CN113373037A - 肠道菌群发酵气体的成分的检测方法及其仪器 - Google Patents
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Abstract
一种针对肠道菌群发酵产气的测试方法，包括：把完成发酵的样品瓶放入样品仓；将取样针插入样品瓶取样；联通样品瓶与气体检测腔从样品瓶定量抽取发酵气体，使进入气体检测腔内的发酵气体占比达到第一梯度；利用传感器检测某发酵气体浓度C，推导出样品瓶中该发酵气体浓度；采用阶梯式进样模式，重复前述检测，直到完成所有预设梯度的肠道菌群发酵气体的检测，且各肠道菌群发酵气体的检测数据都符合预设气体传感器的检测量程；根据采集数据还原计算发酵小瓶的各种肠道菌群发酵气体的浓度。本发明还包括实施一种针对肠道菌群发酵产气的测试方法的仪器。本发明提供简便快速的适用于临床检测的肠道微生物发酵气体的成分的检测方法及其仪器。
Description
技术领域
本发明涉及一种肠道菌群发酵气体的成分的检测方法及其仪器，尤其是一种 结肠菌群发酵气体的检测方法和仪器。
背景技术
肠道菌群有两大类代谢产物，短链脂肪酸(short-chain fatty acid,SCFA) 和气体。众所周知，肠道菌群是影响人体健康的关键因素，而这种影响作用主要 是通过其代谢产物调控人体的生理功能来实现的。目前了解得比较清楚的是 SCFA的功能：参与人体的能量代谢、参与人体血糖稳态的维持、参与食欲调节、 体温调节，还与血压调节相关，是维护肠道屏障功能、肠道与全身免疫功能的关 键。相比之下，气体，主要有氢气、甲烷、二氧化碳和硫化氢等，对人体生理功 能的影响所知不多，与疾病的相关性却相对明确，主要是碳水化合物的消化不良、 以及与甲烷相关的便秘。这主要得益于呼气试验(breath test)的临床应用。 该方法主要是检测受试者呼气中氢气、甲烷等气体的含量来实现对小肠中微生物产气的间接分析，作为疾病的判断依据。这一临床检测方法始于上个世纪70年 代，目前已经被北美共识采纳，建议作为小肠细菌过度生长、碳水化合物的消化 不良、以及与甲烷相关的便秘的诊断依据。然而，针对结肠微生物产气分析的临 床应用几乎没有。
结肠是肠道菌群的主要聚居场所，与小肠中的微生物数量(104-107)相比， 结肠中微生物的数量为1010-1013，多100万倍。通常提及肠道菌群一般指的是结 肠的微生物，因此结肠的微生物产生的代谢产物，包括气体，也是大大超过小肠 细菌的产量。结肠微生物每天产生约1.2L的气体(Levitt,Gastroenterology， 1970)，主要释放路径有二，一个是肠壁吸收，进入血液随呼气排出体外，另一 个是随肠道内容物向结肠远端移动进而从肛门排出。可见，肠道菌群在结肠产生 的气体由于产气量庞大、释放途径不同，不能通过呼气试验来定量检测。而直接 从结肠采集气体，属于有创手术，个别的临床案例也许可行，但几乎不可能成为 科研样本的采集方法。可见，气体采集的困难导致了对肠道菌群气体研究的严重滞后。肠道菌群产生的气体，与SCFA并列两大肠道菌群代谢产物之首，却研究 甚少、数据的缺失，这势必造成对肠道菌群代谢产物认识的片面与不足，进而扭 曲我们对肠道菌群与疾病关系的认知。
肠道菌群被称为人体的第二基因组，却与人体基因组的高度稳定性不同，具 有高度的可塑性，主要受环境因素影响，包括出生方式、母乳喂养、饮食、抗生 素使用史等。而饮食是改变肠道菌群群组成及其代谢产物的主要因素(David， Nature，2014)。近50年来，免疫相关疾病、癌症、代谢疾病等慢病的发病率 持续上升，这种趋势与人们在饮食、生活方式的改变呈现高度的一致性，表明肠 道菌群在这些疾病的发生、发展中的发挥了重要作用(David，Nature，2014)。 另一方面，肠道菌群的高度可塑性也使其成为治疗与预防这些现代慢病的主要靶 标(Gentile,Science，2018)。这种高度可塑性同时也造就了肠道菌群在个体 间的巨大差异。因此，肠道菌群被认为是精准医学的主角，而个性化的检测成为 实施精准医学的基础。目前，肠道菌群代谢产物的检测，在临床检验领域还是一 片空白。
传统的肠道菌群研究主要是人体试验。由于人体试验固有的局限性，包括依 从性差，时间长，成本高等，其他的研究方法，包括体外模型、离体模型、计算 机模拟和动物肠道模型等日益受到重视。尤其是体外模型，也称体外模拟发酵模 型，与耗工费时的人体试验、动物试验相比，具有快速、高通量特征，在临床与 各个科学研究领域具有广阔的应用场景。据此，我们依据体外模拟发酵中的批次 发酵的方法，开发了一套肠道菌群体外代谢产物的检测系统，以满足临床与科研 对快速、高通量的检测技术的迫切需求。
研究肠道菌群的主要方法是人体试验，由于耗时费力、依从性差等局限性， 体外模型、离体模型、计算机模拟和动物肠道模型系统提供了研究肠道菌群的另 一大类方法。很早就有学者提出当我们把肠道菌群看成是一个能够进行复杂代谢 的器官，就应该认为可以在体外进行整体研究(Macfarlane&Macfarlane,Curr Opin Biotechnol，2007)。在当今动物实验也因伦理、宿主特异性等条件受限， 肠道体外模型的优势日益凸显。体外模型以模拟肠道菌群在消化道内的生长环境 为基础，利用粪便中的肠道菌群在体外建立模拟发酵体系，分为连续发酵模型与 批次发酵模型两大类。连续发酵模型模拟人体肠道食物摄入到粪便排出的开放系 统，涉及到培养基的流量控制、pH控制和整个发酵体系的厌氧控制等诸多环节， 尽管设备庞大、复杂，模拟肠道菌群的整体组成效果好，不仅相似性高，还可以 通过多级串联实现模拟升结肠、横结肠、降结肠等人体结肠的不同部位的发酵。 应用较广的有三阶段连续结肠模型系统(Sannasiddappa，PLoS ONE,2011)， 和涉及胃、小肠和结肠的全消化道模拟系统，如SHIME模型(Van den Abbeele，Appl.Environ.Microbiol.2010)和TIM模型(Reis，Food Biophys.2008) 等。Williams等人利用TIM-1和TIM-2成功地分析了药物的药代动力学的参数 (Williams,Annu Rev FoodSci Technol,2015)，展示出连续发酵模型潜在 的广阔应用前景。我们也拥有一个连续发酵系统的中国专利(ZL201711069219.7)。
另一方面，批次发酵模型主要模拟远端结肠，具有设备简单、发酵时间短的 特征。尽管模拟程度上不及连续发酵模型，在快速分析代谢产物方面有很大优势， 不仅速度快而且高通量。这个方法已经用于多个益生元的体外评估以及不同食物 组分对肠道菌群生长及其代谢产物影响的研究，包括SCFAs和产气量(Wang& Gibson，J.Appl.Bacteriol.1993；Vulevic，Am J Clin Nutr,2008)。我 们也利用批次发酵模型结合16S测序发现了不同肠型对长链低聚异麦芽糖 (isomalto-oligosaccharides,IMO)代谢的差异，包括SCFAs和对双歧杆菌促 进作用(Wu，Anaerobe,2017)。不过，批次模拟发酵在应用过程中，也存在不 少问题。
相比于人体实验或者动物实验采集肠道内气体的困难，对于批次发酵模型， 肠道菌群发酵气体的采集已经不再是问题。但是在临床检测中使用批次发酵的气 体检测依然遇到很多困难，缺乏简便可靠的方法。
首先，环境气体检测设备是完全不适用，这些设备往往需要几升的气体，以 便将环境气体循环泵入检测腔，当检测腔内气体与环境气体达到平衡后，再利用 传感器进行气体含量的检测进。或者需要加大的空间，比如1米左右的光程，以 便利用各种分析仪器进行气体检测，比如大型烟囱内的气体。而临床检测中一般 采用装有5ml液体培养基的10ml西林瓶内的气体的检测，检测对象为6.7ml 的物理空间中的气体组成。这对目前所有气体检测设备都是一个挑战因此，无法 采用环境气体检测设备来实施本发明面对的少量气体的检测。
其次，现有技术无法一次采集气体检测多种肠道菌群发酵气体的成分。通常 肠道菌群发酵气体的研究，往往采用气相色谱检测发酵气体，如果仅仅检测氢气 与甲烷，一个火焰检测器就可以同时检测，但加上硫化氢与二氧化碳，4中气体 的检测就需要至少2种检测器，就需要采集两次气体。这就需要比较多的气体， 一般会采用200ml以上的密闭容器来做体外模拟发酵，采用注射器来抽取气体 样本，手动进样检测。然而临床检测面对的是不足10ml的气体空间，而且面向 临床样本，就有很多极端的情况。有些特殊样本，比如新生儿的样本，产气就很 少，有可能不足以用注射器抽出，那就无法用这种手动进样的气相色谱来检测。 此外，气相色谱的手动进样，检测的误差较大。同时，由于发酵气体中有极易逃 逸的氢气与化学性质活泼的硫化氢，多次采样会造成很大的损失，导致误差。因 此，通常的气相色谱的检测方法，无法一次检测包括甲烷、氢气、二氧化碳、硫 化氢的4种气体，检测误差大，且对临床检测所用的发酵小瓶的少量气体的检测 是无法胜任的。
比如2020年美国明尼苏达大学的学者通过检测体外发酵产生甲烷的量，分 析人体肠道细菌中的甲烷菌的丰度与产甲烷的关系。这项研究采用气相色谱检测 甲烷，然后再利用环境气体检测设备--QRAE 3气体监测装置(RAE Systems,San Jose,CA)检测硫化氢。气相色谱对样本量的要求不高，只需要2ml，而硫化氢 的检测需要先抽取58ml发酵气体，再放入一个容器稀释5倍到348ml的气体， 然后才能使用特定的设备检测硫化氢的含量(Teigen，Dig Dis Sci,2020)。如 此繁琐的操作也是因为没有很好的检测设备的权宜之计。因为硫化氢的化学性质 非常活泼，理论上是可以采用气相色谱检测，但硫化氢的腐蚀性会对检测设备造 成比较大的折损，而肠道菌群发酵之后硫化氢的含量较高，因此气相色谱不适用 于结肠肠道菌群发酵气体的检测。
其三，虽然有学者尝试研制能够检测肠道菌群气体的专用设备，但是现有的 检测气体浓度的传感器的检测量程无法适应人体肠道菌群发酵气体的浓度波动 范围，检测效果不佳。检测气体浓度的传感器要么适用于小量程，要么适用于大 量程。为了获取小量程下气体浓度的灵敏度，需要使用小量程的传感器，但是小 量程的传感器在被检测气体浓度较高时就会因超出量程而失效；反之，大量程的 传感器不具有小量程下气体浓度的灵敏度与精确性。
澳大利亚科学家基于批次发酵模型，开发了带有气体和压力传感器的体外粪 便发酵系统，用于实时监测发酵气体(Rotbart,Sensors and Actuators B: Chemical,2017)。该系统使用200ml的瓶子，装有10ml培养基和50ml粪便 悬浊液(16％)，瓶口自下而上安装有气体传感器和释放阀装置，前者用于检测 气体含量氢气、甲烷、二氧化碳和硫化氢等4种气体，后者用于保持发酵系统的 压力恒定。利用该装置监测4h的人体肠道菌群体外发酵数据，学者们发现与无 机硫化物相比，硫化氢的产生更容易被半胱氨酸诱导，并且受到抗性淀粉、低聚 果糖(FOS)等非消化性碳水化合物的强烈抑制(Yao,Gut Microbes,2018)。 然而，这种实时检测设备对0-4h的发酵气体可以进行准确的检测，同时也意味 着无法检测长时间，比如24h，发酵的气体含量，因为气体含量会增加比较多， 而超过传感器的量程。因为作为能检测微量气体含量的元器件，其检测量程不可 能很大。而人体肠道气体中的氢气与甲烷的含量是很高的，有可能超过爆炸的极 限值，手术室的火灾就是一个很好的例证。
基于上述原因，尽管学界已经认识到肠道菌群代谢产物的重要性，是肠道菌 群影响人体健康的主要媒介，但目前两大代谢产物中，只有SCFA的数据是比较 容易获得的，而气体的含量一直没有很好的方法来检测。而缺失一半的代谢数据， 对全面认识肠道菌群对人体的影响是非常不利的。因此，开发肠道菌群发酵气体 的检测设备，已经成为深入肠道菌群研究的当务之急。
发明内容
本发明要克服现有技术的上述缺点，提供简便快速的适用于临床检测的一种 肠道菌群发酵气体的成分的检测方法及其仪器。本发明通过一次气体采集就可以 检测肠道菌群发酵气体中的包括甲烷、氢气、二氧化碳、硫化氢等4种气体的浓 度，并且克服传感器量程的限制。
本发明采用模拟结肠发酵效果较好的连续发酵模型的培养基，来创造尽可能 有利于肠道菌群生长的环境，并且利用相对固定的培养基，给出一个稳定的发酵 环境，从而比较不同的肠道菌群的生长状况，包括菌群组成，代谢产物，从而发 现其中的共性，以加深对各个饮食组分对肠道菌群影响的认知，推进精准营养学 与精准医学的发展。同时，这个发酵体系能够满足科研、临床的实际需求，包括 快速、准确和高通量。为此，构建了一个小型的批次发酵体系，采用连续发酵模 型的培养基，开发出能检测这个批次发酵体系中肠道菌群产生的少量气体的分析 设备。
首先，开发了一套能够同时检测SCFA与气体的基于批次发酵模型的代谢产 物检测系统。为了满足临床快速、准确和高通量的需求，设计了小规模的批次发 酵模型，本发明就是为这个模型量身定制了发酵气体的专业气体分析方法和设备， 同时具备临床检测设备的时效性。
本发明采用了一个相对比较小的发酵体系以减少样本量：10ml的西林瓶中 添加5ml的培养基，利用厌氧灌装技术建立了一种5ml批次发酵体系。肠道菌 群的体外模拟发酵的接种物一般采用人的粪便的悬浊液，总的接种率为1％(w/v)。 本发明的发酵小瓶因体系小，对样本的需求量很少，每瓶只需要0.05g粪便， 收集1g粪便就能接种10瓶以上的培养基。
此外，鉴于目前的批次发酵模型没有固定培养基，本发明采用了连续发酵模 型的常规培养基，以维持体外模拟系统中营养源的一致性。通常的批次发酵模型 采用无机盐的缓冲液，主要的有机物来自粪便中的残留，这会造成肠道菌群的营 养源的严重匮乏，与结肠发酵环境相似性下降。肠道菌群的个体差异较大，如果 培养基中的有机物组成存在差异，就可能加剧体外发酵的代谢产物差异的随机性。 因此，采用公认的肠道菌群的培养基有利于减少检测数据的非预测波动。
针对批次发酵模型体系小的特点，发酵小瓶内大约有6.7ml的物理空间可 以储存发酵气体，本发明开发了一系列的技术来实现气体量较少的条件下的4 种气体组分的含量检测，包括氢气、甲烷、二氧化碳和硫化氢。
发明的构思方案是：
1.采用肠道菌群培养常用的培养基YCFA作为基础培养基，通过添加目标碳源 开展该碳源对肠道菌群影响的研究。
2.为了解决待测气体量少带来的困难，做了两个设计：
a)首先设计了可以容纳整个发酵小瓶的样本仓，直接检测发酵小瓶中的气 体，减少样本瓶与检测腔之间的距离。
b)采用真空来建立检测腔与样本气体一定比例的平衡。采用传感器检测气 体，一般需要形成一个与样本气体一致的检测腔的气体，通常采用的是 气泵，所以需要足够多的气体量，否则检测腔内的气体不容易与样本气 体达成一致性。本发明则利用检测腔的真空度，通过定量抽取样本瓶内 的发酵气体，形成一定稀释度的气体，然后利用理想气体状态方程，把 稀释后的气体含量换算成发酵瓶内的气体含量。为此，我们在抽取发酵 气体之前，先检测发酵瓶内的气体压力，以及气体密度等参数。这个设 计方案大大降低对样本气体量的要求，解决了检测腔内与样本瓶中气体 的一致性的问题。
3.在开发过程中，发现个体差异大，检测十个样本，就有一个样本的某一气体 含量超过该气体传感器的量程，严重影响检测的准确性。并且我们发现某些 疾病患者的某类气体的含量会普遍高于正常人群，比如硫化氢，炎症性肠病 的患者的含量较正常人群高，能检测正常人群的硫化氢传感器就不能用于这 类患者的发酵气体。
为此，本发明采用了阶梯式进样方式，一举解决了这些问题。采用小量 程/高精度传感器，以同时实现高精度与大量程检测。通过调节检测腔的初 始气压控制进入检测腔内气体的百分比(1％-99％)，以扩增传感器的现有检 测范围与检测精度，以适应发酵气体组成在个体间的巨大差异。采用阶梯式 进样，比如连续吸取4次发酵气体，每次分别占总发酵气体的1％，5％，10％， 84％，使得数次的检测值中总能找到处于传感器量程范围内的值，选择这样 的检测值通过换算，得到发酵小瓶中的气体组成。每次采集气体的体积，可 以通过气压计的读取的气压值经计算获得。同时这个方法还能解决同一待测 样品中不同气体浓度相差较大、无法通过现有传感器同时实现准确测量的问 题。
下面的叙述中发酵小瓶，也称样品瓶。
本发明的一种针对肠道菌群发酵产气的测试方法，包括以下步骤：
S1.打开样品仓，把完成发酵的样品瓶放入样品仓，关闭样品仓；
S2.将取样针插入样品瓶，利用第一气压传感器检测样品瓶中的气压P0，再 换算发酵气体的总量为ΔV＝V1(P0/Patm-1)，其中V1为样品瓶的体积，Patm为 大气压，即发酵前的样品瓶内气压。
S3.利用连接样品瓶的气泵使得样品瓶达到第一气压P1，利用连接气体检测 腔的真空发生器控制气体检测腔的气压达到第二气压P2，联通样品瓶与气体检 测腔从样品瓶定量抽取发酵气体，使进入气体检测腔内的发酵气体占比达到第一 梯度；进入气体检测腔的气量比例为(P1-P2)*V2/(P1*(V1+V2))，其中V1为样 品瓶的体积，V2为气体检测腔的体积；
S4.利用气体检测腔中的若干气体传感器读取样本中的各种肠道菌群发酵气 体的含量数据，利用传感器检测某发酵气体浓度C，推导出样品瓶中该发酵气体 浓度为C0＝C*(P1*(V1+V2))/((P1-P2)*V1)。
S5.按照步骤S3,再次从样品瓶定量抽取肠道菌群发酵气体，使气体检测腔 内的肠道菌群发酵气体占比达到第二梯度的百分比；
S6.读取气体检测腔中各肠道菌群发酵气体的含量数据；
S7.采用阶梯式进样模式，重复步骤S5和S6，直到完成所有预设梯度的肠 道菌群发酵气体的检测，且各肠道菌群发酵气体的检测数据都符合预设气体传感 器的检测量程；
S8.引入经过过滤的空气冲洗检测仓数次，直到各个传感器读数归零，为下 一个样本的检测做准备；
S9.根据采集数据还原计算发酵小瓶的各种肠道菌群发酵气体的浓度。
优选地，步骤S4、S6、S7所述的各种肠道菌群发酵气体包括氢气、硫化氢、 甲烷与二氧化碳。
优选地，步骤S3所述的进入气体检测腔的发酵气体占比的范围是1％到99％。
优选地，步骤S7所述的阶梯式进样模式中进入气体检测腔的发酵气体设置 为不同占比范围和进样次数。
优选地，所述的阶梯式进样模式是：连续吸取4次发酵气体，每次分别占总 发酵气体的1％，5％，10％，84％。
实施本发明的一种针对肠道菌群发酵产气的测试方法的仪器，其特征在于： 包括样品仓、从所述样品仓内收集样本的采样机构和检测所收集样本的气体检测 腔；所述气体检测腔内设有若干个分别检测某种肠道菌群发酵气体的气体传感器 和第二气压传感器，所述采样机构和气体检测腔之间连接有阀门组，所述采样机 构、气体检测腔和阀门组之间分别通过密封管组连接；采样机构上装有检测样品 瓶中的气压的第一气压传感器；还包括自动控制各个机构分别完成相关检测动作 的主控电路，所述主控电路分别与所述采样机构、气体检测腔和阀门组的控制端 口连接，主控电路还连接第一气压传感器和第二气压传感器的输出端口；
所述样品仓内设有样品瓶，所述采样机构设有朝向样品瓶的取样针，所述取 样针气密地连接采样机构连接；
真空发生器分别与所述气体检测腔和阀门组气密连接，真空发生器的控制端 口与所述主控电路连接；
主控电路在需要从样品瓶抽取肠道菌群发酵气体时，向真空发生器发出启动 信号，并根据第一气压传感器和第二气压传感器的读数计算每个梯次进入气体检 测腔的肠道菌群发酵气体进入气体检测腔的气量比例，计算公式如下： (P1-P2)*V2/(P1*(V1+V2))，其中V1为样品瓶的体积，V2为气体检测腔的体积；
当进入气体检测腔中的肠道菌群发酵气体达到预设的气量比例时，主控电路 向阀门组发出关闭指令；
主控电路计算利用传感器检测某发酵气体浓度C，推导出样品瓶中该发酵气 体浓度为C0＝C*(P1*(V1+V2))/((P1-P2)*V1)，并输出到显示装置：主控电路预 装梯度式进样模式，逐次控制进入气体检测腔中的肠道菌群发酵气体的气量比例， 得到多次检测数据；针对不同气体样品组成，选择检测量最符合传感器检测量程 的数据成为最终检测结果并显示到人机界面。
所述气体传感器分别包括CH4传感器、H2传感器、H2S传感器或CO2传感器。
本发明的仪器，还包括外壳和底座，所述外壳和底座对接形成容纳各个机构 的密闭空间；所述外壳上设有控制设备启动的电源开关和控制所述样品仓启闭的 仓门开关，所述电源开关和仓门开关的控制端均与所述主控电路连接。
本发明的仪器，所述外壳上分别设有可打开的第一检修窗和第二检修窗，所 述第一检修窗对应所述气体检测腔的位置布置，所述第二检修窗对应所述阀门组 的位置布置。
本发明主要解决以下两个问题：
1.解决了少量混合气体(小于10ml)的各个气体组分的精确检测。
2.克服了气体成分样本间巨大的差异，能够实现大量程、高精度和全自动 检测。
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：
1.目前的环境气体检测设备是完全不适用肠道菌群的批次发酵模型。这些设 备往往需要几升的气体，以便将环境气体循环泵入检测腔，当检测腔内气体与环 境气体达到平衡后，再利用传感器进行气体含量的检测进。或者需要加大的空间， 比如1米左右的光程，以便利用各种分析仪器进行气体检测，比如大型烟囱内的 气体。此外，肠道菌群产的气体浓度比较高，往往超过环境中的浓度。比如环境 中甲烷的爆炸极限是4％，所以，用于环境气体检测的传感器的量程可以选很小 只要能检测小于4％这个阈值即可。而肠道中甲烷的含量之前有报道为7.2％ (Levitt，Gastroenterology，1970)，并且我们希望获得的数据相对准确，以 便把气体含量作为代谢参数，用于生物标记物的筛查。可见，肠道菌群的发酵气 体无法采用环境气体的检测设备来实施。
2.与目前用于发酵气体分析时采用的批次发酵模型比，样本量的要求比较低。 无论是澳大利亚学者研发的设备，发酵容器体积为200ml，还是美国学者检测 甲烷与硫化氢使用了250ml的气密容器，对粪便样本的需求量都在10g左右， 这对临床应用十分不利，尤其不适用于样本量少的人群，比如新生儿，腹泻患者 等。本发明利用少量粪便样本比如0.5g，就能进行体外批次发酵，进而实现代 谢产物的分析。
3.本发明借鉴连续发酵模型的培养基用于批次发酵模型，能减少肠道菌群体 外发酵的不确定性因素，提供一个统一的发酵系统，便于获得可以比较的大规模 人体肠道菌群的代谢产物数据，为体外批次发酵的数据应用于临床、科研奠定了 方法学的基础。
4.本发明能够一次自动测量发酵气体总量与4种气体组成等5项指标，提高 了检测数据的准确性与数据间的可比性，为本发酵系统的气体检测的可靠性打下 来坚实的基础。
5.本发明采用了阶梯式进样模式，采用小量程/高精度传感器，以同时实现 高精度与大量程检测。
气体传感器应用最广的是环境气体的检测，然而环境气体检测的目的仅仅在 于判断是否对人类有害，或者具有爆炸危险，而这些参数的极限值都是恒定的， 所以环境气体检测设备中的传感器的选择是没有难度的，能够准确判断阈值即可。 然而，本发明涉及的是对样本中的气体组分做准确的检测，而且不同样本间差异 很大，而且有可能同一个样本中不同气体的含量也会处于传感器量程的不同位置， 一次检测无法满足4种气体传感器的量程。此外，还存在患者与正常人群的气体 浓度范围的较大差异。因此，阶梯式进样模式的采用使得本发明适用于大部分人 体肠道菌群发酵气体的检测。
6.提供批次体外模拟发酵后与SCFA对应的发酵气体的组成与产气量的数据， 弥补目前肠道菌群代谢产物检测中普遍存在的不足，即两大类代谢产物，只有 SCFA数据，气体参数缺失的现状。
7.本发明实现了发酵气体检测的自动测量，便于包括临床在内的多领域的应 用与推广。
附图说明
图1是本发明的一个实施例的仪器外形示意图；
图2是本发明的一个实施例的仪器的内部结构示意图；
图3是图2中气体检测腔的内部结构示意图；
图4是本发明的一个实施例的仪器的控制流程图。
具体实施方式
以下描述用于揭露本发明以使本领域技术人员能够实现本发明。以下描述中 的优选实施例只作为举例，本领域技术人员可以想到其他显而易见的变型。在以 下描述中界定的本发明的基本原理可以应用于其他实施方案、变形方案、改进方 案、等同方案以及没有背离本发明的精神和范围的其他技术方案。
本领域技术人员应理解的是，在本发明的揭露中，术语“纵向”、“横向”、 “上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”“内”、 “外”等指示的方位或位置关系是基于附图所示的方位或位置关系，其仅是为了 便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定 的方位、以特定的方位构造和操作，因此上述术语不能理解为对本发明的限制。
在本发明中，权利要求和说明书中术语“一”应理解为“一个或多个”，即 在一个实施例，一个元件的数量可以为一个，而在另外的实施例中，该元件的数 量可以为多个。除非在本发明的揭露中明确示意该元件的数量只有一个，否则术 语“一”并不能理解为唯一或单一，术语“一”不能理解为对数量的限制。
在本发明的描述中，需要理解的是，属于“第一”、“第二”等仅用于描述目 的，而不能理解为指示或者暗示相对重要性。本发明的描述中，需要说明的是， 除非另有明确的规定和限定，属于“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以 是固定连接，也可以是可拆卸连接或者一体地连接；可以是机械连接，也可以是 电连接；可以是直接连接，也可以是通过媒介间接连接。对于本领域的普通技术 人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、 “具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特 征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书 中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述 的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的 方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中 描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
本发明的一种针对肠道菌群发酵产气的测试方法，包括以下步骤：
S1.打开样品仓，把完成发酵的样品瓶放入样品仓，关闭样品仓；
S2.将取样针插入样品瓶，利用第一气压传感器检测样品瓶中的气压P0，再 换算发酵产气的总量ΔV；ΔV＝V1(P0/Patm-1)，其中V1为样品瓶的体积，Patm 为大气压，即发酵前的样品瓶内气压。
S3.利用连接样品瓶的气泵使得样品瓶达到第一气压P1，利用连接检测腔的 真空发生器控制检测腔的气压达到第二气压P2，联通样品瓶与检测腔从样品瓶 定量抽取发酵气体，使进入检测腔内的发酵气体占比达到第一梯度；进入检测腔 的气量比例为(P1-P2)*V2/(P1*(V1+V2))，其中V1为样品瓶的体积，V2为检测 腔的体积；
S4.利用检测腔中的若干气体传感器读取样本中的各种肠道菌群发酵气体的 含量数据，利用传感器检测某发酵气体浓度C，推导出样品瓶中该发酵气体浓度 为C0＝C*(P1*(V1+V2))/((P1-P2)*V1)。
S5.按照步骤S3,再次从样品瓶定量抽取肠道菌群发酵气体，使检测腔内的 肠道菌群发酵气体占比达到第二梯度的百分比；
S6.读取检测腔中各肠道菌群发酵气体的含量数据；
S7.采用阶梯式进样模式，重复步骤S5和S6，直到完成所有预设梯度的肠 道菌群发酵气体的检测，且各肠道菌群发酵气体的检测数据都符合预设气体传感 器的检测量程；
S8.引入经过过滤的空气冲洗检测仓数次，直到各个传感器读数归零，为下 一个样本的检测做准备；
S9.根据采集数据还原计算发酵小瓶的各种肠道菌群发酵气体的浓度。
步骤S4、S6、S7所述的各种肠道菌群发酵气体包括氢气、硫化氢、甲烷与 二氧化碳。
步骤S3所述的进入检测腔的发酵气体占比的范围是1％到99％。
步骤S7所述的阶梯式进样模式中进入检测腔的发酵气体设置为不同占比范 围和进样次数，例如：连续吸取4次发酵气体，每次分别占总发酵气体的1％， 5％，10％，84％。
实施本发明的一种针对肠道菌群发酵产气的测试方法的仪器，包括样品仓1、 从所述样品仓1内收集样本的采样机构2和检测所收集样本的气体检测腔3，所 述气体检测腔内3设有若干个分别检测某种肠道菌群发酵气体的气体传感器和 第二气压传感器，采样机构2上装有检测样品瓶中的气压的第一气压传感器；所 述采样机构2和气体检测腔3之间连接有阀门组4，所述采样机构2、气体检测 腔3和阀门组4之间分别通过密封管组连接；还包括自动控制各个机构分别完成 相关检测动作的主控电路，所述主控电路分别与所述采样机构2、气体检测腔3 和阀门组4的控制端口连接，主控电路还连接第一气压传感器和第二气压传感器 的输出端口；
所述样品仓1内设有样品瓶12，所述采样机构2设有朝向样品瓶12的取样 针13，所述取样针13气密地连接采样机构2；
真空发生器5分别与所述气体检测腔3和阀门组4气密连接，真空发生器5 的控制端口与所述主控电路连接；
主控电路在需要从样品瓶12抽取肠道菌群发酵气体时，向真空发生器5发 出启动信号，并根据第一气压传感器和第二气压传感器的读数计算每个梯次肠道 菌群发酵气体进入气体检测腔3的气量比例，计算公式如下： (P1-P2)*V2/(P1*(V1+V2))，其中V1为样品瓶12的体积，V2为气体检测腔3 的体积；
当进入气体检测腔3中的肠道菌群发酵气体达到预设的气量比例时，主控电 路向阀门组4发出关闭指令；
主控电路计算利用传感器检测某发酵气体浓度C，推导出样品瓶12中该发 酵气体浓度为C0＝C*(P1*(V1+V2))/((P1-P2)*V1)，并输出到显示装置：主控电 路预装梯度式进样模式，逐次控制进入气体检测腔3中的肠道菌群发酵气体的气 量比例，得到多次检测数据；针对不同气体样品组成，选择检测量最符合传感器 检测量程的数据成为最终检测结果并显示到人机界面。
所述气体传感器分别包括CH4传感器、H2传感器、H2S传感器或CO2传感器。
本发明的仪器，还包括外壳6和底座7，所述外壳6和底座7对接形成容纳 各个机构的密闭空间；所述外壳6上设有控制设备启动的电源开关8和控制所述 样品仓启闭的仓门开关9，所述电源开关8和仓门开关9的控制端均与所述主控 电路连接。
本发明的仪器，外壳6上分别设有可打开的第一检修窗10和第二检修窗11， 所述第一检修窗10对应所述气体检测腔3的位置布置，所述第二检修窗11对应 所述阀门组4的位置布置。
如图1至图4所示，本发明提供的一种针对肠道菌群发酵产气的测试仪器， 包括外壳6和底座7，外壳6和底座7对接形成容纳各个机构的密闭空间，外壳 6内依次设有放置待测气体样品的样品仓1、从样品仓1内定量化取样收集样本 的采样机构2和检测收集样本浓度的气体检测腔3、以及用于气体检测腔3检测 前清空与检测后清洗的真空发生器5。
样品仓1内可放置有移动式的样品瓶12，采样机构2上朝向样品瓶12连接 设有自动控制的移动式取样针13，取样针13通过密封管组与采样机构2连接进 行取样抽样。
气体检测腔3内分别设有若干个检测肠道菌群发酵气体的气体传感器，根据 实际检测的需要，可以包含但不限于CH4传感器14、H2传感器15、H2S传感器16 或CO2传感器17等能测定各自气体含量、气压、温度等指标的传感器。
采样机构2和气体检测腔3之间连接有可控制气体进样时间与压力的阀门组 4，采样机构2、气体检测腔3和阀门组4之间的气腔分别通过密封管组连接， 真空发生器5通过密封管组分别与气体检测腔3和阀门组4连接。
如图4所示，外壳6内还设有主控电路，主控电路自动控制各个机构可编程 自动化完成所有检测动作，主控电路通过电线组分别与采样机构2、气体检测腔 3、阀门组4和真空发生器5控制连接。
本发明的逻辑结构与工作流程如下：
1、真空发生器通过阀门组将气体检测腔调整到一定的真空状态；
2、气体由样品瓶通过采样机构进入仪器，采样量通过阀门组进行调整；
3、气体进入气体检测腔，并通过各个气体传感器组进行测量；
4、测量结果通过预设软件进行推算，并得到样品瓶内气体含量以及菌种组 成。
主控电路控制所有组件开关与运行时间以及运算。
本发明利用体外发酵模型与气体分析仪，直接将受试者的粪便悬液接种于培 养基中进行体外发酵，预存于样品仓中，通过采样机构自动从样品仓中定量取样， 最后由气体检测腔检测气体成分，能更准确的检测出受试者结肠部位微生物所产 气体的含量、组成成分及各成分所占比例。
与呼吸气体测定仪相比，本发明可适用人群较广，且所测气体的相关数值更 接近于结肠部位的气体产量及组成成分。相对于屁的成分的检测，本发明所产生 的误差较小，且更方便进行。
进一步优选的，外壳6上分别设有控制设备启动的电源开关8和分别控制样 品仓1启闭的仓门开关9，电源开关8和仓门开关9分别通过电线组与主控电路 连接，可实现一键自动化控制操作。
外壳6上分别设有可打开的第一检修窗10和第二检修窗11，第一检修窗10 对应气体检测腔3的位置布置，第二检修窗11对应阀门组4的位置布置，可方 便设备核心部件及电路故障时的检修操作。
本发明针对新生儿NEC专门设计肠道菌群发酵产气的测试仪器，相对与现有 技术，能够更准确的检测出受试者结肠部位微生物所产气体的含量、组成成分及 各成分所占比例。
Claims (9)
1.一种针对肠道菌群发酵产气的测试方法，包括以下步骤：
S1.打开样品仓，把完成发酵的样品瓶放入样品仓，关闭样品仓；
S2.将取样针插入样品瓶，利用第一气压传感器检测样品瓶中的气压P0，再换算发酵气体的总量为ΔV＝V1(P0/Patm-1)，其中V1为样品瓶的体积，Patm为大气压，即发酵前的样品瓶内气压。
S3.利用连接样品瓶的气泵使得样品瓶达到第一气压P1，利用连接气体检测腔的真空发生器控制气体检测腔的气压达到第二气压P2，联通样品瓶与气体检测腔从样品瓶定量抽取发酵气体，使进入气体检测腔内的发酵气体占比达到第一梯度；进入气体检测腔的气量比例为(P1-P2)*V2/(P1*(V1+V2))，其中V1为样品瓶的体积，V2为气体检测腔的体积；
S4.利用气体检测腔中的若干气体传感器读取样本中的各种肠道菌群发酵气体的含量数据，利用传感器检测某发酵气体浓度C，推导出样品瓶中该发酵气体浓度为C0＝C*(P1*(V1+V2))/((P1-P2)*V1)。
S5.按照步骤S3,再次从样品瓶定量抽取肠道菌群发酵气体，使气体检测腔内的肠道菌群发酵气体占比达到第二梯度的百分比；
S6.读取气体检测腔中各肠道菌群发酵气体的含量数据；
S7.采用阶梯式进样模式，重复步骤S5和S6，直到完成所有预设梯度的肠道菌群发酵气体的检测，且各肠道菌群发酵气体的检测数据都符合预设气体传感器的检测量程；
S8.引入经过过滤的空气冲洗检测仓数次，直到各个传感器读数归零，为下一个样本的检测做准备；
S9.根据采集数据还原计算发酵小瓶的各种肠道菌群发酵气体的浓度。
2.如权利要求1所述的一种针对肠道菌群发酵产气的测试方法，其特征在于：步骤S4、S6、S7所述的各种肠道菌群发酵气体包括氢气、硫化氢、甲烷与二氧化碳。
3.如权利要求1所述的一种针对肠道菌群发酵产气的测试方法，其特征在于：步骤S3所述的进入气体检测腔的发酵气体占比的范围是1％到99％。
4.如权利要求1所述的一种针对肠道菌群发酵产气的测试方法，其特征在于：步骤S7所述的阶梯式进样模式中进入气体检测腔的发酵气体设置为不同占比范围和进样次数。
5.如权利要求4所述的一种针对肠道菌群发酵产气的测试方法，其特征在于：所述的阶梯式进样模式是：连续吸取4次发酵气体，每次分别占总发酵气体的1％，5％，10％，84％。
6.实施权利要求1所述的一种针对肠道菌群发酵产气的测试方法的仪器，其特征在于：包括样品仓、从所述样品仓内收集样本的采样机构和检测所收集样本的气体检测腔；所述气体检测腔内设有若干个分别检测某种肠道菌群发酵气体的气体传感器和第二气压传感器，所述采样机构和气体检测腔之间连接有阀门组，所述采样机构、气体检测腔和阀门组之间分别通过密封管组连接；采样机构上装有检测样品瓶中的气压的第一气压传感器；还包括自动控制各个机构分别完成相关检测动作的主控电路，所述主控电路分别与所述采样机构、气体检测腔和阀门组的控制端口连接，主控电路还连接第一气压传感器和第二气压传感器的输出端口；
所述样品仓内设有样品瓶，所述采样机构设有朝向样品瓶的取样针，所述取样针气密地连接采样机构连接；
真空发生器分别与所述气体检测腔和阀门组气密连接，真空发生器的控制端口与所述主控电路连接；
主控电路在需要从样品瓶抽取肠道菌群发酵气体时，向真空发生器发出启动信号，并根据第一气压传感器和第二气压传感器的读数计算每个梯次进入气体检测腔的肠道菌群发酵气体进入气体检测腔的气量比例，计算公式如下：(P1-P2)*V2/(P1*(V1+V2))，其中V1为样品瓶的体积，V2为气体检测腔的体积；
当进入气体检测腔中的肠道菌群发酵气体达到预设的气量比例时，主控电路向阀门组发出关闭指令；
主控电路计算利用传感器检测某发酵气体浓度C，推导出样品瓶中该发酵气体浓度为C0＝C*(P1*(V1+V2))/((P1-P2)*V1)，并输出到显示装置：主控电路预装梯度式进样模式，逐次控制进入气体检测腔中的肠道菌群发酵气体的气量比例，得到多次检测数据；针对不同气体样品组成，选择检测量最符合传感器检测量程的数据成为最终检测结果并显示到人机界面。
7.如权利要求6所述的仪器，其特征在于，所述气体传感器分别包括CH4传感器、H2传感器、H2S传感器或CO2传感器。
8.如权利要求7所述的仪器，其特征在于，还包括外壳和底座，所述外壳和底座对接形成容纳各个机构的密闭空间；所述外壳上设有控制设备启动的电源开关和控制所述样品仓启闭的仓门开关，所述电源开关和仓门开关的控制端均与所述主控电路连接。
9.如权利要求8所述的仪器，其特征在于，所述外壳上分别设有可打开的第一检修窗和第二检修窗，所述第一检修窗对应所述气体检测腔的位置布置，所述第二检修窗对应所述阀门组的位置布置。
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