JP2015519048A - 膵臓前駆細胞及び機能的β細胞をｈＰＳＣから生成するための方法及び組成物 - Google Patents

膵臓前駆細胞及び機能的β細胞をｈＰＳＣから生成するための方法及び組成物 Download PDF

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Abstract

内胚葉細胞集団からNKX6-1+膵臓前駆細胞及び／又はインスリン産生細胞を製造するための方法及び組成物であって、当該方法は、内胚葉細胞集団を、EGF成分、ニコチンアミド成分及び／又はNoggin成分、場合によっては少なくとも一種のEGF成分と少なくとも一種のニコチンアミド成分との組み合わせと接触させ、少なくとも一種の内胚葉細胞のNKX6-1+膵臓前駆細胞への分化を誘導することを含んでなり、当該組み合わせはさらに少なくとも一種のNoggin成分を含んでいてもよい。

Description

本開示は、NKX6-1陽性膵臓前駆細胞及び機能的膵臓β細胞を製造するための方法及び組成物に関する。
ヒト多能性幹細胞（hPSC；胚性幹細胞（hESC）及び人工多能性幹細胞（hiPSC）を含む）から膵臓前駆細胞を生成する能力は、１）予測薬物毒性学及び創薬、２）糖尿病治療のための移植、並びに３）正常な膵臓発生及び糖尿病発生のインビトロ（in vitro）モデリングのためのヒト内分泌細胞、外分泌細胞及び導管細胞源を提供し得る。この実現には、異なるhESC及びhiPSC細胞系から膵臓前駆細胞の高富化集団を再現可能に生成し、インビトロ及びインビボ（in vivo）でインスリン産生β細胞へのそれらの成熟を促進することができる能力が必要となる。過去の文献にはhPSCからのインスリン産生細胞の生成が可能であることが報告されているが、生成した細胞は多ホルモン性（poly-hormonal）であった。これらインスリン産生細胞の分析は、当該細胞が機能的β細胞の発生に必須の重要な転写因子であるNKX6-1を発現しないことを示している。ある研究は、hESCからのNKX6-1+前駆細胞の生成を実証し、かつ、免疫無防備なレシピエントへの移植後に、それらが機能的β細胞へ分化可能であることを示した（Kelly, O.G. et al., Nat Biotechnol 29(8): 750-756(2011)）。しかしながら、本研究のデータは、膵臓系統へ分化する傾向を有する二種のhESC系に基づくものである。他の系に適用すると、本研究に記載されるプロトコールはNKX6-1+前駆細胞の効率的な発生を促進しなかった（Kelly, O.G. et al., Nat Biotechnol 29(8): 750-756(2011)）。
本開示の一側面は、内胚葉細胞集団からNKX6-1+膵臓前駆細胞を製造する方法であって、内胚葉細胞集団を、EGF成分、ニコチンアミド成分及び／又はNoggin成分、場合によっては少なくとも一種のEGF成分と少なくとも一種のニコチンアミド成分との組み合わせと接触させ、少なくとも一部の内胚葉細胞集団のNKX6-1+膵臓前駆細胞への分化を誘導することを含んでなる製造方法を包含する。
一実施形態において、EGF成分は、
EGF及び／又はその活性複合体及び／又は断片；
アンフィレグリン(AR)及び／又はその活性複合体及び／又は断片；
トランスフォーミング成長因子α（TGFa）及び／又はその活性複合体及び／又は断片；
ベタセルリン（BTC）及び／又はその活性変異体及び／又は断片；
エピレグリン（EPR）及び／又はその活性変異体及び／又は断片；
ニューレグリン（例えば、NRG1、NRG2、NRG3、NRG4を含む）及び／又はその活性変異体及び／又はそ断片；及び／又は
これらの二種又はそれ以上の組み合わせ
を含んでなる。
一実施形態において、ニコチンアミド成分は、
ニコチンアミド（ナイアシンアミド及びニコチン酸アミドとしても知られている）、その塩、溶媒和物及び複合体；
ベンズアミド及び／又は３−アミノベンズアミド（Otonkoski et al., 1993）などのポリ（ADP−リボース）合成酵素阻害剤；
サーチノール、M15、スプリトマイシン（Bitterman et al., 2002）などのSir-2阻害剤；
AN-9、CI-994、FK228、LAQ-824、MS275、SAHA、バルプロ酸、TSA、酪酸ナトリウム（Bitterman et al., 2002）などのHDAC阻害剤；及び／又は
これらの二種又はそれ以上の組み合わせ
を含んでなる。
一実施形態において、Noggin成分は、
Noggin及び／又はその活性複合体及び／又は断片；
BMPR1A及び／又はその活性複合体及び／又は断片；
BMPR1B及び／又はその活性複合体及び／又は断片；
ドルソモルフィン（Dorsomorphin）及び／又はその塩又は溶媒和物；
LDN 193189（DM-3189としても知られている）及び／又はその塩又は溶媒和物；
CHORDIN及び／又はその活性複合体及び／又は断片；及び／又は
これらの二種又はそれ以上のいずれかの組み合わせ
の一種又はそれ以上を含んでなる。
一実施形態において、当該組み合わせは、少なくとも一種のNoggin成分、少なくとも一種のEGF成分及び少なくとも一種のニコチンアミド成分を含んでなる。
一実施形態において、少なくとも一種のNoggin成分、少なくとも一種のEGF成分及び少なくとも一種のニコチンアミド成分の組み合わせが、Noggin、EGF及びニコチンアミド（例えばNENA）を含んでなる。
一実施形態において、当該方法は更に、エキセンディン−４成分と前記細胞を接触させることを含んでなる。
一実施形態において、当該方法は、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％又は少なくとも５５％の内胚葉細胞集団をNKX6-1+膵臓前駆細胞へ分化誘導する。
一実施形態において、当該方法は最初に内胚葉細胞集団を製造することを含んでなる。
一実施形態において、内胚葉細胞集団を製造する方法は、工程（又は副工程）ａ、ｂ及びｃの一つ又はそれ以上と工程ｄとを含んでなる：
ａ）多能性幹細胞集団を
Ｉ）nodalアゴニスト（場合によってはActA）及びwntシグナリングアゴニスト（場合によってはWnt3a又はCIHR 99021）、
ＩＩ）nodalアゴニスト（場合によってはActA）、FGFアゴニスト（場合によってはbFGF）及び場合によってはwntシグナリングアゴニスト（場合によってはWnt3a、CIHR99021）及び
ＩＩＩ）nodalアゴニスト（場合によってはActA）及びFGFアゴニスト（場合によってはbFGF）
の組み合わせと接触させ、ステージ１の分化細胞を製造する工程、
ｂ）ステージ１の分化細胞を、FGFアゴニスト（場合によってはFGF10）及び場合によってはwntシグナリングアゴニスト（場合によってはWnt3a）及び／又はnoggin成分（場合によってはドルソモルフィン）と接触させ、ステージ２の分化細胞を製造する工程、
ｃ）ステージ２の分化細胞を、Noggin成分（場合によってはNoggin）、レチノイン酸（RA）又はRA類似体、及び場合によってはシクロパミン−KAAD（Cyc）、FGFアゴニスト（場合によってはFGF10）、及び／又はエキセンディン−４成分（場合によってはエキセンディン−４）と接触させることにより、内胚葉細胞集団を提供する工程、及び
ｄ）内胚葉細胞集団を、EGF成分、ニコチンアミド成分及び／又はNoggin成分、場合によっては少なくとも一種のEGF成分と少なくとも一種のニコチンアミド成分とを含んでなる組み合わせと、少なくとも一部の内胚葉細胞集団をNKX6-1+膵臓前駆細胞へ分化誘導するのに十分な量で接触させる工程。
一実施形態において、NKX6-1膵臓前駆細胞を製造するための組み合わせは更に、少なくとも一種のNoggin成分を含んでなる。
別の側面は、NKX6-1+インスリン産生細胞集団を生成する方法であって、
ａ）本明細書に記載の方法に従ってNKX6-1陽性膵臓前駆細胞集団を製造し、
ｂ）前記細胞集団、又はNKX6-1富化若しくは単離集団を被検体内に導入すること、
を含んでなる生成方法を包含する。
更なる側面は、インスリン産生細胞を生成する方法であって、
ａ）NKX6-1陽性膵臓前駆細胞を含んでなる細胞集団を生成し、
ｂ）NKX6-1陽性膵臓前駆細胞を、インスリン産生細胞、場合によってはNKX6-1陽性インスリン産生細胞を得るのに十分な時間CD34+内皮細胞と共培養すること
を含んでなる生成方法を包含する。
一実施形態において、当該方法は更に、NKX6-1陽性細胞集団を富化又は単離することを含んでなる。
別の実施形態において、富化又は単離工程は、細胞集団をHPxエピトープ検出抗体と接触させ、HPx1及び／又はHPx2結合細胞亜集団を単離又は部分的に精製することを含んでなる。
別の側面は、本明細書に記載の方法に従って製造された富化及び／又は単離されたNKX6-1陽性細胞集団と、好適な希釈剤とを包含する。
一実施形態において、富化及び／又は単離されたNKX6-1陽性細胞集団は、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％又は最大で約９５％のNKX6-1陽性細胞を含んでなる。
更なる側面では、EGF成分、ニコチンアミド成分及び／又はNoggin成分、及び場合によってはエキセンディン−４成分を含んでなる培地補充組成物が挙げられる。
また、別の側面によれば、基本培地と、本明細書に記載の培地補充物とを含んでなる培地組成物が提供される。
更なる実施形態は、
ａ）EGF成分、
ｂ）ニコチンアミド成分、及び／又は
Noggin成分
を含んでなるキットを包含する。
また、予測薬物毒性学及び創薬、移植、糖尿病治療、組織工学及び／又は疾患モデリングのための、細胞集団を含んでなる組成物及び当該細胞集団の使用が提供される。
本開示の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明から明らかとなろう。しかしながら、詳細な説明及び特定実施例は、本開示の好ましい実施形態を示しつつ、例証のためのみに与えられるものであり、そのため、本開示の精神及び範囲内の多様な変更及び修正が本詳細な説明から当業者にとって明らかとなることを理解すべきである。
ここで、本開示の実施形態を以下の図面に関連して説明する。
図１は、膵臓分化プロトコール例の概略図である。 図２は、Noggin、EGF、ニコチンアミド（NENA）、エキセンディン−４で処理した後のhESC由来細胞から誘導されるNKX6-1:GFP+細胞の割合を実証するグラフである。 図３は、サンプル研究におけるNKX6-1、PDX1、PTF1A及びSOX9のmRNA発現レベルを実証するグラフである。 図４Ａは、NKX6-1GFP/wHESC系を使用して、未処理又は化合物の多様な組み合わせと比べて、Noggin、EGF、ニコチンアミド（エキセンディン−４を伴う又は伴わない）の存在下で内胚葉細胞を培養するときにNKX6-1:GFP+細胞の割合が最も高いことを実証している。図４Ｂは、H1（WO01）HESC系を使用して、未処理又は化合物の多様な組み合わせと比べて、Noggin、EGF、ニコチンアミド（エキセンディン−４を伴う又は伴わない）の存在下で内胚葉細胞を培養するときにNKX6-1 +細胞の割合が最も高いことを実証するグラフである。 図５は、「NENA処理」を用いて生成したNKX6-1細胞がインスリン産生細胞生成能を有することを示す一連の画像である。図５Ａ：H1(WA01) d14分化細胞を移植してから６週間後に採取した乳房脂肪体内でのNKX6-1及びインスリンの免疫組織化学分析。図５Ｂ：H1(WA01) d14分化細胞を移植してから６週間後に採取した乳房脂肪体内でのＣペプチド及びグルカゴン（GCG）の免疫組織化学分析。 図６は、HPxがNKX6-1発現細胞を富化するために使用可能であることを示す一連のフローサイトメトリープロファイルである。三重処理（Noggin、EGF及びニコチンアミド）の存在又は不在下で培養したNKX6-1GFP/whESC系の分化１３日目におけるNKX6-1:GFPのみ（Ａ）、NKX6-1:GFP対hPx（Ｂ）、及びNKX6-1:GFP対CD142（Ｃ）に関するフローサイトメトリー分析。 図７Ａは、蛍光活性化細胞選別（FACS）を用いて単離するHPx2+細胞が、CD142富化（CD142+）集団において見られたレベルと同様に、未選別細胞（PS=選別前）と比べて高レベルのNKX6-1 mRNAを発現する集団について富化されていることを実証するグラフである。図７Ｂは、蛍光活性化細胞選別（FACS）を用いて単離するHPx2+CD142+二重陽性細胞が、未選別細胞（PS=選別前）と比べて高レベルのNKX6-1 mRNAを発現する集団について富化されていることを実証するグラフである。 図８Ａは、６日目の中胚葉の一連のフローサイトメトリープロファイルである。図８Ｂは、CD34+細胞の位相像（phase picture）である。図８Ｃ〜Ｄは、アセチル化ＬＤＬ取り込みを示す細胞の画像である。図８Ｅは、vWFに関する免疫組織化学を示す画像である。 図９Ａは、一連のプロットトップパネルである：対照（コントロール）の単層（Ctrl）、コラーゲン上の凝集物（Col）及びES由来内皮細胞との共培養物（ES-E）としての１４日目培養物からの生細胞におけるGFPに関するFACS分析。下部パネル：各培養条件からのGFP+集団内のｃペプチドに関する細胞内FACS。図９Ｂは、異なる培養条件下でのインスリン（INS）及びグルカゴン（GCG）に関するリアルタイムQPCR分析を示すグラフである。数字はFOXA2に関する。 図１０は、蛍光活性化細胞選別（FACS）を用いて単離するHPx1+細胞が、HPx1-細胞と比べて高レベルのNKX6-1、SOX9及びPTF1a mRNAを発現する集団について富化されていることを実証するグラフである。 図１１は、「NENA」処理を用いて生成したNKX6-1細胞が、機能的なインスリン産生細胞を生成する能力を有することを実証するグラフである。H1(WA01)d13分化細胞を免疫無防備マウスへ移植してから６週（W）後、１２週（W）後及び１８週（W）後に、グルコースチャレンジに応答するヒトＣペプチド分泌をELISAによって測定した。
発明の具体的説明
本明細書には、BMP阻害剤（Nogginなど）、ニコチンアミド及びEGFシグナリング経路のアゴニストを含む因子の規定された組み合わせを使用して、ヒト多能性幹細胞（hPSC）からNKX6-1+膵臓前駆細胞を効果的に生成するための確固たる信頼性の高いプラットフォームが記載されている。単一ホルモン性のインスリン産生β細胞は、ここで製造される細胞と同様にNKX6-1陽性である。本明細書では、マウス移植実験を用いて、記載される方法に従って製造される細胞が単一ホルモン性かつ機能性であることが実証される。
また、本明細書では、NKX6-1+膵臓内分泌前駆細胞をヒト多能性幹細胞（hPSC）の異なる集団から分化可能であることが実証される。
本開示の一側面は、内胚葉細胞集団からNKX6-1+膵臓前駆細胞を製造する方法であって、内胚葉細胞集団を、EGF成分、ニコチンアミド成分及び／又はNoggin成分、場合によっては少なくとも一種のEGF成分と少なくとも一種のニコチンアミド成分との組み合わせと接触させ、少なくとも一部の内胚葉細胞集団のNKX6-1+膵臓前駆細胞への分化を誘導することを含んでなる製造方法を包含する。
一実施形態において、当該組み合わせは、少なくとも一種のNoggin成分を更に含んでなる。
用語「接触させる」（例えば、一種又は複数の成分と内胚葉細胞集団を接触させる）は、一種又は複数の成分及び細胞を共にインビトロでインキュベートする（例えば、培養細胞に化合物を添加する）ことを包含することが意図されており、接触工程は任意の好適な様式で実施可能である。例えば、細胞を付着培養又は懸濁培養において処理してもよく、時間的に実質的に同時に（例えば、共にカクテルで）又は連続して（例えば、最初の成分を添加してから一時間以内に）成分を添加することができる。また細胞は、成長因子若しくは他の分化剤などの別の剤と接触させることができ、あるいは細胞を安定化させる若しくは細胞を更に分化させ、例えば実施例において更に記載されるような多能性（及び／又は分化した）集団を培養するための当該分野において既知の条件などの下で細胞を培養することを含む環境と接触させることができる。
本明細書で使用される「内胚葉細胞集団」は、図１のステージ３に相当する内胚葉細胞の少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％を含んでなる細胞集団を指す。内胚葉細胞は、少なくともFOXA2を発現する胚後部前腸細胞集団などに相当し、PDX1に対して陽性又は陰性であり得る。他の因子も発現され得る。当該集団はNKX6-1陰性（NKX6-1-）であるか、又は低レベルのNKX6-1を発現し得る。例えば、FOXA2などの一種またはそれ以上のマーカーに関するフローサイトメトリー分子分析によって内胚葉細胞集団を同定することができる。内胚葉細胞集団は、例えば、２Ｄ（単層）又は３Ｄ（胚葉体又は他の形態の凝集物）形式であり得る。
本明細書で使用される用語「内胚葉」は、極早期胚における３つの一次胚細胞層（primary germ cell layers）の一つ（他の２つの胚細胞層は中胚葉及び外胚葉である）を指す。内胚葉は、３つの層のうちの最内層である。内胚葉細胞は分化して最初に胚消化管（embryonic gut）となり、次いで消化管（食道、胃、腸、直腸、大腸）の内膜、咽頭嚢誘導体（扁桃腺、甲状腺、胸腺、副甲状腺）、肺、肝臓、胆嚢及び膵臓となる。
本明細書で使用される用語「多能性幹細胞」は、異なる条件下で２つ以上の分化細胞種に分化する能力、例えば、３つの胚細胞層に特有の細胞種に分化する能力を有する細胞を指し、胚性幹細胞及び人工多能性幹細胞を包含する。多能性細胞は、ヌードマウス奇形腫形成アッセイなどを使用して２つ以上の細胞種に分化するそれらの能力を特徴とする。多能性も胚性幹（ES）細胞マーカーの発現によって証明される。
用語「前駆細胞」は、分化より生じ得る細胞に関して、完全に分化した細胞よりも発生経路又は行程に沿ってより早期段階にある細胞表現型を指す。前駆細胞は、発生経路及び細胞が発生・分化する環境に応じて、複数の異なる分化細胞種又は単一の分化細胞種となり得る。
用語「膵臓前駆細胞」は、以下のいずれかを形成し得る細胞を指す：膵臓内分泌細胞（グルカゴン産生α細胞又はインスリン産生β細胞など）又は膵臓外分泌細胞（例えば、アミラーゼ＋及び／又はトリプシン＋膵臓細胞）又は膵臓導管細胞。膵臓内分泌細胞、膵臓外分泌細胞又は膵臓導管細胞の一種以上（one more）の形成又は発生は、EGF成分とニコチンアミド成分との組み合わせなどの成分の添加によって及び／又は前駆細胞が発生する環境から誘導され得る。例えば、内皮接触を含む条件下での「NKX6-1陽性膵臓多能性前駆細胞」は機能的β細胞となり得る。同様に、NKX6-1膵臓前駆細胞のインビボ注入により、このような細胞が発生し得る。NKX6-1膵臓前駆細胞は、実施例に記載されるようなインスリン産生NKX6-1陽性細胞及びCK-19陽性導管細胞となることも実証されている。
本明細書で使用される用語「機能性β細胞」は、膵臓内のランゲルハンス島と呼ばれる区域に位置する一種の膵臓細胞を意味し、NKX6-1陽性及び／又はPDX1陽性であり、かつ、インスリンを生成し、放出する。
本明細書で使用される用語「幹細胞」は、増殖可能な、自己複製可能な、及び分化した又は分化可能な娘細胞を後に生むことができる多数の母細胞を生成する能力を有するより多くの前駆細胞の生成が可能な未分化細胞を指す。例えば、親の発生能を有する一つ又はそれ以上の細胞も保持しつつ、後に一つ又はそれ以上の成熟細胞種に分化する子孫を増殖・産生するように娘細胞を誘導することができる。
細胞との関連で、用語「分化した」又は「分化する」は相対的な用語であり、「分化（した）細胞」は、比較対象の細胞よりも発生経路を先に進んだ細胞である。よって、幹細胞は、系統制限された前駆細胞（内胚葉前駆細胞など）へ分化し、次いで当該経路を更に進んだ他種の前駆細胞へ分化し、その後、ある組織種において特徴的な役割を果たし、かつ、更に増殖する能力を保持していてもしていなくてもよい最終段階の分化細胞へ分化することができる。
用語「胚性幹細胞」は、胚盤胞（embryonic blastocyst）の内細胞塊の多能性幹細胞を指すのに使用される（例えば、米国特許第５，８４３，７８０号、６，２００，８０６号を参照）。このような細胞はまた、体細胞核移植から得られる胚盤胞の内細胞塊から得ることもできる（例えば、米国特許第５，９４５，５７７号、５，９９４，６１９号、６，２３５，９７０号を参照）。胚性幹細胞の際立った特徴は、胚性幹細胞の表現型を規定する。従って、細胞は、他の細胞と区別できるような胚性幹細胞の独特な特徴の一つ又はそれ以上を有する場合、胚性幹細胞の表現型を有する。代表的な際立った胚性幹細胞の特徴としては、遺伝子発現プロファイル、増殖能、分化能、核型、特定の培養条件に対する応答性などが挙げられるが、これらに限定されない。
用語「発現」は、RNA及びタンパク質の産生及び必要に応じてタンパク質の分泌（必要に応じて転写、翻訳、折り畳み、修飾及びプロセシングを含むがこれらに限定されない）に関与する細胞のプロセスを指す。「発現産物」としては、遺伝子から転写されたRNA及び遺伝子から転写されたmRNAの翻訳によって得られたポリペプチドが挙げられる。
本明細書で使用される用語「NKX6-1陽性膵臓前駆細胞」は、膵臓内胚葉細胞などから得られ、少なくともインスリン産生細胞（膵臓β細胞など）へ分化する能力を有する細胞を指す。NKX6-1陽性膵臓前駆細胞はマーカーNKX6-1を発現し、例えば、多能性幹細胞（PSC）と比べて増大したレベルのPDX1、PTF1A及びSOX9を発現し得る。
本明細書で使用される用語「NKX6-1」は、「NK6ホメオボックス１」遺伝子（遺伝子ID:4825）のmRNA（及び／又は、場合によってはcDNA）又はタンパク質産物、タンパク質及びmRNA配列（及び／又は、場合によってはcDNA）を含む配列を指し、これらを参照により本明細書に引用する。
本明細書で実証されるように、EGF及びニコチンアミドによる処理は、Nogginの添加により増大されるNKX6-1+細胞を生じさせる（図４）。
従って、更なる実施形態において、当該組み合わせは更にNoggin成分を含んでなる。
本明細書で使用される用語「Noggin成分」は、TGFβファミリーリガンドを結合することなどによってTGF-b/BMPファミリーシグナル変換を阻害する任意のポリペプチド又は化合物BMPアンタゴニストを意味し、実施例１０に示される剤を含むがこれらに限定されず、例えば、Noggin（NOG）（例えば、遺伝子識別番号（遺伝子ID:9241）を有するヒトNoggin）並びにその活性複合体及び断片（天然活性複合体及び断片を含む）；骨形成タンパク質受容体ＩＡ型（BMPR1A）（例えば、遺伝子識別番号（遺伝子ID:657）などを有するヒトBMPR1A）並びにその活性複合体及び断片（天然活性複合体及び断片を含む）；骨形成タンパク質受容体ＩＢ型（BMPR1B）（例えば、遺伝子識別番号（遺伝子ID:658）などを有するヒトBMPR1B）並びにその活性複合体及び断片（天然活性複合体及び断片を含む）；低分子化学阻害剤ドルソモルフィン及びその塩、溶媒和物及び組み合わせ；低分子化学阻害剤LDN 193189（DM-3189としても知られている）及び／又はその塩及び／又は溶媒和物；並びにCHORDIN（例えば、遺伝子識別番号（遺伝子ID:8646）などを有するヒトCHORDIN（CHRD））並びにその活性複合体及び断片（天然活性複合体及び断片を含む）；及び／又はこれらの二種又はそれ以上の組み合わせ（例えば、Nogginを含んでなる組み合わせを含む）を包含する。配列（タンパク質及びmRNA配列を含む）は、これら各々（例えば、遺伝子IDによって同定される各成分）を参照により本明細書に引用する。
本明細書で使用される用語「Noggin」は、遺伝子識別番号（遺伝子ID:9241）を有する骨形成タンパク質アンタゴニスト、配列（タンパク質及びmRNA配列を含む）を指し、これらを参照により本明細書に引用する。
化合物「ドルソモルフィン」は、以下の式：
Figure 2015519048
 の化合物、その塩、溶媒和物及び／又は組み合わせを包含する。
化合物「LDN」は、以下の式：
Figure 2015519048
 を有する化合物、その塩、溶媒和物及び／又は組み合わせを意味する。
一実施形態において、Noggin成分はNogginである。Nogginの濃度は、例えば約１ng〜約５００ng/ml、例えば約１ng〜約２５０ng/ml、約１０ng〜約２５０ng/ml、約１０ng〜約１００ng/mlの範囲であり得る。別の実施形態において、Noggin濃度は、約１０ng/ml、約２０ng/ml、約３０ng/ml、約４０ng/ml、約５０ng/ml、約６０ng/ml、約７０ng/ml、約８０ng/ml、約９０ng/ml、約１００ng/ml、約１５０ng/ml、約２００ng/ml、約３００ng/ml、約４００ng/ml又は約５００ng/mlである。
本明細書で使用される用語「EGF成分」は、EGF受容体ファミリーメンバー（ErbB1/HER-1/EGFR（遺伝子ID:1956）、ErbB2/HER-2/neu（遺伝子ID:2064）、ErbB3/HER-3（遺伝子ID: 2065）及び／又はErbB4/HER-4（遺伝子ID:2066））のいずれかを活性化させる任意のポリペプチド又は低分子を意味し、例えば実施例１１に示される剤を含むがこれらに限定されず、上皮成長因子（EGF）（例えば、遺伝子識別番号（遺伝子ID:1950）などを有するヒトEGF）並びにその活性複合体及び断片（天然活性複合体及び断片を含む）；アンフィレグリン（AR）（例えば、遺伝子識別番号（遺伝子ID:374）などを有するヒトAG/AREG）並びにその活性複合体及び断片（天然活性複合体及び断片を含む）；トランスフォーミング成長因子α（TGFa）（例えば、遺伝子識別番号（遺伝子ID:7039）などを有するヒトTGFa）並びにその活性複合体及び断片（天然活性複合体及び断片を含む）；ベタセルリン（BTC）（例えば、遺伝子識別番号（遺伝子ID:685）などを有するヒトBTC）並びにその活性変異体及び断片（天然活性複合体及び断片を含む）；遺伝子識別番号（遺伝子ID:1839）などを有するヘパリン結合EGF様成長因子（HB-EGF）並びにその活性複合体及び断片（天然活性複合体及び断片を含む）；エピレグリン（EREG/ER）（例えば、遺伝子識別番号（遺伝子ID:2069）などを有するヒトEREG）並びにその活性変異体及び断片（天然活性変異体及び断片を含む）；ニューレグリン（例えば、NRG1、NRG2、NRG 3、NRG4を含む）（例えば、遺伝子識別番号（それぞれ、遺伝子ID:3084、遺伝子ID:9542、遺伝子ID:10718、遺伝子ID:145957）などを有するヒトNRG）並びにその活性変異体及び断片（天然活性変異体及び断片を含む）；並びに／又はこれらの二種又はそれ以上の組み合わせ（例えば、ヒトEGFを含んでなる組み合わせを含む）を包含する。
一実施形態において、本明細書で使用される用語「EGF」は、上皮成長因子（EGF）（例えば、遺伝子識別番号（遺伝子ID:1950）などを有するヒトEGF）並びにその活性複合体及び断片（天然活性変異体及び断片を含む）を指す。
一実施形態において、EGF成分はEGFである。EGFの濃度は、例えば約１ng〜約５００ng/ml、例えば約１ng〜約２５０ng/ml、約１０ng〜約２５０ng/ml、約１０ng〜約１００ng/mlの範囲であり得る。別の実施形態において、EGF濃度は、約１０ng/ml、約２０ng/ml、約３０ng/ml、約４０ng/ml、約５０ng/ml、約６０ng/ml、約７０ng/ml、約８０ng/ml、約９０ng/ml、約１００ng/ml、約１５０ng/ml、約２００ng/ml、約３００ng/ml、約４００ng/ml又は約５００ng/mlである。
本明細書で使用される用語「ニコチンアミド成分」は、サーチュインヒストン脱アセチル化酵素（HDAC）の任意の阻害剤を意味し、ニコチンアミド（ナイアシンアミド及びニコチン酸アミドとしても知られている）、その塩、溶媒和物及び複合体；ポリ（ADP−リボース）合成酵素阻害剤（例えばベンズアミド及び３−アミノベンズアミドなど（Otonkoski et al., 1993））；Sir-2阻害剤（例えばサーチノール、M15、スプリトマイシンなど（Bitterman et al., 2002））；他のHDAC阻害剤（例えばAN-9、CI-994、FK228、LAQ-824、MS275、SAHA、バルプロ酸、TSA、酪酸ナトリウムなど（Bitterman et al., 2002））；及び／又はこれらの二種又はそれ以上の組み合わせ（例えば、ニコチンアミドを含んでなる組み合わせ）を含むがこれらに限定されない。例えば、Bitterman et al., 2002及びOtonkoski et al., 1993は、サーチノール、M15、スプリトマイシン、ベンズアミド及び／又は３−アミノベンズアミドがニコチンアミドと同様の又はそれよりも良好な効果を有することを実証している。
本明細書で使用される用語「ニコチンアミド」は、ナイアシンアミド及びニコチン酸アミドとしても知られている水溶性ビタミン及びその塩、溶媒和物及び複合体を指し、ニコチン酸のアミドである（ビタミンＢ３／ナイアシン）。
一実施形態において、ニコチンアミド成分は、ニコチンアミド及び／又はその塩、溶媒和物及び複合体である。ニコチンアミドの濃度は、例えば約１０mM〜約１００mM、例えば約１０mM〜約５０mM、約１mM〜約１００mM、又は約１mM〜約５０mMの範囲であり得る。別の実施形態において、ニコチンアミド濃度は、約１mM、約２mM、約５mM、約１０mM、約１５mM、約２０mM、約３０mM、約４０mM、約５０mM、約６０mM、約７０mM、約８０mM、約９０mM又は約１００mMである。
本明細書では、例えば実施例１３で示されるように、Noggin、EGF及びニコチンアミドの組み合わせで細胞を処理すると、１０％を超える処理細胞を誘導してNKX6-1を発現させることができる。
従って、一実施形態において、少なくとも一種のNoggin成分、少なくとも一種のEGF成分及び少なくとも一種のニコチンアミド成分の組み合わせは、Noggin、EGF及びニコチンアミド（例えばNENA）を含んでなる。
ニコチンアミドは、ヒト胎児膵臓細胞における内分泌分化の潜在的な誘導因子であることが示されている（Otonkoski et al., 1993）。しかしながら、この開示の前に、ニコチンアミドは、確定的な（definitive）内胚葉からのNKX6-1+前駆細胞の発生を特定的に促進するためにBMP阻害剤及び／又はEGF経路のアゴニスト（EGF又は他のEGF関連成長因子）と組み合わせて使用されてはいなかった。ニコチンアミドの包含は、例えば、異なるhPSC系からのNKX6-1+膵臓前駆細胞の再生可能かつ効果的な製造を向上させる。
エキセンディン−４並びにその活性複合体及び断片もまた、膵臓前駆細胞の分化誘導のために使用することができる。実施例１３はまた、エキセンディン−４を含んでなる組み合わせが内胚葉細胞集団の少なくとも３０％を分化誘導することを示している。
従って、一実施形態において、少なくとも一種のNoggin成分、少なくとも一種のEGF成分及び少なくとも一種のニコチンアミド成分の組み合わせは、エキセンディン−４成分を更に含んでなる。
本明細書で使用される用語「エキセンディン−４成分」は、GLP-1（グルカゴン様ペプチド１）受容体を活性化させ細胞内cAMPを増大させるポリペプチド及び化合物を指し、エキセンディン−４（SIGMA 7144）並びにその活性複合体及び断片、GLP-1並びにその活性複合体及び断片、例えばヒトグルカゴン様ペプチド１（SIGMA G3265）及びヒトグルカゴン様ペプチドアミド断片7-36（SIGMA G8147）並びにその活性複合体及び断片（天然活性変異体及び断片を含む）などを含むがこれらに限定されない。
ポリペプチド各々に対する活性化突然変異体（mutant variant）及び保存的突然変異体などの変異体（variants）も使用可能である。例えば、GLP-1(7-37)A8GなどのGLP-1の活性化突然変異体（mutant）も包含され得る。
本明細書で使用される用語「エキセンディン−４」は、GLP-1（グルカゴン様ペプチド１）受容体を活性化させ細胞内cAMP（SIGMA 7144）を増大させる３９個のアミノ酸ペプチド並びにその活性複合体及び断片を指す。
本明細書で使用される用語「活性断片」は、もととなるポリペプチドよりもサイズは小さいが実質的に相同なアミノ酸配列を有するポリペプチドであり、活性断片ポリペプチドは少なくとも約５０％又は６０％又は７０％又は８０％又は９０％又は１００％又は１００％を超える場合、例えば、もととなるポリペプチドよりも、生物学的作用について１．５倍、２倍、３倍、４倍又は４倍を超えて有効である。例としては、EGF受容体を結合して活性化させるEGFの断片、及びインスリン産生を促進するのに有効なGLP-1 7-37に類似しているが、GLP-1 9-37などの不活性断片ではないヒトグルカゴン様ペプチドアミド断片7-36（GLP-1 7-36アミド）（SIGMA G8147）が挙げられる。
一実施形態において、少なくとも一種のNoggin成分、少なくとも一種のEGF成分及び少なくとも一種のニコチンアミド成分の組み合わせは、少なくとも一種のエキセンディン−４成分を更に含んでなり、Noggin、EGF、ニコチンアミド及びエキセンディン−４（例えば、NENAEx）を含んでなる。
一実施形態において、内胚葉細胞集団を、少なくとも一種のNoggin成分、少なくとも一種のEGF成分、少なくとも一種のニコチンアミド成分、及び場合によっては少なくとも一種のエキセンディン−４の組み合わせと、少なくとも又は約３日間、少なくとも約４日間、少なくとも約５日間、少なくとも約６日間、少なくとも約７日間、少なくとも約８日間、少なくとも約９日間又は少なくとも約１０日間接触させる。別の実施形態において、内胚葉細胞集団を、当該組み合わせと、少なくとも約１１日間、少なくとも約１２日間、少なくとも約１３日間、少なくとも約１４日間又は少なくとも約１５日間接触させる。NKX6-1陽性及び／又はインスリン産生細胞生成能が、培養細胞内で例えば少なくとも３０日以上持続可能であることが見出される。
少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％又は少なくとも５０％又は少なくとも６０％又は少なくとも７０％又は少なくとも８０％又は少なくとも９０％の内胚葉細胞集団をNKX6-1+膵臓前駆細胞へ分化誘導する。
膵臓細胞マーカーのレベルを決定することによって分化を検出することができる。例えば、NKX6-1、PDX1、PTF1A及びSOX9は膵臓前駆細胞マーカーであり、これらのmRNA発現を、例えばRT-PCRによって検出することができる。また、膵臓前駆細胞を認識する抗体を用いて分化を検出することもできる。本明細書に記載されるように、例えば抗CD142抗体と同様に（Kelly et al., 2011）、成体ヒト膵臓外分泌細胞の表面マーカーと反応することが示されている抗HPx1及び抗HPx2抗体を使用してNKX6-1+膵臓前駆細胞の発生をモニタリングすることもできる。
一実施形態において、胚性幹細胞（ESC）又は人工多能性幹細胞（iPSC）などの多能性幹細胞（PSC）から内胚葉細胞集団を分化させる。
一実施形態において、多能性幹細胞はヒトなどの哺乳類由来である。一実施形態において、多能性幹細胞はヒトESC（hESC）又はヒトiPSC（hiPSC）である。
本明細書で使用される用語「iPSC」及び「人工多能性幹細胞」は互換可能に使用され、例えば、SOX2（遺伝子ID:6657）、KLF4（遺伝子ID:9314）、cMYC（遺伝子ID:4609）、NANOG（遺伝子ID:79923）、LIN28/LIN28A（遺伝子ID:79727）と組み合わせた（しかしこれらに限定されない）一種又はそれ以上の遺伝子（POU4F1/OCT4（遺伝子ID:5460）を含む）の発現を誘導することによって非多能性細胞、典型的には成体体細胞から人工的に得られた（例えば、完全な逆転によって誘導された）多能性幹細胞を指す。
一実施形態において、当該方法は、内胚葉細胞集団を得るための工程を含んでなる。例えば、本明細書に記載されるように、ESC又はiPSCなどの多能性幹細胞から内胚葉細胞への分化は、図１にステージ１〜３を含んでなるものとして特徴付けられている一連の工程を包含する。ステージ１は更に、サブステージ、例えば０日目から５日目までの３つのサブステージに分割することができる。ステージ２は例えば２〜３日であり、ステージ３は例えば１〜４日である。Nostro et al 2011及び本明細書に記載されるように、ステージ１は、多能性幹細胞集団を、ActA（又は他のNodalアゴニスト）及びWnt3aと０日目に接触させ、当該集団をActA、bFGF及び場合によってはWnt3aと１日目に接触させ、当該集団をActA及びbFGFと２日目に接触させ、ステージ１の分化細胞を製造することを含んでなることができる。ステージ２は例えば、分化させるべき集団（例えば、ステージ１の分化細胞）を、線維芽細胞成長因子１０（FGF10）、場合によってはウィングレス型MMTV組込部位ファミリーメンバー３Ａ（Wnt3a）及び場合によってはドルソモルフィンと接触させ、ステージ２の分化細胞を製造することを包含し得る。ステージ３は例えば、分化させるべき集団（例えば、ステージ２の分化細胞）を、Noggin、場合によってはシクロパミン−KAAD（Cyc）（又はその他のヘッジホッグ（HH）シグナリング阻害剤）、レチノイン酸（RA）、場合によってはFGF10及び／又は場合によってはエキセンディン−４と接触させることにより、内胚葉細胞集団を提供することを包含し得る。ドルソモルフィンは、例えば、CHORDIN LDN 193189及びBMPRなどの他のnoggin成分で置き換えることができる。ActAは他のNodalアゴニストで置き換えることができ、Wnt3aは他のWntシグナリングアゴニスト又は他のwnt/bカテニンアゴニスト、例えばCIHR99021で置き換えることができる。同様に、bFGF及びFGF10は、bFGF又はFGF10それぞれと同じ受容体を活性化させる他のFGF又は化合物で置き換えることができる。レチノイン酸は、例えばレチノイン酸類似体によって置き換えることができる。プロトコールは、例えば前述のプロトコール（Nostro et al., 2011）及び／又はそれに修正を加えたもの（例えば、１日目にWnt3aを添加し、５日目〜７日目にエキセンディン−４（Ex-4）を添加する）であり得る。変更としては、例えば、FGF10及び／又はエキセンディン−４をプロトコールから省略すること、および、Wnt3aの代わりとしてCIHR99021（Stemgent 04-0004）などを使用することが挙げられる。ステージ３の細胞を生成するためのプロトコールは、例えば、米国特許第７，９８９，２０４号、７，９９３，９１６号、８，１２９，１８２号及び８，１８７，８７８号に記載されており、これら各々を参照により引用する。そこに記載された方法を使用してステージ３の細胞を得ることができ、本明細書に記載されるステージ４の方法（例えば、ENA、NENA、NExENAなど）のいずれかを使用してそれらステージ３の細胞を更に分化させる。
ActAはnodalアゴニストである。本明細書で使用される用語「nodalアゴニスト」は、「nodal」（例えば、遺伝子ID:4338などのヒトnodal）又は「アクチビン」などのnodalシグナル変換を活性化させる任意の分子を意味する。本明細書で使用される用語「アクチビン」又は「ActA」は、「アクチビンＡ」（例えば、遺伝子ID:3624）、例えばヒトアクチビン、並びにその活性複合体及び断片（場合によっては天然活性複合体及び断片を含む）;例えばnodalシグナル変換を活性化させ得るもの並びにその活性複合体及び断片（場合によっては天然活性複合体及び断片を含む）を指す。
Wnt3Aはwntシグナリングアゴニストである。用語「wntシグナリングアゴニスト」は、本明細書で使用される際、肝細胞内でwnt/b-カテニン受容体を活性化させる任意の分子を意味し、例えばWnt3a及びGSK3選択阻害剤、例えばCIHR99021（StemoleculeTM CIHR99021 Stemgent）、６−ブロモインジルビン−３’−オキシム（BIO）（Cayman Chemical (カタログ番号:13123)）又はStemgent社製StemoleculeTM BIO（カタログ番号:04003）などを包含する。CIHR99021はGSK3の選択阻害剤である。想定されるGSK3選択阻害剤は、Wntシグナリング経路におけるGSK-3a/bに対する選択阻害剤などである。
FGF10及びbFGFは、FGF受容体シグナリングを活性化させるFGFメンバーである。
本明細書で使用される用語「FGFアゴニスト」は、サイトカインなどの分子を意味し、例えば、FGFシグナリング経路を活性化させる、例えばFGF受容体を結合して活性化させるFGF又は低分子を包含する。本明細書で使用される用語「FGF」は、任意の線維芽成長因子、例えばヒトFGF1（遺伝子ID:2246）、FGF2（bFGFとしても知られている；遺伝子ID:2247）、FGF3（遺伝子ID:2248）、FGF4（遺伝子ID:2249）、FGF5（遺伝子ID:2250）、FGF6（遺伝子ID:2251）、FGF7（遺伝子ID:2252）、FGF8（遺伝子ID:2253）、FGF9（遺伝子ID:2254）及びFGF10（遺伝子ID:2255）を指し、それらの活性複合体及び断片（天然活性複合体及び断片を含む）を含んでいてもよい。幾つかの実施形態において、FGFは、bFGF、FGF10、FGF4及び／又はFGF2である。
ステージ３（例えば、d7）までの多能性幹細胞を分化させるために添加される成分の代表的な範囲は、先に記載されたように（Nostro et al., 2011）提供され、及び／又は、サイトカイン及び低分子は以下の濃度で使用可能である：アクチビンＡ（Act1: 10-1000 ng/ml）、Wnt3a（ステージ１:25 ng/ml）、CIHR99021（ステージ１:0.1-3 mM）、bFGF（0.1-50 ng/ml）、FGF10（5-500 ng/ml）、Wnt3a（ステージ２: 3 ng/ml）、ドルソモルフィン（DM: 0.25-0.75 mM）、Noggin（NOG:1-500 ng/ml）、シクロパミン−KAAD（Cyc: 0.5-2.5 mM）、レチノイン酸（RA: 0.02-2 mM）、エキセンディン−４（Ex-4: 5-500 ng/ml）、EGF（1-500 ng/ml）、ニコチンアミド（NA: 1-100 mM）。
内胚葉細胞集団を得るための他の細胞分化方法も使用可能である。
従って、更なる側面は、工程（又は副工程）ａ、ｂ及びｃの一つ又はそれ以上と工程ｄとを含んでなる、多能性幹細胞集団からNKX6-1+膵臓前駆細胞を製造する方法を包含する：
ａ）多能性幹細胞集団を
Ｉ）nodalアゴニスト（場合によってはActA）及びwntシグナリングアゴニスト（場合によってはWnt3a又はCIHR 99021）、
ＩＩ）nodalアゴニスト（場合によってはActA）、FGFアゴニスト（場合によってはbFGF）及び場合によってはwntシグナリングアゴニスト（場合によってはWnt3a、CIHR99021）及び
ＩＩＩ）nodalアゴニスト（場合によってはActA）及びFGFアゴニスト（場合によってはbFGF）
の組み合わせと接触させ、ステージ１の分化細胞を製造する工程、
ｂ）ステージ１の分化細胞を、FGFアゴニスト（場合によってはFGF10）及び場合によってはwntシグナリングアゴニスト（場合によってはWnt3a）及び／又はnoggin成分（場合によってはドルソモルフィン）と接触させ、ステージ２の分化細胞を製造する工程、
ｃ）ステージ２の分化細胞を、Noggin成分（場合によってはNoggin）、レチノイン酸（RA）又はRA類似体、及び場合によってはシクロパミン−KAAD（Cyc）、FGFアゴニスト（場合によってはFGF10）、及び／又はエキセンディン−４成分（場合によってはエキセンディン−４）と接触させることにより、内胚葉細胞集団を提供する工程、及び
ｄ）内胚葉細胞集団を、EGF成分、ニコチンアミド成分及び／又はNoggin成分、場合によっては少なくとも一種のEGF成分と少なくとも一種のニコチンアミド成分とを含んでなる組み合わせと、少なくとも一部の内胚葉細胞集団をNKX6-1+膵臓前駆細胞へ分化誘導するのに十分な量で接触させる工程。
一実施形態において、ステージ２（場合によってはドルソモルフィンの代わりに）は、当該集団を少なくとも一種のNoggin成分と接触させることを更に含んでなる。
一実施形態において、当該工程は、工程ａ、ｂ及びｃの二つ又はそれ以上を含んでなる。例えば、当業者は、ステージ２の細胞又はその等価物に適用すべき方法が工程ｃ）及びｄ）を含んでなることを認識するであろう。同様に、出発細胞集団のサブステージに応じて、一つ又はそれ以上の副工程ａ）を行う及び／又は除外することもできる。
本明細書で使用される「ステージ１の細胞」は、Nostro et al., 2011などに記載されるような、２Ｄ又は３Ｄ形式でのヒト多能性幹細胞（hESC及びhiPSC）のインビトロ分化の後に生成されるSRYボックス含有遺伝子１７（SOX17）（遺伝子ID:64321）及びケモカイン（C-X-Cモチーフ）受容体４（CXCR4）（遺伝子ID:7852）の発現を少なくとも特徴とする内胚葉細胞を意味する。
本明細書で使用される「ステージ２の細胞」は、Nostro et al., 2011などに記載されるような、２Ｄ又は３Ｄ形式でのヒト多能性幹細胞（hESC及びhiPSC）のインビトロ分化の後に生成されるフォークヘッドボックスＡ２（FOXA2）（遺伝子ID:3170）の発現及びHNF1ホメオボックスＢ（HNF1B）（遺伝子ID:6928）の発現を少なくとも特徴とする内胚葉細胞を意味する。
本明細書で使用される「ステージ３の細胞」は、Nostro et al., 2011などに記載されるような、２Ｄ又は３Ｄ形式でのヒト多能性幹細胞（hESC及びhiPSC）のインビトロ分化の後に生成されるフォークヘッドボックスＡ２（FOXA2）（遺伝子ID:3170）の発現を少なくとも特徴とする内胚葉細胞を意味する。
本明細書で使用される「ステージ４の細胞」は、実施例１などに記載されるような、２Ｄ又は３Ｄ形式でのヒト多能性幹細胞（hESC及びhiPSC）のインビトロ分化の後に生成されるNK6ホメオボックス１（NKX6-1）（遺伝子ID:4825）の発現並びに膵臓及び十二指腸ホメオボックス１（PDX1）（遺伝子ID:3651）の発現を少なくとも特徴とする内胚葉細胞を意味する。
例えばNKX6-1陽性前駆細胞を用いてインスリン産生細胞をインビボ及び／又はインビトロで生成することができる。
例えば、本明細書に記載された方法に従って製造された移植NKX6-1陽性前駆細胞は、本明細書の実施例３に実証されるように、インスリン産生細胞に分化する。
一実施形態において、例えば、ステージ３の細胞を、インドラクタムＶ及び／又はPDBuなどのPKC活性化因子と共に培養する。他の化合物としては、ITS（即ち、B27補充物を使用するのと同様であるインスリン・セレン・トランスフェリン）；CYP26A阻害剤、場合によってはＮ−｛４−［２−エチル−ｌ−（ｌＨ−１，２，４−トリアゾール−ｌ−イル）ブチル］フェニル｝−ｌ，３−ベンゾチアゾール−２−アミンが挙げられる。
また、別の側面において提供されるのは、ステージ３の内胚葉細胞及び／又はステージ４の膵臓前駆細胞からインスリン産生細胞を製造するためのインビトロでの方法であって、ステージ３及び／又は４細胞を内皮細胞と共培養することを含んでなる方法である。一実施形態において、当該方法は、CD34+内皮細胞の存在下で内胚葉細胞を培養することを含んでなる。
共培養は、例えば、bFGF（例えば50 ng/ml）及びVEGF（100 ng/ml）を補完したNENA及び／又はNENaEx培地内で行うが、膵臓細胞生存及び内皮細胞生存の両方を許容する任意の培地内、例えばEndoGRO (Millipore)、MV2 培地(Promocell)、BD内皮細胞培地内で行うこともできる。培地は、場合によってはNoggin成分、EGF成分、ニコチンアミド成分及びエキセンディン−４成分の一種又はそれ以上、並びにbFGF（又は他のFGF）及びVEGF（又はVEGF受容体KDRを介してシグナリングを活性化させる他の化合物）の一種又はそれ以上を含んでなる。一実施形態において、培地は、Noggin成分、EGF成分、ニコチンアミド成分、bFGF及びVEGFを含んでなる。一実施形態では、膵臓前駆細胞が凝集させられる。膵臓前駆細胞を凝集させるために、単層培養物を、ピペッティングにより機械的に分裂させるか、又は酵素で解離させ、低付着プレート内でのインキュベーションにより又は細胞集団の振とうにより凝集させることができる。
一実施形態において、NKX6-1陽性膵臓前駆細胞を凝集させ、凝集物をCD34+内皮細胞と共培養する。凝集物をCD34+内皮細胞上に直接播種するか、又は膜又は他の装置などの拡散させる生体材料によって分離することができる。場合によっては5ng/mlのbFGF 及び100ng/mlのVEGFを含んでいてもよいNENAEx含有培地中において、更に７、８、９、１０日間又はそれ以上培養物を維持することができる。
内皮細胞は、例えばhESC由来であり得る。例えば、培養hESCを、BMP4、bFGF及びVEGFの一種又はそれ以上の組み合わせを用いて誘導することができる。十分な時間（例えば６日間）の後、CD34+細胞を選別し、bFGF及びVEGFなどを補充したEGM-2培地（Lonza）などの好適な培地中で培養することができる。十分な時間は、例えば、KDR、CD31、VE-カドヘリン、VEGF受容体及びvWFの一種又はそれ以上を誘導する及び／又は図８などに示されるようにアセチル化LDLを取り込む能力を備える（comprise）のに十分な程長い誘導時間を含む。
一実施形態において、内皮細胞はH1 hESC系由来である。プロトコールは任意のhESC系及びhiPS系まで拡張可能である。
一実施形態において、内皮細胞をEGM-2培地中で培養する。その他の市販されている内皮細胞培地も好適である。
インスリン産生細胞の検出としては、例えば、フローサイトメトリーなどによるｃペプチド陽性の検出及び／又はRT-PCRなどによるインスリン及び／又はグルカゴン発現の検出を挙げることができる。
一実施形態において、例えば内皮細胞との共培養後に生成されるインスリン産生細胞は、単一ホルモン性である。
本明細書で使用される用語「インスリン産生細胞」は、インスリンを分泌する膵臓前駆細胞から分化した細胞を指す。インスリン産生細胞としては、機能的膵臓β細胞、並びに構成的又は誘導可能な様式でインスリンを合成、発現又は分泌する膵臓β様細胞が挙げられる。例えば、本明細書に記載された方法に従って内胚葉細胞を膵臓前駆細胞へ分化させ、その後インスリン産生細胞へ分化させることによって製造されるインスリン産生細胞集団は、機能的膵臓β細胞又はβ様細胞（例えば、内因性の機能的β細胞の少なくとも２つの特徴を有する細胞）であり得る。また、例えば本明細書に開示されたような方法によって製造されるインスリン産生細胞集団が、膵臓β細胞又は膵臓β様細胞を含んでなることができ、また、非インスリン産生細胞（例えば、それらがインスリンを産生又は分泌しないこと以外は、β細胞様表現型を有する細胞）を含有し得ることも想定される。
本開示はまた、別の側面において、NKX6-1+膵臓前駆細胞の成熟をインビトロで促進するのに有用な内皮細胞を提供する。生成されたインスリン産生細胞が機能的である又は機能的であると期待されるかどうかを決定することは（例えば、これらインスリン産生細胞がPDX1及びNKX6-1などのその他重要な膵臓細胞を共発現する場合には）有用である。本出願に開示された方法は、ヒト内皮細胞（又はそれらの成分）を膵臓前駆細胞との共培養において使用し、PDX1及びNKX6-1を共発現する膵臓系統細胞を製造する。現在開示されている細胞は機能的であると期待される。本開示に示すように、hESC由来内皮細胞は、hPSCからのインスリン産生細胞の誘導及び成熟に適する集団となる。
一実施形態によれば、当該方法は、約１０％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は約９５％を超えるNKX6-1陽性膵臓前駆細胞を、内胚葉細胞集団から製造することを誘導し、及び／又は約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は約９５％を超えるインスリン産生細胞を、NKX6-1陽性膵臓前駆細胞から製造することを誘導する。
細胞は、細胞培養混合物として採取する（例えば、好適な希釈剤中において沈降・再懸濁させる）ことができる。
幾つかの実施形態において、当該方法は、NKX6-1陽性膵臓前駆細胞及び／又はNKX6-1陽性膵臓β細胞などを富化及び／又は単離することを更に含んでなる。
一実施形態において、単離工程は、NKX6-1陽性細胞を結合する特定の剤と細胞集団を接触させることを含んでなる。
例えば実施例４において、HPx1及びHPx2に対する抗体を使用してNKX6-1陽性細胞を富化することができることもまた実証されている。具体的には、HPx1及びHPx2抗体がNKX6-1陽性膵臓前駆細胞の富化を許容することが実証される。
従って、一実施形態において、当該方法は、NKX6-1陽性細胞を含んでなる細胞集団をHPXエピトープ検出抗体と接触させることを含んでなる。
本明細書で使用される「HPXエピトープ検出抗体」は、例えば、Oregon Health&Science University（HPx2=OHSU#10381）、Beta Cell Biology Consortium（Hpx2=AB2195及びHPx1=AB2194）、Novus Biologicals（HPx1=NBP1-18951、HPx2=NBP1-18952）から入手できるHpx1及びHPx2と呼ばれる抗体、及びHpx1又はHPx2と同じエピトープを認識する抗体を包含する。例えば、Hpx1及び／又はHPx2抗体と同じCDR配列を含んでなる抗体（例えばヒト化形態及びキメラ形態を含む）は、Hpx1及び／又はHPx2と同じエピトープを検出する。
NKX6-1陽性前駆細胞がSOX9、PTF1aを発現することも実証される。SRYボックス９としても知られているSOX9は転写因子であり、PTF1aは膵臓特異的転写因子１ａとしても知られている。
一実施形態において、当該方法は、NKX6-1+膵臓前駆細胞を単離／富化することを含んでなり、単離／富化は、膵臓前駆細胞を含んでなる細胞集団をHPx1及び／又はHPx2に対する抗体と接触させ、HPx1及び／又はHPx2結合細胞亜集団を単離又は部分的に精製することを含んでなる。
別の実施形態において、当該方法は、NKX6-1+膵臓前駆細胞を単離／富化することを含んでなり、単離／富化は、膵臓前駆細胞を含んでなる細胞集団を、CD142に対する抗体と組み合わせてHPx1及び／又はHPx2に対する抗体と接触させ、HPx1及び／又はHPx2及びCD142結合細胞亜集団を単離又は部分的に精製することを含んでなる。
一実施形態において、HPx1及び／又はHPx2及び／又はCD142抗体を磁気ビーズなどのビーズにコンジュゲートさせる。一実施形態において、富化は、蛍光活性化細胞選別（FACS）などによって細胞選別することを含んでなる。
実施例４は、例えば、HPxが１３日目のNENA誘導されたNKX6-1 GFP陽性細胞のおよそ６０％を染色することを示している。
NKX6-1+前駆細胞集団を染色する二種の抗体（HPx1及びHPx2）の同定は、hPSC由来膵臓前駆細胞のモニタリング、定量化及び精製などを促進する。
本開示の前に、成体外分泌細胞を検出することが知られていた抗体HPx1及びHPx2（本明細書ではまとめて「HPx」と呼ぶ）が膵臓前駆細胞を認識することを示す又は証明するものはなかった。これら抗体の使用は、様々な下流用途に対するそれらの実施可能性を保つように、例えばhESCs/hiPSCs由来又は他の供給源由来の膵臓前駆細胞を同定、モニタリング及び単離する方法を促進する。
HPx抗体を、例えばCD142などの他の抗体と組み合わせて、場合によっては富化及び／又は単離された集団中のNKX6-1陽性細胞の数を更に増やすことができる。
従って、一実施形態において、当該方法は、NKX6-1陽性膵臓前駆細胞集団を富化及び／又は単離することを含んでなり、単離された集団内の全細胞の少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又はそれ以上がNKX6-1陽性膵臓前駆細胞である。
単離／富化方法はまた、例えばCD142などの他の膵臓前駆細胞表面マーカーに対する抗体などの他の剤を使用することを含んでなることができる。
一実施形態において、NKX6-1陽性細胞を含んでなる細胞集団は、本明細書に記載される方法に従って製造されるNKX6-1陽性集団である。
本明細書で使用される用語「単離された細胞集団」は、混合された又は均質な細胞集団から除去及び分離された細胞集団を指す。幾つかの実施形態において、単離された集団は、細胞を単離又は富化した均質な集団と比べて実質的に純粋な細胞集団である。
特定の細胞集団に関する用語「実質的に純粋な」は、全細胞集団を構成する細胞に対して少なくとも約６５％、好ましくは少なくとも約７５％、少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％及び最も好ましくは少なくとも約９５％純粋である細胞集団を指す。同様に、NKX6-1陽性膵臓前駆細胞の「実質的に純粋な」集団は、本明細書中の用語によって規定されるようなNKX6-1陽性膵臓前駆細胞でもそれらの子孫でもない細胞を約３０％未満、約２０％未満、より好ましくは約１５％未満、１０％、８％、７％、最も好ましくは約５％未満、４％、３％、２％、１％又は１％未満を含有する細胞集団を指す。幾つかの実施形態において、本発明は、NKX6-1陽性膵臓前駆細胞集団を増殖させる方法であって、増殖させたNKX6-1陽性膵臓前駆細胞集団はNKX6-1陽性膵臓前駆細胞の実質的に純粋な集団である方法を包含する。
用語「富化する」又は「富化される」は、本明細書中では互換可能に使用され、一種の細胞の収率（画分）が、出発培養物又は調製物における当該種類の細胞の画分に対して少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％又は少なくとも約６０％増大することを意味する。富化及び部分的な精製も互換的に使用可能である。
組成物及びキット
上述のように、NKX6-1膵臓前駆細胞及び分化されたインスリン産生細胞を単離することができる。従って、更なる側面は、本明細書に記載される方法に従って製造されるNKX6-1陽性膵臓前駆細胞及び／又は分化させたインスリン産生細胞の富化、精製又は単離された細胞集団を包含する。別の側面は、NKX6-1陽性膵臓前駆細胞及び／又は分化させたインスリン産生細胞の富化、精製又は単離された細胞集団と、好適な希釈剤とを含んでなる組成物を包含する。
好適な希釈剤としては、例えば好適な培地、すなわち血清、血清代替物若しくは血清補充物などを含有する凍結培地、及び／又はジメチルスルホキシド（DMSO）、グリセロールメチルセルロース若しくはポリビニルピロリドンなどの好適な抗凍結剤が挙げられる。
更なる側面は、EGF成分、ニコチンアミド成分、及び／又はNoggin成分を含んでなる培地補充組成物を包含し、これらの成分は細胞培養基本培地用の補充物として使用することができる。また、補充物としては、アスコルビン酸、L-グルタミン及びB27などの本明細書で検討した他の成分を挙げることができる。一実施形態における補充物は、活性成分：Noggin、EGF、ニコチンアミド（例えば、NENA補充物）及び場合によってはアスコルビン酸、L-グルタミン及びB27の一種又はそれ以上を含んでなる。他の実施形態において、補充物としては、例えばエキセンディン−４成分（例えば、NENAEx補充物）が挙げられる。
内胚葉細胞からNKX6-1+細胞を分化させるための成分を、DMEM（又は例えば、IMDM、RPMI、CMRL）などの基本培地に添加すべき単一の補充物として含ませることができる。一実施形態において、補充物は、活性成分：Noggin、EGF、ニコチンアミド、アスコルビン酸、L-グルタミン及びB27を含有する。
更なる側面は、ある段階から別の段階へ細胞を分化させるのに適する培地組成物である。例えば、好適なステージ４の培地組成物は、例えばEGF成分及び／又はニコチンアミド成分、場合によってはNoggin成分、及び／又はステージ４の分化を促進し得る本明細書に記載された更に他の成長因子など（場合によってはエキセンディン−４成分）を含んでなることができる。
本明細書中で言及される用語「細胞培地」（本明細書中では「培地（culture medium）」又は「培地（medium）」とも呼ぶ）は、細胞生存能力を維持し、かつ増殖及び場合によっては分化をサポートする栄養素を含有する細胞を培養するための培地である。細胞培地は、以下のいずれかを好適な組み合わせで含有し得る：塩；緩衝剤；アミノ酸、グルコース又は他の糖、抗生物質、血清又は血清代替物、及びペプチド成長因子、ビタミンなどの他の成分。特定の細胞種に通常使用される細胞培地は当業者に知られている。
好適な培地としては、好適な基本培地、例えばDMEM（Life Technologies）、IMDM、RPMI、CMRL及び／又は内胚葉細胞の成長をサポートし、成分及び場合によっては他の剤を添加することができる基本培地組成物などを提供する（例えば、好適なステージ４の培地組成物を提供する）その他の培地を挙げることができる。
ステージ特異的培地、例えばステージ４の培地（例えばNENA又はNENAEx培地）を調製することができる。例えば、培地を使用して内胚葉細胞集団を培養し、NKX6-1陽性分化を誘導することができる。
従って、更なる側面は、
細胞培養基本培地；及び
ｉ）EGF成分、
ｉｉ）ニコチンアミド成分、及び
ｉｉｉ）Noggin成分、及び
ｉｖ）場合によってはエキセンディン−４成分
の一種又はそれ以上
を含んでなる培地組成物である。
培地組成物（又は基本培地）は、ペニシリン及びストレプトマイシンなどの一種又はそれ以上の抗生物質；L-グルタミン（Life Technologies）、血清代替物B27 Supplement（Life Technologies）などの一種又はそれ以上のアミノ酸、及び／又はL-アスコルビン酸（SIGMA）などの一種又はそれ以上のビタミンを更に含んでなることができる。好適なレシピは実施例８などに提供されている。
補充物中の成分の量は、例えば、培地中で希釈したとき（例えば、４５０mLの基本培地中で希釈したとき）に内胚葉集団などを分化させるための本明細書に記載される濃度になる量であり得る。同様に、培地中の成分の量も、内胚葉集団などを分化させるための本明細書に記載される濃度になる量であり得る。
更なる側面は、
EGF成分、
ニコチンアミド成分、及び／又は
Noggin成分、及び／又は
場合によってはエキセンディン−４成分
を含んでなるキットを包含する。
上記のように、組成物及びキット成分は、本明細書の他の部分及び場合によっては使用説明書に記載される成分のいずれかを包含し得る。例えば、一実施形態において、キットは、本明細書に記載される一つ又はそれ以上のステージの分化を誘導する成分などを含んでなる補充物（例えばステージ４の補完物）を含んでなる。一実施形態において、キットは、基本培地、場合によっては本明細書に記載される基本培地を含んでなる。
使用
NKX6-1+HPSC由来膵臓前駆細胞（例えばHpx1/2富化された）及びそれらのβ細胞誘導体は多数の用途に使用可能である。
例えば、NKX6-1膵臓前駆細胞は予測薬物毒性学（predictive drug toxicology）及び創薬のために使用可能である。
従って、一実施形態においては、本明細書に記載される方法を用いて生成したNKX6-1発現集団を試験化合物と接触させ、試験化合物が、対照と比べて、１）増殖を促進する、２）アポトーシスを誘発する及び／又は３）NKX6-1発現細胞をインスリン産生β様細胞及び他のホルモン産生細胞（例えば、ソマトスタチン、グルカゴン、膵臓ポリペプチド及びグレリン）、腺房又は導管細胞へ分化誘導するか否かを決定するアッセイが提供される。当該技術分野で知られているアッセイを使用して、例えばアポトーシス及び／又は細胞増殖を評価することができる。ホルモン産生細胞への分化は、ホルモン産生、場合によっては分泌ホルモンを測定することによって、又はmRNAレベルを評価することによって評価可能である。
試験化合物との接触のためにより均質な集団を提供することによって、HPX抗体の使用は化合物スクリーニングを促進し得る。更に、内皮細胞との共培養によって生成されるインスリン+細胞を富化した集団を使用して、増殖又はアポトーシスを誘発し得る化合物及びグルコース刺激インスリン分泌を改善し得る化合物を試験することができる。
記載された細胞はまた実施例３などに示されるような細胞移植にも使用可能である。例えば、糖尿病及び／又は前糖尿病状態を治療するために、混合細胞集団、富化及び／又は単離NKX6-1陽性膵臓前駆細胞、及び／又はNKX6-1陽性インスリン産生細胞を、それを必要とする被検体に導入することができる。
従って、ある側面は、本明細書に記載される方法に従って細胞を取得し及び／又は膵臓前駆細胞及び／又はインスリン産生細胞を調製し、それを必要とする被検体、例えば糖尿病を伴う被検体に前記細胞を投与することを包含する。
また、前記細胞及び前記細胞を含んでなる組成物の、それを必要とする被検体に移植する及び／又は当該被検体を治療するため、例えば糖尿病を伴う被検体に移植する及び／又は当該被検体を治療するための使用も含まれる。
一実施形態において、糖尿病は１型糖尿病である。別の実施形態において、糖尿病は２型糖尿病である。
一実施形態において、NKX6-1陽性膵臓前駆細胞及び／又はβ細胞は組織工学において使用される。例えば、精製された膵臓系統細胞集団へのアクセスにより、規定数の膵臓細胞を用いて改変された構築体の生成が可能になる。
一実施形態において、当該方法は、患者特異的疾患hiPSCに適用され、例えば糖尿病モデルに使用される。例えば、糖尿病患者から採取した膵臓又は他の細胞を単離、処理してhiPSCを取得し、次いでそれらを培養し、NKX6-1膵臓前駆細胞へ分化誘導することができる。これらの細胞を使用して、疾患に関与する遺伝子又は患者の免疫細胞に対する応答などの疾患の特徴を評価することができる。
例えば、正常な細胞と患者特異的疾患hiPSCとをNKX6-1陽性膵臓及び内皮細胞へ誘導し、比較することができる。例えば、正常な細胞及び患者特異的hiPSCから得られた膵臓前駆細胞及びβ細胞の遺伝子分析、エピジェネティック分析及びプロテオーム分析を行うことができる。かかる詳細な分析は、正常なヒト膵臓発生を制御するシグナリング経路、転写制御ネットワーク及び／又は細胞表面マーカー並びに疾患に関与するそれらのものの発見につながり得る。
本明細書で使用される用語「被検体」は、哺乳類を含む動物の全てのメンバーを包含し、好適にはヒトを指す。
用語「治療する（treat）」、「治療する（treating）」、「治療（treatment）」などは、単離細胞に対して適用される際、細胞をあらゆる種類のプロセス又は条件に供すること、又は細胞に対するあらゆる種類の操作又は処置を行うことを包含する。被検体に対して適用される際、当該用語は、医療的又は外科的配慮、ケア又は管理を個体に提供することを指す。
本明細書で使用される用語「治療」は、被検体に対して適用される際、有利な又は所望の結果（臨床結果を含む）を得ることを目的とするアプローチを指し、医療的処置及び適用、例えば薬剤介入、手術、放射線治療及び自然療法的介入、並びに糖尿病治療のための試験治療を包含する。有利な又は所望の結果としては、一つ又はそれ以上の症状又は状態の緩和又は改善、疾患の程度の低下、疾患状態の安定化（すなわち悪化しないこと）、疾患の蔓延防止、疾患の進行の遅延又は鈍化、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解（部分的又は全体的）（いずれも検出可能であるか検出不能であるかは問わない）が挙げられるが、これらに限定されない。「治療」はまた、治療を受けない場合に予測される生存と比較して生存を引き延ばすことを意味する。
本明細書で使用される用語「投与する」、「導入する」及び「移植する」は、所望部位に導入細胞を少なくとも部分的に局在させる方法又は経路によって細胞（例えば、NKX6-1陽性膵臓前駆細胞又はそれらの分化した子孫（例えば、膵臓β細胞などのインスリン産生細胞））を被検体内に送達するという文脈においては互換可能に使用される。細胞を膵臓に直接移植するか、あるいは被検体内の所望位置に送達させる任意の好適な経路によって投与することができ、ここでは、移植細胞又は当該細胞の成分の少なくとも一部は生存したままの状態である。
更に、特定の章に記載された定義及び実施形態は、当業者が理解するように、好適であると本明細書に記載される他の実施形態にも適用可能であることが意図されている。例えば、以下の部分には本発明の様々な側面がより詳細に規定される。特にそれとは反対の指示がない限り、そのように規定される各側面をその他の一つまたはそれ以上の側面と組み合わせてもよい。特に、好ましい又は有利であるものとして示される特徴を好ましい又は有利であるものとして示される一つまたはそれ以上のその他の特徴と組み合わせてもよい。
上記開示は本出願を一般的に記載するものである。以下の特定実施例を参照することによって、より完全なる理解が得られる。これらの実施例は例証のためにのみ記載され、本出願の範囲を限定するものではない。状況が示唆し得る又は好都合とし得る場合には、形式の変化及び均等物の置換が想定される。本明細書中には特定の用語が使用されているが、このような用語は説明のためのものであり、限定目的のものではない。
以下の非限定実施例は、本開示を説明するためのものである。
実施例１：Noggin、EGF、ニコチンアミド及びエキセンディン−４がhESC由来内胚葉細胞内でのNKX6-1発現を誘導する
機能的β細胞を生成する能力を有する膵臓前駆細胞は、重要な転写因子：PDX1、SOX9、NKX6-1及びPTF1Aの発現を特徴とする。NKX6-NKX6-11は、機能的β細胞集団の発生に必須であるため、特に重要である（Sander et al., 2000）。現在までの間、PDX1膵臓内胚葉からのこれら前駆細胞の発生を制御する因子は知られていない。
機能的β細胞を生成する能力を有するhPSCからNKX6-1+内胚葉細胞を生成するための確実な方法が本明細書に記載されている。相同組換えによってGFPがNKX6-1遺伝子座を標的としているhESCレポーター細胞系を使用して、NKX6-1-GFP+集団の発生を誘導し得る因子を同定した。この手法により、以前に公開されたプロトコール（Nostro et al., 2011；参照により本明細書に引用する）を用いて、７日間かけてhPSCを「膵臓蕾状期（pancreatic bud stage）」（PDX1+発現細胞）へ分化させる。次いでこれらの細胞を、一種又はそれ以上の成分、場合によってはBMP阻害剤（Noggin又は他のBMPアンタゴニスト）、EGF（又はEGF関連因子）、ニコチンアミド（Nicotinamide）及びエキセンディン−４（Exendin-4）の組み合わせ（NENAEx）中で培養し、様々なNKX6-1-GFP発現時間にて分析する。NKX6-1-GFP発現は、フローサイトメトリーにより測定すると、NENAEx中での培養を開始して３日以内に検出された（図２）。
図１は、前記プロトコール（Nostro et al., 2011）に多少の修正（１日目にWnt3aを添加し、５日目〜７日目にエキセンディン−４（Ex-4）を添加する）を加えたものに従ってHPSCをステージ３（ｄ７）まで分化させることを概略的に例証している。サイトカイン及び低分子を以下の濃度で使用した：アクチビンＡ（Act1: 100 ng/ml）、Wnt3a（ステージ1:25 ng/ml）、bFGF（5 ng/ml）、FGF10（50 ng/ml）、Wnt3a（ステージ２: 3 ng/ml）、ドルソモルフィン（DM: 0.75 mm）、Noggin（NOG:50 ng/ml）、シクロパミン−KAAD（Cyc: 2.5 mM）、レチノイン酸（RA: 2 mM）、エキセンディン−４（Ex-4: 50 ng/ml）、EGF（50 ng/ml）、ニコチンアミド（NA: 10 mM）。
図２は、Noggin、EGF、ニコチンアミド及びエキセンディン−４が、hESC由来内胚葉細胞中でのNKX6-1:GFP発現を誘導することを実証している。NKX6-1GFP/whESC系の膵臓分化中のGFPに関する動態解析（７日目〜１７日目、T7-T17）。公開されたプロトコール（Nostro et al., 2011）に従ってNKX6-1GFP/w細胞をステージ３まで分化させ、次いでNoggin（50 ng/ml）、EGF（50 ng/ml）、ニコチンアミド（10 mM）及びエキセンディン−４（50 ng/ml）で１１日間処理した。GFPは、フローサイトメトリーにより測定すると、１０日目に初めて検出され、分化１３日目にその発現が最大に達する。エラーバーは、平均の標準誤差を表す（n=3）。
NKX6-1-GFP+細胞の割合は、その後３日間（例えば、培養１１〜１３日目）で劇的に増加し、１３日目までに培養物全体の６０％を超えることを示している。NKX6-1-GFPレベルは、次の２日間は一定のままであり、その後、培養１７日目まで緩やかに減少した。
分子解析（RT-qPCR）により、９日目〜１１日目にNKX6-1発現がアップレギュレートされ、次いで１７日目まで着実に減少することが明らかになった（図３）。
図３は、NKX6-1誘導がPDX1、PRF1A及びSOX9発現と一致することを示している。NKX6-1GFP/whESC系の膵臓分化中のGFPに関する動態解析（７日目〜１７日目、T7-T17）中の、NKX6-1、PDX1、PTF1A及びSOX9に関するQPCR解析。公開されたプロトコール（Nostro et al., 2011）に従ってNKX6-1GFP/w細胞をステージ３まで分化させ、次いでNoggin（50 ng/ml）、EGF（50 ng/ml）、ニコチンアミド（10 mM）及びエキセンディン−４（50 ng/ml）で１１日間処理した。発現レベルはハウスキーピング遺伝子TBPに対して正規化され、成体の膵臓（AP、灰色のバー）の発現レベルと比較される。エラーバーは、平均の標準誤差を表す（n=2）。
mRNA及びGFP発現の動態における差異は、導入遺伝子発現の遅延並びにNKX6-1メッセージとGFPタンパク質との安定性の差異を反映し得る。PDX1の発現は数日早く、つまり７日目〜８日目にアップレギュレートされた（図３）。PDX1発現レベルは１０日目にピークを迎え、その後、次の７日間で低下した。PTF1A発現パターンは一時的なものであり、分化１０日目〜１４日目に検出された。SOX9発現は８日目〜１０日目にアップレギュレートされ、次いで、実験期間中ずっと比較的一定のままであった。総合すると、これらの知見により、NENAExの組み合わせが膵臓内胚葉からの内分泌前駆細胞の発生を誘導することが実証される。
実施例２：Noggin、EGF及びニコチンアミド（NENA）の組み合わせがhESC由来内胚葉細胞におけるNKX6-1発現を誘導する
NENAEx因子の組み合わせのいずれがNKX6-1+前駆細胞の生成にとって必須であるかを更に決定するために、レポーターNKX6-1-GFP hESC上及び第二の未操作hESC系H1（WA01）上で異なる組み合わせを試験した。細胞内フローサイトメトリーを使用して、H1由来集団におけるNKX6-1+細胞の割合を評価した。図４に示すように、Noggin、EGF及びニコチンアミドの組み合わせ（NENA）は、NKX6-1を誘導する上でNoggin、EGF、ニコチンアミド及びエキセンディン−４の四種の因子の組み合わせと同等に有効であった。EGF及びニコチンアミドの組み合わせ（ENA）はNKX6-1発現を誘導した（46.9±7.4%）が、レベルは常に三種の因子の組み合わせ（NENA）と比べて低いものであった（図４Ａ）。H1（WA01）分化は、NENA処理に応答して非常によく似たパターンを示した（図４Ｂ）。H9細胞系を使用して同様のデータが得られた。これは、この誘導プロトコールが細胞系依存型ではなく、hPSC由来NKX6-1前駆細胞の生成に広く適用可能であることを実証している。
図４Ａは、NKX6-1GFP/w HESC系を使用して、未処理又は上記化合物の多様な組み合わせと比べて、Noggin、EGF、ニコチンアミド（エキセンディン−４を伴う又は伴わない）の存在下で内胚葉細胞を培養するときにNKX6-1:GFP+細胞の割合が最も高いことを実証している。
図４Ｂは、H1（WO01）HESC系を使用して、未処理又は上記化合物の多様な組み合わせと比べて、Noggin、EGF、ニコチンアミド（エキセンディン−４を伴う又は伴わない）の存在下で内胚葉細胞を培養するときにNKX6-1+細胞の割合が最も高いことを実証するグラフである。
実施例３：「NENA処理」を用いて生成されたNKX6-1細胞はインスリン産生細胞を生成する能力を有する
hPSC由来NKX6-1富化集団の発生能を確立するために、免疫無防備マウスの乳房脂肪体内に5-10´106個のNENA誘導細胞を移植した（分化１４日目）。移植後４週間での移植片分析は、PDX1及びNKX6-1の両方の発現を維持した導管様構造（例えば、CK19+）の存在を明らかにした。この段階で、移植片には僅かしかグルカゴン+細胞が含まれておらず、インスリン+細胞はほぼ含まれていなかった（図５Ａ）。移植後６週間で、移植片には相当数のNKX6-1+細胞が含まれていた（図５Ｂ）。６週目の移植片は、４週目の移植片と比べて、含まれるインスリン+細胞の割合が高かった。これらのインスリン+細胞は全てNKX6-1を共発現した（図５Ｂ）。移植片中に存在するインスリン+細胞がhPSC由来インスリン産生細胞を表すことを実証するために、抗ヒトｃペプチド抗体を用いて免疫組織化学を行った。図５Ｃに示すように、移植片はｃペプチド+細胞を含有しており、このことは、インスリンが血液から採取されているのではなく、ヒト細胞によって産生されていることを裏付けるものである。更に、抗グルカゴン抗体で共染色することにより、ｃペプチド+細胞がグルカゴンを発現しないことが判明した。このことは、それらが多ホルモン性ではないことを示している（図５Ｃ）。これら移植研究からの知見は、NENA誘導前駆細胞がインビボ移植後にインスリン産生細胞及び導管細胞へ分化可能であることを実証している。
実施例４：HPx抗体がNKX6-1+前駆細胞を標識する
最近の研究によって、表面マーカーCD142がhPSC由来培養物から多能性膵臓前駆細胞を単離するのに使用可能な潜在的エピトープとして同定された（Kelly et al., 2011）。異なる抗体のライブラリーを分析すると、二種の前記抗体HPx1及びHPx2がNKX6-1+前駆細胞集団を染色することが判明した。図６に示されるように、HPx（例えば、HPx1及び／又はHPx2）は培養１３日目にNENA誘導NKX6-1-GFP+集団のおよそ６０％を染色する。HPxはまた、NKX6-1-GFP-陰性細胞集団を染色する。非処理培養物において検出されたHPx+細胞はごく僅かであり、このことは、HPx染色がNKX6-1+前駆細胞の発生とよく相関していることを実証している。抗CD142抗体は、Kelly et al.らによって報告されるように（Kelly et al., 2011）、NKX6-1-GFP集団のかなりの部分を標識する（図６Ｃ）。しかしながら、これらの条件下ではわずかなNKX6-1+細胞しか検出されないという事実にもかかわらず、非誘導培養物も大きなCD142集団を含有する（図６Ｃ）。これらの知見は、CD142発現がNKX6-1+前駆細胞の発生とそれほど相関していないことを示す。HPx染色パターンは、それがNKX6-1+前駆細胞の発生をモニタリングし、かつ、細胞培養混合物からそれらを単離するための優れた試薬であることを示唆している。
実施例５：HPx抗体を使用してNKX6-1陽性細胞富化集団を精製することができる
HPx（例えば、HPx、HPx1、HPx2、Px、Px1及びPx2は互換可能に使用される：HPx1及びHPx2は同じ集団を認識し、HPx1とHPx2は互換可能に及び／又は共に使用できる）とCD142抗体とを比較する２つの実験を行った（図７）。
二種の抗体に対して陽性及び陰性の細胞をd14 NENA分化細胞から単離し、NKX6-1を最も高いレベルで発現する画分を決定した（図７Ａ及び図１０）。
これらの結果は、HPxを使用してNKX6-1陽性細胞を富化することができることを示唆している。CD142+及びPx2+画分は、選別前（PS）集団と比べてNKX6-1の発現レベルが二倍増大した。両方の抗体を使用してNKX6-1陽性細胞を富化することができるが、HPxは、より高い特異性を示し（図６Ｃを参照）、より高い細胞収率（HPxを使用すると、CD142と比べて、同じ時間枠内でおよそ三倍多くの細胞を単離することができる）を提供する。
二種の抗体（CD142及びHPx）を、d14 NENA分化細胞由来のPx2+及びCD142+細胞を選別するために組み合わせて使用し、以下の異なる画分においてNKX6-1の発現レベルを評価した：選別前（PS）、Px2-CD142-、Px2+CD142-、Px2+CD142+、Px2-CD142+選別集団（図７Ｂ）。Px2+CD142+二重陽性集団においてNKX6-1は最も高いレベルで発現されたが、PSに対する増大量（fold increase）は単一CD142+又は単一Px2+集団と同じであり、これは二重選別（double sorting）の利点がほとんどないことを示唆している。
図７は、１４日目のNENA分化H1（WA01）細胞から得られた選別前（PS）、Px2+、Px2-、CD142+、CD142-選別集団中のNKX6-1に関する定量PCR（QPCR）分析を示し、（Ｂ）は、１４日目のNENA分化H1（WA01）細胞から得られた選別前（PS）、Px2-CD142-、Px2+CD142-、Px2+CD142+、Px2-CD142+選別集団中のNKX6-1に関する定量PCR（QPCR）分析を示す。エラーバーは、平均の標準誤差を表す（Ａの場合はn=2であり、Ｂの場合はn=3である）。NKX6-1発現はハウスキーピング遺伝子TBP（TATA結合タンパク質）に対して正規化される。
実施例６：ｃペプチド + 細胞の成熟を促進することができる内皮細胞の生成
BMP4、bFGF、VEGFの組み合わせによる誘導によって、H1 hESC細胞系を用いてHES由来内皮細胞を生成した。６日目に、CD34+を選別し、50ng/mlのbFGF及び100ng/mlのVEGFを補充したEGM-2培地（Lonza）中で培養した。６日目のCD34+細胞の分析により、それらがKDR、CD31及びvWFを発現し、かつ、アセチル化LDLを取り込む能力を示すことが判明した（図８）。
任意の内皮集団、具体的には胚性幹細胞由来の内皮細胞を使用することができる。
実施例７：hESC由来内皮細胞及び膵臓前駆細胞の共培養がNKX6-1+前駆細胞のプールを増大し、それらのインスリン産生細胞への成熟を促進する
これらの研究に関して、NKX6-1-GFPレポーター細胞系から生成した培養１０日目のNENAEx誘導前駆細胞を凝集させ、凝集物をコンフルーエントなhESC由来CD34+内皮細胞上に播種した。これら培養物を５ng/mlのbFGF及び100ng/mlのVEGFを含むNENAEx含有培地中に更に７日間維持した。対照として、細胞を単層として保つか、又は、凝集物をコラーゲン被覆皿上にて内皮細胞不在下で培養した。図９Ａに示すように、内皮細胞上で培養した細胞は、単層として培養されたもの又はコラーゲン上の凝集物として培養されたものよりも高い割合でNKX6-1-GFP+細胞を維持した。インスリン産生細胞の存在に関して異なる集団の分析により、顕著な差異が明らかになった。内皮細胞と共培養させた凝集物のみが、かなりの数のｃペプチド+細胞を生成した。NKX6-1-GFP+細胞のおよそ３３％がｃペプチド+であった。これは、凝集物集団全体の１７％（５３％GFP細胞の33%）を表す。RT-qPCR分析は、フローサイトメトリー分析を裏付け、内皮細胞と共培養させた集団のみがインスリン及びグルカゴンメッセージの両方を発現したことを示した（図９Ｂ）。これらの知見は、hESC由来内皮細胞がNKX6-1+前駆細胞からのｃペプチド+細胞の成熟をサポートすることができることを実証している。ｃペプチド+細胞がNKX6-1-GFPを共発現するという事実は、それらが単一ホルモン性β細胞であることを強く示唆している。
実施例８
Figure 2015519048
*内胚葉細胞の成長をサポートするIMDM、RPMI、CMRL又はその他の培地などの基本培地をDMEMの代わりに使用することができる。基本培地は、抗生物質：ペニシリン／ストレプトマイシン（Life Technologies）を含有する。
**エキセンディン−４はNKX6-1の誘導には必要とされない。
内皮細胞との共培養によるインスリン+細胞の生成は、bFGF及びVEGF（R&D Systems）の添加によってサポートされる。
実施例９
後部前腸（ステージ３）集団のマーカー
ステージ３の内胚葉細胞は少なくともFOXA2を発現しなければならず、PDX1に対して陽性又は陰性であり得る（HNF1b、肝細胞核因子４、α（HNF4A）遺伝子ID：3172及びワンカットホメオボックス１（ONECUT1/HNF6）遺伝子ID:3175などの他の因子も発現し得る）。
膵臓前駆細胞（ステージ４）集団のマーカー
NKX6-1+膵臓前駆細胞に分化させた細胞は、NKX6-1を発現することに加えて、FOXA2、PDX1、SRY（性別決定領域Y）−ボックス９（SOX9）遺伝子ID:6662及び膵臓特異的転写因子１ａ（PTF1A）遺伝子ID:256297を発現する。
実施例１０：Noggin成分例
・Noggin
・BMPR1A
・BMPR1B
・ドルソモルフィン
・LDN 193189
・CHORDIN
・又は上記の組み合わせ。
実施例１１：EGF成分例
・EGF
・アンフィレグリン（AR）
・トランスフォーミング成長因子α（TGFa）
・ベタセルリン（BTC）
・ヘパリン結合EGF（HB-EGF）
・エピレグリン（EPR）
・ニューレグリン（NRG1、NRG2、NRG 3、NRG4）
又は上記の組み合わせ、及びMAPK又はPI3キナーゼ活性化因子などを含む下流シグナル分子に影響を与え得るEGF因子。
実施例１２：ニコチンアミド成分例
・ポリ（ADP−リボース）合成酵素阻害剤、例えばベンズアミド及び３−アミノベンズアミドなど（Otonkoski et al., 1993）
・Sir-2阻害剤、例えばサーチノール、M15、スプリトマイシンなど（Bitterman et al., 2002）
・他のHDAC阻害剤、例えばAN-9、CI-994、FK228、LAQ-824、MS275、SAHA、バルプロ酸、TSA、酪酸ナトリウムなど（Bitterman et al., 2002）
実施例１３
Figure 2015519048
実施例１４
HPSC由来膵臓前駆細胞（HPx1/2富化）及びそれらのβ細胞誘導体を使用して予測薬物毒性学及び創薬を行うことができた。
具体的には、本明細書に記載の培養条件を使用して生成したNKX6-1発現集団を使用して、１）増殖を促進すること、２）アポトーシスを誘発すること、３）NKX6-1発現細胞をβ様細胞及び他のホルモン産生細胞（ソマトスタチン、グルカゴン、膵臓ポリペプチド及びグレリン）、腺房又は導管細胞への分化を誘導可能な化合物を同定すること、ができる。HPX抗体の使用は、均質な集団を提供することによって化合物スクリーニングを促進し得る。更に、内皮細胞との共培養により生成したインスリン+細胞富化集団を使用して、増殖又はアポトーシスを誘発し得る化合物及びグルコース刺激インスリン分泌を向上し得る化合物を試験することができる。
実施例１５
１）インビトロで生成したNKX6-1陽性及び／又はインスリン陽性細胞の有効性及び機能性を試験するための、糖尿病動物モデルへの細胞移植。簡潔には、異なる免疫不全動物モデル（ここで、遺伝学的に又は薬物処理（ストレプトゾトシン処理）により糖尿病を誘導することができる）へ細胞を移植し、動物血清中のヒトＣペプチドレベル及び血中グルコース濃度を測定することによってヒトPSC由来膵臓細胞（NKC6-1陽性及び／又はインスリン陽性）の機能性を評価する。
２）細胞移植：ａ）前駆細胞集団と機能的β細胞との移植効果を比較し、ｂ）HPx1/2富化膵臓前駆細胞と、規定数の膵臓細胞及び他の細胞腫（内皮細胞及び線維芽細胞などを含む）からなる混合系統集団との移植効果を比較する。
実施例１６
NENAを使用して実施例１に記載したように膵臓前駆細胞を調製した。図１０に示すように、HPx1+細胞を、蛍光活性化細胞選別（FACS）を用いて単離し、HP´1+細胞及び選別前細胞（PS）と比べて高レベルのNKX6-1/TBP、SOX9/TBP及びPTF1a/TBP mRNAを発現する集団について富化する。
実施例１７
実施例１に記載した「NENA」処理を用いてNKX6-1+膵臓細胞を生成し、免疫無防備マウスに移植した。これらの細胞は、グルコースチャレンジに応答するヒトＣペプチド分泌によって示される（indicted）ように機能的インスリン産生細胞を生成する。H1(WA01)d13分化細胞を免疫無防備マウスへ移植してから６、１２及び１８週後に、グルコースチャレンジに応答するヒトＣペプチド分泌レベルをELISAによって測定した（図１１）。５回の移植（１、２、３、４及び５とする）＋対照細胞を使用する移植（「対照」とする）を行った。マウス１、２、４及び５の血清Ｃペプチドレベルは著しく上昇した。
現在好ましい実施例であると考えられるものを参照して本出願を説明してきたが、本出願は開示された実施例に限定されるものではないと理解すべきである。逆に、本出願は、添付の請求項の精神及び範囲に含まれる様々な修正及び等価の構成を包含するものと意図される。
全ての出版物、特許及び特許出願は、個々の出版物、特許及び特許出願の内容全体が参照により引用されると具体的かつ個別的に示されている場合と同程度に、それらの内容全体が参照により本明細書に引用される。具体的には、表などに記載された受入番号及び／又はバイオマーカー番号（タンパク質及び／又は核酸など）などを含む本明細書に記載された各受入番号と関連する配列もその全体が参照により引用される。
明細書中に言及される参考文献
Bitterman, K.J., Anderson, R.M., Cohen, H.Y., Latorre-Esteves, M. and Sinclair, D.A. 2002 Inhibition of Silencing and Accelerated Aging by Nicotinamide, a putative negative regulator of yest Sir2 and Human SIRT1. JBC 277(47): 45099
Dorrell, C., Abraham, S.L., Lanxon-Cookson, K.M., Canaday, P.S., Streeter, P.R., and Grompe, M. 2008. Isolation of major pancreatic cell types and long-term culture-initiating cells using novel human surface markers. Stem Cell Res 1(3): 183-194.
Jaramillo, M. and Banerjee, I. 2012. Endothelial Cell Co-culture Mediates Maturation of Human Embryonic Stem Cell to Pancreatic Insulin Producing Cells in a Directed Differentiation Approach. J Vis Exp(61).
Kelly, O.G., Chan, M.Y., Martinson, L.A., Kadoya, K., Ostertag, T.M., Ross, K.G., Richardson, M., Carpenter, M.K., D'Amour, K.A., Kroon, E., Moorman, M., Baetge, E.E., and Bang, A.G. 2011. Cell-surface markers for the isolation of pancreatic cell types derived from human embryonic stem cells. Nat Biotechnol 29(8): 750-756.
Lammert, E., Cleaver, O., and Melton, D. 2001. Induction of pancreatic differentiation by signals from blood vessels. Science 294(5542): 564-567.
Nostro, M.C., Sarangi, F., Ogawa, S., Holtzinger, A., Corneo, B., Li, X., Micallef, S.J., Park, I.H., Basford, C., Wheeler, M.B., Daley, G.Q., Elefanty, A.G., Stanley, E.G., and Keller, G. 2011. Stage-specific signaling through TGFbeta family members and WNT regulates patterning and pancreatic specification of human pluripotent stem cells. Development 138(5): 861-871.
Otonkoski, T., Beattie, G.M., Mally, M.I., Ricordi, C., and Hayek, A. 1993. Nicotinamide is a potent inducer of endocrine differentiation in cultured human fetal pancreatic cells. J Clin Invest 92(3): 1459-1466.
Sander, M., Sussel, L., Conners, J., Scheel, D., Kalamaras, J., Dela Cruz, F., Schwitzgebel, V., Hayes-Jordan, A., and German, M. 2000. Homeobox gene NKX6-1 lies downstream of Nkx2.2 in the major pathway of beta-cell formation in the pancreas. Development 127(24): 5533-5540.
Yoshitomi, H. and Zaret, K.S. 2004. Endothelial cell interactions initiate dorsal pancreas development by selectively inducing the transcription factor Ptf1a. Development 131(4): 807-817.

Claims (29)

  1. 内胚葉細胞集団からNKX6-1+膵臓前駆細胞を製造する方法であって、内胚葉細胞集団を、EGF成分、ニコチンアミド成分及び／又はNoggin成分、場合によっては少なくとも一種のEGF成分と少なくとも一種のニコチンアミド成分との組み合わせと接触させ、少なくとも一部の内胚葉細胞集団のNKX6-1+膵臓前駆細胞への分化を誘導することを含んでなり、前記組み合わせはさらに少なくとも一種のNoggin成分を含んでいてもよい、製造方法。
  2. Noggin成分が、
    Noggin及び／又はその活性複合体及び／又は断片；
    BMPR1A及び／又はその活性複合体及び／又は断片；
    BMPR1B及び／又はその活性複合体及び／又は断片；
    ドルソモルフィン（Dorsomorphin）及び／又はその塩又は溶媒和物；
    LDN 193189（DM-3189としても知られている）及び／又はその塩又は溶媒和物；
    CHORDIN及び／又はその活性複合体及び／又は断片；及び／又は
    これらの二種又はそれ以上のいずれかの組み合わせ
    の一種又はそれ以上を含んでなる、請求項１に記載の方法。
  3. Noggin成分がNogginである、請求項２に記載の方法。
  4. EGF成分が、
    EGF及び／又はその活性複合体及び／又は断片；
    アンフィレグリン(AR)及び／又はその活性複合体及び／又は断片；
    トランスフォーミング成長因子α（TGFa）及び／又はその活性複合体及び／又は断片；
    ベタセルリン（BTC）及び／又はその活性変異体及び／又は断片；
    エピレグリン（EPR）及び／又はその活性変異体及び／又は断片；
    ニューレグリン（例えば、NRG1、NRG2、NRG3、NRG4を含む）及び／又はその活性変異体及び／又は断片；及び／又は
    これらの二種又はそれ以上の組み合わせ
    を含んでなる、請求項１に記載の方法。
  5. EGF成分がEGF及び／又はその活性複合体及び／又は断片である、請求項４に記載の方法。
  6. EGF複合体がヘパリン結合EGF（HB-EGF）である、請求項５に記載の方法。
  7. ニコチンアミド成分が、
    ニコチンアミド（ナイアシンアミド及びニコチン酸アミドとしても知られている）、その塩、溶媒和物及び複合体；
    ベンズアミド及び／又は３−アミノベンズアミドなどのポリ（ADP−リボース）合成酵素阻害剤；
    サーチノール、M15、スプリトマイシンなどのSir-2阻害剤；
    AN-9、CI-994、FK228、LAQ-824、MS275、SAHA、バルプロ酸、TSA、酪酸ナトリウムなどのHDAC阻害剤；及び／又は
    これらの二種又はそれ以上の組み合わせ
    を含んでなる、請求項１に記載の方法。
  8. ニコチンアミド成分がニコチンアミド及び／又はその塩、溶媒和物及び／又は複合体である、請求項７に記載の方法。
  9. 少なくとも一種のNoggin成分、少なくとも一種のEGF成分及び少なくとも一種のニコチンアミド成分の組み合わせが、Noggin、EGF及びニコチンアミド（例えばNENA）を含んでなる、請求項１に記載の方法。
  10. エキセンディン−４成分を更に含んでなる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
  11. エキセンディン−４成分がエキセンディン−４である、請求項１０に記載の方法。
  12. 内胚葉細胞集団が、胚性幹細胞（ESC）又は人工多能性幹細胞（iPSC）などの多能性幹細胞（PSC）から分化させたものである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 多能性幹細胞がヒトESC（hESC）又はヒトiPSC（hiPSC）である、請求項１２に記載の方法。
  14. 内胚葉細胞集団を製造することを最初に含んでなる、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 内胚葉細胞集団を製造する方法が、工程（又は副工程）ａ、ｂ及びｃの一つ又はそれ以上と工程ｄとを含んでなる、請求項１４に記載の方法：
    ａ）多能性幹細胞集団を
    Ｉ）nodalアゴニスト（場合によってはActA）及びwntシグナリングアゴニスト（場合によってはWnt3a又はCIHR 99021）、
    ＩＩ）nodalアゴニスト（場合によってはActA）、FGFアゴニスト（場合によってはbFGF）及び場合によってはwntシグナリングアゴニスト（場合によってはWnt3a、CIHR99021）及び
    ＩＩＩ）nodalアゴニスト（場合によってはActA）及びFGFアゴニスト（場合によってはbFGF）
    の組み合わせと接触させ、ステージ１の分化細胞を製造する工程、
    ｂ）ステージ１の分化細胞を、FGFアゴニスト（場合によってはFGF10）及び場合によってはwntシグナリングアゴニスト（場合によってはWnt3a）及び／又はnoggin成分（場合によってはドルソモルフィン）と接触させ、ステージ２の分化細胞を製造する工程、
    ｃ）ステージ２の分化細胞を、Noggin成分（場合によってはNoggin）、レチノイン酸（RA）又はRA類似体、及び場合によってはシクロパミン−KAAD（Cyc）、FGFアゴニスト（場合によってはFGF10）、及び／又はエキセンディン−４成分（場合によってはエキセンディン−４）と接触させることにより、内胚葉細胞集団を提供する工程、及び
    ｄ）内胚葉細胞集団を、EGF成分、ニコチンアミド成分及び／又はNoggin成分、場合によっては少なくとも一種のEGF成分と少なくとも一種のニコチンアミド成分とを含んでなる組み合わせと、少なくとも一部の内胚葉細胞集団をNKX6-1+膵臓前駆細胞へ分化誘導するのに十分な量で接触させる工程。
  16. NKX6-1+インスリン産生細胞集団を生成する方法であって、
    ａ．請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法に従ってNKX6-1陽性膵臓前駆細胞集団を製造し、
    ｂ．前記細胞集団、又はNKX6-1富化若しくは単離集団を被検体内に導入すること、
    を含んでなる生成方法。
  17. インスリン産生細胞を生成する方法であって、
    ａ．NKX6-1陽性膵臓前駆細胞を含んでなる細胞集団を生成し、
    ｂ． NKX6-1陽性膵臓前駆細胞をCD34+内皮細胞と共培養すること
    を含んでなる生成方法。
  18. NKX6-1陽性膵臓前駆細胞を含んでなる細胞集団が、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法に従って製造される、請求項１７に記載の方法。
  19. NKX6-1陽性細胞集団を富化又は単離することを含んでなる、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. 富化又は単離工程が、細胞集団をHPxエピトープ検出抗体と接触させ、HPx1及び／又はHPx2結合細胞亜集団を単離又は部分的に精製することを含んでなる、請求項１９に記載の方法。
  21. 前記HPxエピトープ検出抗体がHPx1及び／又はHPx2である、請求項２０に記載の方法。
  22. 請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の方法に従って製造される富化及び／又は単離されたNKX6-1陽性細胞集団、及び／又は、前記細胞集団と好適な希釈剤とを含んでなる組成物。
  23. 少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％又は最大で約９５％のNKX6-1陽性細胞を含んでなる、請求項２２の富化されたNKX6-1陽性細胞集団。
  24. 少なくとも３０％、３５％、４０％又は少なくとも５０％のNKX6-1陽性膵臓前駆細胞を含んでなる、請求項２３の単離されたNKX6-1陽性細胞集団。
  25. 少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％又は最大で約９５％のNKX6-1陽性インスリン産生細胞を含んでなる、請求項２３の富化／単離されたNKX6-1陽性細胞集団。
  26. EGF成分、ニコチンアミド成分、及び場合によってはNoggin成分及び／又はエキセンディン−４成分を含んでなる培地補充組成物。
  27. 好適な基本培地、EGF成分、ニコチンアミド成分、及び場合によってはNoggin成分及び／又はエキセンディン−４成分を含んでなる培地培養組成物。
  28. EGF成分、
    ニコチンアミド成分、及び／又は
    Noggin成分、及び／又は
    場合によってはエキセンディン−４成分
    を含んでなるキット。
  29. 予測薬物毒性学、創薬、移植組織工学及び／又は疾患モデリングのための、請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の細胞集団の使用。
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