗三遍。
1ug/ml DAPI染色5秒，PBS洗三遍，甘油封片，荧光显微镜拍照。
间接检测细胞屏障的完整性。
取培养装置第二层细胞培养液，采用市售试剂盒进行LPS、D-乳酸、二胺氧化酶含量的检测，间接分析细胞屏障的完整性。
8.肠道菌群对SD大鼠海马神经元膜电位的影响研究
以癫痫病人肠道菌群为对照，分析正常人肠道菌群通过与肠道细胞的相互作用对SD大鼠海马神经元自放电的影响。
9.肠道菌群对细胞因子的影响研究
采用ELISA的方法，对促炎细胞因子肿瘤坏死因子-A、干扰素-C、白细胞介素(IL)-2、IL-6及IL-17、IL-23以及抗炎细胞因子IL-4、IL-10、IL-13、转化生长因子-B等水平进行检测，分析肠道菌群通过与肠道细胞的相互作用对细胞因子分泌量的影响。
10.肠道菌群对神经元细胞离子的影响研究
采用荧光探针法对神经元内钾、钠、钙等离子浓度进行测定，并分析肠道菌群通过与肠道细胞的相互作用对神经元内相关离子浓度的影响。
11.肠道菌群对神经递质的影响研究
ELISA方法分析肠道菌群通过与肠道细胞的相互作用对SD大鼠海马神经元分泌神经递质γ一氨基丁酸(GABA)、谷氨酸(Glu)、5一羟色胺(5-HT)、8-肽胆囊收缩素、阿片肽、神经肽Y、一氧化氮(NO)等的影响研究。
上述细胞共培养装置及模拟体内厌氧菌与需氧细胞相互作用的体外研究模型和方法，可以在体外模拟体内真实环境，用于厌氧细菌与其他细胞的相互作用研究，如可以用于厌氧细菌与其定植处细胞及体内其他系统的相互作用研究。该细胞共培养装置可实现对共培养系统中各成分的精确控制，从细胞水平乃至分子水平对共培养系统的基因组、蛋白质组、代谢组等进行精确分析，为体内厌氧菌群、药物等的临床研究提供可靠的验证方法。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种细胞共培养装置，其特征在于，包括第一培养容器和第二培养容器；
所述第一培养容器具有第一培养腔，所述第一培养容器还具有与所述第一培养腔直接连通的第一加样口，该第一加样口处设有用于密封该第一加样口的第一密封塞，所述第一培养容器的底部设有与所述第一培养腔连通的开口且该开口由多孔滤膜封住，所述第一培养容器内设有用于盛放除氧剂的除氧腔室，所述除氧腔室具有第二加样口，该第二加样口处设有用于密封该第二加样口的第二密封塞，所述除氧腔室与所述第一培养腔连通；
所述第二培养容器具有第二培养腔，所述第二培养容器还具有所述第二培养腔连通的开口，所述第一培养容器的底部能够从该开口伸入至所述第二培养腔中，且当所述第一培养容器伸入至所述第二培养容器中后，所述第一培养容器能够架在所述第二培养容器上并使所述第一培养容器的底部与所述第二培养容器的底部之间具有间隙。
2.一种模拟体内厌氧菌与需氧细胞相互作用的体外研究方法，其特征在于，使用如权利要求1所述的细胞共培养装置，所述体外研究方法包括如下步骤：
在所述第一培养容器的第一培养腔内接种第一需氧细胞，所述第一需氧细胞在所述多孔滤膜上贴壁生长，保持所述第一密封塞为打开状态，进行有氧培养；
在所述第二培养容器的第二培养腔内接种第二需氧细胞，进行有氧培养；
待所述第一需氧细胞培养至所需状态时，在所述除氧腔室内添加除氧剂，并塞上所述第二密封塞，经由第一加样口吸弃所述第一需氧细胞的培养基，清洗后注入厌氧培养基，并塞上所述第一密封塞，待所述厌氧培养基中的氧含量指示剂显示所述第一培养腔内无氧气时，在所述第一培养腔内经由所述第一密封塞注入厌氧细菌，并将所述第一培养容器架在第二培养容器上，进行共培养。
3.如权利要求2所述的模拟体内厌氧菌与需氧细胞相互作用的体外研究方法，其特征在于，所述第一需氧细胞为肠道上皮细胞，所述厌氧细菌为肠道菌群细菌；或
所述第一需氧细胞为阴道上皮细胞，所述厌氧细菌为阴道菌群细菌；或
所述第一需氧细胞为牙周细胞或口腔上皮细胞，所述厌氧细菌为口腔菌群细菌。
4.如权利要求3所述的模拟体内厌氧菌与需氧细胞相互作用的体外研究方法，其特征在于，所述第二需氧细胞为免疫系统的细胞、消化系统的细胞、神经系统的细胞或心血管系统的细胞。
5.如权利要求2所述的模拟体内厌氧菌与需氧细胞相互作用的体外研究方法，其特征在于，所述除氧剂是焦没食子酸与强碱、或者是柠檬酸盐与碳酸氢盐、或者是硼氢化钠、水与钯触媒。
6.如权利要求5所述的模拟体内厌氧菌与需氧细胞相互作用的体外研究方法，其特征在于，所述在所述除氧腔室内添加除氧剂包括如下步骤：先打开所述第二密封塞，加入所述除氧剂中的部分成分，再闭上所述第二密封塞，后续在所述厌氧培养基注入完后，经由所述第二密封塞注入所述除氧剂的余下成分。
7.如权利要求2所述的模拟体内厌氧菌与需氧细胞相互作用的体外研究方法，其特征在于，所述氧含量指示剂为亚甲基美兰或刃天青。
8.如权利要求2～7中任一项所述的模拟体内厌氧菌与需氧细胞相互作用的体外研究方法，其特征在于，所述第二培养容器的底部包被有多聚氨基酸。
9.如权利要求8所述的模拟体内厌氧菌与需氧细胞相互作用的体外研究方法，其特征在于，所述多聚氨基酸为多聚赖氨酸。
10.一种模拟体内厌氧菌与需氧细胞相互作用的体外研究模型，其采用如权利要求2～9中任一项所述的模拟体内厌氧菌与需氧细胞相互作用的体外研究方法构建得到。
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