CN118043447A - 包含垂体组织的细胞群的制备方法及该细胞群 - Google Patents

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CN118043447A CN202280066380.1A CN202280066380A CN118043447A CN 118043447 A CN118043447 A CN 118043447A CN 202280066380 A CN202280066380 A CN 202280066380A CN 118043447 A CN118043447 A CN 118043447A
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中野德重
多贺诗织
桑原笃
须贺英隆
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Sumitomo Chemical Co Ltd
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Sumitomo Chemical Co Ltd
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Abstract

本发明的课题在于提供从多潜能干细胞有效制备包含垂体组织的细胞群的技术。本发明的包含垂体组织的细胞群的制备方法包括下述步骤(1)及(2)：(1)第一步骤，将多潜能干细胞在c‑jun N末端激酶(JNK)信号转导途径抑制物质和Wnt信号转导途径抑制物质存在的条件下培养；(2)第二步骤，将第一步骤得到的细胞群在BMP信号转导途径作用物质和Sonic hedgehog信号转导途径作用物质存在的条件下培养，得到包含垂体组织的细胞群。

Description

包含垂体组织的细胞群的制备方法及该细胞群
技术领域
本发明涉及包含垂体组织的细胞群的制备方法及该细胞群。进一步涉及在细胞群中包含神经系统细胞或神经组织、垂体组织以及间充质细胞的细胞团块。
垂体为在头部存在的内分泌器官，产生促肾上腺皮质激素(ACTH)、生长激素等对生物体的维持、生长而言重要的各种垂体激素。在由于垂体的发育不全、垂体功能减退、垂体腺瘤等疾病而产生垂体的功能失调的情况下，产生类似于发育障碍、生殖器相关的异常、肾上腺、甲状腺的异常的严重病情。一般而言，已受到损伤的垂体组织极少自然再生而恢复功能。
在专利文献1及非专利文献1、2中报告了通过将人多潜能干细胞在BMP信号转导途径抑制因子乃至作用因子、Sonic hedgehog(在本说明书中有时记载为Shh)信号转导途径作用因子及TGF-β信号转导途径抑制剂的存在下诱导分化，由此制备了包含垂体细胞的源自头部基板的细胞。然而，制备的细胞是二维培养而成的，达不到重现对功能的发挥而言重要的生物体的复杂垂体组织的结构。
本发明人在专利文献2至4和非专利文献3、4中报道了由多潜能干细胞制备立体垂体组织，该组织具有产生垂体激素的能力。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2016-538856号公报
专利文献2：WO2013/065763
专利文献3：WO2016/013669
专利文献4：WO2019/103129
非专利文献
非专利文献1：Dincer et al.Cell Reports 5，1387-1402，2013.
非专利文献2：Zimmer et al.Stem Cell Reports 6，858-872，2016.
非专利文献3：Suga et al.Nature.2011 Nov 9；480(7375)：57-62.
非专利文献4：Ozone et al.Nature communications 7.10351(2016)：1-10.
发明内容
发明所要解决的问题
本发明的目的是提供一种进一步有效地从多潜能干细胞制备包含垂体组织的细胞群的方法。特别是，提供了一种有效地制备包含适合于人的移植和再生医疗的高质量的垂体组织的细胞群的方法。进而，鉴定并制备相当于适于最终产品的制造、纯化的中间制造体的细胞群。具体而言，就是提供一种可以将无饲养培养的多潜能干细胞作为起始材料，通过降低昂贵重组蛋白的用量，以更便宜的价格生产而有效制备的方法。
解决问题的方法
本发明人在为解决上述问题进行反复研究时发现：通过在c-jun N末端激酶(JNK)信号转导途径抑制物质的存在下培养，添加BMP信号转导途径作用物质和Sonic hedgehog信号转导途径作用物质，由此可以有效地制备包含垂体组织的细胞群。进一步发现，通过同时添加所述JNK信号转导途径抑制物质和Wnt信号转导途径抑制物质，可以更有效地制备包含垂体组织的细胞群。
即，本发明涉及以下内容。
[1]包含垂体组织的细胞群的制备方法，其包括下述步骤(1)及(2)：
(1)第一步骤，将多潜能干细胞在c-jun N末端激酶(JNK)信号转导途径抑制物质和Wnt信号转导途径抑制物质存在的条件下培养，得到细胞群；
(2)第二步骤，将第一步骤得到的细胞群在BMP信号转导途径作用物质和Sonichedgehog信号转导途径作用物质存在的条件下培养，得到包含垂体组织的细胞群。
[2]根据[1]所述的制备方法，其特征在于，在第一步骤之前，对多潜能干细胞实施下述步骤(a)：
(a)将多潜能干细胞在不存在饲养细胞的条件下，在包含1)TGFβ家族信号转导途径抑制物质和/或Sonic hedgehog信号转导途径作用物质，以及2)未分化维持因子的培养基中进行培养。
[2-1]根据[2]所述的制备方法，其中所述步骤(a)中添加的TGFβ家族信号转导途径抑制物质为Alk5/TGFβR1抑制剂，Alk5/TGFβR1抑制剂包含选自由SB431542、SB505124、SB525334、LY2157299、GW788388、LY364947、SD-208、EW-7197、A83-01、A77-01、RepSox、BIBF-0775、TP0427736、TGFBR1-in-1、SM-16、TEW-7197、LY3200882、LY2109761、KRCA 0008、GSK 1838705、Crizotinib、Ceritinib、ASP 3026、TAE684、AZD3463及它们的衍生物组成的组中的至少一种。
[3]根据[1]所述的制备方法，第一步骤中的培养进一步是在Sonichedgehog信号转导途径作用物质存在的条件下进行的，在第一步骤及第二步骤中的Sonic hedgehog信号转导途径作用物质存在的条件下的培养期间为30天。
[4]根据[1]、[2]、[2-1]及[3]的任一项所述的制备方法，对第二步骤得到的细胞群实施下述步骤(3)：
(3)第三步骤，将第二步骤得到的细胞群在不存在Sonic hedgehog信号转导途径作用物质的条件下培养，得到包含垂体组织的细胞群。
[5]根据[4]所述的制备方法，其特征在于，在第三步骤之前，对第二步骤得到的细胞群实施下述步骤(b)；
(b)b步骤，将第二步骤得到的细胞群在BMP信号转导途径抑制物质的存在下培养。
[5-1]根据[5]所述的制备方法，其中所述步骤(b)中添加的BMP信号转导途径抑制物质包含I型BMP受体抑制剂。
[5-2]根据[5-1]所述的制备方法，其中所述I型BMP受体抑制剂包含选自由K02288、Dorsomorphin、LDN-193189、LDN-212854、LDN-214117、ML347、DMH1、DMH2、化合物1(Compound 1)、VU5350、OD52、E6201、Saracatinib、BYL719及它们的衍生物组成的组中的至少一种。
[6]根据[1]～[5]、[2-1]、[5-1]及[5-2]的任一项所述的制备方法，其中所述JNK信号转导途径抑制物质包含JNK抑制剂。
[6-1]根据[6]所述的制备方法，其中所述JNK抑制剂包含选自由SP600125、JNK-IN-8、DB07268、IQ-1S、Tanzisertib、Bentamapimod、BI-78D3、BI-87G3、CC-401、TCS JNK5a、AS601245、CV-65、D-JNK1、ER-358063、ER-409903、ER-417258、CC-359、CC-930、SB203580及它们的衍生物组成的组中的至少一种。
[6-2]根据[6]或[6-1]所述的制备方法，其中所述JNK抑制剂包含JNK-IN-8或SP600125，在包含1nM～50μM的JNK-IN-8、或1nM～25μM的SP600125的培养基中开始所述步骤(1)。
[7]根据[1]～[5]、[2-1]、[5-1]及[5-2]的任一项所述的制备方法，其中所述JNK信号转导途径抑制物质包含Rac抑制剂。
[7-1]根据[7]所述的制备方法，其中所述Rac抑制剂包含选自由NSC23766、EHop-016、ZCL278、MBQ-167、KRpep-2d、ARS-853、Salirasib、ML141、EHT1864及它们的衍生物组成的组中的至少一种。
[8]根据[1]～[7]、[2-1]、[5-1]、[5-2]、[6-1]、[6-2]、及[7-1]的任一项所述的制备方法，其中所述Wnt信号转导途径抑制物质包含对于非经典Wnt途径具有抑制活性的物质。
[8-1]根据[8]所述的制备方法，具有相对于所述非经典Wnt途径的抑制活性物质为PORCN抑制剂，PORCN抑制剂包含选自由IWP-2、IWP-3、IWP-4、IWP-L6、IWP-12、IWP-O1、LGK-974、Wnt-C59、ETC-131、ETC-159、GNF-1331、GNF-6231、Porcn-IN-1、RXC004、CGX1321及它们的衍生物组成的组中的至少一种。
[9]根据[1]～[8]、[2-1]、[5-1]、[5-2]、[6-1]、[6-2]、[7-1]及[8-1]的任一项所述的制备方法，其中在所述第一步骤、第二步骤、b步骤以及第三步骤的任意一个以上的步骤中，还存在TGF信号转导途径抑制物质。
[9-1]根据[1]～[9]、[2-1]、[5-1]、[5-2]、[6-1]、[6-2]、[7-1]、及[8-1]的任一项所述的制备方法，其中所述a步骤、第一步骤、第二步骤及b步骤的任意一个以上的步骤中添加的Sonic hedgehog信号转导途径作用物质包含选自由SAG、嘌吗啡胺(Purmorphamine)和GSA-10组成的组中的至少一种。
[10]根据[1]～[9]、[2-1]、[5-1]、[5-2]、[6-1]、[6-2]、[7-1]、[8-1]、及[9-1]的任一项所述的制备方法，其中在所述第一步骤、第二步骤、b步骤以及第三步骤的任意一个以上的步骤中，还存在TAK1抑制物质。
[10-1]根据[10]所述的制备方法，其中所述TAK1抑制物质包含选自由(5Z)-7-Oxozeaenol、N-Des(氨基羰基)AZ-TAK1抑制剂、Takinib、NG25、Sarsasapogenin及它们的衍生物组成的组中的至少一种。
[11]根据[1]～[10]、[2-1]、[5-1]、[5-2]、[6-1]、[6-2]、[7-1]、[8-1]、[9-1]、[10-1]的任一项所述的制备方法，其中在所述第二步骤、b步骤以及第三步骤的任意一个以上的步骤中，还存在FGF信号转导途径作用物质。
[11-1]根据[11]所述的制备方法，其中所述FGF信号转导途径作用物质包含选自由FGF2、FGF3、FGF8、FGF10及它们的变体组成的组中的至少一种。
[12]根据[1]～[11]、[2-1]、[5-1]、[5-2]、[6-1]、[6-2]、[7-1]、[8-1]、[9-1]、[10-1]、[11-1]的任一项所述的制备方法，其中在所述第二步骤、b步骤以及第三步骤的任意一个以上的步骤中，还存在具有减轻氧化应激作用的物质。
[12-1][12]所述的制备方法，其中所述具有减轻氧化应激作用的物质包含选自由抗坏血酸、N-乙酰基-L-半胱氨酸、烟酰胺及它们的衍生物组成的组中的至少一种。
[13]根据[1]～[12]、[2-1]、[5-1]、[5-2]、[6-1]、[6-2]、[7-1]、[8-1]、[9-1]、[10-1]、[11-1]、及[12-1]的任一项所述的制备方法，其中在所述第二步骤、b步骤以及第三步骤的任意一个以上的步骤中，还存在针对应激反应信号转导途径的抑制物质。
[14]根据[1]～[13]、[2-1]、[5-1]、[5-2]、[6-1]、[6-2]、[7-1]、[8-1]、[9-1]、[10-1]、[11-1]、及[12-1]的任一项所述的制备方法，其中在所述第二步骤、b步骤以及第三步骤的任意一个以上的步骤中，一边摇动一边培养细胞。
[15]根据[1]～[14]、[2-1]、[5-1]、[5-2]、[6-1]、[6-2]、[7-1]、[8-1]、[9-1]、[10-1]、[11-1]、及[12-1]的任一项所述的制备方法，其中所述第一步骤得到的细胞群为细胞聚集体。
[16]根据[1]～[15]、[2-1]、[5-1]、[5-2]、[6-1]、[6-2]、[7-1]、[8-1]、[9-1]、[10-1]、[11-1]、及[12-1]的任一项所述的制备方法，其中将所述第一步骤、第二步骤、b步骤以及第三步骤的任意一个以上的步骤，在形成至少1个孔的培养器材中实施，所述孔被分成多个微孔，实施悬浮培养，使得每个所述微孔形成1个细胞团。
[17]垂体组织的制备方法，其特征在于，从细胞群回收垂体组织，该细胞群为通过[1]～[16]、[2-1]、[5-1]、[5-2]、[6-1]、[6-2]、[7-1]、[8-1]、[9-1]、[10-1]、[11-1]、及[12-1]的任一项所述的制备方法得到的包含垂体组织的细胞群。
发明效果
根据本发明，在JNK信号转导途径抑制物质的作用下，向外胚层的诱导分化效率变高，从而能够从多能干细胞中有效地制备包含激素产生能力更高的垂体组织的细胞群。
附图说明
[图1]图1为示意性示出本发明的包含垂体组织的细胞群的制备方法(步骤(a)、步骤(1)及步骤(2)中实施的方式：实施例1)的图(上图)和示出得到的细胞群(细胞团)的形态的图(下图)。
[图2A]图2A为示意性示出本发明的包含垂体组织的细胞群的制备方法(步骤(a)、步骤(1)及步骤(2)中实施的方式：实施例2)的图。
[图2B]图2B为示出通过图2A所示步骤制备的细胞群(细胞团)的形态的图。
[图3A]图3A为示意性示出本发明的包含垂体组织的细胞群的制备方法(步骤(a)、步骤(1)及步骤(2)中实施的方式：实施例3)的图。
[图3B]图3B为示出通过图3A所示步骤制备的细胞群(细胞团)中的Lhx3、Pitx1及E-cadherin的表达情况的图。
[图4A]图4A为示意性示出本发明的包含垂体组织的细胞群的制备方法(步骤(a)、步骤(1)、步骤(2)及步骤(3)中实施的方式：实施例4)的图。
[图4B]图4B为示出检查由通过图4A所示步骤制备的细胞群(细胞团)诱导分化的垂体组织在诱导分化第61天、第103天、第152天、第201天的促肾上腺皮质激素(ACTH)分泌能力的结果的曲线图。
[图5]图5为示意性示出本发明的包含垂体组织的细胞群的制备方法(步骤(a)、步骤(1)、步骤(2)及步骤(3)中实施的方式：实施例5)的图(上图)和示出得到的细胞群(细胞团)的形态的图(下图)。步骤(3)通过振荡培养进行。
[图6]图6为示意性示出本发明的包含垂体组织的细胞群的制备方法(步骤(a)、步骤(1)、步骤(2)及步骤(3)中实施的方式：实施例6)的图(上图)和示出得到的细胞群(细胞团)的形态的图(下图)。步骤(3)通过振荡培养进行。步骤(3)中添加或未添加N乙酰半胱氨酸。
[图7A]图7A为示意性示出由人ES细胞制备包含垂体组织的细胞群的方法的参考例1的步骤(在步骤(1)中，在不添加JNK抑制剂的条件下)的图。
[图7B]图7B为示出通过图7A所示步骤制备的细胞聚集体在第32天的RAX、PITX1及E-cadherin的表达情况的图。
[图8A]图8A为示意性示出由人iPS细胞制备包含垂体组织的细胞群的方法的参考例2的步骤(步骤(1)和步骤(2)中IWP2、SB431542及BMP4的添加期间的研究)的图。
[图8B-1]图8B-1为示出通过图8A所示步骤(IWP2、SB431542的添加期间：d0-6)制备的细胞聚集体在第29天的RAX、PITX1、LHX3及E-cadherin的表达情况的图。上部示出了BMP4的添加期间为d2-6的情况，下部示出了BMP4的添加期间为d2-18的情况。
[图8B-2]图8B-2为示出通过图8A所示步骤(IWP2、SB431542的添加期间：d0-12)制备的细胞聚集体在第29天的RAX、PITX1、LHX3及E-cadherin的表达情况的图。上部示出了BMP4的添加期间为d2-6的情况，下部示出了BMP4的添加期间为d2-18的情况。
[图8B-3]图8B-3为示出通过图8A所示步骤(IWP2、SB431542的添加期间：d0-29)制备的细胞聚集体在第29天的RAX、PITX1、LHX3及E-cadherin的表达情况的图。上部示出了BMP4的添加期间为d2-6的情况，下部示出了BMP4的添加期间为d2-18的情况。
[图9]上图(A)为示意性示出由人ES细胞制备包含垂体组织的细胞群的方法的参考例3的步骤(步骤(1)、步骤(2)及步骤(3)的IWP2、BMP4及SAG的添加浓度的研究)的图。下图(B)为示出检查通过A所示步骤制备的细胞聚集体在诱导分化开始后61天、103天、152天、201天、250天的ACTH分泌能力的结果的曲线图。□示出了低浓度组的结果，■示出了高浓度组的结果。
[图10]上图(A)为示意性示出本发明的包含垂体组织的细胞群的制备方法(步骤(a)、步骤(1)、步骤(2)及步骤(3)中实施的方式：实施例7)的图。下图(B)为示出通过A所示步骤制备的细胞聚集体在诱导分化开始后第103天的ACTH和E-cadherin的表达情况的图。上部示出了未添加JNK抑制剂的情况的结果，下部示出了添加了JNK抑制剂的情况的结果。
[图11]图11为示出了通过本发明的包含垂体组织的细胞群的制备方法(步骤(a)、步骤(1)、步骤(2)及步骤(3)中实施的方式：实施例8)得到的细胞聚集体在诱导分化开始后第59天的ACTH和SOX2的表达情况的图。
[图12]上图(A)为示意性示出本发明的包含垂体组织的细胞群的制备方法(步骤(a)、步骤(1)、步骤(2)及步骤(3)中实施的方式：实施例9)的图。如A所示，下图(B)是分为在分化诱导开始后第30天之前处理SAG的情况和之后继续处理SAG的情况制备细胞聚集体，比较各ACTH分泌能力的图。口示出了到第30天为止用SAG处理的情况，■示出了30天以后继续用SAG处理的结果。*：p＜0.05、Student’s t-检验。
[图13A]图13A为示意性示出本发明的包含垂体组织的细胞群的制备方法(步骤(a)、步骤(1)、步骤(2)及步骤(3)中实施的方式：实施例10)的图。
[图13B]图13B为示出定量通过图13A所示步骤制备的细胞聚集体在诱导分化开始后第3、6、19、30、60、100、201天的各种细胞标记的表达量的结果的图。上部示出了PITX1、LHX3、及POMC的结果。下部示出了RAX及TTF1的结果。
[图14]图14为示出了通过图13A所示步骤(步骤(a)、步骤(1)、步骤(2)及步骤(3)中实施的方式：实施例11)制备的细胞聚集体中PRL、POU1F1、TSH、LH、FSH及GH的表达情况的图。A：示出了悬浮培养开始第103天后的PRL、POU1F1及DAPI的三重染色(左图)及悬浮培养开始第103天后的PRL及DAPI的二重染色(右图)，B：示出了悬浮培养开始第103天后的TSH及DAPI的二重染色，C：示出了悬浮培养开始第103天后的LH及DAPI的二重染色，D：示出了悬浮培养开始第103天后的FSH及DAPI的二重染色，E：示出了悬浮培养开始第152天后的GH、POU1F1及DAPI的三重染色(左图)及悬浮培养开始第152天后的GH及DAPI的二重染色(右图)。
[图15]图15为利用电子显微镜观察通过图13A所示步骤(步骤(a)、步骤(1)、步骤(2)及步骤(3)中实施的方式：实施例12)制备的诱导分化开始后第201天的细胞聚集体的图。
[图16]图16为确认通过图13A所示步骤(步骤(a)、步骤(1)、步骤(2)及步骤(3)中实施的方式：实施例13)制备的细胞聚集体在诱导分化开始后第103天的ACTH及CXADR的表达的图。
[图17]A为示出了通过图13A所示步骤(步骤(a)、步骤(1)、步骤(2)及步骤(3)中实施的方式：实施例14)制备的细胞聚集体在诱导分化开始后第29天、61天、103天、152天、201天、250天的ACTH分泌能力的图。**：p＜0.01、***：p＜0.001、具有Tukey事后检验的单因素ANOVA(one-way ANOVAwith post hoc Tukey)。B和C为示出了通过图13A所示步骤(步骤(a)、步骤(1)、步骤(2)及步骤(3)中实施的方式：实施例14)制备的细胞聚集体在诱导分化开始第103天的通过CRH(B)或地塞米松(C)进行的ACTH刺激试验的结果的图。**：p＜0.01、配对t-检验。
[图18A]图18A为确认通过图13A所示步骤(步骤(a)、步骤(1)、步骤(2)及步骤(3)中实施的方式：实施例15)制备的诱导分化开始后第30、60、100天的细胞聚集体，及未分化细胞中各细胞标记的表达的图。
[图18B]图18B为示出通过图13A所示步骤(步骤(a)、步骤(1)、步骤(2)及步骤(3)中实施的方式：实施例15)制备的细胞聚集体在诱导分化第103天的NESTIN及SOX11的表达情况的图。a：NESTIN、SOX11及DAPI的三重染色，b：NESTIN及DAPI的二重染色，c：SOX11及DAPI的二重染色，d：NESTIN、SOX11及DAPI的三重染色。
[图19A]图19A为示意性示出使用具有分割微孔的培养器材由人iPS细胞制备垂体类器官的方法(步骤(a)、步骤(1)及步骤(2)中实施的方式：实施例16)的图。
[图19B]图19B为示出了对通过图19A所示步骤制备的细胞聚集体在诱导分化开始后第29天的形状进行偏斜照明观察的结果的图。形成了具有基板样的垂体组织的垂体类器官。
[图20A]图20A为示意性示出了本发明的包含源自人iPS细胞的垂体组织的细胞群的制备方法(步骤(a)、步骤(1)及步骤(2)中实施的方式：实施例17)的图。
[图20B]图20B为示出了对通过图20A所示步骤制备的细胞聚集体在诱导分化开始后第28天的形状进行偏斜照明观察的结果的图。在诱导分化开始后第1天和第2天的任一天的BMP4添加条件下，形成了具有基板样的垂体组织的垂体类器官。
具体实施方式
1.定义
在本说明书中，术语的定义如下。“干细胞”意指具有分化潜能和增殖能力(特别是自我更新的能力)的未分化的细胞。在干细胞中，根据分化潜能而包括多潜能干细胞(pluripotent stem cell)，多能干细胞(multipotent stem cell)，单能干细胞(unipotent stem cell)等。“多潜能干细胞”意指能够在体外培养，并且具有可能分化为构成生物体的全部的细胞的潜能(分化多潜能性(pluripotency))的干细胞。所有细胞是指源自外胚层、中胚层、内胚层这三胚层的细胞。“多能干细胞”意指具有分化成多种类型的组织或细胞、但不是所有种类的组织或细胞的潜能的干细胞。“单能性干细胞”意指具有分化成特定的组织、细胞的潜能的干细胞。
多潜能干细胞可以由受精卵、克隆胚胎、生殖干细胞、组织中的干细胞、体细胞等诱导。作为多潜能干细胞，可列举：胚胎干细胞(ES细胞：Embryonic stem cell)，EG细胞(Embryonic germ cell)，人工多潜能干细胞(iPS细胞：induced pluripotent stem cell)等。由间充质干细胞(mesenchymal stem cell；MSC)得到的Muse细胞(Multi-lineagedifferentiating Stress Enduring cell)、由生殖细胞(例如睾丸)制作的GS细胞也包括在多潜能干细胞中。此外，人胚胎干细胞从受精14日以内的人胚胎中建立。
胚胎干细胞最先在1981年建立，并且自1989年起还已经用于产生敲除小鼠。在1998年，建立了人胚胎干细胞，其也正用于再生医学。可通过在饲养细胞上或在含有白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor，LIF)的培养基中培养内细胞群而产生ES细胞。ES细胞的制备方法记载在例如国际公开第96/22362号、国际公开第02/101057号、美国专利第5843780号说明书、美国专利第6200806号说明书、美国专利第6280718号说明书等。胚胎干细胞可从给定的机构得到，或可以购买市售品。例如，作为人胚胎干细胞的KhES-1，KhES-2和KhES-3可从京都大学再生医科学研究所得到。作为任意小鼠胚胎干细胞的EB5细胞可从国立研究开发法人理化学研究所得到，并且D3细胞系可从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)得到。作为ES细胞之一的核移植ES细胞(ntES细胞)可从将体细胞的细胞核移植到去除了细胞核的卵细胞制备的克隆胚胎建立。
EG细胞可通过在含有小鼠干细胞因子(mSCF)、LIF和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的培养基中培养原始生殖细胞而产生(Cell，70：841-847，1992)。
“人工多潜能干细胞”意指通过公知的方法等将体细胞重编程(reprogramming)而被诱导具有多潜能性的细胞。作为人工多潜能干细胞，具体而言，可列举将成纤维细胞、外周血单核细胞等分化成的体细胞通过表达选自包括Oct3/4、Sox2、Klf4、Myc(c-Myc、N-Myc、L-Myc)、Glis1、Nanog、Sall4、lin28、Esrrb等的重编程基因组中的多个基因而进行重编程，从而被诱导具有多潜能性的细胞。2006年，由山中等以小鼠细胞建立了人工多潜能干细胞(Cell，2006，126(4)pp.663-676)。在2007年还从人成纤维细胞中建立了人工多潜能干细胞，与胚胎干细胞同样具有多潜能性和自我更新能力(Cell，2007，131(5)pp.861-872；Science，2007，318(5858)pp.1917-1920；Nat.Biotechnol.，2008，26(1)pp.101-106)。作为人工多潜能干细胞，除了利用基因表达的直接重编程而制备的方法以外，也可以通过化合物的添加等由体细胞诱导人工多潜能干细胞(Science，2013，341，pp.651-654)。
用于获得人工多潜能干细胞的体细胞没有特别限制，可列举组织来源的成纤维细胞、血液谱系细胞(例如，外周血单核细胞、T细胞)、肝细胞、胰腺细胞、肠上皮细胞、平滑肌细胞等。
当通过表达一些种类的基因(例如，Oct3/4、Sox2、Klf4及Myc这4种因子)进行重编程而产生人工多潜能干细胞时，对用于基因表达的方式没有特别限制。作为用于表达基因的手段，可列举例如：使用病毒载体(例如，逆转录病毒载体、慢病毒载体、仙台病毒(Sendaivirus)载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体)的感染法，使用质粒载体(例如，质粒载体、附加体载体)的基因导入法(例如，磷酸钙法、脂质转染法、RetroNectin法、电穿孔法)，使用RNA载体的基因导入法(例如，磷酸钙法、脂质转染法、电穿孔法)，直接注射蛋白的方式，等等。
另外，还可以获取细胞株化的人工多潜能干细胞，例如，在京都大学建立的201B7细胞、201B7-Ff细胞、253G1细胞、253G4细胞、1201C1细胞、1205D1细胞、1210B2细胞、1231A3细胞等人工多能性细胞系可以从京都大学和iPS Academia Japan，Inc.获取。作为细胞株化的人工多潜能干细胞，例如，在京都大学建立的Ff-I01细胞、Ff-I14细胞和QHJI01 s04细胞可以从京都大学获取。
多潜能干细胞可以遗传上修饰。可以例如，通过使用同源重组技术产生遗传上修饰的多潜能干细胞。作为被修饰的染色体上的基因，可列举例如：细胞标记基因、组织相容性抗原的基因、与由神经系统细胞的障碍导致的疾病相关的基因等。染色体上的靶基因的修饰可以使用以下各项所述的方法进行：Manipulating the Mouse Embryo，A LaboratoryManual(操作小鼠胚胎，实验室手册)，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1994)；Gene Targeting，A Practical Approach(基因靶向，实践方法)，IRL Press atOxford University Press(1993)；Biomanual Series 8，Gene Targeting，Making ofMutant Mouse using ES cell(基因靶向，使用ES细胞产生突变体小鼠)，YODOSHA CO.，LTD.(1995)；等等。
具体而言，例如，分离要修饰的靶基因(例如，细胞标记基因、组织相容性抗原基因、疾病相关的基因等)的基因组遗传子，并使用该分离的基因组遗传子制备用于将该靶基因进行同源重组的靶向载体。将所产生的靶向载体引入到干细胞中，并选择在所述靶基因与所述靶向载体之间发生了同源重组的细胞，由此，能够制备染色体上的基因得到了所述修饰的干细胞。
作为用于分离靶基因的基因组基因的方法，可列举以下各项中记载的已知的方法：Molecular Cloning，A Laboratory Manual(分子克隆，实验室手册)，第二版，ColdSpring Harbor Laboratory Press(1989)，Current Protocols in Molecular Biology(现代分子生物学流程)，John Wiley&Sons(1987-1997)等。可以使用基因组DNA文库筛选系统(由Genome Systems制造)、通用基因组步量试剂盒(Universal GenomeWalker试剂盒)(由Clontech制造)等。
用于靶基因同源重组的靶向载体的制备和同源重组子的有效筛选可以按照以下各项中记载的方法进行：Gene Targeting，A Practical Approach(基因靶向，实践方法)，IRL Press at Oxford University Press(1993)；Biomanual Series 8，Gene Targeting，Making of Mutant Mouse using ES cell(基因靶向，使用了ES细胞产生突变体小鼠)，YODOSHA CO.，LTD.(1995)；等等。作为所述靶向载体可以使用替换类型或插入类型中的任一种。作为所述筛选方法，可以使用诸如阳性选择、启动子选择、阴性选择、聚腺苷酸(polyA)选择等方法。作为用于从所选的细胞系中选择需要的同源重组子的方法，可列举用于基因组DNA的DNA杂交法(Southem hybridization method)、PCR法等。
作为多潜能干细胞，也可以使用经过基因组编辑的多潜能干细胞。“基因组编辑”是指利用核酸酶切断位点特异性基因组DNA链，或者通过碱基的化学转化等原理，有意改变靶基因或基因组区域的技术。作为位点特异性核酸酶，可列举：锌指核酸酶(ZFN)、TALEN、CRISPR/Cas9等。通过利用基因组编辑技术，可以制备缺失特定基因的敲除细胞系、在特定基因座上人工插入另一序列的敲入细胞系等。
作为多潜能干细胞，也可以使用疾病特异性多潜能干细胞。“疾病特异性多潜能干细胞”表示与疾病发病有关的基因变异或具有遗传背景的多潜能干细胞。疾病特异性多潜能干细胞可以通过上述方法等从患有目标疾病的患者或近亲中建立人工多潜能干细胞的方法，或者通过锌指核酸酶(ZFN)、TALEN、CRISPR等基因组编辑技术等改变已建立的多潜能干细胞的基因组的方法来制备。
“哺乳动物”包括啮齿类、有蹄类、食肉目、灵长类动物等。啮齿类包括小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠等。有蹄类包括猪、牛、山羊、马、绵羊等。在食肉目中，包括犬、猫等。在兔子目中，包含兔子等。“灵长类”是指属于灵长目的哺乳动物，并且灵长类包括诸如狐猴，懒猴，树鼩等的原猴亚目，和诸如猴，类人猿，人等的类人猿亚目。
本发明使用的多潜能干细胞为哺乳动物的多潜能干细胞，优选为啮齿类(例如，小鼠，大鼠)或灵长类(例如，人，猴)的多潜能干细胞，最优选为人多潜能干细胞。
“细胞黏附(Cell adhesion)”中包含细胞和细胞的黏附(细胞-细胞黏附)，及细胞与细胞外基质(底物)的黏附(细胞-底物黏附)。在体外的人工培养环境中产生的细胞与培养器材等的黏附也包含在细胞黏附中。细胞-细胞黏附中形成的结合是细胞-细胞结合(cell-cell junction)，细胞-底物黏附中形成的结合是细胞-底物结合(cell-substratumjunction)。作为细胞黏附的种类，可列举锚定连接(anchoring junction)，通讯连接(communicating junction)，封闭连接(occluding junction)。
作为细胞-细胞结合，可列举：“紧密连接(tight junction)”、”黏附连接(adherence junction)”。紧密连接是一种较强的细胞-细胞结合，可在上皮细胞中产生。细胞间是否存在紧密连接，可以通过利用使用例如针对紧密连接的构成成分的抗体(抗紧密连接蛋白抗体，抗ZO-1抗体等)的免疫组织化学等手段来检测。
“悬浮培养”是指将细胞维持在培养液中悬浮存在的状态下培养。即，悬浮培养为细胞在与培养器材及培养器材上的饲养细胞等(以下记作“培养器材”)等不黏附的条件下进行，区别于与培养器材等黏附的条件下进行的培养(贴壁培养)。更具体而言，悬浮培养意指在细胞与培养器材等之间未形成强的细胞-基质间连接的条件下的培养。本领域技术人员例如通过显微镜观察时的培养器材的摇动等，可以容易地判断所培养的细胞是悬浮培养状态还是贴壁培养。
“贴壁培养”是指将细胞维持在与培养器材等黏附存在的状态下培养。此处，细胞与培养器材等黏附是指例如细胞与培养器材之间，形成了作为细胞黏附的一种的牢固的细胞-基质连接。
在悬浮培养中的细胞聚集体中，细胞和细胞为面黏附。在悬浮培养中的细胞聚集体中，细胞与培养器材等之间，未形成牢固的细胞-基质连接，几乎不形成细胞-基质连接、或即使形成，其贡献也是小的。在悬浮培养中的细胞聚集体的内部，也可以存在内在的细胞-基质连接。“细胞-细胞发生面黏附(面连接)”，意指一个细胞以面与另一个细胞连接。更具体地，细胞-细胞面黏附意指例如，在一个细胞的表面积中，与另一个细胞的表面发生黏附的比例为例如1％以上，优选3％以上，更优选5％以上。细胞的表面可通过根据将膜染色的试剂(例如DiI)的染色、细胞粘附因子(例如，E-cadherin、N-cadherin)的免疫染色等进行检测。
进行贴壁培养时使用的培养器材没有特别限制，只要其能够实现贴壁培养即可，并且本领域普通技术人员能够适当确定此类培养器材。作为这样的培养器材，可列举例如：烧瓶、组织培养瓶、平皿、组织培养皿、多联培养皿、微量平板、微孔平板、微孔、多联平板、多孔平板、室载玻片、碗、管、托盘、培养袋和芯片上的器官(Organ-on-a-Chip)等生物功能芯片等。作为细胞黏附性的培养器材，可以使用培养器材的表面经人工处理的培养器材等，以提高与细胞的黏附性。人工处理可列举例如：细胞外基质、利用高分子等的涂覆处理，以及气体等离子体处理、正电荷处理等表面加工。作为细胞黏附的细胞外基质，可列举例如：基膜制剂、层粘连蛋白、巢蛋白、胶原蛋白、明胶等。作为高分子，可列举聚赖氨酸、聚鸟氨酸等。培养器材的培养面可以是平底的，也可以是凹凸不平的。
“层粘连蛋白(laminin)”是指包含α，β，γ链的异三聚物分子，为存在亚单元链的组成不同的亚型的细胞外基质蛋白质。具体而言，层粘连蛋白以5种α链、4种β链及3种γ链的杂三聚物的组合计，有约15种亚型。层粘连蛋白的名称通过将α链(α1-α5)、β链(β1-β4)和γ链(γ1-γ3)各自的数目进行组合而确定。例如，具有α5链、β1链、γ1链的组合的层粘连蛋白称为层粘连蛋白511。
进行悬浮培养时使用的培养器材没有特别限制，只要其能够实现悬浮培养即可，并且本领域普通技术人员能够适当确定此类培养器材。作为这样的培养器材，可列举例如：烧瓶、组织培养瓶、平皿、组织培养皿、多联培养皿、微量平板、微孔平板、微孔、多联平板、多孔平板、室载玻片、碗、管、托盘、培养袋、旋转烧瓶及转瓶等。为了能够实现悬浮培养，这些培养器材优选为非细胞黏附性的。作为非细胞黏附性的培养器材，可以使用培养器材的表面经上述人工处理的培养器材等，以提高与细胞的黏附性。作为细胞黏附性的培养器材，也可以使用培养器材的表面经人工处理的培养器材，以降低与细胞的黏附性。培养器材的培养面可以是平底、U底或V底的，也可以是凹凸不平的。作为降低与细胞的黏附性的处理，可列举例如：通过2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱(2-methacryloyloxyethylphosphorylcholine，MPC)聚合物、聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)(Poly(2-hydroxyethyl methacrylate)(Poly-HEMA))、聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG))等涂覆进行的超亲水性处理、蛋白低吸附处理等。
“振荡培养”是指通过摇动培养器材而搅拌培养液，促进向培养液中供氧、与细胞周围进行物质交换等的培养法。也可以进行搅拌培养、流路培养等。
出于保护细胞聚集体免受悬浮培养时产生的剪切力等物理应激，提高细胞分泌的生长因子和细胞因子类的局部浓度，促进组织发育的目的，也可将细胞聚集体包埋于凝胶中或封入于具有物质渗透性的胶囊中之后再实施悬浮培养(Nature，2013，501.7467：373)。也可以振荡培养封入的细胞聚集体。用于包埋的凝胶或胶囊可以是生物来源或合成高分子制的任一种。作为用于上述目的的凝胶或胶囊，例如有基质胶(Corning公司制)、PuraMatrix(3D Matrix公司制)、VitroGel 3D(TheWell Bioscience公司制)、胶原凝胶(新田明胶公司制)、海藻酸凝胶(PG Research公司生产)、Cell-in-a-Box(Austrianova公司制)等。
用于培养细胞的培养基可以由通常用于培养动物细胞的培养基作为基础培养基而制作。作为基础培养基，可列举例如：Basal Medium Eagle(BME)、BGJb培养基、CMRL 1066培养基、Glasgow Minimum Essential Medium(Glasgow MEM)、Improved MEM ZincOption、Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium(IMDM)、Medium 199、Eagle MinimumEssential Medium(Eagle MEM)、A Modified Eagle Minimum Essential Medium(αMEM)、Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM)、F-12培养基、DMEM/F12、IMDM/F12、Ham’s培养基、RPMI 1640、Fischer’s培养基、或它们的混合培养基等。
在多潜能干细胞的培养中，可以使用基于上述基础培养基的用于培养多潜能干细胞的培养基、优选公知的用于胚胎干细胞或人工多潜能干细胞的培养基、用于在无饲养细胞下培养多潜能干细胞的培养基(无饲养细胞培养基)等。作为无饲养细胞培养基，许多合成培养基已开发并上市销售，例如Essential 8培养基。Essential 8培养基包含在DMEM/F12培养基中作为添加剂的L-抗坏血酸-2-磷酸酯镁(64mg/l)、亚硒酸钠(14μg/l)、胰岛素(19.4mg/l)、NaHCO3(543mg/l)、转铁蛋白(10.7mg/l)、bFGF(100ng/mL)、及TGFβ家族信号转导途径作用物质(TGFβ1(2ng/mL)或Nodal(100ng/mL))(Nature Methods，8，424-429(2011))。作为市售的无饲养细胞培养基，可列举例如：Essential 8(Thermo FisherScientific公司制)、S-medium(DSPharma Biomedical公司制)、StemPro(Thermo FisherScientific公司制)、hESF9、mTeSR1(STEMCELL Technologies公司制)、mTeSR2(STEMCELLTechnologies公司制)、TeSR-E8(STEMCELL Technologies公司制)、mTeSR Plus(STEMCELLTechnologies公司制)、StemFit(味之素公司制)、ReproMed iPSC Medium(ReproCELL公司制)、NutriStem XF(Biological industries公司制)、NutriStem V9(Biologicalindustries公司制)、Cellartis DEF-CS Xeno-Free Culture Medium(TAKARABio公司制)、Stem-Partner SF(极东制药公司制)、PluriSTEM Human ES/iPS Cell Medium(Merck公司制)、StemSure hPSC MediumΔ(富士胶片和光纯药公司制)等。
无血清培养基可以含有血清代替物。作为血清代替物，可列举适当含有例如：白蛋白、转铁蛋白、脂肪酸、胶原蛋白前体、微量元素、2-巯基乙醇或3’硫醇甘油，或它们的等效物等的那些。此种血清代替物可以通过例如：国际公开第98/30679号中记载的方法制备。作为血清代替物，也可以利用市售品。作为市售的血清代替物，可列举例如：敲除血清替代品(Knockout Serum Replacement，Thermo Fisher Scientific公司制，下文中有时也被称为“KSR”)，化学成分确定的脂质浓缩物(Chemically Defined LipidConcentrate，ThermoFisher Scientific公司制)，GlutamaxTM(Thermo FisherScientific公司制)，B27补充物(Thermo Fisher Scientific公司制)，N2补充物(Thermo Fisher Scientific公司制)。
用于悬浮培养和贴壁培养的无血清培养基可以适当含有脂肪酸或脂质、氨基酸(例如非必须氨基酸)、维生素、生长因子、细胞因子、抗氧化剂、2-巯基乙醇、丙酮酸、缓冲剂、无机盐等。
为避免复杂的制备，作为无血清培养基可以使用添加有适量的市售的KSR(由Thermo Fisher Scientific公司制)(例如：约0.5％～约30％、优选为约1％～约20％)的无血清培养基(例如：在F-12培养基和IMDM培养基的1：1混合液中添加了1×化学成分确定的脂质浓缩物、5％KSR及450μM 1-一硫代甘油的培养基)。另外，作为KSR等同产品，可列举日本特表2001-508302号公报公开的培养基。
“血清培养基”是指含有无调整或未纯化的血清的培养基。该培养基可以含有脂肪酸或脂质、氨基酸(例如非必须氨基酸)、维生素、生长因子、细胞因子、抗氧化剂、2-巯基乙醇、1-一硫代甘油、丙酮酸、缓冲剂、无机盐等。
在本发明中，培养优选在无外源物质(xeno-free)的条件下进行。“无外源物质”是指已将与培养对象的细胞的生物种类不同的生物种类来源的成分排除的条件。
从避免化学上不确定的成分的混入的观点出发，本发明使用的培养基优选为所含成分经化学上确定的培养基(化学成分确定的培养基，Chemically defined medium；CDM)。
“基膜(Basement membrane)结构”是指由细胞外基质构成的薄的膜状结构。在生物体中，基膜在上皮细胞的基底侧(basal)形成。作为基膜的成分，可列举：IV型胶原蛋白，层粘连蛋白，硫酸乙酰肝素蛋白多糖(串珠素，perlecan)，entactin/nidogen，细胞因子，生长因子等。在源自生物体的组织中以及用本发明的制备方法等制作的细胞团块中是否存在基膜，可以通过利用使用例如PAM染色等组织染色，以及针对基膜的构成成分的抗体(抗层粘连蛋白抗体，抗IV型胶原蛋白抗体等)的免疫组织化学等手段来检测。
“基膜制剂”指包含具有以下功能的基膜构成成分的制剂：当在其上接种并培养具有基膜形成能力的期望的细胞的情况下，控制上皮细胞样的细胞形态，分化，增殖，运动，功能表达等。在本发明中，在进行细胞的贴壁培养时，可以在基膜制剂的存在下培养。此处，“基膜组成成分”是指在动物组织中的上皮细胞层与间质细胞层等之间存在的薄膜形式的细胞外基质分子。基膜制剂可以通过例如以下操作而制作：将经由基膜而黏附于支撑体上的具有基膜形成能力的细胞，使用具有该细胞的脂质溶解能力的溶液、碱溶液等从支撑体除去。作为基膜制剂，可列举包括作为基膜制作物而市售的商品，例如：Matrigel(由Coming公司制)、Geltrex(由Thermo Fisher Scientific公司制)，作为基膜成分公知的细胞外基质分子(例如：层粘连蛋白，IV型胶原蛋白，硫酸乙酰肝素蛋白多糖，entactin等)的那些。
可以将从Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤等组织或细胞提取、并使其可溶的基质胶(Corning公司制)等基膜制剂用于细胞以及组织的培养。同样地，作为细胞培养中使用的基膜成分，也可使用人可溶化羊膜(生物资源应用研究所制)，在HEK293细胞中产生的人重组层粘连蛋白(BioLamina公司制)，人重组层粘连蛋白片段(Nippi公司制)，人重组玻连蛋白(Thermo Fisher Scientific公司制)等，从避免源自不同的生物种类的成分的混入的观点，及避免传染病的风险的观点出发，基膜制剂优选成分明确的重组蛋白质。
在本说明书中，“包含物质X的培养基”及“在物质X的存在下”分别是指添加了外源性(exogenous)的物质X的培养基或包含外源性的物质X的培养基，及在外源性的物质X的存在下。对外源性的物质X而言，与例如在培养基中存在的细胞或组织内源性(endogenous)表达，分泌或者产生该物质X的内源性的物质X相区别。培养基中的物质X可以由于物质X的分解或培养基的蒸发而发生微量的浓度变化。
在本说明书中，在物质X的浓度为Y的培养基中开始培养时，优选地指培养基中物质X的浓度在Y处变得均匀时，但如果培养容器足够小(例如，在96孔板或培养液在200μL以下培养)，则为了使浓度为Y进行后述的培养基添加操作、半量培养基更换操作或全量培养基更换操作时，被解释为在浓度Y处开始培养时。另外，培养基中物质X的浓度为Y包含：在一定培养期间内物质X的平均浓度为Y的情况、以Y浓度含有物质X的期间为培养期间的50％以上的情况、以Y浓度含有物质X的期间为各步骤中假定的培养期间中最短的期间以上的情况等。
在本说明书中，“在物质X不存在下”是指没有添加外源性(exogenous)的物质X的培养基或不包含外源性的物质X的培养基，或在外源性的物质X不存在的状态。
在本说明书中，“人蛋白质X”是指蛋白质X具有在人生物体内天然表达的蛋白质X的氨基酸序列。
“分离”是指进行除去作为目标的成分、细胞以外的因子的操作而脱离了天然存在的状态。因此，在“经过分离的蛋白质X”中，不包括由培养对象的细胞、组织产生的细胞、在组织及培养基中包含的内源性的蛋白质X。“经过分离的蛋白质X”的纯度(蛋白质X的重量占总蛋白质重量的百分率)通常为70％以上，优选为80％以上，更优选为90％以上，进一步优选为99％以上，最优选为100％。
在本说明书中，“衍生物”是指相对于特定的化合物，该化合物分子中的一部分被替换为其他官能团或其他原子所产生的化合物组。在本说明书中，蛋白质的“变体”是指在能够维持原蛋白质特性的范围内，发生氨基酸残基缺失、添加、替换等突变的蛋白质。突变的氨基酸数量没有特别限制，可列举1～4个、1～3个、1～2个、或1个。蛋白质的“变体”可以为具有与原始蛋白质显示至少90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、或99.5％以上的同一性的氨基酸序列的蛋白质。变体中突变的氨基酸可以为非天然型。
在本说明书中，“A小时(A天)以后”包含A小时(A天)，是指A小时(A天)之后。“B小时(B天)以内”包含B小时(B天)，是指B小时(B天)之前。
在本发明中，“饲养细胞”是指在培养干细胞时共存的除干细胞之外的细胞。作为用于培养多潜能干细胞同时维持未分化状态的饲养细胞，可列举例如：小鼠成纤维细胞(MEF)、人成纤维细胞、SNL细胞等。饲养细胞，优选经历增殖抑制处理的。作为增殖抑制处理，可列举增殖抑制剂(例如：丝裂霉素C)处理或UV照射等。对用于培养多潜能干细胞同时维持未分化状态的饲养细胞而言，通过分泌体液因子(优选为未分化维持因子)，或产生用于细胞黏附的构架(细胞外基质)而有助于维持多潜能干细胞的未分化。
在本说明书中，不存在饲养细胞的条件下(无饲养细胞)是指在不存在饲养细胞的条件下培养。不存在饲养细胞的条件是指未添加饲养细胞的条件，或实质上不含饲养细胞(例如：相对于总细胞数，饲养细胞数的比例为3％以下)的条件。
“细胞聚集体”(cell aggregate)是指由细胞集合形成的团块，细胞之间彼此黏附。在细胞的聚集体中包括：细胞群、胚样体(Fmbryoid body)、球体(Sphere)、球状体(Spheroid)、类器官(Organoid)。优选在细胞的聚集体中细胞彼此为面黏附。在一些实施方式中，在细胞聚集体的一部分或全部中，细胞彼此黏附，例如形成黏附结合(adherencejunction)。在一些实施方式中，两个以上细胞聚集体之间也可以进一步人工黏附或聚集。细胞聚集体中还含有进一步粘附或聚集细胞群的团块，以及类组装体(assembloid)。细胞聚集体的形态不限于球状，例如可以为双球状、串珠状、球的集合体状、绳状和分枝状(Scientific reports，11：21421(2021)、特愿2021-078154中记载的形状)等形态。
“均匀的细胞聚集体”是指在培养多个细胞聚集体时每个细胞聚集体的大小是恒定的，如果用最大直径的长度来评价细胞聚集体的大小，那么均匀的细胞聚集体是指最大直径的长度的分散小。更具体地说，是指在多个细胞聚集体中75％以上的细胞聚集体中，其最大直径在多个细胞聚集体最大直径平均值的±100％以内，优选在最大直径平均值的±50％以内，更优选在最大直径平均值的±20％以内。
“细胞群”是指由2个以上的细胞构成的细胞群体。细胞群可以由一种细胞构成，也可以由多种细胞构成。构成细胞群的细胞可以在培养基中悬浮，也可以与培养器材等黏附。另外，构成细胞群的细胞可以是单一细胞，也可以在细胞群的至少一部分中，细胞彼此黏附，形成细胞群。此处“单一细胞”是指，例如细胞之间几乎没有黏附(例如面黏附)的细胞。在一些实施方式中，分散到单个细胞中，可列举细胞-细胞间连接(例如黏附连接)几乎消失的状态。细胞群可以包含细胞聚集体。
“组织”是指形态和性质不同的多种细胞以一定的模式立体配置而成的具有结构的细胞群体的结构体。
“外胚层”是指在生物初始发育过程中，卵受精后形成的3个胚层中，存在于最外侧的胚层。外胚层随发育的发展分为神经外胚层和表层外胚层，神经外胚层又分为神经管和神经堤。这些外胚层形成了身体的各种器官，外胚层形成的器官被称为来源于外胚层。例如由神经管形成脑和脊髓等中枢神经系统器官或组织。例如由神经堤形成部分中枢神经系统细胞、面部骨骼及软骨、感觉神经细胞、自主神经细胞、色素细胞、间充质细胞等。由表层外胚层形成包含表皮、内耳、垂体前叶、嗅上皮的上呼吸道组织等。基板和基板来源组织来源于表层外胚层。多潜能干细胞在分化为外胚层的过程中，表达作为例如Pax3、Otx2、Sox1的外胚层标记而已知的基因。
“内胚层”是指在生物初始发发育过程中，卵受精后形成的3个胚层中，存在于最内侧的胚层。由内胚层形成例如消化道、尿路、咽部、气管、支气管、肺。多潜能干细胞在分化为内胚层的过程中，表达作为例如SOX17、HNF-3β/FoxA2、Klf5、GATA4、GATA6、PDX-1的内胚层标记而已知的基因。
“中胚层”表示在外胚层与内胚层之间形成的胚层。中胚层形成例如循环系统、骨骼、肌肉等器官或组织。多潜能干细胞在分化为中胚层的过程中，表达作为例如T/Brachury、SMA、ABCA4、Nkx2.5、PDGFRα等中胚层标记而公知的基因。
在本发明中，“神经组织”是指由神经系统细胞构成的组织，包括发育阶段或成人阶段的大脑，中脑，间脑，小脑，脊髓，视网膜，外周神经等。在本说明书中，“神经上皮组织”是指神经组织形成具有层结构的上皮结构，并且神经组织中的神经上皮组织可以通过使用光学显微镜的明场观察而评价存在的量。
“中枢神经系统”表示神经组织集聚，构成信息处理中心的领域。在脊椎动物中，中枢神经系统中包含大脑和脊髓。中枢神经系统来源于外胚层。
“神经系统细胞(Neural cell)”是指来源于外胚层的组织中除表皮谱系细胞之外的细胞。即，神经系统细胞包括：神经系统前体细胞、神经元(神经细胞)、胶质细胞、神经干细胞、神经元前体细胞、神经胶质前体细胞等细胞。神经系统细胞还包括构成后述的视网膜组织的细胞(视网膜细胞)、视网膜祖细胞、视网膜层专有的神经细胞、神经视网膜细胞和视网膜色素上皮细胞。神经系统细胞可以用巢蛋白(Nestin)、βIII微管蛋白(TuJ1)、PSA-NCAM、N-cadherin等作为标记进行鉴定。
神经元是形成神经回路并且对信号转导有贡献的功能细胞，可以通过将TuJ1，Dcx，HuC/D等不成熟神经细胞标记，和/或Map2，NeuN等成熟神经细胞标记的表达作为指标进行鉴定。
作为胶质细胞，可列举：星形胶质细胞，少突胶质细胞，米勒胶质细胞等。作为星形胶质细胞的标记，可列举GFAP，作为少突胶质细胞的标记可列举O4，作为米勒胶质细胞的标记可列举CRALBP等。
神经干细胞是具有向神经细胞和胶质细胞的分化潜能(多分化潜能性)和维持多分化潜能性的增殖能力(有时称为自我更新能力)的细胞。关于神经干细胞标记，可列举：巢蛋白、Sox2、Musashi、Hes家族、CD133等；然而，这些标记是关于祖细胞/前体细胞全体的标记，而不被认为是神经干细胞特异性的标记。神经干细胞的数量可以通过神经球测定、克隆测定等评估。
神经元前体细胞是具有增殖能力的细胞，其产生神经细胞，并且不产生胶质细胞。作为神经元前体细胞的标记，可列举Tbr2、Tα1等。不成熟神经细胞标记(TuJ1、Dcx、HuC/D)阳性且增殖标记(Ki67、pH3、MCM)阳性的细胞也可以作为神经元前体细胞鉴定。胶质前体细胞是指具有增殖能力，产生胶质细胞，且不产生神经细胞的细胞。
神经系统前体细胞(Neural Precursor cell)为包括神经干细胞，神经元前体细胞及胶质前体细胞的前体细胞的聚集体，具有增殖能力和神经元及胶质细胞产生能力。神经系统前体细胞可以用巢蛋白、GLAST、Sox2、Soxl、Musashi、Pax6等作为标记鉴定。神经系统细胞标记为阳性且生长标记(Ki67、pH3、MCM)为阳性的细胞也可以被鉴定为神经系统前体细胞。
“大脑组织”是指胎儿期或成体的构成大脑的细胞(例如大脑神经系统前体细胞(cortical neural precursor cell)、背侧大脑神经系统前体细胞、腹侧大脑神经系统前体细胞、大脑层结构特异性神经细胞(神经元)、第一层神经元、第二层神经元、第三层神经元、第四层神经元、第五层神经元、第六层神经元、胶质细胞(星形胶质细胞和少突胶质细胞)，这些前体细胞等)中的一种或多种层状、立体排列而成的组织。胎儿期的大脑也称为前脑或终脑。各个细胞的存在，可以通过公知的方法，例如细胞标记的表达有无、其程度等来确认。
作为大脑细胞标记，可列举：在大脑细胞中表达的FoxG1(别名Bf1)、在大脑神经系统前体细胞中表达的Sox2和Nestin、在背侧大脑神经系统前体细胞中表达的Pax6和Emx2、在腹侧大脑神经系统前体细胞中表达的Dlx1、Dlx2和Nkx2.1、在神经元前体细胞中表达的Tbr2、Nex、Svet1、在第六层神经元中表达的Tbr1、在第五层神经元中表达的Ctip2、在第四层神经元中表达的RORβ、在第三层神经元或第二层神经元中表达的Cux1或Brn2、在第一层神经元中表达的Reelin等。
在本发明中，“脑室”是指由中枢神经组织形成的腔所。在生物体中为通常被脑脊髓液等组织液充满的无细胞性的结构，神经组织的顶端面侧面向脑室。围拢脑室的脑室周围层为存在神经干细胞，在发育阶段产生细胞的增殖和神经元产生的区域。通过本发明的制备方法制备的细胞群以及组织中是否包含脑室，可以通过例如使用中枢神经组织标记(Bf1、Pax6等)及顶端面标记(PKC-zeta等)的免疫组织化学等手段来检测。
在本发明中，“间脑”是指与第三脑室相接的中枢神经系统的神经组织。间脑中包含上丘脑、丘脑、下丘脑、垂体等组织。
在本发明中，“下丘脑”是指与垂体相接的间脑的一个区域。下丘脑为进一步区域化为背侧下丘脑及腹侧下丘脑。下丘脑可以使用Rx、Vax1、Six3等标记鉴定。背侧下丘脑可以使用Otp、Bm2、加压素等标记鉴定。腹侧下丘脑可以使用Nkx 2.1、SF1等标记鉴定。
在本发明中，“非神经上皮组织”是指在具有上皮结构的组织中除了神经上皮组织以外的组织。上皮组织可由外胚层，中胚层，内胚层，营养外胚层中的任意胚层形成。在上皮组织中包括上皮，中皮，内皮。作为非神经上皮组织中包含的组织的例，可列举：表皮，角膜上皮、鼻腔上皮、口腔上皮、气管上皮、支气管上皮、气管上皮、肾上皮、肾皮质上皮、胎盘上皮等。
对上皮组织而言，通常利用各种细胞间结合而连接，形成具有单层或复层化的层结构的组织。这些上皮组织的有无的确认，存在量的定量能够通过利用光学显微镜的观察、或使用针对上皮细胞标记的抗体(抗E-cadherin抗体，抗N-cadherin抗体，抗EpCAM抗体等)的免疫组织化学等手段进行。
在本发明中，“上皮细胞极性(Epithelial polarity)”表示在上皮细胞内，在空间上形成的构成成分及细胞功能的分布的偏置。例如：角膜上皮细胞局部存在于眼球的最外层，在顶端侧(apical)表达用于泪液维持的膜结合型粘蛋白(MUC-1、4、16)等顶端侧特异性蛋白质，在基底侧(basal)表达用于与基膜黏附的α6整联蛋白，β1整联蛋白等基底侧特异性蛋白质。
源自生物体的组织中以及用本发明的制备方法等制作的细胞团块中的上皮细胞以及上皮组织中是否存在上皮细胞极性，可以通过使用鬼笔环肽(Phalloidin)，顶端侧标记(抗MUC-1抗体，抗PKC-zeta抗体等)以及基底侧标记(抗α6整联蛋白抗体，抗β1整联蛋白抗体等)的免疫组织化学等手段来检测。
在本发明中，“基板(placode)”主要表示在脊椎动物的发育过程中，表皮外胚层的一部分肥大而形成的器官的原基(primordial organ)。作为源自于基板的组织，可列举：晶状体，鼻，内耳，三叉神经、腺垂体等。作为基板，或为其前体组织的前基板区域(preplacoderegion)的标记，可列举Six1、Six4、Dlx5、Eya2、Emx2、Bf1等。
在本发明中，“垂体基板”是指在胚胎发育的过程中在表皮外胚层的区域形成的肥大的结构，其表达垂体前体细胞标记。作为垂体前体细胞标记，可列举Lim3(Lhx3)、Pitx1/2、Islet1/2等。垂体基板表达选自Lim3、Pitx1/2及Islet1/2组成的组中的至少1个，优选为全部垂体前体细胞标记。垂体基板陷入，形成发育途中的袋状的结构的拉特克囊(Rathke’spouch)，进一步发育进展则形成腺性垂体。
在本发明中，“腺性垂体”是指包含至少一种前叶或中叶的垂体细胞组织。在垂体细胞中，包括产生调节生理功能的激素的垂体激素产生细胞和非激素产生细胞。作为垂体激素产生细胞，可列举：生长激素(GH)产生细胞，催乳素(PRL)产生细胞，促肾上腺皮质激素(ACTH)产生细胞，促甲状腺激素(TSH)产生细胞，卵胞刺激素(FSH)产生细胞，黄体激素(LH)产生细胞等构成前叶的细胞；黑色素细胞刺激素(MSH)产生细胞等构成中叶的细胞。作为非激素产生细胞，包括：血管内皮细胞，周细胞，滤泡星形胶质细胞，垂体干细胞，垂体前体细胞。
在一种实施方式中，腺性垂体包含选自生长激素(GH)产生细胞，催乳素(PRL)产生细胞，及促肾上腺皮质激素(ACTH)产生细胞组成的组中的至少一种、优选为两种，更优选为3种的垂体激素产生细胞。在进一步的实施方式中，腺性垂体包含选自：生长激素(GH)产生细胞，催乳素(PRL)产生细胞，促肾上腺皮质激素(ACTH)产生细胞，促甲状腺激素(TSH)产生细胞，卵胞刺激素(FSH)产生细胞，及黄体化激素(LH)产生细胞组成的组中的至少一种、优选为两种以上(2，3，4，5或6种)垂体激素产生细胞。在源自生物体的组织中以及用本发明的制备方法等制作的细胞群中是否包含腺性垂体及垂体激素产生细胞，可以通过使用生长激素(GH)产生细胞标记(抗Pit1抗体，抗GH抗体等)，催乳素(PRL)产生细胞标记(抗Pit1抗体，抗PRL抗体等)，促肾上腺皮质激素(ACTH)产生细胞标记(抗T-Pit抗体，抗NeuroD1抗体，抗ACTH抗体等)，促甲状腺激素(TSH)产生细胞标记(抗GATA2抗体，抗ACTH抗体等)，卵胞刺激素(FSH)产生细胞，及黄体化激素(LH)产生细胞标记(抗GATA2抗体，抗SF1抗体，抗FSH抗体，抗LH抗体等)的免疫组织化学及针对分泌的激素ELISA的等手段来检测。
在本发明中的“垂体干细胞”是指在垂体中存在，促进垂体组织的再生、垂体激素产生细胞的供给的未分化的多能干细胞、前体细胞。对于通过本发明的制备方法制备的细胞群以及组织中是否包含垂体干细胞，可以通过例如使用了针对Sox2，Sox9，E-cadherin，巢蛋白，S100β，GFRα2，丙1，CD133，β-连环蛋白，Klf4，Oct4，Pax6，柯萨奇病毒-腺病毒共同受体(CXADR)，PRRX1/2，Ephrin-B2，ACE等垂体干细胞标记及Ki67，磷酸化组蛋白H3，MCM等细胞增殖标记的抗体的免疫组织化学，使用了BrdU，EdU，IdU等核酸类似物的增殖细胞标记分析，荧光标记二肽(β-丙氨酰-赖氨酰-N-7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酸)的摄取试验，垂体球(pitusphere)形成试验等手段来检测。
在本发明中，“口腔上皮”表示形成口腔的上皮组织及其细胞。作为口腔上皮，可列举例如：口腔黏膜上皮、唾液腺上皮、牙源性上皮。口腔黏膜上皮通常是由复层扁平上皮组成的黏膜组织，在与结缔组织相接的基底膜上包含基底细胞、默克尔细胞、黑色素产生细胞等，其上层形成有刺细胞、颗粒细胞、角质层。口腔黏膜上皮可以被检测为例如细胞角蛋白7、8、13、14、19阳性的组织。
在本发明中，“小生境(niche)”或者“干细胞小生境”是指有关干细胞的增殖，分化，性质的维持等的微环境。作为生物体中小生境的例子，可列举：造血干细胞小生境，毛囊干细胞小生境，肠道上皮干细胞小生境，肌肉干细胞小生境，垂体小生境等。在这些小生境中存在各个组织特有的干细胞和提供小生境的支持细胞，干细胞由支持细胞提供的细胞因子，趋化因子，细胞外基质，细胞粘附因子，细胞间信号转导因子等维持。
在本发明中，“垂体小生境”是指有关垂体干细胞的增殖，分化，性质的维持等的微环境。作为垂体小生境，可列举：作为发育阶段的袋状的拉特克囊的中空部的痕迹而在垂体前叶与中叶之间残留的残留腔(Rathke裂)周边存在的边缘细胞层(Maginal Cell Layer)(MCL)小生境，及散在于垂体前叶的实质层(Parenchymal)小生境。
在本发明中的“间充质细胞”是指主要源自中胚层以及神经嵴，形成结缔组织的非上皮性的细胞。这些细胞中的一部分为被称为间充质干细胞的多能性的体细胞干细胞。通过本发明的制备方法制备的细胞群以及组织中是否包含间充质细胞，可以通过使用针对巢蛋白(Nestin)，波形蛋白(Vimentin)，钙黏着蛋白-11(Cadherin-11)，层粘连蛋白(Laminin)，CD44等间充质细胞标记的抗体的免疫组织化学等手段来检测。是否包含间充质干细胞，可以通过使用针对CD9，CD13，CD29，CD44，CD55，CD59，CD73，CD105，CD140b，CD166，VCAM-1，STRO-1，c-Kit，Sca-1，核干细胞因子(Nucleostemin)，CDCP1，BMPR2，BMPR1A及BPMR1B等间充质干细胞标记的抗体的免疫组织化学等手段来检测。
2.包含垂体组织的细胞群的制备方法
本发明提供包含垂体组织的细胞群及该制备方法。以下也称为本发明的制备方法。
本发明的制备方法的一个方面是制备包含垂体组织的细胞群的方法，其包含下述步骤(1’)～(2)。
(1’)第一步骤，将多潜能干细胞在JNK信号转导途径抑制物质存在的条件下培养，形成细胞群；
(2)第二步骤，将第一步骤得到的细胞群在BMP信号转导途径作用物质和Sonichedgehog信号转导途径作用物质存在的条件下培养，得到包含垂体组织的细胞群。
在步骤(1’)中，优选在JNK信号转导途径抑制物质中组合使用Wnt信号转导途径抑制物质。
本发明的制备方法的更优选的一个方面是制备包含垂体组织的细胞群的方法，其包含下述步骤(a)和下述步骤(1’)～(2)。
(a)a步骤，将多潜能干细胞在不存在饲养细胞的条件下，在包含1)TGFβ家族信号转导途径抑制物质和/或Sonic hedgehog信号转导途径作用物质，以及2)未分化维持因子的培养基中进行培养；
(1’)第一步骤，将a步骤得到的细胞在JNK信号转导途径抑制物质存在的条件下培养(优选悬浮培养)；
(2)第二步骤，将第一步骤得到的细胞群在BMP信号转导途径作用物质和Sonichedgehog信号转导途径作用物质存在的条件下培养(优选悬浮培养)，得到包含垂体组织的细胞群。
优选地，第一步骤是形成细胞的聚集体的步骤，在第二步骤中第一步骤得到的细胞群可以是细胞的聚集体。
在步骤(1’)中，优选在JNK信号转导途径抑制物质中组合使用Wnt信号转导途径抑制物质。
本发明的制备方法的更优选的一个方面是制备包含垂体组织的细胞群的方法，其包含下述步骤(a)和下述步骤(1)～(3)。
(a)a步骤，将多潜能干细胞在不存在饲养细胞的条件下，在包含1)TGFβ家族信号转导途径抑制物质和/或Sonic hedgehog信号转导途径作用物质，以及2)未分化维持因子的培养基中进行培养；
(1)第一步骤，将a步骤得到的细胞在JNK信号转导途径抑制物质和Wnt信号转导途径抑制物质存在的条件下培养(优选悬浮培养)。
(2)第二步骤，将第一步骤得到的细胞群在BMP信号转导途径作用物质和Sonichedgehog信号转导途径作用物质存在的条件下培养(优选悬浮培养)；
(3)第三步骤，将第二步骤得到的细胞群在不存在Sonic hedgehog信号转导途径作用物质的条件下培养(优选悬浮培养)，得到包含垂体组织的细胞群。
优选地，第一步骤是形成细胞的聚集体的步骤，在第二步骤中第一步骤得到的细胞群，以及第三步骤中第二步骤得到的细胞群可以分别是细胞的聚集体。
<步骤(a)>：a步骤
对将多潜能干细胞在不存在饲养细胞的条件下，在包含1)TGFβ家族信号转导途径抑制物质和/或Sonic hedgehog信号转导途径作用物质，以及2)未分化维持因子的培养基中进行培养的a步骤进行说明。
在步骤(a)中，通过将多潜能干细胞用TGFβ家族信号转导途径抑制物质及/或Sonic hedgehog信号转导途径作用物质处理后，在第一步骤中进行培养(优选悬浮培养)，改变了多潜能干细胞的状态，改善了非神经上皮组织的形成效率，提高了得到的细胞群(聚集体)的质量，易于分化，不易发生细胞死亡，提高了垂体细胞的制备效率。
步骤(a)是在不存在饲养细胞的条件下实施。
本发明中不存在饲养细胞的条件下(无饲养细胞)是指实质上不包含饲养细胞(例如，相对于总细胞数，饲养细胞数的比例为3％以下)的条件。
在本发明的垂体的制备方法中，多潜能干细胞优选胚胎干细胞或人工多潜能干细胞。人工多潜能干细胞可从给定的机构得到，或可以购买市售品。例如人工多潜能干细胞系201B7株、201B7-Ff细胞、253G1细胞、253G4细胞、1201C1细胞、1205D1细胞、1210B2细胞、1231A3细胞可以从京都大学和iPS Academia Japan，Inc.获取。作为细胞株化的人工多潜能干细胞，例如，在京都大学建立的Ff-I01细胞、Ff-I14细胞和QHJI01 s04细胞可以从京都大学获取。另外，HC-6#10株、1231A3株和1383D2株可以从国立研究开发法人理化学研究所获取。
TGFβ家族信号转导途径(即TGFβ超家族信号转导途径)是指以转化生长因子β(TGFβ)，Nodal/激活蛋白或BMP为配体，在细胞内由Smad家族转导的信号转导途径。
TGFβ家族信号转导通路抑制物质表示抑制GFβ家族信号转导通路，即由Smad家族转导的信号转导通路的物质，具体而言可列举：TGFβ信号转导通路抑制物质、Noda1/激活蛋白信号转导通路抑制物质和BMP信号转导通路抑制物质。作为TGFβ家族信号转导途径抑制物质，优选TGFβ信号转导途径抑制物质。
作为TGFβ信号转导通路抑制物质没有特别限定，只要为抑制TGFβ引起的信号转导通路的物质即可，可为核酸、蛋白质、低分子有机化合物中的任一种。作为该物质，可列举例如：直接作用于TGFβ的物质(例如，蛋白质、抗体、适体等)、抑制编码TGFβ的基因的表达的物质(例如，反义寡核苷酸、siRNA等)、抑制TGFβ受体与TGFβ的结合的物质、抑制由TGFβ受体的信号转导而引起的生理活性的物质(例如，TGFβ受体的抑制剂、Smad的抑制剂等)。作为TGFβ信号转导通路抑制物质而为人所知的蛋白质，可列举Lefty等。
作为TGFβ信号转导途径抑制物质，可以使用本领域技术人员众所周知的化合物。具体而言，可列举：SB431542(有时简写为“SB431”)(4-[4-(3，4-亚甲二氧基苯基)-5-(2-吡啶基)-1H-咪唑-2-基]苯甲酰胺)、SB505124(2-[4-(1，3-苯并二氧代醇-5-基)-2-(1，1-二甲基乙基)-1H-咪唑-5一基]-6-甲基吡啶)、SB525334(6-[2-(1，1-二甲基乙基)-5-(6-甲基-2-吡啶基)-1H-咪唑-4-基]喹喔啉)、LY2157299(4-[5，6-二氢-2-(6-甲基-2-吡啶基)-4H-吡咯并[1，2-b]吡唑-3-基]-6-喹啉甲酰胺)、LY2109761(4-[5，6-二氢-2-(2-吡啶基)-4H-吡咯并[1，2-b]吡唑-3-基]-7-[2-(4-吗啉基)乙氧基]-喹啉)、GW788388(4-{4-[3-(吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-基]-吡啶-2-基}-N-(四氢-2H-吡喃-4-基)苯甲酰胺)、LY364947(4-[3-(2-吡啶基)-1H-吡唑-4-基]喹啉)、SD-208(2-[(5-氯-2-氟苯基)蝶啶-4-基]吡啶-4-基-胺)、EW-7197(N-(2-氟苯基)-5-(6-甲基-2-吡啶基)-4-[1，2，4]三唑并[1，5-a]吡啶-6-基-1H-咪唑并-2-甲胺)、A83-01(3-(6-甲基吡啶-2-基)-4-(4-喹啉基)-1-苯基硫基氨基甲酰基-1H-吡唑)、RepSox(2-[5-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-基]-1，5-萘啶)、SM16(4-[4-(1，3-苯并二氧代醇-5-基)-5-(6-甲基-2-吡啶基)-1H-咪唑-2-基]双环[2.2.2]辛烷-1-甲酰胺)、R268712(4-[2-氟-5-[3-(6-甲基-2-吡啶基)-1H-吡唑-4-基]苯基]-1H-吡唑-1-乙醇)、IN1130(3-[[5-(6-甲基-2-吡啶基)-4-(6-喹喔啉基)-1H-咪唑-2-基]甲基]苯甲酰胺)、Galunisertib(4-[5，6-二氢-2-(6-甲基-2-吡啶基)-4H-吡咯并[1，2-b]吡唑-3-基]-6-喹啉甲酰胺)、AZ12799734(4-({4-[(2，6-二甲基吡啶-3-基)氧]吡啶-2-基}氨基)苯磺酰胺)、A77-01(4-[3-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-基]喹啉)、KRCA 0008(1，1-[(5-氯-2，4-嘧啶二基)双[亚氨基(3-甲氧基-4，1-亚苯基)-4，1-哌嗪二基]]双乙酮)、GSK1838705(2-[[2-[[1-[(二甲基氨基)乙酰基]-5-(甲基氧)-2，3-二氢-1H-吲哚-6-基]氨基]-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基]氨基]-6-氟-N-甲基苯甲酰胺)、Crizotinib(3-[(1R)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙氧基]-5-[1-(哌啶-4-基)-1H-吡唑-4-基]-2-氨基吡啶)、Ceritinib(5-氯-N2-[2-异丙氧基-5-甲基-4-(4-哌啶基)苯基]-N4-(2-异丙基磺酰基苯基)嘧啶-2，4-二胺)、ASP 3026(N2-[2-甲氧基-4-[4-(4-甲基-1-哌嗪基)-1-哌啶基]苯基]-N4-[2-[(1-甲基乙基)磺酰基]苯基]-1，3，5-三嗪-2，4-二胺)、TAE684(5-氯-N2-[2-甲氧基-4-[4-(4-甲基-1-哌嗪基)-1-哌啶基]苯基]-N4-[2-[(1-甲基乙基)磺酰基]苯基]-2，4-嘧啶二胺基)、AZD3463(N-[4-(4-氨基-1-哌啶基)-2-甲氧基苯基]-5-氯-4-(1H-吲哚-3-基)-2-嘧啶胺)、TP0427736(6-[4-(4-甲基-1，3-噻唑-2-基)-1H-咪唑-5一基]-1，3-苯并噻唑)、TGFBR1-IN-1(5-(1，3-苯并噻唑-6-基)-N-(4-羟苯基)-1-(6-甲基吡啶-2-基)吡唑-3-甲酰胺)、TEW-7197(2-氟-N-[[5-(6-甲基吡啶-2-基)-4-([1，2，4]三唑并[1，5-a]吡啶-6-基)-1H-咪唑-2-基]甲基]苯胺)、LY3200882(2-[4-[[4-[1-环丙基-3-(氧代烷-4-基)吡唑-4-基]氧吡啶-2-基]氨基]吡啶-2-基]丙-2-醇)、BIBF-0775((3Z)-N-乙基-2，3-二氢-N-甲基-2-氧代-3-[苯基[[4-(1-哌啶基甲基)苯基]氨基]亚甲基]-1H-吲哚-6-甲酰胺)等Alk5/TGFβR1抑制剂、SIS3(1-(3，4-二氢-6，7-二甲氧基-2(1H)-异喹啉)-3-(1-甲基-2-苯基-1H-吡咯并[2，3-b]吡啶-3-基)-2-丙烯-1-酮)等SMAD3抑制剂、ITD-1(4-[1，1’-联苯]-4-基-1，4，5，6，7，8-六氢-2，7，7-三甲基-5-氧代-3-喹啉羧酸甲酯)等受体分解促进剂和这些化合物的衍生物等。这些物质可以单独或组合使用。SB431542是作为TGFβ受体(ALK5)和Activin受体(ALK4/7)的抑制剂(即TGFβR抑制剂)而公知的化合物。SIS3为阻碍作为处于TGFβ受体的控制下的细胞内信号转导因子的SMAD3的磷酸化的TGFβ信号转导途径抑制物质。ITD-1是TGF-βII型受体的蛋白酶体分解促进剂。上述化合物等具有作为TGFβ信号转导途径抑制物质的活性，这对于本领域技术人员而言是公知的(例如在Expert opinion oninvestigational drugs，2010，19.1：77-91.等中记载)。
TGFβ信号转导途径抑制物质优选包含A1k5/TGFβR1抑制剂。A1k5/TGFβR1抑制剂优选包含选自由SB431542、SB505124、SB525334、LY2157299、GW788388、LY364947、SD-208、EW-7197、A83-01、RepSox、SM16、R268712、IN1130、Galunisertib、AZ12799734、A77-01、KRCA0008、GSK 1838705、Crizotinib、Ceritinib、ASP 3026、TAE684、AZD3463、TP0427736组成的组中的至少一种，进一步优选包含SB431542或A83-01。
培养基中的TGFβ信号转导途径抑制物质的浓度，可以根据在能够达到上述效果的范围内使用的物质适当地设定。在作为步骤(a)中的TGFβ信号转导途径抑制物质使用SB431542的情况下，通常以约1nM～约100μM，优选为约10nM～约100μM，更优选为约10nM～约50μM，进一步优选为约100nM～约50μM，特别优选为约1μM～约10μM的浓度使用。另外，在使用除了SB431542以外的TGFβ信号转导途径抑制物质的情况下，优选地以赋予与上述浓度的SB431542等同的TGFβ信号转导途径抑制活性的浓度使用。此外，SB431542等TGFβ信号转导途径抑制活性可以通过本领域技术人员众所周知的方法，例如通过Smad的磷酸化蛋白质印迹法检测来确定(Mol Cancer Ther.(2004)3，737-45.)。
Shh信号转导途径作用物质是指可以增强通过Shh介导的信号转导的物质。作为Shh信号转导途径作用物质，可列举例如：属于Hedgehog家族的蛋白质(例如Shh、Ihh)、Shh受体、Shh受体激动剂、Smo激动剂、嘌吗啡胺(9-环己基-N-[4-(吗啉基)苯基]-2-(1-萘氧基)-9H-嘌呤-6-胺)、GSA-10(丙基4-(1-己基-4-羟基-2-氧代-1，2-二氢喹啉-3-甲酰胺)苯甲酸酯)、Hh-Ag1.5、20(S)-羟基胆固醇、SAG(平滑激动剂：N-甲基-N’-(3-吡啶基苄基)-N’-(3-氯苯并[b]噻吩-2-羰基)-1，4-二氨基环己烷)、20(S)-羟基胆固醇((3S，8S，9S，10R，13S，14S，17S)-17-[(2R)-2-羟基-6-甲基庚-2-基]-10，13-二甲基-2，3，4，7，8，9，11，12，14，15，16，17-十二氢-1H-环戊[a]菲-3-醇)等。这些物质可以单独或组合使用。上述化合物等具有作为Shh信号转导途径作用物质的活性，这对于本领域技术人员而言是公知的(例如Molecular BioSystems，2010，6.1：44-54.中记载)。
Shh信号转导途径作用物质优选包含选自由SAG、嘌吗啡胺、GSA-10组成的组中的至少一种，更优选包含SAG。培养基中的Shh信号转导途径作用物质的浓度，可以根据在能够达到上述效果的范围内使用的物质适当地设定。SAG在步骤(a)中通常以约1nM～约2000nM，优选为约10nM～约1000nM，更优选为约10nM～约700nM，进一步优选为约50nM～约700nM，特别优选为约100nM～约600nM，最优选为约100nM～约500nM的浓度使用。另外，在使用除了SAG以外的Shh信号转导途径作用物质的情况下，优选地以赋予与上述浓度的SAG等同的Shh信号转导促进活性的浓度使用。Shh信号转导促进活性可通过对本领域技术人员公知的方法、例如着眼于Gli1基因的表达的报道基因检测法来确定(Oncogene(2007)26，5163-5168)。
步骤(a)中使用的培养基为了能够实现未分化维持培养而包含未分化维持因子。未分化维持因子没有特别限定，只要是具有抑制多潜能干细胞的分化的作用的物质即可。作为本领域普通技术人员广泛应用的未分化维持因子，在致敏的(primed)多潜能干细胞(例如，人ES细胞，人iPS细胞)的情况下，可列举：FGF信号转导途径作用物质、TGFβ家族信号转导途径作用物质、胰岛素等。作为FGF信号转导途径作用物质，具体而言可列举：成纤维细胞生长因子(例如bFGF、FGF4或FGF8)。另外，作为TGFβ家族信号转导途径作用物质，可列举：TGFβ信号转导途径作用物质、Nodal/Activin信号转导途径作用物质。作为TGFβ信号转导途径作用物质，可列举例如：TGFβ1、TGFβ2。作为Nodal/Activin信号转导途径作用物质，可列举例如Nodal、ActivinA、ActivinB。这些物质可以单独或组合使用。培养人多潜能干细胞(例如人ES细胞、人iPS细胞)时，步骤(a)中的培养基优选为作为未分化维持因子而包含bFGF。
未分化维持因子通常为哺乳动物的未分化维持因子。作为哺乳动物，可列举上文提及的那些。由于未分化维持因子可以在哺乳动物物种之间具有交叉反应性，因此也可以使用用于维持任何哺乳动物未分化状态的因子，只要能够维持要培养的多潜能干细胞的未分化状态即可。未分化维持因子优选为与要培养的细胞是同一物种的哺乳动物的未分化维持因子。例如，对于人多潜能干细胞的培养，使用人未分化维持因子(例如bFGF、FGF4、FGF8、EGF、Nodal、ActivinA、ActivinB、TGFβ1、TGFβ2等)。未分化维持因子优选经过分离。
未分化维持因子可以使用由任一宿主生产的或人工合成的，只要具有作为培养对象的多潜能干细胞的未分化维持能力。本发明中使用的未分化维持因子优选接受与在生物体内产生的相同的修饰，更优选在与作为培养对象的多潜能干细胞同种的细胞中在不含异种成分的条件下产生。
本发明的制备方法的一种实施方式包括提供经过分离的未分化维持因子的步骤。本发明的制备方法的一种实施方式包括向步骤(a)中使用的培养基中外来地(或外因地)添加经过分离的未分化维持因子的步骤。也可以在步骤(a)中使用的培养基中预先添加未分化维持因子。
步骤(a)中使用的培养基中的未分化维持因子浓度是能够维持要培养的多潜能干细胞的未分化状态的浓度，本领域技术人员可以适当设定。例如在不存在饲养细胞的条件下，在作为未分化维持因子使用bFGF的情况下，该浓度通常为约4ng/mL～约500ng/mL，优选为约10ng/mL～约200ng/mL，更优选为约30ng/mL～约150ng/mL。
步骤(a)是在不存在饲养细胞的条件下实施。步骤(a)中多潜能干细胞的培养，可以在悬浮培养和贴壁培养的任一条件下进行，优选通过贴壁培养进行。在不存在饲养细胞的条件下的多潜能干细胞的培养中，可以使用适当的基质作为构架，用于给多潜能干细胞提供替代饲养细胞的构架。通过作为构架的基质而在表面进行了涂覆的培养器材中贴壁培养多潜能干细胞。
关于可以用作构架的基质，可列举：层粘连蛋白(Nat Biotechnol.28，611-615(2010))、层粘连蛋白片段(Nat Commun 3，1236(2012))、基膜制剂(Nat Biotechnol 19，971-974(2001))、明胶、胶原蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖、entactin、玻连蛋白(Vitronectin)等。基质优选使用层粘连蛋白511(Nat Biotechnol 28，611-615(2010))。
层粘连蛋白片段没有特别限制，只要其具有与多潜能干细胞的黏附性并且允许在无饲养细胞的条件下维持培养多潜能干细胞即可，并且其优选是E8片段。在通过用弹性蛋白酶消化层粘连蛋白511得到的多个片段中，层粘连蛋白E8片段被鉴定为具有强细胞黏附活性的片段(EMBO J.，3：1463-1468，1984、J.Cell Biol.，105：589-598，1987)。作为层粘连蛋白片段优选使用层粘连蛋白511的E8片段(Nat Commun 3，1236(2012)、ScientificReports 4，3549(2014))。层粘连蛋白E8片段不需要是层粘连蛋白的弹性蛋白酶消化产物，并且可以是重组体。或可以为在基因重组动物(蚕等)中产生的那些。从避免未鉴定成分的混入的观点出发，优选使用重组体的层粘连蛋白片段。层粘连蛋白511的E8片段已经市售，并可以从例如Nippi，Inc.等购买。
从避免未鉴定成分的混入的观点出发，在本发明中使用的层粘连蛋白或层粘连蛋白片段优选经过分离。在步骤(a)中在饲养细胞不存在的条件下的多潜能干细胞的培养中，优选将人多潜能干细胞在用经过分离的层粘连蛋白511或层粘连蛋白511的E8片段，更优选层粘连蛋白511的E8片段涂覆表面的培养器材中贴壁培养。
对步骤(a)中使用的培养基而言，只要是在无饲养细胞条件下能够实现多潜能干细胞的未分化维持培养的培养基(无饲养细胞培养基)即可，没有特别限定。
在步骤(a)中使用的培养基可以为血清培养基也可以为无血清培养基。从避免化学上未确定的成分的混入的观点出发，在步骤(a)中使用的培养基优选为无血清培养基。培养基也可以包含血清代替物。
步骤(a)中多潜能干细胞的培养时间没有特别限定，在可实现继续提高第一步骤中形成的细胞群(聚集体)的素质的效果的范围内即可，通常为0.5～144小时，优选为2～96小时，更优选为6～48小时，进一步优选为12～48小时，特别优选为18～28小时，例如，24小时)。即，步骤(a)在第一步骤开始的0.5～144小时前，优选18～28小时前开始，在步骤(，a)结束之后继续进行第一步骤。
在步骤(a)的一个优选的实施方案中，在不存在饲养细胞的条件下，和在包含bFGF的无血清培养基中，贴壁培养人多潜能干细胞。该贴壁培养优选为在用层粘连蛋白511、层粘连蛋白511的E8片段或玻连蛋白对表面进行涂覆的培养器材中实施。对该贴壁培养而言，优选地，作为无饲养细胞培养基使用StemFit实施。StemFit培养基含有bFGF作为未分化维持成分(Scientific Reports(2014)4，3594)。
在步骤(a)的一个优选的实施方案中，在不存在饲养细胞的条件下，和在包含bFGF的无血清培养基中，悬浮培养人多潜能干细胞。在该悬浮培养中，人多潜能干细胞可以形成人多潜能干细胞的聚集体。
在步骤(a)及后述步骤中，培养温度、CO2浓度等培养条件可以适当设定。培养温度例如为约30℃～约40℃，优选为约37℃。CO2浓度在使用重碳酸缓冲系统的培养基的情况下，例如为约1％～约10％，优选为约5％。
<步骤(1)>、<步骤(1’)>：第一步骤
在步骤(1’)中，在c-Jun N末端激酶(JNK)信号转导途径抑制物质存在的条件下培养多潜能干细胞，得到细胞群。
JNK是属于MAPK家族的激酶，与各种环境应激、炎症性细胞因子、生长因子、GPCR激动剂刺激的细胞内信号转导有关。
在本发明中，JNK信号转导途径抑制物质没有限制，只要能抑制通过JNK转导的信号转导即可。作为JNK信号转导途径抑制物质，具有例如JNK信号转导机制的上游或下游的因子，或具有通过JNK本身的酶活性、多聚体化、抑制与其它因子或核酸的结合、促进分解等机制抑制信号转导的活性的物质。作为JNK信号转导途径抑制物质，可列举例如：JNK抑制剂、Rac抑制剂、MKK抑制剂、MEK抑制剂、Src抑制剂、受体酪氨酸激酶(RTK)抑制剂、ASK抑制剂等，但不限于此。
作为c-Jun N末端激酶(JNK)抑制剂，可列举例如：JNK-IN-8((E)-3-(4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰胺)N-(3-甲基-4-((4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)苯甲酰胺)、SP600125(蒽[1-9-cd]吡唑-6(2H)-酮)、DB07268(2-[[2-[(3-羟苯基)氨基]-4-嘧啶基]氨基]苯甲酰胺)、Tanzisertib(反式-4-[[9-[(3S)-四氢-3-呋喃y1]-8-[(2，4，6-三氟苯基)氨基]-9H-嘌呤-2-基]氨基]环己醇)、Bentamapimod(1，3-苯并噻唑-2-基)[2-[[4-[(吗啉-4-基)甲基]苄基]氧]嘧啶-4-基]乙腈、TCS JNK 6o(N-(4-氨基-5-氰基-6-乙氧基-2-吡啶基)-2，5-二甲氧基苯乙酰胺)、SU3327(5-[(5-硝基-2-噻唑)硫基]-1，3，4-噻二唑-2-胺)、CEP1347((9S，10R，12R)-5-16-双[(乙基硫基)甲基]-2，3，9，10，11，12-六氢-10-羟基-9-甲基-1-氧代-9，12-环氧-1H-二吲哚并[1，2，3-fg：3’，2’，1’-k1]吡咯并[3，4-i][1，6]苯并二氮杂-10-羧酸甲酯)、c-JUN肽、AEG3482(6-苯基咪唑并[2，1-b]-1，3，4-噻二唑-2-磺酰胺)、TCS JNK 5a(N-(3-氰基-4，5，6，7-四氢苯并[b]噻吩基-2-基)-1-萘甲酰胺)、BI-78D3(4-(2，3-二氢-1，4-苯并二噁英-6-基)-2，4-二氢-5-[(5-硝基-2-噻唑)硫基]-3H-1，2，4-三唑-3-酮)、IQ-3(11H-茚并[1，2-b]喹喔啉-11-酮-(2-呋喃羰基)肟)、SR 3576(3-[4-[[[(3-甲基苯基)氨基]羰基]氨基]-1H-吡唑-1-基]-N-(3，4，5-三甲氧基苯基)苯甲酰胺)、IQ-1S(11H-茚并[1，2-b]喹喔啉-11-酮肟二盐)、JIP-1(153-163)、CC-401(3-[3-[2-(1-哌啶基)乙氧基]苯基]-5-(1H-1，2，4-三唑-5-基)-1H-吲唑二盐酸盐)、BI-87G3(2-(5-硝基噻唑-2-基硫基)苯并[d]噻唑)、AS601245(2-(1，3-苯并噻唑-2-基)-2-[2-(2-吡啶-3-基乙基氨基)嘧啶-4-基]乙腈)、CV-65(3，7-二甲基-1，9-二氢吡啶并[3，2-g]喹啉-2，5，8，10-四酮)、D-JNK1(CAS编号1445179-97-4)、ER-358063、ER-409903、ER-417258、CC-359((4S)-4-(2，4-二氟-5-嘧啶-5-基苯基)-4-甲基-5，6-二氢-1，3-噻嗪-2-胺)、CC-401(3-[3-(2-哌啶-1-基乙氧基)苯基]-5-(1H-1，2，4-三唑-5-基)-1H-吲唑)、CC-930(4-[[9-[(3S)-氧杂环戊烷-3-基]-8-(2，4，6-三氟苯胺基)嘌呤-2-基]氨基]环己-1-醇)、SB203580(4-[4-(4-氟苯基)-2-(4-甲基亚砜基苯基)-1H-咪唑-5-基]吡啶)及它们的衍生物等。这些物质可以单独或组合使用。上述化合物等具有作为JNK抑制剂的活性，这对于本领域技术人员而言是公知的(例如J Enzyme Inhib Med Chem.2020；35(1)：574-583.中记载的)。
作为Rac抑制剂，可列举例如：EHT1864(5-(5-(7-(三氟甲基)喹啉-4-基硫基)戊氧基)-2-(吗啉甲基)-4H-吡喃-4-酮双盐酸盐)、NSC23766(N6-[2-[[4-(二乙基氨基)-1-甲基丁基]氨基]-6-甲基-4-嘧啶基]-2-甲基-4，6-喹啉二胺基三盐酸盐)、EHop-016(N4-(9-乙基-9H-咔唑-3-基)-N2-[3-(4-吗啉基)丙基]-2，4-嘧啶二胺基)、1A-116(N-(3，5-二甲基苯基)-N’-[2-(三氟甲基)苯基]胍)、ZCL278(2-(4-溴-2-氯苯氧基)-N-(4-(N-(4，6-二甲基嘧啶-2-基)磺酰)苯基氨基甲硫酰基)乙酰胺)、MBQ-167(9-乙基-3-(5-苯基-1H-1，2，3-三唑-1-基)-9H-咔唑)、KRpep-2d(锕；[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(3R，8R，11S，14S，20S，23S，26S，29S，32S，35S，38S)-8-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-氨基-5-氨基甲酰胺基-1-氧代戊烷-2-基]氨基]-5-氨基甲酰胺基-1-氧代戊烷-2-基]氨基]-5-氨基甲酰胺基-1-氧代戊烷-2-基]氨基]-5-氨基甲酰胺基-1-氧代戊烷-2-基]氨基甲酰基]-29-[(2R)-丁烷-2-基]-20-(羧甲基)-26-(羟甲基)-23，32-双[(4-羟苯基)甲基]-35-(2-甲基丙基)-2，10，13，19，22，25，28，31，34，37-十氧代-11-丙-2-基-5，6-二硫基-1，9，12，18，21，24，27，30，33，36-十氮三环[36.3.0.014，18]戊烷-3-基]氨基]-5-氨基甲酰胺基-1-氧代戊烷-2-基]氨基]-5-氨基甲酰胺基-1-氧代戊烷-2-基]氨基]-5-氨基甲酰胺基-1-氧代戊烷-2-基]氨基]-5-氨基甲酰胺基-1-氧代戊烷-2-基]氮杂胺)、ARS-853(1-[3-[4-[2-[[4-氯-2-羟基-5-(1-甲基环丙基)苯基]氨基]乙酰基]-1-哌嗪基]-1-氮杂丁基]-2-丙烯-1-酮)、Salirasib(2-(((2E，6E)-3，7，11-三甲基十二碳-2，6，10-三烯-1-基)硫基)苯甲酸)、ML141(4-(5-(4-甲氧基苯基)-3-苯基-4，5-二氢吡唑-1-基)苯磺酰胺)及它们的衍生物等。这些物质可以单独或组合使用。上述化合物等具有作为Rac抑制剂的活性，这对于本领域技术人员而言是公知的(例如在Cancer research，2018，78.12：3101-3111.中记载)。
本发明中JNK信号转导途径抑制物质的添加期间，只要能发挥由人多潜能干细胞制备垂体组织的效率改善效果即可，但优选在后述步骤(2)中添加BMP信号转导途径作用物质的时刻就已经添加，从诱导分化开始72小时以内。更优选的JNK抑制剂的添加期间与诱导分化的开始是同时的。
在步骤(1’)的培养基中，优选还存在Wnt信号转导途径抑制物质。将此种第一步骤作为步骤(1)。即，步骤(1)是将多潜能干细胞在JNK信号转导途径抑制物质和Wnt信号转导途径抑制物质存在的条件下培养的第一步骤。
Wnt信号转导途径是指以Wnt家族、蛋白质为配体，主要以Frizzled为受体的信号转导途径。作为该信号转导途径，可列举：经典Wnt途径(Canonical Wnt pathway)、非经典Wnt途径(Non-Canonical Wnt pathway)等。经典Wnt途径由β-Catenin转导。作为非经典Wnt途径，可列举：Planar Cell Polarity(PCP)途径、Wnt/JNK途径、Wnt/Calcium途径、Wnt-RAP1途径、Wnt-Ror2途径、Wnt-PKA途径、Wnt-GSK3MT途径、Wnt-aPKC途径、Wnt-RYK途径、Wnt-mTOR途径等。在非经典Wnt途径中，存在着在除了Wnt以外的其它信号转导途径中也被活化的共用的信号转导因子，但在本发明中将所述JNK途径以外的这些因子也作为Wnt信号转导途径的构成因子，将针对这些因子的抑制物质也包括在Wnt信号转导途径抑制物质中。
Wnt信号转导途径抑制物质只要能抑制通过Wnt家族、蛋白质诱发的信号转导即可。抑制物质可以为核酸、蛋白质、低分子有机化合物的任一种。作为该物质，可列举例如：抑制Wnt的加工和向胞外的分泌的物质，直接作用于Wnt的物质(例如：蛋白质，抗体，适体等)，抑制编码Wnt的基因的表达的物质(例如反义寡核苷酸，siRNA，CRISPRi等等)，抑制Wnt受体和Wnt的结合的物质，抑制经由Wnt受体的信号转导引起的生理活性的物质。
作为Wnt信号转导途径抑制物质已知的蛋白质，可列举：属于分泌型卷曲相关蛋白(secreted Frizzled Related Protein，sFRP)类的蛋白质(sFRP1～5、Wnt抑制因子-1(WIF-1)、Cerberus)、属于Dickkopf(Dkk)类的蛋白质(Dkk1～4、Kremen)、APCDD1、APCDD1L、属于Draxin家族的蛋白质、IGFBP-4、Notum、属于SOST/Sclerostin家族的蛋白质等。
作为Wnt信号转导途径抑制物质，可以使用本领域技术人员而言众所周知的化合物。作为经典Wnt信号转导途径的抑制物质，可列举例如：Frizzled抑制剂、Dishevelled(Dvl)抑制剂、Tankyrase(TANK)抑制剂、酪蛋白激酶1抑制剂、连环蛋白反应性转录抑制剂、p300抑制剂、CREB-结合蛋白(CBP)抑制剂、BCL-9抑制剂、TCF降解诱导剂(Am J CancerRes.2015；5(8)：2344-2360)等。作为非经典Wnt途径的抑制物质，可列举例如：Porcupine(PORCN)抑制剂、钙离子/钙调素依赖性蛋白激酶II(CaMKII)抑制剂、TGF-β-活化激酶1(TAK1)抑制剂、Nemo-样激酶(NLK)抑制剂、LIM激酶抑制剂、雷帕霉素的哺乳动物靶标(mTOR)抑制剂、Rac抑制剂、c-Jun NH2-末端激酶(JNK)抑制剂、蛋白激酶C(PKC)抑制剂、甲硫氨酸氨基肽酶2(MetAP2)抑制剂、钙调磷酸酶(Calcineurin)抑制剂、活化T细胞的核因子(nuclear factor of activated T cells，NFAT)抑制剂、ROCK抑制剂等。另外，虽然未报道作用机制，但是作为Wnt信号转导途径抑制物质，可列举：KY02111(N-(6-氯-2-苯并噻唑)-3，4-二甲氧基苯丙酰胺)、KY03-I(2-(4-(3，4-二甲氧基苯基)丁酰胺)-6-碘苯并噻唑)。这些物质可以单独或组合使用。
作为PORCN抑制剂，可列举例如：IWP-2(N-(6-甲基-2-苯并噻唑)-2-[(3，4,6，7-四氢-4-氧代-3-苯基噻吩并[3，2-d]嘧啶-2-基)硫基]乙酰胺)、IWP-3(2-[[3-(4-氟苯基)-3，4，6，7-四氢-4-氧代噻吩并[3，2-d]嘧啶-2-基]硫基]-N-(6-甲基-2-苯并噻唑)乙酰胺)、IWP-4(N-(6-甲基-2-苯并噻唑)-2-[[3，4，6，7-四氢-3-(2-甲氧基苯基)-4-氧代噻吩并[3,2-d]嘧啶-2-基]硫基]乙酰胺)、IWP-L6(N-(5-苯基-2-吡啶基)-2-[(3,4,6,7-四氢-4-氧代-3-苯基噻吩并[3,2-d]嘧啶-2-基)硫基]乙酰胺)、IWP-12(N-(6-甲基-2-苯并噻唑)-2-[(3,4,6,7-四氢-3,6-二甲基-4-氧代噻吩并[3,2-d]嘧啶-2-基)硫基]乙酰胺)、IWP-O1(1H-1,2，3-三唑-1-乙酰胺，5-苯基-N-(5-苯基-2-吡啶基)-4-(4-吡啶基)-)、LGK-974(2-(2’，3-二甲基-2，4’-联吡啶-5-基)N-(5-(吡嗪-2-基)吡啶-2-基)乙酰胺)、Wnt-C59(2-[4-(2-甲基吡啶-4-基)苯基]-N-[4-(吡啶-3-基)苯基]乙酰胺)、ETC-131、ETC-159(1，2，3，6-四氢-1，3-二甲基-2，6-二氧代-N-(6-苯基-3-哒嗪基)-7H-嘌呤-7-乙酰胺)、GNF-1331(N-(6-甲氧基-1，3-苯并噻唑-2-基)-2-[(4-丙基-5-吡啶-4-基-1，2，4-三唑-3-基)硫烷基]乙酰胺)、GNF-6231(N-[5-(4-乙酰基-1-哌嗪基)-2-吡啶基]-2’-氟-3-甲基[2，4’-联吡啶]-5-乙酰胺)、Porcn-IN-1(N-[[5-氟-6-(2-甲基吡啶-4-基)吡啶-3-基]甲基]-9H-咔唑-2-甲酰胺)、RXC004、CGX1321及它们的衍生物等。这些物质可以单独或组合使用。
Wnt信号转导途径抑制物质优选为包含选自由PORCN抑制剂、KY02111和KY03-I组成的组中的至少一种，更优选包含PORCN抑制剂。Wnt信号转导途径抑制物质也优选包含具有相对于Wnt的非经典Wnt途径的抑制活性的物质。Wnt信号转导途径抑制物质为更优选包含具有相对于Wnt/Planar Cell Polarity(PCP)途径的抑制活性的物质。本发明中使用的PORCN抑制剂优选包含选自由IWP-2、IWP-3、IWP-4、IWP-L6、IWP-12、LGK-974、Wnt-C59、ETC-159和GNF-6231组成的组中的至少一种，更优选包含IWP-2或Wnt-C59，进一步优选包含IWP-2。
培养基中的Wnt信号转导途径抑制物质的浓度，可以根据在能够达到上述效果的范围内使用的物质适当地设定。从提高构成垂体的细胞的制备效率的观点出发，例如在作为Wnt信号转导途径抑制物质使用为PORCN抑制剂IWP-2的一种的情况下，该浓度通常为约10nM～约50μM，优选为约10nM～约30μM，进一步优选为约100nM～约10μM，最优选为约0.5μM。在使用为PORCN抑制剂的一种的Wnt-C59的情况下，该浓度通常为约10pM～约1μM，优选为约100pM～约500nM，更优选为约50nM。在KY02111使用的情况下，该浓度通常为约10nM～约50μM，优选为约10nM～约30μM，更优选为约100nM～约10μM，进一步优选为约5μM。在使用除了上述以外的Wnt信号转导途径抑制物质的情况下，优选地以赋予与上述浓度的Wnt信号等同的转导途径抑制活性的浓度使用。
在第一步骤(步骤(1)或步骤(1’))的培养基中，优选还存在TGFβ信号转导途径抑制物质。作为用于第一步骤的TGFβ信号转导途径抑制物质，可以使用与步骤(a)中例示的相同的那些。步骤(a)及第一步骤的TGFβ信号转导途径抑制物质可以相同也可以不同，优选相同。
培养基中的TGFβ信号转导途径抑制物质的浓度，可以根据在能够达到上述效果的范围内使用的物质适当地设定。在作为TGFβ信号转导途径抑制物质使用SB431542的情况下，通常以约lnM～约100μM，优选为约10nM～约100μM，更优选为约100nM～约50μM，进一步优选为约500nM～约10μM的浓度使用。另外，在使用除了SB431542以外的TGFβ信号转导途径抑制物质的情况下，优选地以赋予与上述浓度的SB431542等同的TGFβ信号转导途径抑制活性的浓度使用。
在第一步骤及后续步骤中，从抑制向中内胚层分化和提高外胚层、基板样组织的制备效率的观点出发，也优选添加针对转化生长因子-β-活化激酶1(TAK1)的抑制物质。TAK1是介导通过TGFβ、骨形成蛋白质(BMP)、白细胞介素1(IL-1)、TNF-α等激活的信号转导的MAP激酶激酶激酶(MAPKKK)家族的丝氨酸苏氨酸蛋白激酶。
TAK1抑制物质只要能抑制TAK1介导的信号转导即可。可以为核酸、蛋白质、低分子有机化合物的任一种。作为该物质，可列举例如：抑制TAK1与底物结合的物质、抑制TAK1磷酸化的物质、促进TAK1去磷酸化的物质、抑制TAK1转录或翻译的物质、促进TAK1分解的物质等。
作为TAK1抑制物质，可列举例如：(5Z)-7-氧代玉米烯醇((3S，5Z，8S，9S，11E)-3，4，9，10-四氢-8，9，16-三羟基-14-甲氧基-3-甲基-1H-2-苯并氧杂环十四烷-1，7(8H)-二酮)、N-Des(氨基羰基)AZ-TAK1抑制剂(3-氨基-5-[4-(4-吗啉基甲基)苯基]-2-噻吩甲酰胺)、Takinib(N1-(1-丙基-1H-苯并咪唑-2-基)-1，3-苯二甲酰胺)、NG25(N-[4-[(4-乙基-1-哌嗪基)甲基]-3-(三氟甲基)苯基]-4-甲基-3-(1H-吡咯并[2，3-b]吡啶-4-基氧)-苯甲酰胺三盐酸盐)、菝葜皂苷元(Sarsasapogenin)及它们的衍生物、类似物。这些物质可以单独或组合使用。
TAK1抑制物质优选为(5Z)-7-氧代玉米烯醇((5Z)-7-Oxozeaenol)。在作为第一步骤中的TAK1抑制物质使用(5Z)-7-氧代玉米烯醇的情况下，通常以约1nM～约100μM，优选为约10nM～约50μM，更优选为约100nM～约25μM，进一步优选为约500nM～约10μM的浓度使用。另外，在使用除了(5Z)-7-氧代玉米烯醇以外的TAK1抑制物质的情况下，优选地以赋予与上述浓度的(5Z)-7-氧代玉米烯醇等同的TAK1抑制活性的浓度使用。TAK1抑制活性可以通过例如Cell chemical biology 24.8(2017)：1029-1039.中记载的激酶分析等手段进行确定。从控制垂体组织中含有的细胞的比例的观点出发，上述TAK1抑制物质可以在第一步骤及后续步骤的任意阶段添加，然后去除。作为优选的一个方面，在后述步骤(b)开始时添加上述TAK1抑制物质。
用于第一步骤的培养基没有特别限制，只要是上文提及的定义部分记载的那些即可。用于第一步骤的培养基可以是血清培养基或无血清培养基。从避免化学上未确定的成分混入的观点出发，在本发明中优选使用无血清培养基。为了避免复杂的制备，例如优选使用：适量添加了市售的KSR等血清代替物的无血清培养基。关于向无血清培养基中的KSR的添加量，例如在人ES細胞的情况下，通常为约1％～约30％、优选为约2％～约20％。作为无血清培养基，可列举例如：在IMDM和F-12的1：1的混合液中添加了5％KSR、450μM 1-一硫代甘油和1x化学成分确定的脂质浓缩物的培养基、或在GMEM中添加了5％～20％KSR、NEAA、丙酮酸和2-巯基乙醇的培养基。
在第一步骤开始时，细胞可以是黏附状态或悬浮状态的任一种。作为优选的一个方面，将多潜能干细胞分散成单一细胞后再聚集，形成悬浮状态的细胞聚集体。因此，在第一步骤开始之前，对于多潜能干细胞，作为一个示例，优选进行将步骤(a)中得到的多潜能干细胞分散成单一细胞的操作。通过分散操作得到的“分散细胞”优选为单一细胞，但可以包括例如由2个以上100个以下的少量细胞组成的细胞团，也可以包括由2个以上50个以下的细胞组成的细胞团。“分散细胞”可以包含例如7成以上单一细胞和3成以下细胞团，优选包含8成以上单一细胞和2成以下细胞团。
作为使多潜能干细胞的分散方法，可列举：机械分散处理、细胞分散液处理和添加细胞保护剂的处理，这些处理可以联合进行。作为使细胞分散的方法，优选在添加细胞保护剂的处理同时进行细胞分散液处理，然后进行机械分散处理即可。
作为用于添加细胞保护剂的处理的细胞保护剂，可列举：FGF信号转导途径作用物质、肝素、Rho-相关蛋白激酶(ROCK)抑制物质、肌球蛋白抑制物质、聚胺类、整合应激反应(Integrated stress response：ISR)抑制剂、半胱天冬酶抑制剂、细胞黏附促进物质、血清、或血清代替物。作为优选的细胞保护剂，可列举ROCK抑制物质。为了抑制由分散诱导的多潜能干细胞(特别是人多潜能干细胞)的细胞死亡，也可以从第一步骤培养开始时添加ROCK抑制物质。作为ROCK抑制物质，可列举：Y-27632((R)-(+)-反式-4-(1-氨基乙基)-N-(4-吡啶基)环己烷甲酰胺，二盐酸盐)、Fasudil(HA1077)(1-(5-异喹啉磺酰基)高哌嗪，盐酸盐)、H-1152(5-[[(2S)-六氢-2-甲基-1H-1，4-二氮杂-1-基]磺酰基]-4-甲基-异喹啉，二盐酸盐)、HA-1100(Hydroxyfasudil)(1-(1-羟基-5-异喹啉磺酰基)高哌嗪，盐酸盐)、Chroman 1((3S)-N-[2-[2-(二甲基氨基)乙氧基]-4-(1H-吡唑-4-基)苯基]-6-甲氧基-3，4-二氢-2H-色烯-3-甲酰胺)、Belumosudil(KD025、2-[3-[4-[(1H-吲唑-5-基)氨基]喹唑啉-2-基]苯氧基]-N-异丙基乙酰胺)、HSD1590([2-甲氧基-3-(4，5，10-三氮杂四环[7.7.0.02，6.012，16]十六碳-1(9)，2(6)，3，7，10，12(16)-己烯-11-基)苯基]硼酸)、CRT0066854((S)-3-苯基-N1-(2-吡啶-4-基-5，6，7，8-四氢苯并[4，5]噻吩并[2，3-d]嘧啶-4-基)丙烷-1，2-二胺)、RKI1447(1-(3-羟基苄基)-3-(4-(吡啶-4-基)噻唑-2-基)脲)、Ripasudil(4-氟-5-[[(2S)-六氢-2-甲基-1H-1，4-二氮杂-1-基]磺酰基]异喹啉)、GSK269962A(N-[3-[2-(4-氨基-1，2，5-噁二唑-3-基)-1-乙基咪唑并[4，5-c]吡啶-6-基]氧苯基]-4-(2-吗啉-4-基乙氧基)苯甲酰胺)、GSK429286A(N-(6-氟-1H-吲唑-5-基)-2-甲基-6-氧代-4-(4-(三氟甲基)苯基)-1，4，5，6-四氢吡啶-3-甲酰胺)、Y-33075((R)-4-(1-氨基乙基)N-1H-吡咯并[2，3-b]吡啶-4-基苯甲酰胺)、LX7101(N，N-二甲基氨基甲酸3-[[[4-(氨基甲基)-1-(5-甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-4-哌啶基]羰基]氨基]苯酯)、AT13148((αS)-α-(氨基甲基)-α-(4-氯苯基)-4-(1H-吡唑-4-基)苯乙醇)、SAR407899(6-(哌啶-4-基氧)异喹啉-1(2H)-酮盐酸盐)、GSK180736A(4-(4-氟苯基)N-(1H-吲唑-5-基)-6-甲基-2-氧代-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-甲酰胺)、羟基法舒地尔(1-(1-羟基-5-异喹啉磺酰基)高哌嗪，HCl)、bdp5290(4-氯-1-(4-哌啶基)N-[3-(2-吡啶基)-1H-吡唑-4-基]-1H-吡唑-3-甲酰胺)、sr-3677(N-[2-[2-(二甲基氨基)乙氧基]-4-(1H-吡唑-4-基)苯基]-2，3-二氢一1，4-苯并二噁英-2-甲酰胺盐酸盐)、CCG-222740(N-(4-氯苯基)-5，5-二氟-1-(3-(呋喃-2-基)苯甲酰)哌啶-3-甲酰胺)、ROCK抑制剂-2(N-[(1R)-1-(3-甲氧基苯基)乙基]-4-吡啶-4-基苯甲酰胺)、Rho-激酶-IN-1(N-[1-[(4-甲基硫烷基苯基)甲基]哌啶-3-基]-1H-吲唑-5-胺)、ZINC00881524(N-(4，5-二氢萘并[1，2-d]噻唑-2-基)-2-(3，4-二甲氧基苯基)乙酰胺)、SB772077B((3S)-1-[[2-(4-氨基-1，2，5-噁二唑-3-基)-1-乙基-1H-咪唑并[4，5-c]吡啶-7-基]羰基]-3-吡咯烷胺二盐酸盐)、Verosudil(N-(1，2-二氢-1-氧代-6-异喹啉)-α-(二甲基氨基)-3-噻吩乙酰胺)、GSK-25(4-(4-氯-2-氟苯基)-2-(2-氯吡啶-4-基)-1-(6-氟-1H-吲唑-5-基)-6-甲基-4H-嘧啶-5-甲酰胺)及它们的衍生物等。作为细胞黏附促进物质，可列举例如：adhesamine和adhesamine-RGDS衍生物(长濑产业公司制)等。作为细胞保护剂，也可以使用制作好的细胞保护剂。作为制作好的细胞保护剂，可列举例如：RevitaCell补充物(由Thermo Fisher Scientific公司制)、CloneR、CloneR2(由StemcellTechnologies公司制)等。这些物质可以单独或组合使用。在第一步骤中，在作为细胞保护剂添加为ROCK抑制物质的Y-27632的情况下，将其添加到培养环境中，使其浓度通常为约10nM～约10mM，优选为约100nM～约1mM，更优选为约1μM～约100μM。在第一步骤中，在作为细胞保护剂添加为ROCK抑制物质的Chroman 1的情况下，将其添加到培养环境中，使其浓度通常为约10pM～约1mM，优选为约100pM～约100μM，更优选为约1nM～约10μM。
关于用于细胞分散液处理的细胞分散液，可列举包含胰蛋白酶、胶原酶、透明质酸酶、弹性蛋白酶、链霉蛋白酶、DNA酶、木瓜蛋白酶等酶和乙二胺四乙酸等螯合剂中的至少一种的溶液。也可以使用市售的细胞分散液，例如TripLE Select(由Thermo FisherScientific公司制)或TripLE Express(由Thermo Fisher Scientific公司制)、Accumax(由Innovative Cell Technologies公司制)。在步骤(a)之后得到的多潜能干细胞的处理中优选细胞分散液为添加了5mM的EDTA的磷酸缓冲液(PBS)，但不限于此。
作为机械分散处理的方法，可列举吹打处理或利用刮刀的刮片操作。分散的细胞悬浮在上述培养基中。
作为使多潜能干细胞分散的方法，可列举将多潜能干细胞的集群在ROCK抑制物质的存在下用乙二胺四乙酸或Accumax处理，进一步通过吹打使其分散的方法。
第一步骤中悬浮培养实施时，将分散的多潜能干细胞的悬浊液播种在非细胞黏附性的培养器材中。当培养器材是非黏附性时，细胞被悬浮培养，多个多潜能干细胞集合形成细胞聚集体。
悬浮培养时，可以通过将经分散的多潜能干细胞接种在诸如10cm平皿的比较大的培养器材中，从而在1个培养器材中同时形成多个细胞聚集体，但从不易产生每个细胞聚集体的大小的偏差的观点出发，优选在例如非细胞黏附性的96孔微量滴定板的这样的多孔板(U底，V底)的各孔中播种一定数量的经分散的多潜能干细胞。将其静置培养时，细胞迅速凝聚，从而在各孔中形成1个细胞聚集体。例如，通过在培养器材的表面涂上超亲水性聚合物等加工，可以使培养器材具有非细胞黏附性。作为非细胞黏附性多孔板，可列举例如：PrimeSurface 96V底板(MS-9096V，住友BakeLite公司制)等。可以进行离心操作以更快地形成细胞聚集体。可以从多个孔中回收在各孔中形成的细胞聚集体，由此得到均一的细胞聚集体群。如果细胞聚集体均匀，在随后的步骤中，可以使每个孔及每次重复实验的制造效率更稳定，可以制造再现性更好地构成垂体的细胞。
作为从分散的多潜能干细胞形成细胞聚集体的另一个实施方案，可以使用一个孔被分成多个微孔并且形成2个以上细胞团块的培养器材。换言之，在本实施的一个侧面，将所述第一步骤、第二步骤、b步骤、及第三步骤的任意一个以上的步骤，在形成至少1个孔的培养器材中实施，所述孔被分成多个微孔，实施悬浮培养，使得每个所述微孔形成1个细胞团，可以制作相当于每个孔分割的微孔的数量的细胞团。作为上述微孔，也可以使用在底面上细胞沉降到一处促进聚集体形成的研钵、向下的四棱锥、凹状等的加工、形成多个格栅、隆起等的培养器材，或者为了容易形成聚集体，只对底面的一部分进行了细胞可黏附加工的培养器材等。具有微孔的培养器材的每个孔的培养面积没有特别限定，但从有效生产细胞团的观点出发，优选底面积大于1cm2(相当于48孔板)，更优选大于2cm2(相当于24孔板)，进一步优选大于4cm2(相当于12孔板)。作为上述培养器材，可列举例如：胚样体形成板AggreWell(StemCell Technologies公司制)、PAMCELL(ANK公司制)、球状体微板(Coming公司制)、NanoCulture Plate/Dish(Organogenix公司制)Cell-able(东洋合成公司制)、EZSPHERE(AGCTECHNO GLASS公司制)、SPHERICALPLATE 5D(水户工业公司制)、TASCL(Cymssbio公司制)、微孔袋(例如，Scientific reports，2022，12.1：1-11.中记载的)等，但不限于此。
作为培养器材，也优选使用三维细胞培养容器，该三维细胞培养容器能够在每个孔中保持细胞聚集体的状态下一次更换整板培养基。作为这种三维细胞培养容器，可列举例如：PrimeSurface 96有缝孔板(住友BakeLite公司制)等在该板上，在96孔的各个上部设置有培养基可以进出的细开口部(狭缝)。由于狭缝设定在细胞聚集体不易通过的宽度，可以一次性更换整板培养基，同时防止细胞聚集体相互粘连，提高操作效率和细胞聚集体的质量。
第一步骤中的多潜能干细胞的浓度可以适当设定，使得细胞聚集体更加均匀、有效地形成。例如当使用96孔微孔板人悬浮培养多潜能干细胞(例如从步骤(a)得到的人iPS细胞)时，将配置使得每孔通常为约1×103～约1×105细胞，优选为约3×103～约5×104细胞，更优选为约4×103～约2×104细胞，进一步优选为约4×103～约1.6×104细胞，特别优选为约8×103～约1.2×104细胞的液体添加于孔中，将板静置而形成细胞聚集体。例如当使用每平皿具有约260个微孔的培养器材EZSPHERE SP平皿35mm Type905悬浮培养人多潜能干细胞(例如从步骤(a)得到的人iPS细胞)时，将配置使得每平皿通常为约1×104～约1×108细胞，优选为约3×104～约5×107细胞，更优选为约4×104～约2×107细胞，进一步优选为约4×104～约1.6×107细胞，特别优选为约8×104～约1.2×107细胞的液体添加于平皿中，将平皿静置而形成细胞聚集体。例如当使用每孔具有约1800个微孔的培养器材AggreWell 800，6-孔板悬浮培养人多潜能干细胞(例如从步骤(a)得到的人iPS细胞)时，将配置使得每孔通常为约1×104～约1×108细胞，优选为约3×104～约5×107细胞，更优选为约4×104～约2×107细胞，进一步优选为约4×104～约1.6×107细胞，特别优选为约8×104～约1.2×107细胞的液体添加于孔中，将板离心而形成细胞聚集体。细胞数量可以通过在血细胞计算盘中计数来获得。
对用于形成细胞的聚集体所必需的悬浮培养的时间而言，能够根据使用的多潜能干细胞而适当确定，但为了形成均一的细胞的聚集体，优选为尽可能短的时间。从经分散的细胞到形成细胞聚集体的步骤可分为：细胞发生汇聚的步骤；及汇聚的细胞形成细胞聚集体的步骤。对从接种经分散的细胞的时刻(即悬浮培养开始时)到细胞发生汇聚而言，例如：在为人多潜能干细胞(例如，人iPS细胞)的情况下，优选为约24小时以内，更优选为约12小时以内。在从接种经分散的细胞的时刻(即悬浮培养开始时)到形成细胞聚集体，例如：在为人多潜能干细胞(人iPS细胞)的情况下，优选在约72小时以内，更优选为约48小时以内。到形成凝集体的时间可通过调整进行细胞凝集的器具、离心条件等而适宜调节。
如果通过迅速汇集多潜能干细胞而形成细胞聚集体，可以以良好的重现性在由所形成的聚集体诱导和分化的细胞中形成上皮样结构。作为形成细胞的聚集体的实验操作，可列举例如：使用小孔的板(例如：孔的底面积用平底换算时为0.1～2.0cm2左右的板)、微孔等将细胞控制在小空间中的方法，通过使用小的离心管进行短时间离心而使细胞聚集的方法。作为小孔的板，可列举例如：24孔板(面积用平底换算时为1.88cm2左右)、48孔板(面积用平底换算时为1.0cm2左右)、96孔板(面积用平底换算时为0.35cm2左右，内径6～8mm左右)、384孔板。优选地，可列举96孔板。关于小孔的板的形状，从上方看孔时底表面的形状可列举为多边形、长方形、椭圆形、正圆形，优选为正圆形。作为小孔的板的形状，从侧面看孔时的底表面的形状优选为外周部高而内凹部低的下凹结构，可列举为例如：U型底，V型底，M型底、优选为U型底或V型底，最优选可列举为V型底。作为小孔的板，也可以使用细胞培养皿(例如：60mm～150mm平皿，培养瓶)的底表面具有凹凸或齿状的那些。小孔的板的底表面优选使用非细胞黏附性底表面，优选经非细胞黏附性包被的底表面。
作为形成细胞聚集体的另一方法，也优选使用立体印刷机、3D打印机。通过将分散的单一细胞，或由多个细胞构成的球状体悬浮在具有生物相容性的墨水(生物墨水)中，通过生物3D打印机(例如Cellink公司制BIOX等)输出，或者将细胞群扎进针并堆起来(Cyfuse公司制Spike等)的方法，可以制备出所需形式的细胞群。
细胞聚集体的形成可以根据细胞聚集体的大小和细胞数量、宏观形态、组织染色分析的微观形态及其均一性、分化和未分化标记的表达及其均一性、分化标记的表达调控及其同步性、分化效率在聚集体间的重现性等进行判断。
在第一步骤开始时，作为优选的一个方面，实施贴壁培养。可以将步骤(a)后的培养器材上的多潜能干细胞直接用于第一步骤，也可以将多潜能干细胞分散成单一细胞后再播种到黏附性的培养器材中。在实施将多潜能干细胞分散成单一细胞后的再播种时，可以使用适当细胞外基质或合成细胞黏附分子作为构架。可以通过构架在表面进行了涂覆的培养器材中贴壁培养多潜能干细胞。细胞外基质优选基质胶或层粘连蛋白。作为合成细胞黏附分子，可列举：聚-D-赖氨酸、包含RGD序列等细胞黏附性的结构域的合成肽等。作为细胞的播种数，只要产生向垂体的分化就没有特别限定，但从再现细胞间黏附和相互作用的观点出发，也优选在向培养器材播种后72小时内，细胞密度达到相当于器材培养空间的6成以上的半汇合的密度。
作为黏附性的培养器材，也优选使用具有微图案的培养器材。培养器材上的微图案可以由细胞黏附性区和细胞非黏附性区构成，优选在细胞黏附性区贴壁培养细胞。细胞黏附性区和细胞非黏附性区的形状没有限制，只要能在培养器材上展开即可。细胞黏附性区和细胞非黏附性区可以在一个培养器材上形成单个区域，也可以形成多个。细胞黏附性区优选人工处理，以提高黏附性。作为具有微图案的培养器材，可列举例如：CYTOOchip(由CYTOO公司制)、ibidi Micropatterning(由ibidi公司制)等。也可以使用PDMS制模具和基质等制作培养器材。或者，使用细胞加工装置(Model：CPD-017，片冈制造所制)等利用激光对涂覆有细胞外基质、促进细胞黏附的基质等的培养器材进行加工，可以将细胞黏附性区域和细胞非黏附性区域制成任意形状。当将步骤(a)中得到的多潜能干细胞在具有微图形的培养器上进行培养时，例如，可以参考先前报道的方法实施(Nature protocols，11(11)，2223-2232.)。
培养器材也优选具有用于灌注培养基的流路(微流路)，并且可以在第一步骤和随后步骤中在灌注环境下培养细胞。这种培养器材也称为微流体芯片。培养器材(例如微流体芯片)可以通过流路与培养在本发明的制造方法中培养的细胞以外的细胞或组织的其他培养装置(例如微流体芯片)连接。由此，可以再现垂体与其他细胞或组织的相互作用。作为与垂体共培养的其它细胞或组织，可列举：受垂体分泌激素调节的组织、促进垂体生长、分化、成熟、生存的组织、例如脑、血管、骨骼、肌肉、脂肪、甲状腺、肝脏、肾上腺、睾丸、卵巢、乳房的细胞或组织等，但不限于此。作为用于培养基灌注的方法，可列举例如：使用磁搅拌器，蠕动泵等，但不限于此。
培养器材可以具有能够透过氧气或培养基的膜。培养器材可以形成化合物、生长因子等的浓度梯度。膜例如为多孔膜。在具有这种膜的培养器材中，可以利用本发明的制备方法，在被膜隔开的一侧培养细胞，在另一侧培养其它细胞或组织、饲养细胞等。由此，可以在不污染构成垂体的细胞或其前体细胞和包含这些的细胞群、其它细胞或组织的情况下培养。
在第一步骤及后续步骤中，当进行培养基更换操作时，可列举例如：不丢弃原有培养基且加入新培养基的操作(添加培养基操作)，弃掉半量左右(原有培养基的体积量的30～90％左右，例如40～60％左右)的原有培养基且加入半量左右(原有培养基的体积量的30～90％，例如40～60％左右)的新培养基的操作(半量培养基更换操作)，弃掉全量左右(原有培养基的体积量的90％以上)的原有培养基并加入全量左右(原有培养基的体积量的90％以上)的新培养基的操作(全量培养基更换操作)。
当在特定时间点添加特定成分时，可以进行例如在计算终浓度的基础上，丢弃半量左右的原有培养基，并加入半量左右的含有比最终浓度还高的特定的成分的新培养基的操作(半量培养基更换操作)。当通过在特定时间点稀释而降低原有培养基中包含的成分的浓度时，例如，可以每天多次进行培养基更换操作，优选在1小时内进行多次(例如，2-3次)。此外，当通过在特定时间点进行稀释而降低原有培养基中包含的成分的浓度时，可以将细胞或细胞聚集体转移到另一个培养容器中。培养基更换操作中使用的工具没有特别限制，可列举例如：移液管、微量移液管(PIPETMAN)(注册商标)、多通道微量移液管(MULTICHANNEL PIPETMAN)、连续的分配器等。例如，使用96孔板作为培养容器的情况下，可以使用多通道微量移液管。
第一步骤中的培养的时间通常为8小时～6天左右，优选为12小时～60小时左右。
在第一步骤及后续步骤中，从提高垂体的制备效率的观点出发，也优选添加促进向基板区域的分化的化合物。作为具有如上所述的作用的化合物，可列举例如美国专利US20160326491A1号中记载的BRL-54443，菲咯啉(Phenanthroline)，银胶菊内酯(Parthenolide)等。作为促进向基板区域的分化的化合物而使用BRL-54443时，通常以约10nM～100μM，使用菲咯啉时通常以约10nM～100μM，使用银胶菊内酯时通常以约10nM～100μM的浓度使用。
在第一步骤中，从改善对垂体的诱导分化效率的观点出发，也可以在Sonichedgehog信号转导途径作用物质存在的条件下实施培养。作为用于第二步骤的Shh信号转导途径作用物质，可以使用与步骤(a)中例示的相同的那些。步骤(a)及第一步骤的Shh信号转导途径作用物质可以相同也可以不同，优选相同，另外优选SAG。
培养基中的Shh信号转导途径作用物质的浓度，可以根据在能够达到上述效果的范围内使用的物质适当地设定。在第一步骤中作为Shh信号转导途径作用物质使用SAG的情况下，通常以约1nM～约3μM，优选为约10nM～约2μM，更优选为约30nM～约1μM，进一步优选为约50nM～约500nM的浓度使用。
<步骤(2)>：第二步骤
步骤(2)是在BMP信号转导途径作用物质和Sonic hedgehog信号转导途径作用物质存在的条件下，培养第一步骤得到的细胞群。在第一步骤中悬浮培养细胞时，在步骤(2)中继续悬浮培养形成的细胞聚集体即可。在第一步骤中贴壁培养细胞时，在步骤(2)中继续贴壁培养细胞即可。在第一步骤中悬浮培养细胞后，可以在步骤(2)中贴壁培养。
BMP信号转导途径作用物质是指可以增强通过BMP介导的信号转导途径的物质。能够增强通过BMP介导的信号转导途径的物质，可列举例如：稳定培养环境中的BMP配体并提高滴度的物质；与I型BMP受体ALK-1、ALK-2、ALK-3、ALK-6结合并激活、诱发受体的下游细胞内信号转导的物质；诱发参与细胞内BMP信号转导的Smad-1、Smad-5、Smad-8、Smad-9的磷酸化的物质；通过Smad-1/5/8/9诱导和增强基因转录的激活或抑制等功能的物质。作为BMP信号转导途径作用物质，可列举例如：BMP2、BMP4或BMP7等BMP蛋白质、GDF5、6、7等GDF蛋白质、抗BMP受体抗体和BMP部分肽等。这些物质可以单独或组合使用。作为从生物学活性的观点出发的BMP信号转导途径作用物质的定义，可列举例如：具有对小鼠前驱软骨细胞系ATDC5、小鼠颅冠来源细胞系MC3T3-E1、小鼠横纹肌来源细胞系C2C12等细胞诱导分化向成骨细胞样细胞的能力、以及诱导产生碱性磷酸酶的能力的物质。作为具有上述活性的物质，可列举例如：BMP2、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP9、BMP10、BMP13/GDF6、BMP14/GDF5、GDF7等。
BMP2蛋白质及BMP4蛋白质可获自例如R&D Systems，BMP7蛋白质可获自例如Biolegend公司，GDF5蛋白质可获自例如PeproTech公司，GDF6蛋白质可获自例如Prime-a-Gene公司，GDF7蛋白质可获自例如富士胶片和光纯药株式会社。BMP信号转导途径作用物质优选包含选自由BMP2、BMP4、BMP7、BMP13和GDF7组成的组中的至少1个蛋白质，更优选包含BMP4。
培养基中的BMP信号转导途径作用物质的浓度，可以根据在能够达到上述效果的范围内使用的物质适当地设定。从提高构成垂体的细胞的制备效率的观点出发，在作为BMP信号转导途径作用物质使用BMP4的情况下，通常以约1pM～约100nM，优选为约10pM～约50nM，更优选为约25pM～约25nM，进一步优选为约25pM～约5nM，特别优选为约100pM～约5nM，最优选为约500pM～约2nM的浓度使用。另外，在使用除了BMP4以外的BMP信号转导途径作用物质的情况下，优选地以赋予与上述浓度的BMP4等同的BMP信号转导途径促进活性的浓度使用。本领域技术人员在使用市售的重组BMP蛋白等作为BMP信号转导途径作用物质时，通过比较产品附件中描述的活性，例如对小鼠前驱软骨细胞系ATDC5诱导产生碱性磷酸酶的能力的ED50等值与上述BMP4的浓度和活性，可以很容易地确定所添加的BMP转导途径作用物质的浓度。
作为BMP信号转导途径作用物质，也可以使用本领域技术人员众所周知的化合物。作为BMP信号转导途径作用物质，可列举例如：Smurf1抑制物质、Chk1抑制物质、磷酸化Smad稳定物质等。作为具有上述活性的化合物，可列举例如：A-01([4-[[4-氯-3-(三氟甲基)苯基]磺酰基]-1-哌嗪基][4-(5-甲基-1H-吡唑-1-基)苯基]甲酮)、PD 407824(9-羟基-4-苯基-吡咯并[3，4-c]咔唑-1，3(2H，6H)-二酮)、SB4(2-[[(4-溴苯基)甲基]硫基]苯并噁唑)、SJ000291942(2-(4-乙基苯氧基)N-(4-氟-3-硝基苯基)-乙酰胺)及它们的衍生物等。
作为用于步骤(2)的Shh信号转导途径作用物质，可以使用与步骤(a)中例示的相同的那些。步骤(a)和步骤(2)的Shh信号转导途径作用物质，根据情况，步骤(1)的Shh信号转导途径作用物质可以相同也可以不同，优选相同，另外优选SAG。
培养基中的Shh信号转导途径作用物质的浓度，可以根据在能够达到上述效果的范围内使用的物质适当地设定。在步骤(2)中作为Shh信号转导途径作用物质使用SAG的情况下，通常以约1nM～约5μM，优选为约10nM～约4.5μM，更优选为约50nM～约4μM，进一步优选为约100nM～约3μM的浓度使用。
步骤(2)中使用的培养基没有特别限定，只要包含Shh信号转导途径作用物质和BMP信号转导途径作用物质即可。作为步骤(2)中使用的培养基，可列举第一步骤中列举的培养基。
从提高垂体的制备效率的观点出发，步骤(2)的开始时期，从第一步骤中的培养开始起优选为0.5小时以后6天以内，更优选为0.5小时以后72小时以内，进一步优选为24小时以后60小时以内。在实施悬浮培养时，在Wnt信号途径抑制物质存在下，在上述时期开始步骤(2)，细胞聚集体的表面形成有非神经上皮样的组织，极其有效地形成垂体。
在第一步骤中进行悬浮培养时，从提高构成垂体的细胞的制备效率的观点出发，步骤(2)的开始时期优选在第一步骤中形成的细胞聚集体的表层中的1成以上，更优选为3成以上，进一步优选为5成以上的细胞相互形成紧贴结合的时期。细胞聚集体中是否形成紧贴结合，本领域技术人员例如通过显微镜观察、采用抗ZO-1抗体的免疫染色等方法可以容易地辨别。
在步骤(2)中BMP信号转导途径作用物质存在的条件下开始培养，可以使用进行了第一步骤的培养容器，进行上述的培养基更换操作(如添加培养基的操作、半量培养基更换操作、全量培养基更换操作等)，也可以将细胞转移到另一个培养容器中。
步骤(2)中在包含BMP信号转导途径作用物质的培养基中的培养的时期可以适当设定。步骤(2)中的培养的时间通常为8小时以上，优选为10小时以上，更优选为12小时以上，进一步优选为14小时以上，最优选为16小时以上。
步骤(2)中在包含Shh信号转导途径作用物质的培养基中的培养的时期可以适当设定。此外，步骤(1)中的悬浮培养进一步在Shh信号转导途径作用物质存在的条件下实施时，从提高垂体激素(特别是ACTH)分泌能力的观点出发，步骤(1)和步骤(2)中在Shh信号转导途径作用物质存在的条件下的培养期间优选为30天。
在步骤(2)及后续步骤中，从促进向垂体基板的分化的观点出发，也优选将FGF信号转导途径作用物质添加到培养环境中。FGF信号转导途径作用物质没有特别限定，只要是可以增强通过FGF(成纤维细胞生长因子)介导的信号转导途径的物质即可。作为FGF信号转导途径作用物质，可列举例如：FGF1、FGF2(也称为bFGF)、FGF3、FGF8、FGF10等FGF蛋白质、抗FGF受体抗体、FGF部分肽等。这些物质可以单独或组合使用。
FGF2蛋白质和FGF8蛋白质例如可获自富士胶片和光纯药株式公司。FGF信号转导途径作用物质优选包含选自由FGF2、FGF3、FGF8和FGF10、以及它们的变体组成的组中的至少一种，更优选包含FGF2，进一步优选包含重组人FGF2。
培养基中的FGF信号转导途径作用物质的浓度，可以根据在能够达到上述效果的范围内使用的物质适当地设定。从促进向构成垂体的细胞的分化和细胞的生存与增殖的观点出发，在作为FGF信号转导途径作用物质使用FGF2的情况下，通常以约1pg/ml～约100μg/ml，优选为约10pg/ml～约50μg/ml，更优选为约100pg/ml～约10μg/ml，进一步优选为约500pg/ml～约1μg/ml，最优选为约1ng/ml～约200ng/ml的浓度使用。另外，在使用除了FGF2以外的FGF信号转导途径作用物质的情况下，优选地以赋予与上述浓度的FGF2等同的FGF信号转导途径促进活性的浓度使用。关于添加物质的FGF信号转导途径促进活性，可以通过使用例如3T3细胞的细胞增殖试验等方法进行测定。
出于从维持培养基中的FGF蛋白质的活性的目的，也优选在包含FGF蛋白质的培养基中添加肝素，硫酸乙酰肝素。肝素作为钠盐，可获自富士胶片和光纯药株式公司。培养基中的肝素或硫酸乙酰肝素的浓度，可以在能够达到上述效果的范围内适当设定。培养基中的肝素钠的浓度通常为约1ng/ml～约100mg/ml，优选为约10ng/ml～约50mg/ml，更优选为约100ng/ml～约10mg/ml，进一步优选为约500ng/ml～约1mg/ml，最优选为约1μg/ml～约200μg/ml。在使用硫酸乙酰肝素的情况下，优选为具有与上述浓度的肝素相同的FGF蛋白质保护的活性的浓度。出于在37℃等的细胞培养环境中维持FGF蛋白质的活性的目的，也优选使用例如在美国专利US8772460B2号中记载的热稳定性FGF2等FGF的变体、生物分解性聚合物上结合FGF2的StemBeads FGF2等FGF2缓释珠。热稳定性FGF2可从例如HumanZyme公司获得。StemBeads FGF2可从例如StemCulture公司获得。
步骤(2)及后续步骤中的FGF信号转导途径作用物质的添加时期可以适当设定。作为优选的一个方面，在添加步骤(2)的BMP信号转导途径作用物质6小时以后，更优选12小时以后，进一步优选18小时以后，添加FGF信号转导途径作用物质。
在步骤(2)中，也优选继续添加步骤(a)或第一步骤中使用的添加物，例如JNK信号转导途径抑制物质、Wnt信号转导途径抑制物质、TGFβ信号转导途径抑制物质、TAK1抑制物质等。步骤(2)中添加的JNK信号转导途径抑制物质、Wnt信号转导途径抑制物质或TGFβ信号转导途径抑制物质可以不同于以前步骤中使用的物质，但优选相同。添加物的浓度和种类可以适当调整。这些物质的添加时期可以与步骤(2)的开始同时，也可以不同。
<步骤(b)>：b步骤
步骤(b)是在BMP信号转导途径抑制物质的添加条件下，培养步骤(2)中得到的细胞群。在步骤(2)中悬浮培养细胞时，在步骤(b)中继续悬浮培养形成的细胞聚集体即可。在步骤(2)中贴壁培养细胞时，在步骤(b)中继续贴壁培养细胞即可。
BMP信号转导途径抑制物质只要能抑制通过BMP家族、蛋白质诱发的信号转导即可。可以为核酸、蛋白质、低分子有机化合物的任一种。作为该物质，可列举例如：抑制BMP的加工和向胞外的分泌的物质，直接作用于BMP的物质(例如：蛋白质，抗体，适体等)，抑制编码BMP的基因的表达的物质(例如反义寡核苷酸，siRNA)，BMP受体和BMP的结合的物质，抑制经由BMP受体的信号转导引起的生理活性的物质。BMP受体中存在I型BMP受体与II型BMP受体，作为I型BMP受体已知的有BMPR1A、BMPR1B、ACVR，作为II型BMP受体已知的有TGF-betaR-II、ActR-II、ActR-IIB、BMPR2、MISR-II。
作为BMP信号转导途径抑制物质而已知的蛋白质，可列举例如：Noggin、Chordin、Follistatin、Gremlin、Inhibin、Twisted Gastrulation、Coco、属于DAN家族的分泌蛋白质等。从在上述步骤(2)中培养液中添加BMP信号转导途径作用物质，由此更有效地抑制以后的BMP信号转导途径的观点出发，关于步骤(，b)中的BMP信号转导途径抑制物质，优选包含在抑制细胞外的BMP的分泌的之后的信号转导途径的物质，例如抑制BMP受体与BMP的结合的物质，利用BMP受体而抑制由信号转导引起的生理活性的物质等，更优选包含I型BMP受体的抑制剂。
作为BMP信号转导途径抑制物质，也可以使用本领域技术人员众所周知的化合物。作为BMP信号转导途径抑制物质，可列举例如：I型BMP受体的抑制物质。作为具有上述活性的化合物，可列举例如：K02288(3-[(6-氨基-5-(3，4，5-三甲氧基苯基)-3-吡啶基]苯酚)、Dorsomorphin(6-[4-[2-(1-哌啶基)乙氧基]苯基]-3-(4-吡啶基)吡唑并[1，5-a]嘧啶)、LDN-193189(4-[6-[4-(1-哌嗪基)苯基]吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-基]喹啉二盐酸盐)、LDN-212854(5-[6-[4-(1-哌嗪基)苯基]吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-基]喹啉)、LDN-214117(1-(4-(6-甲基-5-(3，4，5-三甲氧基苯基)吡啶-3-基)苯基)哌嗪)、ML347(5-[6-(4-甲氧基苯基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-基]喹啉)、DMH1(4-(6-(4-异丙氧基苯基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-基)喹啉)、DMH2(4-[6-[4-[2-(4-吗啉基)乙氧基]苯基]吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-基]-喹啉)、化合物1(3-(1，2，3-苯并噻二唑-6-基)-1-[2-(环己-1-烯-1-基)乙基]脲)、VU0465350(7-(4-异丙氧基苯基)-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1，2-a]吡啶)、VU0469381(5-(6-(4-甲氧基苯基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-基)喹诺酮)、OD36(4-氯-7，10-二氧杂-13，17，18，21-四氮杂四环[12.5.2.12，6.017，20]二十二碳六烯酸-1(20)，2(22)，3，5，14(21)，15，18-庚烯)、OD52、E6201((3S，4R，5Z，8S，9S，11E)-14-(乙基氨基)-8，9，16-三羟基-3，4-二甲基-3，4，9，10-四氢-1 H-苯并[c][1]氧杂环十四烷-1，7(8H)-二酮)、Saracatinib(N-(5-氯-1，3-苯并二氧代醇-4-基)-7-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基]-5-(氧代烷-4-基氧)喹唑啉-4-胺)、BYL719((2S)-1-N-[4-甲基-5-[2-(1，1，1-三氟-2-甲基丙烷-2-基)吡啶-4-基]-1，3-噻唑-2-基]吡咯烷-1，2-二甲酰胺)等。这些物质可以单独或组合使用。
BMP信号转导途径抑制物质优选为I型BMP受体抑制剂，更优选包含选自由K02288、Dorsomorphin、LDN-193189、LDN-212854、LDN-214117、ML347、DMH1和DMH2组成的组中的至少一种，进一步优选包含K02288至LDN-193189。
培养基中的BMP信号转导途径抑制物质的浓度，可以根据在能够达到上述效果的范围内使用的物质适当地设定。从垂体组织的形成效率的观点出发，在作为步骤(b)中的BMP信号转导途径抑制物质使用K02288的情况下，通常以约1nM～约100μM，优选为约10nM～约50μM，更优选为约100nM～约50μM，进一步优选为约500nM～约25μM的浓度使用。在作为BMP信号转导途径抑制物质使用LDN-193189的情况下，通常以约1nM～约100μM，优选为约10nM～约10μM，更优选为约25nM～约1μM，进一步优选为约100nM～约500nM的浓度使用。在作为BMP信号转导途径抑制物质使用LDN-212854的情况下，通常以约1nM～约100μM，优选为约10nM～约10μM，更优选为约25nM～约5μM，进一步优选为约250nM～约3μM的浓度使用。在作为BMP信号转导途径抑制物质使用ML347的情况下，通常以约1nM～约100μM，优选为约10nM～约50μM，更优选为约100nM～约50μM，进一步优选为约1μM～约25μM的浓度使用。在作为BMP信号转导途径抑制物质使用DMH2的情况下，通常以约1nM～约100μM，优选为约10nM～约10μM，更优选为约25nM～约5μM，进一步优选为约250nM～约3μM的浓度使用。另外，在使用除了K02288以外的BMP信号转导途径抑制物质的情况下，优选地以赋予与上述浓度的K02288等同的BMP信号转导途径抑制活性的浓度使用。
关于实施步骤(2)后开始步骤(b)的时期，可以适当设定。开始步骤(b)的时期通常为开始步骤(2)后8小时以上、15天以内，优选为10小时以上、12天以内，更优选为12小时以上、9天以内，进一步优选为14小时以上、8天以内，最优选为16小时以上、7天以内。
在步骤(2)及后续步骤中，可以通过在培养基中添加肾上腺皮质激素类，利用肾上腺皮质激素类处理细胞群。通过肾上腺皮质激素类处理，可促进从垂体基板和/或拉特克囊分化为除了ACTH产生细胞以外的垂体激素产生细胞(即，GH产生细胞、PRL产生细胞、TSH产生细胞、LH产生细胞、FSH产生细胞等)。作为肾上腺皮质激素类，可列举：羟基可的松，乙酸可的松，醋酸氟氢可的松等天然糖皮质激素；地塞米松、倍他米松、泼尼松龙、甲基泼尼松龙、去炎松等人工合成的糖皮质激素等，但不限于这些。
对培养基中的肾上腺皮质激素类的浓度没有特别限定，只要可促进从垂体基板和/或拉特克囊分化为垂体激素产生细胞(但是ACTH产生细胞除外)即可，另外，可以根据肾上腺皮质激素类的种类适当设定。例如在羟基可的松的情况下，通常为100ng/ml以上，优选1μg/ml以上。只要对垂体激素产生细胞(但ACTH产生细胞除外)的分化没有不利影响，羟基可的松的浓度就没有上限值，但是从培养成本的观点出发，通常为1000μg/ml以下，优选为100μg/ml以下。在一个方式中，培养基中羟基可的松的浓度通常为约100ng/ml～约1000μg/ml，优选为约1～约100μg/ml。作为肾上腺皮质激素类，使用地塞米松时，该培养基中的浓度可以是羟基可的松的1/25左右。
在步骤(2)及后续步骤中，在培养基中添加肾上腺皮质激素类的时期没有特别限定，只要可促进从垂体基板和/或拉特克囊分化为垂体激素产生细胞(但是ACTH产生细胞除外)即可，可以从第二步骤开始时向培养基中添加肾上腺皮质激素类，也可以在第二步骤开始后，在没有添加肾上腺皮质激素类的培养基中培养一定期间之后在培养基中添加肾上腺皮质激素类。优选地，开始第二步骤后，在细胞群中确认ACTH产生细胞的出现的阶段，在培养基中添加肾上腺皮质激素类。即，在当细胞凝聚团块中确认到ACTH产生细胞的出现之前，将细胞凝聚团块在没有添加肾上腺皮质激素类的培养基中培养，当确认到ACTH产生细胞的出现后，在包含肾上腺皮质激素类的培养基中继续进行第二步骤至后续步骤。ACTH产生细胞的出现，可以使用针对ACTH的抗体通过免疫组织学染色进行确认。在使用人多潜能干细胞的情况下，由于通常只要是从第一步骤开始30天以后就可以期待ACTH产生细胞的出现，因此在一种实施方式中，在第一步骤开始30天以后，在培养基中添加肾上腺皮质激素类。
关于将细胞凝聚团块用肾上腺皮质激素类处理的时期没有特别限定，只要可促进从垂体基板和/或拉特克囊分化为垂体激素产生细胞(但是ACTH产生细胞除外)即可，通常，与肾上腺皮质激素类非处理组相比，在肾上腺皮质激素类处理组中确认到促进分化为垂体激素产生细胞(但是ACTH产生细胞除外)之后，将细胞凝聚团块在肾上腺皮质激素类中处理。处理时期通常为7天以上，优选为12天以上。对处理时期的上限值没有特别限定，与肾上腺皮质激素类非处理组相比，在肾上腺皮质激素类处理组中，也可以在确认到分化为垂体激素产生细胞(但是ACTH产生细胞除外)的促进的阶段从培养基中除去肾上腺皮质激素类。
在步骤(2)及后续步骤中，从促进向垂体的分化和向生长激素产生细胞的分化的观点出发，也优选在维甲酸信号转导途径作用物质存在的条件下进行。作为维甲酸转导途径作用物质，可列举例如：与维甲酸受体(RAR)或类视黄醇X受体(RXR)结合，并激活下游转录的物质等。作为具有上述作用的化合物，可列举例如全反式维甲酸、异维甲酸、9-顺式维甲酸、TTNPB(4-[(E)-2-[(5，5，8，8-四甲基-5，6，7，8-四氢萘)-2-基]-1-丙烯基]苯甲酸)、Ch55(4-[(E)-3-(3，5-二-叔丁基苯基)-3-氧代-1-丙烯基]苯甲酸)、EC19(3-[2-(5，6，7，8-四氢-5，5，8，8-四甲基-2-萘基)乙炔基]苯甲酸)、EC23(4-[2-(5，6，7，8-四氢-5，5，8，8-四甲基-2-萘基)乙炔基]-苯甲酸)、Fenretinide(4-羟基苯基维他酰胺)、Acitretin((all-e)-9-(4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯基)-3，7-二甲基-2，4，6，8-壬四烯)、Trifarotene、Adapalene、AC 261066(4-[4-(2-丁氧基乙氧基-)-5-甲基-2-噻唑]-2-氟苯甲酸)、AC55649(4-正辛基联苯-4-羧酸)、AM 580(4-[(5，6，7，8-四氢-5，5，8，8-四甲基-2-萘基)甲酰胺]苯甲酸)、AM80(4-[(5，5，8，8-四甲基-6，7-二氢萘-2-基)氨基甲酰基]苯甲酸)、BMS 753(4-[[(2，3-二氢-1，1，3，3-四甲基-2-氧代-1H-茚-5-基)羰基]氨基]苯甲酸)、BMS 961(3-氟-4-[(r)-2-羟基-2-(5，5，8，8-四甲基-5，6，7，8-四氢-萘-2-基)-乙酰基氨基]-苯甲酸)、CD1530(4-(6-羟基-7-三环[3.3.1.13，7]十二-1-基-2-萘基)苯甲酸)、CD2314(5-(5，6，7，8-四氢-5，5，8，8-四甲基-2-蒽基)-3-噻吩羧酸)、CD437(2-萘羧酸，6-(4-羟基-3-三环(3.3.1.1(3，7))癸-1-基苯))、CD271(6-[3-(1-金刚烷基)-4-甲氧基苯基]-2-萘羧酸)及它们的衍生物等。这些物质可以单独或组合使用。
在步骤(2)及后续步骤中的维甲酸转导途径作用物质优选包含全反式维甲酸至EC23。培养基中的维甲酸转导途径作用物质的浓度没有特别限定，只要在能够达到上述效果的范围内即可，在作为维甲酸转导途径作用物质而使用EC23的情况下，例如EC23的浓度为约10pM～约30μM，优选为约100pM～约20μM，更优选为约10nM～约10μM，进一步优选为约100nM～约5μM。在使用除了EC23以外的维甲酸转导途径作用物质的情况下，优选地以赋予与上述浓度的EC23等同的维甲酸转导途径作用活性的浓度使用。
从调节分化趋势的观点出发，也优选在Notch信号转导途径抑制物质存在的条件下进行步骤(2)及后续步骤。在本发明中，Notch信号转导途径表示通过为在细胞膜上表达的受体的Notch蛋白质与在相邻细胞的膜上表达的Notch配体(Delta、Jagged等)的直接相互作用而被活化的信号转导途径。在有Notch信号传递的细胞中，Notch蛋白质逐步受到加工，在膜上被切出的细胞内结构域被运输向核内而控制下游基因的表达。
Notch信号转导途径抑制物质没有特别限定，只要能抑制通过Notch介导的信号转导即可。可以为核酸、蛋白质、低分子有机化合物的任一种。作为所述物质，可列举例如：功能缺失型的Notch受体及配体，抑制Notch的加工(S1切割)的物质，抑制Notch及Notch配体的糖链修饰的物质，抑制细胞膜转移的物质，抑制Notch的细胞内结构域(NICD)的加工(S2切割，S3切割)的物质(γ分泌酶抑制剂)，分解NICD的物质，抑制NICD依赖性地转录的物质等。
作为Notch信号转导途径抑制物质，也可以使用本领域技术人员众所周知的化合物。作为具有作为Notch信号转导途径抑制物质的活性的化合物，可列举例如：DAPT(N-[N-(3，5-二氟苯乙酰基)-1-丙氨酰基]-S-苯基甘氨酸叔丁酯)、DBZ((2S)-2-[[2-(3，5-二氟苯基)乙酰基]氨基]-N-[(7S)-5-甲基-6-氧代-7H-苯并[d][1]苯并氮杂-7-基]丙酰胺)、MDL28170(苄基N-[(2S)-3-甲基-1-氧代-1-[[(2S)-1-氧代-3-苯基丙-2-基]氨基]丁烷-2-基]氨基甲酸酯)、FLI-06(环已基2，7，7-三甲基-4-(4-硝基苯基)-5-氧代-1，4，6，8-四氢喹啉-3-羧酸酯)、L-685，458(叔丁基N-[6-[[1-[(1-氨基-1-氧代-3-苯基丙-2-基)氨基]-4-甲基-1-氧代戊烷-2-基]氨基]-5-苄基-3-羟基-6-氧代-1-苯基己-2-基]氨基甲酸酯)、CB-103(6-(4-叔丁基苯氧基)吡啶-3-胺)及它们的衍生物等，以及Onco Targets Ther.2013；6：943-955.中记载的物质等。Notch信号转导途径抑制物质优选包含DAPT。
培养基中的Notch信号转导途径抑制物质的浓度没有特别限定，只要是在能够实现上述效果的范围内即可，但是例如在作为Notch信号转导途径抑制物质而使用DAPT的情况下，例如DAPT的浓度为约100pM～约50μM，优选为约1nM～约30μM，更优选为约100nM～约20μM，进一步优选为约1μM～约10μM。在使用除了DAPT以外的Notch信号转导途径抑制物质的情况下，优选地以赋予与上述浓度的DAPT等同的Notch信号转导途径抑制活性的浓度使用。
<步骤(3)>、<步骤(3’)>：第三步骤
第三步骤是在未添加Sonic hedgehog信号(Shh)转导途径作用物质的条件下，培养在步骤(2)或步骤(b)中培养的细胞群。将第二步骤得到的细胞群在Shh信号转导途径作用物质不存在的条件下培养，得到包含垂体组织的细胞群的第三步骤作为步骤(3)，将b步骤得到的细胞群在Shh信号转导途径作用物质不存在的条件下培养，得到包含垂体组织的细胞群的第三步骤作为步骤(3’)。在步骤(2)或步骤(b)中悬浮培养细胞时，在第三步骤中继续悬浮培养形成的细胞聚集体即可。在步骤(2)或步骤(b)中贴壁培养细胞时，在第三步骤中继续贴壁培养细胞即可。在步骤(2)或步骤(b)悬浮培养细胞后，可以在第三步骤中贴壁培养。
第三步骤中使用的培养基没有特别限定，只要不含有Shh信号转导途径作用物质即可。本步骤中的Shh信号转导途径作用物质的非添加条件是指有意将Shh信号转导途径作用物质添加到细胞群的培养环境中的条件，Shh信号转导途径作用物质因细胞群的自体分泌等非有意地包含在培养环境中时，也包含在Shh信号转导途径作用物质的非添加条件中。作为在第三步骤中使用的培养基，可列举第一步骤中列举的培养基或含有10％至20％的KSR的gfCDM培养基等。
第三步骤及后续步骤中，从促进构成垂体的细胞的生存和分化成熟的观点出发，也可以包括将细胞包埋在聚集体凝胶中培养的步骤。作为凝胶，可列举例如使用琼脂糖、甲基纤维素、胶原、基质胶等的凝胶，优选使用基质胶。
在第三步骤及后续步骤的凝胶中包埋培养细胞的步骤中，细胞聚集体可以直接包埋，也可以将分散和分离后的细胞播种在凝胶中。可以使用细胞分类仪等分取基底细胞等特定的细胞种后进行播种。作为包埋在凝胶中的培养方法的另一方式，也可以与成纤维细胞、间充质细胞、血管系的细胞等垂体以外的细胞进行共培养。上述凝胶包埋培养可以参照例如Nature501，373-379(2013)，Nature，499，481-484(2013)，Nat Protoc 14，518-540(2019)，Genes 2020，11，603等实施。
在第三步骤及后续步骤中，为了改善对细胞的营养和氧供给，以及改善物质交换，也优选实施细胞物理摇动的培养方法。作为这种培养方法，可列举振荡培养、旋转培养、搅拌培养等静置培养以外的方法。振荡培养、旋转培养、搅拌培养等用于实施的手段没有特别限定，但是，可以通过例如将培养细胞的培养器材设置在转子、振荡器等中，或将细胞置于搅拌器等旋转的环境下来实施。振荡培养、旋转培养、搅拌培养的速度等参数，本领域技术人员可以在不对细胞造成伤害的范围内适当设定。例如，当使用波动形摇动的3D振荡器(例如Mini-Shaker 3D，Biosan公司制)实施振荡培养时，振荡速度范围可以设定为例如5～60rpm，优选5～40rpm，更优选5～20rpm的范围。当使用往复式的振荡器(例如NS-LR，Asone公司制)实施振荡培养时，振荡速度范围可以设定为例如15～60rpm，优选15～50rpm，更优选15～45rpm的范围。当使用翘板式的振荡器(例如NS-S，Asone公司制)实施振荡培养时，振荡速度范围可以设定为例如例如5～50rpm，优选5～40rpm，更优选5～30rpm的范围。通过搅拌培养、旋转培养来培养细胞聚集体时，例如将旋转烧瓶(例如3152，Coming公司制)设置在磁性搅拌器上，以细胞聚集体目测不沉降的旋转数实施培养。也可以使用三维旋转悬浮培养装置(例如CellPet CUBE、J_TECH公司制；Clinostar、Celvivo公司制)实施培养。从抑制对细胞的摩擦等的物理伤害的观点出发，还优选将所述凝胶中包埋的细胞聚集体进行振荡培养、旋转培养或搅拌培养。
第三步骤及后续步骤中，从抑制细胞死亡，促进细胞的增殖的观点出发，也优选在高氧的气体氛围中培养。培养过程中的高氧条件可以通过例如将培养细胞的培养箱与氧泵连接，人工地供给氧而实现。用于所述目标的氧浓度通常为25％～80％，更优选为30％～60％。
在第三步骤及后续步骤中，从增加培养细胞聚集体的培养基中的氧供给量的观点出发，也可以使用气体交换效率高的培养器材。作为这样的培养器材的例子，可列举使细胞培养皿，板的底面为气体透过性的膜Lumox平皿(SARSTEDT株式会社制)，VECELL 96孔板(Vessel株式会社制)等。也优选与所述高氧浓度条件下的培养组合使用。
在第三步骤及后续步骤中，从维持细胞聚集体中的非神经上皮组织的结构的观点出发，可以将细胞保护剂添加到培养基中。作为第三步骤及后续步骤中使用的细胞保护剂，可列举：上述FGF信号转导途径作用物质、肝素、ROCK抑制物质、基膜制剂、肌球蛋白抑制物质、聚胺类、ISR抑制剂、半胱天冬酶抑制剂、血清、或血清代替物等。作为肌球蛋白抑制物质，可列举例如：非肌型肌球蛋白II ATP酶的抑制物质Blebbistatin、肌球蛋白轻链激酶(MLCK)的抑制物质ML-7、ML-9、W-7、MLCK抑制剂肽18及它们的衍生物等。添加的细胞保护剂可以与第一步骤中添加的不同，但优选相同。作为优选的细胞保护剂，可列举ROCK抑制物质。在第三步骤及后续步骤中，作为细胞保护剂在添加为ROCK抑制物质的Y-27632的情况下，将其添加到培养环境中，使其浓度通常为约10nM～约10mM，优选为约100nM～约1mM，更优选为约1μM～约100μM。在添加为ROCK抑制物质的Chroman 1的情况下，将其添加到培养环境中，使其浓度通常为约10pM～约1nM，优选为约100pM～约100μM，更优选为约1nM～约10μM。在作为细胞保护剂添加为非肌型肌球蛋白II ATP酶的抑制物质的Blebbistatin情况下，将其添加到培养环境中，使其浓度通常为约10nM～约10mM，优选为约100nM～约1mM，更优选为约1μM～约100μM。
在第三步骤及后续步骤中，也可以添加除了细胞保护剂以外的具有维持非神经上皮组织的结构的作用的物质。作为上述物质，可列举例如：促进细胞黏附的物质、促进基膜成分合成的物质、抑制基膜成分分解的物质等。促进细胞黏附的物质可以是促进细胞-细胞间的黏附、细胞-基膜间的黏附、细胞-培养器材间的黏附等任一种的物质，也可以是促进细胞黏附相关因子的产生的物质。作为促进细胞黏附的物质，可列举例如：adhesamine、adhesamine-RGDS衍生物、Pyrintegrin、生物素三肽-1(Biotin tripeptide-1)、乙酰基四肽-3(Acetyl Tetrapeptide-3)、RGDS肽及它们的衍生物等。作为促进基膜成分的合成的物质，可列举例如：抗坏血酸衍生物等。作为抗坏血酸衍生物，可列举例如：抗坏血酸磷酸钠、抗坏血酸磷酸镁、抗坏血酸2-葡糖苷、3-O-乙基抗坏血酸、四己基癸醇抗坏血酸酯、棕榈酸抗坏血酸酯、硬脂酸抗坏血酸酯、抗坏血酸-2磷酸-6棕榈酸、甘油酯辛基抗坏血酸等。作为抑制基膜成分分解的物质，可列举例如：基质金属蛋白酶和丝氨酸蛋白酶的抑制剂等。当添加作为促进基膜成分合成的物质的抗坏血酸衍生物的一种抗坏血酸2-磷酸时，将其添加到培养环境中，使其浓度通常为10μg/ml以上、1000μg/ml以下，优选为30μg/ml以上500μg/ml以下，进一步优选为50μg/ml以上300μg/ml以下。在添加其它抗坏血酸和抗坏血酸的衍生物等时，只要以与上述浓度和摩尔当量相同的方式添加即可。
在第三步骤及后续步骤中，从促进垂体细胞的生存观点出发，也优选添加具有减轻氧化应激作用的物质。作为具有上述活性的物质，可列举例如：抗氧化物质、具有自由基清除剂作用的物质、NADPH氧化酶抑制物质、环氧合酶抑制物质、脂氧合酶(LOX)抑制物质、超氧化物歧化酶(SOD)样物质、Nrf2活化剂等。作为具有上述活性的物质，可列举例如：抗坏血酸、N-乙酰-L-半胱氨酸、乙酸(±)-α-生育酚、Apocynin(4’-羟基-3’-甲氧基苯乙酮)、烟酰胺、牛磺酸(2-氨基乙磺酸)、IM-93(1-异丙基-3-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-4-(N，N-二甲基-1，3-丙二胺)-1H-吡咯-2，5H-二酮)、咖啡酸(3，4-二羟基肉桂酸)、雷公藤红素(3-羟基-24-去甲-2-氧代-1(10)，3，5，7-friedelatetraen-29-硅酸；雷公藤红素)、Ebselen(2-苯基-1，2-苯并异硒唑-3(2H)-酮)、(-)-Epigallocatechin Gallate((2R，3R)-2-(3，4，5-三羟苯基)-3，4-二氢-1[2H]-苯并吡喃-3，5，7-三醇-3-(3，4，5-三羟基苯甲酸酯))、EUK-8(N，N’-双(水杨亚氨基)乙烷-锰(II))、Edaravone(3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮)、MnTBAP(Mn(III)四(4-苯甲酸)卟啉氯)、去甲二氢愈创木酸、白藜芦醇(反式-3，4，5-三羟基二苯乙烯)及它们的衍生物等，但不限于此。也可以使用制作好的试剂(例如抗氧化补充剂，SigmaAldrich公司制，A1345)进行细胞培养。本发明中使用的具有减轻氧化应激作用的物质优选包含选自由抗坏血酸、N-乙酰基-L-半胱氨酸以及它们的衍生物组成的组中的至少一种。抗坏血酸(例如作为该衍生物抗坏血酸2磷酸)可以添加到培养基中，以约1nM～约1M，优选为约10nM～约100mM，更优选为约100nM～约10mM，进一步优选为约1μM～约3mM的浓度，N-乙酰基-L-半胱氨酸例如为约1nM～约1M，优选为约10nM～约100mM，更优选为约100nM～约10mM，进一步优选为约1μM～约5mM的浓度添加。
在第三步骤及后续步骤中，从促进垂体细胞的生存的观点出发，也优选添加针对应激反应信号转导途径的抑制物质(抑制针对应激的细胞内信号转导机制的物质)。应激反应性MAP激酶途径(stress-activated protein kinase：SAPK)是针对应激的细胞内信号转导机制的主要机制之一。作为应激反应性MAP激酶途径的抑制剂，可列举例如：MAP3K抑制剂、MAP2K抑制剂、ASK抑制剂、MEK抑制剂、Akt抑制剂、Rho家族激酶抑制剂、JNK抑制剂、p38抑制剂、MSK抑制剂、STAT抑制剂、NF-κB抑制剂、CAMK抑制剂等。
作为MEK抑制剂，可列举例如：Selumetinib(AZD6244，6-(4-溴-2-氯苯胺基)-7-氟N-(2-羟基乙氧基)-3-甲基苯并咪唑-5-甲酰胺)、Mirdametinib(PD0325901，N-[(2R)-2，3-二羟基丙氧基]-3，4-二氟-2-(2-氟-4-碘苯氨基)苯甲酰胺)、Trametinib(GSK1120212，N-[3-[3-环丙基-5-(2-氟-4-碘苯氨基)-6，8-二甲基-2，4，7-三氧基吡啶并[4，3-d]嘧啶-1-基]苯基]乙酰胺)、U0126(1，4-二氨基-2，3-二氰基-1，4-双(2-氨基苯基硫基)丁二烯)、PD184352(CI-1040，2-(2-氯-4-碘苯氨基)N-(环丙基甲氧基)-3，4-二氟苯甲酰胺)、PD98059(2-(2-氨基-3-甲氧基苯基)色烯-4-酮)、BIX 02189(3-[N-[3-[(二甲基氨基)甲基]苯基]-C-苯基碳酰亚胺基]-2-羟基-N,N-二甲基-1H-吲哚-6-甲酰胺)、Pimasertib(AS-703026，N-[(2S)-2，3-二羟基丙基]-3-(2-氟-4-碘苯氨基)吡啶-4-甲酰胺)、Pelitinib(EKB-569，(E)-N-[4-(3-氯-4-氟苯胺基)-3-氰基-7-乙氧基喹啉-6-基]-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰胺)、BIX 02188(3-[N-[3-[(二甲基氨基)甲基]苯基]-C-苯基碳酰亚胺基]-2-羟基-1H-吲哚-6-甲酰胺)、TAK-733(3-[(2R)-2，3-二羟基丙基]-6-氟-5-(2-氟-4-碘苯氨基)-8-甲基吡啶并[2，3-d]嘧啶-4，7-二酮)、AZD8330(2-(2-氟-4-碘苯氨基)N-(2-羟基乙氧基)-1，5-二甲基-6-氧吡啶-3-甲酰胺)、Binimetinib(MEK162，6-(4-溴-2-氟苯胺基)-7-氟-N-(2-羟基乙氧基)-3-甲基苯并咪唑-5-甲酰胺)、SL-327((Z)-3-氨基-3.-(4-氨基苯基)硫烷基-2-[2-(三氟甲基)苯基]丙-2-烯腈)、Refametinib(RDEA119，N-[3，4-二氟-2-(2-氟-4-碘苯氨基)-6-甲氧基苯基]-1-[(2S)-2，3-二羟基丙基]环丙烷-1-磺酰胺)、GDC-0623(5-(2-氟-4-碘苯氨基)-N-(2-羟基乙氧基)咪唑并[1，5-a]吡啶-6-甲酰胺)、BI-847325(3-[3-[N-[4-[(二甲基氨基)甲基]苯基]-C-苯基碳酰亚胺基]-2-羟基-1H-吲哚-6-基]-N-乙基丙-2-炔胺)、RO5126766(CH5126766，3-[[3-氟-2-(甲基磺酰氨基)吡啶-4-基]甲基]-4-甲基-7-嘧啶-2-氧基色-2-酮)、Cobimetinib(GDC-0973，[3，4-二氟-2-(2-氟-4-碘苯氨基)苯基]-[3-羟基-3-[(2S)-哌啶-2-基]氮杂丁基-1-基]甲酮)及它们的衍生物等。
作为p38抑制剂，可列举例如：SB203580(4-[4-(4-氟苯基)-2-(4-甲基亚砜基苯基)-1H-咪唑-5-基]吡啶)、Doramapimod(BIRB 796，1-[5-叔丁基-2-(4-甲基苯基)吡唑-3-基]-3-[4-(2-吗啉-4-基乙氧基)萘-1-基]脲)、SB202190(FHPI，4-[4-(4-氟苯基)-5-吡啶-4-基-1H-咪唑-2-基]苯酚)、Ralimetinib dimesylate(5-[2-叔丁基-4-(4-氟苯基)-1H-咪唑-5-基]-3-(2，2-二甲基丙基)咪唑并[4，5-b]吡啶-2-胺；甲磺酸)、VX-702(6-(N-氨基甲酰基-2，6-二氟苯胺基)-2-(2，4-二氟苯基)吡啶-3-甲酰胺)、PH-797804(3-[3-溴-4-[(2，4-二氟苯基)甲氧基]-6-甲基-2-氧吡啶-1-基]-N，4-二甲基苯甲酰胺)、Neflamapimod(VX-745，5-(2，6-二氯苯基)-2-(2，4-二氟苯基)硫烷基嘧啶并[1，6-b]哒嗪-6-酮)、TAK-715(N-[4-[2-乙基-4-(3-甲基苯基)-1，3-噻唑-5-基]吡啶-2-基]苯甲酰胺)、PD 169316(4-[4-(4-氟苯基)-2-(4-硝基苯基)-1H-咪唑-5-基]吡啶)、TA-02(4-[2-(2-氟苯基)-4-(4-氟苯基)-1H-咪唑-5-基]吡啶)、SD0006(1-[4-[3-(4-氯苯基)-4-嘧啶-4-基-1H-吡唑-5-基]哌啶-1-基]-2-羟乙酮)、Pamapimod(6-(2，4-二氟苯氧基)-2-(1，5-二羟基戊烷-3-基氨基)-8-甲基吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮)、BMS-582949(4-[5-(环丙基氨基甲酰基)-2-甲基苯胺基]-5-甲基N-丙基吡咯并[2，1-f][1，2，4]三嗪-6-甲酰胺)、SB239063(4-[4-(4-氟苯基)-5-(2-甲氧基嘧啶-4-基)咪唑-1-基]环己-1-醇)、Skepinone-L(13-(2，4-二氟苯胺基)-5-[(2R)-2，3-二羟基丙氧基]三环[9.4.0.03，8]十五碳-1(11)，3(8)，4，6，12，14-己烯-2-酮)、DBM 1285(N-环丙基-4-[4-(4-氟苯基)-2-哌啶-4-基-1，3-噻唑-5-基]嘧啶-2-胺；二盐酸盐)、SB 706504(1-氰基-2-[2-[[8-(2，6-二氟苯基)-4-(4-氟-2-甲基苯基)-7-氧吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基]氨基]乙基]胍)、SCIO 469(2-[6-氯-5-[(2R，5S)-4-[(4-氟苯基)甲基]-2，5-二甲基哌嗪-1-羰基]-1-甲基吲哚-3-基]-N，N-二甲基-2-氧代乙酰胺)、Pexmetinib(1-[5-叔丁基-2-(4-甲基苯基)吡唑-3-基]-3-[[5-氟-2-[1-(2-羟基乙基)吲唑-5-基]氧苯基]甲基]脲)、UM-164(2-[[6-[4-(2-羟基乙基)哌嗪-1-基]-2-甲基嘧啶-4-基]氨基]N-[2-甲基-5-[[3-(三氟甲基)苯甲酰]氨基]苯基]-1，3-噻唑-5-甲酰胺)、p38MAPK抑制剂(4-(2，4-二氟苯基)-8-(2-甲基苯基)-7-氧化-1，7-萘啶-7-鎓)、p38MAP激酶抑制剂III(4-[5-(4-氟苯基)-2-甲基硫烷基-1H-咪唑-4-基]-N-(1-苯基乙基)吡啶-2-胺)、p38 MAP激酶抑制剂IV(3，4，6-三氯-2-(2，3，5-三氯-6-羟苯基)磺酰基苯酚)、CAY105571(4-[5-(4-氟苯基)-2-[4-(甲基磺酰基)苯基]-1H-咪唑-4-基]-吡啶)及它们的衍生物等。
作为JNK抑制剂，可列举例如与第一步骤中记载的相同的药物。在本发明中使用的抑制针对应激的细胞内信号转导机制的物质，优选为选自由MEK抑制剂、p38抑制剂、JNK抑制剂组成的组中的一种以上。在作为p38抑制剂使用SB203580的情况下，可以以通常为约1nM～约1mM，优选为约10nM～约100μM，更优选为约100nM～约10μM，进一步优选为约500nM～约5μM的浓度添加到培养基中。MEK抑制剂作为PD0325901使用的情况下，可以以通常为约1nM～约1mM，优选为约10nM～约100μM，更优选为约100nM～约10μM，进一步优选为约500nM～约5μM的浓度添加到培养基中。在作为JNK抑制剂使用JNK-IN-8使用的情况下，可以以与第一步骤中记载的浓度相同的浓度添加到培养基中。在使用其它MEK抑制剂、p38抑制剂、JNK抑制剂的情况下，优选以具有与上述抑制剂的添加浓度等同的抑制活性的浓度添加。
3.包含垂体组织的细胞群
本发明提供包含垂体组织的细胞群，特别是包含1)神经系统细胞或神经组织、2)垂体组织、和3)间充质细胞的细胞群。以下也称为本发明的细胞群。本发明的细胞群优选可以通过上述本发明的制备方法制备。
本发明的细胞群中的1)神经系统细胞或神经组织优选为中枢神经系统的细胞或组织，或其前体组织，作为中枢神经系统的细胞或组织可列举视网膜、大脑皮质、间脑(例如，下丘脑)及源自这些组织的细胞，更优选为间脑(下丘脑)或其前体组织，进一步优选为在组织中具有脑室样的结构的间脑或其前体组织。1)神经系统细胞或神经组织例如为N-cadherin阳性的神经上皮组织。
本发明的细胞群中的2)垂体组织优选为与非神经上皮组织连续地形成，进一步优选1)神经系统细胞或神经组织及3)间充质细胞中的至少一个被非神经上皮组织及垂体组织包覆。
上述非神经上皮组织也优选为口腔上皮或其前体组织。垂体组织优选包含垂体激素产生细胞或作为其前体细胞的垂体前体细胞，优选包含垂体干细胞，优选包含滤泡星状细胞，进一步优选包含垂体激素产生细胞、垂体前体细胞、垂体干细胞、滤泡星状细胞中的全部。作为垂体激素产生细胞，可列举例如选自由生长激素(GH)产生细胞、催乳素(PRL)产生细胞及促肾上腺皮质激素(ACTH)产生细胞组成的组中的至少一种。
也优选在垂体组织中形成有垂体小生境，垂体小生境也优选为垂体前叶和中叶之间残留的残留腔周边的MCL小生境样的结构，垂体小生境也优选为实质层小生境样的结构，进一步优选一起包含MCL小生境样的结构和实质层小生境样的结构。
本发明的细胞群中的3)间充质细胞优选为头部间充质细胞。
对3)间充质细胞而言，优选在包覆细胞群表面的非神经上皮组织与存在于细胞群的内侧的1)神经系统细胞或神经组织之间存在。
本发明的细胞群例如1)神经上皮组织内部形成脑室样空泡，与该空泡接触的1)神经上皮组织面为Ezrin，PKC-zeta阳性的顶端面。
本发明的细胞群中包含的3)间充质细胞表达选自由例如巢蛋白，波形蛋白，Cadherin-11，层粘连蛋白，CD44，CD90及CD105组成的组中的至少一种间充质细胞标记。
本发明中可包含的非神经上皮组织表达选自由例如细胞角蛋白，E-cadherin及EpCAM组成的组中的至少一种非神经上皮组织标记。
本发明的细胞群中可包含的垂体干细胞表达选自由例如Sox2、Sox9、E-cadherin、巢蛋白、S100β、GFRα2、Prop1、CD133、β-连环蛋白、Klf4、Oct4、Pax6、柯萨奇病毒-腺病毒共同受体(CXADR)、PRRX1/2、Ephrin-B2及ACE组成的组中的至少一种垂体干细胞标记。本发明的细胞群的优选方式包含垂体干细胞标记(例如CXADR)阳性的垂体干细胞。该细胞群中垂体干细胞数的比例(垂体干细胞数的存在比例)可以为1％以上，优选为3％以上或5％以上。
4.垂体组织的制备方法
本发明提供了垂体组织的制备方法，该方法的特征在于，从利用上述“2.包含垂体组织的细胞群的制备方法”得到的包含垂体组织的细胞群回收垂体组织。一个实施方式中包含下述步骤(1)、(2)及(4)。
(1)第一步骤，将多潜能干细胞在JNK信号转导途径抑制物质和Wnt信号转导途径抑制物质存在的条件下培养，得到细胞群；
(2)第二步骤，将第一步骤得到的细胞群在BMP信号转导途径作用物质及Sonichedgehog信号转导途径作用物质存在的条件下培养(优选悬浮培养)，得到包含垂体组织的细胞群；
(4)第四步骤，从第二步骤得到的细胞群回收垂体组织。
第一步骤及第二步骤可以与上述“2.包含垂体组织的细胞群的制备方法”的第一步骤及第二步骤同样地实施。另外，也可以根据需要在第一步骤前实施a步骤。或者，也可以根据需要在第二步骤和第四步骤之间实施第三步骤。
从包含垂体组织的细胞群中回收垂体组织的第四步骤，如果所形成的细胞群是通过贴壁培养等获得的平面组织，可使用例如在显微镜观察下用针等，物理剥离垂体组织等方法进行回收。当形成的细胞群是细胞团等立体组织时，在显微镜观察下使用镊子等，通过剥离、回收在细胞团的外侧(拉特克囊部分)形成的垂体组织而进行。垂体组织可以例如在Nature communications，2016，7中记载的那样，以得到的细胞团块的表层存在的半透明的薄的上皮形式辨别。作为第四步骤中从细胞群(细胞团块)回收垂体组织的方法，也可以使用冻融、优选为慢速冷冻法。在该方法中，通过将在外侧具有垂体组织及在内侧具有间充质神经、神经上皮组织的细胞团块冻融，由此不实施物理处理而将外侧的垂体组织从细胞团块剥离。
5.毒性、药效性评价用试剂及毒性、药效评价方法
对本发明的细胞群，通过本发明的制备方法制备的细胞群，或从该细胞群回收的组织而言可以为垂体组织。因此，可提供被测物质的毒性、药效性评价用试剂，其含有本发明的细胞群，通过本发明的制备方法制备的细胞群或从该细胞群回收的垂体组织。
另外，本发明可以使用上述的细胞群或从该细胞群回收的垂体组织，提供毒性、药效评价方法。
可列举被测物质的毒性、药效评价方法，包括例如：使细胞群或从该细胞群回收的垂体组织与被测物质接触的步骤；以及检验该被测物质对该细胞群或垂体组织造成的影响的步骤。
或者，可列举用于该载体的基因治疗法及其它用法时的毒性、药效评价方法，其包括：使从细胞群或该细胞群回收的垂体组织与用于向细胞导入特定序列的核酸、基因的载体接触的步骤；以及检测该载体或导入基因、核酸对该细胞群或垂体组织的影响，例如检验导入基因的效果、导入基因的传递性、细胞障碍的程度等的步骤。
从本发明的细胞群、通过本发明的制备方法制备的细胞群或从该细胞群中回收，并用作评价受试物毒性和药效性试剂的垂体组织，也优选为采用基因经基因组编辑改造的多潜能干细胞为原料制备的。在原料多潜能干细胞中编辑的基因，优选为疾病相关基因，进一步优选为垂体疾病的疾病相关基因。作为所述垂体疾病，可列举例如：肢端巨大症、库欣病、泌乳素产生垂体腺瘤、TSH(促甲状腺激素)产生垂体腺瘤、颅咽管瘤、拉特克囊肿、垂体炎、垂体功能减退症、儿童生长激素分泌不全症、男性低促性腺激素(LH、FSH)性性腺功能减退症、下丘脑/垂体性闭经症、多发性内分泌肿瘤症等，这些致病基因、疾病相关基因优选作为多潜能干细胞中基因组编辑的靶点，但不限于此。另一个方面的疾病相关基因是与垂体至下丘脑的癌症和肿瘤发生有关的基因。作为此类疾病相关基因，可列举例如：AIP、GPR101、MEN1、MEN4、CDKN1B、PRKAR1A、PRKACB 2q16、SDHA/B/C/D、SDHAF2、NF1、DICER1、GNAS、USP8、PIK3CA、MTND1，2，4，5、MTTL2、MTTM、MTCYB、MTRNR2等，但不限于此。或者，也可以从健康人或患者的垂体及其他组织的正常和病变部位采集细胞，建立iPS细胞，制作本申请所述的垂体组织。
6.药物组合物、治疗药物及疾病的治疗方法
作为本发明的一个方面，可列举含有本发明的细胞群、通过本发明的制备方法制备的细胞群或从该细胞群回收的垂体组织的药物组合物(用于移植的组合物、用于移植的组织或移植物)。药物组合物优选地除了包含本发明的细胞群、通过本发明的制备方法制备的细胞群或从该细胞群回收的垂体组织外，还包含药学上可接受的载体。
作为药学上可接受的载体，可以使用生理性水性溶剂(生理盐水、缓冲液、无血清培养基等)。如有需要，药物组合物中，在移植医疗中含有要移植的组织或细胞的药物可以与通常使用的防腐剂、稳定剂、还原剂、等渗剂等配合使用。
作为本发明的一个方面，可提供由于垂体的障碍导致的疾病的治疗药物，其含有本发明的细胞群，通过本发明的制备方法制备的细胞群或从该细胞群回收的垂体组织。
作为由于垂体的障碍导致的疾病的治疗药物，可列举例如含有包含本发明的细胞群或者通过本发明的制备方法制备的细胞群的悬浊液的移植物。
作为悬浊液，可列举例如将细胞群悬浊于培养基、人工泪液或生理盐水中的液体。悬浊液也可以包含从细胞群分离的非神经上皮细胞，可以包含促进细胞的黏附的因子，例如细胞外基质、透明质酸等。
可以代替细胞团块而使用从细胞群回收的垂体组织。
进一步，可提供由于垂体的障碍导致的疾病的治疗方法，包括从本发明的细胞群，通过本发明的制备方法制备的细胞群将垂体组织的有效量移植至有需要进行移植的对象的步骤。
上述由于垂体的障碍导致的疾病可以为由于垂体的障碍导致的动物的疾病，可以为由于垂体的障碍导致的非人动物的疾病。作为由于垂体的障碍导致的疾病，具体而言可列举全垂体功能减退，垂体性侏儒症，肾上腺皮质功能减退，部分垂体功能减退，单纯性垂体前叶激素缺乏，垂体腺瘤等手术后的垂体功能·激素分泌不全，颅咽管瘤等。
从本发明的细胞群、通过本发明的制备方法制备的细胞群或从该细胞群中回收，并用作由于垂体的障碍导致的疾病的治疗药物的垂体组织，也优选为采用基因经基因组编辑改造的多潜能干细胞为原料制备的。作为基因组编辑对象的基因是参与通过本发明的制造方法进行的垂体组织分化的基因、与向通过本发明的制造方法副生的垂体以外的目的外细胞的分化有关的基因、从垂体分泌的激素相关基因、与疾病的感染有关的基因等，但不限于此。
实施例
以下示出了实施例，对本发明进行了更详细地说明，但这些实施例不限制本发明的范围。另外，所使用的试剂和材料是可商业获得的，除非另有特别说明。
[实施例1：JNK抑制剂在源自人iPS细胞的包含垂体组织的细胞群(垂体类器官)的制备中对细胞分化的效果的研究]
将人iPS细胞(HC-6#10株，从理化学研究所获得)基于Scientific Reports，4，3594(2014)中记载的方法在无饲养细胞条件下培养。作为无饲养细胞培养基使用了StemFit培养基(味之素公司制)，无饲养细胞构架使用了Laminin511-E8(Nippi公司制)。
作为具体维持培养操作，首先将亚汇合的人iPS细胞(HC-6#10株)利用0.5mMEDTA/PBS洗涤2次之后，进一步利用5mM EDTA/PBS在37℃下处理10分钟。进行吹打，从培养皿表面剥下细胞，分散成单一细胞。之后，将分散为单一细胞的人iPS细胞接种在利用Laminin511-E8包被的塑料培养皿中，在Y27632(ROCK抑制物质，富士胶片和光纯药公司制，10μM)的存在下，利用StemFit培养基进行了无饲养细胞培养。作为塑料培养皿而使用了6孔板(Corning公司制，细胞培养用，培养面积9.5cm2)的情况下，使分散为单一细胞的人iPS细胞的接种细胞数为7×103。接种1天后，将全部量的培养基更换为不包含Y-27632的StemFit培养基。然后，1-2天一次将全部量的培养基更换为不含Y-27632的StemFit培养基。培养至接种的7天后达到亚汇合(培养面积的6成覆盖细胞的程度)。
将培养的多潜能干细胞用于诱导分化中时，播种的6天后与StemFit培养基的培养基更换同时添加了SB431542(TGF-β信号转导途径抑制物质，富士胶片和光纯药公司制，终浓度5μM)和SAG(Shh信号途径作用物质，Enzo Life Sciences公司制，终浓度300nM)培养24小时(步骤(a)开始)。
将制作的亚汇合的人iPS细胞，与上述传代时一样，利用0.5mMEDTA/PBS处理。添加诱导分化用的无血清培养基，进行吹打，从培养皿表面剥下细胞，分散成单一细胞。
之后，将分散成单个细胞的人ES细胞以在非细胞黏附性的96孔培养板(PrimeSurface 96V底板，MS-9096V，住友BakeLite公司制)的每1孔为9×103细胞的方式而悬浮在100μl的无血清培养基中，在37℃，5％CO2的条件下悬浮培养。关于此时的无血清培养基，使用了在F-12+Glutamax培养基(Thermo Fisher Scientific公司制)和IMDM+Glutamax培养基(Thermo Fisher Scientific公司制)的体积比1∶1混合液中添加了5％Knockout血清替代物(Thermo Fisher Scientific公司制)，450μM1-一硫代甘油(富士胶片和光纯药公司制)，1x化学成分确定的脂质浓缩物(Thermo Fisher Scientific公司制)，50单位/ml青霉素-50μg/ml链霉素(Nacalai Tesque公司制)的无血清培养基。之后，该无血清培养基也称为5％KSR gfCDM。悬浮培养开始时(悬浮培养开始后第0天，步骤(1)开始)，在上述无血清培养基中添加了Y-27632(终浓度10μM)，IWP-2(Wnt信号转导途径抑制物质，Tocris Bioscience公司制，0.5μM)，SB431542(TGFβ信号转导途径抑制物质，和光纯药公司制，1μM)。进一步，为了验证在多潜能干细胞的垂体诱导分化中JNK信号转导途径抑制的效果，将c-Jun N末端激酶(JNK)抑制剂JNK-IN-8(Merck公司制、1μM)添加条件和无添加条件进行比较。
悬浮培养开始后第2天以每1孔100μl加入了不含有Y-27632，但包含IWP-2、SB431542、BMP4(BMP信号转导途径作用物质)、SAG的无血清培养基。关于BMP4，在添加的培养基中添加1nM，使得孔中终浓度为0.5nM，关于SAG，在添加的培养基中添加1.4μM，使得孔中终浓度为700nM。之后，在悬浮培养开始后第6、10、13、17、21及24天，使用不含有Y-27632和BMP4，但包含IWP-2，SB-431542和SAG的无血清培养基进行半量培养基更换。
在悬浮培养开始后第28天，使用倒置显微镜(Keyence公司制，BIOREVO BZ-9000)进行相位差观察(图1下图)。通过上述诱导分化法，形成直径约1000μm左右的球状细胞聚集体。比较添加JNK抑制剂的条件和无添加条件后可知，在添加JNK抑制剂的条件下，细胞团的大小直径比无添加条件小100μm左右，细胞团的表面被作为垂体组织基础的非神经上皮组织、基板样组织覆盖的比例大，非神经上皮组织以外的目的外细胞的增殖受到抑制，分化效率提高。上述结果显示，在由人多潜能干细胞制备垂体组织中，通过添加JNK抑制剂可以改善制备效率。
[实施例2：JNK抑制剂在源自人iPS细胞的包含垂体组织的细胞群(垂体类器官)的制备中的添加时期的研究]
在实施例2中，按照图2A所示步骤，制备包含构成垂体组织的细胞的细胞群。具体而言，将人iPS细胞(1231A3株，从理化学研究所获得)基于Scientific Reports，4，3594(2014)中记载的方法在无饲养细胞条件下培养。作为无饲养细胞培养基使用了StemFit培养基，无饲养细胞构架使用了Laminin511-E8。
作为诱导分化的条件，相对于实施例1的条件，除了JNK抑制剂的添加条件外，以与实施例1相同的条件实施诱导分化。作为JNK抑制剂的添加条件，将在诱导分化开始第0、2、6、10、13天添加c-Jun N末端激酶(JNK)抑制剂JNK-IN-8(Merck公司制、1μM)的条件和无添加条件进行比较。在诱导分化开始第2、6、10、13天添加JNK抑制剂时，在添加或更换培养基时的培养基中添加2μM，使得孔中的终浓度为1μM。
在悬浮培养开始后第28天，使用倒置显微镜(Keyence公司制，BIOREVO BZ-X800)，通过偏射照明进行明视野观察(图2B)。其结果，在分化诱导开始第0、2、6天添加JNK抑制剂的条件下，非神经上皮、垂体比非添加条件下更有效地形成，但在分化诱导开始第10、13天添加的条件下，未发现与非添加条件的差异。上述结果显示，在由人多潜能干细胞制备垂体组织中，JNK抑制剂优选在诱导分化开始第10天之前添加。
[实施例3：JNK抑制剂在源自人iPS细胞的包含垂体组织的细胞群(垂体类器官)的制备中对垂体激素分泌能力的效果的研究]
在实施例3中，按照图3A所示步骤，制备包含构成垂体组织的细胞的细胞群。具体而言，将人iPS细胞(201B7株，从京都大学获得)基于Scientific Reports，4，3594(2014)中记载的方法在无饲养细胞条件下培养。作为无饲养细胞培养基使用了StemFit培养基，无饲养细胞构架使用了Laminin511-E8。
将所述亚汇合的人iPS细胞使用TrypLE Select进行细胞分散液处理，再通过吹打操作分散成单一细胞。之后，将分散成所述单个细胞的人ES细胞以在非细胞黏附性的96孔培养板的每1孔为9000细胞的方式而悬浮在100μL的无血清培养基中，在37℃，5％CO2的条件下悬浮培养。关于此时的无血清培养基(gfCDM+KSR)，使用了在F-12培养基和IMDM培养基的1：1混合液中添加了5％KSR，450μM 1-一硫代甘油，1x化学成分确定的脂质浓缩物的无血清培养基。再悬浮培养开始时(诱导分化开始后第0天)，在所述无血清培养基中添加Y-27632(终浓度10μM)、IWP-2(0.5μM)、SB431542(1μM)、SAG(100nM)。
在诱导分化开始后第2天以每1孔100μL加入了不含有Y-27632，但包含IWP-2、SB431542、BMP4(0.5nM)、SAG(700nM)的无血清培养基。之后，在诱导分化开始后第6、9、12、15、19、22、26天，使用不含有Y-27632和BMP4，但包含IWP-2，SB-431542和SAG的无血清培养基进行半量培养基更换。第19天以后，培养时的氧分压为40％。
将诱导分化开始后第29天的所述细胞聚集体分别为4％用低聚甲醛固定，制作成冷冻切片。关于这些冷冻切片，使用针对垂体前体标记Pitx1(抗Pitx1抗体，自制(NatureCommunications，7：10351，2016、Cell Reports，30，18-24，January 7，2020))和Lhx3(抗Lhx3抗体，自制(Nature Communications，7：10351，2016、Cell Reports，30，18-24，January 7，2020))、上皮细胞标记E-cadherin(TAKARABio公司制)的抗体进行免疫染色。一抗反应后，使用用Alexa488、555、647荧光标记的二抗(Life Technologies公司制)进行检测。结果显示，在通过上述诱导分化法诱导的诱导分化开始后第29天的细胞聚集体中，与无添加的对照相比，在诱导分化后第0天添加1μM JNK-IN-8的条件下，细胞团表面被E-Cadherin阳性的上皮组织覆盖的比例更高，垂体前体标记Pitx1和Lhx3阳性细胞的比例也高(图3B)。上述结果显示，JNK抑制剂的添加促进看从多潜能干细胞进行垂体诱导分化。
[实施例4：JNK抑制剂在源自人iPS细胞的包含垂体组织的细胞群(垂体类器官)的制备中对垂体激素分泌能力的效果的研究]
在实施例4中，按照图4A所示步骤，制备包含构成垂体组织的细胞的细胞群。具体而言，经时地回收按照实施例3所述的方法制作的源自人iPS细胞系201B7的细胞团的培养上清液，测定每个细胞团的ACTH的分泌量。作为具体的测量方法，在诱导分化第0天至第30天，在添加1μM、3μM或10μM JNK抑制剂JNK-IN-8的条件和无添加对照的4个条件下，制作包含垂体组织的细胞团。其中，在添加10μM JNK-IN-8的条件下，确认了细胞团的崩解。之后，将无添加对照及添加1μM或3μM JNK-IN-8制作的细胞团，在10cm平皿、培养基20ml的条件下，悬浮培养各条件的细胞团，每3至4天进行半量培养基更换。在诱导分化第61天、第103天、第152天、第201天的半量培养基更换前回收培养上清液，在-150℃下冷冻，待所有样本齐全后，用临床检查中使用的ELISA法测定回收的培养基中ACTH的浓度(委托SRL株式会社进行检查)。以取得的ACTH浓度(pg/mL)的数据为基础，从取样时的细胞块总数及培养基总量中，将20个细胞块修正为在20ml培养基中培养的条件下的ACTH浓度，并制成曲线图。同样的实验实施了2次。
其结果，与不添加JNK抑制剂的条件相比，在从诱导分化第0天开始添加1μM JNK-IN-8的条件下，培养基中的ACTH浓度在诱导分化第61天时为5倍左右，在诱导分化第103天、152天时为2倍左右，在诱导分化第201天时高1.3倍左右。在添加3μM JNK-IN-8的条件下，在诱导分化第61天、103天时，培养基中的ACTH浓度比无添加条件高，但是在诱导分化第152天、201时，比无添加条件低。上述结果显示，在源自多潜能干细胞的垂体组织诱导分化中，通过添加JNK抑制剂，提高了每个细胞团的ACTH分泌能力，且添加的JNK抑制剂的浓度优选在3μM以下(图4B)。
[实施例5：振荡培养在源自人iPS细胞的包含垂体组织的细胞群(垂体类器官)的制备中的效果的研究]
在实施例5中，按照图5上图所示步骤，制备包含构成垂体组织的细胞的细胞群。具体而言，将按照实施例2所述的方法由人iPS细胞系1231A3制备的诱导分化30天的细胞团，转移到细胞非黏附性的T75组织培养用烧瓶(Corning公司制)，实施后续的悬浮培养。作为悬浮培养的条件，使用了在F-12培养基和IMDM培养基的1：1混合液中添加了10％KSR、450μM1-一硫代甘油、1x化学成分确定的脂质浓缩物的无血清培养基，添加了1μM SB431542、700nM SAG。将48个细胞团在25ml的培养基中悬浮培养，每隔3天至4天实施半量培养基更换。将装有上述细胞团的烧瓶使用往复式的振荡器(NS-LR，Asone公司制)在30rpm的条件下实施振荡培养，与在相同烧瓶中实施静置培养的条件进行比较。在诱导分化第43天，使用倒置显微镜(Keyence公司制，BIOREVO BZ-X800)，通过偏射照明进行明视野观察(图5下图)。
结果显示，在实施振荡培养的细胞团中，细胞团表面的上皮结构发育，改善了垂体组织的生长，振荡培养对由多潜能干细胞制备垂体组织是有用的。
[实施例6：具有减轻氧化应激作用的物质在源自人iPS细胞的包含垂体组织的细胞群(垂体类器官)的制备中的研究]
在实施例6中，按照图6上图所示步骤，制备包含构成垂体组织的细胞的细胞群。具体而言，按照实施例5所述的方法由人iPS细胞系1231A3制作包含垂体组织的细胞团。在诱导分化第30天将细胞团转移到T75烧瓶中，改变培养条件。作为具有减轻氧化应激作用的物质，将N乙酰半胱氨酸(NAC)从诱导分化的第10天开始以1mM的浓度添加到培养基中，与无添加条件进行比较。在诱导分化第30天及51天，使用倒置显微镜(Keyence公司制，BIOREVOBZ-X800)，通过偏射照明进行明视野观察(图6下图)。
其结果，在添加NAC的条件中，在诱导分化第30天时，细胞团的直径比非添加条件小50μm左右，目的外细胞的增殖受到了抑制。通过进一步实施悬浮培养，在诱导分化第51天，形成被包含垂体的上皮组织覆盖的比例较多的细胞团。上述结果显示，添加具有减轻氧化应激作用的物质，对由多潜能干细胞制备垂体组织是有用的。
[参考例1：实施a步骤在包含源自人ES细胞的垂体组织的细胞群(垂体类器官)的制备中的效果的研究]
使用人ES细胞(RAX：：敲入Venus的KhES-1株、理化学研究所)，按照图7A所示步骤，设置了a步骤实施组和不实施组，制备包含构成垂体组织的细胞的细胞群。
具体而言，将亚汇合的人ES细胞，与实施例1相同，播种到用Laminin511-E8涂覆的塑料培养皿中，在包含300nM SAG和5μM SB431542的StemFit培养基中进行无饲养细胞培养(步骤(a))。播种1天后，将所述人ES细胞用TrypLE Select进行细胞分散液处理，进一步通过吹打操作，分散成单一细胞。之后，将分散成所述单个细胞的人ES细胞以在非细胞黏附性的96孔培养板的每1孔为1.0×104细胞的方式而悬浮在100μL的无血清培养基中，在37℃，5％CO2的条件下悬浮培养。关于此时的无血清培养基(gfCDM+KSR)，使用了在F-12培养基和IMDM培养基的1∶1混合液中添加了5％KSR，450μM 1-一硫代甘油，1x化学成分确定的脂质浓缩物的无血清培养基。在悬浮培养开始时(诱导分化开始后第0天)，在所述无血清培养基中添加Y-27632(终浓度20μM)、SAG(100nM)(步骤(1))。
在诱导分化开始后第2天以每1孔100μL加入了不含有Y-27632，但包含BMP4(5nM)、SAG(2μM)的无血清培养基。在诱导分化开始后第6、9、12、15天使用不含有Y-27632，但包含BMP4和SAG的无血清培养基进行半量培养基更换(步骤(2)的开始)。之后，在诱导分化开始后第19、22、26天，使用不含有Y-27632及BMP4，但包含SAG的无血清培养基进行半量培养基更换。第19天以后，培养时的氧分压为40％。将悬浮培养开始后第32天的细胞聚集体，与实施例3相同，制作成冷冻切片。关于冷冻切片，对垂体的前体标记PITX1(抗Pitx1抗体、自制)和上皮细胞标记E-cadherin(TAKARABio公司制)使用抗体进行免疫染色，用DAPI染色细胞核。其结果，在不实施a步骤的组中，聚集体不能很好地形成而崩溃了(数据未显示)。另一方面，在实施a步骤的组中，证实了包含PITX1阳性且具有E-cadherin阳性细胞的组织及具有RAX：：Venus阳性细胞的组织这两层的细胞聚集体的形成。(图7B)但是，使用针对垂体祖细胞标记LHX3(兔；1∶3,000，Takara生物公司制)的抗体进行染色的结果，LHX3阳性细胞没有检测出那么多。结果启示，通过实施a步骤，可以得到具有2层组织的细胞聚集体。图7B的右下角的比例尺表示200μm。
[参考例2：TGFβ/Nodal/Activin/BMP及Wnt信号调节在包含源自人iPS细胞的垂体组织的细胞群的制备中的效果的研究]
使用人ES细胞(RAX：：敲入Venus的KhES-1株，日本理化学研究所)，按照图8A所示步骤，实施a步骤后，加入BMP4(5nM)和SAG(100nM(步骤(1))或2μM(步骤(2))，在添加了Wnt信号抑制剂IWP2(2μM)和TGFβ信号抑制剂SB431542(1μM)的培养基中进行悬浮培养。IWP2和SB431542的添加在悬浮培养开始第0天至第6天的时期(图8B-1)、悬浮培养开始第0天至第12天的时期(图8B-2)或悬浮培养开始第0天至第29天的时期(图8B-3)进行，BMP4的添加在悬浮培养开始第2天至第6天的时期(图8B-1～3的各上部)或悬浮培养开始第2天至第18天的时期(图8B-1～3的各下部)进行。使用悬浮培养开始后第29天的细胞聚集体，与实施例3相同，制作成冷冻切片。使用PITX1(抗Pitx1抗体，自制)和上皮细胞标记E-cadherin(Takara生物公司制)的抗体对冷冻切片进行免疫染色。结果确认了，聚集体的外侧存在PITX1阳性和E-cadherin阳性的非神经上皮组织，内侧为RAX：：Venus阳性的神经上皮组织(图8B-1～3)。
可知，在包含PITX1阳性和E-cadherin阳性的非神经上皮组织的外侧细胞层中存在LHX3阳性细胞(图8B-1～3)。PITX1阳性和E-cadherin阳性的非神经上皮组织最有可能形成的条件是，IWP2和SB431542的添加在悬浮培养开始第0天至第29天的时期进行，BMP4的添加在悬浮培养开始第2天至第6天的时期进行(图8B-3)。其结果显示，在从人iPS细胞添加了Wnt信号抑制剂和TGFβ信号抑制剂的分化诱导条件下，可以制备高效形成外侧非神经上皮组织，且外侧非神经上皮的一部分为LHX3阳性的垂体基板的细胞团。图8B-1～3的右下角的比例尺表示200μm。
[参考例3：各信号调节剂在包含源自人ES细胞的垂体组织的细胞群(垂体类器官)的制备中的浓度的研究]
接下来，为了研究各步骤中添加的IWP2、BMP4及SAG的最佳浓度，设定高浓度组(IWP2；2μM、BMP4；5nM、SAG；2μM)和低浓度组(IWP2；0.5μM、BMP4；0.5nM、SAG；700nM)这2个组，以诱导分化第61天、103天、152天、201天、250天的培养液中的ACTH浓度为指标进行比较研究。在细胞中使用人ES细胞(KhES-1株)，按照图9A所示步骤，制备包含构成垂体组织的细胞的细胞群。使用实施例4中记载的方法，测定培养基中的ACTH浓度。研究结果显示，低浓度组中培养液中ACTH浓度更高(图9B)。结果启示，为了诱导分化ACTH分泌能力优异的组织，低浓度组(IWP2；0.5μM、BMP4；0.5nM、SAG；700nM)的浓度是合适的。
[实施例7：JNK抑制剂在包含源自人iPS细胞的垂体组织的细胞群(垂体类器官)的制备中对垂体上皮组织及垂体激素分泌能力的效果的研究]
按照图10A所示的步骤，使用人iPS细胞(201B7株)，按照与实施例4相同的方法进行悬浮培养，持续到第103天，使用得到的细胞聚集体，与实施例3相同，分别制作成冷冻切片。对于得到的切片，使用抗ACTH抗体(Fitzgerald industries公司制)和抗E-cadherin抗体(TAKARABio公司制)进行免疫染色，用DAPI染色细胞核。其结果可知，与无添加的对照相比，在添加JNK-IN-8的条件下，覆盖细胞聚集体表面的层中E-cadherin阳性细胞的比例高，整个细胞聚集体中ACTH阳性细胞的比例也变多(JNKi(+)；42.2±4.4％，JNKi(-)；总细胞的28.8±4.0％，均值±SEM，n＝8-12)(图10B)。图10B的右下角的比例尺表示200μm。
[实施例8：包含源自人iPS细胞的垂体组织的细胞群(垂体类器官)的制备中垂体激素分泌细胞存在的确认]
使用人iPS细胞(1231A3株)，按照与实施例6相同的方法进行悬浮培养，使用培养第59天的细胞聚集体，与实施例3相同，制作成冷冻切片。对于得到的切片，使用抗ACTH抗体(Lab Vision公司制)和抗SOX2抗体(Santa Cruz公司制)进行免疫染色，用DAPI染色细胞核。结果确认，细胞聚集体表面的一层形成了垂体上皮组织，整个细胞聚集体中存在ACTH阳性细胞(图11)。图11的右下角的比例尺表示200μm。
[实施例9：包含源自人iPS细胞的垂体组织的细胞群(垂体类器官)的制备中的SAG添加时期的研究]
使用人iPS细胞(201B7株)，按照图12A所示的步骤制备细胞聚集体。但是，关于SAG的处理时期，设定了从诱导分化开始后到第30天添加SAG的组，从诱导分化开始后到第30天以后(第61天、第103天及第131天)也添加SAG的组这2组，比较ACTH分泌能力。按照与实施例4相同的方法进行ACTH的测定。
结果表明，通过在诱导分化开始30天后停止SAG处理，提高了ACTH分泌能力(图12B)。
[实施例10：包含源自人ES细胞的垂体组织的细胞群(垂体类器官)的制备中的基因表达变动的研究]
使用ES细胞(KhES-1株)，按照图13A所示的步骤制备细胞聚集体。为了确认诱导分化开始后各培养天数的分化程度，将垂体标记(PITX1，LHX3，POMC(ACTH前体细胞))和下丘脑标记(RAX，NKX2.1(TTF1))的表达变化通过定量PCR进行研究。具体实施如下。
使用RNeasy Micro Kit(Qiagen公司)，每个样本从6个细胞聚集体中提取RNA。定量PCR使用Biomark HD(Fluidigm)实施。此外，各基因的探针使用GAPDH(Hs02758991_g1)、PITX1(Hs00267528-m1)、LHX3(Hs01033412_m1)、POMC(Hs01596743_m1)、RAX(Hs00429439-m1)、TTF1(Hs00968940-m1)(TaqMan Probes；Thermo Fisher Scientific)。得到的数据作为内在性的对照，在使用GAPDH进行标准化(normalize)的基础上，使用比较Ct法(ΔΔCt法)得到定量结果。
其结果，LHX3的表达在诱导分化开始第6天至第60天增加，LHX3的表达在诱导分化开始第19天至第30天增加，POMC的表达在诱导分化开始第30天以后增加(图13B)。这些结果显示，逐步诱导向垂体分化。
另一方面，RAX的表达在分化诱导开始第3天至第6天左右到达平台，随后减少(图13C)。另外，TTF1的表达在诱导分化开始第6天至第19天增加，随后减少(图13C)。这些结果启示，在分化的初始阶段，在向垂体前体组织分化的同时，也在进行向下丘脑(腹侧下丘脑)的分化。
[实施例11：包含源自人ES细胞的垂体组织的细胞群(垂体类器官)的制备中各种激素分泌细胞表达的确认]
使用人ES细胞(KhES-1株)，使用与实施例10相同的诱导分化法，制备细胞聚集体。使用悬浮培养开始后第103天的细胞聚集体，与实施例3相同，制作成冷冻切片。使用抗催乳素(PRL)抗体(Dako公司制)、抗POU1F1抗体(自制)、抗促甲状腺素(TSH)抗体(Dako公司制)、抗黄体生成素(LH)抗体(Dako公司制)和抗促卵泡激素(FSH)抗体(Dako公司制)进行免疫染色，用DAPI染色细胞核。另外，对悬浮培养开始第152天后的细胞聚集体，使用抗生长激素(GH)抗体(Santa Cruz公司制)进行免疫染色，用DAPI染色细胞核。其结果，确认了对使用的所有抗体有反应的细胞的存在。结果显示，包含垂体前体细胞的细胞聚集体具有分泌多种激素的能力(图14)。图14的右下角的比例尺表示50μm。
[实施例12：使用电子显微镜对包含垂体组织的细胞聚集体(垂体类器官)的结构进行研究]
使用与实施例10相同的诱导分化法，制备包含垂体组织的细胞聚集体，将图13A中悬浮培养开始后第51天以后的培养一直持续到第201天。将细胞聚集体使用4％低聚甲醛、1％戊二醛和2％蔗糖，在4℃下固定3天。按照常规方法，用酒精溶液脱水，用LR-WHlTE树脂(Nissin EM)聚合和包埋后制成超薄切片，用电子显微镜(Hitachi H-7500)观察。
结果显示，垂体组织中的许多细胞包含激素分泌颗粒(hormone-secretinggranules)(图15B、C、D)。在细胞聚集体的内层(下丘脑组织)，特别是更深的层中，发现了细胞死亡和纤维化(图15A：“*”所示部分)。在类器官壁内，存在细胞内具有分泌颗粒的内分泌细胞，相当于垂体前叶(图15A、B、C)。在许多区域中，垂体细胞层(pituitary cell layer)形成了薄囊壁(cystic wall)，由假多列柱状上皮(false multi-rowcolumnarepithelium)的内分泌细胞组成。垂体细胞层的最下层形成基底膜样结构(图15A：箭头)，最外层薄覆纤毛细胞(ciliated cells)(图15A、B、C：“→”所示部分)。虽然分散着含有大量分泌颗粒的内分泌细胞，但这些细胞维持着一定的未成熟状态，内分泌细胞的种类不清楚。内分泌细胞在基底膜及与外侧的边界方向上显示出较强的极性，例如桥粒偏向外侧层(图15C：箭头)。此外，在类器官壁上还发现了滤泡星状细胞(folliculo-stellatecells：FSCs)的存在(图15D：虚线)。图15A的右下角的比例尺表示8μm，图15B、C的右下角的比例尺表示2μm，图15D的右下角的比例尺表示500mm。
[实施例13：通过免疫染色对包含垂体组织的细胞聚集体(垂体类器官)中的垂体干细胞的存在进行研究]
报告了实施例12中确认的垂体中的滤泡星状细胞是一种成体垂体干细胞，启示了通过本制法生产的垂体-下丘脑类器官不仅包含激素产生细胞，还包含垂体干细胞。因而，按照与实施例10相同的方法制备包含垂体组织的细胞聚集体，对悬浮培养(诱导分化)开始后第103天的细胞聚集体，进行了垂体干细胞的标记CXADR的免疫染色。具体而言，与实施例3相同，分别制作成冷冻切片。对这些冷冻切片，使用抗ACTH抗体(小鼠，1∶200；Fitzgerald)和抗CXADR抗体(兔；1∶100；Atlas antibodies)进行免疫染色，用DAPI染色细胞核。使用共焦点激光扫描型显微镜(Olympus公司制)观察这些染色的切片，获得免疫染色像。
结果显示，在垂体组织存在的区域中，ACTH阳性细胞存在于细胞聚集体的内侧，CXADR阳性和ACTH阴性细胞存在于其另一侧(细胞聚集体的外侧)(图16)。因而，启示激素产生细胞和垂体干细胞显示极性。在由多潜能干细胞诱导的垂体-下丘脑类器官中，迄今尚未报告垂体干细胞的存在，本实施例首次确认了这一情况。图16的右下角的比例尺表示50μm。
[实施例14：包含垂体组织的细胞聚集体(垂体类器官)的ACTH分泌能力的研究]
按照与实施例10相同的方法制备包含垂体组织的细胞聚集体，研究ACTH分泌能力。将悬浮培养开始后培养天数不同的20个细胞聚集体，转移到包含添加了20％KSR的无血清培养基(20mL)的10cm悬浮培养用平皿中，在37℃下培养3～4天后，回收培养上清液。回收的培养上清液中的ACTH浓度，通过临床检查中使用的ELISA法进行测定(委托株式会社SRL进行检查)。其结果是，从悬浮培养开始后的第29天开始，确认了ACTH的分泌(23pg/mL)，之后随着培养天数的延长，ACTH分泌量显著增加(图17A)。
接下来，研究了是否发现CRH引起的ACTH分泌增加和糖皮质激素引起的ACTH分泌抑制。具体而言，将悬浮培养开始后第103天的20个细胞聚集体，转移到包含添加了20％KSR的无血清培养基(10mL)的10cm悬浮培养用平皿中，在37℃、40％O2条件下培养24小时后，回收培养上清液。将细胞聚集体用添加了20％KSR的无血清培养基洗涤后，转移到装有添加了20％KSR的新无血清培养基10mL的10cm悬浮培养用平皿中，添加了CRH(NIPRO ES PHARMA公司制)5μg/mL或地塞米松(DX，Aspen Japan公司制)500ng/mL。分别将无添加组设定为对照。在37℃、40％O2条件下培养24小时后，回收培养上清液。回收的培养上清液中的ACTH浓度按上述方法进行测定。其结果，通过CRH刺激，ACTH分泌量增加约三倍(图17B)。
而通过DX处理，ACTH分泌量减少了约40％(图17C)。这些结果显示，在通过本制法制备的垂体-下丘脑类器官中，通过激素维持稳态。
[实施例15：由人ES细胞制备的垂体类器官中表达的目的外细胞的特定(基因解析、免疫染色)]
为了特定目的外细胞，使用基因表达解析的方法，对悬浮培养细胞聚集体中表达的基因进行特定。为了进行解析，我们分别准备了5或6个未诱导分化的人ES细胞(KhES-1株)和按照图13A所示步骤制作的悬浮培养开始第30天后、第60天后和第100天后的细胞聚集体，并对每个细胞聚集体使用RLT缓冲和RNeasy Micro Kit(均为QIAGEN公司制造)制作了基因分析用样本(共17个样本)。使用Biomark HD(Fluidigm)解析制作的RNA样本。探针使用了Thermo Fisher Scientific公司制的TaqMan探针(GAPDH (Hs02758991_g1)、ACTB(Hs01060665-g1)、PITX1(Hs00267528-m1)、PITX2(Hs04234069-mH)、LHX3(Hs01033412_m1)、POMC(Hs01596743_m1)、E-cadherin(Hs01023895_m1)、EpCAM(Hs00901885_m1)、RAX(Hs00429459-m1)、TTF1(Hs00968940-m1)、NESTin(Hs04187831-g1)、SOX11(Hs00846583_s1)、Lin28A(Hs00702808-s1)、NANOG(Hs04260366-g1)、POU5F1(Hs04260367-gH)。结果表明，如图18A的热图(Heat map)所示，在悬浮培养开始30天后、60天后和100天后的组织中，神经前体细胞标记NESTIN和SOX11表达。
接下来，从悬浮培养开始后第103天的组织中，使用与实施例3相同的方法制作冷冻切片，使用针对NESTIN(小鼠：1∶500；R&DSystems公司制)和SOX11(羊：1∶100；R&DSystems公司制)的抗体进行免疫染色，用DAPI染色细胞核。结果可知，在多个细胞聚集体中，聚集体内部的细胞层中存在NESTIN阳性和SOX11阳性的细胞(图18B)。上述结果显示，源自多潜能干细胞的诱导分化的细胞团中，存在垂体组织、下丘脑组织和神经系统前体细胞(图18B)。图18B的a的右下角的比例尺是200μm、图18B的b～d的右下角的比例尺是50μm显示。
[实施例16：使用具有分割微孔的培养器材由人iPS细胞制备、诱导分化垂体类器官]
按照图19A所示步骤，使用具有分割微孔的培养器材由人多潜能干细胞制备垂体类器官。作为多潜能干细胞，使用人iPS细胞1231A3株。用于诱导分化的细胞与实施例1同样地制作。
事先在35mm EZSPHERE平皿型号905(旭TECHNO GLASS公司制)中添加后述的诱导分化用的无血清培养基2ml，1小时左右，在CO2培养箱中静置，用显微镜确认了微孔内气泡的去除。
之后，与实施例1中记载的方法相同，用5mM EDTA/PBS处理制作的亚汇合的人iPS细胞1231A3株。细胞回收时添加诱导分化用的无血清培养基，进行吹打，从培养皿表面剥下细胞，分散成单一细胞，在事先制作的35mm EZSPHERE平皿中，悬浮在3ml无血清培养基中，在37℃、5％CO2的条件下悬浮培养，使每平皿1.8×106细胞。此时的无血清培养基中，使用5％KSR gfCDM(步骤(1)开始)。
在悬浮培养开始时(在悬浮培养开始后第0天，步骤(1)开始)，在上述无血清培养基中添加Y-27632(终浓度10μM)、IWP-2(终浓度1μM)、SB431542(终浓度1μM)、JNK-IN-8(终浓度1μM)、SAG(终浓度100nM)。
在悬浮培养开始后第1天，用显微镜确认EZSPHERE平皿的底面的微孔内形成细胞聚集体后，以每1平皿1ml加入不含Y-27632，但含有IWP-2、SB431542、JNK-IN-8、SAG(终浓度700nM)、BMP4(终浓度0.5nM)的无血清培养基(步骤(2)开始)。
进一步，在悬浮培养开始后第3天，使用宽孔的1000μl移液管吸头回收细胞聚集体，转移到10cm悬浮培养用平皿中。在此时的培养基中，使用不含Y-27632和BMP4，包含IWP-2、SB431542、JNK-IN-8、SAG(终浓度700nM)的5％KSR gfCDM12ml。之后，在培养第6、10、13、17天，从平皿中回收6ml培养基，使其不吸收细胞聚集体，添加6ml新培养基，进行半量培养基更换。
在悬浮培养开始后第29天，使用倒置荧光显微镜(BIOREVO BZ-X800、Keyence公司制)，进行偏斜照明观察(图19B)。其结果，在细胞团块的表面上形成了被观察为厚的高透明性上皮，且具有基板样的垂体组织的垂体有机质。根据上述结果，与使用所述96孔微孔板时相同，通过使用具有分割微孔的培养器材，可以通过人多潜能干细胞制造表面具有垂体组织的垂体类器官。通过使用具有分割微孔的培养器材，可以大量生产垂体组织。
[实施例17：包含源自人iPS细胞的垂体组织的细胞群(垂体类器官)的制备中的JNK抑制剂添加条件下的BMP添加时期的研究]
在实施例17中，按照图20A所示步骤，制备包含构成垂体组织的细胞的细胞群。具体而言，将人iPS细胞(1231A3株，从理化学研究所获得)基于Scientific Reports，4，3594(2014)中记载的方法在无饲养细胞条件下培养。作为无饲养细胞培养基使用了StemFit培养基，无饲养细胞构架使用了Laminin511-E8。
作为诱导分化的条件，除了将BMP4的添加条件和IWP-2的终浓度更改为1μM这点以外，在与实施例1相同的条件下，实施诱导分化。作为BMP4的添加条件，在诱导分化开始后约24小时后(1天)和约48小时后(2天)实施步骤(2)。
在悬浮培养开始后第28天，使用倒置荧光显微镜(BIOREVO BZ-X800、Keyence公司制)，进行偏斜照明观察(图20B)。其结果，在诱导分化开始后约24小时后(第1天)和约48小时后(第2天)的任一BMP4添加条件下，在细胞团块的表面上形成了被观察为厚的高透明性上皮，且具有基板样的垂体组织的垂体有机质。比较上述条件，在24小时后(第1天)BMP4添加条件下，形成的垂体类器官的大小均匀，细胞团的表面被垂体组织覆盖的比例高，垂体以外的细胞比例少。上述结果显示，在JNK抑制剂添加条件下，作为制备垂体类器官时优选的BMP信号转导途径活化物质的添加时期的一个方式是从人多潜能干细胞诱导分化开始12小时以后，60小时以内。
本申请以在日本申请的特愿2021-162255(申请日：2021年9月30日)和特愿2022-116716(申请日：2022年7月21日)为基础，这些的内容全部包含在本说明书中。

Claims (17)

1.包含垂体组织的细胞群的制备方法，其包括下述步骤(1)及(2)：
(1)第一步骤，将多潜能干细胞在c-jun N末端激酶(JNK)信号转导途径抑制物质和Wnt信号转导途径抑制物质存在的条件下培养，得到细胞群；
(2)第二步骤，将第一步骤得到的细胞群在BMP信号转导途径作用物质和Sonichedgehog信号转导途径作用物质存在的条件下培养，得到包含垂体组织的细胞群。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在第一步骤之前，对多潜能干细胞实施下述步骤(a)：
(a)a步骤，将多潜能干细胞在不存在饲养细胞的条件下，在包含1)TGFβ家族信号转导途径抑制物质和/或Sonic hedgehog信号转导途径作用物质，以及2)未分化维持因子的培养基中进行培养。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其中，第一步骤中的培养进一步在Sonic hedgehog信号转导途径作用物质存在的条件下进行，在第一步骤及第二步骤中的Sonic hedgehog信号转导途径作用物质存在的条件下的培养期间为30天。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，对第二步骤得到的细胞群实施下述步骤(3)：
(3)第三步骤，将第二步骤得到的细胞群在不存在Sonic hedgehog信号转导途径作用物质的条件下培养，得到包含垂体组织的细胞群。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，在第三步骤之前，对第二步骤得到的细胞群实施下述步骤(b)：
(b)b步骤，将第二步骤得到的细胞群在BMP信号转导途径抑制物质的存在下培养。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其中所述JNK信号转导途径抑制物质包含JNK抑制剂。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其中所述JNK信号转导途径抑制物质包含Rac抑制剂。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其中所述Wnt信号转导途径抑制物质包含对于非经典Wnt途径具有抑制活性的物质。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的制备方法，其中在所述第一步骤、第二步骤、b步骤以及第三步骤的任意一个以上的步骤中，还存在TGF信号转导途径抑制物质。
10.根据权利要求1～8中任一项所述的制备方法，其中在所述第一步骤、第二步骤、b步骤以及第三步骤的任意一个以上的步骤中，还存在TAK1抑制物质。
11.根据权利要求1～8中任一项所述的制备方法，其中在所述第二步骤、b步骤以及第三步骤的任意一个以上的步骤中，还存在FGF信号转导途径作用物质。
12.根据权利要求1～8中任一项所述的制备方法，其中在所述第二步骤、b步骤以及第三步骤的任意一个以上的步骤中，还存在具有减轻氧化应激作用的物质。
13.根据权利要求1～8中任一项所述的制备方法，其中在所述第二步骤、b步骤以及第三步骤的任意一个以上的步骤中，还存在针对应激反应信号转导途径的抑制物质。
14.根据权利要求1～8中任一项所述的制备方法，其中在所述第二步骤、b步骤以及第三步骤的任意一个以上的步骤中，一边摇动一边培养细胞。
15.根据权利要求1～8中任一项所述的制备方法，其中所述第一步骤得到的细胞群为细胞聚集体。
16.根据权利要求1～8中任一项所述的制备方法，其中将所述第一步骤、第二步骤、b步骤以及第三步骤的任意一个以上的步骤在形成至少1个孔的培养器材中实施，所述孔被分成多个微孔，实施悬浮培养，使得每个所述微孔形成1个细胞团。
17.垂体组织的制备方法，其特征在于，从通过权利要求1～8中任一项所述的制备方法得到的包含垂体组织的细胞群回收垂体组织。
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