CN101113408B - 一种肠道菌群离体培养装置 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种能模拟肠道的、连续流动的肠道菌群离体培养装置。它包括发酵罐的控温系统、自动输送新鲜培养基及输出废液系统和肠道菌群生长所需环境保障系统；设计了与恒温水浴锅和微型潜水器相连的带水浴夹套的发酵罐。通过蠕动泵的连接实现培养基能连续地流入、废液能连续地排出系统；通过输入氮气、pH控制器达到所需的厌氧环境、pH范围和营养条件。本发明成功构建的人体肠道菌群连续培养装置，具有成本低、使用方便、操作简单的特点，且经检测表明人体肠道菌群能够稳定生长，结构与培养前相比相似性达80％以上。可满足应用于抗菌药残留对人体肠道菌群影响的安全评价研究，还可用于营养物质的功能评价和药品食品的功能、安全评价研究。

Description

一种肠道菌群离体培养装置
技术领域
本发明涉及菌群离体培养装置，具体是指一种能模拟肠道、连续流动的肠道菌群离体培养装置，特别适用于研究观察外来药物或食物对肠道菌群的影响。
背景技术
肠道菌群是一个平衡的生态系统，它对保持人和动物的健康起着非常重要的作用。抗菌药物在抑制病原菌生长的同时也会对肠道正常菌群产生影响，破坏其平衡状态，引起二重感染等。近年来研究发现，残留在动物性食品中的抗菌药物也会对人体的肠道菌群产生不利影响，而一些功能性食品如微生态制剂等则有调节人和动物肠道菌群的作用。因此，对药物及功能性食品的安全性或功能性评价成为近年研究的热点。肠道菌群种类浩繁，据估计，人肠道中的细菌细胞总数达1014个，每克肠内容物含1011个细菌，种数在400～500种，互相作用极为复杂。直接在体内研究观察外来药物或食物对这一复杂群体的影响，在目前尚有许多困难，因而应用体外模型或实验动物是目前采用的主要手段。
经过对现有技术文献的检索发现，目前，国际上推荐的评价抗菌药残留对人体肠道菌群影响的研究模型包括MIC测定、半连续和连续流动培养系统(离体恒化器模型)、模拟的肠道模型、普通实验动物、悉生小鼠和携带人体肠道菌群的啮齿动物(HFA)等离体和活体模型，这些模型都各有优缺点，它们的可靠性和有效性还需进一步研究。与普通实验动物相比，HFA的肠道菌群与人体更接近，但存在植入后的菌群构成可能不稳定等问题。离体恒化器模型的结构比较复杂，限制了同一处理组的重复个体数，但它是所有离体模型中与肠道更为接近的模型。美国FDA建立了一个离体恒化器模型，并采用此模型研究了新霉素、四环素、红霉素和环丙沙星对肠道菌群的影响，研究结果表明，离体恒化器模型可以用来检测低水平抗菌药残留对肠道菌群的影响。该实验装置的关键部分是发酵罐，具有自动加热、自动搅拌、自动流速控制等，但该设备不仅价格比较昂贵，且在设计方面也存在一些缺陷，如电热管对培养内容物直接加热，对某些温度敏感型微生物的生长具有不利影响、发酵内容物搅拌不均匀等。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术存在的缺陷和不足，提供一种不仅能模拟肠道的环境，使肠道菌群在系统中稳定地生长，而且能象肠道那样连续地摄入和排出内容物的肠道菌群离体培养装置。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的。
本发明所指的这种肠道菌群离体培养装置包括发酵罐的控温系统、自动输送新鲜培养基及输出废液系统和肠道菌群生长所需环境保障系统；发酵罐的控温系统是由带水浴夹套的发酵罐、微型潜水泵和恒温水浴锅所组成，自动输送新鲜培养基及输出废液系统是由培养系统磁力搅拌器、新鲜培养基贮存罐、新鲜培养基磁力搅拌器、废液收集装置、废气收集装置、新鲜培养基输送蠕动泵、废液输送蠕动泵所组成，肠道菌群生长所需环境保障系统是由氮气导入系统、pH自动控制系统所组成；其连接方式为：新鲜培养基贮存罐通过装有新鲜培养基输送蠕动泵的管子与发酵罐连通，高压氮气钢瓶通过装有细菌滤器的管子与发酵罐连通，发酵罐通过装有废液输送蠕动泵的管子与废液收集装置连通，发酵罐通过管子与废气收集装置连通；pH控制器电极与发酵罐内的培养液接触，并与pH控制器相连接，pH控制器与碱泵连接，碱贮存液罐通过装有碱泵的管子与发酵罐连通，发酵罐的水浴夹套上端设有出水口、下端设有进水口，它们分别与微型潜水泵和恒温水浴锅相连，微型潜水泵放置在恒温水浴锅内。
所述培养系统磁力搅拌器置于发酵罐罐体的下面，新鲜培养基磁力搅拌器置于在新鲜培养基贮存罐的下面。磁棒置于发酵罐罐体底部中间位置，该位置呈凹陷状。
本发明与现有技术相比具有如下突出优点：
1、本装置解决了模拟肠道的环境(厌氧环境、一定的pH值、合适的营养成分、合适的温度、合适的流动速度)的几个关键问题，其主要体现在以下几个方面：(1)设有循环水浴加热系统，使发酵内容物只是被间接加热，即使对发酵内容物中温度敏感型的微生物，也不会因为局部温度过高而影响其生长；水浴锅内保持恒温37℃的水经微型潜水泵强制循环，使发酵罐内发酵液所受温度恒定，不同发酵罐间的温度差异范围＜0.1℃，能较好地控制培养液的温度。(2)发酵罐底部中间位置稍凹陷，可保证磁棒在发酵罐的中心位置匀速转动，能够有效保证整罐发酵液搅拌均匀一致。(3)采用pH控制器及与碱泵、碱贮备液的连接，可对发酵罐内pH进行自动控制，能较好地控制培养液的pH值在设定的范围之内。(4)采用了双通道的蠕动泵向各个发酵罐内均匀地导入新鲜培养基及导出废液，由于蠕动泵的精密控制作用，更精确地控制了稀释率，使发酵罐内的溶液体积保持稳定。
2、经过分子生物学方法、细菌培养计数方法和液相色谱技术的检测，表明人体肠道菌群能够在本装置中稳定生长，与未培养前的粪便相比，细菌数量达到稳定状态后各种细菌数量及比例与之都比较接近，菌群结构与培养前相比相似性达80％以上。
3、本发明成功建立了人体肠道菌群连续培养恒化器模型，可以满足和应用于抗菌药残留对人体肠道菌群影响的安全评价研究，还可用于营养物质的功能评价研究和其他药品食品的功能和安全评价研究。
4、本发明克服了目前国外建立同类模型时存在的成本高、控温不均、搅拌不均匀等问题，具有成本低、使用方便、操作简单的特点。特别是微型潜水泵结合发酵罐水浴夹套所完成的循环水浴大大降低了成本，仅为市售循环水浴装置的约1/100。
附图说明
图1为肠道菌群离体培养装置结构示意图。
具体实施方式
下面通过实施例进一步描述本发明。
实施例1
为达到发明目的本发明的一种肠道菌群离体培养装置结构如图1所示，它包括发酵罐的控温系统、自动输送新鲜培养基及输出废液系统和肠道菌群生长所需环境保障系统。所采用的第一个技术方案为设计了发酵罐的控温系统是由带水浴夹套16的发酵罐1、微型潜水泵6和恒温水浴锅7所组成。发酵罐1是一带水浴夹套的双层外壁玻璃培养瓶，发酵罐1的水浴夹套16外壁上端设有出水口19、下端设有进水口18，它们分别与微型潜水泵6和恒温水浴锅7相连，微型潜水泵6放置在恒温水浴锅7内，实现控制发酵罐内温度的效果。
采用的第二个技术方案为设计了自动输送新鲜培养基及输出废液系统，它是由培养系统磁力搅拌器2、新鲜培养基贮存罐3、新鲜培养基磁力搅拌器4、废液收集装置8、废气收集装置9、新鲜培养基输送蠕动泵12、废液输送蠕动泵13所组成。系统采用了双通道的蠕动泵向发酵罐内均匀地导入新鲜培养基及导出废液，由于蠕动泵的精密控制作用，更精确地控制了稀释率，使发酵罐内的溶液体积保持稳定。
采用的第三个技术方案为设计了肠道菌群生长所需环境保障系统，它是由氮气导入系统、pH自动控制系统所组成；通过高压氮气钢瓶5输入氮气、通过pH控制器11的使用和选择合适的培养基使系统达到了肠道菌群生长所需的厌氧环境、pH范围和营养条件。
所述的厌氧环境是指发酵罐内被持续通入无菌氮气。
采用pH控制器电极10、pH控制器11与碱泵14、碱贮备液的连接，可对发酵罐内pH进行自动控制，能较好地控制培养液的pH值在设定的范围之内。
所述的肠道菌群生长所需的营养条件是这样实现的：本系统运行时连续流入的培养基的配方为(g/L)：淀粉(5.0)，牛乳酪蛋白(3.0)，蛋白胨(3.0)，果胶(0.6)，木聚糖(0.6)，阿拉伯半乳糖(0.6)，支链淀粉(0.6)，L-半胱氨酸(0.4)，氯化血红素(0.01)，胆固醇(0.25)，鹅去氧胆酸(0.25)，胆酸(0.25)，KH2PO4(2.0)，NaHCO3(10.0)，NaCl(4.5)，MgSO4.7H2O(0.5)，CaCl2.2H2O(0.45)。
其连接方式为：新鲜培养基贮存罐3通过装有新鲜培养基输送蠕动泵12的管子与发酵罐1连通，将新鲜培养基不断地从贮存罐输送到发酵罐内；高压氮气钢瓶5通过装有细菌滤器17的管子与发酵罐1连通，将过滤过的氮气输送到发酵罐1内；发酵罐1通过装有废液输送蠕动泵13的管子与废液收集装置8连通，将培养液不断地从发酵罐内输出到废液收集装置；发酵罐1通过管子与废气收集装置9连通，将发酵罐内产生的气体吸收至废气收集装置9；pH控制器电极10与发酵罐1内的培养液接触，并与pH控制器11相连接，pH控制器11与碱泵14连接，碱贮存液罐15再通过装有碱泵14的管子与发酵罐1连通，起到自动控制发酵罐内培养物pH值的作用；培养系统磁力搅拌器2置于发酵罐1罐体及其水浴夹套16的下面，发酵罐1的底部凹陷，这样可保证磁棒保持在发酵罐的中心位置，持续搅拌，起到均匀搅拌培养液的作用；新鲜培养基磁力搅拌器4置于新鲜培养基贮存罐3的下面，起到均匀搅拌新鲜培养基的作用。
本发明的一种肠道菌群离体培养装置的工作过程：
(1)运行前的准备工作
灭菌处理：玻璃发酵罐和与发酵罐相连的进新鲜培养基、出废液、进氮气、出废气采用的硅胶管及pH电极用高压蒸气锅121℃、20分钟灭菌；用以控制pH值的碱泵所配备的硬质管通过循环过75％酒精并紫外照射的灭菌方式进行灭菌处理；在无菌室内将各灭菌好的部件进行连接；发酵罐置于通风橱内准备运行。
(2)肠道菌群离体培养装置的运行
开启高压氮气钢瓶5，使氮气通过细菌滤器17过滤除菌，无菌氮气通过发酵罐1上的进口以每分钟150mL的速度进入发酵罐1内，以保证发酵过程的厌氧环境。通过开启新鲜培养基的蠕动泵12，新鲜培养基以恒定的速度从新鲜培养基贮存罐3向发酵罐1内连续注入；通过开启废液输送蠕动泵13，发酵罐1内的培养液以恒定的速度输送到废液收集装置8；启动放置在发酵罐1正下方的磁力搅拌器2，通过发酵罐1内磁力搅拌棒的作用起到对发酵内容物的匀速搅拌作用；发酵罐1内产生的废气通过与其相连接的出废气管进入废气收集装置9，用以收集发酵过程中产生的H2S。发酵罐1内培养液pH的变化通过pH控制器电极10传送到pH控制器11，设定pH控制器高点继电器为6.4，低点继电器为6.2，迟滞为1.0；碱贮存液罐15与碱泵14连接，用0.5M NaOH来调节碱度，以维持发酵液6.2-6.4的pH条件；pH控制器11根据pH值的变化调控碱泵14的启动或关闭，碱泵14将碱贮存液罐15内的碱液输送到发酵罐1内，直到达到设定的pH值范围，起到自动控制发酵罐内培养物pH值的作用。恒温水浴锅7内加满水，开启电源，并将温度设定为37℃，辅以温度计校正加热系统的设定值；将微型潜水泵6调至360L/h，恒温水浴锅7内的温水通过进水口18进入水浴夹套16，再通过恒温水浴锅7内的微型潜水泵6的作用，由出水口19输送回发酵罐水浴夹套16。开启微型潜水泵6开关，通过潜水泵6提供循环水浴保证发酵罐处于37℃的水浴中，实现控制发酵罐内温度的效果。
(3)系统运行时进行的常规检查工作
检查输入培养基及输出废液的管是否有堵塞现象；及时更换氮气通入管的滤膜，保证发酵罐氮气的正常导入；检查循环水浴装置，保证发酵罐培养温度的准确控制。
本装置是一个连续流动的系统，以一定的速度不断地添加新的培养基，同时又以同样的速度不断地释放出老的培养基，以保证微生物对营养物质的需要，并排出部分有害代谢产物，使微生物保持较长时间的高速生长。这就需要保证培养基以恒定速度连续流入和流出，且要保证稳定的pH、温度和厌氧环境等。经细菌培养计数方法、分子生物学技术和液相色谱技术的检测表明，人体肠道菌群能够在装置中稳定生长，与未培养前的粪便相比，细菌数量达到稳定状态后各种细菌数量及比例与之都比较接近，菌群结构与培养前相比相似性达80％以上。

Claims (3)

1.一种肠道菌群离体培养装置，其特征在于：包括发酵罐的控温系统、自动输送新鲜培养基及输出废液系统和肠道菌群生长所需环境保障系统；发酵罐的控温系统是由带水浴夹套(16)的发酵罐(1)、微型潜水泵(6)和恒温水浴锅(7)所组成，自动输送新鲜培养基及输出废液系统是由培养系统磁力搅拌器(2)、新鲜培养基贮存罐(3)、新鲜培养基磁力搅拌器(4)、废液收集装置(8)、废气收集装置(9)、新鲜培养基输送蠕动泵(12)、废液输送蠕动泵(13)所组成，肠道菌群生长所需环境保障系统是由氮气导入系统、pH自动控制系统所组成；其连接方式为：新鲜培养基贮存罐(3)通过装有新鲜培养基输送蠕动泵(12)的管子与发酵罐(1)连通，高压氮气钢瓶(5)通过装有细菌滤器(17)的管子与发酵罐(1)连通，发酵罐(1)通过装有废液输送蠕动泵(13)的管子与废液收集装置(8)连通，发酵罐(1)通过管子与废气收集装置(9)连通；pH控制器电极(10)与发酵罐(1)内的培养液接触，并与pH控制器(11)相连接，pH控制器(11)与碱泵(14)连接，碱贮存液罐(15)再通过装有碱泵(14)的管子与发酵罐(1)连通；发酵罐(1)的水浴夹套(16)上端设有出水口(19)、下端设有进水口(18)，它们分别与微型潜水泵(6)和恒温水浴锅(7)相连，微型潜水泵(6)放置在恒温水浴锅(7)内。
2.根据权利要求1所述的一种肠道菌群离体培养装置，其特征在于：培养系统磁力搅拌器(2)置于发酵罐(1)罐体及其水浴夹套(16)的下面，新鲜培养基磁力搅拌器(4)置于在新鲜培养基贮存罐(3)的下面。
3.根据权利要求2所述的一种肠道菌群离体培养装置，其特征在于：发酵罐(1)底部中间位置呈凹陷状，磁棒放置在发酵罐(1)的中心位置。
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