CN102399692B

CN102399692B - 一种全自动肠道菌群体外模拟模型装置

Info

Publication number: CN102399692B
Application number: CN 201110318448
Authority: CN
Inventors: 尹业师; 雷芳; 朱立颖; 王欣
Original assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Hangzhou Hai Lu medical science and Technology Co., Ltd.
Priority date: 2011-10-19
Filing date: 2011-10-19
Publication date: 2013-06-05
Anticipated expiration: 2031-10-19
Also published as: CN102399692A

Abstract

一种全自动肠道菌群体外模拟模型装置，所述装置包括肠道菌群体外连续培养系统，所述肠道菌群体外连续培养系统包括气路系统、发酵系统、控制系统；所述发酵系统包括发酵单元结构，所述的发酵单元结构包括带有搅拌装置的培养基瓶和带有搅拌装置的生物反应器；所述控制系统包括显示屏、中央处理器，所述控制系统还包括与发酵单元结构相匹配的pH控制仪、温度控制系统、体积控制系统和分别通过胶管与生物反应器进料口连接的营养液蠕动泵、酸液蠕动泵、碱液蠕动泵，所述的中央处理器接受并处理控制系统的信号并发出工作指令，调节反应温度、pH值和反应体积。本发明有益效果是：提供一种操作简单、体系稳定、应用广泛的全自动肠道菌群体外模拟模型装置。

Description

一种全自动肠道菌群体外模拟模型装置

(一)技术领域

本发明属于微生物学技术领域，具体涉及一种全自动肠道菌群体外模拟模型装置。

(二)背景技术

自2006年Peter等在Nature杂志上报道肠道微生物的菌群结构与肥胖相关以来，肠道微生物的研究已经成为全球科学家关注的研究热点之一。相关的报道也屡见不鲜，已有研究报道肠道微生物对宿主的健康和生理具有很多非常重要的功能，如参与宿主的代谢、刺激宿主免疫系统的发育等等。当然，如果肠道微生物的正常平衡遭到破坏，其菌群结构的变化也与很多疾病的发生发展相关，如肥胖、糖尿病、炎症性肠炎等。所以研究肠道微生态的菌群结构，了解宿主与肠道微生物之间的关系、认清正常菌群与病原菌之间的相互作用关系已成为全球科学家关注的热点之一。

人体及动物的肠道中悉生着大量的微生物，人的胃肠道中含有10～100万亿个微生物，其细胞数量比人体细胞总数的10倍还多，其密度也非常高，在大肠的每克内容物中就含有10¹¹～10¹²个微生物。而且其种类也非常丰富，达到500～1000种。由于科学技术的限制，到目前为止大于80％的肠道细菌都还未能在体外进行纯培养。所以到目前为止人们对肠道微生物的认识其实还非常有限。

目前用于体外肠道菌群模拟的模型主要有由Macfarlane等研发的单相和三相连续发酵系统，这些系统已经广泛用于细菌与抗菌素之间的相互作用、细菌与细菌之间的相互作用及微生物对营养物质的代谢等的研究。但该模型工艺相对简单，发酵参数如温度、pH、流加速度等控制不够准确，容易影响试验结果。另外，由于当时技术的限制，Macfarlane等研发的模型的模拟效果并没有进行很好的评估。而且由于当时的知识有限，他们也并没有考虑肠道中未培养菌的富集培养问题。

对现有技术的文献检索发现，目前与本发明密切相关的专利有两篇，一个是专利“一种肠道菌群离体培养装置”(申请号：200710028346.2)，另一个是“一种人肠道菌群连续培养的系统及方法”(申请号：200810048065.8)。前者着重介绍了一种能模拟肠道的、连续流动的肠道菌群离体培养装置，且菌群相似性达到80％以上。后者在前者的基础上做了一定的改进，给出了具体的培养方法，以实例分析了培养前后优势菌群和代谢产物(主要是短链脂肪酸)的变化。但从公开的说明书和权利要求书来看，其工艺还比较粗糙、操作不够简单、发酵参数也不能控制的很精准，达不到数字化控制的要求。尽管其也对发酵前后的菌群结构进行了分析，但由于技术方法的限制，当时的发明者只是采用传统细菌培养计数的方法对肠道中有限的几种可培养的优势菌进行了比较，而肠道中大于80％的菌到目前为止还是不能在体外进行纯培养的，这在一定程度上影响了其结果的可靠性。同时，已发明的这两项专利都只是对某一个样品进行了研究，其代表性、重复性和广泛适用性可能还有待进一步考究。另外，可能由于当时生物技术和实验条件的限制，发明者对未培养菌的关注比较少，所以在进行模拟效果评估的时候并没有考虑未培养菌的模拟和富集情况。

(三)发明内容

本发明针对目前对肠道菌群体外培养技术的局限性，提供一种操作简单、稳定有效、使用广泛的全自动肠道菌群体外模拟模型。

一种全自动肠道菌群体外模拟模型装置，所述的装置包括肠道菌群体外连续培养系统，其特征在于：所述的肠道菌群体外连续培养系统包括气路系统、发酵系统、控制系统，所述的气路系统包括氮气瓶，所述氮气瓶通过胶管与所述的发酵系统连通；

所述的发酵系统包括发酵单元结构，所述的发酵单元结构包括所带有搅拌装置的培养基瓶和带有搅拌装置的生物反应器，所述的生物反应器通过营养液蠕动泵与培养基瓶连通，所述的培养基瓶包括培养基瓶体和培养基瓶盖，所述的培养基瓶盖上设有进气口A和排气口A，所述进气口A通过空气过滤器与氮气瓶相接，所述排气口A通过空气过滤器与大气相通；所述的生物反应器包括反应器瓶体和反应器瓶盖，所述的反应器瓶盖设有进气口B、排气口B和pH探针口及可深入反应器液面的pH探针，所述的反应器瓶体为夹套模式，所述的夹套里层为反应器，夹套层设有受温度控制系统控制的并与加温水源相连的循环进口和循环出口，所述的温度控制系统包括冷却系统和加热系统，所述夹套层安装有温度感应器，所述的温度感应器与温度控制系统连接；所述反应器瓶盖设有可通入软管的进料口，所述的进料口通过软管与营养液蠕动泵相连，通常将软管伸入反应器瓶的瓶底，所述反应器的侧面设有预定水位高度不同的发酵液出料口1-5个，优选2-3个，更优选3个，所述出料口与接收盘连通；所述进气口B通过空气过滤器与氮气瓶相接，所述排气口B通过空气过滤器与大气相通；

所述控制系统包括显示屏、中央处理器，所述的控制系统还包括与发酵单元结构相匹配的pH控制仪、温度控制系统、体积控制系统和分别通过软管与生物反应器进料口连接的营养液蠕动泵、酸液蠕动泵、碱液蠕动泵，所述的中央处理器接受并处理温度控制系统和体积控制系统与pH控制仪的信号，对营养液蠕动泵、酸液蠕动泵、碱液蠕动泵、冷却系统或加热系统发出工作指令，所述的酸液蠕动泵与调pH值的酸液连接、碱液蠕动泵与调pH值的碱液连接；所述的体积控制系统根据设定值控制营养液蠕动泵内流体的速度；所述的pH控制仪通过导线与所述的pH探针相连，所述的pH探针将实时采集的pH数据经过可将外部世界模拟信号和计算机连接的A/D转换后，传输到计算机和数字系统，经过比较判断算法与pH设定值进行比较后将模拟信号转换为可识别的数字信号，并通过命令识别控制程序传输到中央处理器，所述的中央处理器发出命令数据控制酸液蠕动泵或碱液蠕动泵工作；所述的温度控制系统与温度感应器连接，所述的温度感应器将实时采集的温度数据经过可将外部世界模拟信号和计算机连接的A/D转换后，传输到计算机和数字系统，经过采用比较判断算法与温度设定值进行比较后将模拟信号转换为可识别的数字信号，并通过命令识别控制程序传输到中央处理器，所述的中央处理器发出命令数据控制冷却系统或加热系统工作，从而改变加温水源的温度。

所述带有搅拌装置的培养基瓶和带有搅拌装置的生物反应器中的搅拌装置为位于培养基瓶或生物反应器下方的磁力搅拌器。

所述的发酵系统包括1～4个发酵单元结构串联组成，所述的每个发酵单元结构设有与自身匹配的pH控制仪、温度控制系统、体积控制系统、分别通过软管与生物反应器进料口的酸液蠕动泵、碱液蠕动泵、营养液蠕动泵连接，所述的每个发酵单元结构的控制系统均与中央处理器连接，所述的前一个发酵单元结构的出料口与下一个发酵单元结构的进料口连接，最后一个发酵单元结构的出料口与所述的接收盘连接。

具体的，将转子放入培养基瓶底部，置于磁力搅拌器上，不停的搅拌以保证培养基的充分混匀，连续通入氮气以保证培养基的厌氧环境，同时通过空气过滤器与外界相通以保持系统的平衡，并将蠕动泵与反应器相连，通过调控蠕动泵的蠕动速度可以调控培养基的流加速度，使培养基瓶中的新鲜培养基按一定的速度连续的流入生物反应器中。生物反应器通过调整发酵液流出口的高低调节生物反应器的发酵体积；另外，生物反应器通过插入其中的pH导线与pH控制器相连，将pH探针采集的数据经过A/D转换后，采用比较判断算法与pH设定值进行比较，将命令识别控制程序传输到中央处理器发出命令数据，控制加酸或加碱蠕动泵工作来控制生物反应器中的pH值；生物反应器也可通过夹套层设置的温度感应器与温度控制仪相连，将温度感应器采集的数据经过A/D转换后，采用比较判断算法与温度设定值进行比较，将命令识别控制程序传输到中央处理器发出命令数据，控制冷却或加热系统工作将加温水源不断泵入夹套层，实现发酵系统的恒温。

本发明的有益效果是：提供一种操作简单、使用方便、体系稳定、应用广泛的全自动肠道菌群体外模拟模型。

(四)附图说明

图1是全自动肠道菌群体外模拟模型的正视图

图2是全自动肠道菌群体外模拟模型的侧视图

图3是全自动肠道菌群体外模拟模型的效果图

图4是全自动肠道菌群体外模拟模型pH控制仪原理图

图5是全自动肠道菌群体外模拟模型温度控制系统原理图

图6是原始菌群和实施例2收集的发酵产物中的细菌的16S基因的PCR-DGGE电泳图比较(采用PCR-DGG的方法对发酵后样品和原始样品中的细菌菌群结构进行分析，结果表明发酵培养后的菌群结构与原始样品的菌群结构很相似，有很好的模拟效果。

图7是原始肠道内容物和实施例2收集的发酵产物中的细菌的成分图，采用454测序的方法对发酵后样品和原始样品中的细菌菌群结构进行分析，结果表明发酵培养后的菌群结构与原始样品的菌群结构很相似，有很好的模拟效果。

图8是对实施例2和实施例3采集的人粪便菌经VI培养基和VL培养基培养的重复性测定，采用PCR-DGG的方法对不同批次的发酵样品和原始样品进行菌群结构分析，结果表明本发明的系统有很好的稳定性和可重复性)

图9是实施例4收集的发酵产物中的细菌中的未培养菌和原始样品中的未培养菌的百分比组成的柱状图，结果表明，与原始肠道样品相比，未培养菌占总菌的比例在发酵后有所提高。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：全自动肠道菌群体外模拟模型的建立

一种全自动肠道菌群体外模拟模型装置，所述的装置包括肠道菌群体外连续培养系统，所述的肠道菌群体外连续培养系统包括气路系统1、发酵系统2、控制系统3，所述的气路系统1包括氮气瓶11，所述氮气瓶11通过胶管与所述的发酵系统2连通；

所述的发酵系统2包括发酵单元结构，所述的发酵单元结构包括所带有搅拌装置的培养基瓶21和带有搅拌装置的生物反应器22，所述的生物反应器21通过营养液蠕动泵与培养基瓶21连通，所述的培养基瓶21包括培养基瓶体211和培养基瓶盖212，所述的培养基瓶盖212上设有进气口A和排气口A，所述进气口A通过空气过滤器与氮气瓶11相接，所述排气口A通过空气过滤器与大气相通；所述的生物反应器22包括反应器瓶体221和反应器瓶盖222，所述的反应器瓶盖222设有进气口B、排气口B和pH探针口及可深入反应器液面的pH探针，所述的进气口B通过空气过滤器与氮气瓶相连，排气口B通过空气过滤器与大气相通，所述的反应器瓶体221为夹套模式，所述的夹套模式里层为反应器，夹套层设有受温度控制系统控制的并与加温水源相连的循环进口和循环出口，所述的温度控制系统包括冷却系统和加热系统，所述夹套层安装有温度感应器，所述的温度感应器与温度控制系统连接；所述反应器瓶盖222设有可伸入软管的进料口，所述的进料口通过软管与营养液蠕动泵相连，通常将软管另一头伸入反应器瓶的瓶底，以确保反应器内原料混合均匀，所述反应器的侧面设有预定水位高度不同的发酵液出料口3个，所述出料口2211与接收盘连通，所述的进料口通过胶管与营养液蠕动泵连通；所述进气口B通过空气过滤器与氮气瓶相接，所述排气口B通过空气过滤器与大气相通；

所述控制系统3包括触摸显示屏31、中央处理器，所述的控制系统还包括与发酵单元结构相匹配的pH控制仪32、温度控制系统33、体积控制系统34和分别通过胶管与生物反应器22进料口连接的营养液蠕动泵、酸液蠕动泵、碱液蠕动泵，所述的中央处理器接受并处理温度控制系统33和体积控制系统34与pH控制仪32的信号，对营养液蠕动泵、酸液蠕动泵、碱液蠕动泵、冷却系统或加热系统发出工作指令，所述的酸液蠕动泵与调pH值的酸液连接、碱液蠕动泵与调pH值的碱液连接；所述的体积控制系统34根据设定值控制营养液蠕动泵内流体的速度；所述的pH控制仪32通过导线与所述的pH探针相连，所述的pH探针将实时采集的pH数据经过可将外部世界模拟信号和计算机连接的A/D转换后，传输到计算机和数字系统，经过比较判断算法与pH设定值进行比较后将模拟信号转换为可识别的数字信号，并通过命令识别控制程序传输到中央处理器，所述的中央处理器发出命令数据控制酸液蠕动泵或碱液蠕动泵工作；所述的温度控制系统33与温度感应器连接，所述的温度感应器将实时采集的温度数据经过可将外部世界模拟信号和计算机连接的A/D转换后，传输到计算机和数字系统，经过比较判断算法与温度设定值进行比较将模拟信号转换为可识别的数字信号，并通过命令识别控制程序传输到中央处理器，所述的中央处理器发出命令数据控制冷却系统或加热系统工作，从而改变加温水源的温度。

所述带有搅拌装置的培养基瓶21和带有搅拌装置的生物反应器22中的搅拌装置为位于培养基瓶21或生物反应器22下方的磁力搅拌器23。

所述的发酵系统2包括1～4个发酵单元结构串联组成，所述的每个发酵单元结构设有与自身匹配的pH控制仪32、温度控制系统33、体积控制系统34，分别通过胶管与生物反应器22进料口的酸液蠕动泵、碱液蠕动泵、营养液蠕动泵连接，所述的每个发酵单元结构的控制系统均与中央处理器连接，所述的前一个发酵单元结构的出料口与下一个发酵单元结构的进料口连接，最后一个发酵单元结构的出料口与所述的接收盘连接。

实施例2：全自动肠道菌群体外模拟模型的模拟效果评估

本发明通过对人和鸡肠道菌群连续培养，评估全自动肠道菌群体外模拟模型的模拟效果。

人和鸡肠道菌群连续培养，主要包括以下步骤：

1.制备健康人粪便或鸡肓肠内容物菌群悬液

称取适量的健康人粪便或鸡肓肠内容物，用灭菌和厌氧处理后的PBS稀释成10％(10g粪便加入100ml PBS)的悬液，用玻璃棒在厌氧环境下充分搅拌均匀后，用孔径为2毫米的筛子过滤3次，将食物残渣等大颗粒去除，然后收集滤液用于接种。

2.发酵用培养基准备

将四套发酵系统分别单独使用，用来连续培养人和鸡的肠道菌群，其中两套发酵系统分别使用VL培养基和VI培养基来发酵培养人粪便菌群，另外两套发酵系统分别使用VL培养基和VI培养基来发酵培养鸡肓肠内容物菌群。生物反应器的发酵体积都控制在330ml，流加速度也控制在330ml/每天。

VI培养基配方(g/L)：淀粉8.0；蛋白胨3.0；胰蛋白胨3.0；酵母提取物4.5；粘液素0.5；3号胆盐0.4；L-半胱氨酸盐酸盐0.8；血红素0.05；吐温801.0；氯化钠4.5；氯化钾2.5；六水氯化镁4.5；六水氯化钙0.2；磷酸二氢钾0.4；七水硫酸镁3.0；二水氯化钙0.1；四水氯化锰0.32；七水硫酸亚铁0.1；七水硫酸钴0.18；七水硫酸锌0.18；五水硫酸铜0.01；六水氯化镍0.092，溶剂为水。

VL培养基配方(g/L)：胰蛋白胨10；牛肉浸膏2.4；L-半胱氨酸盐酸盐0.8；葡萄糖2.5；酵母提取物5.0；氯化钠5.0，溶剂为水。

3.向生物反应器接种制备好的健康人粪便或鸡肓肠内容物菌群悬液

接种前先将培养基装入上述实施例1所述的模型的反应器中，待高压冷却后再向生物反应器中接入菌群悬液，接种量为发酵液体积的10％。

4.连续发酵培养至稳定期，收集发酵液用于模拟效果的评价。

将发酵液收集后，差异离心获得细菌沉淀后，用于细菌DNA的提取和PCR-DGGE分析，结果表明连续发酵7天后，反应器进入稳定状态，其中的菌群结构基本上不会再发生改变。这时可以收集稳定期后的发酵液用于模拟效果的评估，评估方法主要包括PCR-DGGE、454测序及发酵液中短链脂肪酸浓度的测定。从图6和图7可以看出，人粪便菌群用VI培养基发酵后模拟效果好，而鸡肓肠内容物菌群用VL培养基发酵后模拟效果好。表1中的相关系数也表明，无论是PCR-DGGE法还是测序法，VI培养基对人粪便菌群有较好的模拟作用，而VL培养基对鸡肓肠内容物菌群有较好的模拟效果。同时从表2发酵液短链脂肪酸的浓度也可以看出VI培养基对人粪便菌群有较好的模拟作用，而VL培养基对鸡肓肠内容物菌群有较好的模拟效果。

表1PCR-DGGE和测序评估原始菌群与发酵后菌群之间的相关系数

表2发酵液中短链脂肪酸浓度的测定(mmol/L)

实施例3体外连续培养模型的可重复性及对其它个体的可适用性

为了验证系统的可重复性，事隔半年后我们再次采集同一个人的粪便样品接种至反应器中，用VI培养基和VL培养基连续发酵培养，然后用PCR-DGGE、454测序及短链脂肪酸浓度等指标来衡量其可重复性。从图8和表3可以看出整个发酵系统和方法不管是在细菌水平还是在短链脂肪酸水平都具有很好的重复性。

另外，为了验证该方法的可适应性，我们又另外收集了一男一女两份粪便样品，待发酵系统稳定后，收集发酵液，使用PCR-DGGE的方法评估其模拟效果，结果发现发酵液中的菌群结构与原始粪便中的菌群的相关系数都大于70％，说明该方法对其他个体也具有广泛的可适用性。

表3VI培养基和VL培养基对人粪便菌群发酵培养的可重复性

实施例4人和鸡肠道内容物中未培养菌的体外富集

在实施例2进行模拟效果评估的同时，我们也对肠道未培养菌的体外富集效果进行了比较分析，从图9可以看出，两种组成成分不同的培养基对人和鸡肠道内容物中未培养菌的体外富集效果存在着一定的差异，VL培养基虽然对人粪便菌群的总体模拟效果并不是很好，但却对某些未培养菌有很好的富集作用，而VI培养基虽然在总体上能很好的模拟人粪便中的菌群结构，但对未培养菌的富集效果却不好。鸡肓肠内容物中的未培养菌的富集效果也与培养基的组成相关，未培养菌在VI培养基中基本上不能生长。这说明我们可以通过调控发酵参数，如培养基组成，及其它参数如流加速度、pH值等在体外富集肠道中未培养的菌。

Claims

1.一种全自动肠道菌群体外模拟模型装置，所述的装置包括肠道菌群体外连续培养系统，其特征在于：所述的肠道菌群体外连续培养系统包括气路系统、发酵系统、控制系统，所述的气路系统包括氮气瓶，所述氮气瓶通过胶管与所述的发酵系统连通；

所述的发酵系统包括发酵单元结构，所述的发酵单元结构包括带有搅拌装置的培养基瓶和带有搅拌装置的生物反应器，所述的生物反应器通过营养液蠕动泵与培养基瓶连通，所述的培养基瓶包括培养基瓶体和培养基瓶盖，所述的培养基瓶盖上设有进气口A和排气口A，所述进气口A通过空气过滤器与氮气瓶相连，排气口A通过空气过滤器与大气相通；所述的生物反应器包括反应器瓶体和反应器瓶盖，所述的反应器瓶盖设有进气口B、排气口B和pH探针口及可深入反应器液面的pH探针，所述的反应器瓶体为夹套模式，所述的夹套里层为反应器，夹套层设有受温度控制系统控制的并与加温水源相连的循环进口和循环出口，所述的温度控制系统包括冷却系统和加热系统，所述夹套层装有温度感应器，所述的温度感应器与温度控制系统连接；所述反应器瓶盖设有可通入软管的进料口，所述的进料口通过软管与营养液蠕动泵相连，所述反应器的侧面设有预定水位高度不同的发酵液出料口1-5个，所述出料口与接收盘连通；所述进气口B通过空气过滤器与氮气瓶相连，排气口B通过空气过滤器与大气相通;

所述控制系统包括显示屏、中央处理器，所述的控制系统还包括与发酵单元结构相匹配的pH控制仪、温度控制系统、体积控制系统和分别通过软管与生物反应器进料口连接的营养液蠕动泵、酸液蠕动泵、碱液蠕动泵，所述的中央处理器接受并处理温度控制系统和体积控制系统与pH控制仪的信号，对营养液蠕动泵、酸液蠕动泵、碱液蠕动泵、冷却系统或加热系统发出工作指令，所述的酸液蠕动泵与调pH值的酸液连接、碱液蠕动泵与调pH值的碱液连接；所述的体积控制系统根据设定值控制营养液蠕动泵内流体的速度；所述的pH控制仪通过导线与所述的pH探针相连，所述的pH探针将实时采集的pH数据经过可将外部世界模拟信号和计算机连接的A/D转换后，传输到计算机和数字系统，经过比较判断算法与pH设定值进行比较后将模拟信号转换为可识别的数字信号，并通过命令识别控制程序传输到中央处理器，所述的中央处理器发出命令数据控制酸液蠕动泵或碱液蠕动泵工作；所述的温度控制系统与温度感应器连接，所述的温度感应器将实时采集的温度数据经过可将外部世界模拟信号和计算机连接的A/D转换后，传输到计算机和数字系统，经过比较判断算法与温度设定值进行比较将模拟信号转换为可识别的数字信号，并通过命令识别控制程序传输到中央处理器，所述的中央处理器发出命令数据控制冷却系统或加热系统工作，从而改变加温水源的温度。

2.如权利要求1所述的全自动肠道菌群体外模拟模型装置，其特征在于：所述带有搅拌装置的培养基瓶和带有搅拌装置的生物反应器中的搅拌装置为位于培养基瓶或生物反应器下方的磁力搅拌器。

3.如权利要求1所述的全自动肠道菌群体外模拟模型装置，其特征在于：所述反应器的侧面设有预定水位高度不同的发酵液出料口2~3个。

4.如权利要求3所述的全自动肠道菌群体外模拟模型装置，其特征在于：所述反应器的侧面设有预定水位高度不同的发酵液出料口3个。

5.如权利要求1所述的全自动肠道菌群体外模拟模型装置，其特征在于：所述的发酵系统包括1~4个发酵单元结构串联组成，所述的每个发酵单元结构设有与自身匹配的pH控制仪、温度控制系统、体积控制系统，分别通过软管与生物反应器进料口的酸液蠕动泵、碱液蠕动泵、营养液蠕动泵连接，所述的每个发酵单元结构的控制系统均与中央处理器连接，所述的前一个发酵单元结构的出料口与下一个发酵单元结构的进料口连接，最后一个发酵单元结构的出料口与所述的接收盘连接。