CN114634904B - 高纯度胰腺祖细胞的产生方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种高纯度胰腺祖细胞的产生方法，该方法关键在于通过高密度接种hPSCs准备分化板，使细胞的生长始终处于一种高度挤压的状态；同时采用Matrigel作为细胞外基质，并限定稀释倍数，使得胶的硬度在合适范围内；另外，采用梯度降低ActA浓度的方式高效产生定型内胚层。以上三个关键步骤的组合对于本方案成功实施缺一不可，在同时满足以上关键步骤的前提下产生的胰腺祖细胞，PDX1+NKX6.1+双阳性细胞效率稳定在90%以上。该方法不仅诱导效率高，且不同批次间稳定性好，不同hPSC间兼容性高；而且分化耗时短、成本低、操作简单。
Description
技术领域
本发明涉及干细胞生物学及再生医学领域，尤其是涉及一种胰腺祖细胞、其构建方法及其应用。
背景技术
糖尿病是一种以高血糖水平为特征的衰弱性疾病，预计到2045年，这种疾病的全球流行率将达到7亿成年人。1型和2型糖尿病（T1D、T2D）分别以自身免疫破坏和渐进性功能障碍为特征，最终患者体内胰岛β细胞耗竭，从而失去产生胰岛素的能力。目前，两种糖尿病的常规治疗方式均采用外源性胰岛素的注射。然而，由于无法确保在正常生理范围内严格保持葡萄糖水平，患者往往面临危及生命的低血糖症、高血糖症，以及心血管疾病、肾衰竭和神经病变等并发症，严重影响患者的生活质量。另一方面，与胰岛素疗法相比，尽管胰岛细胞移植可实现更好的血糖控制；但由于供体匮乏、价格高昂等因素，使得该技术难以广泛应用。基于近年来胚胎发育学与干细胞生物学的迅速发展，基于人多能干细胞（Humanpluripotent stem cells，hPSC）的体外定向分化技术有了长足的进步。使用hPSC作为种子细胞，在体外可源源不断地诱导分化为具备功能的细胞类型；因而一举克服了来源受限的难题，在转化医学领域应用前景巨大。目前，效率较高的胰腺祖细胞技术方法有：1）在分化第三阶段（后前肠）将细胞消化为单细胞，再以聚集体的形式继续分化（Cell aggregationoptimizes the differentiation of human ESCs and iPSCs into pancreatic bud-like progenitor cells, Stem Cell Research,2015,14(2):185-197；Controlledinduction of human pancreatic progenitors produces functional beta-like cellsin vitro, EMBO Journal,2015,34(13):1759-1772），这种方法虽然大幅提高了PDX1+NKX6.1+胰腺祖细胞的分化效率（>80%），但操作步骤繁琐，涉及到3D悬浮培养，成本高；2）分化第一阶段（定型内胚层诱导）结束后，将其消化为单细胞并重新接种，最后可获得纯度约80%的胰腺祖细胞（Enhanced differentiation of human pluripotent stem cells intopancreatic progenitors co-expressing PDX1 and NKX6.1, Stem Cell Research andTherapy,2018,9:15; Highly Efficient Differentiation of Human Pluripotent StemCells into Pancreatic Progenitors Co-expressing PDX1 and NKX6.1, Methods inMolecular Biology,2020），该方法虽全程采用2D分化，但中间要转板的步骤增加了操作难度，而增加了额外Matrigel的使用带来的成本增加。此外，这两种方法的诱导时间耗时较长，大于14天，而其他分化方案的诱导效率均在55%左右（Reversal of diabetes withinsulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells,Nature Biotechnology,2014,32:1121-1133; Generation of Functional HumanPancreatic β Cells In Vitro, Cell,2014,159(2):428-439）。另外，现有方法在不同批次间的稳定性也较差。因此，在hPSC向胰岛β细胞定向分化方面，诱导效率低与批次间稳定性差是阻碍应用的2个重要原因。
发明内容
有鉴于此，本发明旨在提出一种胰腺祖细胞、其构建方法及其应用，聚焦于β细胞定向分化技术流程的前半部分，提高“hPSC→胰岛祖细胞”定向分化技术中的诱导效率与稳定性。使用该方法，不仅诱导效率高，且不同批次间稳定性好，不同hPSC间兼容性高，另具备分化耗时短、成本低、操作简单的优势。
为达到上述目的，本发明的技术方案实现方式如下：
一种胰腺祖细胞的构建方法，该方法包括如下步骤：
S0：分化前，将人多能干细胞以0.2×106-1×106个细胞/cm2的密度接种于Matrigel包被的细胞培养板，Matrigel稀释倍数为70-100倍，达到分化要求后启动分化；
S1：使用浓度阶梯降低的ActA逐步诱导步骤S0得到的人多能干细胞分化形成定型内胚层；
S2：诱导定型内胚层分化为原始肠管；
S3：诱导原始肠管分化为后前肠；
S4：诱导后前肠分化为胰腺祖细胞。
进一步，步骤S1中分化天数至少2天，第1天ActA的浓度为150-110ng/ml，后续每一天的ActA浓度分别根据前一天使用浓度降低5-20ng/ml。
进一步，步骤S1中分化天数为3天，第1天至第3天依次使用120ng/ml rhActA、110ng/ml rhActA和100ng/ml rhActA进行诱导培养。
进一步，步骤S1中诱导培养基包括培养基A、培养基B和培养基C，培养基A、培养基B和培养基C均包括基础培养基和添加组分，培养基A中的添加组分为120ng/ml的rhActA、3μM的CHIR99021，培养基B中的添加组分为110ng/ml的rhActA，培养基C中的添加组分为100ng/ml的rhActA。
进一步，基础培养基为含有3-10mM Glucose、1-2g/L NaHCO3、体积占比为0.1-0.3%的BSA-不含脂肪酸和体积占比为1%的GlutaMax的MCDB131培养基。
进一步，步骤S0在进行细胞接种之前，先将人多能干细胞制成单细胞悬液，且单细胞悬液中添加有ROCK抑制剂。
进一步，步骤S2在含有rhFGF7的培养基中诱导培养2-3天，步骤S3在含有rhFGF7、RA、SANT1、Decursin和ML347的培养基中诱导培养2-3天，步骤S4在含有rhEGF、NIC、SANT1、Decursin和ML347培养基中诱导培养3-4天。
本发明还提供了一种由上述任一项所述的方法构建的胰腺祖细胞。
本发明还提供了一种如上述所述的胰腺祖细胞在诱导产生胰岛β细胞上的应用。
本发明还提供了一种用于上述方法的试剂盒，包括：
步骤S1使用的阶梯浓度的ActA；
步骤S2使用的rhFGF7；
步骤S3使用的rhFGF7、RA、SANT1、Decursin和ML347；
步骤S4使用的rhEGF、NIC、SANT1、Decursin和ML347。
相对于现有技术，本发明所述的具有以下优势：
本发明所述的胰腺祖细胞的构建方法是一种完全基于2D培养胰腺祖细胞定向分化方法，不仅诱导效率高，大于90%，且不同批次间稳定性好，不同hPSC间兼容性高，短诱导周期，仅需10天即可获得高纯度胰腺祖细胞；无血清诱导体系，成分明确可控；全2D操作系统成本低，操作简单。
附图说明
构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1为胰腺祖细胞的诱导分化阶段示意图；
图2为hPSC的多能性免疫荧光鉴定结果图；（a）为DAPI染色结果，用以表征细胞核；（b）为OCT4染色结果，（c）为Nanog染色结果，（d）为DAPI+OCT4+Nanog染色结果堆叠；
图3为第0天（D0或Day 0）分化起始前明场图；
图4为S1阶段第3天（D3或Day 3）形成的定型内胚层明场图；
图5为S2阶段第5天（D5或Day 5）形成的原始肠管明场图；
图6为S3阶段第7天（D7或Day 7）形成的后前肠明场图；
图7为S4阶段第10天（D10或Day 10）形成的胰腺祖细胞明场图；
图8为S4阶段第10天（D10或Day 10）免疫荧光鉴定结果图；（a）为DAPI染色结果，用以表征细胞核；（b）为PDX1+染色结果，（c）为NKX6.1+染色结果，（d）为DAPI+PDX1++NKX6.1+染色结果堆叠；
图9为S4阶段第10天（D10或Day 10）流式鉴定结果图；
图10为细胞株Ⅰ分别在S1阶段、S2阶段、S3阶段和S4阶段的分化图及免疫荧光鉴定结果图；（a）为S1阶段分化图，（b）为S2阶段分化图，（c）为S3阶段分化图，（d）为S4阶段分化图，（e）为免疫荧光鉴定结果图；
图11为细胞株Ⅱ分别在S1阶段、S2阶段、S3阶段和S4阶段的分化图及免疫荧光鉴定结果图；（a）为S1阶段分化图，（b）为S2阶段分化图，（c）为S3阶段分化图，（d）为S4阶段分化图，（e）为免疫荧光鉴定结果图；
图12为细胞株Ⅲ分别在S1阶段、S2阶段、S3阶段和S4阶段的分化图及免疫荧光鉴定结果图；（a）为S1阶段分化图，（b）为S2阶段分化图，（c）为S3阶段分化图，（d）为S4阶段分化图，（e）为免疫荧光鉴定结果图；
图13为细胞株Ⅰ、细胞株Ⅱ、细胞株Ⅲ和细胞株Ⅳ表达PDX1+NKX6.1+的细胞占比图；细胞株Ⅳ即本实施例使用的细胞株；
图14为对比例1低密度组第10天（D10或Day 10）流式鉴定结果图；
图15为对比例1低密度组第10天（D10或Day 10）免疫荧光结果图；（a）为DAPI染色结果，用以表征细胞核；（b）为PDX1+染色结果，（c）为NKX6.1+染色结果，（d）为DAPI+PDX1++NKX6.1+染色结果堆叠；
图16为对比例2与第0天（D0或Day 0）、本实施例在S1阶段诱导效率；（a）为标志物FOXA2的表达，（b）为标志物SOX17的表达；
图17为对比例3取自不同细胞株的细胞采用不同浓度Matrigel包被后表达PDX1+NKX6.1+的细胞占比图。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
定形内胚层：指胚胎发育早期肝脏、小肠、大肠等内脏器官主要组成细胞的原始发育位点。
后肠管衍生物（或肠管前部衍生物）：肠管（gut tube）指胚胎发育早期由定形内胚层发育而来的条形组织。
下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
然而，以下实施例仅用于说明本发明，本发明的内容不限于此。
实施例中用到的相关试剂示于表1和表2，使用的相关抗体示于表3。
分化前，从多能性标志物阳性率检验hPSC的质量，以确保后续分化的成功率与高效率。
如图2免疫荧光鉴定结果所示，（a）图为DAPI染色结果，用以表征细胞核；（b）图为OCT4染色结果，（c）图为Nanog染色结果，（d）图为DAPI+OCT4+Nanog染色结果堆叠，用以判断正确表达模式下的双阳性率（由于OCT4定位于细胞核，因此双阳性的判断还要看是否在细胞核上）。多能性标志物OCT4与Nanog在表达模式正确的前提下，双阳性率＞98%；表明hPSC具备良好的分化潜能。
本方法的关键在于：1）通过高密度接种hPSCs准备分化板，使细胞的生长始终处于一种高度挤压的状态，这对本方法最终的成功至关重要；2）同时本方法采用Matrigel作为细胞外基质，稀释倍数限制在70-100倍，使得胶的硬度在合适范围内；3）另外，ActA的浓度对第一阶段定型内胚层的形成至关重要，本方法采用梯度降低ActA浓度的方式高效产生定型内胚层。在同时满足以上关键步骤的前提下产生的胰腺祖细胞，PDX1+NKX6.1+双阳性细胞效率稳定在90%以上，以上三个关键步骤的组合对于本方案成功实施缺一不可。
图1为胰腺祖细胞的诱导分化阶段示意图，具体分化方法包括如下步骤：
本方法整体分为4个阶段，历时10天。
S0：待hPSCs汇合度达80%～90%后，使用TrypLE酶消散为单细胞悬液，离心后重悬于补充有10μM Y-27632的mTeSR1培养基，并以0.5×106个细胞/cm2的密度接种于Matrigel包被的细胞培养板，Matrigel稀释倍数限制在70倍，24小时后汇合度达90%～100%启动分化，如图3所示。
S1：诱导hPSC分化定形内胚层（Day 1-3）
该阶段基础培养基如下：MCDB131培养基补充5mM Glucose、1.2g/L NaHCO3、体积占比为0.1% BSA（不含脂肪酸）以及体积占比为1% GlutaMax。
Day 1:将上述人多能干细胞在培养基A中培养1天，培养基A包括上述基础培养基及添加组分，添加组分包括：120ng/ml rhActA、3μM CHIR99021；
Day 2:之后将上述细胞转移至培养基B中继续培养1天，培养基B包括上述基础培养基及添加组分，添加组分包括：110ng/ml rhActA；
Day 3:之后将上述细胞转移至培养基C中继续培养1天，培养基C包括上述基础培养基及添加组分，添加组分包括：100ng/ml rhActA。
S2：诱导定型内胚层分化为原始肠管（Day 4-5）
将S1分化成功的细胞继续在培养基D中培养2天，培养基D包括基础培养基及添加组分，基础培养基为MCDB131培养基补充5mM Glucose、1.2g/L NaHCO3、体积占比为0.1%BSA（不含脂肪酸）、体积占比为1% GlutaMax以及0.25 mM Vc，添加组分包括：50ng/mlrhFGF7。
在培养期间，每24h更换新的分化培养基。
S3：诱导原始肠管分化为后前肠（Day 6-7）
将上述细胞继续在培养基E中培养2天，培养基E包括基础培养基及添加组分，基础培养基为MCDB131培养基补充3mM Glucose、2g/L NaHCO3、体积占比为2% BSA（不含脂肪酸）、体积占比为1% GlutaMax、体积占比为1% P/S以及0.25mM Vc，添加组分包括：50ng/mlrhFGF7、2μM RA、0.25μM SANT1、20μM Decursin、25μM ML347。
在培养期间，每24h更换新的分化培养基。
S4：诱导后前肠分化为胰腺祖细胞（Day 8-10）
该阶段培养基F包括基础培养基及添加组分，基础培养基在阶段S3的基础上加体积占比为1%的B27，添加组分包括：100ng/ml rhEGF、10mM NIC、0.25μM SANT1、20μMDecursin、25μM ML347。
在培养期间，每24h更换新的分化培养基。
在本实施例方案提供的S0阶段准备分化板和S1阶段诱导定型内胚层的基础下，将第S1、S2阶段的BSA更换为等量血清可获得相近的效果，但引入了血清中的不明成分。
在本实施例方案提供的S0阶段准备分化板和S1阶段诱导定型内胚层的基础下，适当调整各阶段的天数可获得相近的结果，比如，S1阶段加减一天，S2、S3、S4阶段加一天，尽管稳定性不如本方案好。
本实施例中S1阶段ActA在第一天的浓度范围锁定在150-110ng/ml，之后第2、3天的浓度范围使用浓度依次降低5-20ng/ml，为梯度降低。浓度可以不等间距变化，但是要比前一天至少低5ng/ml，否则细胞由于ActA浓度持续处于高水平而生长速度缓慢，最终达不到胰腺祖细胞诱导的必要条件：细胞持续处于高度挤压状态。若是降的太多，大于20ng/ml，定型内胚层的诱导效率降低。
对比例1
将hPSC以0.8×105个细胞/cm2的密度进行接种，设定为低密度组，其他条件与本实施例相同，当其汇合度达90%～100%启动分化。
对比例2
在上述实施例的基础上，第一阶段3天分化使用的rhActA浓度始终保持100ng/ml。
对比例3
为了证明该方法的兼容性，另取与本实施例所用细胞株不同株的3个细胞株，即细胞株1、细胞株2、细胞株3，而本实施例的细胞是从细胞株4中挑取的，细胞株1、细胞株2、细胞株3和细胞株4均购自北京塞贝生物技术有限公司。
从细胞株1、细胞株2和细胞株3中分别挑取细胞，并标记为细胞株Ⅰ、细胞株Ⅱ、细胞株Ⅲ，重复上述诱导分化过程。本实施例从细胞株4中挑取的细胞标记为细胞株Ⅳ。
对比例4
在上述实施例的基础上，改变Matrigel的包被浓度，稀释倍数分别为50、70、100、110。分别从上述的细胞株1、细胞株2、细胞株3和细胞株4中各挑取4份细胞，并将这些细胞分别对应标记为细胞株Ⅴ、细胞株Ⅵ、细胞株Ⅶ和细胞株Ⅷ；将这些细胞分为4个组，每一组中均包含细胞株Ⅴ、细胞株Ⅵ、细胞株Ⅶ和细胞株Ⅷ，之后分别对这4个组采用不同稀释倍数的Matrigel进行包被，稀释倍数依次为50、70、100、110。
结果分析：
1、S1阶段完成，即3天后细胞群呈现内胚层典型特点，并且由于细胞密度不断增大，第3天出现隆起，如图4。S2阶段完成，即第5天，此时细胞出现典型的条状隆起，如图5。继续加入S3阶段分化培养基，此阶段结束后，即第7天，细胞又恢复平滑的单层，如图6所示。更换为S4阶段培养基，直到该阶段结束，即第10天，细胞始终维持平滑的单层生长状态，如图7所示。
2、图8为第10天得到的胰腺祖细胞的免疫荧光鉴定结果，其中，（a）图为DAPI染色结果，用以表征细胞核；（b）图为PDX1+染色结果，图（c）为NKX6.1+染色结果，图（d）为DAPI+PDX1++NKX6.1+染色结果堆叠，结果证明PDX1+NKX6.1+双阳细胞的效率在S4阶段结束后达90%以上。图9为流式鉴定结果，也可以看出PDX1+NKX6.1+双阳细胞的效率达90%以上。
3、如图10-图12所示，图10为细胞株Ⅰ分别在S1阶段、S2阶段、S3阶段和S4阶段的分化图，图10中（e）图为其免疫荧光鉴定结果图；图11为细胞株Ⅱ分别在S1阶段、S2阶段、S3阶段和S4阶段的分化图，图11中（e）图为其免疫荧光鉴定结果图；图12为细胞株Ⅲ分别在S1阶段、S2阶段、S3阶段和S4阶段的分化图，图12中（e）图为其免疫荧光鉴定结果图。
图13为分别从细胞株1、细胞株2、细胞株3和细胞株4中挑取的细胞（即细胞株Ⅰ、细胞株Ⅱ、细胞株Ⅲ和细胞株Ⅳ）并按照上述实施例的方法进行诱导培养后所表达PDX1+NKX6.1+的细胞占比图。
从图10-图13中可以发现，本方法在不同细胞株上获得了高度一致的结果，说明该方法在不同hPSC间兼容性高，不同批次间稳定性好。
4、在进行细胞培养时，细胞接种数对细胞的生长有直接影响，适宜的接种密度可以促使细胞更好的增殖，接种密度太高或太低都不利于细胞的生长增殖，细胞正常的接种密度为0.5×105-0.8×105个细胞/cm2。对比例1采用的接种密度是常规的密度，图14为对比例1低密度组第10天（D10）流式鉴定结果图，可以发现按照常规密度接种的对比例1得到的胰腺祖细胞的PDX1+NKX6.1+双阳细胞的比例大幅下降至57%。图15免疫荧光结果图也可以看出PDX1+NKX6.1+双阳细胞明显变少。
5、通过对比例2的比较结果图16中可以看出，S1阶段不采用梯度浓度，S1阶段定型内胚层的诱导效率大幅降低，说明梯度浓度培养方式对定型内胚层的诱导效率至关重要。
6、Matrigel在使用时一般需要进行稀释，常规稀释倍数在30-50倍。图17为4组细胞分别在稀释倍数为50、70、100、110的Matrigel包被下培养后的结果，从图17中可以看出，当Matrigel的稀释倍数若在70～100倍之外，该方案的兼容性明显变差，分化效率也低下。
通过对比例的比较可以发现，高密度接种、限制Matrigel包被浓度以及梯度降低ActA浓度诱导定型内胚层的组合方法产生胰腺祖细胞的效率更高，批间差异更少，而改变其中任何一个条件均达不到本发明所强调的优点，即高效率、高兼容性、低耗时。
本发明所述的胰腺祖细胞的构建方法具有以下优点：1、高分化效率，诱导效率稳定在90%以上；2、高兼容性，适用于多种hPSC的诱导，不同批次间稳定性好；3、短诱导周期，仅需10天即可获得高纯度胰腺祖细胞；4、无血清诱导体系，成分明确可控；5、全2D（二维）分化系统，操作简便。
表1 试剂列表
| 试剂名称 | 公司（货号） |
| mTeSR1 | STEMCELL (85850) |
| MCDB131 | Gibco (10372019) |
| GlutaMAX Supplement | Gibco (35050061) |
| B27 | Gibco (17504044) |
| Y-27632 | R&D (1254) |
| CHIR99021 | R&D (4423) |
| rhActA | R&D (338-AC) |
| rhFGF7 | R&D (251-KG) |
| rhEGF | R&D (236-EG) |
| Matrigel（GFR） | Corning (356230) |
| TrypLE™ Express 酶 (1X)，无酚红 | Gibco (12604021) |
| Glucose | Sigma (D9434) |
| NaHCO<sub>3</sub> | Sigma (S5761) |
| BSA | Proliant (68700) |
| Vc | Tocris (4055) |
| P/S | Gibco (10378016) |
| RA | Tocris (0695) |
| SANT1 | Tocris(1974) |
| Decursin | MCE (HY-18981 ) |
| ML347 | Tocris (4945) |
| NIC | Tocris (4106) |
| hPSC | Wisconsin Cell Research Institute (ES01) |
表2 试剂对应名称
表3 抗体列表
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种胰腺祖细胞的构建方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：
S0：分化前，将人多能干细胞以0.2×106-1×106个细胞/cm2的密度接种于Matrigel包被的细胞培养板，Matrigel稀释倍数为70-100倍，达到分化要求后启动分化；
S1：使用浓度阶梯降低的ActA逐步诱导步骤S0得到的人多能干细胞分化形成定型内胚层；
S2：诱导定型内胚层分化为原始肠管；
S3：诱导原始肠管分化为后前肠；
S4：诱导后前肠分化为胰腺祖细胞；
步骤S1中分化天数至少2天，第1天ActA的浓度为150-110ng/ml，后续每一天的ActA浓度分别根据前一天使用浓度降低5-20ng/ml。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤S1中分化天数为3天，第1天至第3天依次使用120ng/ml rhActA、110ng/ml rhActA和100ng/ml rhActA进行诱导培养。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤S1中诱导培养基包括培养基A、培养基B和培养基C，培养基A、培养基B和培养基C均包括基础培养基和添加组分，培养基A中的添加组分为120ng/ml的rhActA、3μM的CHIR99021，培养基B中的添加组分为110ng/ml的rhActA，培养基C中的添加组分为100ng/ml的rhActA；基础培养基为含有3-10mM Glucose、1-2g/LNaHCO3、体积占比为0.1-0.3%的BSA-不含脂肪酸和体积占比为1%的GlutaMax的MCDB131培养基。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤S0在进行细胞接种之前，先将人多能干细胞制成单细胞悬液，且单细胞悬液中添加有ROCK抑制剂。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤S2在含有rhFGF7的培养基中诱导培养2-3天，步骤S3在含有rhFGF7、RA、SANT1、Decursin和ML347的培养基中诱导培养2-3天，步骤S4在含有rhEGF、NIC、SANT1、Decursin和ML347培养基中诱导培养3-4天。
6.一种用于权利要求1-5任一项所述的方法的试剂盒，其特征在于：包括：
步骤S1使用的阶梯浓度的ActA；
步骤S2使用的rhFGF7；
步骤S3使用的rhFGF7、RA、SANT1、Decursin和ML347；
步骤S4使用的rhEGF、NIC、SANT1、Decursin和ML347。
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