KR20200004815A

KR20200004815A - 다능성줄기세포 유래 장관 오가노이드의 제작법

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Publication number: KR20200004815A
Application number: KR1020197033665A
Authority: KR
Inventors: 다미히데 마쓰나가; 다카히로 이와오; 다이치 오노자토; 이사무 오가와
Original assignee: 고리츠다이가쿠호징 나고야시리츠다이가쿠
Priority date: 2017-05-09
Filing date: 2018-05-02
Publication date: 2020-01-14
Also published as: KR102581280B1; JPWO2018207714A1; CA3062600A1; JP7174426B2; EP3623469A4; WO2018207714A1; CN110691845A; EP3623469A1; US11859212B2; US20200157507A1

Abstract

다능성줄기세포(pluripotent stem cell)로부터 기능적인 장관(腸管) 오가노이드(organoid)를 제작하는 것을 과제로 한다. (1) 다능성줄기세포를 내배엽 유사 세포로 분화시키는 공정, (2) 공정(1)에서 얻어진 내배엽 유사 세포를 장관 줄기세포 유사 세포로 분화시키는 공정, (3) 공정(2)에서 얻어진 장관 줄기세포 유사 세포를 배양하여, 스페로이드를 형성시키는 공정, 및 (4) 공정(3)에서 형성된 스페로이드를 분화시키고, 장관 오가노이드를 형성시키는 공정으로서, 상피성장인자, BMP 저해제 및 Wnt 시그널 활성화제에 더하여, MEK1/2 저해제, DNA 메틸화 저해제, TGFβ 수용체 저해제 및 γ-세크레타아제 저해제의 존재 하에서 배양을 포함하는 공정에 의해, 다능성줄기세포로부터 장관 오가노이드를 제작한다.

Description

다능성줄기세포 유래 장관 오가노이드의 제작법

본 발명은 다능성줄기세포(pluripotent stem cell) 유래의 장관(腸管) 오가노이드(organoid)를 제작하는 방법 및 그 용도에 관한 것이다. 본 출원은, 2017년 5월 9일자에 출원된 일본특허출원 제2017-093418호에 기초한 우선권을 주장하는 것이며, 상기 특허출원의 전체 내용은은 참조에 의해 원용된다.

소장은 경구 투여된 의약품의 체내 동태를 고려하는 면에서 매우 중요한 장기다. 비임상시험의 단계에 있어서 인간 소장에서의 약물의 동태(흡수, 배설, 대사)를 종합적으로 평가하기 위해서는 초대 소장상피세포의 사용이 바람직하지만, 이는 입수 자체가 곤란하다. 최근, 신규 in vitro 평가계로서, 장관 조직을 모방한 3차원 조직 구조체(오가노이드)가 주목받고 있다. 그러나, 배아줄기세포(embryonic stem cells: ES 세포) 및 ES 세포와 동일한 다분화능과 거의 무한한 증식능을 가지고, 창약(創藥) 연구로의 이용도 기대되고 있는 인공다능성줄기세포(induced pluripotent stem cells: iPS 세포)로부터 분화 유도된 장관 오가노이드는 미숙하며, 약물 동태학적인 기능의 분석은 거의 이루어지지 않고 있다.

또한, 인간 이외의 포유동물은 질환 모델이나 생물의학적 연구에 유용하다. 특히, 창약 연구에 있어서 실험 동물로서 사용되는 게잡이원숭이(cynomolgus monkey)는 인간과 매우 유사한 점이 많고, 약물 대사 효소나 트랜스포터의 아미노산서열은 90∼95 %의 상동성이 인정되고, 기질 특이성이 유사하다. 이 때문에 비임상시험의 단계에 있어서, 게잡이원숭이를 사용하여 in vivo 및 in vitro의 상관성을 확인함으로써, 보다 정확하게 인간을 예측하는 것이 가능하다.

ES 세포나 iPS 세포로부터 2차원(2D) 배양으로 장관 상피세포를 제작한 것(예를 들면, 특허문헌 1, 2를 참조), 및 매트리젤(matrigel) 등을 사용한 3차원(3D) 배양으로 장관 오가노이드를 제작한 것(예를 들면, 특허문헌 3, 4, 비특허문헌 1∼4)이 보고되어 있다.

국제공개 제2014/132933호 팜플렛 국제공개 제2012/060315호 팜플렛 국제공개 제2016/093222호 팜플렛 일본공개특허 제2006-239169호 공보

Drug Metab. Pharmacokinetic Vol.29(1). P.44-51(2014) Nature, Vol.470, P. l05-109(2011) Stem Cells, vol.24, P.2618-2626(2006) Biochem. Biophys. Res. Commun., Vol.391 (1), No.7, P.38-42(2010)

상기한 2D 배양으로부터 얻어지는 장관 상피세포는 장기간의 배양이 곤란하다. 또한, 장관 오가노이드를 형성하는 것이 아닌, 그것을 사용한 평가계는 장관 오가노이드의 경우와 그 구성, 용도, 이용 가치의 점 등에서 상이하다. 한편, 3D 배양에 의해 제작된 장관 오가노이드에 대해서는 그 기능성의 검증이 충분히 이루어져 있지 않고(아마도 미숙한 구조체인 것으로 여겨짐), 즉 그 실용성은 불분명하며, 약물 동태의 분석 등에 이용할 수 있다고 하기 어렵다. 이에 본 발명은, 다능성줄기세포로부터 기능적인(즉, 약물 동태학적인 기능을 가지는) 장관 오가노이드를 제작하는 것을 제1 과제로 하고, 장관 오가노이드의 제작 효율의 향상을 제2 과제로 한다.

상기한 과제를 해결하기 위해 예의(銳意) 검토한 결과, 본 발명자들은 기능적인 장관 오가노이드의 형성에 유효한 인자의 조합을 발견하였다. 형성에 성공한 장관 오가노이드에는 기능적인 타이트 정션(tight junction)이 인정되었고, 배출 트랜스포터의 수송 기능, 약물대사효소활성 등도 확인되었다. 약물 동태학적 기능을 구비한 기능적인 장관 오가노이드가 구축되어 있는 것을 실증한 점에 있어서도, 본 발명자들의 성과는 과거의 보고와 일선을 긋는다. 한편, 배양 방법을 개량함으로써, 장관 오가노이드의 제작 효율의 향상에도 성공했다. 그리고, 신규 조합에 채용한 인자는 모두 저렴하며 로트간 차이가 적은 저분자 화합물이며, 이 특징은, 장관 오가노이드의 제작 비용의 저감에 더하여, 장관 오가노이드의 품질 및 신뢰성의 향상 등을 초래한다.

또한 더 한층의 검토에 의해, 재생의료에 적용할 때 특히 유리한 제작 방법이 발견되었다.

이하의 발명은, 주로, 이상의 성과에 기초한 것이다.

[1] 하기 공정(1)∼공정(4)를 포함하는, 다능성줄기세포로부터 장관 오가노이드를 제작하는 방법:

(1) 다능성줄기세포를 내배엽 유사 세포(endoderm-like cell)로 분화시키는 공정;

(2) 공정(1)에서 얻어진 내배엽 유사 세포를 장관 줄기세포 유사 세포로 분화시키는 공정;

(3) 공정(2)에서 얻어진 장관 줄기세포 유사 세포를 배양하여, 스페로이드를 형성시키는 공정;

(4) 공정(3)에서 형성된 스페로이드를 분화시키고, 장관 오가노이드를 형성시키는 공정으로서, 상피성장인자, BMP 저해제 및 Wnt 시그널 활성화제에 더하여, MEK1/2 저해제, DNA 메틸화 저해제, TGFβ 수용체 저해제 및 γ-세크레타아제 저해제의 존재 하에서의 배양을 포함하는 공정.

[2] 상기 다능성줄기세포가 인공다능성줄기세포 또는 배아줄기세포인, [1]에 기재된 제작 방법.

[3] 상기 다능성줄기세포가 인간 또는 영장류의 세포인, [1] 또는 [2]에 기재된 제작 방법.

[4] 상기 다능성줄기세포가 인간 인공다능성줄기세포이며, 공정(2)가 FGF4와 Wnt 아고니스트의 존재 하에서의 배양을 포함하는, [1]에 기재된 제작 방법.

[5] 상기 인간 인공다능성줄기세포가, 장질환 환자 유래의 인공다능성줄기세포인, [4]에 기재된 제작 방법.

[6] 상기 다능성줄기세포가 게잡이원숭이 인공다능성줄기세포이며, 공정(2)가 FGF2와 GSK-3 저해제의 존재 하에서의 배양을 포함하는, [1]에 기재된 제작 방법.

[7] 공정(3)의 배양에 있어서, 균일한 형상 및 크기의 복수의 웰이 세포 저접착성 또는 세포 비접착성의 배양면에 형성된 배양 용기를 사용하여, 복수의 스페로이드를 형성시키는, [1]∼[6] 중 어느 한 항에 기재된 제작 방법.

[8] BMP 저해제가 Noggin이며, Wnt 시그널 활성화제가 R-spondin-1인, [1]∼[7] 중 어느 한 항에 기재된 제작 방법.

[9] MEK1/2 저해제가 PD98059이며, DNA 메틸화 저해제가 5-아자-2'-데옥시시티딘이며, TGFβ 수용체 저해제가 A-83-01이며, γ-세크레타아제 저해제가 N-[(3,5-디플루오로페닐)아세틸]-L-알라닐-2-페닐-1,1-디메틸에틸에스테르-글리신(N-[(3,5-difluorophenyl)acetyl]-L-alanyl-2-phenyl-1,1-dimethylethyl ester-glycine)인, [1]∼[8] 중 어느 한 항에 기재된 제작 방법.

[10] 수용액 중에 3차원적 그물눈 구조를 형성하는 재료를 첨가한 액체 배지를 공정(4)의 배양에 사용하고, 공정(3)에서 형성시킨 복수의 스페로이드가 함께 부유(浮遊) 배양되는, [1]∼[9] 중 어느 한항에 기재된 제작 방법.

[11] 상기 재료가 고분자 겔 및 다당으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 재료인, [10]에 기재된 제작 방법.

[12] 상기 재료가 탈(脫)아실화젤란검을 포함하는, [10]에 기재된 제작 방법.

[13] 공정(4)의 배양 기간이 12일간∼36일간인, [1]∼[12] 중 어느 한 항에 기재된 제작 방법.

[14] 공정(4)가, 하기 공정(4-1)과 공정(4-2)을 포함하는, [1]∼[12] 중 어느 한 항에 기재된 제작 방법:

(4-1) 상피성장인자, BMP 저해제 및 Wnt 시그널 활성화제의 존재 하에서 배양하는 공정;

(4-2) 상피성장인자, BMP 저해제 및 Wnt 시그널 활성화제에 더하여, MEK1/2 저해제, DNA 메틸화 저해제, TGFβ 수용체 저해제 및 γ-세크레타아제 저해제의 존재 하에서 배양하는 공정.

[15] 공정(4-1)의 배양 기간이 3일간∼15일간이며, 공정(4-2)의 배양 기간이 3일간∼21일간인, [14]에 기재된 제작 방법.

[16] [1]∼[15] 중 어느 한 항에 기재된 제작 방법에 의해 얻어진 장관 오가노이드.

[17] [16]에 기재된 장관 오가노이드를 사용한, 피험물질의 체내 동태 또는 독성을 평가하는 방법.

[18] 상기 체내 동태가, 대사, 흡수성, 막투과성, 약물 상호 작용, 약물 대사 효소의 유도, 또는 약물 트랜스포터의 유도인, [17]에 기재된 평가 방법.

[19] 하기 공정(I) 및 공정(II)를 포함하는, [18]에 기재된 방법:

(I) [16]에 기재된 장관 오가노이드에 피험물질을 접촉시키는 공정;

(II) 피험물질의 대사, 흡수성, 막투과성, 약물 상호 작용, 약물 대사 효소의 유도, 또는 약물 트랜스포터의 유도, 혹은 독성을 측정·평가하는 공정.

[20] [16]에 기재된 장관 오가노이드를 포함하는, 이식(移植) 재료.

도 1a는 인간 및 게잡이원숭이 iPS 세포로부터 장관 오가노이드로의 분화에 대한 저분자 화합물의 효과. 평균±S.D.(n=3)로 데이터를 나타내었다. 콘트롤은 저분자 화합물 비첨가군. 소장의 값을 기준(소장=1)으로 했다.
도 1b는 도 1의 계속이다.
도 1c는 도 1의 계속이다.
도 1d는 도 1의 계속이다.
도 1e는 도 1의 계속이다.
도 1f는 도 1의 계속이다.
도 1g는 도 1의 계속이다.
도 2는 저분자 화합물의 신규 조합에 의해 분화 유도한 인간 및 게잡이원숭이 장관 오가노이드의 형태학적 관찰을 나타낸다. (A), (B): 명시야(明視野) 관찰. 스케일 바 500㎛. (C), (D): 투과형 전자현미경에 의한 미세융모(MV: 흑색화살표 끝), 타이트 정션(TJ: 백색화살표 끝)의 관찰. 스케일 바 1㎛. (E)-(G): HE 염색. 스케일 바 100㎛. (H)-(J): 알시안블루 염색(흑색화살표). 스케일 바 100㎛.
도 3은 저분자 화합물의 신규 조합에 의해 분화 유도한 인간 및 게잡이원숭이 장관 오가노이드의 면역형광염색을 나타낸다. (A)-(C): Villin/OLFM4. (D)-(F): E-cad(상피세포접착인자)/MUC2. (G)-(I): E-cad/CHGA(Chromogranin A). (J)-(L): E-cad/Lyso(Lysozyme). (M)-(O): Vim(Vimentin: 섬유아세포 마커)/α-SMA(평활근 마커). DAPI: 핵염색. 스케일 바 50㎛.
도 4는 저분자 화합물의 신규 조합에 의해 분화 유도한 인간 및 게잡이원숭이 장관 오가노이드의 기능적인 타이트 정션의 형성을 나타낸다. (A)-(C): Occludin의 면역형광염색. DAPI: 핵염색. 스케일 바 50㎛. (D)-(G) FITC-dextran 4000(FD-4)에 의한 업테이크 시험. FD-4(1mg/mL) 37℃, 1시간 인큐베이션. (D), (E): 명시야 관찰. (F), (G): FD-4의 형광관찰. 스케일 바 100㎛.
도 5는 저분자 화합물의 신규 조합에 의해 분화 유도한 인간 및 게잡이원숭이 장관 오가노이드의 트랜스포터 면역염색. (A)-(C): SLC15A 1/PEPT1의 면역형광염색. (D)-(F): ABCB1/MDR1의 면역형광염색. DAPI: 핵염색. (A)-(E) 스케일 바 50㎛. (F) 스케일 바 100㎛.
도 6은 저분자 화합물의 신규 조합에 의해 분화 유도한 인간 장관 오가노이드의 로다민 123을 사용한 ABCB1/MDR1의 기능 평가를 나타낸다. ABCB1/MDR1의 저해제인 베라파밀(100μmol/L)의 비존재 하(A, B)와 존재 하(C, D)에서 로다민 123(10μmol/L)을 첨가하고, 37℃에서 1시간 인큐베이트했다. 스케일 바 100㎛.
도 7은 저분자 화합물의 신규 조합에 의해 분화 유도한 인간 및 게잡이원숭이 장관 오가노이드의 CYP3A 유도능을 나타낸다. 평균±S.D.(n=3); 콘트롤; 유도제 비첨가군. **P<0.01, *P<0.05 vs 콘트롤군(인간). †P<0.05 vs 콘트롤군(게잡이원숭이).
도 8은 저분자 화합물의 신규 조합에 의해 분화 유도한 게잡이원숭이 장관 오가노이드의 CYP3A8 대사활성을 나타낸다. 평균±S.D.(n=4); 콘트롤; 케토코나졸 비첨가군. †P<0.05 vs 콘트롤군(게잡이원숭이).
도 9는 인공다능성줄기세포로부터 장관 오가노이드로의 신규 분화 프로토콜을 나타낸다. (A) 인간 iPS 세포로부터 장관 오가노이드로의 분화 프로토콜. (B) 게잡이원숭이 iPS 세포로부터 장관 오가노이드로의 분화 프로토콜. 저분자 화합물의 조합으로서, 이하의 2종류를 비교·검토했다. A/PD/5-aza: A-83-01(0.5μmol/L), PD98059(20μmol/L), 5-아자-2'-데옥시시티딘(5μmol/L) 첨가군. A/PD/5-aza/DAPT: A-83-01(0.5μmol/L), PD98059(20μmol/L), 5-아자-2'-데옥시시티딘(5μmol/L), DAPT(5μmol/L) 첨가군.
도 10a는 인간 iPS 세포로부터 장관 오가노이드로의 분화에 대한 다당류 폴리머(FP001, FP003)의 효과. 평균±S.D.(n=3)로 데이터를 나타내었다. 소장의 값을 기준(소장=1)으로 했다. *P<0.05, **P<0.01 vs 매트리젤
도 10b는 도 10의 계속이다.
도 10c는 도 10의 계속이다.
도 10d는 도 10의 계속이다.
도 11은 다당류 폴리머(FP001, FP003)를 사용하여 분화 유도한 인간 장관 오가노이드의 형태학적 관찰을 나타낸다. (A)-(C): 명시야 관찰. 스케일 바 500㎛. (D)-(F): HE 염색. 스케일 바 100㎛.
도 12는 다당류 폴리머(FP001, FP003)를 사용하여 분화 유도한 인간 장관 오가노이드의 면역형광염색을 나타낸다. (A)-(C): Villin/OLFM4. (D)-(F): CDX2(장관계보의 세포)/MUC2. (G)-(I): E-cad(상피세포접착인자)/CHGA(Chromogranin A). (J)-(L): Ki67(증식세포 마커)/LGR5(줄기세포 마커). (M)-(O): E-cad/Lyso(Lysozyme). (P)-(R): Vim(Vimentin: 섬유아세포 마커)/α-SMA(평활근 마커). (S)-(U): Occludin(타이트 정션). (V)-(X): ABCG2/BCRP(배출 트랜스포터). DAPI: 핵염색. 스케일 바 50㎛.
도 13은 다당류 폴리머(FP001, FP003)를 사용하여 분화 유도한 인간 장관 오가노이드의 로다민 123을 사용한 ABCB1/MDR1의 기능 평가를 나타낸다. ABCB1/MDR1의 저해제로서 베라파밀(100μmol/L)을 사용했다. 평균± S.D.(n=3)로 데이터를 나타내었다. 콘트롤군(저해제 비첨가)의 값을 기준(콘트롤군=1)으로 했다. *P<0.05 vs 콘트롤군.
도 14는 다당류 폴리머(FP001, FP003)를 사용하여 분화 유도한 인간 장관 오가노이드의 훼스트(hoechst) 33342를 사용한 ABCG2/BCRP의 기능 평가를 나타낸다. ABCG2/BCRP의 저해제로서 Ko143(20μmol/L)을 사용했다. 평균±S.D.(n=3)로 데이터를 나타내었다. 콘트롤군(저해제 비첨가)의 값을 기준(콘트롤군=1)으로 했다. *P<0.05 vs 콘트롤군.
도 15는 다당류 폴리머(FP001, FP003)를 사용하여 분화 유도한 인간 장관 오가노이드의 CYP3A4 유도능을 나타낸다. (A) 평균±S.D.(n=3)로 데이터를 나타내었다. 콘트롤; 유도제 비첨가군. **P<0.01, *P<0.05 vs 콘트롤군. 콘트롤군의 값을 기준(콘트롤군=1)으로 했다. (B) 평균±S.D.(n=4)로 데이터를 나타내었다. 콘트롤; 유도제 비첨가군. **P<0.01, *P<0.05 vs 콘트롤군.
도 16은 다당류 폴리머를 사용하여 분화 유도한 인간 장관 오가노이드의 CYP3A4 대사 활성을 나타낸다. 평균±S.D.(n=4)로 데이터를 나타내었다. 콘트롤; 케토코나졸 비첨가군. N.D.; 검출되지 않음. **P<0.01, *P<0.05 vs 콘트롤군.

1. 장관 오가노이드를 제작하는 방법

본 발명은 다능성줄기세포로부터 장관 오가노이드를 제작하는 방법(이하, 「본 발명의 제작 방법」이라고도 함)에 관한 것이다. 본 발명에 의하면, 생체의 장관조직과 유사한 특성을 나타내는(장관조직을 모방한) 3차원 조직구조체인 장관 오가노이드가 얻어진다.

「다능성줄기세포」란, 생체를 구성하는 모든 세포로 분화될 수 있는 능력(분화 다능성)과, 세포분열을 거쳐 자기와 동일한 분화능을 가지는 딸세포를 만들어 내는 능력(자기복제능)을 겸비하는 세포를 일컫는다. 분화 다능성은, 평가 대상의 세포를, 누드마우스에 이식하고, 3배엽(외배엽, 중배엽, 내배엽)의 각각의 세포를 포함하는 데라토마형성의 유무를 시험하는 것에 의해, 평가할 수 있다.

다능성줄기세포로서, 배아줄기세포(ES 세포), 배아생식세포(EG 세포), 인공다능성줄기세포(iPS 세포) 등을 예로 들 수 있지만, 분화 다능성 및 자기복제능을 겸비하는 세포라면, 이것으로 한정되지 않는다. 바람직하게는 ES 세포 또는 iPS 세포를 사용한다. 더욱 바람직하게는 iPS 세포를 사용한다. 다능성줄기세포는, 바람직하게는 포유동물(예를 들면, 인간이나 침팬지, 게잡이원숭이 등의 영장류, 마우스나 래트(rat) 등의 설치류)의 세포, 특히 바람직하게는 인간의 세포이다.

ES 세포는, 예를 들면, 착상 이전의 초기배(初期胚), 상기 초기배를 구성하는 내부세포괴(細胞塊), 단일할구 등을 배양함으로써 수립할 수 있다(Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1994); Thomson, J. A. et al., Science, 282, 1145-1147(1998)). 초기배로서, 체세포의 핵을 핵이식함으로써 제작된 초기배를 사용할 수도 있다(Wilmut et al. (Nature, 385, 810(1997)), Cibelli et al. (Science, 280, 1256(1998)), 이리야(入谷) 아키라(明) 등(단백질핵산효소, 44, 892(1999)), Baguisi et al. (Nature Biotechnology, 17, 456(1999)), Wakayama et al. (Nature, 394, 369 (1998); Nature Genetics, 22, 127 (1999); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 14984(1999)), Rideout III et al. (Nature Genetics, 24, 109(2000), Tachibana et al. (Human Embryonic Stem Cells Derived by Somatic Cell Nuclear Transfer, Cell, 153, 1228-1238(2013)). 초기좌로서, 단위발생배를 사용할 수도 있다(Kim et al. (Science, 315, 482-486(2007)), Nakajima et al. (Stem Cells, 25, 983-985(2007)), Kim et al. (Cell Stem Cell, 1, 346-352(2007)), Revazova et al. (Cloning Stem Cells, 9, 432-449(2007)), Revazova et al. (Cloning Stem Cells, 10, 11-24(2008)). 상기한 논문 외에, ES 세포의 제작에 대해서는 Strelchenko N., et al. Reprod Biomed Online.9: 623-629, 2004; Klimanskaya I., et al. Nature 444: 481-485, 2006; Chung Y., et al. Cell Stem Cell 2: 113-117, 2008; Zhang X., et al Stem Cells 24: 2669-2676, 2006; Wassarman, P. M. et al. Methods in Enzymology, Vol.365, 2003 등이 참고가 된다. 그리고, ES 세포와 체세포의 세포융합에 의해 얻어지는 융합 ES 세포도, 본 발명의 제작 방법에 사용되는 배아줄기세포에 포함된다.

ES 세포 중에는, 보존기관으로부터 입수 가능한 것, 혹은 시판되고 있는 것도 있다. 예를 들면, 인간 ES 세포에 대해서는 교토대학 재생의과학연구소(예를 들면, KhES-1, KhES-2 및 KhES-3), WiCell Research Institute, ESI BIO 등으로부터 입수 가능하다.

ES 세포는, 시원생식세포를, LIF, bFGF, SCF의 존재 하에서 배양하는 것 등에 의해 수립할 수 있다(Matsui et al., Cell, 70, 841-847(1992), Shamblott et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95(23), 13726-13731(1998), Turnpenny et al., Stem Cells, 21(5), 598-609, (2003)).

「인공다능성줄기세포(iPS 세포)」는, 초기화인자의 도입 등에 의해 체세포를 리프로그래밍함으로써 제작되는, 다능성(다분화능)과 증식능을 가지는 세포이다. 인공다능성줄기세포는 ES 세포에 가까운 성질을 나타낸다. iPS 세포의 제작에 사용하는 체세포는 특별히 한정되지 않고, 분화된 체세포라도 되고, 미분화의 줄기세포라도 된다. 또한, 그 유래도 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 포유동물(예를 들면, 인간이나 침팬지, 게잡이원숭이 등의 영장류, 마우스나 래트 등의 설치류)의 체세포, 특히 바람직하게는 인간의 체세포를 사용한다. iPS 세포는, 지금까지 보고된 각종 방법에 의해 제작할 수 있다. 또한, 이후 개발되는 iPS 세포 제작법을 적용하는 것도 당연히 상정(想定)된다.

장질환 환자 유래의 iPS 세포(환자의 체세포로부터 조제한 iPS 세포)를 사용하기로 하면, 질환 특이적인 장관 오가노이드를 제작하는 것이 가능하게 된다. 상기 iPS 세포는, 환자로부터 채취된 체세포(예를 들면, 피부, 혈액, 단핵구 등)로부터 조제된다. 여기서의 장질환의 예로서 난치성 염증성 장질환(크론병, 궤양성 대 장염), 폴립, 대장암, 약제성 장염 등을 들 수 있다. 질환 특이적인 장관 오가노이드는 장관 병태 모델로서 유용하며, 약제 평가계로의 이용이나, 질환의 기전(발증, 병태 형성, 진전에 관한 분자 메커니즘 등)의 규명으로의 공헌을 기대할 수 있다.

iPS 세포제작법의 가장 기본적인 방법은, 전사인자인 Oct3/4, Sox2, Klf4 및 c-Myc의 4개 인자를, 바이러스를 이용하여 세포에 도입하는 방법이다(Takahashi K, Yamanaka S: Cell 126(4), 663-676, 2006; Takahashi, K, et al: Cell 131(5), 861-72, 2007). 인간 iPS 세포에 대해서는 Oct4, Sox2, Lin28 및 Nonog의 4개 인자의 도입에 의한 수립의 보고가 있다(Yu J, et al: Science 318(5858), 1917-1920, 2007). c-Myc를 제외한 3개 인자(Nakagawa M, et al: Nat. Biotechnol.26(1), 101-106, 2008), Oct3/4 및 Klf4의 2개 인자(Kim J B, et al: Nature 454(7204), 646-650, 2008), 혹은 Oct3/4만(Kim J B, et al: Cell 136(3), 411-419, 2009)의 도입에 의한 iPS 세포의 수립도 보고되어 있다. 또한, 유전자의 발현 산물인 단백질을 세포에 도입하는 방법(Zhou H, Wu S, Joo JY, et al: Cell Stem Cell 4, 381-384, 2009; Kim D, Kim CH, Moon JI, et al: Cell Stem Cell 4, 472-476, 2009)도 보고되어 있다. 한편, 히스톤 메틸기전이효소 G9a에 대한 저해제 BIX-01294이나 히스톤 탈아세틸화 효소저해제 발프로산(VPA) 혹은 BayK8644 등을 사용함으로써 제작 효율의 향상이나 도입하는 인자의 저감 등이 가능한 것에 대한 보고도 있다(Huangfu D, et al: Nat. Biotechnol.26(7), 795-797, 2008; Huangfu D, et al: Nat. Biotechnol.26(11), 1269-1275, 2008; Silva J, et al: PLoS. Biol.6 (10), e 253, 2008). 유전자 도입법에 대해서도 검토가 진행되어, 레트로바이러스 외에, 렌티바이러스(Yu J, et al: Science 318(5858), 1917-1920, 2007), 아데노바이러스(Stadtfeld M, et al: Science 322(5903), 945-949, 2008), 플라스미드(Okita K, et al: Science 322(5903), 949-953, 2008), 트랜스포존 벡터(Woltjen K, Michael IP, Mohseni P, et al: Nature 458, 766-770, 2009; Kaji K, Norrby K, Pac a A, et al: Nature 458, 771-775, 2009; Yusa K, Rad R, Takeda J, et al: Nat Methods 6, 363-369, 2009), 혹은 에피소말 벡터(Yu J, Hu K, Smuga-Otto K, Tian S, et al: Science 324, 797-801, 2009)를 유전자 도입에 이용한 기술이 개발되어 있다.

iPS 세포로의 형질 전환, 즉 초기화(리프로그래밍)가 생긴 세포는 Fbxo15, Nanog, Oct/4, Fgf-4, Esg-1 및 Cript 등의 다능성줄기세포 마커(미분화 마커)의 발현 등을 지표로서 선택할 수 있다. 선택된 세포를 iPS 세포로서 회수한다.

iPS 세포는, 예를 들면, 국립대학법인 교토대학 또는 독립행정법인 이화학연구소 바이오리소스센터로부터 제공을 받을 수도 있다.

본 명세서에 있어서 「분화시킨다」, 「유도한다」의 용어는, 특정한 세포 계보를 따라 분화하도록 작용시키는 것을 미한다. 본 발명에서는, 다능성줄기세포를 장관 오가노이드로 분화시킨다. 본 발명의 제작 방법은 대별하여 4단계의 배양 공정, 즉 (1) 다능성줄기세포를 내배엽 유사 세포로 분화시키는 공정(공정(1))과, 공정(1)에서 얻어진 내배엽 유사 세포를 장관 줄기세포 유사 세포로 분화시키는 공정(공정(2))과, 공정(2)에서 얻어진 장관 줄기세포 유사 세포를 배양하여, 스페로이드를 형성시키는 공정(공정(3))과, 공정(3)에서 형성된 스페로이드를 분화시키고, 장관 오가노이드를 형성시키는 공정으로서, 상피성장인자, BMP 저해제 및 Wnt 시그널 활성화제에 더하여, MEK1/2 저해제, DNA 메틸화 저해제, TGFβ 수용체 저해제 및 γ-세크레타아제 저해제의 존재 하에서 배양을 포함하는 공정(공정(4))을 포함한다. 이하, 각 공정의 상세를 설명한다.

<공정(1) 내배엽 유사 세포로의 분화>

이 공정에서는 다능성줄기세포를 배양하고, 내배엽 유사 세포로 분화시킨다. 바꾸어 말하면, 내배엽 유사 세포로의 분화를 유도하는 조건 하에서 다능성줄기세포를 배양한다. 다능성줄기세포가 내배엽 유사 세포로 분화되는 한, 배양 조건은 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 통상적인 방법에 따라, 액티빈A를 첨가한 배지에서 배양한다. 이 경우에, 배지 중의 액티빈A의 농도를 예를 들면 10ng/mL∼200ng/mL, 바람직하게는 20ng/mL∼150ng/mL로 한다. 세포의 증식율이나 유지 등의 관점에서, 배지에 혈청 또는 혈청대체물(Knockout serum replacement(KSR) 등)을 첨가하는 것이 바람직하다. 혈청은 우태아 혈청으로 한정되지 않고, 인간 혈청이나 양 혈청 등을 사용할 수도 있다. 혈청 또는 혈청대체물의 첨가량은, 예를 들면, 0.1%(v/v)∼10%(v/v)이다.

Wnt/β-카테닌 시그널 경로의 저해제 (예를 들면, 헥사클로로펜, 케르세틴, Wnt 리간드인 Wnt3a)를 배지에 첨가하고, 내배엽 유사 세포로의 분화의 촉진을 도모해도 된다.

공정(1)으로서 2단계의 배양을 행하도록 해도 된다. 1단계째의 배양에서는 비교적 저농도의 혈청(예를 들면, 0.1%(v/v)∼1%(v/v))을 첨가한 배지에서 행하고, 계속되는 2단계째의 배양에서는 1단계째의 배양보다 혈청 농도를 높인 배지(혈청 농도를 예를 들면 1%(v/v)∼10%(v/v))에서 행한다. 이와 같이 2단계의 배양을 채용하는 것은, 1단계째의 배양에 의해 미분화 세포의 증식을 억제하고, 계속되는 2단계째에 의해 분화된 세포를 증식시키는 점에서 바람직하다.

공정(1)의 기간(배양 기간)은, 예를 들면, 1일간∼10일간, 바람직하게는 2일간∼7일간이다. 공정(1)으로서 2단계의 배양을 채용하는 경우에는 1단계째의 배양 기간을 예를 들면 1일간∼7일간, 바람직하게는 2일간∼5일간으로 하고, 2단계째의 배양 기간을 예를 들면 1일간∼6일간, 바람직하게는 1일간∼4일간으로 한다.

<공정(2) 장관 줄기세포 유사 세포로의 분화>

이 공정에서는, 공정(1)에서 얻어진 내배엽 유사 세포를 배양하고, 장관 줄기세포 유사 세포로 분화시킨다. 바꾸어 말하면, 장관 줄기세포 유사 세포로의 분화를 유도하는 조건 하에서 내배엽세포를 배양한다. 내배엽 유사 세포가 장관 줄기세포 유사 세포로 분화되는 한, 배양 조건은 특별히 한정되지 않는다. 공정(1)에 제공하는 다능성줄기세포로서 인간 세포를 사용한 경우에는, 바람직하게는, FGF4(섬유아세포 증식인자 4)과 Wnt 아고니스트(예를 들면, Wnt3a, BML-284, 2-Amino-4-(3,4-(methylenedioxy)benzylamino)-6-(3-methoxyphenyl)pyrimidine 등)의 존재 하에서 배양을 행한다. FGF4로서 바람직하게는 인간 FGF4(예를 들면, 인간 재조합 FGF4)를 사용한다. 한편, 공정(1)에 제공하는 다능성줄기세포로서 게잡이원숭이 세포나 붉은털원숭이 세포, 침팬지 세포 등을 사용한 경우에는, 바람직하게는, FGF2(섬유아세포 증식인자 2)과 GSK-3 저해제(예를 들면, CHIR99021, CHIR98014, BIO, SB415286, SB216763, TWS119, A1070722 등)의 존재 하에서 배양을 행한다. FGF2로서, 예를 들면, 인간 FGF2(예를 들면, 인간 재조합 FGF2)를 사용한다.

전형적으로는, 공정(1)을 거쳐 얻어진 세포 집단 또는 그 일부를, 선별하지 않고 공정(2)에 제공한다. 한편, 공정(1)을 거쳐 얻어진 세포 집단 중에서 내배엽 유사 세포를 선별한 후에 공정(2)을 실시해도 된다. 내배엽 유사 세포의 선별은, 예를 들면, 세포 표면 마커를 지표로 하여 플로우 사이토미터(셀 소터)에서 행하면 된다.

「FGF4와 Wnt 아고니스트의 존재 하」는, FGF4와 Wnt 아고니스트가 배지 중에 첨가된 조건과 동일한 의미이다. 따라서, FGF4와 Wnt 아고니스트의 존재 하에서의 배양을 행하기 위해서는, FGF4와 Wnt 아고니스트가 첨가된 배지를 사용하면 된다. FGF4의 첨가 농도의 예를 나타내면 100ng/mL∼5μg/mL, 바람직하게는 300ng/mL∼1μg/mL이다. 또한, Wnt 아고니스트의 첨가 농도의 예(Wnt3a의 경우)를 나타내면, 100ng/mL∼5μg/mL, 바람직하게는 300ng/mL∼1μg/mL이다.

마찬가지로, 「FGF2와 GSK-3 저해제의 존재 하」는, FGF2와 GSK-3 저해제가 배지중에 첨가된 조건과 동일한 의미이다. 따라서, FGF2와 GSK-3 저해제의 존재 하에서 배양을 행하기 위해서는, FGF2와 GSK-3 저해제가 첨가된 배지를 사용하면 된다. FGF2의 첨가 농도의 예를 나타내면 50ng/mL∼2.5μg/mL, 바람직하게는 150ng/mL∼500ng/mL이다. 또한, GSK-3 저해제의 첨가 농도의 예(CHIR99021의 경우)를 나타내면, 600㎚ol/L∼60μmol/L, 바람직하게는 1μmol/L∼20μmol/L이다.

그리고, 예시한 화합물, 즉, Wnt3a, CHIR99021과는 상이한 화합물을 사용하는 경우의 첨가 농도에 대해서는, 사용하는 화합물의 특성과, 예시한 화합물의 특성의 상이(특히 활성의 상이)를 고려하면, 당업자라면 상기한 농도 범위에 준하여 설정할 수 있다. 또한, 설정한 농도 범위가 적절한지의 여부는, 후술하는 실시예에 준한 예비 실험에 의해 확인할 수 있다.

공정(2)의 기간(배양 기간)은, 예를 들면 2일간∼10일간, 바람직하게는 3일간∼7일간이다. 상기한 배양 기간이 지나치게 짧으면, 기대되는 효과(분화 효율의 상승, 장관 줄기세포로서의 기능 획득 촉진)를 충분히 얻을 수 없다. 한편, 상기 배양 기간이 길면, 분화 효율의 저하를 일으킨다.

장관 줄기세포 유사 세포로 분화된 것은, 예를 들면, 장관 줄기세포 마커의 발현을 지표로 하여 판정 내지 평가할 수 있다. 장관 줄기세포 마커의 예를 나타내면, 류신-리치 리피트(leucine-rich repeat)를 포함하는 G단백질 공역 수용체 5(LGR5), 에프린 B2 수용체(EphB2)이다.

<공정(3) 스페로이드의 형성>

이 공정에서는, 공정(2)에서 얻어진 장관 줄기세포 유사 세포를 배양하여, 스페로이드를 형성시킨다. 스페로이드를 형성시키기 위해서는 부유 배양이 적합하다. 부유 배양에서는, 통상, 세포 저접착성 또는 세포 비접착성의 배양면(예를 들면, 폴리머 재료나 하이드로겔 등의 처리/결합에 의해 세포 저접착성/세포 비접착성이 부여된 배양면)을 구비하는 배양 용기가 사용되며, 배양면으로부터 이격된 상태(즉 부유 상태)에서 세포를 배양한다. 부유 배양에 사용하는 배양 용기는 특별히 한정되지 않고, 예를 들면, 디시(dish), 플라스크, 멀티웰플레이트, 튜브, 트레이, 배양 백 등을 사용할 수 있다. 바람직하게는, 세포 저접착성 또는 세포 비접착성의 배양면에 균일한 형상 및 크기의 복수의 웰이 형성된 배양 용기(일반적으로 패턴 플레이트라고 불리운다. 구체예로서, AGC테크노글라스주식회사가 제공하는EZSPHERE(등록상표), 주식회사크라레가 제공하는 Elplasia 등을 들 수 있다.)를 사용하여, 복수의 스페로이드를 형성시킨다. 이와 같이 하면, 스페로이드를 효율적으로 형성시킬 수 있고, 나아가서는 장관 오가노이드의 제작 효율이 향상된다.

부유 배양 시에는, 배양면에 대한 비접착 상태를 유지 가능한 한, 세포/세포괴를 정치(靜置) 배양해도 되고, 선회(旋回) 배양이나 진탕 배양해도 된다. 바람직하게는, 여기서의 부유 배양을 정치배양에 의해 행한다. 정치 배양은 특별한 장치가 불필요하고, 세포로의 충격 내지 데미지도 적은 것이 기대되고, 배양액의 양도 적게 할 수 있는 것 등, 많은 이점을 가진다.

스페로이드를 형성 가능하다면, 배양 조건은 특별히 한정되지 않는다. 전형적으로는, 줄기세포성을 유지하면서 스페로이드를 형성시키기 위하여, 상피성장인자(EGF), BMP 저해제 및 Wnt 시그널 활성화제의 존재 하, 즉, 이들 성분이 첨가된 배지를 사용하여 부유 배양한다.

상피성장인자를 사용함으로써, 세포 증식을 촉진시키는 효과를 기대할 수 있다. 또한, BMP 저해제를 사용함으로써, 줄기세포의 분화를 억제하여, 줄기세포성을 유지하는 효과를 기대할 수 있다. Wnt 시그널 활성화제에는 줄기세포의 증식과 줄기세포성을 유지하는 효과를 기대할 수 있다.

BMP 저해제로서 예를 들면 Noggin을 사용할 수 있다. 또한, Wnt 시그널 활성화제로서 예를 들면 R-spondin-1을 사용할 수 있다.

상피성장인자의 첨가 농도의 예를 나타내면, 10ng/mL∼500ng/mL, 바람직하게는 50ng/mL∼200ng/mL이다. BMP 저해제의 첨가 농도의 예(Noggin의 경우)를 나타내면 10ng/mL∼500ng/mL, 바람직하게는 50ng/mL∼200ng/mL이다. 마찬가지로, Wnt 시그널 활성화제의 첨가 농도의 예(R-spondin-1의 경우)를 나타내면 10ng/mL∼1000ng/mL, 바람직하게는 50ng/mL∼500g/mL이다.

그리고, 예시한 화합물, 즉 Noggin, R-spondin-1와는 상이한 화합물을 사용하는 경우의 첨가 농도에 대해서는, 사용하는 화합물의 특성과, 예시한 화합물의 특성의 상이(특히 활성의 상이)를 고려하면, 당업자라면 상기한 농도 범위에 준하여 설정할 수 있다. 또한, 설정한 농도 범위가 적절한지의 여부는, 후술하는 실시예에 준한 예비 실험에 의해 확인할 수 있다.

공정(3)의 기간(배양 기간)은 예를 들면 1일간∼10일간, 바람직하게는 2일간∼7일간이다. 상기 배양 기간이 지나치게 짧으면, 충분한 크기의 스페로이드가 형성되지 않는다. 한편, 상기 배양 기간이 길면, 필요 이상으로 스페로이드가 커지고, 내부의 세포가 네크로시스를 일으킬 우려가 있다. 바람직하게는, 직경 100㎛∼200㎛ 정도의 스페로이드를 형성시킨다. 예를 들면, 직경 400∼500 ㎛, 깊이 100∼200 ㎛의 웰이 균일하게 형성된 패턴 플레이트의 사용에 의해, 상기한 사이즈의 스페로이드를 형성시킬 수 있다.

<공정(4) 장관 오가노이드의 형성>

이 공정에서는, 공정(3)에서 형성된 스페로이드를 분화시키고, 장관 오가노이드를 형성시킨다. 이 목적을 위하여, 상피성장인자, BMP 저해제 및 Wnt 시그널 활성화제에 더하여, MEK1/2 저해제, DNA 메틸화 저해제, TGFβ 수용체 저해제 및 γ-세크레타아제 저해제의 존재 하에서 배양을 행한다. MEK1/2 저해제, DNA 메틸화 저해제, TGFβ 수용체 저해제 및 γ-세크레타아제 저해제의 조합을 사용하는 점은 본 발명에 있어서 특히 특징적이며, 분화 유도 효율의 향상, 장관 오가노이드의 성숙화의 촉진에 기여한다.

이 공정의 배양에 사용하는 인자 중, 상피성장인자, BMP 저해제 및 Wnt 시그널 활성화제의 구체예나 첨가 농도 등에 대해서는 공정(3)의 경우와 동일하므로, 그 설명을 생략한다.

MEK1/2 저해제로서 PD98059, PD184352, PD184161, PD0325901, U0126, MEK inhibitor I, MEK inhibitor II, MEK1/2 inhibitor II, SL327을 예로 들 수 있다. 마찬가지로, DNA 메틸화 저해제로서 5-아자-2'-데옥시시티딘, 5-아자시티딘, RG108, 제불라린(Zebularine)을 예로 들 수 있다. TGFβ 수용체 저해제에 대해서는, 바람직하게는, TGF-β수용체 ALK4, ALK5, ALK7 중 1개 이상에 대하여 저해 활성을 나타낸 것을 사용하면 된다. 예를 들면, A-83-01, SB431542, SB-505124, SB525334, D4476, ALK5 inhibitor, LY2157299, LY364947, GW788388, RepSox가 상기한 조건을 만족시킨다. γ-세크레타아제 저해제의 예를 나타내면, N-[(3,5-difluorophenyl)acetyl]-L-alanyl-2-phenyl-1,1-dimethylethyl ester-glycine (DAPT), L-685,458, Compound E(CAS 209986-17-4), (R)-Flurbiprofen, BMS299897, JLK6, LY-411575, R04929097, MK-0752, SCP0004, SCP0025, gamma-Secretase Inhibitor XI, gamma-Secretase Inhibitor XVI, gamma-Secretase Inhibitor I, gamma-Secretase Inhibitor VII, Semagacestat (LY450139), gamma-Secretase Inhibitor III, Compound 34, BMS-708163, Compound W, YO-01027(Dibenzazepine), Avagacestat(BMS-708163)이다.

MEK1/2 저해제의 첨가 농도의 예(PD98059의 경우)를 나타내면 4μM∼100μM, 바람직하게는 10∼40 μM이다. 동일하게 DNA 메틸화 저해제의 첨가 농도의 예(5-아자-2'-데옥시시티딘의 경우)를 나타내면, 1μM∼25μM, 바람직하게는 2.5μM∼10μM이며, TGFβ 수용체 저해제의 첨가 농도의 예(A-83-01의 경우)를 나타내면 0.1μM∼2.5μM, 바람직하게는 0.2μM∼1μM이며, γ-세크레타아제 저해제의 첨가 농도의 예(DAPT의 경우)를 나타내면 1nM∼20μM, 바람직하게는 0.1μM∼10μM이다.

그리고, 예시한 화합물, 즉 PD98059, 5-아자-2'-데옥시시티딘, A-83-01, DAPT와는 상이한 화합물을 사용하는 경우의 첨가 농도에 대해서는, 사용하는 화합물의 특성과, 예시한 화합물의 특성의 상이(특히 활성의 상이)를 고려하면, 당업자라면 상기한 농도 범위에 준하여 설정할 수 있다. 또한, 설정한 농도 범위가 적절한지의 여부는, 후술하는 실시예에 준한 예비 실험에 의해 확인할 수 있다.

스페로이드로부터 장관 오가노이드를 형성시키기 위해서, 공정(4)의 배양은 부유 배양으로 한다. 여기서의 부유 배양에는, 바람직하게는, 수용액 중에 3차원적 그물눈 구조를 형성하는 재료를 첨가한 액체 배지를 사용하고, 공정(3)에서 형성시킨 복수의 스페로이드를 함께(즉, 하나의 배양 용기 내에 복수의 스페로이드가 병존한 상태에서) 부유 배양한다. 즉, 바람직한 태양에서는, 공정(3)에서 형성시킨 스페로이드의 일부(단 2개 이상) 또는 모두가, 특징적인 액체 배지를 사용한 부유 배양에 제공되게 된다.

수용액 중에 3차원적 그물눈 구조를 형성하는 재료(이하, 「점성 재료」라고 함)를 사용함으로써, 그물눈 구조에 스페로이드가 포착 내지 포획되고, 혹은 배지의 점성이 높아져서 스페로이드의 동작이 제한되어, 스페로이드의 회합이나 응집을 방지할 수 있다. 따라서, 복수의 스페로이드를 함께 부유 배양할 수 있어, 효율적인 장관 오가노이드의 형성이 가능하게 된다.

점성 재료로서, 예를 들면, 고분자 겔, 다당을 사용할 수 있다. 고분자 겔의 예는, 콜라겐, 고분자 하이드로겔, 매트리젤^TM(통상의 매트리젤, 성장 인자의 함유량을 적게 한 그로스팩터리듀스드(growth factor-reduced)(GFR) 매트리젤 등)이다. 다당의 예는 젤란검나, 결정 셀룰로오스, 나노 셀룰로오스, 카르복시셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스 등이다. 2종류 이상의 재료를 병용해도 된다.

바람직한 일태양에서는, 점성 재료로서, 음이온성의 관능기를 가지는 고분자 화합물을 사용할 수 있다. 음이온성의 관능기로서는, 카르복시기, 술포기, 인산기 및 이들의 염을 예로 들 수 있고, 카르복시기 또는 그의 염이 바람직하다. 본 발명에 사용하는 고분자 화합물은, 상기 음이온성의 관능기의 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상을 가지는 것을 사용할 수 있다. 여기서의 고분자 화합물의 바람직한 구체예로서는, 특별히 제한되는 것은 아니지만, 단당류(예를 들면, 트리오스, 테트로스, 펜토오스, 헥소오스, 헵토오스 등)가 10개 이상 중합한 다당류를 들 수 있고, 보다 바람직하게는, 음이온성의 관능기를 가지는 산성 다당류를 예로 들 수 있다. 여기에 말하는 산성 다당류란, 그 구조 중에 음이온성의 관능기를 가지면 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면 우론산(예를 들면, 글루쿠론산, 이두론산, 갈락투론산, 만누론산)을 가지는 다당류, 구조 중의 일부에 황산기 또는 인산기를 가지는 다당류, 혹은 그 양쪽의 구조를 가지는 다당류이며, 천연으로부터 얻어지는 다당류뿐만 아니라, 미생물에 의해 발생된 다당류, 유전자 공학적으로 생산된 다당류, 혹은 효소를 사용하여 인공적으로 합성된 다당류도 포함된다. 보다 구체적으로는, 히알루론산, 젤란검, 탈아실화젤란검, 람산검, 디우탄검, 크산탄검, 카라기난, 잔탄검, 헥수론산, 후코이단, 펙틴, 펙틴산, 펙틴산, 헤파란황산, 헤파린, 헤파리틴황산, 케라토황산, 콘드로이틴황산, 데르마탄황산, 람난황산 및 이들의 염으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상으로 구성되는 것이 예시된다. 다당류는, 바람직하게는, 히알루론산, 탈아실화젤란검, 디우탄검, 크산탄검, 카라기난 또는 이들의 염이며, 저농도의 사용으로 목적을 달성할 수 있는 점 등을 고려하면, 가장 바람직하게는, 탈아실화젤란검이다. 여기서 말하는 염이란, 예를 들면, 리튬, 나트륨, 칼륨과 같은 알칼리금속의 염, 칼슘, 바륨, 마그네슘과 같은 알칼리토류 금속의 염 또는 알루미늄, 아연, 동, 철, 암모늄, 유기염기 및 아미노산 등의 염이 있다.

상기 고분자 화합물(다당류 등)의 중량평균분자량은, 바람직하게는 10,000∼50,000,000이며, 보다 바람직하게는 100,000∼20,000,000, 더욱 바람직하게는 1,000,000∼10,000,000이다. 예를 들면, 상기 분자량은, 겔침투크로마토그래피(GPC)에 의한 풀루란 환산으로 측정할 수 있다.

또한, 탈아실화젤란검는 인산화한 것을 사용할 수도 있다. 상기 인산화는 공지의 방법으로 행할 수 있다.

본 발명에 있어서는, 상기 다당류를 복수종(바람직하게는 2종) 조합하여 사용할 수 있다. 다당류의 조합의 종류는, 스페로이드의 회합이나 응집을 방지할 수 있는 것이면 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는, 상기 조합은 적어도 탈아실화젤란검 또는 그의 염을 포함한다. 즉, 바람직한 다당류의 조합에는, 탈아실화젤란검 또는 그의 염, 및 탈아실화젤란검 또는 그의 염 이외의 다당류(예, 크산탄검, 알긴산, 카라기난, 디우탄검, 메틸셀룰로오스, 로커스트빈검 또는 이들의 염)가 포함된다. 구체적인 다당류의 조합으로서는, 탈아실화젤란검과 람산검, 탈아실화젤란검과 디우탄검, 탈아실화젤란검과 크산탄검, 탈아실화젤란검과 카라기난, 탈아실화젤란검과 잔탄검, 탈아실화젤란검과 로커스트빈검, 탈아실화젤란검과 κ-카라기난, 탈아실화젤란검과 알긴산 나트륨, 탈아실화젤란검과 메틸셀룰로오스 등을 들 수 있지만, 이들로 한정되지 않는다.

본 발명에 사용하는 점성 재료의 더욱 바람직한 구체예로서는, 히알루론산, 탈아실화젤란검, 디우탄검, 카라기난 및 크산탄검, 및 이들의 염을 들 수 있고, 가장 바람직한 예로서는 탈아실화젤란검 또는 그의 염을 들 수 있다. 탈아실화젤란검의 경우, 시판중인 것, 예를 들면, 산쇼(三晶)주식회사에서 제조한 「KELCOGEL(CP·켈코사의 등록상표) CG-LA」, 산에이겐(三榮源) F·F·I 주식회사에서 제조한 「켈코겔(C P·겔코사의 등록상표)」등을 사용할 수 있다. 또한, 네이티브형 젤란검으로서, 산에이겐 F·F·I 주식회사에서 제조한 「켈코겔(C P·겔코사의 등록상표) HT」 등을 사용할 수 있다. 특히 바람직한 점성 재료의 예로서, 닛산화학공업(日産化學工業)주식회사가 제공하는 폴리머 FP001 또는 폴리머 FP003을 들 수 있다. 그리고, 폴리머 FP001은 닛산화학공업주식회사에서 제조한 3차원 배양 배지 FCeM(등록상표) 시리즈의 배합 성분이며, 폴리머 FP003은 동(同) FCeM(등록상표) Advance Preparation Kit의 배합 성분이다.

점성 재료의 사용량, 즉 배지로의 첨가량은, 기대되는 상기한 효과를 발휘할 수 있다면 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 배지의 점도가 5mPas·s∼2000mPas·s로 되도록 점성 재료의 사용량을 조정한다. 배지의 점도가 지나치게 낮으면, 스페로이드의 회합이나 응집을 방지하는 효과가 얻어지지 않는다. 한편, 배지의 점도가 지나치게 높으면, 조작성(취급)에 영향을 주어(예를 들면, 회수 조작이 번잡하게 됨), 배지 성분의 세포로의 공급에 영향을 미칠 우려도 있다. 그리고, 점성 재료의 사용량의 구체예로서 매트리젤의 경우를 나타내면, 통상의 사용(즉 3차원 배양용의 기재로서의 사용)에서의 사용량의 1%∼10% 정도로 하면 된다. 또한, 탈아실화젤란검의 경우, 0.001%∼1.0% (w/v), 바람직하게는 0.003%∼0.5% (w/v), 보다 바람직하게는 0.005%∼0.3% (w/v), 더욱 바람직하게는 0.01%∼0.05% (w/v), 가장 바람직하게는, 0.01%∼0.03% (w/v) 배지 중에 첨가하면 된다.

부유 배양으로 사용하는 배양 용기는, 특별히 한정되지 않고, 예를 들면, 디시, 플라스크, 멀티웰플레이트, 튜브, 트레이, 배양 백 등을 사용할 수 있다.

그리고, 공정(4)의 기간(배양 기간)은, 예를 들면, 12일간∼36일간이다.

바람직하게는, 공정(4)로서, 하기 공정(4-1)과 공정(4-2)을 이 순서로 행한다. 이 태양에서는, 공정(4)에 특징적인 저분자 화합물의 조합(즉, MEK1/2 저해제, DNA 메틸화 저해제, TGFβ 수용체 저해제 및 γ-세크레타아제 저해제의 조합)을 공정(4-2)에서 사용하게 된다.

<공정(4-1)>

이 공정은, 4종의 저분자 화합물(MEK1/2 저해제, DNA 메틸화 저해제, TGFβ 수용체 저해제 및 γ-세크레타아제 저해제)의 조합에 의한 적극적인 분화 유도를 촉진하기 전의 준비의 단계로서 자리매김할 수 있다. 이 공정을 개재(介在)시킴으로써, 스페로이드의 성장이 촉진되어, 기능적인 장관 오가노이드의 구축에 유리하게 된다. 이 공정의 배양은, 공정(3)과 동일 조건(즉, 상피성장인자, BMP 저해제 및 Wnt 시그널 활성화제의 존재 하에서의 부유 배양)에서 행할 수 있지만, 바람직하게는, 수용액 중에 3차원적 그물눈 구조를 형성하는 재료(점성 재료)를 첨가한 액체 배지를 사용하고, 공정(3)에서 형성시킨 복수의 스페로이드를 함께 부유 배양함으로써, 조작성 및 효율성의 향상을 도모한다.

공정(4-1)의 기간(배양 기간)은, 예를 들면 3일간∼15일간, 바람직하게는 6일간∼12일간이다. 상기 배양 기간이 지나치게 짧으면, 스페로이드가 작아 세포사를 일으키기 쉽다. 한편, 상기 배양 기간이 길면, 저분자 화합물에 의한 충분한 효과를 얻을 수 없다.

<공정(4-2)>

이 공정에서는, 상피성장인자, BMP 저해제 및 Wnt 시그널 활성화제에 더하여, MEK1/2 저해제, DNA 메틸화 저해제, TGFβ 수용체 저해제 및 γ-세크레타아제 저해제의 존재 하에서 부유 배양을 행하고, 적극적인 분화 유도를 촉진시키고, 장관 오가노이드를 형성시킨다. 배양 조건은 상기 공정(4)의 배양 조건과 동일하므로, 그 설명을 생략한다.

공정(4-2)의 기간(배양 기간)은, 예를 들면, 3일간∼21일간, 바람직하게는 9일간∼18일간이다. 상기 배양 기간이 지나치게 짧으면, 충분한 기능 향상으로 이어지지 않는다. 한편, 상기 배양 기간이 길면, 스페로이드에 대한 데미지에 의해, 세포사를 일으킬 가능성이 있다.

본 발명을 구성하는 각 공정(공정(1), 공정(2), 공정(3), 공정(4), 공정(4-1), 공정(4-2))에서의, 그 외의 배양 조건(배양 온도 등)은, 동물 세포의 배양에 있어서 일반적으로 사용되고 있는 조건으로 하면 된다. 즉, 예를 들면, 37℃, 5%CO₂의 환경 하에서 배양하면 된다. 또한, 기본 배지로서, 이스코브 변형 둘베코 배지(IMDM)(GIBCO사 등), 햄F12 배지(HamF12)(SIGMA사, Gibco사 등), 둘베코 변형 이글 배지(D-MEM)(나카라이테스크주식회사, 시그마사, Gibco사 등), 글래스고 기본 배지(Gibco사 등), RPMI1640 배지 등을 사용할 수 있다. 2종 이상의 기본 배지를 병용해도 된다. 공정(3) 및 공정(4)(공정(4)로서 공정(4-1)과 공정(4-2)을 행하는 경우에는 이들 공정)에 있어서는, 상피세포의 배양에 적합한 기본 배지(예를 들면, D-MEM과 햄F12 배지의 혼합 배지, D-MEM)를 사용하는 것이 바람직하다. 배지에 첨가 가능한 성분의 예로서 소혈청 알부민(BSA), 항생 물질, 2-머캅토에탄올, PVA, 비필수 아미노산(NEAA), 인슐린, 트랜스페린, 셀레늄을 들 수 있다.

본 발명을 구성하는 공정(1), 공정(2)의 도중에 계대 배양을 행해도 된다. 예를 들면, 컨플루언트 또는 서브컨플루언트가 되었을 때 세포의 일부를 채취하여 별도의 배양 용기에 옮기고, 배양을 계속한다. 세포의 회수에는 세포해리액 등을 이용하면 된다. 세포해리액으로서는, 예를 들면, 트립신-EDTA, 콜라게나아제IV, 메탈로프로테아제 등의 단백질 분해 효소 등을 단독으로 또는 적절하게 조합하여 사용할 수 있다. 세포장해성이 적은 것이 바람직하다. 이와 같은 세포해리액으로서, 예를 들면, 디스파제(에이디아), TrypLE(Invitrogen) 또는 아큐타아제(MILLIPORE) 등의 시판품이 입수 가능하다. 분산(이산) 상태로 되도록, 회수 후의 세포를 셀스트레이너 등으로 처리한 후에 계대 배양에 제공하면 된다. 한편, 본 발명을 구성하는 각 공정에 있어서, 필요에 따라 배지 교환이 행해진다. 예를 들면, 24시간∼3일에 1회의 빈도로 배지 교환하면 된다.

계대 배양이나 배지 교환에 따른, 세포의 회수 시에는, 세포사를 억제하기 위하여 Y-27632 등의 ROCK 저해제(Rho-associated coiled-coil forming kinase/Rho결합 키나제)로 미리 세포를 처리해 두면 된다.

이상에서 설명한 본 발명에 의하면, 기능적인 장관 오가노이드를 제작할 수 있다. 「기능적인 장관 오가노이드란, 장관에 특징적인 약물 동태학적인 기능을 가지는 장관 오가노이드이며, 기능적인 타이트 정션이 인정되고, 대사(흡수, 배출) 기능을 가진다. 기능적인 장관 오가노이드인 것은, 타이트 정션 마커의 발현, 각종 트랜스포터(펩티드 트랜스포터, 배출 트랜스포터, 유기 음이온 트랜스포터 등)의 발현, 약물 대사 효소의 발현/활성 등에 의해 평가할 수 있다. 또한, 약물 응답성의 유무나 정도도, 장관 오가노이드의 기능성을 평가하는 지표로서 유용하여. 타이트 정션 마커의 예는 Occludin(오클루딘)이며, 펩티드 트랜스포터의 예는 SLC15A1/PEPT1(SLC(solute carrier)패밀리멤버 15A1/펩티드 트랜스포터 1)이며, 배출 트랜스포터의 예는, ABCB1/MDR1(ATP 결합 카세트 트랜스포터 B1/약제 내성(耐性) 단백질 1), ABCC2/MRP2(ATP 결합 카세트 트랜스포터 C2/약제 내성 관련 단백질 2), ABCG2/BCRP(ATP 결합 카세트 트랜스포터 G2/유방암 내성 단백질)이며, 유기 음이온 트랜스포터의 예는 SLCO2B1/OATP2B1(SLC(solute carrier) 유기 음이온 트랜스포터 2B1)이며, 약물 대사 효소의 예는, CYP3A4(시토크롬 P4503A4), CYP3A8(시토크롬 P4503A8)이다. 약물 응답성의 평가에는, 예를 들면, 리팜피신 또는 비타민D 수용체를 통한 약물 대사 효 소CYP3A(예를 들면, 인간인 경우에는 CYP3A4, 게잡이원숭이인 경우에는 CYP3A8)의 발현 유도를 지표로 할 수 있다.

그리고, CDX2(Caudal-type 호메오박스 2), Chromogranin A, E-cad(E-cadherin; 상피 카드헤린), LGR5(류신-리치 리피트를 포함하는 G단백질 공역형 수용체), Lysozyme(라이소자임), MUC2(뮤신 2당 단백질), OLFM4(올팍토메딘 4), Villin(빌린), Vim(Vimentin; 비멘틴) 등도 장관 오가노이드의 구조 또는 기능성을 평가하는 면에서 유용하다.

2. 장관 오가노이드의 용도

본 발명의 제2 국면은 본 발명의 제작 방법에 의해 얻어진 장관 오가노이드의 용도에 관한 것이다. 제1 용도로서 각종 어세이가 제공된다. 본 발명의 장관 오가노이드는 장관, 특히 소장의 모델계에 이용 가능하며, 장관, 특히 소장에서의 약물 동태(흡수, 대사 등)의 평가나 독성의 평가에 유용하다. 바꾸어 말하면, 본 발명의 장관 오가노이드는, 화합물의 체내 동태의 평가나 독성의 평가에 그 이용이 도모된다.

구체적으로는, 본 발명의 장관상피세포 유사 세포를 사용하여 피험물질의 대사, 흡수성, 막투과성, 약물 상호 작용, 약물 대사 효소의 유도, 약물 트랜스포터의 유도, 독성 등을 시험할 수 있다. 즉, 본 발명은, 장관 오가노이드의 용도 중 하나로서, 피험물질의 대사, 흡수성, 막투과성, 약물 상호 작용, 약물 대사 효소의 유도, 약물 트랜스포터의 유도, 독성 등을 평가하는 방법을 제공한다. 상기 방법에서는, (I) 본 발명의 제작 방법에 의해 얻어진 장관 오가노이드에 피험물질을 접촉시키는 공정과, (II), 피험물질의 대사, 흡수성, 막투과성, 약물 상호 작용, 약물 대사 효소의 유도, 또는 약물 트랜스포터의 유도, 혹은 독성을 측정·평가하는 공정을 행한다.

공정(I)에서의 「접촉」은, 전형적으로는, 배지에 피험물질을 첨가함으로써 행해진다. 피험물질의 첨가 타이밍은 특별히 한정되지 않는다. 따라서, 피험물질을 포함하지 않는 배지에서 배양을 개시한 후, 어떤 시점에서 피험물질을 첨가해도 되고, 미리 피험물질을 포함하는 배지에서 배양을 개시해도 된다.

피험물질에는 다양한 분자 사이즈의 유기 화합물 또는 무기 화합물을 사용할 수 있다. 유기 화합물의 예로서 핵산, 펩티드, 단백질, 지질(단순 지질, 복합 지질(포스포글리세리드, 스핑고 지질, 글리코실글리세리드, 세레브로시드 등), 프로스타글라딘, 이소프레노이도, 테르펜, 스테로이드, 폴리페놀, 카테킨, 비타민(B1, B2, B3, B5, B6, B7, B9, B12, C, A, D, E 등)을 예시할 수 있다. 의약품, 영양식품, 식품첨가물, 농약, 향장품(화장품) 등의 기존 성분 혹 후보 성분도 바람직한 피험물질의 하나l다. 식물추출액, 세포추출액, 배양 상청액 등을 피험물질로서 사용할 수도 있다. 2종류 이상의 피험물질을 동시에 첨가함으로써, 피험물질간의 상호 작용, 상승(相乘) 작용 등을 조사할 수도 있다. 피험물질은 천연물 유래라도 되고, 혹은 합성에 의한 것이라도 된다. 후자의 경우에는, 예를 들면, 콤비나토리얼(combinatorial) 합성의 방법을 이용하여 효율적인 어세이계를 구축할 수 있다.

피험물질을 접촉시키는 기간은 임의로 설정 가능하다. 접촉 기간은, 예를 들면, 10분간∼3일간, 바람직하게는 1시간∼1일간이다. 접촉을 복수회로 나누어 행해도 된다.

공정(I) 후에, 피험물질의 대사, 흡수성, 막투과성, 약물 상호 작용, 약물 대사 효소의 유도, 또는 약물 트랜스포터의 유도, 혹은 독성을 측정·평가한다(공정(II)). 공정(I)의 직후, 즉 피험물질의 접촉 후, 실질적인 시간 간격을 두지 않고 대사 등을 측정·평가해도 되고, 혹은, 일정 시간(예를 들면, 10분∼5시간)을 경과한 후에 대사 등을 측정·평가해도 된다. 대사의 측정은, 예를 들면, 대사 산물의 검출에 의해 행할 수 있다. 이 경우에는, 통상, 공정(I) 후의 배양액을 샘플로 하고, 예상되는 대사 산물을 정성적(定性的) 또는 정량적(定量的)으로 측정한다. 측정 방법은 대사 산물에 따라 적절한 것을 선택하면 되지만, 예를 들면, 질량분석, 액체 크로마토그래피, 면역학적 방법(예를 들면, 형광면역측정법(FIA법), 효소면역측정법(EIA법)) 등을 채용 가능하다.

전형적으로는, 피험물질의 대사 산물이 검출되었을 때, 「피험물질이 대사되었다」고 판정 내지 평가한다. 또한, 대사 산물의 양에 따라 피험물질의 대사량을 평가할 수 있다. 대사 산물의 검출결과와, 피험물질의 사용량(전형적으로는 배지로의 첨가량)에 기초하여, 피험물질의 대사 효율을 산출해도 된다.

장관 오가노이드에서의 약물 대사 효소(시토크롬 P450(특히 인간에서는 CYP3A4, 게잡이원숭이에서는 CYP3A8), 우리딘2인산-글루쿠론산 전이 효소(특히 UGT1A8, UGT1A10), 황산 전이 효소(특히 SULT1A3 등))의 발현을 지표로 하여 피험물질의 대사를 측정하는 것도 가능하다. 약물 대사 효소의 발현은 mRNA 레벨 또는 단백질 레벨로 평가할 수 있다. 예를 들면, 약물 대사 효소의 mRNA 레벨에 상승을 인정했을 때, 「유전자 레벨에서의 발현량이 상승하였다」고 판정할 수 있다. 마찬가지로, 약물 대사 효소의 활성에 상승을 인정했을 때, 「피험물질이 대사되었다」고 판정할 수 있다. 대사 산물을 지표로서 판정하는 경우와 마찬가지로, 약물 대사 효소의 발현량에 기초하여 정량적인 판정·평가를 행해도 된다.

피험물질의 흡수를 평가하기 위해서는, 예를 들면, 배양액 중의 피험물질의 잔존량을 측정한다. 통상, 공정(I) 후의 배양액을 샘플로 하여 피험물질을 정량한다. 측정 방법은 피험물질에 따라 적절한 것을 선택하면 된다. 예를 들면, 질량분석, 액체 크로마토그래피, 면역학적 방법(예를 들면, 형광면역측정법(FIA법), 효소면역측정법(EIA법)) 등을 채용 가능하다. 전형적으로는, 배양액 중의 피험물질의 함유량 저하를 인정했을 때, 「피험물질이 흡수되었다」로 판정·평가한다. 또한, 저하의 정도에 따라 피험물질의 흡수량 내지 흡수 효율을 판정·평가할 수 있다. 그리고, 세포 내에 받아들여진 피험물질의 양을 측정하는 것에 의해서도, 흡수의 평가는 가능하다.

그리고, 대사의 측정·평가와 흡수의 측정·평가를 동시에 또는 병행하여 행해도 된다.

본 발명의 제작 방법에 의해 얻어진 장관 오가노이드의 제2 용도로서 장관 오가노이드를 포함하는 이식 재료가 제공된다. 본 발명의 이식 재료는 각종 장질환(예를 들면, 난치성 염증성 장질환)의 치료에 적용할 수 있다. 특히, 장애를 입은 (기능부전을 포함함) 장관 조직의 재생·재건용의 재료로서의 이용이 상정된다. 즉, 재생 의료에 대한 공헌을 기대할 수 있다. 본 발명의 이식 재료는 그대로, 혹은 매트리젤이나 콜라겐겔 포매 등의 처리를 한 후, 이식 재료로서 이용할 수 있다. 또한, 각종 장질환 병태 모델로서의 치료약 후보 화합물의 스크리닝이나 병태 메커니즘의 규명 연구와 같은 이용 형태도 상정된다. 세포의 보호를 목적으로 하여 디메틸술폭시드(DMSO)이나 혈청 알부민 등을, 세균의 혼입을 저지하는 것을 목적으로 하여 항생 물질 등을, 세포의 활성화, 증식 또는 분화 유도 등을 목적으로 하여 각종 성분(비타민류, 사이토카인, 성장 인자, 스테로이드 등)을 본 발명의 이식 재료에 함유시켜도 된다. 또한, 제제(製劑) 상 허용되는 다른 성분(예를 들면, 담체, 부형제(賦形劑), 붕괴제, 완충제, 유화제, 현탁제, 무통화제, 안정제, 보존제, 방부제, 생리식염수 등)을 본 발명의 이식 재료에 함유시켜도 된다.

본 발명의 이식 재료는 in vivo 실험계의 구축에도 이용 가능하다. 예를 들면, 인간 다능성줄기세포를 사용하여 제작한 장관 오가노이드를 포함하는 이식 재료를 마우스, 래트, 모르모트, 햄스터, 돼지, 게잡이원숭이, 붉은털원숭이, 침팬지 등의 실험 동물에 이식하여, 인간화 동물(인간 장관 모델)을 제작할 수 있다. 이와 같은 인간화 동물은 약물 동태나 독성 시험 등의 실험에 특히 유용하며, 경구약에 대한 초회 통과 효과의 영향이나 약제성 장염 등의 연구에 대한 공헌이 기대된다.

장질환 환자 유래의 iPS 세포를 사용하여 제작한 장관 오가노이드에 대해서는, 장관 병태 모델로서, 약제 평가계에 이용할 수 있는 것 외에, 장질환의 발증, 병태 형성 및/또는 진전의 기전 규명을 목표로 한 연구에서의 각종 실험에도 이용 가능하다.

[실시예]

기능적인 장관 오가노이드를 제작하는 신규 방법의 창출을 목표로 하여, 이하의 검토를 행하였다.

1. 방법

(1) 세포

인간 iPS 세포(iPS-51: Windy)는, 인간태아 폐섬유아세포 MRC-5에 octamer binding protein 3/4(OCT3/4), sex determining region Y-box 2(SOX2), kruppel-like factor 4(KLF4), V-myc myelocytomatosis viral oncogene homolog(avian)(c-MYC)을, 판트로픽 레트로바이러스 벡터(pantropic retrovirus vector)를 사용하여 도입한 후, 인간 ES 세포 유사 콜로니를 클론화한 것이며, 국립생육의료연구센터 우메자와(梅澤) 아키히로(明弘) 박사로부터 제공받았다. 게잡이원숭이 iPS 세포는 게잡이원숭이 피부 조직으로부터 배양한 섬유아세포에 에피소말 벡터(episomal vector)인 pCXLE-hOCT3/4-shp53-F, pCXLE-hSK, pCXLE-hUL을 전기천공법(electroporation method)으로 도입한 후, 게잡이원숭이 ES 세포 유사 콜로니를 클론화한 것이며, 본 발명자들이 수립했다. 피더(feeder) 세포는 마우스태아 섬유아세포(MEF)를 사용했다.

(2) 배지

MEF의 배양에는 10% 우태아 혈청(FBS), 2mmol/L L-글루타민(L-Glu), 1% 비필수 아미노산(NEAA), 100units/mL 페니실린G, 100μg/mL 스트렙토마이신을 포함하는둘베코 변형 이글 배지(DMEM)를 사용했다. MEF의 박리액에는 0.05% 트립신-에틸렌 디아민 4아세트산(EDTA)을, MEF의 보존액에는 셀 벙커 1을 사용했다. 인간 iPS 세포의 유지 배양에는 20% 녹아웃(Knock out) 혈청대체물(KSR), 0.8% NEAA, 2mmol/L L-Glu, 0.1mmol/L 2-머캅토에탄올(2-MeE), 5ng/mL 섬유아세포 증식 인자(FGF) 2를 포함하는 DMEM Ham's F-12(DMEM/F12)를 사용했다. 게잡이원숭이 iPS 세포의 유지 배양에는 20% KSR, 1.0% NEAA, 2mmol/L L-Glu, 100units/mL 페니실린G, 100μg/mL 스트렙토마이신, 0.1mmol/L 2-MeE, 5ng/mL FGF2를 포함하는 DMEM/F12를 사용했다. 인간 및 게잡이원숭이 iPS 세포의 박리액에는 1mg/mL 콜라게나아제IV, 0.25% 트립신, 20% KSR, 1mmol/L 염화 칼슘을 포함하는 둘베코 인산 완충 생리식염수(PBS)를 사용했다. 인간 및 게잡이원숭이 iPS 세포의 보존액에는 영장류 ES/iPS 세포용 동결보존액을 사용했다.

(3) 인간 및 게잡이원숭이 iPS 세포의 배양

인간 iPS 세포는 마이토마이신C 처리를 실시한 MEF(6×10⁵cells/100mm 디시) 상에, 게잡이원숭이 iPS 세포는 마이토마이신C 처리를 실시한 MEF(1×10⁶cells/100mm 디시) 상에 파종하고, 5% CO₂/95% air 조건 하 CO₂ 인큐베이터 중 37℃에서 배양했다. 인간 및 게잡이원숭이 iPS 세포의 계대는, 3∼5 일 배양 후, 1:2∼1:3의 스플릿비(split ratio)로 행하였다. 인간 및 게잡이원숭이 iPS 세포는 해동 48시간 후에 배지를 교환하고, 그 후에는 매일 교환했다.

(4) 인간 및 게잡이원숭이 iPS 세포의 장관 오가노이드로의 분화

인간 및 게잡이원숭이 iPS 세포의 장관 오가노이드로의 분화는, 계대 시에 인간 및 게잡이원숭이 iPS 세포용 배지에서 30배로 희석한 매트리젤(성장인자 제거)로 코팅한 배양 디시에 파종하고, 35ng/mL FGF2를 포함하는 StemSure(등록상표) hPSC 배지에서 배양하고, 미분화 콜로니가 차지하는 비율이 약 80%로 된 상태에서 개시했다. 100ng/mL 액티빈A, 100units/mL 페니실린G, 100μg/mL 스트렙토마이신, 2mmol/L L-Glu를 포함하는 로즈웰파크기념연구소(RPMI) 배지에서 1일간, 0.2% FBS, 100ng/mL 액티빈A, 100units/mL 페니실린G, 100μg/mL 스트렙토마이신, 2mmol/L L-Glu를 포함하는 RPMI 배지에서 1일간, 2% FBS, 100ng/mL 액티빈A, 100units/mL 페니실린G, 100μg/mL 스트렙토마이신, 2mmol/L L-Glu를 포함하는 RPMI 배지에서 1일간 배양함으로써 내배엽으로 분화시켰다. 그 후, 인간 iPS 세포에서는, 2% FBS, 500ng/mL FGF4, 500ng/mL Wnt3a, 100units/mL 페니실린G, 100μg/mL 스트렙토마이신을 포함하는 RPMI+글루타막스 배지에서 4일간 배양함으로써 장관 줄기세포로 분화시켰다. 게잡이원숭이 iPS 세포에서는, 2% FBS, 250ng/mL FGF2, 6μmol/L CHIR99021, 100units/mL 페니실린G, 100μg/mL 스트렙토마이신을 포함하는 RPMI+글루타막스 배지에서 4일간 배양함으로써 장관 줄기세포로 분화시켰다. 인간 iPS 세포에서는 FGF4, Wnt3a 처리 후, 게잡이원숭이 iPS 세포에서는, FGF4, CHIR99021 처리 후, Y-27632(Rho 결합 키나제 저해제)를 10μmol/L로 되도록 첨가하고, 5% CO₂/95% air 조건하 CO₂ 인큐베이터 중 37℃에서 60분간 처리한 세포를 0.05% 트립신-EDTA로 박리하고, 40㎛ 나일론 메쉬의 셀스트레이너에서 세포괴를 부수고, 7.0×10⁶ 세포를 100mm EZSPHERE(등록상표) 상에 파종했다. 그 후, 2mmol/L L-Glu, 2% B27 supplement, 1% N2 supplement, 100units/mL 페니실린G, 100μg/mL 스트렙토마이신, 100ng/mL 상피성장인자(EGF), 100ng/mL Noggin, 200ng/mL R-spondin-1, 10μmol/L Y-27632를 포함하는 Advanced-DMEM/F12에서 3일간 배양한 후, 2mmol/L L-Glu, 2% B27 supplement, 1% N2 supplement, 100units/mL 페니실린G, 100μg/mL 스트렙토마이신, 100ng/mL EGF, 100ng/mL Noggin, 200ng/mL R-spondin-1, 성장 인자를 제거한 매트리젤 3%를 포함하는 Advanced-DMEM/F12에서 24일간 초저접착 6웰 플레이트 상에서 부유 배양함으로써 장관 오가노이드로 분화시켰다. 약물 대사 효소의 유도제 처리는, 2mmol/L L-Glu, 2% B27 supplement, 1% N2 supplement, 100units/mL 페니실린G, 100μg/mL 스트렙토마이신, 100ng/mL EGF, 100ng/mL Noggin, 200ng/mL R-spondin-1, 성장 인자를 제거한 매트리젤 3%를 포함하는 Advanced-DMEM/F12에 리팜피신을 40μmol/L 혹은 1α,25-디하이드록시비타민D₃(VD3)를 1μmol/L로 되도록 첨가하고, 회수 전 72시간 배양함으로써 행하였다. 또한, 분화 개시 19일째로부터 34일째까지, 이전 본 발명자들이 발견한 저분자 화합물인 PD98059(20μmol/L), 5-아자-2'-데옥시시티딘(5μmol/L), A-83-01(0.5μmol/L)에 더하여, 5μmol/L N-[(3,5-디플루오로페닐)아세틸]-L-알라닐-2-페닐-1,1-디메틸에틸에스테르-글리신(DAPT)을 첨가하여, 장관 오가노이드로의 분화에 미치는 영향에 대하여 검토했다. 그리고, 이상의 배양 방법(분화 프로토콜)의 개요를 도 9에 나타내었다.

(5) 총리보핵산(RNA) 추출

총RNA는 인간 및 게잡이원숭이 iPS 세포의 분화 유도 종료 후, Agencourt RNAdvence Tissue의 첨부 매뉴얼에 따라 추출했다.

(6) 역전사반응

상보적 DNA(cDNA)의 합성은, ReverTra Ace qPCR RT Master Mix를 사용하여, 첨부 매뉴얼에 따라 행하였다.

(7) Real-Time RT-PCR법

Real-Time RT-PCR은 KAPA SYBR Fast qPCR Kit를 사용하여, cDNA를 주형으로 하고, 반응은 첨부 매뉴얼에 따라 행하였다. 결과는 내재성 콘트롤로서 글리세르알데히드-3-인산탈수소 효소(GAPDH)를 사용하여 보정했다.

(8) 헤마톡실린-에오신(HE) 염색 및 알시안블루 염색

분화 유도 종료 후, 장관 오가노이드를 4% 파라포름알데히드에서 고정하고, OCT 콤파운드로 동결 포매했다. 두께 10㎛의 동결 절편을 제작한 후, 슬라이드 글라스에 부착하고, HE 염색에서는, 메이어 헤마톡실린(Mayer's hematoxylin) 및 에오신알코올을 사용하여 염색했다. 알시안블루 염색에서는, pH2.5에서의 알시안블루를 염색하고, 핵염색으로서 뉴클리어패스트레드(nuclear fast red)를 사용했다.

(9) 면역형광염색

분화 유도 종료 후, 장관 오가노이드를 4% 파라포름알데히드로 고정하고, OCT 콤파운드로 동결 포매했다. 두께 10㎛의 동결 절편을 제작한 후, 슬라이드 글라스에 부착하고, 항원의 부활화(賦活化)를 행하였다. 5% FBS 용액으로 30분간 블록킹하고, 1차항체를 4℃에서 하룻밤 반응시켰다. 그 후, 슬라이드 글라스를 세정하고, 2차항체를 실온에서 1시간 반응시키고, 핵염색으로서 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)을 사용했다. 봉입(封入) 작업을 행하고, Zeiss LSM510 공초점 레이저 현미경을 사용하여, 형광을 관찰했다.

(10) 투과형 전자현미경에 의한 관찰

분화 유도 종료 후, 장관 오가노이드를 2.5% 글루타르알데히드로 전(前)고정하고, 4℃에서 하룻밤 인큐베이션했다. 그 후, 1% 4산화 오스뮴으로 4℃에서 2시간, 후고정을 행하고, 에탄올에 의한 탈수 작업을 행하였다. 프로필렌옥사이드로 치환한 후, 수지 내에 포매했다. 0.1㎛의 절편을 제작하고, 아세트산 우라닐로 전자 염색을 행한 후, JEM-1400 Plus 투과형 전자현미경을 사용하여, 미세융모 및 타이트 정션의 관찰을 행하였다.

(11) FITC-dextran 4000(FD-4)의 투과 실험

분화 유도 종료 후, 장관 오가노이드를 FITC-dextran 4000(FD-4)을 포함하는 HBSS(행크스 완충 염류 용액)로 37℃에서 인큐베이션했다. HBSS는, 137mmol/L 염화나트륨, 5.4mmol/L 염화칼륨, 0.81mmol/L 황산 마그네슘, 0.44mmol/L 인산 2수소 칼륨, 0.34mmol/L 인산수소 2나트륨, 1.3mmol/L 염화칼슘, 4.2mmol/L 탄산 수소나트륨, 5.6mmol/L D-글루코오스, 10mmol/L HEPES를 포함하는 pH 7.4인 것을 사용했다. 인큐베이션 종료 후, 빙랭한 HBSS으로 세포를 세정했다. 그 후, Nikon ECLIPSE Ti-S 현미경을 사용하여, 형광을 관찰했다.

(12) 로다민 123의 업테이크 실험

분화 유도 종료 후, 장관 오가노이드를 로다민 123을 포함하는 HBSS로 37℃에서 인큐베이션했다. 인큐베이션 종료 후, 빙랭한 HBSS로 세포를 세정함으로써 업테이크를 정지시켰다. 그 후, Zeiss LSM510 공초점 레이저 현미경을 사용하여, 형광을 관찰했다.

(13) 약물 대사 실험

분화 유도 종료 후, 장관 오가노이드를 5μmol/L 미다졸람을 포함하는 배지(2mmol/L L-Glu, 2% B27 supplement, 1% N2 supplement, 100units/mL 페니실린G, 100μg/mL 스트렙토마이신을 포함하는 Advanced-DMEM/F12)로 37℃에서 인큐베이션하고, 24시간 경과 후, 배지를 샘플링했다. 대사 활성은, 액체 크로마토그래피-매스스펙트로미터(LC-MS/MS)를 사용하여 측정한 배지 중의 1-수산화미다졸람의 양에 의해 산출했다. 대사 실험 종료 후, 단백질 정량을 행하고, 대사 활성을 단백질량으로 보정했다.

본 검토에서 사용한 마커 유전자의 특징을 이하에 나타낸다.

α-SMA(alpha-smooth muscle actin. 평활근 마커)

ABCB1/MDR1(ATP 결합 카세트 트랜스포터 B1/약제 내성 단백질 1. P당 단백질. 배출 트랜스포터)

ABCC2/MRP2(ATP 결합 카세트 트랜스포터 C2/약제 내성 관련 단백질 2. 배출 트랜스포터)

ABCG2/BCRP(ATP 결합 카세트 트랜스포터 G2/유방암 내성 단백질. 배출 트랜스포터)

CDX2(Caudal-type 호메오박스 2. 장관상피세포의 증식·분화에 관여하고 있는 전사인자)

Chromogranin A(분비 과립 중에 존재하는 특이적인 단백질. 장관내분비세포 마커)

CYP3A4(시토크롬 P4503A4. 인간 소장에 있어서 주요한 약물 대사 효소)

CYP3A8(시토크롬 P4503A8. 게잡이원숭이 소장에 있어서 주요한 약물 대사 효소)

E-cad(E-cadherin)(상피 카드헤린. 세포 표면에 존재하는 당 단백질의 1군이며, 세포 접착을 담당하는 분자)

LGR5(류신-리치 리피트를 포함하는 G단백질 공역형 수용체. 장관 줄기세포의 마커)

Lysozyme(진정세균의 세포벽을 구성하는 다당류를 가수분해하는 효소. 장관파네트 세포 마커)

MUC2(mucin2 당 단백질. 술잔세포 마커)

Occludin(오클루딘. 타이트 정션(밀착 결합)의 형성에 영향을 미치는 주요한 단백질)

OLFM4(올팍토메딘 4. 장관 줄기세포 마커)

SLC15A1/PEPT1(SLC(solute carrier) 패밀리 멤버 15A 1/펩티드 트랜스포터 1. 소장의 정상측 막측에 발현하고 있다)

SLCO2B1/OATP2B1(SLC(solute carrier) 유기 음이온 트랜스포터 2B1. 소장의 정상측 막측에 발현하고 있다)

Villin(빌린. 미세융모가 주요한 구성 성분. 흡수 상피세포 마커)

Vim(Vimentin)(비멘틴. 간엽계 세포 특유의 중간 직경 필라멘트)

2. 결과·고찰

(1) 저분자 화합물을 사용한 장관 오가노이드로의 분화 유도(도 1)

인간 및 게잡이원숭이 iPS 세포로부터 장관 오가노이드로의 분화 유도 시에 첨가하는 저분자 화합물의 영향에 대하여 조사했다. 그 결과, A-83-01(0.5μmol/L), PD98059(20μmol/L), 5-아자-2'-데옥시시티딘(5μmol/L)을 첨가한 군(A/PD/5-aza)에서 장관 관련 유전자나 CYP3A 등을 비롯한 다양한 약물 동태 관련 유전자의 mRNA 발현량은 증가했다. 또한 DAPT(5μmol/L)을 가한 군(A/PD/5-aza/DAPT)에서 인간 장관 오가노이드에 있어서는, 콘트롤군에 비해, 장관에서의 주요한 약물 대사 효소인 시토크롬 P450(CYP)3A4에서 약 2,000배, 펩티드의 업테이크 트랜스포터인 SLC15A1/PEPT1에서 약 10배, 배출 트랜스포터인 ABCB1/MDR1에서 약 36배, ABCG2/BCRP에서 약 125배, ABCC2/MRP2에서 약 47배 등 많은 약물 동태 관련 유전자의 mRNA 발현이 상승했다. 또한, 장관을 구성하고 있는 세포 마커인 Villin(흡수 상피세포), MUC2(술잔 세포), Chromogranin A(장관내분비세포), CDX2(장관계보의 세포), LGR5(장관 줄기세포)는 콘트롤군에 비해, 동일한 정도 혹은 그 이상의 mRNA 발현을 나타내었다. 게잡이원숭이 장관 오가노이드에 있어서도 인간과 동일한 경향을 나타내며, 콘트롤군에 비해, CYP3A8에서 약 1,400배, SLC15A1/PEPT1에서 약 2,200배, ABCB1/MDR1에서 약 18배, ABCG2/BCRP에서 약 2.8배, ABCC2/MRP2에서 약 27배 등 많은 약물 동태 관련 유전자의 mRNA 발현이 상승했다. 또한, Villin, MUC2, Chromogranin A, Lysozyme, CDX2는 콘트롤군에 비해, 동일한 정도 혹은 그 이상의 mRNA 발현을 나타내었다. 따라서, 이후의 실험에서는, A-83-01, PD98059, 5-아자-2'-데옥시시티딘 및 DAPT를 첨가하여 분화를 행하고, 분석을 진행하였다.

(2) 저분자 화합물의 신규 조합에 의해 분화 유도한 인간 및 게잡이원숭이 장관 오가노이드의 형태학적 관찰

저분자 화합물의 신규 조합에 의해 분화 유도한 인간 및 게잡이원숭이 iPS 세포 유래 장관 오가노이드는 구형(球形)의 형태를 하고 있었다(도 2의 A, B). 투과형 전자현미경의 관찰로부터 장관 오가노이드의 내측에 장관 솔모양 가장자리막(intestinal brush border membrane) 측에 존재하는 미세융모 및 타이트 정션의 형성이 확인되었다(도 2의 C, D). 또한, HE 염색이나 알시안블루 염색의 결과로부터, 장관 오가노이드는 분비 세포를 포함하는 세포 집단인 것을 알았다(도 2의 E∼J).

(3) 저분자 화합물의 신규 조합에 의해 분화 유도한 인간 및 게잡이원숭이 장관 오가노이드의 면역형광염색

면역형광염색에 의해, 장관을 구성하고 있는 다양한 세포(흡수 상피세포, 장관 줄기세포, 술잔세포, 장관내분비세포, 파네트 세포, 간엽계 세포)의 마커의 발현이 인정되었다(도 3). 따라서, 장관 오가노이드는 이들 세포를 포함하는 장관조직 유사체인 것이 시사되었다.

(4) 저분자 화합물의 신규 조합에 의해 분화 유도한 인간 및 게잡이원숭이 장관 오가노이드의 타이트 정션의 형성과 그 기능

기능적인 타이트 정션이 형성되어 있는지 확인하기 위하여, 먼저 면역형광염색으로, 타이트 정션 마커인 Occludin의 단백질 발현을 확인하였다(도 4의 A∼C). 이 결과로부터, 타이트 정션은, 장관 오가노이드의 관강(管腔) 측을 따라 발현하고 있는 것이 시사되었다. 또한, 투과형 전자현미경의 관찰로부터, 장관 오가노이드의 관강 내측이 장관 솔모야 가장자리막 측에 상당하는 것이 밝혀졌다(도 2의 C, D). 이에, 비흡수성 마커인 FITC-dextran 4000(FD-4)을 사용한 장관 오가노이드 내로의 투과 시험을 행한 바, 오가노이드 내로의 축적은 인정되지 않았다(도 4의 D∼G). 이 결과로부터, 저분자 화합물의 신규 조합에 의해 분화 유도한 인간 및 게잡이원숭이 장관 오가노이드는 기능적인 타이트 정션을 형성하고 있는 것이 시사되었다.

(5) 저분자 화합물의 신규 조합에 의해 분화 유도한 인간 및 게잡이원숭이 장관 오가노이드의 트랜스포터 면역형광염색

저분자 화합물의 신규 조합에 의해 분화 유도한 인간 및 게잡이원숭이 장관 오가노이드에서는, 소장에 특이적으로 발현하고 있는 SLC15A1/PEPT1, 및 장관에서 주요한 배설 트랜스포터인 ABCB1/MDR1의 단백질 발현이 장관 오가노이드의 내측 관강을 따라 인정되었다(도 5).

(6) 저분자 화합물의 신규 조합에 의해 분화 유도한 인간 장관 오가노이드의 로다민 123을 사용한 ABCB1/MDR1의 기능 평가

배출 트랜스포터인 ABCB1/MDR1의 기질인 로다민 123 및 저해제인 베라파밀을 사용하여, ABCB1/MDR1의 기능 평가를 행하였다. 로다민 123의 장관 오가노이드 내로의 배출이 인정되고(도 6의 A, B), 그 배출 방향의 수송은 베라파밀에 의해 현저하게 억제되었다(도 6의 C, D). 이러한 사실로부터, 저분자 화합물의 신규 조합에 의해 분화 유도한 인간 장관 오가노이드는, ABCB1/MDR1의 기능을 가지고 있는 것이 시사되었다.

(7) 저분자 화합물의 신규 조합에 의해 분화 유도한 인간 및 게잡이원숭이 장관 오가노이드의 CYP3A 유도능

CYP3A의 유도제인 리팜피신 및 1α,25-디하이드록시비타민D₃(VD3)를 사용하여, CYP3A의 mRNA 발현 유도에 대하여 검토를 행하였다. 인간 장관 오가노이드에서는, 콘트롤군에 비해, 리팜피신 첨가군에서 약 2배, VD3 첨가군에서 약 4.5배로 유의하게 CYP3A4의 mRNA 발현이 유도되었다(도 7). 이러한 사실로부터, 저분자 화합물의 신규 조합에 의해 분화 유도한 인간 장관 오가노이드에서는 CYP3A의 약물 응답성을 가지고 있는 것이 시사되었다. 게잡이원숭이 장관 오가노이드에서는, 콘트롤군에 비해, 리팜피신 첨가군에서 약 2배로 유의하게 CYP3A8의 mRNA 발현은 유도되었지만, VD3에서의 mRNA 발현 유도는 인정되지 않았다(도 7).

(8) 저분자 화합물의 신규 조합에 의해 분화 유도한 게잡이원숭이 장관 오가노이드의 CYP3A8 대사 활성

인간 CYP3A4 및 게잡이원숭이 CYP3A8의 기질인 미다졸람과 그 저해제인 케토코나졸을 사용하여, CYP3A8의 대사 활성을 평가했다. 게잡이원숭이 장관 오가노이드에 있어서, 미다졸람의 대사 활성이 인정되고, 그 활성은 케토코나졸의 첨가에 의해, 약 20분의 1로 유의하게 저해되었다(도 8). 따라서, 저분자 화합물의 신규 조합에 의해 분화 유도한 게잡이원숭이 장관 오가노이드에서는, CYP3A8의 대사능을 가지고 있는 것이 시사되었다.

3. 결론

이상의 결과로부터, 본연구에서는, 인간 및 게잡이원숭이 iPS 세포로부터 장관 오가노이드로의 분화 촉진에 유용한 저분자 화합물의 조합을 새로이 발견할 수 있었다. 또한, 이 방법에 의해 제작한 장관 오가노이드는, 기능적인 타이트 정션, 배출 트랜스포터의 수송 기능에 더하여, 약물 대사 효소 활성 및 유도능을 가지는 등, 장관에 특징적인 다양한 약물 동태학적 기능을 가지고 있는 것이 밝혀졌다.

<부유 배양 조건의 검토>

분화 촉진 및 보다 높은 기능의 획득, 및 이종(異種) 동물 유래 성분을 사용하지 않는 배양계의 구축을 목표로, 장관 오가노이드를 제작할 때, 매트리젤의 대체로서 다당류 폴리머를 사용한 배지를 사용하여 부유 배양을 행하였다.

1. 방법

(1) 세포

인간 iPS 세포(iPS-51: Windy)는, 인간태아 폐섬유아세포 MRC-5에 octamer binding protein 3/4(OCT3/4), sex determining region Y-box 2(SOX2), kruppel-like factor 4(KLF4), V-myc myelocytomatosis viral oncogene homolog(avian)(c-MYC)을, 판트로픽 레트로바이러스 벡터를 사용하여 도입한 후, 인간 ES 세포 유사 콜로니를 클론화한 것이며, 국립생육의료연구센터 우메자와 아키히로 박사로부터 제공해 받았다. 피더 세포는 마우스태아 섬유아세포(MEF)를 사용했다.

(2) 배지

MEF의 배양에는 10% 우태아 혈청(FBS), 2mmol/L L-글루타민(L-Glu), 1% 비필수 아미노산(NEAA), 100units/mL 페니실린G, 100μg/mL 스트렙토마이신을 포함하는둘베코 변형 이글 배지(DMEM)를 사용했다. MEF의 박리액에는 0.05% 트립신-에틸렌 디아민 4아세트산(EDTA)을, MEF의 보존액에는 셀 벙커 1을 사용했다. 인간 iPS 세포의 유지 배양에는 20% 녹아웃 혈청대체물(KSR), 0.8% NEAA, 2mmol/L L-Glu, 0.1mmol/L 2-머캅토에탄올(2-MeE), 5ng/mL 섬유아세포증식인자(FGF) 2를 포함하는 DMEM Ham's F-12(DMEM/F12)를 사용했다. 인간 iPS 세포의 박리액에는 1mg/mL 콜라게나아제IV, 0.25% 트립신, 20% KSR, 1mmol/L염화 칼슘을 포함하는둘베코 인산완충 생리식염수(PBS)를 사용했다. 인간 iPS 세포의 보존액에는 영장류 ES/iPS 세포용 동결보존액을 사용했다.

(3) 인간 iPS 세포의 배양

인간 iPS 세포는 마이토마이신C 처리를 실시한 MEF(6×10⁵cells/100mm 디시) 상에 파종하고, 5% CO₂/95% air 조건 하 CO₂ 인큐베이터 중 37℃에서 배양했다. 인간 iPS 세포의 계대는, 3∼5 일 배양 후, 1:2∼1:3의 스플릿비로 행하였다. 인간 iPS 세포는 해동 48시간 후에 배지를 교환하고, 그 이후에는 매일 교환했다.

(4) 인간 iPS 세포의 장관 오가노이드로의 분화

인간 iPS 세포의 장관 오가노이드로의 분화는, 계대 시에 인간 iPS 세포용 배지에서 30배로 희석한, 성장 인자를 제거한 매트리젤를 코팅한 배양 디시에 파종하고, 35ng/mL FGF2를 포함하는 StemSure(등록상표) hPSC 배지에서 배양했다. 미분화 콜로니가 차지하는 비율이 약 80%로 된 상태에서 개시했다. 100ng/mL 액티빈A, 100units/mL 페니실린G, 100μg/mL 스트렙토마이신, 2mmol/L L-Glu를 포함하는 로즈웰파크기념연구소(RPMI) 배지에서 1일간, 0.2% FBS, 100ng/mL 액티빈A, 100units/mL 페니실린G, 100μg/mL 스트렙토마이신, 2mmol/L L-Glu를 포함하는 RPMI 배지에서 1일간, 2% FBS, 100ng/mL 액티빈A, 100units/mL 페니실린G, 100μg/mL 스트렙토마이신, 2mmol/L L-Glu를 포함하는 RPMI 배지에서 1일간 배양함으로써 내배엽으로 분화시켰다. 그 후, 2% FBS, 500ng/mL FGF4, 3μmol/L CHIR99021, 100units/mL 페니실린G, 100μg/mL 스트렙토마이신을 포함하는 RPMI+글루타막스 배지에서 4일간 배양함으로써 장관 줄기세포로 분화시켰다. FGF4, CHIR99021 처리 후, Y-27632(Rho 결합 키나제 저해제)를 10μmol/L로 되도록 첨가하고, 5% CO₂/95% air 조건 하 CO₂ 인큐베이터 중 37℃에서 60분간 처리한 세포를 0.05% 트립신-EDTA로 박리하고, 40㎛ 나일론 메쉬의 셀스트레이너에서 세포괴를 부수고, 3.0×10⁶ 세포를 100 mm EZSPHERE(등록상표) 상에 파종했다.

그 후, 2mmol/L L-Glu, 2% B27 supplement, 1% N2 supplement, 100units/mL 페니실린G, 100μg/mL 스트렙토마이신, 100ng/mL 상피성장인자(EGF), 100ng/mL Noggin, 200ng/mL R-spondin-1, 10μmol/L Y-27632를 포함하는 Advanced-DMEM/F12에서 3일간 배양 후, 2mmol/L L-Glu, 2% B27 supplement, 1% N2 supplement, 100units/mL 페니실린G, 100μg/mL 스트렙토마이신, 100ng/mL EGF, 100ng/mL Noggin, 200ng/mL R-spondin-1, 성장 인자를 제거한 매트리젤 3% 혹은 다당류 폴리머(탈아실화젤란검)를 포함하는 Advanced-DMEM/F12에서 24일간 초저접착 6웰 플레이트 상에서 부유 배양함으로써 장관 오가노이드로 분화시켰다.

또한, 분화 개시 19일째로부터 34일째까지, 이전 본 발명자들이 발견한 저분자 화합물인 PD98059(20μmol/L), 5-아자-2'-데옥시시티딘(5μmol/L), A-83-01(0.5μmol/L)에 더하여, 5μmol/L N-[(3,5-디플루오로페닐)아세틸]-L-알라닐-2-페닐-1,1-디메틸에틸에스테르-글리신(DAPT)을 첨가했다.

약물 대사 효소의 유도제 처리는, 2mmol/L L-Glu, 2% B27 supplement, 1% N2 supplement, 100units/mL 페니실린G, 100μg/mL 스트렙토마이신, 100ng/mL EGF, 100ng/mL Noggin, 200ng/mL R-spondin-1, 성장 인자를 제거한 매트리젤 3% 혹은 다당류 폴리머(탈아실화젤란검)를 포함하는 Advanced-DMEM/F12에 1α,25-디하이드록시비타민D₃(VD3)를 1μmol/L로 되도록 첨가하고, 회수 전 72시간 배양함으로써 행하였다. 다당류 폴리머는 닛산화학공업주식회사로부터 제공받은 FP001 또는 FP003을 배지 중 농도 0.015%(w/v)로 사용하여, 장관 오가노이드로의 분화에 미치는 영향에 대하여 검토했다.

(5) 총리보핵산(RNA)추출

총RNA는 인간 iPS 세포의 분화 유도 종료 후, Agencourt RNAdvence Tissue의 첨부 매뉴얼에 따라 추출했다.

(6) 역전사반응

(7) Real-Time RT-PCR법

Real-Time RT-PCR은 KAPA SYBR Fast qPCR Kit를 사용하고, cDNA를 주형으로 하여, 반응은 첨부 매뉴얼에 따라 행하였다. 결과는 내재성 콘트롤로서 히포크산틴포스포리보실트랜스퍼라아제(HPRT)를 사용하여 보정했다.

(8) 헤마톡실린-에오신(HE) 염색

분화 유도 종료 후, 장관 오가노이드를 4% 파라포름알데히드로 고정하고, OCT 콤파운드로 동결 포매했다. 두께 10㎛의 동결 절편을 제작 후, 슬라이드 글라스에 부착하고, 마이어 헤마톡실린 및 에오신 알코올을 사용하여 염색했다.

(9) 면역형광염색

분화 유도 종료 후, 장관 오가노이드를 4% 파라포름알데히드로 고정하고, OCT 콤파운드로 동결 포매했다. 두께 10㎛의 동결 절편을 제작 후, 슬라이드 글라스에 부착하고, 항원의 부활화를 행하였다. 5% FBS 용액으로 30분간 블록킹하고, 1차항체를 4℃에서 하룻밤 반응시켰다. 그 후, 슬라이드 글라스를 세정하고, 2차항체를 실온에서 1시간 반응시키고, 핵염색으로서 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)을 사용했다. 봉입 작업을 행하고, Zeiss LSM510 공초점 레이저 현미경을 사용하고, 형광을 관찰했다.

(10) 로다민 123의 수송 실험

분화 유도 종료 후, 장관 오가노이드를 로다민 123을 포함하는 HBSS로 37℃에서 인큐베이션했다. HBSS는, 137mmol/L 염화나트륨, 5.4mmol/L 염화칼륨, 0.81mmol/L 황산 마그네슘, 0.44mmol/L 인산 2수소 칼륨, 0.34mmol/L 인산수소 2나트륨, 1.3mmol/L 염화칼슘, 4.2mmol/L 탄산 수소 나트륨, 5.6mmol/L D-글루코오스, 10mmol/L HEPES를 포함하는 pH 7.4인 것을 사용했다. 인큐베이션 종료 후, 빙랭한 PBS로 세포를 세정함으로써 업테이크를 정지시켰다. 37℃로 데운 PBS에서 4시간 인큐베이션함으로써, 로다민 123을 오가노이드 밖으로 방출시켰다. 그 후, Synergy HTX 마이크로플레이트리더를 사용하여 상청액의 형광강도를 측정했다. 수송 실험 종료 후, 단백질 정량을 행하고, 형광강도를 단백질량으로 보정했다.

(11) 훼스트 33342의 수송 실험

분화 유도 종료 후, 장관 오가노이드를 훼스트 33342를 포함하는 HBSS로 37℃에서 인큐베이션했다. 인큐베이션 종료 후, 빙랭한 PBS로 세포를 세정함으로써 업테이크를 정지시켰다. 37℃로 데운 PBS에서 4시간 인큐베이션함으로써, 훼스트 33342를 오가노이드 밖으로 방출시켰다. 그 후, Synergy HTX 마이크로플레이트리더를 사용하여 상청액의 형광강도를 측정했다. 수송 실험 종료 후, 단백질 정량을 행하고, 형광강도를 단백질량으로 보정했다.

(12) 약물 대사 실험

분화 유도 종료 후, 장관 오가노이드를 5μmol/L 미다졸람을 포함하는 배지(2mmol/L L-Glu, 2% B27 supplement, 1% N2 supplement, 100units/mL 페니실린G, 100μg/mL 스트렙토마이신을 포함하는 Advanced-DMEM/F12)에서 37℃에서 인큐베이션하고, 24시간 경과 후, 배지를 샘플링했다. 대사 활성은, 액체 크로마토그래피-매스스펙트로미터(spectrometer)(LC-MS/MS)를 사용하여 측정한 배지 중의 1-수산화미다졸람의 양으로부터 산출했다. 대사 실험 종료 후, 단백질 정량을 행하고, 대사 활성을 단백질량으로 보정했다.

본 검토에서는, 이하의 마커 유전자, 즉 α-SMA, ABCB1/MDR1, ABCG2/BCRP, CDX2, Chromogranin A, CYP3A4, E-cad(E-cadherin), Ki67(G1기, S기, G2기, M기에 있는 세포에 발현. 증식 세포 마커), LGR5, Lysozyme, MUC2, Occludin, OLFM4, PXR(프레그난 X 수용체. CYP3A4 등의 전사 조절에 관여하는 핵내 수용체), Sucrase-isomaltase(막관통 II형 당 단백질. 장의 상피세포의 솔모양 가장자리에 발현하고 있음), SLC15A 1/PEPT1, Villin, Vim(Vimentin)을 사용했다.

2. 결과·고찰

(1) 다당류 폴리머를 사용한 인간 장관 오가노이드로의 분화 유도

인간 iPS 세포로부터 장관 오가노이드로의 분화 유도 시음에 첨가하는 다당류 폴리머의 영향에 대하여 조사했다. 그 결과, FP001 및 FP003을 첨가한 군에서 장관 관련 유전자나 CYP3A 등을 비롯한 다양한 약물 동태 관련 유전자의 mRNA 발현량이 증가했다. 특히 FP001을 가한 군에서 성장 인자를 제거한 매트리젤 3%를 가한 콘트롤군에 비해, 장관에서의 주요한 약물 대사 효소인 시토크롬 P450(CYP)3A4에서 3.7배, 펩티드의 업테이크 트랜스포터인 SLC15A1/PEPT1에서 4.1배, 배출 트랜스포터인 ABCB1/MDR1에서 4.5배, 등 많은 약물 동태 관련 유전자의 mRNA 발현이 상승했다. 또한, 장관을 구성하고 있는 세포 마커인 Villin(흡수 상피세포), sucrase-isomaltase(상피세포의 솔모양 가장자리), MUC2(술잔세포), LGR5(장관 줄기세포)는 콘트롤군에 비해, 동일한 정도 혹은 그 이상의 mRNA 발현을 나타내었다(도 10).

(2) 다당류 폴리머를 사용하여 분화 유도한 인간 장관 오가노이드의 형태학적 관찰

매트리젤 및 다당류 폴리머를 사용하여 분화 유도한 인간 iPS 세포 유래 장관 오가노이드는 구형의 형태를 하고 있었다 (도 11의 A-C). HE 염색의 결과로부터, 다당류 폴리머를 사용하여 분화 유도한 인간 장관 오가노이드에 있어서도 관강이 확인되었다(도 11의 D-F).

(3) 다당류 폴리머를 사용하여 분화 유도한 인간 장관 오가노이드의 면역형광염색

면역형광염색에 의해, 장관을 구성하고 있는 다양한 세포(흡수 상피세포, 장관 줄기세포, 술잔세포, 장관내분비세포, 파네트 세포, 간엽계 세포) 및 배출 트랜스포터나 타이트 정션의 마커 발현이 인정되었다(도 12). 따라서, 장관 오가노이드는 이 세포를 포함하는 장관 조직 유사체인 것이 시사되었다.

(4) 다당류 폴리머를 사용하여 분화 유도한 인간 장관 오가노이드의 로다민 123을 사용한 ABCB1/MDR1의 기능 평가

배출 트랜스포터인 ABCB1/MDR1의 기질인 로다민 123 및 저해제인 베라파밀을 사용하여, ABCB1/MDR1의 기능 평가를 행하였다. 로다민 123의 장관 오가노이드 내로의 배출이 인정되고, 그 배출 방향의 수송은 베라파밀에 의해 억제되었다(도 13). 이러한 사실로부터, 다당류 폴리머를 사용하여 분화 유도한 인간 장관 오가노이드는, ABCB1/MDR1의 기능을 가지고 있는 것이 시사되었다.

(5) 다당류 폴리머를 사용하여 분화 유도한 인간 장관 오가노이드의 훼스트 33342를 사용한 ABCG2/BCRP의 기능 평가

배출 트랜스포터인 ABCG2/BCRP의 기질인 훼스트 33342 및 저해제인 Ko143을 사용하여, ABCG2/BCRP의 기능 평가를 행하였다. 훼스트 33342의 장관 오가노이드 내로의 배출이 인정되고, 그 배출 방향의 수송은 Ko143에 의해 억제되었다(도 14). 이러한 사실로부터, 다당류 폴리머를 사용하여 분화 유도한 인간 장관 오가노이드는, ABCG2/BCRP의 기능을 가지고 있는 것이 시사되었다.

(6) 다당류 폴리머를 사용하여 분화 유도한 인간 장관 오가노이드의 CYP3A4 유도능

CYP3A의 유도제인 1α,25-디하이드록시비타민D₃(VD3)를 사용하여, CYP3A4의 mRNA 발현 유도에 대하여 검토를 행하였다. 콘트롤군에 비해, VD3 첨가군에서 유의하게 CYP3A4의 mRNA 발현이 유도되었다(도 15의 A). 또한, VD3 첨가군에 있어서, 유의하게 미다졸람의 대사 활성이 상승하고(도 15의 B), CYP3A4의 단백질 레벨에서의 유도가 인정되었다. 이러한 사실로부터, 다당류 폴리머를 사용하여 분화 유도한 인간 장관 오가노이드에서는 CYP3A4의 약물 응답성을 가지고 있는 것이 시사되었다.

(7) 다당류 폴리머를 사용하여 분화 유도한 인간 장관 오가노이드의 CYP3A4 대사 활성

CYP3A4의 기질인 미다졸람과 그 저해제인 케토코나졸를 사용하여, CYP3A4의 대사 활성을 평가했다. 인간 장관 오가노이드에 있어서, 미다졸람의 대사 활성이 인정되고, 그 활성은 케토코나졸의 첨가에 의해 유의하게 저해되었다(도 16). 따라서, 다당류 폴리머를 사용하여 분화 유도한 인간 장관 오가노이드에서는, CYP3A4의 대사능을 가지고 있는 것이 시사되었다.

3. 결론

이상의 결과로부터, 본 연구에서는, 인간 iPS 세포로부터 장관 오가노이드로의 분화에 있어서 유용한 부유제(점성 재료)를 새로이 발견할 수 있었다. 또한, 이 방법에 의해 제작한 장관 오가노이드는, 배출 트랜스포터의 수송 기능에 더하여, 약물 대사 효소활성 및 유도능을 가지는 등, 장관에 특징적인 다양한 약물 동태학적 기능을 가지고 있는 것이 밝혀졌다. 또한, FP001 및 FP003은 다당류의 폴리머이며 이종 동물 유래 성분을 포함하지 않으므로, 장관 오가노이드를 재생의료에 사용할 때 사용하는 배양 재료로서 극히 유용한 것으로 여겨진다.

[산업상 이용가능성]

본 발명은 기능적인 장관 오가노이드의 제작을 가능하게 한다. 본 발명에서 사용하는 인자의 조합(MEK1/2 저해제, DNA 메틸화 저해제, TGFβ 수용체 저해제 및 γ-세크레타아제 저해제)은 저렴하며 로트간 차이가 적은 저분자 화합물이다. 이 특징은 실용성의 점에 있어서 극히 중요하며, 본 발명에 의하면, 장관 오가노이드의 제작 비용의 저감, 장관 오가노이드의 품질 및 신뢰성의 향상 등을 초래한다. 본 발명에 의해 제작한 장관 오가노이드는 기능적인 구조체이며, 다양한 용도로의 적용을 기대할 수 있다. 예를 들면, in vitro 평가계(약효, 독성, 약물 동태의 평가), 난치성 염증 장질환 등의 장관 병태 모델의 제작 및 이것을 사용한 병태 기전의 규명, 생체(인간, 실험 동물 등)로의 이식에 이용될 수 있다.

본 발명은, 상기 발명의 실시형태 및 실시예의 설명으로 전혀 한정되는 것은 아니다. 특허청구의 범위 기재를 일탈하지 않고, 당업자가 용이하게 상도(想到)할 수 있는 범위에서 각종 변형 태양도 본 발명에 포함된다. 본 명세서 중에서 명시한 논문, 공개 특허공보, 및 특허 공보 등의 내용은, 그 모든 내용을 원용에 의해 인용하는 것으로 한다.

Claims

하기 공정(1)∼공정(4)를 포함하는, 다능성줄기세포(pluripotent stem cell)로부터 장관(腸管) 오가노이드(organoid)를 제작하는 방법:
(1) 다능성줄기세포를 내배엽 유사 세포(endoderm-like cell)로 분화시키는 공정;
(2) 공정(1)에서 얻어진 내배엽 유사 세포를 장관 줄기세포 유사 세포로 분화시키는 공정;
(3) 공정(2)에서 얻어진 장관 줄기세포 유사 세포를 배양하여, 스페로이드(spheroid)를 형성시키는 공정;
(4) 공정(3)에서 형성된 스페로이드를 분화시키고, 장관 오가노이드를 형성시키는 공정으로서, 상피성장인자, BMP 저해제 및 Wnt 시그널 활성화제에 더하여, MEK1/2 저해제, DNA 메틸화 저해제, TGFβ 수용체 저해제 및 γ-세크레타아제 저해제의 존재 하에서의 배양을 포함하는 공정.
제1항에 있어서,
상기 다능성줄기세포가 인공다능성줄기세포 또는 배아줄기세포인, 제작 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 다능성줄기세포가 인간 또는 영장류의 세포인, 제작 방법.
제1항에 있어서,
상기 다능성줄기세포가 인간 인공다능성줄기세포이며, 공정(2)가 FGF4와 Wnt 아고니스트의 존재 하에서의 배양을 포함하는, 제작 방법.
제4항에 있어서,
상기 인간 인공다능성줄기세포가, 장질환 환자 유래의 인공다능성줄기세포인, 제작 방법.
제1항에 있어서,
상기 다능성줄기세포가 게잡이원숭이(cynomolgus monkey) 인공다능성줄기세포이며, 공정(2)가 FGF2와 GSK-3 저해제의 존재 하에서의 배양을 포함하는, 제작 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
공정(3)의 배양에 있어서, 균일한 형상 및 크기의 복수의 웰이 세포저접착성 또는 세포비접착성의 배양면에 형성된 배양 용기를 사용하여, 복수의 스페로이드를 함께 형성시키는, 제작 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
BMP 저해제가 Noggin이며, Wnt 시그널 활성화제가 R-spondin-1인, 제작 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
MEK1/2 저해제가 PD98059이며, DNA 메틸화 저해제가 5-아자-2'-데옥시시티딘이며, TGFβ 수용체 저해제가 A-83-01이며, γ-세크레타아제 저해제가 N-[(3,5-디플루오로페닐)아세틸]-L-알라닐-2-페닐-1,1-디메틸에틸에스테르-글리신(N-[(3,5-difluorophenyl)acetyl]-L-alanyl-2-phenyl-1,1-dimethylethyl ester-glycine)인, 제작 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
수용액 중에 3차원적 그물눈 구조를 형성하는 재료를 첨가한 액체 배지를 공정(4)의 배양에 사용하고, 공정(3)에서 형성시킨 복수의 스페로이드가 함께 부유(浮遊) 배양되는, 제작 방법.
제10항에 있어서,
상기 재료가 고분자 겔 및 다당으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 재료인, 제작 방법.
제10항에 있어서,
상기 재료가 탈(脫)아실화젤란검을 포함하는, 제작 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
공정(4)의 배양 기간이 12일간∼36일간인, 제작 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
공정(4)가 하기 공정(4-1)과 공정(4-2)을 포함하는, 제작 방법:
(4-1) 상피성장인자, BMP 저해제 및 Wnt 시그널 활성화제의 존재 하에서 배양하는 공정;
(4-2) 상피성장인자, BMP 저해제 및 Wnt 시그널 활성화제에 더하여, MEK1/2 저해제, DNA 메틸화 저해제, TGFβ 수용체 저해제 및 γ-세크레타아제 저해제의 존재 하에서 배양하는 공정.
제14항에 있어서,
공정(4-1)의 배양 기간이 3일간∼15일간이며, 공정(4-2)의 배양 기간이 3일간∼21일간인, 제작 방법.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 기재된 제작 방법에 의해 얻어진 장관 오가노이드.
제16항에 기재된 장관 오가노이드를 사용한, 피험물질의 체내 동태 또는 독성을 평가하는 방법.
제17항에 있어서,
상기 체내 동태가, 대사, 흡수성, 막투과성, 약물 상호 작용, 약물 대사 효소의 유도, 또는 약물 트랜스포터의 유도인, 평가 방법.
제18항에 있어서,
하기 공정(I) 및 공정(II)를 포함하는 방법:
(I) 제16항에 기재된 장관 오가노이드에 피험물질을 접촉시키는 공정;
(II) 피험물질의 대사, 흡수성, 막투과성, 약물 상호 작용, 약물 대사 효소의 유도, 또는 약물 트랜스포터의 유도, 혹은 독성을 측정·평가하는 공정.
제16항에 기재된 장관 오가노이드를 포함하는 이식(移植) 재료.