JP7174426B2 - 多能性幹細胞由来腸管オルガノイドの作製法 - Google Patents
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Description
[1]以下の工程(1)~(4)を含む、多能性幹細胞から腸管オルガノイドを作製する方法:
(1)多能性幹細胞を内胚葉様細胞へと分化させる工程;
(2)工程(1)で得られた内胚葉様細胞を腸管幹細胞様細胞へと分化させる工程;
(3)工程(2)で得られた腸管幹細胞様細胞を培養し、スフェロイドを形成させる工程;
(4)工程(3)で形成されたスフェロイドを分化させ、腸管オルガノイドを形成させる工程であって、上皮成長因子、BMP阻害剤及びWntシグナル活性化剤に加えて、MEK1/2阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤及びγ-セクレターゼ阻害剤の存在下での培養を含む工程。
[2]前記多能性幹細胞が人工多能性幹細胞又は胚性幹細胞である、[1]に記載の作製方法。
[3]前記多能性幹細胞がヒト又は霊長類の細胞である、[1]又は[2]に記載の作製方法。
[4]前記多能性幹細胞がヒト人工多能性幹細胞であり、工程(2)がFGF4とWntアゴニストの存在下での培養を含む、[1]に記載の作製方法。
[5]前記ヒト人工多能性幹細胞が、腸疾患の患者由来の人工多能性幹細胞である、[4]に記載の作製方法。
[6]前記多能性幹細胞がカニクイザル人工多能性幹細胞であり、工程(2)がFGF2とGSK-3阻害剤の存在下での培養を含む、[1]に記載の作製方法。
[7]工程(3)の培養において、均一な形状及び大きさの複数のウェルが細胞低接着性又は細胞非接着性の培養面に形成された培養容器を使用し、複数のスフェロイドをまとめて形成させる、[1]~[6]のいずれか一項に記載の作製方法。
[8]BMP阻害剤がNogginであり、Wntシグナル活性化剤がR-spondin-1である、[1]~[7]のいずれか一項に記載の作製方法。
[9]MEK1/2阻害剤がPD98059であり、DNAメチル化阻害剤が5-アザ-2’-デオキシシチジンであり、TGFβ受容体阻害剤がA-83-01であり、γ-セクレターゼ阻害剤がN-[(3,5-difluorophenyl) acetyl]-L-alanyl-2-phenyl-1,1-dimethylethyl ester-glycineである、[1]~[8]のいずれか一項に記載の作製方法。
[10]水溶液中に3次元的網目構造を形成する材料を添加した液体培地を工程(4)の培養に用い、工程(3)で形成させた複数のスフェロイドがまとめて浮遊培養される、[1]~[9]のいずれか一項に記載の作製方法。
[11]前記材料が高分子ゲル及び多糖からなる群より選択される一以上の材料である、[10]に記載の作製方法。
[12]前記材料が脱アシル化ジェランガムを含む、[10]に記載の作製方法。
[13]工程(4)の培養期間が12日間~36日間である、[1]~[12]のいずれか一項に記載の作製方法。
[14]工程(4)が、以下の工程(4-1)と工程(4-2)を含む、[1]~[12]のいずれか一項に記載の作製方法:
(4-1)上皮成長因子、BMP阻害剤及びWntシグナル活性化剤の存在下で培養する工程;
(4-2)上皮成長因子、BMP阻害剤及びWntシグナル活性化剤に加えて、MEK1/2阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤及びγ-セクレターゼ阻害剤の存在下で培養する工程。
[15]工程(4-1)の培養期間が3日間~15日間であり、工程(4-2)の培養期間が3日間~21日間である、[14]に記載の作製方法。
[16][1]~[15]のいずれか一項に記載の作製方法で得られた腸管オルガノイド。
[17][16]に記載の腸管オルガノイドを用いた、被検物質の体内動態又は毒性を評価する方法。
[18]前記体内動態が、代謝、吸収性、膜透過性、薬物相互作用、薬物代謝酵素の誘導、又は薬物トランスポーターの誘導である、[17]に記載の評価方法。
[19]以下の工程(I)及び(II)を含む、[18]に記載の方法:
(I)[16]に記載の腸管オルガノイドに被検物質を接触させる工程;
(II)被検物質の代謝、吸収性、膜透過性、薬物相互作用、薬物代謝酵素の誘導、又は薬物トランスポーターの誘導、或いは毒性を測定・評価する工程。
[20][16]に記載の腸管オルガノイドを含む、移植材料。
本発明は多能性幹細胞から腸管オルガノイドを作製する方法(以下、「本発明の作製方法」とも呼ぶ。)に関する。本発明によれば、生体の腸管組織と類似の特性を示す(腸管組織を模倣した)3次元組織構造体である腸管オルガノイドが得られる。
この工程では多能性幹細胞を培養し、内胚葉様細胞へと分化させる。換言すれば、内胚葉様細胞への分化を誘導する条件下で多能性幹細胞を培養する。多能性幹細胞が内胚葉様細胞に分化する限り、培養条件は特に限定されない。例えば、常法に従い、アクチビンAを添加した培地で培養する。この場合、培地中のアクチビンAの濃度を例えば10 ng/mL~200 ng/mL、好ましくは20 ng/mL~150 ng/mLとする。細胞の増殖率や維持等の観点から、培地に血清又は血清代替物(Knockout serum replacement(KSR)など)を添加することが好ましい。血清はウシ胎仔血清に限られるものではなく、ヒト血清や羊血清等を用いることもできる。血清又は血清代替物の添加量は例えば0.1%(v/v)~10%(v/v)である。
この工程では、工程(1)で得られた内胚葉様細胞を培養し、腸管幹細胞様細胞へと分化させる。換言すれば、腸管幹細胞様細胞への分化を誘導する条件下で内胚葉細胞を培養する。内胚葉様細胞が腸管幹細胞様細胞へ分化する限り、培養条件は特に限定されない。工程(1)に供する多能性幹細胞としてヒト細胞を用いた場合には、好ましくは、FGF4(線維芽細胞増殖因子4)とWntアゴニスト(例えばWnt3a、BML-284、2-Amino-4-(3,4-(methylenedioxy)benzylamino)-6-(3-methoxyphenyl)pyrimidine等)の存在下で培養を行う。FGF4として好ましくはヒトFGF4(例えばヒト組換えFGF4)を用いる。一方、工程(1)に供する多能性幹細胞としてカニクイザル細胞やアカゲザル細胞、チンパンジー細胞等を用いた場合には、好ましくは、FGF2(線維芽細胞増殖因子2)とGSK-3阻害剤(例えばCHIR99021、CHIR98014、BIO、SB415286、SB216763、TWS119、A1070722等)の存在下で培養を行う。FGF2として例えばヒトFGF2(例えばヒト組換えFGF2)を用いる。
この工程では、工程(2)で得られた腸管幹細胞様細胞を培養し、スフェロイドを形成させる。スフェロイドを形成させるためには浮遊培養が適する。浮遊培養では、通常、細胞低接着性又は細胞非接着性の培養面(例えば、ポリマー材料やハイドロゲル等の処理/結合により細胞低接着性/細胞非接着性が付与された培養面)を備える培養容器が使用され、培養面から離れた状態(即ち浮遊状態)で細胞を培養する。浮遊培養に用いる培養容器は特に限定されず、例えば、ディッシュ、フラスコ、マルチウェルプレート、チューブ、トレイ、培養バック等を用いることができる。好ましくは、細胞低接着性又は細胞非接着性の培養面に均一な形状及び大きさの複数のウェルが形成された培養容器(一般にパターンプレートと呼ばれる。具体例として、AGCテクノグラス株式会社が提供するEZSPHERE(登録商標)、株式会社クラレが提供するElplasia等を挙げることができる)を使用し、複数のスフェロイドをまとめて形成させる。このようにすれば、効率よくスフェロイドを形成させることができ、ひいては腸管オルガノイドの作製効率が向上する。
この工程では、工程(3)で形成されたスフェロイドを分化させ、腸管オルガノイドを形成させる。この目的のため、上皮成長因子、BMP阻害剤及びWntシグナル活性化剤に加え、MEK1/2阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤及びγ-セクレターゼ阻害剤の存在下での培養を行う。MEK1/2阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤及びγ-セクレターゼ阻害剤の組合せを用いる点は本発明において特に特徴的であり、分化誘導効率の向上、腸管オルガノイドの成熟化の促進に寄与する。
この工程は、4種の低分子化合物(MEK1/2阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤及びγ-セクレターゼ阻害剤)の組合せによる積極的な分化誘導を促す前の準備の段階として位置付けることができる。この工程を介在させることにより、スフェロイドの成長が促され、機能的な腸管オルガノイドの構築に有利となる。この工程の培養は、工程(3)と同条件(即ち、上皮成長因子、BMP阻害剤及びWntシグナル活性化剤の存在下での浮遊培養)で行うことができるが、好ましくは、水溶液中に3次元的網目構造を形成する材料(粘性材料)を添加した液体培地を用い、工程(3)で形成させた複数のスフェロイドをまとめて浮遊培養することで、操作性及び効率性の向上を図る。
この工程では、上皮成長因子、BMP阻害剤及びWntシグナル活性化剤に加えて、MEK1/2阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤及びγ-セクレターゼ阻害剤の存在下での浮遊培養を行い、積極的な分化誘導を促し、腸管オルガノイドを形成させる。培養条件は上記工程(4)の培養条件と同様であるため、その説明を省略する。
本発明の第2の局面は本発明の作製方法で得られた腸管オルガノイドの用途に関する。第1の用途として各種アッセイが提供される。本発明の腸管オルガノイドは腸管、特に小腸のモデル系に利用可能であり、腸管、特に小腸での薬物動態(吸収、代謝など)の評価や毒性の評価に有用である。換言すれば、本発明の腸管オルガノイドは、化合物の体内動態の評価や毒性の評価にその利用が図られる。
機能的な腸管オルガノイドを作製する新規方法の創出を目指し、以下の検討を行った。
(1)細胞
ヒトiPS細胞(iPS-51:Windy)は、ヒト胎児肺線維芽細胞MRC-5にoctamer binding protein 3/4(OCT3/4)、sex determining region Y-box 2(SOX2)、kruppel-like factor 4(KLF4)、v-myc myelocytomatosis viral oncogene homolog(avian)(c-MYC)を、パントロピックレトロウイルスベクターを用いて導入後、ヒトES細胞様コロニーをクローン化したものであり、国立成育医療研究センター梅澤明弘博士よりご供与いただいた。カニクイザルiPS細胞はカニクイザル皮膚組織より培養した線維芽細胞にエピソーマルベクターであるpCXLE-hOCT3/4-shp53-F、pCXLE-hSK、pCXLE-hULをエレクトロポレーション法にて導入後、カニクイザルES細胞様コロニーをクローン化したものであり、本発明者らが樹立した。フィーダー細胞はマウス胎仔線維芽細胞(MEF)を使用した。
MEFの培養には10%ウシ胎仔血清(FBS)、2 mmol/L L-グルタミン(L-Glu)、1%非必須アミノ酸(NEAA)、100 units/mLペニシリンG、100μg/mLストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)を用いた。MEFの剥離液には0.05%トリプシン-エチレンジアミン四酢酸(EDTA)を、MEFの保存液にはセルバンカー1を用いた。ヒトiPS細胞の維持培養には20%ノックアウト血清代替物(KSR)、0.8% NEAA、2 mmol/L L-Glu、0.1 mmol/L 2-メルカプトエタノール(2-MeE)、5 ng/mL線維芽細胞増殖因子(FGF)2を含むDMEM Ham’s F-12(DMEM/F12)を用いた。カニクイザルiPS細胞の維持培養には20%KSR、1.0% NEAA、2 mmol/L L-Glu、100 units/mLペニシリンG、100μg/mLストレプトマイシン、0.1 mmol/L 2-MeE、5 ng/mL FGF2を含むDMEM/F12を用いた。ヒト及びカニクイザルiPS細胞の剥離液には1 mg/mLコラゲナーゼIV、0.25%トリプシン、20% KSR、1 mmol/L塩化カルシウムを含むダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を用いた。ヒト及びカニクイザルiPS細胞の保存液には霊長類ES/iPS細胞用凍結保存液を用いた。
ヒトiPS細胞はマイトマイシンC処理を施したMEF(6×105 cells/100 mmディッシュ)上に、カニクイザルiPS細胞はマイトマイシンC処理を施したMEF(1×106 cells/100 mmディッシュ)上に播種し、5% CO2/95% air条件下CO2インキュベーター中37℃にて培養した。ヒト及びカニクイザルiPS細胞の継代は、3~5日培養後、1:2~1:3のスプリット比で行った。ヒト及びカニクイザルiPS細胞は解凍48時間後に培地を交換し、それ以降は毎日交換した。
ヒト及びカニクイザルiPS細胞の腸管オルガノイドへの分化は、継代時にヒト及びカニクイザルiPS細胞用培地にて30倍に希釈したマトリゲル(成長因子除去)にてコートした培養ディッシュに播種し、35 ng/mL FGF2を含むStemSure(登録商標) hPSC 培地にて培養し、未分化コロニーの占める割合が約80%になった状態で開始した。100 ng/mLアクチビンA、100 units/mLペニシリンG、100μg/mLストレプトマイシン、2 mmol/L L-Gluを含むロズウェルパーク記念研究所(RPMI)培地で1日間、0.2% FBS、100 ng/mLアクチビンA、100 units/mLペニシリンG、100μg/mLストレプトマイシン、2 mmol/L L-Gluを含むRPMI培地で1日間、2% FBS、100 ng/mLアクチビンA、100 units/mLペニシリンG、100μg/mLストレプトマイシン、2 mmol/L L-Gluを含むRPMI培地で1日間培養することで内胚葉に分化させた。その後、ヒトiPS細胞では、2% FBS、500 ng/mL FGF4、500 ng/mL Wnt3a、100 units/mLペニシリンG、100μg/mLストレプトマイシンを含むRPMI+グルタマックス培地で4日間培養することで腸管幹細胞へ分化させた。カニクイザルiPS細胞では、2% FBS、250 ng/mL FGF2、6μmol/L CHIR99021、100 units/mLペニシリンG、100μg/mLストレプトマイシンを含むRPMI+グルタマックス培地で4日間培養することで腸管幹細胞へ分化させた。ヒトiPS細胞ではFGF4、Wnt3a処理後、カニクイザルiPS細胞では、FGF4、CHIR99021処理後、Y-27632(Rho結合キナーゼ阻害剤)を10μmol/Lとなるように添加し、5% CO2/95% air条件下CO2インキュベーター中37℃にて60分間処理した細胞を0.05%トリプシン-EDTAにて剥離し、40μmナイロンメッシュのセルストレイナーにて細胞塊を砕き、7.0×106細胞を100 mm EZSPHERE(登録商標)上に播種した。その後、2 mmol/L L-Glu、2% B27 supplement、1% N2 supplement、100 units/mLペニシリンG、100μg/mLストレプトマイシン、100 ng/mL上皮成長因子(EGF)、100 ng/mL Noggin、200 ng/mL R-spondin-1、10μmol/L Y-27632を含むAdvanced-DMEM/F12で3日間培養後、2 mmol/L L-Glu、2% B27 supplement、1% N2 supplement、100 units/mLペニシリンG、100μg/mLストレプトマイシン、100 ng/mL EGF、100 ng/mL Noggin、200 ng/mL R-spondin-1、成長因子を除去したマトリゲル3%を含むAdvanced-DMEM/F12で24日間超低接着6ウェルプレート上で浮遊培養することで腸管オルガノイドへ分化させた。薬物代謝酵素の誘導剤処理は、2 mmol/L L-Glu、2% B27 supplement、1% N2 supplement、100 units/mLペニシリンG、100μg/mLストレプトマイシン、100 ng/mL EGF、100 ng/mL Noggin、200 ng/mL R-spondin-1、成長因子を除去したマトリゲル3%を含むAdvanced-DMEM/F12にリファンピシンを40μmol/Lもしくは1α,25-ジヒドロキシビタミンD3(VD3)を1μmol/Lとなるよう添加し、回収前72時間培養することで行った。また、分化開始19日目から34日目まで、以前我々が見出した低分子化合物であるPD98059(20μmol/L)、5-アザ-2’-デオキシシチジン(5μmol/L)、A-83-01(0.5μmol/L)に加え、5μmol/L N-[(3,5-ジフルオロフェニル) アセチル]-L-アラニル-2-フェニル-1, 1-ジメチルエチルエステル-グリシン(DAPT)を添加し、腸管オルガノイドへの分化に及ぼす影響について検討した。尚、以上の培養方法(分化プロトコール)の概要を図9に示す。
総RNAはヒト及びカニクイザルiPS細胞の分化誘導終了後、Agencourt RNAdvence Tissueの添付マニュアルに従い抽出した。
相補的DNA(cDNA)の合成は、ReverTra Ace qPCR RT Master Mixを使用し、添付マニュアルに従い行った。
Real-Time RT-PCRはKAPA SYBR Fast qPCR Kitを用い、cDNAを鋳型にして、反応は添付マニュアルに従い行った。結果は内在性コントロールとしてグリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素(GAPDH)を用いて補正した。
分化誘導終了後、腸管オルガノイドを4%パラホルムアルデヒドにて固定し、OCTコンパウンドにて凍結包埋した。厚さ10μmの凍結切片を作製後、スライドガラスに貼り付け、HE染色では、マイヤーヘマトキシリン及びエオシンアルコールを使用して染色した。アルシアンブルー染色では、pH2.5におけるアルシアンブルーを染色し、核染色としてヌクレアファストレッドを使用した。
分化誘導終了後、腸管オルガノイドを4%パラホルムアルデヒドにて固定し、OCTコンパウンドにて凍結包埋した。厚さ10μmの凍結切片を作製後、スライドガラスに貼り付け、抗原の賦活化を行った。5% FBS溶液にて30分間ブロッキングし、一次抗体を4℃で1晩反応させた。その後、スライドガラスを洗浄し、二次抗体を室温で1時間反応させ、核染色として4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)を用いた。封入作業を行い、Zeiss LSM510共焦点レーザー顕微鏡を用いて、蛍光を観察した。
分化誘導終了後、腸管オルガノイドを2.5%グルタルアルデヒドにて前固定し、4℃で一晩インキュベーションした。その後、1%四酸化オスミウムにて4℃で2時間、後固定を行い、エタノールによる脱水作業を行った。プロピレンオキサイドに置換した後、樹脂内に包埋した。0.1μmの切片を作製し、酢酸ウラニルにて電子染色を行った後、JEM-1400 Plus透過型電子顕微鏡を用いて、微絨毛及びタイトジャンクションの観察を行った。
分化誘導終了後、腸管オルガノイドをFITC-dextran 4000(FD-4)を含むHBSS(ハンクス緩衝塩類溶液)で37℃にてインキュベーションした。HBSSは、137 mmol/L塩化ナトリウム、5.4 mmol/L塩化カリウム、0.81 mmol/L硫酸マグネシウム、0.44 mmol/Lリン酸二水素カリウム、0.34 mmol/Lリン酸水素二ナトリウム、1.3 mmol/L塩化カルシウム、4.2 mmol/L炭酸水素ナトリウム、5.6 mmol/L D-グルコース、10 mmol/L HEPESを含むpH 7.4のものを用いた。インキュベーション終了後、氷冷したHBSSで細胞を洗浄した。その後、Nikon ECLIPSE Ti-S顕微鏡を用いて、蛍光を観察した。
分化誘導終了後、腸管オルガノイドをローダミン123を含むHBSSで37℃にてインキュベーションした。インキュベーション終了後、氷冷したHBSSで細胞を洗浄することにより取り込みを停止させた。その後、Zeiss LSM510共焦点レーザー顕微鏡を用いて、蛍光を観察した。
分化誘導終了後、腸管オルガノイドを5μmol/Lミダゾラムを含む培地(2 mmol/L L-Glu、2% B27 supplement、1% N2 supplement、100 units/mLペニシリンG、100μg/mLストレプトマイシンを含むAdvanced-DMEM/F12)で37℃にてインキュベーションし、24時間経過後、培地をサンプリングした。代謝活性は、液体クロマトグラフィー-マススペクトロメーター(LC-MS/MS)を用いて測定した培地中の1-水酸化ミダゾラムの量より算出した。代謝実験終了後、タンパク定量を行い、代謝活性をタンパク量で補正した。
α-SMA(alpha-smooth muscle actin。平滑筋マーカー)
ABCB1/MDR1(ATP結合カセットトランスポーターB1/多剤耐性タンパク1。P糖タンパク質。排出トランスポーター)
ABCC2/MRP2(ATP結合カセットトランスポーターC2/多剤耐性関連タンパク質2。排出トランスポーター)
ABCG2/BCRP(ATP結合カセットトランスポーターG2/乳ガン耐性タンパク。排出トランスポーター)
CDX2(Caudal-type ホメオボックス2。腸管上皮細胞の増殖・分化に関与している転写因子)
Chromogranin A(分泌顆粒中に存在する特異的なタンパク質。腸管内分泌細胞マーカー)
CYP3A4(シトクロムP450 3A4。ヒト小腸において主要な薬物代謝酵素)
CYP3A8(シトクロムP450 3A8。カニクイザル小腸において主要な薬物代謝酵素)
E-cad(E-cadherin)(上皮カドヘリン。細胞表面に存在する糖タンパク質の一群であり、細胞接着をつかさどる分子)
LGR5(ロイシンリッチリピートを含むGタンパク質共役型受容体。腸管幹細胞のマーカー)
Lysozyme(真正細菌の細胞壁を構成する多糖類を加水分解する酵素。腸管パネート細胞マーカー)
MUC2(ムチン2糖タンパク。杯細胞マーカー)
Occludin(オクルディン。タイトジャンクション(密着結合)の形成に関わる主要なタンパク質)
OLFM4(オルファクトメジン4。腸管幹細胞マーカー)
SLC15A1/PEPT1(SLC(solute carrier)ファミリー メンバー15A1/ペプチドトランスポーター1。小腸の頂側膜側に発現している)
SLCO2B1/OATP2B1(SLC(solute carrier)有機アニオントランスポーター2B1。小腸の頂側膜側に発現している)
Villin(ビリン。微絨毛の主要な構成成分。吸収上皮細胞マーカー)
Vim(Vimentin)(ビメンチン。間葉系細胞に特有の中間径フィラメント)
(1)低分子化合物を用いた腸管オルガノイドへの分化誘導(図1)
ヒト及びカニクイザルiPS細胞から腸管オルガノイドへの分化誘導の際に添加する低分子化合物の影響について調べた。その結果、A-83-01(0.5μmol/L)、PD98059(20μmol/L)、5-アザ-2’-デオキシシチジン(5μmol/L)を添加した群(A/PD/5-aza)で腸管関連遺伝子やCYP3A等をはじめとする様々な薬物動態関連遺伝子のmRNA発現量は増加した。さらにDAPT(5μmol/L)を加えた群(A/PD/5-aza/DAPT)でヒト腸管オルガノイドにおいては、コントロール群に比べ、腸管での主要な薬物代謝酵素であるシトクロムP450(CYP)3A4で約2,000倍、ペプチドの取り込みトランスポーターであるSLC15A1/PEPT1で約10倍、排出トランスポーターであるABCB1/MDR1で約36倍、ABCG2/BCRPで約125倍、ABCC2/MRP2で約47倍など多くの薬物動態関連遺伝子のmRNA発現が上昇した。また、腸管を構成している細胞マーカーであるVillin(吸収上皮細胞)、MUC2(杯細胞)、Chromogranin A(腸管内分泌細胞)、CDX2(腸管系譜の細胞)、LGR5(腸管幹細胞)はコントロール群に比べ、同程度もしくはそれ以上のmRNA発現を示した。カニクイザル腸管オルガノイドにおいてもヒトと同様の傾向を示し、コントロール群に比べ、CYP3A8で約1,400倍、SLC15A1/PEPT1で約2,200倍、ABCB1/MDR1で約18倍、ABCG2/BCRPで約2.8倍、ABCC2/MRP2で約27倍など多くの薬物動態関連遺伝子のmRNA発現が上昇した。また、Villin、MUC2、Chromogranin A、Lysozyme、CDX2はコントロール群に比べ、同程度もしくはそれ以上のmRNA発現を示した。したがって、以降の実験では、A-83-01、PD98059、5-アザ-2’-デオキシシチジン及びDAPTを添加して分化を行い、解析を進めた。
低分子化合物の新規組み合わせにより分化誘導したヒト及びカニクイザルiPS細胞由来腸管オルガノイドは球状の形をしていた(図2A,B)。透過型電子顕微鏡の観察から腸管オルガノイドの内側に腸管刷子縁膜側に存在する微絨毛及びタイトジャンクションの形成が確認された(図2C,D)。また、HE染色やアルシアンブルー染色の結果から、腸管オルガノイドは分泌細胞を含む細胞集団であることが分かった(図2E~J)。
免疫蛍光染色により、腸管を構成している様々な細胞(吸収上皮細胞、腸管幹細胞、杯細胞、腸管内分泌細胞、パネート細胞、間葉系細胞)のマーカーの発現が認められた(図3)。したがって、腸管オルガノイドはこれらの細胞を含む腸管組織類似体であることが示唆された。
機能的なタイトジャンクションが形成されているか確認するため、まず免疫蛍光染色にて、タイトジャンクションマーカーであるOccludinのタンパク質発現を確認した(図4A~C)。この結果から、タイトジャンクションは、腸管オルガノイドの管腔側に沿って発現していることが示唆された。また、透過型電子顕微鏡の観察から、腸管オルガノイドの管腔内側が腸管刷子縁膜側に相当することが明らかとなった(図2C,D)。そこで、非吸収性マーカーであるFITC-dextran 4000(FD-4)を用いた腸管オルガノイド内への透過試験を行ったところ、オルガノイド内への蓄積は認められなかった(図4D~G)。この結果から、低分子化合物の新規組み合わせにより分化誘導したヒト及びカニクイザル腸管オルガノイドは機能的なタイトジャンクションを形成していることが示唆された。
低分子化合物の新規組み合わせにより分化誘導したヒト及びカニクイザル腸管オルガノイドでは、小腸に特異的に発現しているSLC15A1/PEPT1、及び腸管で主要な排泄トランスポーターであるABCB1/MDR1のタンパク質発現が腸管オルガノイドの内側管腔に沿って認められた(図5)。
排出トランスポーターであるABCB1/MDR1の基質であるローダミン123及び阻害剤であるベラパミルを用いて、ABCB1/MDR1の機能評価を行った。ローダミン123の腸管オルガノイド内への排出が認められ(図6A,B)、その排出方向の輸送はベラパミルにより顕著に抑制された(図6C,D)。このことから、低分子化合物の新規組み合わせにより分化誘導したヒト腸管オルガノイドは、ABCB1/MDR1の機能を有していることが示唆された。
CYP3Aの誘導剤であるリファンピシン及び1α,25-ジヒドロキシビタミンD3(VD3)を用いて、CYP3AのmRNA発現誘導について検討を行った。ヒト腸管オルガノイドでは、コントロール群に比べ、リファンピシン添加群で約2倍、VD3添加群で約4.5倍と有意にCYP3A4のmRNA発現が誘導された(図7)。このことから、低分子化合物の新規組み合わせにより分化誘導したヒト腸管オルガノイドではCYP3Aの薬物応答性を有していることが示唆された。カニクイザル腸管オルガノイドでは、コントロール群に比べ、リファンピシン添加群で約2倍と有意にCYP3A8のmRNA発現は誘導されたが、VD3でのmRNA発現誘導は認められなかった(図7)。
ヒトCYP3A4及びカニクイザルCYP3A8の基質であるミダゾラムとその阻害剤であるケトコナゾールを用いて、CYP3A8の代謝活性を評価した。カニクイザル腸管オルガイドにおいて、ミダゾラムの代謝活性が認められ、その活性はケトコナゾールの添加により、約20分の1に有意に阻害された(図8)。したがって、低分子化合物の新規組み合わせにより分化誘導したカニクイザル腸管オルガノイドでは、CYP3A8の代謝能を有していることが示唆された。
以上の結果より、本研究では、ヒト及びカニクイザルiPS細胞から腸管オルガノイドへの分化促進に有用である低分子化合物の組み合わせを新たに見出すことができた。また、この方法によって作製した腸管オルガノイドは、機能的なタイトジャンクション、排出トランスポーターの輸送機能に加え、薬物代謝酵素活性及び誘導能を有するなど、腸管に特徴的な様々な薬物動態学的機能を有していることが明らかとなった。
分化促進及びより高い機能の獲得、並びに異種動物由来成分を使用しない培養系の構築を目指し、腸管オルガノイドを作製する際、マトリゲルの代替として多糖類ポリマーを使用した培地を用いて浮遊培養を行った。
(1)細胞
ヒトiPS細胞(iPS-51:Windy)は、ヒト胎児肺線維芽細胞MRC-5にoctamer binding protein 3/4(OCT3/4)、sex determining region Y-box 2(SOX2)、kruppel-like factor 4(KLF4)、v-myc myelocytomatosis viral oncogene homolog(avian)(c-MYC)を、パントロピックレトロウイルスベクターを用いて導入後、ヒトES細胞様コロニーをクローン化したものであり、国立成育医療研究センター梅澤明弘博士よりご供与いただいた。フィーダー細胞はマウス胎仔線維芽細胞(MEF)を使用した。
MEFの培養には10%ウシ胎仔血清(FBS)、2 mmol/L L-グルタミン(L-Glu)、1%非必須アミノ酸(NEAA)、100 units/mLペニシリンG、100μg/mLストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)を用いた。MEFの剥離液には0.05%トリプシン-エチレンジアミン四酢酸(EDTA)を、MEFの保存液にはセルバンカー1を用いた。ヒトiPS細胞の維持培養には20%ノックアウト血清代替物(KSR)、0.8% NEAA、2 mmol/L L-Glu、0.1 mmol/L 2-メルカプトエタノール(2-MeE)、5 ng/mL線維芽細胞増殖因子(FGF)2を含むDMEM Ham’s F-12(DMEM/F12)を用いた。ヒトiPS細胞の剥離液には1 mg/mLコラゲナーゼIV、0.25%トリプシン、20% KSR、1 mmol/L塩化カルシウムを含むダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を用いた。ヒトiPS細胞の保存液には霊長類ES/iPS細胞用凍結保存液を用いた。
ヒトiPS細胞はマイトマイシンC処理を施したMEF(6×105 cells/100 mmディッシュ)上に播種し、5% CO2/95% air条件下CO2インキュベーター中37℃にて培養した。ヒトiPS細胞の継代は、3~5日培養後、1:2~1:3のスプリット比で行った。ヒトiPS細胞は解凍48時間後に培地を交換し、それ以降は毎日交換した。
ヒトiPS細胞の腸管オルガノイドへの分化は、継代時にヒトiPS細胞用培地にて30倍に希釈した、成長因子を除去したマトリゲルをコートした培養ディッシュに播種し、35 ng/mL FGF2を含むStemSure(登録商標) hPSC 培地にて培養した。未分化コロニーの占める割合が約80%になった状態で開始した。100 ng/mLアクチビンA、100 units/mLペニシリンG、100μg/mLストレプトマイシン、2 mmol/L L-Gluを含むロズウェルパーク記念研究所(RPMI)培地で1日間、0.2% FBS、100 ng/mLアクチビンA、100 units/mLペニシリンG、100μg/mLストレプトマイシン、2 mmol/L L-Gluを含むRPMI培地で1日間、2% FBS、100 ng/mLアクチビンA、100 units/mLペニシリンG、100μg/mLストレプトマイシン、2 mmol/L L-Gluを含むRPMI培地で1日間培養することで内胚葉に分化させた。その後、2% FBS、500 ng/mL FGF4、3μmol/L CHIR99021、100 units/mLペニシリンG、100μg/mLストレプトマイシンを含むRPMI+グルタマックス培地で4日間培養することで腸管幹細胞へ分化させた。FGF4、CHIR99021処理後、Y-27632(Rho結合キナーゼ阻害剤)を10μmol/Lとなるように添加し、5% CO2/95% air条件下CO2インキュベーター中37℃にて60分間処理した細胞を0.05%トリプシン-EDTAにて剥離し、40μmナイロンメッシュのセルストレイナーにて細胞塊を砕き、3.0×106細胞を100 mm EZSPHERE(登録商標)上に播種した。その後、2 mmol/L L-Glu、2% B27 supplement、1% N2 supplement、100 units/mLペニシリンG、100μg/mLストレプトマイシン、100 ng/mL上皮成長因子(EGF)、100 ng/mL Noggin、200 ng/mL R-spondin-1、10μmol/L Y-27632を含むAdvanced-DMEM/F12で3日間培養後、2 mmol/L L-Glu、2% B27 supplement、1% N2 supplement、100 units/mLペニシリンG、100μg/mLストレプトマイシン、100 ng/mL EGF、100 ng/mL Noggin、200 ng/mL R-spondin-1、成長因子を除去したマトリゲル3%もしくは多糖類ポリマー(脱アシル化ジェランガム)を含むAdvanced-DMEM/F12で24日間超低接着6ウェルプレート上で浮遊培養することで腸管オルガノイドへ分化させた。また、分化開始19日目から34日目まで、以前我々が見出した低分子化合物であるPD98059(20μmol/L)、5-アザ-2’-デオキシシチジン(5μmol/L)、A-83-01(0.5μmol/L)に加え、5μmol/L N-[(3,5-ジフルオロフェニル) アセチル]-L-アラニル-2-フェニル-1, 1-ジメチルエチルエステル-グリシン(DAPT)を添加した。薬物代謝酵素の誘導剤処理は、2 mmol/L L-Glu、2% B27 supplement、1% N2 supplement、100 units/mLペニシリンG、100μg/mLストレプトマイシン、100 ng/mL EGF、100 ng/mL Noggin、200 ng/mL R-spondin-1、成長因子を除去したマトリゲル3%もしくは多糖類ポリマー(脱アシル化ジェランガム)を含むAdvanced-DMEM/F12に1α,25-ジヒドロキシビタミンD3(VD3)を1μmol/Lとなるよう添加し、回収前72時間培養することで行った。多糖類ポリマーは日産化学工業株式会社よりご供与いただいたFP001もしくはFP003を培地中濃度0.015%(w/v)で使用し、腸管オルガノイドへの分化に及ぼす影響について検討した。
総RNAはヒトiPS細胞の分化誘導終了後、Agencourt RNAdvence Tissueの添付マニュアルに従い抽出した。
相補的DNA(cDNA)の合成は、ReverTra Ace qPCR RT Master Mixを使用し、添付マニュアルに従い行った。
Real-Time RT-PCRはKAPA SYBR Fast qPCR Kitを用い、cDNAを鋳型にして、反応は添付マニュアルに従い行った。結果は内在性コントロールとしてヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HPRT)を用いて補正した。
分化誘導終了後、腸管オルガノイドを4%パラホルムアルデヒドにて固定し、OCTコンパウンドにて凍結包埋した。厚さ10μmの凍結切片を作製後、スライドガラスに貼り付け、マイヤーヘマトキシリン及びエオシンアルコールを使用して染色した。
分化誘導終了後、腸管オルガノイドを4%パラホルムアルデヒドにて固定し、OCTコンパウンドにて凍結包埋した。厚さ10μmの凍結切片を作製後、スライドガラスに貼り付け、抗原の賦活化を行った。5% FBS溶液にて30分間ブロッキングし、一次抗体を4℃で1晩反応させた。その後、スライドガラスを洗浄し、二次抗体を室温で1時間反応させ、核染色として4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)を用いた。封入作業を行い、Zeiss LSM510共焦点レーザー顕微鏡を用いて、蛍光を観察した。
分化誘導終了後、腸管オルガノイドをローダミン123を含むHBSSで37℃にてインキュベーションした。HBSSは、137 mmol/L塩化ナトリウム、5.4 mmol/L塩化カリウム、0.81 mmol/L硫酸マグネシウム、0.44 mmol/Lリン酸二水素カリウム、0.34 mmol/Lリン酸水素二ナトリウム、1.3 mmol/L塩化カルシウム、4.2 mmol/L炭酸水素ナトリウム、5.6 mmol/L D-グルコース、10 mmol/L HEPESを含むpH 7.4のものを用いた。インキュベーション終了後、氷冷したPBSで細胞を洗浄することにより取り込みを停止させた。37℃に温めたPBSにて4時間インキュベーションすることにより、ローダミン123をオルガノイド外に放出させた。その後、Synergy HTX マイクロプレートリーダーを用いて上清の蛍光強度を測定した。輸送実験終了後、タンパク定量を行い、蛍光強度をタンパク量で補正した。
分化誘導終了後、腸管オルガノイドをヘキスト33342を含むHBSSで37℃にてインキュベーションした。インキュベーション終了後、氷冷したPBSで細胞を洗浄することにより取り込みを停止させた。37℃に温めたPBSにて4時間インキュベーションすることにより、ヘキスト33342をオルガノイド外に放出させた。その後、Synergy HTX マイクロプレートリーダーを用いて上清の蛍光強度を測定した。輸送実験終了後、タンパク定量を行い、蛍光強度をタンパク量で補正した。
分化誘導終了後、腸管オルガノイドを5μmol/Lミダゾラムを含む培地(2 mmol/L L-Glu、2% B27 supplement、1% N2 supplement、100 units/mLペニシリンG、100μg/mLストレプトマイシンを含むAdvanced-DMEM/F12)で37℃にてインキュベーションし、24時間経過後、培地をサンプリングした。代謝活性は、液体クロマトグラフィー-マススペクトロメーター(LC-MS/MS)を用いて測定した培地中の1-水酸化ミダゾラムの量より算出した。代謝実験終了後、タンパク定量を行い、代謝活性をタンパク量で補正した。
(1)多糖類ポリマーを用いたヒト腸管オルガノイドへの分化誘導
ヒトiPS細胞から腸管オルガノイドへの分化誘導の際に添加する多糖類ポリマーの影響について調べた。その結果、FP001およびFP003を添加した群で腸管関連遺伝子やCYP3A等をはじめとする様々な薬物動態関連遺伝子のmRNA発現量が増加した。特にFP001を加えた群で成長因子を除去したマトリゲル3%を加えたコントロール群に比べ、腸管での主要な薬物代謝酵素であるシトクロムP450(CYP)3A4で3.7倍、ペプチドの取り込みトランスポーターであるSLC15A1/PEPT1で4.1倍、排出トランスポーターであるABCB1/MDR1で4.5倍、など多くの薬物動態関連遺伝子のmRNA発現が上昇した。また、腸管を構成している細胞マーカーであるVillin(吸収上皮細胞)、sucrase-isomaltase(上皮細胞の刷子縁)、MUC2(杯細胞)、LGR5(腸管幹細胞)はコントロール群に比べ、同程度もしくはそれ以上のmRNA発現を示した。(図10)。
マトリゲル及び多糖類ポリマーを用いて分化誘導したヒトiPS細胞由来腸管オルガノイドは球状の形をしていた(図11A-C)。HE染色の結果から、多糖類ポリマーを用いて分化誘導したヒト腸管オルガノイドにおいても管腔が確認された(図11D-F)。
免疫蛍光染色により、腸管を構成している様々な細胞(吸収上皮細胞、腸管幹細胞、杯細胞、腸管内分泌細胞、パネート細胞、間葉系細胞)および排出トランスポーターやタイトジャンクションのマーカーの発現が認められた(図12)。したがって、腸管オルガノイドはこれらの細胞を含む腸管組織類似体であることが示唆された。
排出トランスポーターであるABCB1/MDR1の基質であるローダミン123および阻害剤であるベラパミルを用いて、ABCB1/MDR1の機能評価を行った。ローダミン123の腸管オルガノイド内への排出が認められ、その排出方向の輸送はベラパミルにより抑制された(図13)。このことから、多糖類ポリマーを用いて分化誘導したヒト腸管オルガノイドは、ABCB1/MDR1の機能を有していることが示唆された。
排出トランスポーターであるABCG2/BCRPの基質であるヘキスト33342および阻害剤であるKo143を用いて、ABCG2/BCRPの機能評価を行った。ヘキスト33342の腸管オルガノイド内への排出が認められ、その排出方向の輸送はKo143により抑制された(図14)。このことから、多糖類ポリマーを用いて分化誘導したヒト腸管オルガノイドは、ABCG2/BCRPの機能を有していることが示唆された。
CYP3Aの誘導剤である1α,25-ジヒドロキシビタミンD3(VD3)を用いて、CYP3A4のmRNA発現誘導について検討を行った。コントロール群に比べ、VD3添加群で有意にCYP3A4のmRNA発現が誘導された(図15A)。また、VD3添加群において、有意にミダゾラムの代謝活性が上昇し(図15B)、CYP3A4のタンパク質レベルでの誘導が認められた。このことから、多糖類ポリマーを用いて分化誘導したヒト腸管オルガノイドではCYP3A4の薬物応答性を有していることが示唆された。
CYP3A4の基質であるミダゾラムとその阻害剤であるケトコナゾールを用いて、CYP3A4の代謝活性を評価した。ヒト腸管オルガイドにおいて、ミダゾラムの代謝活性が認められ、その活性はケトコナゾールの添加により有意に阻害された(図16)。したがって、多糖類ポリマーを用いて分化誘導したヒト腸管オルガノイドでは、CYP3A4の代謝能を有していることが示唆された。
以上の結果より、本研究では、ヒトiPS細胞から腸管オルガノイドへの分化において有用な浮遊剤(粘性材料)を新たに見出すことができた。また、この方法によって作製した腸管オルガノイドは、排出トランスポーターの輸送機能に加え、薬物代謝酵素活性および誘導能を有するなど、腸管に特徴的な様々な薬物動態学的機能を有していることが明らかとなった。さらに、FP001およびFP003は多糖類のポリマーであり異種動物由来成分を含まないため、腸管オルガノイドを再生医療に用いる際に使用する培養材料として極めて有用であると考えられる。
Claims (17)
- 以下の工程(1)~(4)を含む、多能性幹細胞から腸管オルガノイドを作製する方法であって、前記多能性幹細胞がヒト又は霊長類の細胞である方法。
(1)多能性幹細胞を内胚葉様細胞へと分化させる工程;
(2)工程(1)で得られた内胚葉様細胞を腸管幹細胞様細胞へと分化させる工程;
(3)工程(2)で得られた腸管幹細胞様細胞を培養し、スフェロイドを形成させる工程;
(4)工程(3)で形成されたスフェロイドを分化させ、腸管オルガノイドを形成させる工程であって、上皮成長因子、BMP阻害剤及びWntシグナル活性化剤に加えて、MEK1/2阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤及びγ-セクレターゼ阻害剤の存在下での培養を含む工程。 - 前記多能性幹細胞が人工多能性幹細胞又は胚性幹細胞である、請求項1に記載の作製方法。
- 前記多能性幹細胞がヒト人工多能性幹細胞であり、工程(2)がFGF4とWntアゴニストの存在下での培養を含む、請求項1に記載の作製方法。
- 前記ヒト人工多能性幹細胞が、腸疾患の患者由来の人工多能性幹細胞である、請求項3に記載の作製方法。
- 前記多能性幹細胞がカニクイザル人工多能性幹細胞であり、工程(2)がFGF2とGSK-3阻害剤の存在下での培養を含む、請求項1に記載の作製方法。
- 工程(3)の培養において、均一な形状及び大きさの複数のウェルが細胞低接着性又は細胞非接着性の培養面に形成された培養容器を使用し、複数のスフェロイドをまとめて形成させる、請求項1~5のいずれか一項に記載の作製方法。
- BMP阻害剤がNogginであり、Wntシグナル活性化剤がR-spondin-1である、請求項1~6のいずれか一項に記載の作製方法。
- MEK1/2阻害剤がPD98059であり、DNAメチル化阻害剤が5-アザ-2’-デオキシシチジンであり、TGFβ受容体阻害剤がA-83-01であり、γ-セクレターゼ阻害剤がN-[(3,5-difluorophenyl) acetyl]-L-alanyl-2-phenyl-1,1-dimethylethyl ester-glycineである、請求項1~7のいずれか一項に記載の作製方法。
- 水溶液中に3次元的網目構造を形成する材料を添加した液体培地を工程(4)の培養に用い、工程(3)で形成させた複数のスフェロイドがまとめて浮遊培養される、請求項1~8のいずれか一項に記載の作製方法。
- 前記材料が高分子ゲル及び多糖からなる群より選択される一以上の材料である、請求項9に記載の作製方法。
- 前記材料が脱アシル化ジェランガムを含む、請求項9に記載の作製方法。
- 工程(4)の培養期間が12日間~36日間である、請求項1~11のいずれか一項に記載の作製方法。
- 工程(4)が、以下の工程(4-1)と工程(4-2)を含む、請求項1~11のいずれか一項に記載の作製方法:
(4-1)上皮成長因子、BMP阻害剤及びWntシグナル活性化剤の存在下で培養する工程;
(4-2)上皮成長因子、BMP阻害剤及びWntシグナル活性化剤に加えて、MEK1/2阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤及びγ-セクレターゼ阻害剤の存在下で培養する工程。 - 工程(4-1)の培養期間が3日間~15日間であり、工程(4-2)の培養期間が3日間~21日間である、請求項13に記載の作製方法。
- 請求項1から14のいずれか一項に記載の方法により腸管オルガノイドを作製すること;および製造された腸管オルガノイドを用いて被検物質の体内動態又は毒性を評価することを含む、被検物質の体内動態又は毒性を評価する方法。
- 前記体内動態が、代謝、吸収性、膜透過性、薬物相互作用、薬物代謝酵素の誘導、又は薬物トランスポーターの誘導である、請求項15に記載の評価方法。
- 以下の工程(I)及び(II)を含む、請求項16に記載の方法:
(I)請求項1から14のいずれか一項に記載の方法により製造された腸管オルガノイドに被検物質を接触させる工程;
(II)被検物質の代謝、吸収性、膜透過性、薬物相互作用、薬物代謝酵素の誘導、又は薬物トランスポーターの誘導、或いは毒性を測定・評価する工程。
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Cited By (2)
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Families Citing this family (11)
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---|---|---|---|---|
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KR20200086665A (ko) * | 2017-10-31 | 2020-07-17 | 머독 칠드런스 리서치 인스티튜트 | 조성물 및 방법 |
WO2020091020A1 (ja) * | 2018-11-02 | 2020-05-07 | 公立大学法人名古屋市立大学 | 多能性幹細胞由来腸管オルガノイドの作製法 |
WO2020095879A1 (ja) * | 2018-11-08 | 2020-05-14 | 公立大学法人名古屋市立大学 | 多能性幹細胞の腸管上皮細胞への分化誘導 |
JP2020162434A (ja) * | 2019-03-28 | 2020-10-08 | 大日本印刷株式会社 | 小腸での代謝又は修飾産物を生体外で生産する方法 |
CN114829582A (zh) * | 2019-12-16 | 2022-07-29 | Jsr株式会社 | 类器官的制造方法 |
JP2023106639A (ja) * | 2020-06-09 | 2023-08-02 | 株式会社オトリンク | 内耳前駆細胞の製造方法、内耳有毛細胞の製造方法、薬剤の評価方法、及び内耳細胞分化誘導用組成物 |
WO2022158882A1 (ko) * | 2021-01-20 | 2022-07-28 | 가톨릭대학교 산학협력단 | 마이크로바이옴과 면역세포 테라그노시스 조사를 위한 장오가노이드 면역콘트롤 통합 플랫폼 |
CN113388572B (zh) * | 2021-08-17 | 2021-11-19 | 天九再生医学(天津)科技有限公司 | 高效人多能干细胞体外诱导分化为多谱系小肠类器官方法 |
CN114317415B (zh) * | 2022-03-07 | 2022-06-03 | 天九再生医学(天津)科技有限公司 | 人多能干细胞向多谱系大肠类器官定向分化的方法 |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2010143747A1 (ja) | 2009-06-10 | 2010-12-16 | 公立大学法人奈良県立医科大学 | 人工腸管の作製法 |
WO2013176249A1 (ja) | 2012-05-25 | 2013-11-28 | 学校法人埼玉医科大学 | 膵臓ホルモン産生細胞の生産方法及び膵臓ホルモン産生細胞、並びに分化誘導促進剤 |
WO2016061464A1 (en) | 2014-10-17 | 2016-04-21 | Children's Hospital Center, D/B/A Cincinnati Children's Hospital Medical Center | In vivo model of human small intetine using pluripotent stem cells and methods of making and using same |
WO2016125884A1 (ja) | 2015-02-06 | 2016-08-11 | 日産化学工業株式会社 | 担癌哺乳動物モデルの作成方法 |
WO2016141137A1 (en) | 2015-03-03 | 2016-09-09 | President And Fellows Of Harvard College | Methods of generating functional human tissue |
Family Cites Families (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2006239169A (ja) | 2005-03-03 | 2006-09-14 | Miyako Takagi | 胚性幹細胞から分化誘導した腸管様細胞塊における壁内神経系の形成方法 |
GB201111244D0 (en) * | 2011-06-30 | 2011-08-17 | Konink Nl Akademie Van Wetenschappen Knaw | Culture media for stem cells |
WO2011140441A2 (en) * | 2010-05-06 | 2011-11-10 | Children's Hospital Medical Center | Methods and systems for converting precursor cells into intestinal tissues through directed differentiation |
EP2636731B1 (en) | 2010-11-02 | 2016-07-13 | National University Corporation Kumamoto University | Method of producing intestinal cells |
CA2864702A1 (en) * | 2012-02-22 | 2013-08-29 | Amgen Inc. | Autologous mammalian models derived from induced pluripotent stem cells and related methods |
WO2014132933A1 (ja) * | 2013-02-26 | 2014-09-04 | 公立大学法人名古屋市立大学 | 人工多能性幹細胞を腸管上皮細胞へ分化誘導する方法 |
KR101500850B1 (ko) | 2013-08-07 | 2015-03-18 | 씨제이제일제당 (주) | 천연 조미소재 제조를 위한 이노신산 발효액 또는 글루탐산 발효액의 제조 방법 |
JP5777127B1 (ja) | 2014-12-09 | 2015-09-09 | 公立大学法人横浜市立大学 | 原始腸内胚葉細胞及びその作製方法 |
-
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Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2010143747A1 (ja) | 2009-06-10 | 2010-12-16 | 公立大学法人奈良県立医科大学 | 人工腸管の作製法 |
WO2013176249A1 (ja) | 2012-05-25 | 2013-11-28 | 学校法人埼玉医科大学 | 膵臓ホルモン産生細胞の生産方法及び膵臓ホルモン産生細胞、並びに分化誘導促進剤 |
WO2016061464A1 (en) | 2014-10-17 | 2016-04-21 | Children's Hospital Center, D/B/A Cincinnati Children's Hospital Medical Center | In vivo model of human small intetine using pluripotent stem cells and methods of making and using same |
WO2016125884A1 (ja) | 2015-02-06 | 2016-08-11 | 日産化学工業株式会社 | 担癌哺乳動物モデルの作成方法 |
WO2016141137A1 (en) | 2015-03-03 | 2016-09-09 | President And Fellows Of Harvard College | Methods of generating functional human tissue |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
Drug Metab. Pharmacokinet.,2016年02月17日,Vol.31,pp.193-200 |
Molecular Carcinogenesis,2015年,Vol.54,pp.189-202 |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP7229608B1 (ja) | 2022-09-13 | 2023-02-28 | オリオン機械株式会社 | 圧縮空気除湿装置を備える冷水供給装置ユニット |
JP7229607B1 (ja) | 2022-09-13 | 2023-02-28 | オリオン機械株式会社 | 圧縮空気除湿装置を備える冷水供給装置ユニット |
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