CN111778153A - 一种连续性体外模拟人体肠道菌群发酵的设备及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种连续性体外模拟人体肠道菌群发酵的设备及方法，包括系统控制器、速率控制系统、搅拌系统、气路系统、温度调节系统、pH调节系统和取样系统。该设备和方法包括控制系统参数设置、模拟发酵、取样等步骤。本发明模拟了离体条件下的人体肠道菌群发酵，模拟真实，重现性好，系统采用智能控制，适用于营养学、食品学、生理学及微生物学等领域的研究。本发明可以体外条件下，真实地模拟人体肠道不同部位微生态对摄入营养素的代谢和发酵，提供了一种较为便捷的实验方法。

Description

一种连续性体外模拟人体肠道菌群发酵的设备及方法
技术领域
本发明涉及人体肠道菌群培养技术领域，尤其涉及一种连续性体外模拟人体肠道菌群发酵的设备及方法。
背景技术
肠道微生态是目前微生物学、营养学和免疫学的研究热点。由于哺乳动物肠道菌群与人体肠道菌群差异较大，动物模型并不能很好地模拟人体情况，因而体外模拟人体肠道菌群发酵装置被不断推广，为食品学、营养学和微生物学的研究提供了巨大的方便，逐渐被学术界接受，某些模拟装置甚至可以作为生产设备，生产需要肠道环境或肠菌激活的某些活性物质。如SHIME系统采用5个反应罐，以A-B-C-D-E串联形式连接。余应新等人设计的系统在SHIME系统的基础上加入一个新的，模拟口腔的环节，同样是串联连接(F-A-B-C-D-E)。但是现有设备较为复杂，占地面积较大，成本高昂，不适用于小型实验室。
发明内容
为解决现有技术的缺点和不足，提供一种连续性体外模拟人体肠道菌群发酵的设备及方法，为在体外条件下，真实地模拟人体肠道不同部位微生态对摄入营养素的代谢和发酵，提供了一种较为便捷的实验方法。
为实现本发明目的而提供的一种连续性体外模拟人体肠道菌群发酵的设备及方法，包括有营养素加料系统、肠道菌群发酵系统、气路系统、恒温培养箱、pH仪、磁力搅拌器和系统控制器，其中营养素加料系统包括加料罐、加料罐罐盖、磁力搅拌器和蠕动泵，所述加料罐罐盖设置有气体进出口以及营养素出口，营养素经由加料罐通过蠕动泵泵入到第一层的发酵罐；肠道菌群发酵系统包括三层自上向下排列的发酵罐、发酵罐罐盖和磁力搅拌器，三层发酵罐自上而下排列，以分别模拟升结肠、横结肠和降结肠，所述发酵罐罐盖装有pH仪、气体进口、气体出口、酸液进口、碱液进口、取样口以及营养素进液口，所述pH仪通过数据线与系统控制器连接；所述气体进口通过铜管连接有气体存储罐；酸液进口连接蠕动泵，并通过硅胶管与盐酸试剂瓶连接；碱液进口连接蠕动泵，并通过硅胶管与碳酸氢钠试剂瓶连接；所述取样口通过硅胶管与注射器连接，气体出口通过硅胶管与注射器连接，用以收集气体样品，上一层的发酵罐底部的排液口通过硅胶管与下一层发酵罐进液口相连，当发酵罐内液体体液达到设定体积时，液体会自动流入下一层发酵罐，最后一层发酵罐的排液口通过硅胶管与废液罐相连；所述发酵罐置于磁力搅拌器上，通过磁力搅拌器内部的转子搅拌发酵罐内的发酵液；所述发酵罐及磁力搅拌器置于恒温培养箱中并且以模拟人体37℃恒温环境培养；所述系统控制器包括人机交换界面和中央处理器，所述中央处理器通过数据线与磁力搅拌器、pH仪和蠕动泵连接。
作为上述方案的进一步改进，包括有以下步骤：
第一步：控制系统参数设置；
第二步：肠道菌群模拟发酵；
第三步：自动取样。
作为上述方案的进一步改进，所述第一步：控制系统参数设置，具体为：
系统温度37℃，蠕动泵速度设置为使营养素进入第一层的发酵罐到流出第三层的发酵罐时间为48h的速度值，发酵罐的pH通过0.05M盐酸和0.5M碳酸氢钠保持在一定范围参数内，第一层的发酵罐模拟升结肠菌群发酵，设置pH参数5.7～5.9之间，设置发酵罐液体体积80ml，包括培养基51.43ml，20％粪便稀释液体积28.57ml；第二层发酵罐模拟横结肠菌群发酵，设置pH参数6.3～6.5之间，设置发酵罐液体体积100ml，包括培养基66.67ml，20％粪便稀释液体积33.33ml；第三层发酵罐模拟降结肠菌群发酵设置pH参数6.7～6.9之间，设置发酵罐液体体积120ml，包括培养基82.50ml，20％粪便稀释液体积37.50ml，当发酵罐内液体体积超过设定值时，发酵液将通过上一层的发酵罐的排液口流入下一层发酵罐，其中，第三层发酵罐中发酵液将流入废液罐。
作为上述方案的进一步改进，所述第二步：肠道菌群模拟发酵，具体为：
第一步：开启恒温培养箱，设置温度37℃，使系统温度保持在37℃；
第二步：加料罐中加入5L营养素，开启蠕动泵；
第三步：每层发酵罐内加入培养基以及制备好的20％粪便稀释液，培养基与粪便稀释液体积根据设定要求加入；
第四步：打开气罐，开启磁力搅拌器，开启pH调节系统使发酵罐内pH稳定在设置好的参数范围内，在模拟发酵过程中，通过控制注射器可定时采集气体样品和粪便发酵液样品，实验开始后，粪便菌群需要18天在发酵罐内稳定并定植。
作为上述方案的进一步改进，所述20％粪便稀释液的制备步骤如下:取近3个月未接受抗生素治疗、未服用益生菌或益生元等功能食品的健康人的新鲜粪便，用0.1％蛋白胨溶液稀释成20％粪水悬液，通过拍打式无菌均质器4次/秒混匀，纱网过滤，加入发酵罐。
作为上述方案的进一步改进，所述加料罐中营养素的配比如下：淀粉：蛋白胨：胰蛋白胨：酵母提取物：氯化钠：氯化钾：黏蛋白：酪蛋白：果胶：木聚糖：阿拉伯半乳聚糖：碳酸氢钠：硫酸镁：瓜尔胶：菊粉：L-半胱氨酸HCL：磷酸氢二钾：磷酸二氢钾：猪胆盐：六水氯化钙：七水硫酸铁：氯高铁血红素：维生素K：吐温80：5:5:5:4.5:4.5:4.5:4:3:2:2:2:1.5:1.05:1:1:0.8:0.5:0.5:0.4:0.15:0.05:0.5：0.01:1；发酵罐中培养基中各组分的配比如下：蛋白胨：酵母提取物：氯化钠：磷酸氢二钾：磷酸二氢钾：七水硫酸镁：六水氯化钙：碳酸氢钠：吐温80：氯高铁血红色：维生素K：L-半胱氨酸HCL：猪胆盐之间的比例为：4:4:0.2:0.08:0.08:0.02:0.02:4:4:0.1:0.02:1:1。
本发明的有益效果是：
1.本发明的连续性体外模拟人体肠道菌群发酵的实验方法实现了离体条件下模拟人体肠道菌群发酵的过程，全系统只需通过人机交换界面输入运行参数，由电脑自动控制完成发酵过程，模拟逼真，具有很好的稳定性，平行性，及可重现性。
2.本发明连续性体外模拟人体肠道菌群发酵的实验方法适用于营养学、毒理学、生理学、食品学和微生物学等领域的研究，如营养学研究中对食物营养成分、微生态制剂(益生菌、益生元、合生元)等的营养性、有效性、安全性的评价；毒理学研究中对外源药物、抗生素、毒物等食入成分的代谢研究；生理学研究中通过代谢组学研究肠道菌群代谢产物对机体产生的影响；微生物学研究中肠道菌群的动力学研究等。
5.本发明中代谢产物可实现在线检测，如结肠菌群代谢培养物质后产气、产酸等、可直接通过气相、液相设备检测。
附图说明
以下结合附图对本发明的具体实施方式作进一步的详细说明，其中：
图1为本发明结构原理示意图；
图2为本发明加料罐的连接示意图；
图3为本发明发酵罐的连接示意图。
具体实施方式
如图1-图3所示，人体外模拟肠道菌群的发酵具体操作如下：
准备系统控制器(人机交换界面、数据处理器模块、设备控制器模块)，数据线、加料罐、发酵罐、磁力搅拌器、pH仪、气体存储罐、气体输入管道、气体输出管道、取样管道、蠕动泵、恒温培养箱。
加料罐与发酵罐的气体进口通过铜管与气体储存罐连接，将加料罐与发酵罐分别置于磁力搅拌器上，磁力搅拌器、蠕动泵分别通过数据线与系统控制器连接。
实验开始时，开启系统控制器，输入营养素蠕动泵参数，输入肠道菌群发酵模拟系统的pH参数和发酵罐内液体体积参数，发酵罐的pH通过盐酸(0.05M)和碳酸氢钠(0.5M)的添加保持在参数范围内(第一层发酵罐模拟升结肠菌群发酵设置pH参数5.7～5.9之间，设置发酵罐液体体积80ml；第二层发酵罐模拟横结肠菌群发酵设置pH参数6.3～6.5之间，设置发酵罐液体体积100ml；第三层发酵罐模拟降结肠菌群发酵设置pH参数6.7～6.9之间，设置发酵罐液体体积120ml)。
肠道菌群模拟发酵步骤如下:开启恒温培养箱，设置温度37℃，使系统温度保持在37℃；加料罐内加入5L营养素；第一层发酵罐内加入培养基51.43ml，20％粪便稀释液体积28.57ml；第二层发酵罐内加入培养基66.67ml，20％粪便稀释液体积33.33ml；第三层发酵罐内加入培养基82.50ml，20％粪便稀释液体积37.50ml，打开气罐；开启磁力搅拌器，开启pH调节系统使发酵罐内pH稳定在设置好的参数范围内。实验开始后，粪便菌群需要18天在发酵罐内稳定并定植，菌群达到稳定状态后，可通过控制注射器可定时采样(气体与粪便发酵液)。
营养素(1L)包括以下成分：
Figure BDA0002553423470000061
培养基(1L)包括以下成分：
Figure BDA0002553423470000062
Figure BDA0002553423470000071
以上实施例不局限于该实施例自身的技术方案，实施例之间可以相互结合成新的实施例。以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而并非对其进行限制，凡未脱离本发明精神和范围的任何修改或者等同替换，其均应涵盖在本发明技术方案的范围内。

Claims (6)

1.一种连续性体外模拟人体肠道菌群发酵的设备，其特征在于：包括有营养素加料系统、肠道菌群发酵系统、气路系统、恒温培养箱、pH仪、磁力搅拌器和系统控制器，其中营养素加料系统包括加料罐、加料罐罐盖、磁力搅拌器和蠕动泵，所述加料罐罐盖设置有气体进出口以及营养素出口，营养素经由加料罐通过蠕动泵泵入到第一层的发酵罐；肠道菌群发酵系统包括三层自上向下排列的发酵罐、发酵罐罐盖和磁力搅拌器，三层发酵罐自上而下排列，以分别模拟升结肠、横结肠和降结肠，所述发酵罐罐盖装有pH仪、气体进口、气体出口、酸液进口、碱液进口、取样口以及营养素进液口，所述pH仪通过数据线与系统控制器连接；所述气体进口通过铜管连接有气体存储罐；酸液进口连接蠕动泵，并通过硅胶管与盐酸试剂瓶连接；碱液进口连接蠕动泵，并通过硅胶管与碳酸氢钠试剂瓶连接；所述取样口通过硅胶管与注射器连接，气体出口通过硅胶管与注射器连接，用以收集气体样品，上一层的发酵罐底部的排液口通过硅胶管与下一层发酵罐进液口相连，当发酵罐内液体体液达到设定体积时，液体会自动流入下一层发酵罐，最后一层发酵罐的排液口通过硅胶管与废液罐相连；所述发酵罐置于磁力搅拌器上，通过磁力搅拌器内部的转子搅拌发酵罐内的发酵液；所述发酵罐及磁力搅拌器置于恒温培养箱中并且以模拟人体37℃恒温环境培养；所述系统控制器包括人机交换界面和中央处理器，所述中央处理器通过数据线与磁力搅拌器、pH仪和蠕动泵连接。
2.一种连续性体外模拟人体肠道菌群发酵的方法，其特征在于：包括有以下步骤：
第一步：控制系统参数设置；
第二步：肠道菌群模拟发酵；
第三步：自动取样。
3.根据权利要求2所述的一种连续性体外模拟人体肠道菌群发酵的方法，其特征在于：所述第一步：控制系统参数设置，具体为：
系统温度37℃，蠕动泵速度设置为使营养素进入第一层的发酵罐到流出第三层的发酵罐时间为48h的速度值，发酵罐的pH通过0.05M盐酸和0.5M碳酸氢钠保持在一定范围参数内，第一层的发酵罐模拟升结肠菌群发酵，设置pH参数5.7～5.9之间，设置发酵罐液体体积80ml，包括培养基51.43ml，20％粪便稀释液体积28.57ml；第二层发酵罐模拟横结肠菌群发酵，设置pH参数6.3～6.5之间，设置发酵罐液体体积100ml，包括培养基66.67ml，20％粪便稀释液体积33.33ml；第三层发酵罐模拟降结肠菌群发酵设置pH参数6.7～6.9之间，设置发酵罐液体体积120ml，包括培养基82.50ml，20％粪便稀释液体积37.50ml，当发酵罐内液体体积超过设定值时，发酵液将通过上一层的发酵罐的排液口流入下一层发酵罐，其中，第三层发酵罐中发酵液将流入废液罐。
4.根据权利要求3所述的一种连续性体外模拟人体肠道菌群发酵的方法，其特征在于：所述第二步：肠道菌群模拟发酵，具体为：
第一步：开启恒温培养箱，设置温度37℃，使系统温度保持在37℃；
第二步：加料罐中加入5L营养素，开启蠕动泵；
第三步：每层发酵罐内加入培养基以及制备好的20％粪便稀释液，培养基与粪便稀释液体积根据设定要求加入；
第四步：打开气罐，开启磁力搅拌器，开启pH调节系统使发酵罐内pH稳定在设置好的参数范围内，在模拟发酵过程中，通过控制注射器可定时采集气体样品和粪便发酵液样品，实验开始后，粪便菌群需要18天在发酵罐内稳定并定植。
5.根据权利要求4所述的一种连续性体外模拟人体肠道菌群发酵的方法，其特征在于：所述20％粪便稀释液的制备步骤如下:取近3个月未接受抗生素治疗、未服用益生菌或益生元等功能食品的健康人的新鲜粪便，用0.1％蛋白胨溶液稀释成20％粪水悬液，通过拍打式无菌均质器4次/秒混匀，纱网过滤，加入发酵罐。
6.根据权利要求5所述的一种连续性体外模拟人体肠道菌群发酵的方法，其特征在于：所述加料罐中营养素的配比如下：淀粉：蛋白胨：胰蛋白胨：酵母提取物：氯化钠：氯化钾：黏蛋白：酪蛋白：果胶：木聚糖：阿拉伯半乳聚糖：碳酸氢钠：硫酸镁：瓜尔胶：菊粉：L-半胱氨酸HCL：磷酸氢二钾：磷酸二氢钾：猪胆盐：六水氯化钙：七水硫酸铁：氯高铁血红素：维生素K：吐温80：5:5:5:4.5:4.5:4.5:4:3:2:2:2:1.5:1.05:1:1:0.8:0.5:0.5:0.4:0.15:0.05:0.5：0.01:1；发酵罐中培养基中各组分的配比如下：蛋白胨：酵母提取物：氯化钠：磷酸氢二钾：磷酸二氢钾：七水硫酸镁：六水氯化钙：碳酸氢钠：吐温80：氯高铁血红色：维生素K：L-半胱氨酸HCL：猪胆盐之间的比例为：4:4:0.2:0.08:0.08:0.02:0.02:4:4:0.1:0.02:1:1。
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