CN114829582A - 类器官的制造方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种类器官的制造方法，包括：在含有包含成纤维细胞生长因子(FGF)1的部分区域和FGF2的部分区域的嵌合FGF的培养基中培养成体干细胞或包含成体干细胞的细胞组织片的工序；还提供一种通过上述制造方法而制造的类器官；还提供一种包含嵌合FGF且嵌合FGF的含量为50ng/mL以下的培养基；还提供一种受试物质的评价方法；利用嵌合FGF，能够减少培养基中所含的生长因子的含量。

Description

类器官的制造方法
技术领域
本发明涉及类器官的制造方法。更详细而言，本发明涉及类器官的制造方法、培养基、类器官、受试物质的评价方法和嵌合FGF。本申请基于2019年12月16日在日本提出申请的特愿2019-226710号而要求优先权，在此引用其内容。
背景技术
类器官是指细胞堆积而形成的培养细胞，具有与生物体内的脏器类似的结构和功能。近年来，正进行由体干细胞、胚胎干细胞(ES细胞)、人工多能干细胞(iPS细胞)等干细胞制作各种各样的类器官的研究，例如制作了脑类器官、肠类器官、肝脏类器官、肾脏类器官、胃类器官、肺类器官、卵巢癌类器官、胆道癌类器官等。
由干细胞的类器官的制造通过控制信号转导通路，诱导干细胞的增殖、分化等而进行。已知MAPK信号转导通路是控制干细胞的增殖、生长、分化和转化、以及细胞凋亡等的信号转导通路。另外，已知MAPK信号转导通路受碱性成纤维细胞增殖因子(成纤维细胞生长因子2、FGF2)、上皮生长因子(表皮生长因子、EGF)等生长因子下调。这些生长因子是通常添加于由干细胞制造类器官的培养基中的成分(参照专利文献1、非专利文献1)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:欧洲专利申请公开第3460042号说明书
非专利文献
非专利文献1:Huch M.,et al.,Long-term culture of genome-stablebipotent stem cells from adult human liver,Cell,160(1-2),299-312,2015.
发明内容
然而，由干细胞制造类器官时，由于培养基成分失活，因此，在细胞的培养中需要定期更换培养基。特别是，在将类器官用于再生医疗、药剂筛选等的情况下，需要足够大小的类器官，与此同时，培养基的更换次数也变多。另一方面，FGF2、EGF等生长因子的成本非常高，另外，有含有内毒素等的风险。因此，期望减少添加在培养基中的生长因子的量。因此，本发明的目的在于提供能够减少培养基中所含的生长因子的含量的类器官的制造技术。
本发明包含以下的实施方式。
[1]一种类器官的制造方法，包括：将成体干细胞或包含成体干细胞的细胞组织片在培养基中进行培养的工序，该培养基含有包含成纤维细胞生长因子(FGF)1的部分区域和FGF2的部分区域的嵌合FGF。
[2]根据[1]所述的制造方法，其中，上述培养基中所含的上述嵌合FGF的含量为50ng/mL以下。
[3]根据[1]或[2]所述的制造方法，其中，上述培养基进一步含有表皮生长因子(EGF)。
[4]根据[3]所述的制造方法，其中，上述培养基中所含的上述嵌合FGF和上述EGF的合计的含量为100ng/mL以下。
[5]根据[1]～[4]中任一项所述的制造方法，其中，上述嵌合FGF为由序列号1～序列号4中的任一个所述的氨基酸序列构成的蛋白质，或者为由序列号1～序列号4中的任一个所述的氨基酸序列中缺失、取代或加成有1个或多个氨基酸的氨基酸序列构成，且具有能够通过在培养基中含有50ng/mL以下而由成体干细胞或包含成体干细胞的细胞组织片制造类器官的活性的蛋白质。
[6]根据[1]～[5]中任一项所述的制造方法，其中，上述培养基进一步含有胰岛素样生长因子(IGF)信号转导通路增强剂。
[7]根据[1]～[6]中任一项所述的制造方法，其中，上述培养基进一步含有转化生长因子-β(TGF-β)信号转导通路抑制剂。
[8]根据[1]～[7]中任一项所述的制造方法，其中，上述培养基进一步含有Wnt信号转导通路增强剂。
[9]根据[1]～[8]中任一项所述的制造方法，其中，上述培养基进一步含有Rho激酶(ROCK)信号转导通路抑制剂。
[10]根据[1]～[9]中任一项所述的制造方法，其中，上述培养基进一步含有骨形态发生蛋白(BMP)信号转导通路抑制剂。
[11]一种培养基，包含嵌合FGF，上述嵌合FGF的含量为50ng/mL以下。
[12]根据权利要求11所述的培养基，其中，进一步包含EGF，上述嵌合FGF和上述EGF的合计的含量为100ng/mL以下。
[13]一种类器官，是通过[1]～[10]中任一项所述的方法而制造的。
[14]一种受试物质的评价方法，包括：使[13]所述的类器官与受试物质接触的工序，以及评价上述受试物质对上述类器官造成的影响的工序。
[15]一种嵌合FGF，是由序列号1～序列号4中的任一个所述的氨基酸序列构成的蛋白质，或者是由序列号1～序列号4中的任一个所述的氨基酸序列中缺失、取代或加成有1个或多个氨基酸的氨基酸序列构成，且具有能够通过在培养基中含有50ng/mL以下而由成体干细胞或包含成体干细胞的细胞组织片制造类器官的活性的蛋白质。
根据本实施方式，可以提供能够减少培养基中所含的生长因子的含量的类器官的制造技术。
附图说明
图1(a)～(d)为实验例1中形成的类器官的显微镜照片。
图2(a)～(d)为实验例1中形成的类器官的显微镜照片。
图3(a)～(d)为实验例3中形成的类器官的显微镜照片。
图4(a)～(d)为实验例3中形成的类器官的显微镜照片。
图5(a)～(d)为实验例3中形成的类器官的显微镜照片。
图6(a)～(d)为实验例3中形成的类器官的显微镜照片。
图7为表示实验例4中测定的FGFC变异体的熔解温度(Tm)的图表。
具体实施方式
以下，示出实施方式对本发明进行进一步的详细说明，但本发明不受以下的实施方式任何限定。
本说明书中例示的各成分、例如培养基中所含的成分、各工序中使用的成分只要没有特别说明，则可以分别单独使用1种或者并用2种以上。
在本说明书中，“A～B”等表示数值范围的表述与“A以上且B以下”含义相同，该数值范围包含A和B。
本说明书中，“包含物质X的培养基”、“在物质X的存在下”是指添加了外源性(exogenous)的物质X的培养基、包含外源性的物质X的培养基或在外源性的物质X的存在下。即，该培养基中存在的细胞或组织内源性(endogenous)地表达、分泌或产生该物质X时，将内源性的物质X与外源性的物质X相区别，即便不含外源性的物质X的培养基包含内源性的物质X，也不属于“包含物质X的培养基”的范畴。
[类器官的制造方法]
1个实施方式是一种类器官的制造方法，包括：将成体干细胞或包含成体干细胞的细胞组织片在含有包含成纤维细胞生长因子(FGF)1的部分区域和FGF2的部分区域的嵌合FGF(以下也称为“FGFC”)的培养基中进行培养的工序。
通过本实施方式的制造方法，能够减少在类器官的制造中添加在培养基中的生长因子的含量。本实施方式的制造方法特别适于肠类器官、肝类器官、卵巢癌类器官、肺类器官、胃类器官等类器官的制造。
类器官的制造中，作为能够通过在培养基中含有嵌合FGF而减少培养基中所含的生长因子的含量的理由，推测如下。即，已知与FGF反应的成纤维细胞增殖因子受体(FGFR)已确定，包括亚型在内有7种。通过将FGF嵌合化，能够与多种FGFR反应，其结果，推测即便是低浓度也能够进行培养。特别是，成体干细胞的培养中重要的上皮系干细胞中，一般认为FGFR2b表达良好，但FGF2与FGFR2b的反应性不好。另一方面，已知FGF1能够与包含FGFR2b的所有7种FGFR反应，同时兼具FGF2和FGF1的性质的FGFC能够与FGFR2b反应，其结果，推测即便是低浓度也能够进行培养。
成体干细胞是被称为体干细胞、组织干细胞、癌干细胞的干细胞，是存在于生物体的体内的未最终分化的细胞。通常，成体干细胞具有分化为特定的多种细胞的能力。本实施方式的制造方法中，成体干细胞可以为经培养维持的细胞，也可以为存在于从成体摘出的组织的原代细胞。另外，作为成体干细胞，优选上皮干细胞。
本说明书中，将细胞凝集而成的结构称为细胞块。另外，在细胞块中，特别是将包含从成体干细胞和成体干细胞分化的细胞且具有与生物体内的脏器类似的结构和功能的细胞块称为类器官。
本实施方式的制造方法中，作为培养基，可以使用在基础培养基中添加了嵌合FGF的培养基。作为基础培养基，例如可举出BME培养基、BGJb培养基、CMRL 1066培养基、Glasgow MEM(GMEM)培养基、Improved MEM Zinc Option培养基、IMDM培养基、Medium 199培养基、Eagle MEM培养基、αMEM培养基、DMEM培养基、F-12培养基、DMEM/F12培养基、IMDM/F12培养基、Ham’s培养基、RPMI 1640培养基、Fischer’s培养基。作为基础培养基，也可以使用将这些培养基混合而成的培养基。
本实施方式的制造方法中的嵌合FGF是包含FGF1的部分区域和FGF2的部分区域的融合蛋白质。作为人FGF1蛋白质的NCBI登录号，可举出NP＿001244138.1、NP＿001244137.1、NP＿001341881.1等。作为小鼠FGF1蛋白质的NCBI登录号，可举出NP＿034327.1等。作为人FGF2蛋白质的NCBI登录号，可举出NP＿001348594.1、NP＿001997.5等。作为小鼠FGF2蛋白质的NCBI登录号，可举出NP＿032032.1等。
作为嵌合FGF，优选为由序列号1～序列号4中的任一个所述的氨基酸序列构成的蛋白质。嵌合FGF只要具有能够通过在培养基中含有50ng/mL以下而由成体干细胞或包含成体干细胞的细胞组织片制造类器官的活性，就可以相对于由序列号1～序列号4中的任一个所述的氨基酸序列构成的蛋白质具有变异。
即，嵌合FGF也可以为由序列号1～序列号4中的任一个所述的氨基酸序列中缺失、取代或加成有1个或多个氨基酸的氨基酸序列构成的蛋白质。在此，1个或多个是指1～10个，优选为1～5个，更优选为1～3个，进一步优选为1～2个。
嵌合FGF的氨基酸序列中，与序列号1的氨基酸序列中的第43位氨基酸对应的氨基酸优选为谷氨酰胺、缬氨酸、异亮氨酸或亮氨酸。
与序列号1的氨基酸序列中的第43位氨基酸对应的氨基酸为谷氨酰胺、缬氨酸、异亮氨酸或亮氨酸的嵌合FGF与FGF1、FGF2相比，具有高耐热性，是稳定的。
其中，与序列号1的氨基酸序列中的第43位氨基酸对应的氨基酸为异亮氨酸的嵌合FGF具有特别高的熔解温度(Tm)，具有高耐热性。
与序列号1的氨基酸序列中的第43位氨基酸对应的氨基酸例如可以通过使用ClustalW等比对程序将对象氨基酸序列与序列号1的氨基酸序列进行比对等来确定。
以往，在类器官的制造中，通常在培养基中添加100ng/mL左右的FGF2。与此相对，通过使用嵌合FGF代替FGF2，能够减少培养基中所含的上述嵌合FGF的含量。培养基中所含的上述嵌合FGF的含量通常为50ng/mL以下，优选为20ng/mL以下，更优选为15ng/mL以下，进一步优选为10ng/mL以下，特别优选为5ng/mL以下。
本实施方式的制造方法中，培养基可以进一步含有表皮生长因子(EGF)。在培养基包含EGF的情况下，能够减少培养基中所含的嵌合FGF和EGF的合计的含量。在培养基包含EGF的情况下，作为培养基中所含的嵌合FGF和EGF的合计的含量，通常为100ng/mL以下，优选为70ng/mL以下。
人EGF蛋白质的NCBI登录号为NP＿001171601.1等。
本实施方式的制造方法中，培养基优选进一步含有Wnt信号转导通路增强剂。
作为Wnt信号转导通路增强剂，可举出Wnt家族成员、R-spondin、Norrin、GSK-3β抑制剂等。这些之中，优选为Wnt家族成员、R-spondin。
作为Wnt家族成员，可举出Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt9a、Wnt9b、Wnt10a、Wnt10b、Wnt11和Wnt16等。
作为Wnt家族成员，优选为Wnt3a或Wnt4，更优选为Wnt3a。为了提高稳定性，Wnt3a优选为与阿法明(Afamin)的复合体。
在使用Wnt3a作为Wnt信号转导通路增强剂的情况下，培养基中所含的Wnt3a的浓度通常为10ng/mL～10μg/mL，优选为10ng/mL～1μg/mL、例如为100ng/mL～700ng/mL。
作为R-spondin，可举出R-spondin 1、R-spondin 2、R-spondin 3、R-spondin 4等。
作为人R-spondin 1蛋白质的NCBI登录号，可举出NP＿001229838.1、XP＿006710646.1等。作为小鼠R-spondin 1蛋白质的NCBI登录号，可举出NP＿619624.2等。作为人R-spondin 2蛋白质的NCBI登录号，可举出XP＿011515320.1、XP＿011515321.1、NP＿848660.3等。作为小鼠R-spondin 2蛋白质的NCBI登录号，可举出NP＿766403.1等。作为人R-spondin 3蛋白质的NCBI登录号，可举出XP＿016866867.1、XP＿016866868.1、NP＿116173.2等。作为小鼠R-spondin 3蛋白质的NCBI登录号，可举出NP＿082627.3等。作为人R-spondin 4蛋白质的NCBI登录号，可举出NP＿001035096.1、NP＿001025042.2等。作为小鼠R-spondin4蛋白质的NCBI登录号，可举出NP＿001035779.1等。
在使用R-spondin作为Wnt信号转导通路增强剂的情况下，培养基中所含的R-spondin的浓度通常为10ng/mL～10μg/mL，优选为10ng/mL～1μg/mL，更优选为100ng/mL～500ng/mL。
作为GSK-3β抑制剂，可举出CHIR99021(CAS号：252917-06-9)、肯帕罗酮(Kenpaullone)(CAS号：142273-20-9)、以及6-溴靛玉红-3’-肟(6-Bromoindirubin-3’-oxime)(BIO，CAS号：667463-62-9)等。
在使用GSK-3β抑制剂作为Wnt信号转导通路增强剂的情况下，培养基中所含的GSK-3β抑制剂的浓度通常为0.1μM～10μM。
本实施方式的制造方法中，培养基优选进一步含有胰岛素样生长因子(IGF)信号转导通路增强剂。
作为IGF信号转导通路增强剂，可举出IGF-1、IGF-2等，优选为IGF-1。作为人IGF-1蛋白质的NCBI登录号，可举出NP＿001104753.1、NP＿001104755.1等。作为小鼠IGF-1蛋白质的NCBI登录号，可举出NP＿001104745.1等。作为人IGF-2蛋白质的NCBI登录号，可举出NP＿001007140.2、NP＿001278790.1等。作为小鼠IGF-2蛋白质的NCBI登录号，可举出NP＿034644.2、NP＿001302418.1等。
本实施方式的制造方法中，培养基优选进一步含有转化生长因子-β(TGF-β)信号转导通路抑制剂。
TGF-β信号转导通路抑制剂是抑制由Smad家族转导的信号转导通路的物质。作为TGF-β信号转导通路抑制剂，可举出A83-01(CAS号：909910-43-6)、SB-431542(CAS号：301836-41-9)、SB-505124(CAS号：694433-59-5)、SB-525334(CAS号：356559-20-1)、LY364947(CAS号：396129-53-6)、SC-203294(CAS号：627536-09-08)、SD-208(CAS号：627536-09-8)、SJN2511(CAS号：446859-33-2)等。这些之中，优选为A83-01、SB-431542。
培养基中所含的TGF-β信号转导通路抑制剂的浓度通常为10nM～100μM，优选为100nM～10μM。
本实施方式的制造方法中，培养基优选进一步含有Rho激酶(ROCK)信号转导通路抑制剂。
作为ROCK信号转导通路抑制剂，例如可举出Y-27632(CAS号：129830-38-2)、法舒地尔/HA1077(CAS号：105628-07-7)、H-1152(CAS号：871543-07-6)、Wf-536(CAS号：539857-64-2)、它们的衍生物等。
培养基中所含的ROCK信号转导通路抑制剂的浓度通常为0.1μM～100μM，优选为0.1μM～50μM，更优选为0.1μM～30μM。
本实施方式的制造方法中，培养基优选进一步含有骨形态发生蛋白(BMP)信号转导通路抑制剂。
作为BMP信号转导通路抑制剂，例如可举出Noggin(ノギン)、Chordin、卵泡抑素(Follistatin)、Dorsomorphin(CAS号：866405-64-3)、DMH1(CAS号：1206711-16-1)、LDN193189(CAS号：1062368-24-4)等。
培养基中所含的BMP信号转导通路抑制剂的浓度通常为0.5μM～10μM。在使用Noggin作为BMP信号转导通路抑制剂的情况下，培养基中所含的Noggin的浓度通常为10ng/mL～1000ng/mL，优选为10ng/mL～500ng/mL，更优选为10ng/mL～300ng/mL。
本实施方式的制造方法中，培养基可以进一步含有培养基补充剂、抗菌剂、血清、血清代替物、胰岛素、白蛋白等作为其它添加剂。
作为培养基补充剂，例如可举出产品名“B-27无血清补充剂”(Thermo FisherScientific公司)等神经细胞培养用补充剂、含有L-谷氨酰胺、L-丙氨酰L-谷氨酰胺等的产品名“GlutaMax”(Thermo Fisher Scientific公司)等含有谷氨酰胺的补充剂、“MEM非必需氨基酸溶液”(Thermo Fisher Scientific公司)等氨基酸水溶液、2-巯基乙醇。
作为抗菌剂，例如可举出青霉素系抗生素、头孢烯系抗生素、大环内酯系抗生素、四环素系抗生素、磷霉素系抗生素、氨基糖苷系抗生素和新喹诺酮系抗生素。
成体干细胞或包含成体干细胞的细胞组织片的培养中，可以将细胞包埋于细胞外基质(ECM)、或者将ECM添加到培养基中。作为ECM，例如可举出基底膜中所含的成分、存在于细胞间隙的糖蛋白。作为基底膜中所含的成分，例如可举出IV型胶原蛋白、层粘连蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖、巢蛋白等。作为存在于细胞间隙的糖蛋白，可举出胶原蛋白、层粘连蛋白、巢蛋白、纤连蛋白、硫酸肝素等。作为ECM，可以使用包含ECM的市售品。作为包含ECM的市售品，例如可举出基质胶(注册商标，Corning公司)、人型层粘连蛋白(Sigma公司)等。
基质胶含有来自Englbreth Holm Swarm小鼠肉瘤的基底膜成分。基质胶的主成分为IV型胶原蛋白、层粘连蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖和巢蛋白，但除它们之外，还可以包含上皮生长因子(EGF)、神经生长因子(NGF)、来自血小板的生长因子(PDGF)、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、TGF-β等各种增殖因子。基质胶也有各种增殖因子的浓度低的等级，其浓度为EGF小于0.5ng/mL、NGF小于0.2ng/mL、PDGF小于5pg/mL、IGF-1小于5ng/mL、TGF-β小于1.7ng/mL。作为基质胶，优选使用各种增殖因子的含有比例低的等级。
在成体干细胞或包含成体干细胞的细胞组织片的培养中，培养基优选1～5天更换1次左右。另外，在形成的类器官大的情况下，优选将类器官分散。分散是指通过对细胞进行酶处理、物理处理等分散处理而分离为10000个以下的细胞群体。分散可以通过对类器官进行细胞分散液处理等而进行。
作为细胞分散液，例如可举出包含胰蛋白酶、胶原蛋白酶、透明质酸酶、弹性蛋白酶、链霉蛋白酶、DNase、木瓜蛋白酶等酶类或乙二胺四乙酸等螯合剂的溶液。作为细胞分散液，可以使用市售的细胞分散液。作为市售的细胞分散液，例如可举出Thermo FisherScientific公司制的TrypLE Select、TrypLE Express等。
[培养基]
1个实施方式是一种培养基，包含嵌合FGF，上述嵌合FGF的含量为50ng/mL以下。通过在本实施方式的培养基中培养成体干细胞或包含成体干细胞的细胞组织片，能够制造类器官。因此，本实施方式的培养基可以说是类器官制造用培养基。
本实施方式的培养基是将嵌合FGF添加到基础培养基中而得的。对于基础培养基、嵌合FGF，与上述的基础培养基、嵌合FGF同样。
本实施方式的培养基优选进一步包含EGF，上述嵌合FGF和上述EGF的合计的含量为100ng/mL以下。对于EGF，与上述的EGF同样。
本实施方式的培养基可以进一步含有Wnt信号转导通路增强剂、IGF信号转导通路增强剂、TGF-β信号转导通路抑制剂、ROCK信号转导通路抑制剂、BMP信号转导通路抑制剂、其它添加剂。对于这些各成分，与上述的成分同样。
[类器官]
1个实施方式是通过上述制造方法而制造的类器官。本实施方式的类器官能够降低生长因子等所需的成本而制造，因此，容易以低成本大量地制造。因此，例如能够适用于大规模实施后述的受试物质的评价等的用途。
本实施方式的类器官使用嵌合FGF代替以往使用的FGF2。因此，本实施方式的类器官与通过以往的制造方法制造的类器官有可能基因表达谱等存在差异。然而，为了确定这样的差异点，需要大量反复试验和劳力，因此，认为以基因表达谱等确定本实施方式的类器官是不现实的，通过制造方法进行确定是现实的。
[受试物质的评价方法]
1个实施方式是一种受试物质的评价方法，包括：使通过上述制造方法而制造的类器官与受试物质接触的工序，以及评价上述受试物质对上述类器官造成的影响的工序。
通过本实施方式的方法，能够使用具有与生物体内的细胞类似的结构和功能的类器官进行受试物质的评价。本实施方式的方法能够应用于各种各样的疾病的治疗药的筛选等。
作为受试物质，例如可举出天然化合物库、合成化合物库、现有药库和代谢物库。
受试物质对类器官造成的影响例如可以以基因水平、蛋白质水平、代谢物水平进行评价。另外，通过类器官的形态的评价，能够评价受试物质对类器官造成的影响。
基因水平下的评价例如可以通过RNA-seq解析、DNA微阵列解析、实时PCR等来进行。另外，蛋白质水平下的评价例如可以通过蛋白质印迹(Western Blotting)、ELISA、免疫染色等来进行。另外，代谢物水平下的评价例如可以通过液相色谱(LC)、质谱分析(MS)、LC/MS等来评价。另外，类器官的形态的评价例如可以通过显微镜观察、免疫染色等来进行。
[嵌合FGF]
1个实施方式是一种嵌合FGF，是由序列号1～序列号4中的任一个所述的氨基酸序列构成的蛋白质，或者是由序列号1～序列号4中的任一个所述的氨基酸序列中缺失、取代或加成有1个或多个氨基酸的氨基酸序列构成，且具有能够通过在培养基中含有50ng/mL以下而由成体干细胞或包含成体干细胞的细胞组织片制造类器官的活性的蛋白质。
如实施例中后述所示，通过使用本实施方式的嵌合FGF，能够减少类器官的制造中添加在培养基中的生长因子的含量。
另外，如上所述，在嵌合FGF的氨基酸序列中，与序列号1的氨基酸序列中的第43位氨基酸对应的氨基酸优选为谷氨酰胺、缬氨酸、异亮氨酸或亮氨酸。
其中，从具有高耐热性且稳定的观点出发，与序列号1的氨基酸序列中的第43位氨基酸对应的氨基酸优选为缬氨酸、异亮氨酸或亮氨酸，更优选为异亮氨酸。
实施例
以下，基于实施例对本实施方式进行进一步的具体说明，但本实施方式并不限定于这些实施例。
[实验例1]
(类器官的制造)
在EGF的存在下或非存在下，使用以各种各样的浓度包含FGF2或嵌合FGF的培养基培养成体干细胞，研究类器官的形成。
《培养基的制备》
作为基本培养基，使用产品名“Advanced DMEM/F12”(Thermo Fisher Scientific公司)，制备添加了下述表1中记载的成分的培养基。表1中，“w/oEGF配方”是指不含EGF的培养基配方，“w/EGF配方”是指包含EGF的培养基配方。
作为培养基补充剂，使用B-27无血清补充剂(Thermo Fisher Scientific公司)。
作为FGF2，使用产品名“FGF-Basic、Human、Recombinant、Animal Free”(Peprotech公司)。另外，作为嵌合FGF，使用产品名“FGFC”(富士胶片和光纯药株式会社)。
作为EGF，使用产品名“Animal-Free Recombinant Murine EGF”(Peprotech公司)。
作为Wnt信号增强剂(Wnt信号转导通路增强剂)，使用小鼠R-spondin 1条件培养基(自制)和产品名“Afamin/Wnt3a CM”(MBL Life Sciences公司)。
作为胰岛素样生长因子(IGF信号转导通路增强剂)，使用产品名“RecombinantHuman IGF-I/IGF-1Protein,CF”(R&D Systems公司)。
作为TGF-β抑制剂(TGF-β信号转导通路抑制剂)，使用A83-01(TOCRIS Bioscience公司)。
作为ROCK抑制剂(ROCK信号转导通路抑制剂)，使用产品名“Y-27632,MF”(富士胶片和光纯药株式会社)。
作为BMP抑制剂(BMP信号转导通路抑制剂)，使用小鼠Noggin条件培养基(自制)。
[表1]
Figure BDA0003688765380000121
《类器官的形成》
作为包含成体干细胞的细胞组织片，使用大肠组织片。更详细而言，将通过基因组编辑在来自大肠组织片的细胞的LGR5基因座的第18外显子导入了报告个构建体的细胞用于实验。LGR5基因为干细胞标志物。另外，作为报告构建体，使用IRES-tdTomato。该细胞如果表达LGR5，则表达作为荧光蛋白质的tdTomato。
将上述的细胞以每1000个细胞为20μL的基质胶(注册商标，Corning公司)进行包埋，接种于48孔板。接下来，将基质胶在37℃静置并固定。接下来，将上述各组成的培养基添加于基质胶的周围。其后，每2～3天进行培养基更换。
接下来，利用荧光显微镜观察检测tdTomato的表达，评价作为干细胞标志物的LGR5蛋白质的表达。
图1(a)～(d)为培养第9天的在EGF的存在下形成的类器官的显微镜照片。图1(a)为图中所示的各浓度的FGF2的存在下形成的类器官的明视野图像。图1(b)为与图1(a)相同视野中检测出LGR5蛋白质的表达的荧光显微镜照片。图1(c)为图中所示的各浓度的FGFC的存在下形成的类器官的明视野图像。图1(d)为与图1(c)相同视野中检测出LGR5蛋白质的表达的荧光显微镜照片。
图2(a)～(d)为培养第8天的EGF的存在下形成的类器官的显微镜照片。图2(a)为图中所示的各浓度的FGF2的存在下形成的类器官的明视野图像。图2(b)为与图2(a)相同视野中检测出LGR5蛋白质的表达的荧光显微镜照片。图2(c)为图中所示的各浓度的FGFC的存在下形成的类器官的明视野图像。图2(d)为与图2(c)相同视野中检测LGR5蛋白质的表达的荧光显微镜照片。
其结果，明确了在EGF的非存在下，即便用包含10ng/mL的FGF2的培养基培养成体干细胞，类器官的形成也不充分。另一方面，明确了即便在EGF的非存在下，在包含FGFC的培养基中也能够形成类器官。另外，如图1(c)和(d)所示，明确了即便培养基中的FGFC的浓度减少到2.5ng/mL左右，也能够形成类器官。
另外，明确了在EGF的存在下，通过用包含12.5ng/mL的FGF2的培养基培养成体干细胞，能够形成类器官。另外，明确了在EGF的存在下，即便将培养基中的FGFC的浓度减少到3.1ng/mL左右，也能够形成类器官。
另外，明确了如果使用包含FGFC的培养基，则与使用包含FGF2的培养基的情况相比，菌落形成数多。
[实验例2]
(FGFC变异体的制作)
通过人工合成而制作编码FGFC变异体的基因片段。将FGFC的氨基酸序列示于序列号1。作为FGFC变异体，制作将FGFC的第43位谷氨酰胺残基取代为缬氨酸的变异体(以下称为“FGFC-V”，将氨基酸序列示于序列号2)、将FGFC的第43位谷氨酰胺残基取代为异亮氨酸的变异体(以下称为“FGFC-I”，将氨基酸序列示于序列号3)、将FGFC的第43位谷氨酰胺残基取代为亮氨酸的变异体(以下称为“FGFC-L”，将氨基酸序列示于序列号4)。
接下来，将编码FGFC、FGFC-V、FGFC-I、FGFC-L的基因片段分别插入表达载体pET-3a，以BL21(DE3)pLysS使其表达，纯化为蛋白质，用于以下的实验。
[实验例3]
(使用FGFC变异体的类器官的制造)
使用以各种各样的浓度包含FGFC或FGFC变异体的培养基培养成体干细胞，研究类器官的形成。
《培养基的制备》
作为基本培养基，使用产品名“Advanced DMEM/F12”(Thermo Fisher Scientific公司)，制备添加了下述表2中记载的成分的培养基。表2中，“w/oEGF配方”是指不含EGF的培养基配方，“w/EGF配方”是指包含EGF的培养基配方。作为FGFC和FGFC变异体，使用实验例2中制备的物质。另外，作为EGF、Wnt信号增强剂、胰岛素样生长因子、TGF-β抑制剂、ROCK抑制剂、BMP抑制剂，使用与实验例1同样的物质。
[表2]
Figure BDA0003688765380000141
《类器官的制造》
作为包含成体干细胞的细胞组织片，使用与实验例1同样的细胞。首先，将上述的细胞以每1000个细胞为20μL的基质胶(注册商标，Corning公司)进行包埋，接种于48孔板。接下来，将基质胶在37℃静置并固定。接下来，将上述各组成的培养基添加于基质胶的周围。其后，每2～3天进行培养基更换。
接下来，利用荧光显微镜观察检测tdTomato的表达，评价作为干细胞标志物的LGR5蛋白质的表达。
图3(a)～(d)为EGF的非存在下形成的培养第9天的类器官的显微镜照片。图3(a)为图中所示的各浓度的FGFC的存在下形成的类器官的明视野图像。图3(b)为图中所示的各浓度的FGFC-V的存在下形成的类器官的明视野图像。图3(c)为图中所示的各浓度的FGFC-I的存在下形成的类器官的明视野图像。图3(d)为图中所示的各浓度的FGFC-L的存在下形成的类器官的明视野图像。
另外，图4(a)为与图3(a)相同视野中检测出LGR5蛋白质的表达的荧光显微镜照片。图4(b)为与图3(b)相同视野中检测出LGR5蛋白质的表达的荧光显微镜照片。图4(c)为与图3(c)相同视野中检测出LGR5蛋白质的表达的荧光显微镜照片。图4(d)为与图3(d)相同视野中检测出LGR5蛋白质的表达的荧光显微镜照片。
图5(a)～(d)为EGF的存在下形成的培养第8天的类器官的显微镜照片。图5(a)为图中所示的各浓度的FGFC的存在下形成的类器官的明视野图像。图5(b)为图中所示的各浓度的FGFC-V的存在下形成的类器官的明视野图像。图5(c)为图中所示的各浓度的FGFC-I的存在下形成的类器官的明视野图像。图5(d)为图中所示的各浓度的FGFC-L的存在下形成的类器官的明视野图像。
另外，图6(a)为与图5(a)相同视野中检测出LGR5蛋白质的表达的荧光显微镜照片。图6(b)为与图5(b)相同视野中检测出LGR5蛋白质的表达的荧光显微镜照片。图6(c)为与图5(c)相同视野中检测出LGR5蛋白质的表达的荧光显微镜照片。图6(d)为与图5(d)相同视野中检测出LGR5蛋白质的表达的荧光显微镜照片。
其结果，明确了使用任一FGFC变异体，均能够与使用FGFC的情况相同程度地制造类器官。另外，如图3(a)～(d)、图4(a)～(d)、图5(a)～(d)、图6(a)～(d)所示，明确了即便将培养基中的FGFC或FGFC变异体的浓度减少到2.5ng/mL或3.1ng/mL，也能够制造类器官。
[实验例4]
(FGFC变异体的耐热性的研究)
研究实验例2中制备的FGFC、FGFC-V、FGFC-I、FGFC-L的耐热性。另外，为了比较，也同样地研究FGF1(产品名“FGF-Acidic、Human、Recombinant”、Peprotech公司)、FGF2(产品名“FGF-Basic、Human、Recombinant、Animal Free”、Peprotech公司)的耐热性。
在耐热性的研究中，使用市售的试剂盒(产品名“Protein Thermal ShiftTM DyeKit”，Thermo Fisher Scientific公司)，按照试剂盒的说明书制备样品后，利用实时PCR装置(产品名“7500fast”，Thermo Fisher Scientific公司)研究各蛋白质的耐热性。测定结果使用软件(产品名“Protein Thermal ShiftTM Software v1.3”、Thermo FisherScientific公司)进行解析。
图7为表示测定的各蛋白质的熔解温度(Tm)的图表。图表的横轴表示温度(℃)。另外，将各蛋白质的Tm值示于下述表3。
[表3]
蛋白质 Tm值(℃)
FGF1 56.7
FGF2 62.9
FGFC 64.4
FGFC-V 66.7
FGFC-I 68.3
FGFC-L 66.5
其结果是，明确了FGFC与FGF2相比，耐热性高。另外，明确了FGFC-V、FGFC-I、FGFC-L具有比FGFC更高的耐热性。
产业上的可利用性
根据本实施方式，可以提供能够减少培养基中所含的生长因子的含量的类器官的制造技术。
序列表
<110> JSR株式会社
学校法人庆应义塾
<120> 类器官的制造方法
<130> PC-31014
<150> JP2019-226710
<151> 2019-12-16
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 136
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽，被命名为FGFC，并且来源于人FGF1和
人FGF2
<400> 1
Met Ala Asn Tyr Lys Lys Pro Lys Leu Leu Tyr Cys Ser Asn Gly Gly
1 5 10 15
His Phe Leu Arg Ile His Pro Asp Gly Arg Val Asp Gly Val Arg Glu
20 25 30
Lys Ser Asp Pro His Ile Lys Leu Gln Leu Gln Ala Glu Glu Arg Gly
35 40 45
Val Val Ser Ile Lys Gly Val Cys Ala Asn Arg Tyr Leu Ala Met Asp
50 55 60
Thr Asp Gly Leu Leu Tyr Gly Ser Gln Thr Pro Asn Glu Glu Cys Leu
65 70 75 80
Phe Leu Glu Arg Leu Glu Glu Asn His Tyr Asn Thr Tyr Ile Ser Lys
85 90 95
Lys His Ala Glu Lys Asn Trp Phe Val Gly Leu Lys Lys Asn Gly Ser
100 105 110
Cys Lys Arg Gly Pro Arg Thr His Tyr Gly Gln Lys Ala Ile Leu Phe
115 120 125
Leu Pro Leu Pro Val Ser Ser Asp
130 135
<210> 2
<211> 136
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽，被命名为FGFC-V，并且来源于人FGF1和
人FGF2
<400> 2
Met Ala Asn Tyr Lys Lys Pro Lys Leu Leu Tyr Cys Ser Asn Gly Gly
1 5 10 15
His Phe Leu Arg Ile His Pro Asp Gly Arg Val Asp Gly Val Arg Glu
20 25 30
Lys Ser Asp Pro His Ile Lys Leu Gln Leu Val Ala Glu Glu Arg Gly
35 40 45
Val Val Ser Ile Lys Gly Val Cys Ala Asn Arg Tyr Leu Ala Met Asp
50 55 60
Thr Asp Gly Leu Leu Tyr Gly Ser Gln Thr Pro Asn Glu Glu Cys Leu
65 70 75 80
Phe Leu Glu Arg Leu Glu Glu Asn His Tyr Asn Thr Tyr Ile Ser Lys
85 90 95
Lys His Ala Glu Lys Asn Trp Phe Val Gly Leu Lys Lys Asn Gly Ser
100 105 110
Cys Lys Arg Gly Pro Arg Thr His Tyr Gly Gln Lys Ala Ile Leu Phe
115 120 125
Leu Pro Leu Pro Val Ser Ser Asp
130 135
<210> 3
<211> 136
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽，被命名为FGFC-I，并且来源于人FGF1和
人FGF2
<400> 3
Met Ala Asn Tyr Lys Lys Pro Lys Leu Leu Tyr Cys Ser Asn Gly Gly
1 5 10 15
His Phe Leu Arg Ile His Pro Asp Gly Arg Val Asp Gly Val Arg Glu
20 25 30
Lys Ser Asp Pro His Ile Lys Leu Gln Leu Ile Ala Glu Glu Arg Gly
35 40 45
Val Val Ser Ile Lys Gly Val Cys Ala Asn Arg Tyr Leu Ala Met Asp
50 55 60
Thr Asp Gly Leu Leu Tyr Gly Ser Gln Thr Pro Asn Glu Glu Cys Leu
65 70 75 80
Phe Leu Glu Arg Leu Glu Glu Asn His Tyr Asn Thr Tyr Ile Ser Lys
85 90 95
Lys His Ala Glu Lys Asn Trp Phe Val Gly Leu Lys Lys Asn Gly Ser
100 105 110
Cys Lys Arg Gly Pro Arg Thr His Tyr Gly Gln Lys Ala Ile Leu Phe
115 120 125
Leu Pro Leu Pro Val Ser Ser Asp
130 135
<210> 4
<211> 136
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽，被命名为FGFC-L，并且来源于人FGF1和
人FGF2
<400> 4
Met Ala Asn Tyr Lys Lys Pro Lys Leu Leu Tyr Cys Ser Asn Gly Gly
1 5 10 15
His Phe Leu Arg Ile His Pro Asp Gly Arg Val Asp Gly Val Arg Glu
20 25 30
Lys Ser Asp Pro His Ile Lys Leu Gln Leu Leu Ala Glu Glu Arg Gly
35 40 45
Val Val Ser Ile Lys Gly Val Cys Ala Asn Arg Tyr Leu Ala Met Asp
50 55 60
Thr Asp Gly Leu Leu Tyr Gly Ser Gln Thr Pro Asn Glu Glu Cys Leu
65 70 75 80
Phe Leu Glu Arg Leu Glu Glu Asn His Tyr Asn Thr Tyr Ile Ser Lys
85 90 95
Lys His Ala Glu Lys Asn Trp Phe Val Gly Leu Lys Lys Asn Gly Ser
100 105 110
Cys Lys Arg Gly Pro Arg Thr His Tyr Gly Gln Lys Ala Ile Leu Phe
115 120 125
Leu Pro Leu Pro Val Ser Ser Asp
130 135

Claims (15)

1.一种类器官的制造方法，包括：将成体干细胞或包含成体干细胞的细胞组织片在培养基中进行培养的工序，该培养基含有包含成纤维细胞生长因子(FGF)1的部分区域和FGF2的部分区域的嵌合FGF。
2.根据权利要求1所述的制造方法，其中，所述培养基中所含的所述嵌合FGF的含量为50ng/mL以下。
3.根据权利要求1或2所述的制造方法，其中，所述培养基进一步含有表皮生长因子(EGF)。
4.根据权利要求3所述的制造方法，其中，所述培养基中所含的所述嵌合FGF和所述EGF的合计的含量为100ng/mL以下。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的制造方法，其中，所述嵌合FGF为由序列号1～序列号4中的任一个所述的氨基酸序列构成的蛋白质，或者为由序列号1～序列号4中的任一个所述的氨基酸序列中缺失、取代或加成有1个或多个氨基酸的氨基酸序列构成，且具有能够通过在培养基中含有50ng/mL以下而由生物体干细胞或包含生物体干细胞的细胞组织片制造类器官的活性的蛋白质。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的制造方法，其中，所述培养基进一步含有胰岛素样生长因子(IGF)信号转导通路增强剂。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的制造方法，其中，所述培养基进一步含有转化生长因子-β(TGF-β)信号转导通路抑制剂。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的制造方法，其中，所述培养基进一步含有Wnt信号转导通路增强剂。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的制造方法，其中，所述培养基进一步含有Rho激酶(ROCK)信号转导通路抑制剂。
10.根据权利要求1～9中任一项所述的制造方法，其中，所述培养基进一步含有骨形态发生蛋白(BMP)信号转导通路抑制剂。
11.一种培养基，包含嵌合FGF，所述嵌合FGF的含量为50ng/mL以下。
12.根据权利要求11所述的培养基，其中，进一步包含EGF，所述嵌合FGF和所述EGF的合计的含量为100ng/mL以下。
13.一种类器官，是通过权利要求1～10中任一项所述的制造方法而制造的。
14.一种受试物质的评价方法，包括：使权利要求13所述的类器官与受试物质接触的工序，以及
评价所述受试物质对所述类器官造成的影响的工序。
15.一种嵌合FGF，是由序列号1～序列号4中的任一个所述的氨基酸序列构成的蛋白质，或者是由序列号1～序列号4中的任一个所述的氨基酸序列中缺失、取代或加成有1个或多个氨基酸的氨基酸序列构成，且具有能够通过在培养基中含有50ng/mL以下而由生物体干细胞或包含生物体干细胞的细胞组织片制造类器官的活性的蛋白质。
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