CN110878286B - 一种用于肝癌类器官细胞球培养的培养基 - Google Patents
一种用于肝癌类器官细胞球培养的培养基 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于肝癌类器官细胞球培养的培养基，由基础培养基、表皮生长因子10‑25ng/mL、成纤维生长因子10‑25ng/mL、细胞生长因子0.5‑2ng/mL、胰岛素生长因子1‑3ng/mL、丙酮酸钠1mmol/L、谷氨酰胺2mmol/L、青霉素100U/mL、链霉素100μg/mL和体积分数为10％的血清组成；所述培养基针对肝癌组织来源细胞的培养生长特点，该培养基组分简单合理，营养丰富，配方价格适中；所述培养基培养的肝癌类器官细胞球能有效的长期稳定生长，细胞球紧密聚集，表面光滑圆润，边界清晰，无崩解现象，并且细胞活性，特异性功能及代谢功能均能显著提升。
Description
技术领域
本发明属于在生物技术的领域，具体涉及一种用于肝癌类器官细胞球培养的培养基。
背景技术
目前，肝癌是全球第四大恶性肿瘤，严重危害人类生命健康。2012年全球癌症统计结果显示肝癌患者新增至78多万例，其中我国每年约有37.2万例死亡，占全球肝癌发病人数及死亡人数约一半以上。因此，研发安全有效的抗肝癌药物逐渐受到人们的重视。在临床前的抗癌药物研发过程中，体外药物筛选大多采用二维细胞培养(2D)，即单层肝癌细胞贴附在平坦的二维支持物表面(例如培养瓶或表面皿壁)。然而，二维培养的细胞仅在有限程度上模拟组织生理条件，缺乏体内真实的组织结构，易导致低分化水平和细胞生理功能的丢失，进而导致获得的实验结果很难预测临床实际结果。在体内，肝癌细胞处于一个复杂的三维结构，细胞-细胞和细胞-胞外基质间的相互作用构建了一个用于维持组织特异性和稳态的三维通讯网络。体外三维癌组织细胞培养(3D)技术相对于常规2D培养，能很大程度上重现细胞的体内微环境，细胞更接近生理的表型及相互作用，可以更精确的重现细胞行为，如信号转导及药物反应等。同时，3D癌组织细胞培养被认为是预测体外抗癌药物筛选评估试验的改进方法，其对于癌症研究具有高度生理相关性。
当前，癌细胞自组装形成的类器官细胞球是一种新颖的体外3D癌组织细胞培养方法，优点在于3D类器官细胞球的组织结构与体内的癌组织相似，癌细胞能很好的保持细胞的生理形态和充分的细胞间互作。同时，3D类器官细胞球可自分泌胞外基质，避免外源性基质成份的引入。外源性基质成分不仅价格昂贵，同时不便于3D类器官细胞球的收集及后期生物学检测，例如基因、蛋白检测。虽然，3D类器官细胞球有很多优点，但是3D类器官细胞球在培养的过程中经常会发生细胞崩解，细胞活力及生理功能降低或丧失等问题，这主要是由于缺乏必要的适宜培养基引起的。
当前，肝癌细胞培养方法多为基础培养基(DMEM，或是DMEM/F12)，青霉素、链霉素及血清。然而，采用常规的培养基质对肝癌类器官细胞球进行培养时，肝癌类器官细胞球易出现细胞活力降低，球体崩解，生理功能表达降低等现象，这些现象不利于后期的抗癌药物筛选评估及生物检测。目前，暂无关于优化肝癌类器官细胞球的培养方法，尤其是具体的培养条件即培养基配方的研究报道。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于肝癌类器官细胞球培养的培养基(LSM)，解决了常规培养基培养的肝癌类器官细胞球的细胞活力降低、球体崩解、特异性功能及代谢功能降低的问题。
为了实现上述目的，本发明提供的一种用于肝癌类器官细胞球培养的培养基，由基础培养基、表皮生长因子、成纤维生长因子、细胞生长因子、胰岛素生长因子、丙酮酸钠、谷氨酰胺、青霉素、链霉素和血清组成。
优选地，各组成成分的含量为：表皮生长因子10-25ng/mL，成纤维生长因子10-25ng/mL，细胞生长因子0.5-2ng/mL，胰岛素生长因子1-3ng/mL，丙酮酸钠1mmol/L，谷氨酰胺2mmol/L，青霉素100U/mL，链霉素100μg/mL和体积分数为10％的血清。
优选地，所述基础培养基为DMEM/F12培养基。
优选地，所述表皮生长因子为重组人表皮生长因子。
优选地，所述成纤维生长因子为重组人碱性成纤维细胞生长因子。
优选地，所述细胞生长因子为重组人肝细胞生长因子。
优选地，所述胰岛素生长因子为重组人胰岛素样生长因子-I。
优选地，所述肝癌类器官细胞为永生化肝癌细胞系、原代肝癌细胞、正常肝细胞转化和衍生自多能性干细胞中的一种或多种。
优选地，所述肝癌类器官细胞球是细胞间聚集形成的细胞球，包括无载体支持下细胞自主聚集形成的细胞球。
本发明提供的一种用于肝癌类器官细胞球培养的培养基，具有如下有益效果：
选用了多种细胞因子成份按照优化比例配置而成，其组分简单合理，营养丰富，配方价格适中；利用该培养基培养的肝癌类器官细胞球能有效的长期稳定生长，细胞球紧密聚集，表面光滑圆润，边界清晰，无崩解现象，并且细胞活性，特异性功能及代谢功能均能显著提升，能够更有效的用于药物敏试验及抗癌新药的研发。
附图说明
图1为具体实施方式中的肝癌类器官细胞球培养基LSM与常规基础培养基分别培养的肝癌类器官细胞球第10天的明场图。
图2为具体实施方式中的肝癌类器官细胞球培养基LSM与常规基础培养基分别培养的肝癌类器官细胞球的形态因子的对比示意图。
图3为具体实施方式中的肝癌类器官细胞球培养基LSM与常规基础培养基分别培养的肝癌类器官细胞球的细胞球活力的对比示意图。
图4为具体实施方式中的肝癌类器官细胞球培养基LSM与常规基础培养基分别培养的肝癌类器官细胞球的细胞上清液中人白蛋白的合成分泌水平的对比示意图。
图5为具体实施方式中的肝癌类器官细胞球培养基LSM与常规基础培养基分别培养的肝癌类器官细胞球的基因表达水平的对比示意图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。
本专利公开的用于肝癌类器官细胞球培养的培养基，可以用于无载体支持下三维肝癌细胞球的培养，针对肝癌组织来源细胞的培养生长特点，该培养基LSM选用了多种细胞因子成份按照优化比例配置而成，其组分简单合理，营养丰富，配方价格适中；培养基LSM培养的肝癌类器官细胞球能有效的长期稳定生长，细胞球紧密聚集，表面光滑圆润，边界清晰，无崩解现象，并且细胞活性，特异性功能及代谢功能均能显著提升，此培养基LSM培养的肝癌细胞球因为有以上优点所以能够更有效的用于药物敏试验及抗癌新药的研发。
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。实验所用器具仪器试剂均可通过商业途径获得，但并不局限于同产家。
以下所述培养基所用试剂除另有说明外，均采购自GIBCO公司。
实施例1：配置普通肝癌类器官细胞球培养的培养基：
取400mL的DMEM/F12(1:1)基础培养基中加入5mL青链霉素混合液(100X，青霉素含量为10kU/mL，链霉素含量为10mg/mL)，用质量分数5％的NaHCO3溶液调节PH至7.2，之后使用0.4μm滤膜(购自Millipore密理博公司)过滤除菌，加入50mL胎牛血清，最后定容至500mL。
DMEM/F12培养基，用于细胞培养,含15mM HEPES，3151mg/L D-葡萄糖,1200mg/L碳酸氢钠，pH值为7.0-7.4。
实施例2：配置本发明的肝癌类器官细胞球培养的培养基LSM-A：
取400mL的DMEM/F12基础培养基中加入5mL青链霉素混合液(100X，青霉素含量为10kU/mL，链霉素含量为10mg/mL)，用质量分数5％的NaHCO3溶液调节PH至7.2，之后使用0.4μm滤膜(购自Millipore)过滤除菌。
加入各组分并且使各组分浓度分别为：表皮生长因子10ng/mL，成纤维生长因子10ng/mL，细胞生长因子0.5ng/mL，胰岛素生长因子1ng/mL，丙酮酸钠1mM，谷氨酰胺2mM，100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素和体积分数为10％的胎牛血清，最后定容至500mL。
其中表皮生长因子为重组人表皮生长因子(Recombinant Human EpidermalGrowth Factor，EGF)；成纤维生长因子为重组人碱性成纤维细胞生长因子(RecombinantHuman Basic fibroblast growth factor，bFGF)；细胞生长因子为重组人肝细胞生长因子(Recombinant Human Hepatocyte Growth Factor,HGF)；胰岛素生长因子为重组人胰岛素样生长因子-I(Recombinant Human Insulin-Like growth factor-1,IGF-I)。
实例3：配置本发明的肝癌类器官细胞球培养的培养基LSM-B：
取400mL的DMEM/F12基础培养基中加入5mL青链霉素混合液(100X，青霉素含量为10kU/mL，链霉素含量为10mg/mL)，用质量分数5％的NaHCO3溶液调节PH至7.2，之后使用0.4μm滤膜(购自Millipore)过滤除菌。
加入各组分并且使各组分浓度分别为：表皮生长因子25ng/mL，成纤维生长因子25ng/mL，细胞生长因子2ng/mL，胰岛素生长因子3ng/mL，丙酮酸钠1mM，谷氨酰胺2mM，100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素和体积分数为10％的胎牛血清，最后定容至500mL。
实施例4：
从肝癌细胞接种到肝癌类器官细胞球成球及后期培养的过程中，肝癌细胞分别采用实施例1、实施例2及实施例3的培养基进行培养。其中肝癌细胞是永生化肝癌细胞系、原代肝癌细胞、正常肝细胞转化和衍生自多能性干细胞中的一种或多种细胞。类器官细胞球是细胞间聚集形成的细胞球，类器官细胞球包括无载体支持下细胞自主聚集形成的细胞球。
将肝癌细胞放置到37℃，5％CO2的培养箱中进行培养，分别加入实施例1、实施例2及实施例3的培养基进行培养，培养24h后，形成肝癌类器官细胞球，每隔2天更换一次培养液，连续培养至第10天，置于倒置显微镜下观察及拍照。
实验结果如图1所示，以实施例1中常规培养基培养的肝癌类器官细胞球为对照组，以实施例2中培养基LSM-A和实施例2中培养基LSM-B培养的肝癌类器官细胞球为试验组，实施例1-3的培养基均能有效地培养肝癌类器官细胞球，但如放大图可明显观察到实施例1中的普通培养基中培养的肝癌类器官细胞球出现空泡及崩解现象(如箭头所示)，细胞球边界不清晰，细胞聚集性降低，折光性减弱。然而相较于常规培养基培养的肝癌类器官细胞球，培养基LSM-A和培养基LSM-B中培养的肝癌类器官细胞球生长状态良好，边界清晰，无崩解现象，细胞聚集紧密度强，折光性良好，说明实施例2和实施例3的培养基LSM具有突出的肝癌类器官细胞球培养效果。
实验结果如图2所示，以实施例1中常规培养基培养的肝癌类器官细胞球为对照组，以实施例2中培养基LSM-A和实施例2中培养基LSM-B培养的肝癌类器官细胞球为试验组，肝癌类器官细胞球形状因子采用公式为4π(面积)/(周长)2，数值越接近于1.0，说明球体形状越圆。本发明培养基LSM-A与培养基LSM-B中培养基LSM中培养的肝癌类器官细胞球结构完整，肝癌类器官细胞球的形状因子接近1.0，说明肝癌类器官细胞球更接近圆球形,见表1。
表1:实施例1-3的培养基中培养的肝癌类器官细胞球形状因子
肝癌类器官细胞球活力测试：分别取培养至第1天、3天、5天、10天的肝癌类器官细胞球，采用乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒LDH(购自碧云天)进行细胞活力测试，操作步骤按照说明书进行操作。
实验结果如图3所示，以实施例1中常规培养基培养的肝癌类器官细胞球为对照组，以实施例2中培养基LSM-A和实施例2中培养基LSM-B培养的肝癌类器官细胞球为试验组，本发明培养基LSM-A与培养基LSM-B中培养的肝癌类器官细胞球的活性可长期稳定的高于普通培养基中培养的肝癌类器官细胞球的活性。
肝癌类器官细胞球特异性功能表达检测：白蛋白主要在肝脏中合成，其作为肝功能特异性表达的主要指标。采用ELISA法检测肝癌类器官细胞球上清液的白蛋白含量，以评估其合成分泌能力。当肝癌类器官细胞球连续培养至10天后，收集普通培养基，培养基LSM-A与培养基LSM-B的细胞上清液，采用人白蛋白ELISA试剂盒，检测上清液中人白蛋白的合成分泌水平。
实验结果如图4所示，以实施例1中常规培养基培养的肝癌类器官细胞球为对照组，以实施例2中培养基LSM-A和实施例2中培养基LSM-B培养的肝癌类器官细胞球为试验组，本发明培养基LSM-A与培养基LSM-B中培养的肝癌类器官细胞球的白蛋白合成分泌能力高于普通培养基中培养的肝癌类器官细胞球，说明本发明培养基LSM-A与培养基LSM-B提升肝癌类器官细胞球的肝功能特异性表达,见表2。
表2:同量的培养基培养的肝癌类器官细胞球的白蛋白合成分泌量
肝癌类器官细胞球代谢功能测试：肝细胞色素P450酶(CYP450)参与多种外源性化合物的代谢、内源性物质的生成，尤其影响肿瘤发生、发展及药物治疗。采用实时定量反转录--聚合酶链反应(Quantitive reaL-time RT-PCR)定量分析肝癌类器官细胞球中3种CYP450(CYP1A1，CYP2E1，CYP3A4)基因表达水平。当肝癌类器官细胞球培养至第10天，利用提纯RNA和合成cDNA试剂盒，合成cDNA，然后逆转录聚合酶反应表达CYP1A1，CYP2E1及CYP3A4基因，以NADPH作为内参。
实验结果如图5所示，以实施例1中常规培养基培养的肝癌类器官细胞球为对照组，以实施例2中培养基LSM-A和实施例2中培养基LSM-B培养的肝癌类器官细胞球为试验组，不同培养基中培养的肝癌类器官细胞球均表达CYP1A1，CYP2E1和CYP3A4基因，其中本发明培养基LSM-A与培养基LSM-B中培养的肝癌类器官细胞球的3种基因表达均明显高于普通培养基中培养的肝癌类器官细胞的3种基因表达水平，见表3。说明本发明培养基LSM可提高肝癌类器官细胞球的代谢活力。
表3：实施例1-3的培养基中培养的肝癌类器官细胞的基因表达水平
本文中应用了具体个例对发明构思进行了详细阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离该发明构思的前提下，所做的任何显而易见的修改、等同替换或其他改进，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种用于肝癌类器官细胞球培养的培养基，其特征在于，由基础培养基、表皮生长因子、成纤维生长因子、细胞生长因子、胰岛素生长因子、丙酮酸钠、谷氨酰胺、青霉素、链霉素和血清组成；
其中，各组成成分的含量为：表皮生长因子10-25ng/mL，成纤维生长因子10-25ng/mL，细胞生长因子0.5-2ng/mL，胰岛素生长因子1-3ng/mL，丙酮酸钠1mmol/L，谷氨酰胺2mmol/L，青霉素100U/mL，链霉素100μg/mL和体积分数为10％的血清；
所述基础培养基为DMEM/F12培养基，所述DMEM/F12培养基中加入青霉素和链霉素后，用质量分数为5％的NaHCO3溶液调节PH至7.2；
所述表皮生长因子为重组人表皮生长因子；
所述成纤维生长因子为重组人碱性成纤维细胞生长因子；
所述细胞生长因子为重组人肝细胞生长因子；
所述胰岛素生长因子为重组人胰岛素样生长因子-I。
2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述肝癌类器官细胞为永生化肝癌细胞系、原代肝癌细胞、正常肝细胞转化和衍生自多能性干细胞中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述肝癌类器官细胞球是细胞间聚集形成的细胞球，包括无载体支持下细胞自主聚集形成的细胞球。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的培养基在培养肝癌类器官细胞球中的应用。
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