JP2022088676A - 幹細胞由来外胚葉系統前駆体を分化する方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】幹細胞由来外胚葉系統前駆体を分化する方法の提供。【解決手段】本開示の主題は、ヒト幹細胞の神経堤、頭蓋プラコードまたは非神経外胚葉の前駆体への分化を誘導するin vitro方法、およびこのような方法によって生成される細胞を提供する。本開示の主題は、神経変性障害および下垂体障害を処置するためのこのような細胞の使用も提供する。本開示は、4つのシグナル伝達経路のモジュレーションが、初期の外胚葉系統の選択の十分な多様性を再現するのに十分であることを示す。本開示に示される結果は、最小限の培地系において、少量の小分子を使用するin vivoでの発生を模倣することによって、外胚葉細胞の運命の決定を再現することができることを実証する。【選択図】なし
Description
関連出願への相互参照
この出願は、2016年2月5日に出願された米国仮出願第62/292,014号、2016年2月24日に出願された米国仮出願第62/299,361号、および2016年6月14日に出願された米国仮出願第62/350,032号に対する優先権を主張する(それぞれの内容は、それらの全体が参考として本明細書に援用され、それぞれに対する優先権が主張される)。
この出願は、2016年2月5日に出願された米国仮出願第62/292,014号、2016年2月24日に出願された米国仮出願第62/299,361号、および2016年6月14日に出願された米国仮出願第62/350,032号に対する優先権を主張する(それぞれの内容は、それらの全体が参考として本明細書に援用され、それぞれに対する優先権が主張される)。
1.序論
本開示の主題は、ヒト幹細胞から誘導される4つの主要な外胚葉系統、CNS、神経堤、頭蓋プラコード、および非神経外胚葉の細胞、ならびに神経障害の細胞ベースの処置および薬物発見のためのそれらの使用に関する。
本開示の主題は、ヒト幹細胞から誘導される4つの主要な外胚葉系統、CNS、神経堤、頭蓋プラコード、および非神経外胚葉の細胞、ならびに神経障害の細胞ベースの処置および薬物発見のためのそれらの使用に関する。
2.発明の背景
ヒトにおいて、初期発生細胞型は単離および研究するのが困難である。多能性幹細胞(PSC)の方向付けられた分化によって、基礎生物学およびトランスレーショナルバイオロジーに適用するための体系的手法において、初期運命決定にアクセスするモデル系が提供される。in vivoでの発生の間に作用することが公知である発生経路のin vitroでのモジュレーションに基づき、自然分化パラダイムおよび方向付けられた分化ストラテジーなどの初期系統へPSCを分化させるためのいくつかのストラテジーが存在する。様々な分化プラットホームにわたって帰結に大きく影響を及ぼす因子として、フィーダー細胞の使用、単層に基づくストラテジー対胚葉体に基づくストラテジー、または複合培地組成が挙げられる。例えば、多くの公開されたプロトコルには、血清または所望の運命を誘導するためのKSRなどの血清置換因子を含有する培地が関与する。これらの試薬の製造におけるバッチ間変動は、分化の再現性に影響を及ぼし、目的の特異的細胞型を生成するために骨の折れるロット試験の遂行を必須とすることが多い(Blauwkampら、2
012年)。KSRなどの複雑な試薬に対するこのような広範な品質管理ストラテジーは、任意の単一のプロトコルについては実行可能であるが、これらは、モジュール形式で何十もの、またはおそらく何百もの定義された細胞型を生成することを目的とする、より意欲的なストラテジーの開発を妨げる。
ヒトにおいて、初期発生細胞型は単離および研究するのが困難である。多能性幹細胞(PSC)の方向付けられた分化によって、基礎生物学およびトランスレーショナルバイオロジーに適用するための体系的手法において、初期運命決定にアクセスするモデル系が提供される。in vivoでの発生の間に作用することが公知である発生経路のin vitroでのモジュレーションに基づき、自然分化パラダイムおよび方向付けられた分化ストラテジーなどの初期系統へPSCを分化させるためのいくつかのストラテジーが存在する。様々な分化プラットホームにわたって帰結に大きく影響を及ぼす因子として、フィーダー細胞の使用、単層に基づくストラテジー対胚葉体に基づくストラテジー、または複合培地組成が挙げられる。例えば、多くの公開されたプロトコルには、血清または所望の運命を誘導するためのKSRなどの血清置換因子を含有する培地が関与する。これらの試薬の製造におけるバッチ間変動は、分化の再現性に影響を及ぼし、目的の特異的細胞型を生成するために骨の折れるロット試験の遂行を必須とすることが多い(Blauwkampら、2
012年)。KSRなどの複雑な試薬に対するこのような広範な品質管理ストラテジーは、任意の単一のプロトコルについては実行可能であるが、これらは、モジュール形式で何十もの、またはおそらく何百もの定義された細胞型を生成することを目的とする、より意欲的なストラテジーの開発を妨げる。
それぞれBMPおよびTGFβシグナル伝達経路を阻害し、それによりSMADシグナル伝達を阻害する小分子であるLDN193189およびSB431542の添加に基づいて、神経系の複数の細胞型を誘導するプロトコルが確立されてきた。SMAD二重阻害(dSMADi)と称されるこの阻害カクテルの組合せは、転写因子Pax6の発現によって特徴付けられる前部神経外胚葉(NE)へと初期化する中枢神経系(CNS)における細胞の効率的な生成を可能とする(Chambersら、2009年)。dSMADiへの改変により、前脳、中脳および脊髄前駆細胞を含む胚の脳脊髄軸に沿った多くの異なる神経亜型を得ることができる。さらに、dSMADiは、神経堤(NC)(Micaら、2013年)、頭蓋プラコード(CP)および非神経外胚葉(NNE)(Dincerら、2013年)などの非CNS細胞型を生成するように適応させることもできる。総体的に、dSMADiは、Pax6+NEのほぼ均一な層を生成する堅固かつ広く使用されるプラットホームである。しかし、dSMADi下でPax6+NEを誘導するためにさえ、Pax6+細胞における最も前部の終脳マーカーFOXG1+の獲得は、KSRバッチ変動によって影響を受けうる。したがって、スケーラブルかつ十分なモジュール分化プラットホームは、KSRまたは他の複雑な培地因子を避けるべきである。
Blauwkamp, T.A., Nigam, S., Ardehali, R., Weissman, I.L., and Nusse, R. (2012). Endogenous Wnt signalling in human embryonic stem cells generates an equilibrium of distinct lineage-specified progenitors. Nature communications 3, 1070.
Chambers, S.M., Fasano, C.A., Papapetrou, E.P., Tomishima, M., Sadelain, M., and Studer, L. (2009). Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature biotechnology 27, 275-280.
Mica, Y., Lee, G., Chambers, S.M., Tomishima, M.J., and Studer, L. (2013). Modeling neural crest induction, melanocyte specification, and disease-related pigmentation defects in hESCs and patient-specific iPSCs. Cell reports 3, 1140-1152.
Dincer, Z., Piao, J., Niu, L., Ganat, Y., Kriks, S., Zimmer, B., Shi, S.H., Tabar, V., and Studer, L. (2013). Specification of functional cranial placode derivatives from human pluripotent stem cells. Cell reports 5, 1387-1402.
3.発明の要旨
本開示の主題は、例えば、in vitro分化によって、ヒト幹細胞から誘導される神経堤(NC)、頭蓋プラコード(CP)、および非神経外胚葉(NNE)前駆体に関する。
本開示の主題は、例えば、in vitro分化によって、ヒト幹細胞から誘導される神経堤(NC)、頭蓋プラコード(CP)、および非神経外胚葉(NNE)前駆体に関する。
本開示の主題は、BMPシグナル伝達の活性化を伴う、SMADシグナル伝達の阻害(例えば、TGFβ/アクチビン-Nodalシグナル伝達の阻害)であって、BMPシグナル伝達が、細胞の有効量の1種または複数のSMAD阻害剤および1種または複数のBMP活性化剤への最初の接触の少なくとも2日後に活性化され、細胞を有効量の1種または複数のNC、CPまたはNNE系統に特異的な活性化剤および阻害剤とさらに接触させる阻害によって、神経堤、頭蓋プラコードおよび非神経外胚葉の非CNS外胚葉系統をヒト幹細胞から分化させることができるという発見に、少なくとも部分的に基づく。例えば、幹細胞は、細胞を有効量の1種または複数のWnt活性化剤とさらに接触させることによってNCに分化させることができ、CPは、幹細胞を有効量の1種または複数のFGFの活性化剤とさらに接触させることによって幹細胞から分化させることができ、NNEは、幹細胞を有効量の1種または複数のFGFの阻害剤とさらに接触させることによって幹細胞から分化させることができる。
ある特定の実施形態では、細胞を有効量の形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/アクチビン-Nodalシグナル伝達の1種または複数の阻害剤およびBMPシグナル伝達の1種または複数の活性化剤に少なくとも約2日間接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を有効量の形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/アクチビン-Nodalシグナル伝達の1種または複数の阻害剤に少なくとも約12日間接触させる。ある特定の実施形態では、有効量の形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/アクチビン-Nodalシグナル伝達の1種または複数の阻害剤およびBMPシグナル伝達の1種または複数の活性化剤を細胞の集団に同時に接触させる。
ある特定の実施形態では、本開示の主題は、ヒト幹細胞の非CNS NC前駆体への分化を誘導するためのin vitro方法であって、ヒト幹細胞の集団を有効量のTGFβ/アクチビン-Nodalシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、有効量のBMPシグナル伝達の1種または複数の活性化剤、および有効量のウイングレス(Wnt)シグナル伝達の1種または複数の活性化剤と接触させるステップを含む方法を提供する。ある特定の実施形態では、細胞を有効量のBMPシグナル伝達の1種または複数の活性化剤と少なくとも約2日間、または少なくとも約3日間接触させ、TFAP2A、TFAP2B、NEUROG1、HAND1、ISL1、BRN3aおよび/またはMASH1から選択される1種または複数のマーカーの検出可能なレベルを発現する細胞の集団を生成する。ある特定の実施形態では、細胞を有効量の前述の薬剤と一定期間接触させ、その結果、細胞の少なくとも10%、20%、30%、40%、50%もしくは60%またはそれより多くが前述のマーカーの検出可能なレベルを発現する。ある特定の実施形態では、有効量のWntシグナル伝達の1種または複数の活性化剤およびTGFβ/アクチビン-Nodalシグナル伝達の1種または複数の阻害剤を細胞に同時に接触させ、Wnt活性化剤の濃度は、細胞をWnt活性化剤と最初に接触させてから約2日後に増加し、細胞をレベルの上昇したWntと約10、11、もしくは12日またはそれより多い日数までの間接触させる。ある特定の実施形態では、細胞は、例えば、有効量のTGFβ/アクチビン-Nodalシグナル伝達の1種または複数の阻害剤と最初に接触させてから約12日後に、検出可能なレベルのSOX10を発現する。ある特定の実施形態では、細胞を有効量の前述の薬剤と一定期間接触させ、その結果、細胞の少なくとも10%、20%、30%、40%、50%もしくは60%またはそれより多くがSOX10の検出可能なレベルを発現する。
ある特定の実施形態では、本開示の主題は、ヒト幹細胞の非CNS CP前駆体への分化を誘導するためのin vitro方法であって、ヒト幹細胞の集団を有効量のTGFβ/アクチビン-Nodalシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、有効量のBMPシグナル伝達の1種または複数の活性化剤、および有効量の線維芽細胞成長因子(FGF)シグナル伝達の1種または複数の活性化剤と接触させるステップを含む方法を提供する。ある特定の実施形態では、細胞を有効量のBMPシグナル伝達の1種または複数の活性化剤と少なくとも約2日間、または少なくとも約3日間接触させ、TFAP2A、TFAP2B、NEUROG1、HAND1、ISL1、BRN3aおよび/またはMASH1から選択される1種または複数のマーカーの検出可能なレベルを発現する細胞の集団を生成する。ある特定の実施形態では、細胞を有効量の前述の薬剤と一定期間接触させ、その結果、細胞の少なくとも10%、20%、30%、40%、50%もしくは60%またはそれより多くが前述のマーカーの検出可能なレベルを発現する。ある特定の実施形態では、細胞をTGFβ/アクチビン-Nodalシグナル伝達の阻害剤と接触させてから少なくとも2日後に、有効量のFGFシグナル伝達の1種または複数の活性化剤を細胞に接触させる。ある特定の実施形態では、細胞は、例えば、TGFβ/アクチビン-Nodalシグナル伝達の阻害剤と最初に接触させてから約12日後に、検出可能なレベルのSIX1および/またはELAVL4を発現する。ある特定の実施形態では、細胞は、細胞をTGFβ/アクチビン-Nodalシグナル伝達の阻害剤と接触させてから約12日後に、SIX1、PAX6、PITX3、クリスタリンアルファA、および/またはクリスタリンアルファBから選択される1種または複数の水晶体プラコード前駆体マーカーの検出可能なレベルを発現する。ある特定の実施形態では、細胞を有効量の前述の薬剤と一定期間接触させ、その結果、細胞の少なくとも10%、20%、30%、40%、50%もしくは60%またはそれより多くが前述のマーカーの検出可能なレベルを発現する。
ある特定の実施形態では、細胞を有効量のTGFβ/アクチビン-Nodalシグナル伝達の1種または複数の阻害剤と接触させてから少なくとも2日後に、有効量のWntシグナル伝達の1種または複数の活性化剤とさらに接触させ、細胞を有効量の1種または複数のWnt活性化剤と約2日間接触させる。ある特定の実施形態では、細胞のWntの活性剤との接触中または接触後には細胞をFGFの活性化剤と接触させない。ある特定の実施形態では、細胞は、例えば、有効量のTGFβ/アクチビン-Nodalシグナル伝達の1種または複数の阻害剤と最初に接触させてから約12日後に、三叉神経プラコード前駆体マーカーであるPAX3の検出可能なレベルを発現する。ある特定の実施形態では、細胞を有効量の前述の薬剤と一定期間接触させ、その結果、細胞の少なくとも10%、20%、30%、40%、50%もしくは60%またはそれより多くがSI1および/またはPAX3の検出可能なレベルを発現する。
ある特定の実施形態では、本開示の主題は、細胞を有効量のTGFβ/アクチビン-Nodalシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、有効量のBMPシグナル伝達の1種または複数の活性化剤、有効量のソニックヘッジホッグ(SHH)シグナル伝達の1種または複数の活性化剤、および有効量のFGFシグナル伝達の1種、2種またはそれより多い活性化剤と接触させることによって、ヒト幹細胞の下垂体細胞、またはその頭蓋プラコード前駆体への分化を誘導するためのin vitro方法を提供する。ある特定の実施形態では、FGFシグナル伝達の活性化剤は、FGF8およびFGF10シグナル伝達を活性化する。ある特定の実施形態では、細胞を有効量のBMPシグナル伝達の1種または複数の活性化剤と少なくとも約2日間、または少なくとも約3日間接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を有効量のTGFβ/アクチビン-Nodalシグナル伝達の1種または複数の阻害剤と接触させてから少なくとも4日後に、有効量のSHHシグナル伝達の1種または複数の活性化剤および有効量のFGFシグナル伝達の1種、2種またはそれより多い活性化剤と接触させ、細胞を1種または複数のSHH活性化剤および1種、2種またはそれより多いFGF活性化剤と少なくとも26日またはそれより多い日数までの間接触させる。
ある特定の実施形態では、下垂体細胞、またはその頭蓋プラコード前駆体の集団を生成する前述の方法は、PITX1、PITX2、LUX、LHX4、HESX1、SIX6、TBX19、PAX6、またはこれらの組合せから選択される1種または複数のマーカーの検出可能なレベルを発現する細胞の集団を生成する。ある特定の実施形態では、細胞を有効量の前述の薬剤と一定期間接触させ、その結果、細胞の少なくとも10%、20%、30%、40%、50%もしくは60%またはそれより多くが前述のマーカーの検出可能なレベルを発現する。
ある特定の実施形態では、細胞を有効量の1種または複数の背方化剤、例えば、FGFシグナル伝達の活性化剤;有効量の1種または複数の腹方化剤、例えば、BMPシグナル伝達の活性化剤;またはこれらの組合せとさらに接触させ、ここで、細胞を有効量のTGFβ/アクチビン-Nodalシグナル伝達の1種または複数の阻害剤と接触させてから少なくとも30日後に、薬剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を有効量の薬剤と少なくとも30日またはそれより多い日数の間接触させる。
ある特定の実施形態では、本開示の主題は、ヒト幹細胞の非CNS NNE前駆体への分化を誘導するためのin vitro方法であって、ヒト幹細胞の集団を有効量のTGFβ/アクチビン-Nodalシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、有効量のBMPシグナル伝達の1種または複数の活性化剤、および有効量のFGFシグナル伝達の1種または複数の阻害剤と接触させるステップを含むin vitro方法を提供する。ある特定の実施形態では、細胞は、例えば、有効量のTGFβ/アクチビン-Nodalシグナル伝達の1種または複数の阻害剤と最初に接触させてから約12日後に、検出可能なレベルのTFAP2Aを発現し、検出可能なレベルのSIX1および/またはSOX10を発現しない。ある特定の実施形態では、細胞を有効量の前述の薬剤と一定期間接触させ、その結果、細胞の少なくとも10%、20%、30%、40%、50%もしくは60%またはそれより多くがTFAP2Aの検出可能なレベルを発現する。
ある特定の実施形態では、方法は、前記ヒト幹細胞の集団を前記有効量のTGFβ/アクチビン-Nodalシグナル伝達の1種または複数の阻害剤および前記有効量のBMPシグナル伝達の1種または複数の活性化剤と同時に接触させるステップを含む。
ある特定の実施形態では、前記ヒト幹細胞の集団を、前記有効量のTGFβ/アクチビン-Nodalシグナル伝達の1種または複数の阻害剤との最初の接触から約12日目またはその後に、1種または複数の神経堤、頭蓋プラコードまたは非神経外胚葉系統マーカーを発現する分化細胞の集団へと分化させる。
本開示は、本明細書に記載されている方法に従って調製された1種または複数の神経堤、頭蓋プラコードまたは非神経外胚葉系統マーカーを発現するin vitroで分化した細胞の集団も提供する。ある特定の実施形態では、分化細胞集団は、ヒト幹細胞の集団から誘導される。本開示の主題は、このような分化細胞集団を含む組成物を、さらに提供する。
さらに、本開示の主題は、幹細胞の分化を誘導するためのキットを提供する。
ある特定の実施形態では、キットは、(a)形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/アクチビン-Nodalシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、(b)BMPシグナル伝達の1種または複数の活性化剤、(c)Wntシグナル伝達の1種または複数の活性化剤、および(d)幹細胞の、1種または複数の神経堤系統マーカーを発現する分化細胞の集団への分化を誘導するための指示書を含む。
ある特定の実施形態では、キットは、(a)形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/アクチビン-Nodalシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、(b)BMPシグナル伝達の1種または複数の活性化剤、(c)FGFシグナル伝達の1種または複数の活性化剤、および(d)幹細胞の、1種または複数の頭蓋プラコード系統マーカーを発現する分化細胞の集団への分化を誘導するための指示書を含む。ある特定の実施形態では、キットは、任意選択で、(e)Wntシグナル伝達の1種または複数の活性化剤を含む。
ある特定の実施形態では、キットは、(a)形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/アクチビン-Nodalシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、(b)BMPシグナル伝達の1種または複数の活性化剤、(c)FGFシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、および(d)幹細胞の、1種または複数の非神経外胚葉系統マーカーを発現する分化細胞の集団への分化を誘導するための指示書を含む。
ある特定の実施形態では、キットは、(a)形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/アクチビン-Nodalシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、(b)BMPシグナル伝達の1種または複数の活性化剤、(c)SHHシグナル伝達の1種または複数の活性化剤、(d)FGFシグナル伝達の2種またはそれより多い活性化剤、および(e)幹細胞の、1種または複数の下垂体細胞、または下垂体細胞前駆体マーカーを発現する分化細胞の集団への分化を誘導するための指示書を含む。
ある特定の実施形態では、本開示は、本明細書に記載されている方法に従って調製された幹細胞由来の前駆体を含むキットを提供する。ある特定の実施形態では、幹細胞由来の細胞は、成熟した分化細胞である。
ある特定の実施形態では、TGFβ/アクチビン-Nodalシグナル伝達の前記1種または複数の阻害剤は、SB431542、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群より選択される小分子である。ある特定の実施形態では、Wntシグナル伝達の前記1種または複数の活性化剤は、Wntシグナル伝達の活性化のためにグリコーゲン合成酵素キナーゼ3β(GSK3β)を低下させる。ある特定の実施形態では、Wntシグナル伝達の前記1種または複数の活性化剤は、CHIR99021、WNT3A、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群より選択される小分子である。ある特定の実施形態では、FGFシグナル伝達の前記活性化剤は、FGF2、FGF8、FGF10、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群より選択される。ある特定の実施形態では、FGFシグナル伝達の前記阻害剤は、SU5402、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群より選択される小分子である。ある特定の実施形態では、BMPシグナル伝達の前記活性化剤は、BMP4、BMP2、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群より選択される。ある特定の実施形態では、SHHシグナル伝達の活性化剤は、ソニックヘッジホッグ(SHH)、C25IIおよび平滑化(SMO)受容体小分子アゴニスト、例えば、パルモルファミン、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群より選択される。
ある特定の実施形態では、前記ヒト幹細胞は、ヒト胚性幹細胞、ヒト人工多能性幹細胞、ヒト単為生殖幹細胞、始原生殖細胞様多能性幹細胞(primordial germ
cell-like pluripotent stem cell)、胚盤葉上層幹細胞、およびFクラス多能性幹細胞からなる群より選択される。
cell-like pluripotent stem cell)、胚盤葉上層幹細胞、およびFクラス多能性幹細胞からなる群より選択される。
ある特定の実施形態では、方法は、分化細胞の前記集団を、前記分化細胞のNC由来ニューロン、CP由来ニューロンまたはNNE由来細胞の集団への成熟に好ましい条件に供するステップを含む。
本開示の主題は、被験体の神経変性障害または下垂体障害を処置する方法をさらに提供する。ある特定の実施形態では、方法は、有効量の本明細書に記載されている分化細胞集団を、神経変性障害または下垂体障害を患っている被験体に投与するステップを含む。
本開示の主題は、被験体の神経変性障害または下垂体障害を処置するための本明細書に記載されている分化細胞集団をさらに提供する。
本開示の主題は、神経変性障害または下垂体障害を処置するための医薬の製造における、本明細書に記載されている分化細胞集団の使用をさらに提供する。
ある特定の実施形態では、下垂体障害は、下垂体機能低下障害である。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される:
(項目1)
幹細胞の分化を誘導するためのin vitro方法であって、幹細胞の集団を有効量の形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/アクチビン-Nodalシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、およびBMPシグナル伝達の1種または複数の活性化剤と少なくとも約2日間接触させるステップを含み、幹細胞の前記集団を、有効量の
(a)Wntシグナル伝達の1種または複数の活性化剤、
(b)FGFシグナル伝達の1種または複数の活性化剤、および
(c)FGFシグナル伝達の1種または複数の阻害剤
の1つまたは複数とさらに接触させて、1種または複数の神経堤、頭蓋プラコード、または非神経外胚葉系統マーカーを発現する分化細胞の集団を生成するin vitro方法。
(項目2)
幹細胞の前記集団を形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/アクチビン-Nodalシグナル伝達の前記1種または複数の阻害剤と少なくとも約12日間接触させるステップを含む、項目1に記載の方法。
(項目3)
形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/アクチビン-Nodalシグナル伝達の前記1種または複数の阻害剤とBMPシグナル伝達の1種または複数の活性化剤を、幹細胞の前記集団に同時に接触させる、項目1に記載の方法。
(項目4)
幹細胞の前記集団を、Wntシグナル伝達の1種または複数の活性化剤と接触させ、ここで、前記細胞が、1種または複数の神経堤系統マーカーを発現する、項目1に記載の方法。
(項目5)
形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/アクチビン-Nodalシグナル伝達の前記1種または複数の阻害剤とWntシグナル伝達の1種または複数の活性化剤を、幹細胞の前記集団に同時に接触させる、項目4に記載の方法。
(項目6)
幹細胞の前記集団を、FGFシグナル伝達の1種または複数の活性化剤と接触させ、ここで、前記細胞が、1種または複数の頭蓋プラコード系統マーカーを発現する、項目1に記載の方法。
(項目7)
FGFシグナル伝達の前記活性化剤を、前記細胞のTGFβ/アクチビン-Nodalシグナル伝達の前記1種または複数の阻害剤との最初の接触の約2日後に、幹細胞の前記集団に接触させる、項目6に記載の方法。
(項目8)
前記頭蓋プラコード系統マーカーが、水晶体プラコード系統マーカーである、項目6に記載の方法。
(項目9)
幹細胞の前記集団をWntシグナル伝達の1種または複数の活性化剤と接触させるステップをさらに含み、前記細胞が、1種または複数の三叉神経プラコード系統マーカーを発現する、項目6に記載の方法。
(項目10)
Wntシグナル伝達の前記活性化剤を、前記細胞のTGFβ/アクチビン-Nodalシグナル伝達の前記1種または複数の阻害剤との最初の接触の約2日後に、幹細胞の前記集団に接触させる、項目9に記載の方法。
(項目11)
幹細胞の前記集団を、FGFシグナル伝達の1種または複数の阻害剤と接触させ、ここで、前記細胞が、1種または複数の非神経外胚葉系統マーカーを発現する、項目1に記
載の方法。
(項目12)
形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/アクチビン-Nodalシグナル伝達の前記1種または複数の阻害剤とFGFシグナル伝達の1種または複数の阻害剤を、幹細胞の前記集団に同時に接触させる、項目11に記載の方法。
(項目13)
幹細胞の前記集団の、TGFβ/アクチビン-Nodalシグナル伝達の前記1種または複数の阻害剤との最初の接触から約12日目またはその後に、前記神経堤、頭蓋プラコード、または非神経外胚葉系統マーカーの1種または複数を発現する分化細胞の集団へと分化させる、項目1に記載の方法。
(項目14)
TGFβ/アクチビン-Nodalシグナル伝達の前記1種または複数の阻害剤が、SB431542、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群より選択される小分子を含む、項目1に記載の方法。
(項目15)
Wntシグナル伝達の前記1種または複数の活性化剤が、Wntシグナル伝達の活性化のためにグリコーゲン合成酵素キナーゼ3β(GSK3β)を低下させる、項目4または9に記載の方法。
(項目16)
Wntシグナル伝達の前記1種または複数の活性化剤が、CHIR99021、そのWNT3A誘導体、およびそれらの混合物からなる群より選択される小分子である、項目4または9に記載の方法。
(項目17)
FGFシグナル伝達の前記1種または複数の活性化剤が、FGF2、その誘導体、およびそれらの混合物を含む、項目6に記載の方法。
(項目18)
前記1種または複数の神経堤系統マーカーが、SOX10からなる群より選択される、項目1に記載の方法。
(項目19)
前記1種または複数の頭蓋プラコード系統マーカーが、SIX1、PAX3、PITX3、クリスタリンアルファA、クリスタリンアルファB、およびこれらの組合せからなる群より選択される、項目1に記載の方法。
(項目20)
前記1種または複数の非神経外胚葉系統マーカーが、TFAP2A、および検出可能なSIX1およびSOX10発現の非存在からなる群より選択される、項目1に記載の方法。
(項目21)
前記幹細胞が、ヒト胚性幹細胞、ヒト人工多能性幹細胞、ヒト単為生殖幹細胞、始原生殖細胞様多能性幹細胞、胚盤葉上層幹細胞、およびFクラス多能性幹細胞からなる群より選択される、項目1に記載の方法。
(項目22)
幹細胞の分化を誘導するためのin vitro方法であって、
幹細胞の集団を有効量の
(a)形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/アクチビン-Nodalシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、
(b)少なくとも約2日間のBMPシグナル伝達の1種または複数の活性化剤、
(c)SHHシグナル伝達の1種または複数の活性化剤、および
(d)FGFシグナル伝達の2種またはそれより多い活性化剤
と接触させるステップを含み、
細胞の前記集団を、(c)および(d)に約20日間またはそれより長い間接触させて、
1種または複数の下垂体プラコード系統マーカーを発現する分化細胞の集団を生成するin vitro方法。
(項目23)
1種または複数の神経堤、頭蓋プラコード、または非神経外胚葉系統マーカーを発現するin vitroで分化した細胞の集団であって、項目1から22のいずれか一項に記載の方法に従って幹細胞の集団から誘導されるin vitroで分化した細胞の集団。(項目24)
項目23に記載のin vitroで分化した細胞の集団を含む組成物。
(項目25)
被験体における神経変性障害または下垂体障害を処置する方法であって、有効量の項目23に記載のin vitroで分化した細胞を、神経変性障害を患っている被験体へと投与するステップを含む方法。
(項目26)
前記下垂体障害が下垂体機能低下障害である、項目25に記載の方法。
(項目27)
神経変性障害または下垂体障害を処置するための医薬の製造における、項目23に記載のin vitroで分化した細胞集団の使用。
(項目28)
前記下垂体障害が下垂体機能低下障害である、項目27に記載の使用。
(項目29)
幹細胞の分化を誘導するためのキットであって、有効量の1種または複数の
(a)形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/アクチビン-Nodalシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、
(b)BMPシグナル伝達の1種または複数の活性化剤、
(c)ウイングレス(Wnt)シグナル伝達の1種または複数の活性化剤、
(c)FGFシグナル伝達の1種または複数の活性化剤、
(d)FGFシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、
(e)SHHシグナル伝達の1種または複数の活性化剤、および
(f)前記幹細胞の、1種または複数の神経堤、頭蓋プラコード、または非神経外胚葉系統マーカーを発現する分化細胞の集団への分化を誘導するための指示書
を含むキット。
(項目30)
幹細胞の分化を誘導するためのキットであって、有効量の
(a)形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/アクチビン-Nodalシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、
(b)BMPシグナル伝達の1種または複数の活性化剤、
(c)ウイングレス(Wnt)シグナル伝達の1種または複数の活性化剤、および
(d)前記幹細胞の、1種または複数の神経堤系統マーカーを発現する分化細胞の集団への分化を誘導するための指示書
を含むキット。
(項目31)
幹細胞の分化を誘導するためのキットであって、有効量の
(a)形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/アクチビン-Nodalシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、
(b)BMPシグナル伝達の1種または複数の活性化剤、
(c)FGFシグナル伝達の1種または複数の活性化剤、および
(d)前記幹細胞の、1種または複数の頭蓋プラコード系統マーカーを発現する分化細胞の集団への分化を誘導するための指示書
を含むキット。
(項目32)
(e)ウイングレス(Wnt)シグナル伝達の1種または複数の活性化剤をさらに含む、項目31に記載のキット。
(項目33)
幹細胞の分化を誘導するためのキットであって、有効量の
(a)形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/アクチビン-Nodalシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、
(b)BMPシグナル伝達の1種または複数の活性化剤、
(c)SHHシグナル伝達の1種または複数の活性化剤、
(d)FGFシグナル伝達の2種またはそれより多い活性化剤、および
(e)前記幹細胞の、1種または複数の下垂体プラコード系統マーカーを発現する分化細胞の集団への分化を誘導するための指示書
を含むキット。
(項目34)
幹細胞の分化を誘導するためのキットであって、有効量の
(a)形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/アクチビン-Nodalシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、
(b)BMPシグナル伝達の1種または複数の活性化剤、
(c)FGFシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、および
(d)前記幹細胞の、1種または複数の非神経外胚葉系統マーカーを発現する分化細胞の集団への分化を誘導するための指示書
を含むキット。
(項目35)
分化した幹細胞の集団を含むキットであって、幹細胞の前記集団を、項目1から22のいずれか一項に記載の方法に従って分化させるキット。
4.図面の簡単な説明
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される:
(項目1)
幹細胞の分化を誘導するためのin vitro方法であって、幹細胞の集団を有効量の形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/アクチビン-Nodalシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、およびBMPシグナル伝達の1種または複数の活性化剤と少なくとも約2日間接触させるステップを含み、幹細胞の前記集団を、有効量の
(a)Wntシグナル伝達の1種または複数の活性化剤、
(b)FGFシグナル伝達の1種または複数の活性化剤、および
(c)FGFシグナル伝達の1種または複数の阻害剤
の1つまたは複数とさらに接触させて、1種または複数の神経堤、頭蓋プラコード、または非神経外胚葉系統マーカーを発現する分化細胞の集団を生成するin vitro方法。
(項目2)
幹細胞の前記集団を形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/アクチビン-Nodalシグナル伝達の前記1種または複数の阻害剤と少なくとも約12日間接触させるステップを含む、項目1に記載の方法。
(項目3)
形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/アクチビン-Nodalシグナル伝達の前記1種または複数の阻害剤とBMPシグナル伝達の1種または複数の活性化剤を、幹細胞の前記集団に同時に接触させる、項目1に記載の方法。
(項目4)
幹細胞の前記集団を、Wntシグナル伝達の1種または複数の活性化剤と接触させ、ここで、前記細胞が、1種または複数の神経堤系統マーカーを発現する、項目1に記載の方法。
(項目5)
形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/アクチビン-Nodalシグナル伝達の前記1種または複数の阻害剤とWntシグナル伝達の1種または複数の活性化剤を、幹細胞の前記集団に同時に接触させる、項目4に記載の方法。
(項目6)
幹細胞の前記集団を、FGFシグナル伝達の1種または複数の活性化剤と接触させ、ここで、前記細胞が、1種または複数の頭蓋プラコード系統マーカーを発現する、項目1に記載の方法。
(項目7)
FGFシグナル伝達の前記活性化剤を、前記細胞のTGFβ/アクチビン-Nodalシグナル伝達の前記1種または複数の阻害剤との最初の接触の約2日後に、幹細胞の前記集団に接触させる、項目6に記載の方法。
(項目8)
前記頭蓋プラコード系統マーカーが、水晶体プラコード系統マーカーである、項目6に記載の方法。
(項目9)
幹細胞の前記集団をWntシグナル伝達の1種または複数の活性化剤と接触させるステップをさらに含み、前記細胞が、1種または複数の三叉神経プラコード系統マーカーを発現する、項目6に記載の方法。
(項目10)
Wntシグナル伝達の前記活性化剤を、前記細胞のTGFβ/アクチビン-Nodalシグナル伝達の前記1種または複数の阻害剤との最初の接触の約2日後に、幹細胞の前記集団に接触させる、項目9に記載の方法。
(項目11)
幹細胞の前記集団を、FGFシグナル伝達の1種または複数の阻害剤と接触させ、ここで、前記細胞が、1種または複数の非神経外胚葉系統マーカーを発現する、項目1に記
載の方法。
(項目12)
形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/アクチビン-Nodalシグナル伝達の前記1種または複数の阻害剤とFGFシグナル伝達の1種または複数の阻害剤を、幹細胞の前記集団に同時に接触させる、項目11に記載の方法。
(項目13)
幹細胞の前記集団の、TGFβ/アクチビン-Nodalシグナル伝達の前記1種または複数の阻害剤との最初の接触から約12日目またはその後に、前記神経堤、頭蓋プラコード、または非神経外胚葉系統マーカーの1種または複数を発現する分化細胞の集団へと分化させる、項目1に記載の方法。
(項目14)
TGFβ/アクチビン-Nodalシグナル伝達の前記1種または複数の阻害剤が、SB431542、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群より選択される小分子を含む、項目1に記載の方法。
(項目15)
Wntシグナル伝達の前記1種または複数の活性化剤が、Wntシグナル伝達の活性化のためにグリコーゲン合成酵素キナーゼ3β(GSK3β)を低下させる、項目4または9に記載の方法。
(項目16)
Wntシグナル伝達の前記1種または複数の活性化剤が、CHIR99021、そのWNT3A誘導体、およびそれらの混合物からなる群より選択される小分子である、項目4または9に記載の方法。
(項目17)
FGFシグナル伝達の前記1種または複数の活性化剤が、FGF2、その誘導体、およびそれらの混合物を含む、項目6に記載の方法。
(項目18)
前記1種または複数の神経堤系統マーカーが、SOX10からなる群より選択される、項目1に記載の方法。
(項目19)
前記1種または複数の頭蓋プラコード系統マーカーが、SIX1、PAX3、PITX3、クリスタリンアルファA、クリスタリンアルファB、およびこれらの組合せからなる群より選択される、項目1に記載の方法。
(項目20)
前記1種または複数の非神経外胚葉系統マーカーが、TFAP2A、および検出可能なSIX1およびSOX10発現の非存在からなる群より選択される、項目1に記載の方法。
(項目21)
前記幹細胞が、ヒト胚性幹細胞、ヒト人工多能性幹細胞、ヒト単為生殖幹細胞、始原生殖細胞様多能性幹細胞、胚盤葉上層幹細胞、およびFクラス多能性幹細胞からなる群より選択される、項目1に記載の方法。
(項目22)
幹細胞の分化を誘導するためのin vitro方法であって、
幹細胞の集団を有効量の
(a)形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/アクチビン-Nodalシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、
(b)少なくとも約2日間のBMPシグナル伝達の1種または複数の活性化剤、
(c)SHHシグナル伝達の1種または複数の活性化剤、および
(d)FGFシグナル伝達の2種またはそれより多い活性化剤
と接触させるステップを含み、
細胞の前記集団を、(c)および(d)に約20日間またはそれより長い間接触させて、
1種または複数の下垂体プラコード系統マーカーを発現する分化細胞の集団を生成するin vitro方法。
(項目23)
1種または複数の神経堤、頭蓋プラコード、または非神経外胚葉系統マーカーを発現するin vitroで分化した細胞の集団であって、項目1から22のいずれか一項に記載の方法に従って幹細胞の集団から誘導されるin vitroで分化した細胞の集団。(項目24)
項目23に記載のin vitroで分化した細胞の集団を含む組成物。
(項目25)
被験体における神経変性障害または下垂体障害を処置する方法であって、有効量の項目23に記載のin vitroで分化した細胞を、神経変性障害を患っている被験体へと投与するステップを含む方法。
(項目26)
前記下垂体障害が下垂体機能低下障害である、項目25に記載の方法。
(項目27)
神経変性障害または下垂体障害を処置するための医薬の製造における、項目23に記載のin vitroで分化した細胞集団の使用。
(項目28)
前記下垂体障害が下垂体機能低下障害である、項目27に記載の使用。
(項目29)
幹細胞の分化を誘導するためのキットであって、有効量の1種または複数の
(a)形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/アクチビン-Nodalシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、
(b)BMPシグナル伝達の1種または複数の活性化剤、
(c)ウイングレス(Wnt)シグナル伝達の1種または複数の活性化剤、
(c)FGFシグナル伝達の1種または複数の活性化剤、
(d)FGFシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、
(e)SHHシグナル伝達の1種または複数の活性化剤、および
(f)前記幹細胞の、1種または複数の神経堤、頭蓋プラコード、または非神経外胚葉系統マーカーを発現する分化細胞の集団への分化を誘導するための指示書
を含むキット。
(項目30)
幹細胞の分化を誘導するためのキットであって、有効量の
(a)形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/アクチビン-Nodalシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、
(b)BMPシグナル伝達の1種または複数の活性化剤、
(c)ウイングレス(Wnt)シグナル伝達の1種または複数の活性化剤、および
(d)前記幹細胞の、1種または複数の神経堤系統マーカーを発現する分化細胞の集団への分化を誘導するための指示書
を含むキット。
(項目31)
幹細胞の分化を誘導するためのキットであって、有効量の
(a)形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/アクチビン-Nodalシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、
(b)BMPシグナル伝達の1種または複数の活性化剤、
(c)FGFシグナル伝達の1種または複数の活性化剤、および
(d)前記幹細胞の、1種または複数の頭蓋プラコード系統マーカーを発現する分化細胞の集団への分化を誘導するための指示書
を含むキット。
(項目32)
(e)ウイングレス(Wnt)シグナル伝達の1種または複数の活性化剤をさらに含む、項目31に記載のキット。
(項目33)
幹細胞の分化を誘導するためのキットであって、有効量の
(a)形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/アクチビン-Nodalシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、
(b)BMPシグナル伝達の1種または複数の活性化剤、
(c)SHHシグナル伝達の1種または複数の活性化剤、
(d)FGFシグナル伝達の2種またはそれより多い活性化剤、および
(e)前記幹細胞の、1種または複数の下垂体プラコード系統マーカーを発現する分化細胞の集団への分化を誘導するための指示書
を含むキット。
(項目34)
幹細胞の分化を誘導するためのキットであって、有効量の
(a)形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/アクチビン-Nodalシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、
(b)BMPシグナル伝達の1種または複数の活性化剤、
(c)FGFシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、および
(d)前記幹細胞の、1種または複数の非神経外胚葉系統マーカーを発現する分化細胞の集団への分化を誘導するための指示書
を含むキット。
(項目35)
分化した幹細胞の集団を含むキットであって、幹細胞の前記集団を、項目1から22のいずれか一項に記載の方法に従って分化させるキット。
4.図面の簡単な説明
5.発明の詳細な説明
本開示の主題は、ヒト幹細胞の、1つまたは複数の神経外胚葉、神経堤、頭蓋プラコード、または非神経外胚葉系統マーカーを発現する細胞への分化を誘導するためのin vitro方法、およびこのような方法によって生成される細胞、およびこのような細胞を含む組成物に関する。また、神経変性障害を処置するためのこのような細胞の使用も提供する。
本開示の主題は、ヒト幹細胞の、1つまたは複数の神経外胚葉、神経堤、頭蓋プラコード、または非神経外胚葉系統マーカーを発現する細胞への分化を誘導するためのin vitro方法、およびこのような方法によって生成される細胞、およびこのような細胞を含む組成物に関する。また、神経変性障害を処置するためのこのような細胞の使用も提供する。
限定としてではなく、開示の明確性を目的として、詳細な説明は以下の小項目に分割される:
5.1.定義;
5.2.幹細胞を分化させる方法;
5.3 分化した細胞集団を含む組成物;
5.4 神経変性および下垂体障害を処置する方法;
5.5.キット
5.6 治療用化合物をスクリーニングする方法;および
5.7 NE、NC、CPまたはNNEの運命を増加させる化合物についてスクリーニングする方法。
5.1.定義;
5.2.幹細胞を分化させる方法;
5.3 分化した細胞集団を含む組成物;
5.4 神経変性および下垂体障害を処置する方法;
5.5.キット
5.6 治療用化合物をスクリーニングする方法;および
5.7 NE、NC、CPまたはNNEの運命を増加させる化合物についてスクリーニングする方法。
5.1 定義
この明細書において使用される用語は、一般に、この発明の文脈の中で、および各用語が使用される具体的な文脈で、当技術分野における通常の意味を有する。ある特定の用語については、本発明の組成物および方法ならびに本発明の組成物の作製方法および使用方法を説明する際に、専門家にさらなるガイダンスを与えるために、以下で、または本明細書の他の場所で論じられる。
この明細書において使用される用語は、一般に、この発明の文脈の中で、および各用語が使用される具体的な文脈で、当技術分野における通常の意味を有する。ある特定の用語については、本発明の組成物および方法ならびに本発明の組成物の作製方法および使用方法を説明する際に、専門家にさらなるガイダンスを与えるために、以下で、または本明細書の他の場所で論じられる。
用語「約(about)」または「およそ(approximately)」は、部分的に特定の値が測定または決定される方法、すなわち測定システムの限界に応じて、当業者によって決定されるその値に対する許容される誤差範囲を意味する。例えば、「約」は、当技術分野の実施によって、3または3超の標準偏差内を意味する場合がある。あるいは、「約」は、所与の値の20%まで、例えば10%まで、5%まで、または1%までの範囲を意味する場合がある。あるいは、特に生物系または生物学的プロセスについて、この用語は、例えば値の5倍以内または2倍以内といった1桁内を意味する。
本明細書で使用する場合、「シグナルトランスダクションタンパク質」に関する用語「シグナル伝達」は、活性化されるかまたはそうでなければ、膜受容体タンパク質へのリガンド結合もしくはいくつかの他の刺激によって影響を受けるタンパク質を指す。シグナルトランスダクションタンパク質の例として、これらに限定されないが、SMAD、ベータ-カテニンを含むウィングレス(Wnt)複合体タンパク質、NOTCH、形質転換成長因子ベータ(TGFβ)、アクチビン、Nodal、グリコーゲン合成酵素キナーゼ3β(GSK3β)タンパク質、骨形成タンパク質(BMP)および線維芽細胞成長因子(FGF)が挙げられる。多くの細胞表面受容体または内部受容体タンパク質に関して、リガンド-受容体相互作用は、細胞の応答に直接的には結び付かない。リガンドによって活性化された受容体は、細胞の挙動に対するリガンドの最終的な生理学的効果が生じる前に、細胞の内部で他のタンパク質とまず相互作用しうる。いくつかの相互作用する細胞タンパク質の鎖の挙動はしばしば、受容体活性化または阻害後に変更される。受容体活性化によって誘導される細胞変化一式が、シグナルトランスダクション機構またはシグナル伝達経路と称される。
本明細書で使用される場合、用語「シグナル」は、細胞構造および機能における変化を制御する内部および外部因子を指す。これらは、本質的に化学的であっても物理的であってもよい。
本明細書で使用される場合、用語「リガンド」は、受容体に結合する分子およびタンパク質、例えば形質転換成長因子-ベータ(TFGβ)、アクチビン、Nodal、骨形成タンパク質(BMP)などを指す。
「阻害剤」は、本明細書で使用される場合、分子または経路のシグナル伝達機能を妨げる(例えば、低減させる、減少させる、抑制する、排除する、または遮断する)化合物または分子(例えば、小分子、ペプチド、ペプチド模倣体、天然化合物、siRNA、アンチセンス核酸、アプタマー、または抗体)を指す。阻害剤は、特定のタンパク質(シグナル伝達分子、特定のシグナル伝達分子に関与する任意の分子、特定の関連分子、例えばグリコーゲン合成酵素キナーゼ3β(GSK3β))(例えば、本明細書に記載されているシグナル伝達分子が挙げられるがこれに限定されない)の任意の活性を変化させる任意の化合物または分子でありうる。例えば、SMADシグナル伝達の阻害剤は、一例として、SMADシグナル伝達に直接接触すること、SMADmRNAに接触すること、SMADのコンフォメーションを変化させること、SMADタンパク質レベルを低下させること、またはSMADのシグナル伝達パートナー(例えば、本明細書に記載されているものを含む)との相互作用を妨げること、およびSMAD標的遺伝子(例えば、本明細書に記載されているもの)の発現に影響を及ぼすことによって、機能し得る。阻害剤は、シグナル伝達分子を上流で(例えば、細胞外ドメイン内で)妨害することによって、例えばSMAD生物活性を間接的に調節する分子も含む。SMADシグナル伝達阻害剤分子と効果の例として以下が挙げられる:骨形成タンパク質を捕捉するノギンは、ALK受容体1、2、3、および6の活性化を阻害し、したがって下流でSMAD活性化を防止する。さらに、Chordin、Cerberus、Follistatinは、同様に、SMADシグナル伝達の細胞外活性化剤を捕捉する。膜貫通タンパク質であるBambiも、細胞外TGFβシグナル伝達分子を捕捉する偽受容体として作用する。他のSMAD阻害剤としては、ドルソモルフィンが挙げられる。アクチビン、nodal、TGFβおよびBMPを遮断する抗体は、SMADシグナル伝達の細胞外活性化剤などを中和するために使用することが企図される。前述の例はSMADシグナル伝達の阻害に関するが、同様または類似する機構を使用して他のシグナル伝達分子を阻害することができる。阻害剤の例として、これらに限定されないが、SMADシグナル伝達阻害に対するLDN193189(LDN)およびSB431542(SB)(LSB)、Wnt阻害に対するXAV939(X)、ならびにFGFシグナル伝達阻害に対するSU5402(S)が挙げられる。
阻害剤は、特定のシグナル伝達分子の上流で分子に結合して影響を及ぼし、順次、特定の分子の阻害を引き起こすことによって誘導される阻害に加えて、競合阻害(別の公知の結合化合物の結合を排除するかまたは低減させるように活性部位に結合する)およびアロステリック阻害(タンパク質のコンフォメーションを変化させるようにタンパク質に結合して、そのタンパク質の活性部位への化合物の結合を妨げる)に関して記載されている。阻害剤は、シグナル伝達の標的と実際に接触することによって、シグナル伝達の標的またはシグナル伝達の標的経路を阻害する「直接阻害剤」でありうる。
「活性化剤」は、本明細書で使用される場合、分子または経路のシグナル伝達機能、例えばWntシグナル伝達、BMPシグナル伝達、FGFシグナル伝達などの活性化を増大させる、誘導する、刺激する、活性化する、促進する、または増強する化合物を指す。
本明細書で使用される場合、用語「誘導体」は、類似するコア構造を有する化学化合物を指す。
本明細書で使用される場合、用語「細胞の集団」または「細胞集団」は、少なくとも2個の細胞の群を指す。非限定例では、細胞集団は、少なくとも約10、少なくとも約100、少なくとも約200、少なくとも約300、少なくとも約400、少なくとも約500、少なくとも約600、少なくとも約700、少なくとも約800、少なくとも約900、少なくとも約1000の細胞、少なくとも約5,000の細胞または少なくとも約10,000の細胞または少なくとも約100,000の細胞または少なくとも約1,000,000の細胞を含むことができる。集団は、1つの細胞型を含む純粋な集団、例えばNE、CP、NCまたはNNE前駆体の集団、または未分化幹細胞の集団であってもよい。あるいは、集団は、2種以上の細胞型を含んでもよい(例えば、混合細胞集団)。
本明細書で使用される場合、用語「幹細胞」は、培養下で無期限に分裂して、特化した細胞を生じる能力を有する細胞を指す。ヒト幹細胞とは、ヒト由来の幹細胞を指す。
本明細書で使用される場合、用語「胚性幹細胞」および「ESC」は、培養下で長期間分化せずに分裂することができる移植前の段階の胚から誘導され、3つの一次胚葉の細胞および組織に発生することが知られている原始(未分化)細胞を指す。ヒト胚性幹細胞は、ヒトに由来する胚性幹細胞を指す。本明細書で使用される場合、用語「ヒト胚性幹細胞」または「hESC」は、培養下で長期間分化せずに分裂することができ、3つの一次胚葉の細胞および組織に発生することが知られている、初期段階のヒト胚から胚盤胞期までおよび胚盤胞期を含む胚から誘導される1種の多能性幹細胞を指す。
本明細書で使用される場合、用語「胚性幹細胞株」は、数日、数カ月から数年までの間、分化せずに増殖可能であるin vitro条件下で培養された胚性幹細胞の集団を指す。
本明細書で使用される場合、用語「全能性」は、体の全ての細胞型、および胎盤などの胚体外組織を構成するすべての細胞型を生じる能力を指す。
本明細書で使用される場合、用語「多分化能」(multipotent)は、体の2種以上の細
胞型に発生する能力を指す。
胞型に発生する能力を指す。
本明細書で使用される場合、用語「多能性」(pluripotent)は、内胚葉、中胚葉、お
よび外胚葉を含む生物の発生における3つの胚葉に発生する能力を指す。
よび外胚葉を含む生物の発生における3つの胚葉に発生する能力を指す。
本明細書で使用される場合、用語「人工多能性幹細胞」または「iPSC」は、胚性幹細胞と同様に、ある特定の胚性遺伝子(例えば、これらに限定されないが、OCT4、SOX2、およびKLF4導入遺伝子)(例えば、参照により本明細書に組み込まれるTakahashiおよびYamanaka Cell 126巻、663~676頁(2006年)を参照のこと)を体細胞(例えば、CI 4、C72など)に導入することによって形成された1種の多能性幹細胞を指す。
本明細書で使用される場合、用語「体細胞」は、配偶子(卵子または精子)以外の体内の任意の細胞を指し、「成体」細胞と称されることもある。
本明細書で使用される場合、用語「体性(成体)幹細胞」は、自己再生(実験室における)と分化の両方に対する能力が制限された多くの器官および分化した組織において見られる比較的稀な未分化細胞を指す。このような細胞は、これらの分化能において変化するが、通常、起源となる器官の細胞型に限定される。
本明細書で使用される場合、用語「ニューロン」は神経系の主な機能単位である神経細胞を指す。ニューロンは、細胞体とその突起、すなわち軸索と1つまたは複数の樹状突起からなる。ニューロンは、シナプスにおいて神経伝達物質を放出することによって、情報を他のニューロンまたは細胞に伝達する。
本明細書で使用される場合、用語「増殖」は、細胞数の増加を指す。
本明細書で使用される場合、用語「未分化」は、特化した細胞型に未だ発生していない細胞を指す。
本明細書で使用される場合、用語「分化」は、特化していない胚性細胞が、ニューロン、心臓、肝臓、または筋肉細胞などの特化した細胞の特徴を獲得する工程を指す。分化は、通常、細胞表面に埋め込まれたタンパク質に関与するシグナル伝達経路を通って、細胞の遺伝子と細胞の外側の物理的および化学的条件との相互作用によって制御されている。
本明細書で使用される場合、用語「誘導された分化」は、神経、神経堤、頭蓋プラコード、および非神経外胚葉の前駆体などの特定の(例えば、所望の)細胞型への分化を誘導する幹細胞培養条件の操作を指す。
本明細書で使用される場合、幹細胞に関する用語「誘導された分化」は、多能性状態からより成熟したまたは特化した細胞運命への幹細胞の遷移を促進する小分子、成長因子タンパク質、および他の成長条件の使用を指す。
本明細書で使用される場合、細胞に関する用語「分化を誘導する」は、デフォルト細胞型(遺伝子型および/または表現型)を非デフォルト細胞型(遺伝子型および/または表現型)に変化させることを指す。したがって、「幹細胞における分化を誘導すること」は、幹細胞とは異なる特徴、例えば遺伝子型(例えば、マイクロアレイなどの遺伝子解析によって決定される遺伝子発現における変化)および/または表現型(例えば、中脳DA細胞、またはその前駆体、例えばSOX1、PAX6、SOX10、SIX1、PITX3およびTFAP2Aのタンパク質マーカーの発現における変化)を有する子孫細胞へ分裂するように幹細胞(例えば、ヒト幹細胞)を誘導することを指す。
本明細書で使用される場合、用語「細胞培養」は、研究または医学的処置のための人工培地におけるin vitroでの細胞の成長を指す。
本明細書で使用される場合、用語「培養培地」は、培養容器、例えばペトリ皿、マルチウェルプレートなどにおいて細胞を覆い、細胞を養い、支持する栄養物を含有する液体を指す。培養培地は、細胞において所望の変化をもたらすために添加される成長因子も含む。
本明細書で使用する場合、用語、細胞を化合物(例えば、1種または複数の阻害剤、活性化剤、および/または誘導剤)と「接触させること」は、細胞を化合物に曝露すること、例えば、細胞に接触させることが可能な位置に化合物を置くことを指す。接触させることは、任意の適切な方法を使用して達成されてもよい。例えば、接触させることは、細胞の管に化合物を添加することによって達成することができる。また、接触させることは、細胞を含む培養培地に化合物を添加することによって達成されてもよい。化合物(例えば、本明細書で開示されている阻害剤および活性化剤)のそれぞれを、溶液(例えば、濃縮溶液)として細胞を含む培養培地に添加することができる。あるいはまたはさらに、化合物(例えば、本明細書で開示されている阻害剤および活性化剤)および細胞は、配合された細胞培養培地中に存在することができる。
有効量は、所望の効果を生じる量である。
本明細書で使用される場合、用語「in vitro」は、人工環境および人工環境内で起こるプロセスまたは反応を指す。例示されるin vitro環境は、これらに限定されないが、試験管および細胞培養である。
本明細書で使用される場合、用語「in vivo」は、自然環境(例えば、動物または細胞)および自然環境内で起こるプロセスまたは反応、例えば胚発生、細胞分化、神経管形成などを指す。
本明細書で使用される場合、遺伝子またはタンパク質に関連する用語「発現すること」は、マイクロアレイアッセイ、抗体染色アッセイなどのアッセイを使用して観察することができるmRNAまたはタンパク質を作製することを指す。
本明細書で使用される場合、用語「マーカー」または「細胞マーカー」は、特定の細胞または細胞型を特定する遺伝子またはタンパク質を指す。細胞に対するマーカーは、1種のマーカーに限定されず、マーカーは、指定されたマーカー群が、別の細胞または細胞型からある細胞または細胞型を特定することができるようなマーカーの「パターン」を指す場合がある。
本明細書で使用される場合、本明細書で開示されている任意の細胞に言及した場合の用語「から誘導される」または「から確立される」または「から分化させる」は、任意の操作、例えば、限定せずに、単細胞単離、in vitroでの培養、例えばタンパク質、化学物質、放射線、ウイルス感染、DNA配列を用いる、例えばモルフォゲンなどを用いるトランスフェクション、培養された親細胞に含有される任意の細胞の選択(例えば、連続培養による)を使用する処置および/または変異誘発を使用して、細胞株、組織(例えば、解離させた胚)、または体液における親細胞から得られた(例えば、単離された、精製されたなど)細胞を指す。誘導された細胞は、成長因子に対する応答、サイトカイン、サイトカイン処置の選択された進行、接着性、接着性の欠如、選別手順などにより、混合集団から選択されうる。
本明細書における「個体」または「被験体」は、脊椎動物、例えばヒトまたは非ヒト動物、例えば哺乳動物である。哺乳動物として、これらに限定されないが、ヒト、霊長類、家畜、競技動物、げっ歯類およびペットが挙げられる。非ヒト動物被験体の非限定例として、マウス、ラット、ハムスター、およびモルモットなどのげっ歯類、ウサギ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ、ウマ、ならびに類人猿およびサルなどの非ヒト霊長類が挙げられる。
本明細書で使用される場合、用語「疾患」は、細胞、組織、または器官の通常の機能に損傷を与えるかまたはそれらを妨げる任意の状態または障害を指す。
本明細書で使用される場合、用語「処置すること」または「処置」は、処置される個体または細胞の疾患経過を変更することを試みる臨床的介入を指し、予防としてかまたは臨床病理の経過中にのいずれかで実施されうる。処置の治療効果として、限定されず、疾患の発生または再発を予防すること、症状の緩和、疾患の任意の直接的なまたは間接的な病理学的帰結の減弱、転移を予防すること、疾患の進行速度を低下させること、疾患状態の好転(amelioration)または軽減、および寛解または改善された予後が挙げられる。疾患または障害の進行を予防することによって、処置によって、罹患したもしくは診断された被験体または障害を有することが疑われる被験体における障害に起因する悪化が予防されうるが、処置によって、障害のリスクを有する被験体または障害を有することが疑われる被験体における障害または障害の症状の発症も予防することができる。
5.2 幹細胞を分化させる方法
本開示の主題は、幹細胞(例えば、ヒト幹細胞)の分化を誘導するためのin vitro方法を提供する。ヒト幹細胞の非限定例として、ヒト胚性幹細胞(hESC)、ヒト多能性幹細胞(hPSC)、ヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)、ヒト単為生殖幹細胞、始原生殖細胞様多能性幹細胞、胚盤葉上層幹細胞、Fクラス多能性幹細胞、体性幹細胞、がん幹細胞、または系列特異的分化の可能な任意の他の細胞が挙げられる。ある特定の実施形態では、ヒト幹細胞は、ヒト胚性幹細胞(hESC)である。ある特定の実施形態では、ヒト幹細胞は、ヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)である。
本開示の主題は、幹細胞(例えば、ヒト幹細胞)の分化を誘導するためのin vitro方法を提供する。ヒト幹細胞の非限定例として、ヒト胚性幹細胞(hESC)、ヒト多能性幹細胞(hPSC)、ヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)、ヒト単為生殖幹細胞、始原生殖細胞様多能性幹細胞、胚盤葉上層幹細胞、Fクラス多能性幹細胞、体性幹細胞、がん幹細胞、または系列特異的分化の可能な任意の他の細胞が挙げられる。ある特定の実施形態では、ヒト幹細胞は、ヒト胚性幹細胞(hESC)である。ある特定の実施形態では、ヒト幹細胞は、ヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)である。
本開示の主題は、BMPシグナル伝達の活性化を伴う、SMADシグナル伝達の阻害であって、BMPシグナル伝達が、細胞の有効量の1種または複数のSMAD阻害剤およびBMP活性化剤への最初の接触の少なくとも2日後に活性化され、細胞を有効量の1種または複数のNC、CPまたはNNE系統に特異的な活性化剤および阻害剤とさらに接触させる阻害によって、神経堤(NC)、頭蓋プラコード(CP)および非神経外胚葉(NNE)の非CNS外胚葉系統をヒト幹細胞から分化させることができるという発見に、少なくとも部分的に基づく。例えば、幹細胞は、細胞を有効量の1種または複数のWnt活性化剤とさらに接触させることによってNCに分化させることができ、CPは、幹細胞を有効量の1種または複数のFGFの活性化剤とさらに接触させることによって幹細胞から分化させることができ、NNEは、幹細胞を有効量の1種または複数のFGFの阻害剤とさらに接触させることによって幹細胞から分化させることができる。
ある特定の実施形態では、本開示の分化方法は、ヒト幹細胞の集団を、Small Mothers Against Decapentaplegic(SMAD)シグナル伝達の阻害をもたらす形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/アクチビン-Nodalシグナル伝達の1種または複数の阻害剤の有効量と接触させることを含む。ある特定の実施形態では、TGFβ/アクチビン-Nodalシグナル伝達の阻害剤は、TGFβ、骨形成タンパク質(BMP)、Nodal、およびアクチビンを含むリガンドを中和するか、またはそれらのシグナル経路を受容体および下流のエフェクターを遮断することによって遮断する。
TGFβ/アクチビン-Nodalシグナル伝達の阻害剤の非限定例は、すべての目的のために、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるWO/2010/096496、WO/2011/149762、WO/2013/067362、WO/2014/176606、WO/2015/077648、Chambersら、Nature Biotechnology 27巻、275~280頁(2009年)、およびChambersら、Nature biotechnology 30巻、715~720頁(2012年)に開示されている。ある特定の実施形態では、TGFβ/アクチビン-Nodalシグナル伝達の1種または複数の阻害剤は、SB431542、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群より選択される小分子である。「SB431542」は、番号がCAS301836-41-9、分子式がC22H18N4O3、名称が4-[4-(1,3-ベンゾジオキソール-5-イル)-5-(2-ピリジニル)-1H-イミダゾール-2-イル]-ベンズアミドである分子を指す。例えば、以下の構造を参照のこと:
5.2.1 神経堤(NC)前駆体を分化させる方法
ある特定の実施形態では、本開示の主題は、ヒト幹細胞の非CNS前駆体への分化を誘導するためのin vitro方法であって、非CNS前駆体が神経堤(NC)前駆体である方法を提供する。ある特定の実施形態では、方法は、ヒト幹細胞の集団を有効量のTGFβ/アクチビン-Nodalシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、有効量のBMPシグナル伝達の1種または複数の活性化剤(例えば、約1ng/mLの濃度で)、および有効量のウイングレス(Wnt)シグナル伝達の1種または複数の活性化剤と接触させるステップを含む。
ある特定の実施形態では、本開示の主題は、ヒト幹細胞の非CNS前駆体への分化を誘導するためのin vitro方法であって、非CNS前駆体が神経堤(NC)前駆体である方法を提供する。ある特定の実施形態では、方法は、ヒト幹細胞の集団を有効量のTGFβ/アクチビン-Nodalシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、有効量のBMPシグナル伝達の1種または複数の活性化剤(例えば、約1ng/mLの濃度で)、および有効量のウイングレス(Wnt)シグナル伝達の1種または複数の活性化剤と接触させるステップを含む。
ある特定の実施形態では、BMP活性化剤を、少なくとも2日間、少なくとも3日間、少なくとも4日間、もしくは少なくとも5日間、または約2日まで、約3日まで、約4日まで、約5日までの間もしくはそれより長い間、細胞に接触させる。特定の実施形態では、BMP活性剤を少なくとも約2日間、細胞に接触させる。
ある特定の実施形態では、Wntシグナル伝達の活性化剤およびTGFβ/アクチビン-Nodalシグナル伝達の阻害剤を細胞に同時に接触させる。ある特定の実施形態では、Wntシグナル伝達の活性化剤およびTGFβ/アクチビン-Nodalシグナル伝達の阻害剤を、少なくとも6日間、少なくとも7日間、少なくとも8日間、少なくとも9日間、少なくとも10日間、少なくとも11日間、少なくとも12日間、またはそれより長い間、細胞に接触させる。ある特定の実施形態では、Wntシグナル伝達の活性化剤およびTGFβ/アクチビン-Nodalシグナル伝達の阻害剤を、約6日間もしくは約6日まで、約7日まで、約8日まで、約9日まで、約10日まで、約11日まで、約12日までの間、またはそれより長い間、細胞に接触させる。特定の実施形態では、細胞を、Wnt活性化剤およびTGFβ/アクチビン-Nodalシグナル伝達の阻害剤と、約12日間またはそれより長い間、接触させる。
ある特定の実施形態では、Wnt活性化剤の濃度は、細胞がWntシグナル伝達の活性化剤と最初に接触させてから約2日後、または約3日後、または約4日後に増加する。ある特定の実施形態では、Wntシグナル伝達の活性化剤の濃度が、約50%、60%、70%、80%、90%、または100%まで増加する。特定の実施形態では、Wntの濃度は、細胞をWnt活性化剤に接触させた2日後に、約50%まで増加する。
ある特定の実施形態では、細胞は、例えば、TGFβ/アクチビン-Nodalシグナル伝達の阻害剤と最初に接触させてから約12日後に、検出可能なレベルのSOX10を発現する。ある特定の実施形態では、細胞を有効量の前述の薬剤と一定期間接触させ、その結果、細胞の少なくとも10%、20%、30%、40%、50%もしくは60%またはそれより多くが検出可能なレベルのSOX10を発現する。
ある特定の実施形態では、細胞を約1から20nMの間、約2から18nMの間、約4から16nMの間、約6から14nMの間、または約8から12nMの間の濃度で形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/アクチビン-Nodalシグナル伝達の阻害剤と接触させる。特定の実施形態では、細胞を約10nMの濃度で形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/アクチビン-Nodalシグナル伝達の阻害剤と接触させる。
ある特定の実施形態では、BMPシグナル伝達の前記活性化剤は、BMP2、BMP4、BMP6、BMP7、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群より選択される。ある特定の実施形態では、BMPシグナル伝達の活性化剤を約0.01から5ng/mlの間、約0.1から2ng/mLの間、または約1から1.5ng/mLの間の濃度で細胞に接触させる。特定の実施形態では、BMPシグナル伝達の活性化剤を約1ng/mLの濃度で細胞に接触させる。
ある特定の実施形態では、細胞を約50nMから2μMの間、約100nMから1.5μMの間、約150nMから1μMの間、約200から950nMの間、約250から900nMの間、約300から850nMの間、約350から800nMの間、約400から750nMの間、約450から700nMの間、約500から650nMの間、または約550から600nMの間の濃度でWntシグナル伝達の活性化剤と接触させる。特定の実施形態では、細胞を約600nMまたは約1.5μMの濃度でWntシグナル伝達の活性化剤と接触させる。
特定の実施形態では、ヒト幹細胞を、1種または複数のTGFβ/アクチビン-Nodalシグナル伝達の阻害剤(10nM)と12日までの間またはそれより長い間、1種または複数のBMPシグナル伝達の活性化剤(1ng/mL)と2日までの間、および1種または複数のウイングレス(Wnt)シグナル伝達の活性化剤(600nMを0~2日間、および1.5μMを2日目以降から)と12日までの間またはそれより長い間、接触させることによって、非CNS NC前駆体をヒト幹細胞から分化させ、ここで、TGFβ/アクチビン-Nodalシグナル伝達の阻害剤、BMPシグナル伝達の活性化剤、およびWntシグナル伝達の活性化剤を細胞に同時に接触させる。
ある特定の実施形態では、Wntシグナル伝達の1種または複数の活性化剤は、Wntシグナル伝達の活性化に対するグリコーゲン合成酵素キナーゼ3β(GSK3β)を低下させる。したがって、Wntシグナル伝達の活性化剤は、GSK3β阻害剤であってよい。GSK3P阻害剤は、WNTシグナル伝達経路を活性化することができ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるCadiganら、J Cell Sci. 2006年;119巻:395~402頁;Kikuchiら、Cell Signaling.
2007年;19巻:659~671頁を参照されたい。本明細書で使用される場合、用語「グリコーゲン合成酵素キナーゼ3β阻害剤」は、グリコーゲン合成酵素キナーゼ3β酵素を阻害する化合物を指し、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるDobleら、J Cell Sci. 2003年;116巻:1175~1186頁を参照されたい。
2007年;19巻:659~671頁を参照されたい。本明細書で使用される場合、用語「グリコーゲン合成酵素キナーゼ3β阻害剤」は、グリコーゲン合成酵素キナーゼ3β酵素を阻害する化合物を指し、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるDobleら、J Cell Sci. 2003年;116巻:1175~1186頁を参照されたい。
Wntシグナル伝達の活性化剤またはGSK3β阻害剤の非限定例は、参照によりその全体が組み込まれるWO2011/149762、Chambers(2012年)およびCalderら、J Neurosci.2015年8月19日;35巻(33号):11462~81頁に開示されている。ある特定の実施形態では、Wntシグナル伝達の1種または複数の活性化剤は、CHIR99021、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群より選択される小分子である。「CHIR99021」(「アミノピリミジン」または「3-[3-(2-カルボキシエチル)-4-メチルピロール-2-メチリデニル]-2-インドリノン」としても公知)は、IUPAC名6-(2-(4-(2,4-ジクロロフェニル)-5-(4-メチル-1H-イミダゾール-2-イル)ピリミジン-2-イルアミノ)エチルアミノ)ニコチノニトリルを指し、以下の式を有する。
CHIR99021は、選択性が高く、関連するおよび関連しないキナーゼのパネルに対してほぼ1000倍の選択性を示し、ヒトGSK3βに対してIC50=6.7nMおよびげっ歯類GSK3βホモログに対してナノモル濃度のIC50値を有する。
5.2.2 頭蓋プラコード(CP)前駆体を分化させる方法
ある特定の実施形態では、本開示の主題は、ヒト幹細胞の非CNS前駆体への分化を誘導するためのin vitro方法であって、非CNS前駆体が頭蓋プラコード(CP)前駆体である方法を提供する。ある特定の実施形態では、方法は、ヒト幹細胞の集団を有効濃度のTGFβ/アクチビン-Nodalシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、有効濃度のBMPシグナル伝達の1種または複数の活性化剤(例えば、約5ng/mLの濃度で)、および有効濃度の線維芽細胞成長因子(FGF)シグナル伝達の1種または複数の活性化剤と接触させるステップを含む。ある特定の実施形態では、BMP活性化剤を、少なくとも2日間、少なくとも3日間、少なくとも4日間、もしくは少なくとも5日間、または約2日まで、約3日まで、約4日まで、約5日までの間もしくはそれより長い間、細胞に接触させる。特定の実施形態では、BMP活性剤を少なくとも約2日間、細胞に接触させる。
ある特定の実施形態では、本開示の主題は、ヒト幹細胞の非CNS前駆体への分化を誘導するためのin vitro方法であって、非CNS前駆体が頭蓋プラコード(CP)前駆体である方法を提供する。ある特定の実施形態では、方法は、ヒト幹細胞の集団を有効濃度のTGFβ/アクチビン-Nodalシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、有効濃度のBMPシグナル伝達の1種または複数の活性化剤(例えば、約5ng/mLの濃度で)、および有効濃度の線維芽細胞成長因子(FGF)シグナル伝達の1種または複数の活性化剤と接触させるステップを含む。ある特定の実施形態では、BMP活性化剤を、少なくとも2日間、少なくとも3日間、少なくとも4日間、もしくは少なくとも5日間、または約2日まで、約3日まで、約4日まで、約5日までの間もしくはそれより長い間、細胞に接触させる。特定の実施形態では、BMP活性剤を少なくとも約2日間、細胞に接触させる。
ある特定の実施形態では、TGFβ/アクチビン-Nodalシグナル伝達の阻害剤を、少なくとも6日間、少なくとも7日間、少なくとも8日間、少なくとも9日間、少なくとも10日間、少なくとも11日間、少なくとも12日間、またはそれより長い間、細胞に接触させる。ある特定の実施形態では、TGFβ/アクチビン-Nodalシグナル伝達の阻害剤を、約6日間もしくは約6日まで、約7日まで、約8日まで、約9日まで、約10日まで、約11日まで、約12日までの間、またはそれより長い間、細胞に接触させる。特定の実施形態では、細胞をTGFβ/アクチビン-Nodalシグナル伝達の阻害剤と約12日間またはそれより長い間接触させる。
ある特定の実施形態では、FGFシグナル伝達の活性化剤を、細胞がTGFβ/アクチビン-Nodalシグナル伝達の阻害剤と接触させてから少なくとも1、2、3、4または5日後に、細胞に接触させる。
ある特定の実施形態では、FGFシグナル伝達の活性化剤を、少なくとも6日間、少なくとも7日間、少なくとも8日間、少なくとも9日間、少なくとも10日間、少なくとも11日間、少なくとも12日間、またはそれより長い間、細胞に接触させる。ある特定の実施形態では、FGFシグナル伝達の活性化剤を、約6日まで、約7日まで、約8日まで、約9日まで、約10日まで、約11日まで、約12日までの間、またはそれより長い間、細胞に接触させる。
特定の実施形態では、細胞を、TGFβ/アクチビン-Nodalシグナル伝達の阻害剤に接触させてから約2日後に、FGFシグナル伝達の活性化剤に接触させ、ここで、細胞を約10日間またはそれより長い間FGF活性化剤に接触させる。
ある特定の実施形態では、細胞は、例えばTGFβ/アクチビン-Nodalシグナル伝達の阻害剤と最初に接触させてから約12日後に、検出可能なレベルのSIX1および/またはELAVL4を発現する。ある特定の実施形態では、細胞は、検出可能なレベルのPAX6、PITX3、クリスタリンアルファA、および/またはクリスタリンアルファBを発現し、ここで、細胞は水晶体プラコード前駆体である。ある特定の実施形態では、FGFシグナル伝達の前記活性化剤は、FGF2、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群より選択される。
ある特定の実施形態では、細胞を少なくとも2日間、少なくとも3日間、少なくとも4日間、または少なくとも5日間、またはそれより長い間、Wntシグナル伝達の活性化剤とさらに接触させる。ある特定の実施形態では、Wntシグナル伝達の活性化剤を、約2日まで、約3日まで、約4日まで、約5日までの間、またはそれより長い間、細胞に接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、TGFβ/アクチビン-Nodalシグナル伝達の阻害剤に接触させてから少なくとも1、2、3、4または5日後に、Wntシグナル伝達の活性化剤と接触させる。特定の実施形態では、細胞を、TGFβ/アクチビン-Nodalシグナル伝達の阻害剤と接触させてから約2日後に、Wntシグナル伝達の活性化剤と接触させ、ここで、細胞を約2日間Wnt活性化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞をFGFシグナル伝達の活性化剤と接触させない。ある特定の実施形態では、CP前駆細胞は、検出可能なレベルのPAX3を発現し、三叉神経プラコード前駆体である。
ある特定の実施形態では、細胞を有効量の前述の薬剤と一定期間接触させ、その結果、細胞の少なくとも10%、20%、30%、40%、50%もしくは60%またはそれより多くが検出可能なレベルの前述のマーカーを発現する。
ある特定の実施形態では、細胞を約1から20nMの間、約2から18nMの間、約4から16nMの間、約6から14nMの間、もしくは約8から12nMの間、または約10nMの濃度で形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/アクチビン-Nodalシグナル伝達の阻害剤と接触させる。特定の実施形態では、細胞を約10nMの濃度で形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/アクチビン-Nodalシグナル伝達の阻害剤と接触させる。
ある特定の実施形態では、BMPシグナル伝達の前記活性化剤は、BMP2、BMP4、BMP6、BMP7、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群より選択される。ある特定の実施形態では、BMPシグナル伝達の活性化剤を約0.01から10ng/mlの間、約0.1から8ng/mLの間、約1から6ng/mLの間、または約2から5ng/mLの間の濃度で細胞に接触させる。特定の実施形態では、BMPシグナル伝達の活性化剤を約5ng/mLの濃度で細胞に接触させる。
ある特定の実施形態では、FGFシグナル伝達の前記活性化剤は、FGF2、FGF4、FGF7、FGF8およびFGF10、その誘導体、ならびにそれらの混合物からなる群より選択される。ある特定の実施形態では、細胞を約10から200nMの間、約20から150nMの間、約30から100nmの間、または約40から75nMの間の濃度でFGFシグナル伝達の活性化剤と接触させる。特定の実施形態では、FGFシグナル伝達の活性化剤を約100ng/mLの濃度で細胞に接触させる。
ある特定の実施形態では、細胞を50nMから2μMの間、約100nMから1.5μMの間、約150nMから1μMの間、約200から950nMの間、約250から900nMの間、約300から850nMの間、約350から800nMの間、約400から750nMの間、約450から700nMの間、約500から650nMの間、または約550から600nMの間の濃度でWntシグナル伝達の活性化剤と接触させる。特定の実施形態では、細胞を約600nMから1.5μMの間の濃度でWntシグナル伝達の活性化剤と接触させる。
特定の実施形態では、ヒト幹細胞を、1種または複数のTGFβ/アクチビン-Nodalシグナル伝達の阻害剤(10nM)と12日までの間またはそれより長い間、1種または複数のBMPシグナル伝達の活性化剤(5ng/mL)と2日までの間、1種または複数のFGFシグナル伝達の活性化剤(100ng/mL)と10日までの間またはそれより長い間、接触させることによって、非CNS CP前駆体をヒト幹細胞から分化させ、ここで、TGFβ/アクチビン-Nodalシグナル伝達の阻害剤およびBMPシグナル伝達の活性化剤を細胞に同時に接触させ、かつ細胞のTGFβ/アクチビン-Nodalシグナル伝達の阻害剤およびBMPシグナル伝達の活性化剤への最初に接触の2日後に、FGF活性化剤を細胞に接触させる。
Wnt活性化剤を細胞にさらに接触させて三叉神経プラコード前駆体を分化させる場合、Wnt活性化剤を2日までの間またはそれより長い間細胞に接触させ、ここで、細胞のTGFβ/アクチビン-Nodalシグナル伝達の阻害剤およびBMPシグナル伝達の活性化剤への最初の接触の2日後に、Wnt活性化剤を細胞に接触させる。ある特定の実施形態では、Wntシグナル伝達の活性化剤に接触させる細胞を、細胞のWntシグナル伝達の活性化剤との接触中または接触後に、FGFシグナル伝達の活性化剤に接触させない。
5.2.2.1 下垂体細胞前駆体を分化させる方法
ある特定の実施形態では、本開示の主題は、ヒト幹細胞の非CNS前駆体への分化を誘導するためのin vitro方法であって、非CNS前駆体が下垂体プラコード前駆体または下垂体細胞であるin vitro方法を提供する。
ある特定の実施形態では、本開示の主題は、ヒト幹細胞の非CNS前駆体への分化を誘導するためのin vitro方法であって、非CNS前駆体が下垂体プラコード前駆体または下垂体細胞であるin vitro方法を提供する。
ある特定の実施形態では、幹細胞を下垂体細胞、または下垂体プラコード前駆体へと分化させ、ここで、ヒト幹細胞を有効量のTGFβ/アクチビン-Nodalシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、有効量のBMPシグナル伝達の1種または複数の活性化剤、有効量のソニックヘッジホッグ(SHH)シグナル伝達の1種または複数の活性化剤、および有効量のFGFシグナル伝達の1種、2種またはそれより多い活性化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、FGFシグナル伝達の活性化剤は、FGF8およびFGF10シグナル伝達を活性化する。ある特定の実施形態では、TGFβ/アクチビン-Nodalシグナル伝達の阻害剤を、少なくとも6日間、少なくとも7日間、少なくとも8日間、少なくとも9日間、少なくとも10日間、少なくとも11日間、少なくとも12日間、少なくとも13日間、少なくとも14日間、少なくとも15日間、少なくとも16日間、少なくとも17日間、少なくとも18日間、少なくとも19日間、少なくとも20日間またはそれより長い間、細胞に接触させる。ある特定の実施形態では、TGFβ/アクチビン-Nodalシグナル伝達の阻害剤を、約6日間もしくは約6日まで、約7日まで、約8日まで、約9日まで、約10日まで、約11日まで、約12日まで、約13日まで、約14日まで、約15日まで、約16日まで、約17日まで、約18日まで、約19日まで、約20日までの間、またはそれより長い間、細胞に接触させる。特定の実施形態では、細胞を約15日間またはそれより長い間TGFβ/アクチビン-Nodalシグナル伝達の阻害剤と接触させる。
ある特定の実施形態では、BMP活性化剤を、少なくとも2日間、少なくとも3日間、少なくとも4日間、もしくは少なくとも5日間、または約2日まで、約3日まで、約4日まで、約5日までの間もしくはそれより長い間、細胞に接触させる。特定の実施形態では、BMP活性剤を少なくとも約3日間細胞に接触させる。
ある特定の実施形態では、SHHシグナル伝達の1種または複数の活性化剤およびFGFシグナル伝達の2種またはそれより多い活性化剤を、少なくとも20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40日間もしくはそれより長い間、または20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40日までの間もしくはそれより長い間、細胞に接触させる。特定の実施形態では、SHHシグナル伝達の1種または複数の活性化剤およびFGFシグナル伝達の2種またはそれより多い活性化剤を少なくとも26日間またはそれより長い間細胞に接触させる。
ある特定の実施形態では、SHHの1種または複数の活性化剤およびFGFの2種またはそれより多い活性化剤を、細胞をTGFβ/アクチビン-Nodalシグナル伝達の1種または複数の阻害剤と接触させてから少なくとも2、3、4、5、または6日後に、細胞に接触させる。特定の実施形態では、SHHの1種または複数の活性化剤およびFGFの2種またはそれより多い活性化剤を、細胞をTGFβ/アクチビン-Nodalシグナル伝達の1種または複数の阻害剤と接触させてから少なくとも4日後に、細胞に接触させる。
ある特定の実施形態では、細胞を約1から20nMの間、約2から18nMの間、約4から16nMの間、約6から14nMの間、または約8から12nMの間の濃度で形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/アクチビン-Nodalシグナル伝達の阻害剤と接触させる。特定の実施形態では、細胞を約10nMの濃度で形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/アクチビン-Nodalシグナル伝達の阻害剤と接触させる。
ある特定の実施形態では、BMPシグナル伝達の前記活性化剤は、BMP2、BMP4、BMP6、BMP7、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群より選択される。ある特定の実施形態では、BMPシグナル伝達の活性化剤を約0.01から10ng/mlの間、約0.1から8ng/mLの間、約1から6ng/mLの間、または約2から5ng/mLの間の濃度で細胞に接触させる。特定の実施形態では、BMPシグナル伝達の活性化剤を約5ng/mLの濃度で細胞に接触させる。
ある特定の実施形態では、細胞を、それぞれ、約10から200ng/mLの間、約20から150ng/mLの間、約30から100ng/mLの間、または約40から75ng/mLの間の濃度で、FGFシグナル伝達の2種またはそれより多い活性化剤と接触させる。特定の実施形態では、細胞を約50ng/mL、または約100ng/mLの濃度でFGFシグナル伝達の1種または複数の活性化剤と接触させる。
ある特定の実施形態では、細胞を、約10から400ng/mLの間、約50から350ng/mLの間、約100から300ng/mLの間、または約150から250ng/mLの間の濃度で、SHHシグナル伝達の1種または複数の活性化剤と接触させる。特定の実施形態では、細胞を約200ng/mLの濃度でSHHシグナル伝達の1種または複数の活性化剤と接触させる。
ある特定の実施形態では、SHHシグナル伝達の活性化剤は、ソニックヘッジホッグ(SHH)、C25IIおよびパルモルファミンなどのスムーズンド(SMO)受容体小分子アゴニスト、SAG(例えば、Stantonら、Mol Biosyst. 2010年1月;6巻(1号):44~54頁に開示されている)、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群より選択される。
ある特定の実施形態では、細胞は、例えば、細胞をTGFβ/アクチビン-Nodalシグナル伝達の阻害剤と接触させてから少なくとも9、15、30または60日後に、検出可能なレベルのPITX1、PITX2、LUX、LHX4、HESX1、SIX6、TBX19、および/またはPAX6を発現する。ある特定の実施形態では、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%を超える細胞の集団が検出可能なレベルの前記マーカーを発現する。
ある特定の実施形態では、細胞は、例えば、細胞をTGFβ/アクチビン-Nodalシグナル伝達の阻害剤と接触させてから約30から60日後に、検出可能なレベルの1種または複数のホルモン、例えば、副腎皮質刺激ホルモン(ACTH)、成長ホルモン(GH)、プロラクチン(PRL)、卵胞刺激ホルモン(FSH)、および/または黄体形成ホルモン(LH)を発現する。ある特定の実施形態では、細胞はCRFまたはストレシンと接触させた際にACTHを発現し、細胞はソマトクリニンと接触させた際にGHを発現し、かつ/または細胞はナファレリンと接触させた際にFSHを発現する。ある特定の実施形態では、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%を超える細胞の集団が検出可能なレベルの前記ホルモンを発現している。ある特定の実施形態では、細胞の少なくとも5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%または50%は2種以上のホルモンを発現する。
ある特定の実施形態では、細胞を背方化剤、腹方化剤、またはこれらの組合せとさらに接触させる。ある特定の実施形態では、背方化剤は、FGFの活性化剤、例えば、FGF8を含む。ある特定の実施形態では、腹方化剤は、BMPの活性化剤、例えば、BMP2を含む。ある特定の実施形態では、細胞を、TGFβ/アクチビン-Nodalシグナル伝達の阻害剤と接触させてから少なくとも20、25、30、35、40日後またはそれより後に、背方化剤、腹方化剤、またはこれらの組合せと接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、少なくとも、15、20、25、30、35、40、45日もしくはそれより長い間、または15、20、25、30、35、40、45日までの間もしくはそれより長い間、背方化剤、腹方化剤、またはこれらの組合せと接触させる。特定の実施形態では、細胞を少なくとも30日間背方化剤、腹方化剤、またはこれらの組合せと接触させる。
ある特定の実施形態では、細胞を、約10から200ng/mLの間、約20から150ng/mLの間、約30から100ng/mLの間、または40から75ng/mLの間の濃度で、背方化剤と接触させる。特定の実施形態では、細胞を約50ng/mL、または約100ng/mLの濃度で背方化剤と接触させる。
ある特定の実施形態では、細胞を、約1から30ng/mLの間、約5から25ng/mLの間、または約10から20ng/mLの間の濃度で、腹方化剤と接触させる。特定の実施形態では、細胞を約10ng/mL、または約20ng/mLの濃度で腹方化剤と接触させる。
ある特定の実施形態では、背方化剤と接触させた細胞は、検出可能なレベルのプロオピオメラノコルチン(POMC)を発現する。
ある特定の実施形態では、腹方化剤と接触させた細胞は、検出可能なレベルのFSHおよび/またはLHを発現する。
ある特定の実施形態では、背方化剤と腹方化剤の混合物と接触させた細胞は、検出可能なレベルのGHおよび/またはTSHBを発現する。
特定の実施形態では、幹細胞を下垂体細胞、または下垂体プラコード前駆体へと分化させ、ここで、ヒト幹細胞を、TGFβ/アクチビン-Nodalシグナル伝達の1種または複数の阻害剤(10nM)、約3日間のBMPシグナル伝達の1種または複数の活性化剤(5ng/mL)、ソニックヘッジホッグ(SHH)シグナル伝達の1種または複数の活性化剤(200ng/mL)、およびFGFシグナル伝達の2種またはそれより多い活性化剤(例えば、100ng/mLのFGF8および50ng/mLのFGF10)と接触させる。ある特定の実施形態では、SHHおよびFGFシグナル伝達の活性化剤を、細胞をTGFβ/アクチビン-Nodalシグナル伝達の1種または複数の阻害剤に接触させてから少なくとも4日後に、細胞に接触させ、ここで、細胞を少なくとも約26日間SHHおよびFGFシグナル活性化剤に接触させる。
5.2.3 非神経外胚葉(NNE)前駆体の分化の方法
ある特定の実施形態では、本開示の主題は、ヒト幹細胞の非CNS前駆体への分化を誘導するためのin vitro方法であって、非CNS前駆体が非神経外胚葉(NNE)前駆体である方法を提供する。ある特定の実施形態では、方法は、ヒト幹細胞の集団を有効量のTGFβ/アクチビン-Nodalシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、有効量のBMPシグナル伝達の1種または複数の活性化剤(例えば、約20ng/mLの濃度で)、および有効量のFGFシグナル伝達の1種または複数の阻害剤と接触させるステップを含む。
ある特定の実施形態では、本開示の主題は、ヒト幹細胞の非CNS前駆体への分化を誘導するためのin vitro方法であって、非CNS前駆体が非神経外胚葉(NNE)前駆体である方法を提供する。ある特定の実施形態では、方法は、ヒト幹細胞の集団を有効量のTGFβ/アクチビン-Nodalシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、有効量のBMPシグナル伝達の1種または複数の活性化剤(例えば、約20ng/mLの濃度で)、および有効量のFGFシグナル伝達の1種または複数の阻害剤と接触させるステップを含む。
FGFシグナル伝達の阻害剤の非限定例として、SU5402(Sunら、Journal of medicinal chemistry 42巻、5120~5130頁(1999年);Patersonら Br. J. Haematol. 124巻 595頁(2004年);Tanakaら、Nature 435巻:172頁(2005年))、PD 173074(N-[2-[[4-(ジエチルアミノ)ブチル]アミノ]-6-(3,5-ジメトキシフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン-7-イル]-N’-(1,1-ジメチルエチル)ウレア;Bansalら、J.Neurosci.Res.、2003年;74巻:486頁)、FIIN 1 ヒドロクロリド(N-(3-(
(3-(2,6-ジクロロ-3,5-ジメトキシフェニル)-7-(4-(ジエチルアミノ)ブチルアミノ)-2-オキソ-3,4-ジヒドロピリミド[4,5-d]ピリミジン-1(2H)-イル)メチル)フェニル)アクリルアミド;Zhou、Chem.Biol.、2010年;17巻:285頁)、SU6668(5-[1,2-ジヒドロ-2-オキソ-3H-インドール-3-イリデン)メチル]-2,4-ジメチル-1H-ピロール-3-プロパン酸;Yamamotoら、Cancer Res. 2008年12月1日;68巻(23号):9754~62頁)、PD 166285 ジヒドロクロリド(6-(2,6-ジクロロフェニル)-2-[[4-[2-(ジエチルアミノ)エトキシ]フェニル]アミノ]-8-メチルピリド[2,3-d]ピリミジン-7(8H)-オン 二塩酸塩;Panekら、J Pharmacol Exp Ther. 1997年12月;283巻(3号):1433~44頁)、PD 1
61570(N-[6-(2,6-ジクロロフェニル)-2-[[4-(ジエチルアミノ)ブチル]アミノ]ピリド[2,3-d]ピリミジン-7-イル]-N’-(1,1-ジメチルエチル)ウレア;Hambyら、J Med Chem. 1997年7月18日;40巻(15号):2296~303頁)、AP 24534(3-(2-イミダゾ[1,2-b]ピリダジン-3-イルエチニル)-4-メチル-N-[4-[(4-メチル-1-ピペラジニル)メチル]-3-(トリフルオロメチル)フェニル]-ベンズアミド;Huangら、J.Med.Chem.、2010年;53巻:4701頁)、またはその誘導体が挙げられる。
(3-(2,6-ジクロロ-3,5-ジメトキシフェニル)-7-(4-(ジエチルアミノ)ブチルアミノ)-2-オキソ-3,4-ジヒドロピリミド[4,5-d]ピリミジン-1(2H)-イル)メチル)フェニル)アクリルアミド;Zhou、Chem.Biol.、2010年;17巻:285頁)、SU6668(5-[1,2-ジヒドロ-2-オキソ-3H-インドール-3-イリデン)メチル]-2,4-ジメチル-1H-ピロール-3-プロパン酸;Yamamotoら、Cancer Res. 2008年12月1日;68巻(23号):9754~62頁)、PD 166285 ジヒドロクロリド(6-(2,6-ジクロロフェニル)-2-[[4-[2-(ジエチルアミノ)エトキシ]フェニル]アミノ]-8-メチルピリド[2,3-d]ピリミジン-7(8H)-オン 二塩酸塩;Panekら、J Pharmacol Exp Ther. 1997年12月;283巻(3号):1433~44頁)、PD 1
61570(N-[6-(2,6-ジクロロフェニル)-2-[[4-(ジエチルアミノ)ブチル]アミノ]ピリド[2,3-d]ピリミジン-7-イル]-N’-(1,1-ジメチルエチル)ウレア;Hambyら、J Med Chem. 1997年7月18日;40巻(15号):2296~303頁)、AP 24534(3-(2-イミダゾ[1,2-b]ピリダジン-3-イルエチニル)-4-メチル-N-[4-[(4-メチル-1-ピペラジニル)メチル]-3-(トリフルオロメチル)フェニル]-ベンズアミド;Huangら、J.Med.Chem.、2010年;53巻:4701頁)、またはその誘導体が挙げられる。
ある特定の実施形態では、用語「SU5402」は、化学式C17H16N2O3および化学名:2-[(1,2-ジヒドロ-2-オキソ-3H-インドール-3-イリデン)メチル]-4-メチル-1H-ピロール-3-プロパン酸(pr-opanoic acid)を有する小分子を指す。ある特定の実施形態では、SU5402は、以下の化学構造:
を有する。
ある特定の実施形態では、TGFβ/アクチビン-Nodalシグナル伝達の阻害剤、BMPシグナル伝達の活性化剤、およびFGFシグナル伝達の阻害剤を、少なくとも6日間、少なくとも7日間、少なくとも8日間、少なくとも9日間、少なくとも10日間、少なくとも11日間、少なくとも12日間、またはそれより長い間、細胞に接触させる。ある特定の実施形態では、TGFβ/アクチビン-Nodalシグナル伝達の阻害剤、BMPシグナル伝達の活性化剤、およびFGFシグナル伝達の阻害剤を、約6日間もしくは約6日まで、約7日まで、約8日まで、約9日まで、約10日まで、約11日まで、約12日までの間、またはそれより長い間、細胞に接触させる。特定の実施形態では、細胞を約12日間またはそれより長い間TGFβ/アクチビン-Nodalシグナル伝達の阻害剤、BMPシグナル伝達の活性化剤、およびFGFシグナル伝達の阻害剤と接触させる。
ある特定の実施形態では、細胞は、例えば、TGFβ/アクチビン-Nodalシグナル伝達の阻害剤と最初に接触させてから約12日後に、検出可能なレベルのTFAP2Aを発現し、検出可能なレベルのSIX1および/またはSOX10を発現しない。
ある特定の実施形態では、細胞を有効量の前述の薬剤と一定期間接触させ、その結果、細胞の少なくとも10%、20%、30%、40%、50%もしくは60%またはそれより多くが検出可能なレベルのTFAP2Aを発現する。
ある特定の実施形態では、FGFシグナル伝達の阻害剤は、SU5402(Sunら、Journal of medicinal chemistry 42巻、5120~5130頁(1999年))、その誘導体、またはそれらの混合物を含む。
ある特定の実施形態では、細胞を約1から20nMの間、約2から18nMの間、約4から16nMの間、約6から14nMの間、または約8から12nMの間の濃度で形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/アクチビン-Nodalシグナル伝達の阻害剤と接触させる。特定の実施形態では、細胞を約10nMの濃度で形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/アクチビン-Nodalシグナル伝達の阻害剤と接触させる。
ある特定の実施形態では、BMPシグナル伝達の前記活性化剤は、BMP2、BMP4、BMP6、BMP7、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群より選択される。ある特定の実施形態では、BMPシグナル伝達の活性化剤を約0.01から30ng/mlの間、約1から25ng/mLの間、約5から20ng/mLの間、または約10から15ng/mLの間の濃度で細胞に接触させる。特定の実施形態では、BMPシグナル伝達の活性化剤を約20ng/mLの濃度で細胞に接触させる。
ある特定の実施形態では、細胞を約1から20nMの間、約2から18nMの間、約4から16nMの間、約6から14nMの間、または約8から12nMの間の濃度でFGFシグナル伝達の阻害剤と接触させる。特定の実施形態では、細胞を約10nMの濃度でFGFシグナル伝達の阻害剤と接触させる。
特定の実施形態では、ヒト幹細胞を、1種または複数のTGFβ/アクチビン-Nodalシグナル伝達の阻害剤(10nM)と12日までの間、1種または複数のBMPシグナル伝達の活性化剤(20ng/mL)と12日までの間、および1種または複数のFGFシグナル伝達の阻害剤(10nM)と12日までの間、接触させることによって、非CNS NNE前駆体をヒト幹細胞から分化させ、ここで、TGFβ/アクチビン-Nodalシグナル伝達の阻害剤、BMPシグナル伝達の活性化剤およびFGFシグナル伝達の阻害剤を細胞に同時に接触させる。
ある特定の実施形態では、上述の阻害剤、活性化剤および分子を幹細胞を含む細胞培養培地に添加する。適切な細胞培養培地として、これらに限定されないが、Essential 8(登録商標)/Essential 6(登録商標)(「E8/E6」)培地が挙げられる。E8/E6培地は市販されている。
E8/E6培地は、ヒト多能性幹細胞の成長および増殖を支持するフィーダーフリーおよび異種成分不含(xeno free)培地である。E8/E6培地は、体細胞再プログラミングを支持することが判明した。さらにE8/E6培地は、PSCの培養に対するカスタム培地の配合物のベースとして使用することができる。E8/E6培地の一例は、参照によりその全体が組み込まれるChenら、Nat Methods 2011年5月;8巻(5号):424~9頁に記載されている。E8/E6培地の一例は、参照によりその全体が組み込まれるWO15/077648に開示されている。ある特定の実施形態では、E8/E6細胞培養培地は、DMEM/F12、アスコルビン酸、セレン(selenum)、インスリン、NaHCO3、トランスフェリン、FGF2およびTGFβを含む。ある特定の実施形態では、E6培地は、FGF2およびTGFβを含まない。E8/E6培地は、E8/E6培地が、活性BMPまたはWnt成分を含まない点でKSR培地と異なる。
分化した細胞は、1種または複数のレポーターをさらに発現しうる。レポーターの非限定例として、蛍光タンパク質(例えば、緑色蛍光タンパク質(GFP)、青色蛍光タンパク質(EBFP、EBFP2、Azurite、mKalama1)、シアン蛍光タンパク質(ECFP、Cerulean、CyPet、mTurquoise2)、および黄色蛍光タンパク質誘導体(YFP、Citrine、Venus、YPet、EYFP))、β-ガラクトシダーゼ(LacZ)、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(cat)、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ(neo)、酵素(例えば、オキシダーゼおよびペルオキシダーゼ)、ならびに抗原分子が挙げられる。本明細書で使用される場合、用語「レポーター遺伝子」または「レポーター構築物」は、着色したタンパク質、GFPなどの蛍光タンパク質またはベータ-ガラクトシダーゼ(lacZ遺伝子)などの酵素などの容易に検出可能なまたは容易にアッセイ可能なタンパク質をコードする核酸を含む遺伝子構築物を指す。ある特定の実施形態では、レポーターは、NE系統マーカー遺伝子の組換えプロモーター、NC系統マーカー遺伝子の組換えプロモーター、CP系統マーカー遺伝子の組換えプロモーター、またはNNE系統マーカー遺伝子の組換えプロモーターによって誘導されうる。
分化した細胞は、分化後、例えば、細胞培養培地中で精製されうる。本明細書で使用される場合、用語「精製された」、「精製する」、「精製」、「単離された」、「単離する」、および「単離」は、試料由来の少なくとも1種の夾雑物の量の低減を指す。例えば、所望の細胞型は、所望されない細胞型の量の対応する低減により、少なくとも10%まで、少なくとも30%まで、少なくとも50%まで、少なくとも75%まで、および少なくとも90%まで精製される。用語「精製する」は、試料由来のある特定の細胞(例えば、所望されない細胞)の除去を指すことができる。
本開示の主題は、本明細書に記載されている方法によって生成された1種または複数のNC、CPまたはNNE系統マーカーを発現するin vitroで分化した細胞の集団、およびこのようなin vitro分化細胞を含む組成物も提供する。
5.3 分化した細胞集団を含む組成物
本開示は、本明細書に記載されている方法に従って調製された、1種または複数の神経堤系統マーカー、またはその先駆細胞を発現するin vitroで分化した細胞を提供する。ある特定の実施形態では、少なくとも約10%、20%、30%、または40%(例えば、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、または少なくとも約99%、または少なくとも約99.5%、または少なくとも99.9%)の細胞の集団が、1種または複数の神経堤系統マーカー、例えば、SOX10を発現する。
本開示は、本明細書に記載されている方法に従って調製された、1種または複数の神経堤系統マーカー、またはその先駆細胞を発現するin vitroで分化した細胞を提供する。ある特定の実施形態では、少なくとも約10%、20%、30%、または40%(例えば、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、または少なくとも約99%、または少なくとも約99.5%、または少なくとも99.9%)の細胞の集団が、1種または複数の神経堤系統マーカー、例えば、SOX10を発現する。
本開示は、本明細書に記載されている方法に従って調製された、1種または複数の頭蓋水晶体プラコード系統マーカー、またはその前駆細胞を発現するin vitroで分化した細胞の集団を提供する。ある特定の実施形態では、少なくとも約10%、20%、30%、または40%(例えば、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、または少なくとも約99%、または少なくとも約99.5%、または少なくとも99.9%)の細胞の集団が、1種または複数の頭蓋水晶体プラコード系統マーカー、例えば、SIX1、PAX6、PITX3、クリスタリンアルファA、クリスタリンアルファB、またはこれらの組合せを発現する。
本開示は、本明細書に記載されている方法に従って調製された、1種または複数の頭蓋三叉神経プラコード系統マーカー、またはその前駆細胞を発現するin vitroで分化した細胞の集団を提供する。ある特定の実施形態では、少なくとも約10%、20%、30%、または40%(例えば、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、または少なくとも約99%、または少なくとも約99.5%、または少なくとも99.9%)の細胞の集団が、1種または複数の頭蓋三叉神経プラコード系統マーカー、例えば、SIX1、PAX3、またはこれらの組合せを発現する。
本開示は、本明細書に記載されている方法に従って調製された、1種または複数の非神経外胚葉系統マーカー、またはその前駆細胞を発現するin vitroで分化した細胞の集団を提供する。ある特定の実施形態では、少なくとも約10%、20%、30%、または40%(例えば、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、または少なくとも約99%、または少なくとも約99.5%、または少なくとも99.9%)の細胞の集団が、1種または複数の非神経外胚葉系統マーカー、例えば、TFAP2Aを発現し、細胞の集団の約15%未満(例えば、約10%未満、約5%未満、約4%未満、約3%未満、約2%未満、約1%未満、約0.5%未満、または約0.1%未満)が、SIX1、SOX10およびこれらの組合せからなる群より選択される1種または複数のマーカーを発現する。
本開示は、本明細書に記載されている方法に従って調製された、1種または複数の下垂体細胞マーカー、または下垂体プラコード前駆体を発現するin vitroで分化した細胞の集団を提供する。ある特定の実施形態では、少なくとも約10%、20%、または30%(例えば、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、または少なくとも約99%、または少なくとも約99.5%、または少なくとも99.9%)の細胞の集団が、1種または複数の下垂体細胞マーカー、例えば、PITX1、PITX2、LUX、LHX4、HESX1、SIX6、TBX19、PAX6、またはこれらの組合せを発現する。
ある特定の実施形態では、分化細胞の集団は、ヒト幹細胞の集団から誘導される。本開示の主題は、このような分化細胞の集団を含む組成物をさらに提供する。
ある特定の実施形態では、組成物は、約1×104から約1×1010、約1×104から約1×105、約1×105から約1×109、約1×105から約1×106、約1×105から約1×107、約1×106から約1×107、約1×106から約1×108、約1×107から約1×108、約1×108から約1×109、約1×108から約1×1010、または約1×109から約1×1010個の本開示の幹細胞から誘導された細胞の集団を含む。
ある特定の非限定的実施形態では、組成物は、生体適合性スキャホールドまたはマトリクス、例えば、細胞を被験体に植込むかまたは移植する際に、組織再生を促進する生体適合性三次元スキャホールドをさらに含む。ある特定の非限定的実施形態では、生体適合性スキャホールドは、細胞外マトリクス材料、合成ポリマー、サイトカイン、コラーゲン、ポリペプチドまたはタンパク質、多糖類(フィブロネクチン、ラミニン、ケラチン、フィブリン、フィブリノーゲン、ヒアルロン酸、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、アガロースまたはゼラチン、および/またはヒドロゲルを含む)を含む。(例えば、そのそれぞれの内容が、全体が参照により組み込まれる、米国特許出願公開第2015/0159135号、同第2011/0296542号、同第2009/0123433号、および同第2008/0268019号を参照のこと。)
ある特定の実施形態では、組成物は、薬学的に許容される担体、賦形剤、希釈剤またはこれらの組合せを含む医薬組成物である。組成物は、本明細書に記載されているように、神経変性障害および下垂体障害を予防および/または処置するために使用することができる。
5.4 神経変性障害および下垂体障害を処置する方法
1種または複数のNC、CPまたはNNE系統マーカーを発現するin vitroで分化した細胞(「幹細胞から誘導されたNC、CPまたはNNE前駆体」とも称される)を神経変性障害または下垂体障害を処置するために使用することができる。本開示の主題は、神経変性障害または下垂体障害を処置する方法であって、有効量の本開示の幹細胞から誘導された前駆体を神経変性障害または下垂体障害を患っている被験体に投与するステップを含む方法を提供する。
1種または複数のNC、CPまたはNNE系統マーカーを発現するin vitroで分化した細胞(「幹細胞から誘導されたNC、CPまたはNNE前駆体」とも称される)を神経変性障害または下垂体障害を処置するために使用することができる。本開示の主題は、神経変性障害または下垂体障害を処置する方法であって、有効量の本開示の幹細胞から誘導された前駆体を神経変性障害または下垂体障害を患っている被験体に投与するステップを含む方法を提供する。
神経変性障害の非限定例として、フリードライヒ運動失調症(Friedrich's Ataxia)
が挙げられる。
が挙げられる。
下垂体障害の非限定例として、下垂体機能低下障害が挙げられる。
本開示の幹細胞由来前駆体は、神経変性障害または下垂体障害を処置または予防するために、被験体に、全身的または直接的に投与または提供することができる。ある特定の実施形態では、本開示の幹細胞由来前駆体は、目的の器官(例えば、中枢神経系(CNS)または末梢神経系(PNS))に直接注射される。
本開示の幹細胞由来前駆体は、任意の生理学的に許容されるビヒクルにおいて投与することができる。本開示の幹細胞由来前駆体および薬学的に許容されるビヒクルを含む医薬組成物も提供される。本開示の幹細胞由来前駆体および前記細胞を含む医薬組成物は、局注、同所(OT)注射、全身注射、静脈内注射、または非経口投与によって投与することができる。ある特定の実施形態では、本開示の幹細胞由来前駆体は、神経変性障害または下垂体障害を患っている患者に、同所(OT)注射により投与することができる。
本開示の幹細胞由来前駆体および前記細胞を含む医薬組成物は、選択されたpHに緩衝されうる滅菌液体調製物、例えば等張水溶液、懸濁物、エマルション、分散物、または粘性組成物として、都合よく提供することができる。液体調製物は、通常、ゲル、他の粘性組成物、および固体組成物より調製しやすい。さらに、液体組成物は、特に注射によって、投与するのに多少都合がよい。一方、粘性組成物は、特定の組織とのより長い接触期間をもたらすのに適当な粘度範囲内で製剤化することができる。液体または粘性組成物は、例えば、水、食塩水、リン酸緩衝食塩水、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど)およびその適切な混合物を含有する溶媒または分散媒でありうる担体を含むことができる。滅菌注射溶液は、本開示の主題の組成物、例えば本開示の幹細胞由来前駆体を含む組成物を、所望の様々な量の他の成分を含む必要量の適当な溶媒に組み込むことによって調製することができる。このような組成物は、滅菌水、生理食塩水、グルコース、デキストロースなどの適切な担体、希釈剤、または賦形剤との混合物において存在してもよい。組成物は、凍結乾燥されてもよい。組成物は、所望の投与経路および調製物に応じて、例えば、湿潤剤、分散剤、または乳化剤(例えば、メチルセルロース)、pH緩衝剤、ゲル化もしくは粘度増強添加剤、保存剤、矯味矯臭剤、着色剤などの補助物質を含有することができる。参照により本明細書に組み込まれる「REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCE」、第17版、1985年などの標準教科書が、過度な実験を行うことなく適切な調製物を調製するために参考にされうる。
抗菌性保存剤、抗酸化剤、キレート剤、および緩衝剤を含む、組成物の安定性および無菌状態を増強する種々の添加剤を添加することができる。微生物の活動の防止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などによって確保される。注射用医薬形態の持続的吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用によってもたらすことができる。しかしながら、本開示の主題によれば、使用される任意のビヒクル、希釈剤、または添加剤は、本開示の幹細胞由来前駆体と適合性であるべきである。
必要であれば、組成物の粘度は、薬学的に許容される増粘剤を使用して、選択されたレベルに維持することができる。容易かつ経済的に入手可能であり、容易に作用するため、メチルセルロースを使用することができる。他の適切な増粘剤として、例えば、キサンタンガム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボマーなどが挙げられる。増粘剤の濃度は、選択される薬剤に応じて変わりうる。重要な点は、選択された粘度を達成する量を使用することである。適切な担体および他の添加剤の選択は、投与の正確な経路および特定の剤形、例えば、液体剤形の性質(例えば、組成物が、液体、懸濁物、ゲルまたは別の液体形態、例えば時限放出形態(time release form)または液体充填形態に製剤化されることになるか否か)に依存して変わる。
当業者は、組成物の構成成分は、化学的に不活性であるように選択されるべきであり、本開示の幹細胞由来前駆体の生存度または有効性に影響を与えないことを認識している。このことは、化学および製薬分野の当業者(those skilled in chemical and pharmaceutical principles)にとって課題を提示せず、すなわち、この開示および本明細書で引用された文書から、標準教科書を参照することにより、または簡単な実験(過度の実験を含まない)により、課題を容易に回避することができる。
本開示の幹細胞由来前駆体の治療用途に関する1つの検討事項は、最適な効果を達成するために必要な細胞の量である。最適の効果として、これらに限定されないが、神経変性障害を患っている被験体のCNSおよび/もしくはPNS領域の再増殖、ならびに/または被験体のCNSおよび/もしくはPNSの機能の改良が挙げられる。
「有効量」(または「治療有効量」)は、処置の際に有益な結果または所望の臨床結果に影響を及ぼすのに十分な量である。有効量は、1または複数の用量で被験体に投与することができる。処置について、有効量は、神経変性障害または下垂体障害の進行を和らげる、好転させる、安定化させる、反転させるもしくは遅延させる、または代わりに神経変性障害または下垂体障害の病理学的帰結を低減するのに十分な量である。有効量は、一般的に、ケースバイケースを基本に医師によって決定され、当業者の技術の範囲内である。いくつかの因子が、典型的には、有効量を達成するために適当な投薬量を決定する際に考慮に入れられる。これらの因子として、被験体の年齢、性別および体重、処置される状態、状態の重症度ならびに投与される細胞の形態および有効濃度が挙げられる。
ある特定の実施形態では、本開示の幹細胞由来前駆体の有効量は、神経変性障害または下垂体障害を患っている被験体のCNSおよび/またはPNS領域の再増殖に十分な量である。ある特定の実施形態では、本開示の幹細胞由来前駆体の有効量は、神経変性障害または下垂体障害を患っている被験体のCNSおよび/またはPNSの機能を改良するのに十分な量であり、例えば改良された機能は、通常のヒトのCNSおよび/またはPNSの機能の約1%、約5%、約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約95%、約98%、約99%または約100%でありうる。
投与される細胞の量は、処置される被験体に対して変化する。ある特定の実施形態では、約1×104~約1×1010、約1×104~約1×105、約1×105~約1×109、約1×105~約1×106、約1×105~約1×107、約1×106~約1×107、約1×106~約1×108、約1×107~約1×108、約1×108~約1×109、約1×108~約1×1010、または約1×109~約1×1010の本開示の幹細胞由来前駆体が、被験体に投与される。ある特定の実施形態では、約1×105~約1×107の本開示の幹細胞由来前駆体が、神経変性障害または下垂体障害を患っている被験体に投与される。ある特定の実施形態では、約2×106の本開示の幹細胞由来前駆体が、神経変性障害または下垂体障害を患っている被験体に投与される。ある特定の実施形態では、約1×106~約1×106の本開示の幹細胞由来前駆体が、神経変性障害または下垂体障害を患っている被験体に投与される。ある特定の実施形態では、約1×106~約4×106の本開示の幹細胞由来前駆体が、神経変性障害または下垂体障害を患っている被験体に投与される。検討される有効用量の正確な決定は、特定の被験体のサイズ、年齢、性別、体重、および状態を含む各被験体に対する個々の因子に基づいてよい。投薬量は、この開示および当技術分野の知識から、当業者によって容易に確認されうる。
ある特定の実施形態では、神経変性障害または下垂体障害を処置するために、神経変性障害または下垂体障害を患っている被験体に投与される細胞は、本開示の幹細胞由来NCまたはCP前駆体から分化/成熟されたニューロンの集団である。
5.5 キット
本開示の主題は、幹細胞の分化を誘導するためのキットを提供する。ある特定の実施形態では、キットは、(a)形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/アクチビン-Nodalシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、(b)BMPシグナル伝達の1種または複数の活性化剤、(c)Wntシグナル伝達の1種または複数の活性化剤、および(c)1種または複数の神経堤系列マーカーを発現する分化細胞の集団への幹細胞の分化を誘導するための指示書を含む。
本開示の主題は、幹細胞の分化を誘導するためのキットを提供する。ある特定の実施形態では、キットは、(a)形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/アクチビン-Nodalシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、(b)BMPシグナル伝達の1種または複数の活性化剤、(c)Wntシグナル伝達の1種または複数の活性化剤、および(c)1種または複数の神経堤系列マーカーを発現する分化細胞の集団への幹細胞の分化を誘導するための指示書を含む。
ある特定の実施形態では、キットは、(a)形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/アクチビン-Nodalシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、(b)BMPシグナル伝達の1種または複数の活性化剤、(c)FGFシグナル伝達の1種または複数の活性化剤、および(d)幹細胞の、1種または複数の頭蓋プラコード系統マーカーを発現する分化細胞の集団への分化を誘導するための指示書を含む。ある特定の実施形態では、キットは、任意選択で、(e)Wntシグナル伝達の1種または複数の活性化剤を含む。
ある特定の実施形態では、キットは、(a)形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/アクチビン-Nodalシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、(b)BMPシグナル伝達の1種または複数の活性化剤、(c)FGFシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、および(d)幹細胞の、1種または複数の非神経外胚葉系統マーカーを発現する分化細胞の集団への分化を誘導するための指示書を含む。
ある特定の実施形態では、キットは、(a)形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/アクチビン-Nodalシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、(b)BMPシグナル伝達の1種または複数の活性化剤、(c)SHHシグナル伝達の1種または複数の活性化剤、(d)FGFシグナル伝達の2種またはそれより多い活性化剤、および(e)幹細胞の、1種または複数の下垂体細胞または下垂体細胞前駆体マーカーを発現する分化細胞の集団への分化を誘導するための指示書を含む。
ある特定の実施形態では、指示は、幹細胞を、特異的な順序で、阻害剤、活性化剤および分子と接触させることを含む。阻害剤、活性化剤および分子を接触させる順序は、幹細胞を培養するために使用される細胞培養培地によって決定することができる。
ある特定の実施形態では、指示は、幹細胞を、本開示の方法によって記載されているように、阻害剤、活性化剤および分子と接触させることを含む(上掲の項目5.2を参照のこと)。
ある特定の実施形態では、本開示は、有効量の本開示の幹細胞由来前駆体の集団または前記前駆体を単位剤形で含む組成物を含むキットを提供する。ある特定の実施形態では、幹細胞由来の細胞は、成熟分化細胞である。ある特定の実施形態では、キットは、治療用組成物を含有する滅菌容器を含み、このような容器は、箱、アンプル、瓶、バイアル、チューブ、バッグ、パウチ、ブリスターパック、または当技術分野で公知の他の適切な容器形態であってよい。このような容器は、プラスチック、ガラス、積層した紙、金属箔、または医薬を保持するために適切な他の材料から作製されうる。
ある特定の実施形態では、キットは、本開示の幹細胞由来前駆体またはそれを含む組成物の集団を、神経変性障害または下垂体障害を患っている被験体に投与するための指示書を含む。指示書は、神経変性障害を処置または予防するための細胞または組成物の使用についての情報を含むことができる。ある特定の実施形態では、指示書は、以下のもののうちの少なくとも1つを含む:治療剤についての記載、投薬スケジュールおよび神経変性障害もしくはその症状を処置もしくは予防するための投与、注意事項、警告、適応症、禁忌(counter-indication)、過量投薬情報、有害反応、動物薬理学、臨床試験、および/または参照文献。指示書は、容器(存在する場合)に直接、または容器に貼られたラベルとして、または容器の中もしくは容器と一緒に供給される別のシート、パンフレット、カード、もしくはフォルダーとして印刷されうる。
5.6 治療用化合物をスクリーニングする方法
本開示の幹細胞から誘導されたNCおよびCP前駆体を使用して、神経変性障害または下垂体障害、例えば、フリードライヒ運動失調症または下垂体機能低下障害をモデル化することができ、疾患細胞表現型を克服することができる候補化合物としてスクリーニングするためのプラットホームとしての機能を果たすことができる。神経変性障害または下垂体障害を緩和する候補化合物の能力を、神経変性障害または下垂体障害を引き起こす生理学的または細胞の欠陥を救助する候補化合物の性能をアッセイすることによって決定することができる。
本開示の幹細胞から誘導されたNCおよびCP前駆体を使用して、神経変性障害または下垂体障害、例えば、フリードライヒ運動失調症または下垂体機能低下障害をモデル化することができ、疾患細胞表現型を克服することができる候補化合物としてスクリーニングするためのプラットホームとしての機能を果たすことができる。神経変性障害または下垂体障害を緩和する候補化合物の能力を、神経変性障害または下垂体障害を引き起こす生理学的または細胞の欠陥を救助する候補化合物の性能をアッセイすることによって決定することができる。
ある特定の実施形態では、方法は、(a)(i)幹細胞(例えば、ヒト幹細胞)から誘導される本開示の前駆体の集団であって、前駆細胞が神経変性障害または下垂体障害を有する被験体由来のiPSCから調製され、前駆細胞が障害の細胞および/または代謝の特徴を発現する集団、ならびに(ii)試験化合物を準備するステップと;(b)前駆体を試験化合物と接触させるステップと、(c)前駆体の機能活性、または遺伝子発現を測定するステップとを含む。ある特定の実施形態では、前駆体を少なくとも約24時間(1日)、約2日間、約3日間、約4日間、約5日間、約6日間、約7日間、約8日間、約9日間、または約10日間試験化合物と接触させる。ある特定の実施形態では、前駆体を、試験化合物と接触させる前に、分化したニューロンへと成熟させる。
5.7 NE、NC、CPまたはNNEの運命を増加させる化合物をスクリーニングする方法
本開示は、NE、NC、CPまたはNNE前駆体の分化を促進する化合物をスクリーニング(例えば、ハイスループットスクリーニング)する方法を提供する。ある特定の実施形態では、NE、NC、CP、およびNNEは、本明細書に記載されている方法に従って分化させることができ、ここで、細胞を試験化合物と接触させて試験化合物がNE、NC、CPまたはNNE誘導を増強するかどうかを決定する。ある特定の実施形態では、細胞は、細胞のNE、NC、CPまたはNNEの運命への分化を決定するためのレポーター構築物、例えば、NE、CP、NCまたはNNE前駆体に特異的な遺伝子のプロモーターに作動可能に連結するGFPなどの検出可能なレポーターを発現する。ある特定の実施形態では、レポーター構築物は、PAX6::H2B-GFP、SOX10::GFP、SIX1::H2B-GFP、およびこれらの組合せからなる群より選択される。
本開示は、NE、NC、CPまたはNNE前駆体の分化を促進する化合物をスクリーニング(例えば、ハイスループットスクリーニング)する方法を提供する。ある特定の実施形態では、NE、NC、CP、およびNNEは、本明細書に記載されている方法に従って分化させることができ、ここで、細胞を試験化合物と接触させて試験化合物がNE、NC、CPまたはNNE誘導を増強するかどうかを決定する。ある特定の実施形態では、細胞は、細胞のNE、NC、CPまたはNNEの運命への分化を決定するためのレポーター構築物、例えば、NE、CP、NCまたはNNE前駆体に特異的な遺伝子のプロモーターに作動可能に連結するGFPなどの検出可能なレポーターを発現する。ある特定の実施形態では、レポーター構築物は、PAX6::H2B-GFP、SOX10::GFP、SIX1::H2B-GFP、およびこれらの組合せからなる群より選択される。
ある特定の実施形態では、スクリーニング方法は、本明細書に記載されている方法に従ってヒト幹細胞を培養するステップを含み、試験化合物を1日目、または2日目、または3日目、または4日目、または5日目、または6日目、または7日目に培養培地に添加する。ある特定の実施形態では、スクリーニング方法は、試験化合物と共に培養した細胞における、1種または複数のNE、NC、CPまたはNNE前駆体マーカー、例えば、SOX1および/もしくはPAX6(NE);SIX1、PAX6、PAX3、PITX3、クリスタリンアルファA、クリスタリンアルファB、および/もしくはTFAP2A(CP);SOX10および/もしくはTFAP2A(NC);またはTFAP2Aの検出可能な発現のレベルならびに検出可能なSIX1およびSOX10(NNE)の発現の欠如を決定するステップと、前記レベルを、試験化合物を含まない培地中で培養された細胞中の同じマーカーの発現のレベルと比較するステップとを含み、試験化合物と共に培養した細胞におけるマーカーの発現レベルの増加が、試験化合物がNE、NC、CPまたはNNE前駆体誘導を増強することを示す。
6.実施例
本開示の主題は、限定としてではなく、本開示の主題の例として提供される以下の実施例を参照してより理解される。
本開示の主題は、限定としてではなく、本開示の主題の例として提供される以下の実施例を参照してより理解される。
6.1 実施例1:神経外胚葉(NE)、神経堤(NC)頭蓋プラコード(CP)および非神経外胚葉(NNE)の外胚葉系統の幹細胞から誘導された前駆細胞を調製する方法
要約
ヒト多能性細胞(hPSC)は、潜在的に、身体の任意の細胞型を生じることができる。長期的な目的は、in vitroで完全なヒトの系統樹を再現するためのストラテジーの開発である。このような努力は、3つの胚葉のそれぞれへのアクセスをもたらすモジュラー分化プラットホームを確立することに依拠する。ここで、本発明者らは、4つの主要な外胚葉系統のすべて(CNS、神経堤、頭蓋プラコード、非神経外胚葉)を十分に定義された条件下で並行して誘導するためのストラテジーを提示する。遺伝子レポーター株を使用して、本発明者らは、非CNS外胚葉誘導体を誘導する際のBMPシグナル伝達に対する用量および時間に依存する役割を実証する。本発明者らは、初期細胞運命の決定の機構を精査する遺伝子編集ツールを適用し、頭蓋プラコードの運命を増大させる化合物を化学的にスクリーニングする本発明者らのプラットホームの有用性をさらに実証する。オンデマンドでの4つの外胚葉系統への再現可能なアクセスは、in vitroでヒト外胚葉系統の多様性を再現する途中の最初のマイルストーンである。
ヒト多能性細胞(hPSC)は、潜在的に、身体の任意の細胞型を生じることができる。長期的な目的は、in vitroで完全なヒトの系統樹を再現するためのストラテジーの開発である。このような努力は、3つの胚葉のそれぞれへのアクセスをもたらすモジュラー分化プラットホームを確立することに依拠する。ここで、本発明者らは、4つの主要な外胚葉系統のすべて(CNS、神経堤、頭蓋プラコード、非神経外胚葉)を十分に定義された条件下で並行して誘導するためのストラテジーを提示する。遺伝子レポーター株を使用して、本発明者らは、非CNS外胚葉誘導体を誘導する際のBMPシグナル伝達に対する用量および時間に依存する役割を実証する。本発明者らは、初期細胞運命の決定の機構を精査する遺伝子編集ツールを適用し、頭蓋プラコードの運命を増大させる化合物を化学的にスクリーニングする本発明者らのプラットホームの有用性をさらに実証する。オンデマンドでの4つの外胚葉系統への再現可能なアクセスは、in vitroでヒト外胚葉系統の多様性を再現する途中の最初のマイルストーンである。
結果
4つの外胚葉系統を誘導するためのdSMADiベースの分化プロトコルは、化学的に定義したシステムを使用すると、NEの運命への偏りを生じる
4つの主要な外胚葉系統は、神経外胚葉(NE)、神経堤(NC)、頭蓋プラコード(CP)および非神経外胚葉(NNE)を含む。これらの系統のそれぞれは、図1Aにまとめたように伝統的なKSRベースのプロトコルを使用してdSMADi条件を修正することによって生成することができる。興味深いことに、KSR条件下で、パターニング因子を含むかまたは減らす最適な時点は、誘導の48時間後である(Dincerら、2013年;Micaら、2013年)。この時点で、dSMADiによる継続によって前部NEが生じ、CHIR99021によるWntシグナル伝達の活性化により頭蓋NCが生じ、BMP阻害剤であるLDN193189の除去により頭蓋プラコードが生じ、またはLDN193189と組み合わせたSU5402によるFGFシグナル伝達のブロッキングによりNNEの運命が誘発される。定義された転写因子および他の系統特異的マーカーを使用して、初期の外胚葉系統のそれぞれを一意的に特定することができる。NEの生成は、SOX1およびPAX6の発現、ならびにTFAP2Aの非存在によってマークされる。TFAP2Aの発現によって、非神経外胚葉から誘導される細胞型から外胚葉が分離される。TFAP2Aと組み合わせて、SOX10対SIX1の発現によって、それぞれ、NC対プラコードの同一性が特異的にマークされる。NNEに対する特異的転写因子が存在するかどうかは不明のままであるが、SOX10とSIX1の両方の非存在下でのTFAP2Aの発現は、これらの培養条件下でNNEを確実に特定しているようである(図1B)。
4つの外胚葉系統を誘導するためのdSMADiベースの分化プロトコルは、化学的に定義したシステムを使用すると、NEの運命への偏りを生じる
4つの主要な外胚葉系統は、神経外胚葉(NE)、神経堤(NC)、頭蓋プラコード(CP)および非神経外胚葉(NNE)を含む。これらの系統のそれぞれは、図1Aにまとめたように伝統的なKSRベースのプロトコルを使用してdSMADi条件を修正することによって生成することができる。興味深いことに、KSR条件下で、パターニング因子を含むかまたは減らす最適な時点は、誘導の48時間後である(Dincerら、2013年;Micaら、2013年)。この時点で、dSMADiによる継続によって前部NEが生じ、CHIR99021によるWntシグナル伝達の活性化により頭蓋NCが生じ、BMP阻害剤であるLDN193189の除去により頭蓋プラコードが生じ、またはLDN193189と組み合わせたSU5402によるFGFシグナル伝達のブロッキングによりNNEの運命が誘発される。定義された転写因子および他の系統特異的マーカーを使用して、初期の外胚葉系統のそれぞれを一意的に特定することができる。NEの生成は、SOX1およびPAX6の発現、ならびにTFAP2Aの非存在によってマークされる。TFAP2Aの発現によって、非神経外胚葉から誘導される細胞型から外胚葉が分離される。TFAP2Aと組み合わせて、SOX10対SIX1の発現によって、それぞれ、NC対プラコードの同一性が特異的にマークされる。NNEに対する特異的転写因子が存在するかどうかは不明のままであるが、SOX10とSIX1の両方の非存在下でのTFAP2Aの発現は、これらの培養条件下でNNEを確実に特定しているようである(図1B)。
規定の分化培地の下でこれらの種々の外胚葉系統マーカーの獲得をモニタリングするために、本発明者らは、3種のGFPレポーター株、PAX6::H2B-GFP(図8A、B、CおよびD)SOX10::GFP(Chambersら、2012年;Micaら、2013年)およびSIX1::H2B-GFP(図8A、B、EおよびF)を使用した。これらの株の特異的細胞型への分化によって、それぞれ平均95%のNE、50%のプラコードおよび58%のNEが生じた(図1Cおよび1D)。全体の分化効率は非常に高く、プラコードおよびNC細胞の収率は分化の繰り返しにわたって可変的であり、分化培地中のある特定の因子が変化し、それによって収率に影響を与える可能性があることを示唆した。
これらのプロトコルをより厳格に規定したE6培地へと移行するために、本発明者らは、hPSCを複数回継代の間E8中で順応させ、4つの主要な外胚葉系統を誘発するために以前に記載された因子および濃度を維持しながら、KRSベースの培地をE6ベースの分化と単純に交換した(図9A)。本発明者らは、小分子、すなわちCHIR99021およびSU5402の一部については、最初の濃度では、分化中に細胞を効率的に死滅させ、再度用量設定しなければならなかったことを見出した。小分子のそれぞれに対する最適な非毒性濃度を決定した後、本発明者らは、E6条件下でのNE形成がKSRベースの条件で得られたものと同等であることを観察した。E6条件下、小分子の非存在下でのNEの形成について以前に実証された(Lippmannら、2014年)。本発明者らは、小分子を使用しないか、dSMADiを使用するか、または単一のTGFβ阻害剤であるSB431542(SB)を使用するかのいずれかによるPAX6陽性細胞生成の効率を比較した。本発明者らは、dSMADiの非存在下での堅固なPAX6の発現を見出した(誘導の12日後に全細胞の約40%)。しかし、PAX6を発現する細胞のパーセンテージは、SBまたはdSMADiの添加でさらに改善し、それぞれ、ほぼ90%と80%となった(図1Eおよび9B)。PAX6+NEはTbr1陽性皮質ニューロンへとさらに効率的に分化し(図9E)、これらの細胞が皮質発生の初期段階へと進行できることを示した。驚くべきことに、高いパーセンテージのPAX6+細胞が、CPまたはNNEで維持された細胞を含むほとんどすべての処理群で観察された。CP細胞はPAX6を発現することができるが、これらの細胞はSix1を同時に発現せず、これらがCP起源ではないことを示唆した(図1E)。さらに、NC誘導によってPAX6陽性細胞もSOX10陽性細胞も生成されず、Wnt活性化によって、NCを誘導するよりもむしろ、細胞を分化させる領域アイデンティティを変更する可能性があることが示された(図9C、D)。最後に、KSR対E6条件下でNCへと分化したhPSCの比較遺伝子発現分析によって、E6下での非神経マーカーの発現の欠如が明らかとなった(図1F)。全体として、これらのデータによって、E6は、KSRベースの分化で開発された小分子条件下で、非神経の運命を誘導する因子を欠いていたことが示唆される。
TFAP2Aを介したBMPシグナル伝達は非CNSの運命を生じるために必須である
ほとんどの外胚葉系統プロトコルが、デフォルトで、PAX6陽性NEを生じた理由を理解するために、本発明者らは、転写因子AP2α(TFAP2A)の誘導について調査した。TFAP2AはNC、CPおよびNNEにおいて高度に発現され、それぞれ、NCおよびCPに対するSOX10およびSIX1などの他の系統に制限されたマーカーの発現に先行する分化の2日以内に上方調節される(Dincerら、2013年)。多くのシグナル伝達分子がレチノイドならびにWNTおよびBMPシグナル伝達の活性化剤などのTFAP2Aの発現を誘導することが報告されている(Luoら、2003年;Xieら、1998年)。興味深いことに、KSR条件下では、これらのシグナル伝達因子はいずれも、堅固なTFAP2A発現にもかかわらず、非CNSの運命の誘導の間に添加されない(Dincerら、2013年)。したがって、本発明者らは、KSRベースの培地はTFAP2Aの誘導に十分な内因性シグナルを誘発することができるが、E6はこれらの因子を欠いていると仮定した。したがって、本発明者らは、関連するシグナル伝達分子を直接添加することによってTFAP2Aの発現を回復させることを試みた。
ほとんどの外胚葉系統プロトコルが、デフォルトで、PAX6陽性NEを生じた理由を理解するために、本発明者らは、転写因子AP2α(TFAP2A)の誘導について調査した。TFAP2AはNC、CPおよびNNEにおいて高度に発現され、それぞれ、NCおよびCPに対するSOX10およびSIX1などの他の系統に制限されたマーカーの発現に先行する分化の2日以内に上方調節される(Dincerら、2013年)。多くのシグナル伝達分子がレチノイドならびにWNTおよびBMPシグナル伝達の活性化剤などのTFAP2Aの発現を誘導することが報告されている(Luoら、2003年;Xieら、1998年)。興味深いことに、KSR条件下では、これらのシグナル伝達因子はいずれも、堅固なTFAP2A発現にもかかわらず、非CNSの運命の誘導の間に添加されない(Dincerら、2013年)。したがって、本発明者らは、KSRベースの培地はTFAP2Aの誘導に十分な内因性シグナルを誘発することができるが、E6はこれらの因子を欠いていると仮定した。したがって、本発明者らは、関連するシグナル伝達分子を直接添加することによってTFAP2Aの発現を回復させることを試みた。
プラコードおよび非神経外胚葉の生成
BMPシグナル伝達は、ニワトリ胚の発生においてNNEおよびプラコードの形成に重要であることが示されている(図2A)(GrovesおよびLaBonne、2014年)。本発明者らは、BMPシグナル伝達を外部から刺激することによってTFAP2Aの発現を誘導し、PAX6+NEを抑制することを考えた。本発明者らは、用量依存的な処置の3日以内に、TFAP2Aの発現が急速に上方調節されることを観察した(図2BおよびC)。高濃度(20ng/ml)で、細胞はTFAP2A陽性となり、SOX10およびSIX1の発現を欠き、NNEが強力なBMPシグナル伝達の活性化により誘発されることを示した(図2D)。FGF経路をさらに阻害することによってCP誘導をさらにブロックし、それによって、NNE誘導の効率を増大させる。NNEを規定の条件を使用してケラチノサイトへと最終分化に供する際に、本発明者らは、未成熟(K14陽性)および成熟上皮細胞(K18陽性)の両方を達成することができた(図2E)。
BMPシグナル伝達は、ニワトリ胚の発生においてNNEおよびプラコードの形成に重要であることが示されている(図2A)(GrovesおよびLaBonne、2014年)。本発明者らは、BMPシグナル伝達を外部から刺激することによってTFAP2Aの発現を誘導し、PAX6+NEを抑制することを考えた。本発明者らは、用量依存的な処置の3日以内に、TFAP2Aの発現が急速に上方調節されることを観察した(図2BおよびC)。高濃度(20ng/ml)で、細胞はTFAP2A陽性となり、SOX10およびSIX1の発現を欠き、NNEが強力なBMPシグナル伝達の活性化により誘発されることを示した(図2D)。FGF経路をさらに阻害することによってCP誘導をさらにブロックし、それによって、NNE誘導の効率を増大させる。NNEを規定の条件を使用してケラチノサイトへと最終分化に供する際に、本発明者らは、未成熟(K14陽性)および成熟上皮細胞(K18陽性)の両方を達成することができた(図2E)。
次に、本発明者らは、BMPシグナル伝達の3日間のパルスがSIX1陽性プラコードを生成するのに十分であるか否かを調べた。実際、BMPの添加はプラコード誘導を誘発したが、効率は低かった(図2Fおよび10)。用量応答研究により、中程度の濃度のBMP4(およそ5ng/ml)がCP誘導に最適であることを示した。興味深いことに、プラコード分化の間の細胞の大多数がNNEに似ており、FGFアゴニストの直接添加が、NNEを犠牲にしてプラコード生成の効率を高めるのに必要である可能性があることを示した。実際に、分化の間に、FGF2を添加し、FGF8を添加しないことにより、SIX1陽性細胞の形成がほぼ50%まで増強された(図2G)。
三叉神経プラコードはhPSCから誘導されるデフォルトプラコードの運命であることが以前に示されている(Dincerら、2013年)。本発明者らは、Six1陽性CPを最終的に分化させ、PAX3などの後部マーカーよりも前プラコードマーカーであるPAX6の発現を観察した(図2H)。プラコード細胞におけるPAX6の発現は、水晶体、下垂体または嗅覚のアイデンティティに対応する。これらの細胞のさらなる分化によって、三叉神経プラコードよりも主として水晶体としての運命を確認する、PITX3、クリスタリンアルファAおよびBなどの水晶体に特異的な因子の発現が実証された(図2HおよびI)。
次に、本発明者らは、これらの因子がKSRにおいて適当であって、E6において適さないため、水晶体プラコードを犠牲にして三叉神経プラコードの誘導を促進する因子を特定しようとした。発生の間、三叉神経プラコードは、PAX6+の水晶体、下垂体および嗅覚のプラコードの後に誘導される。したがって、本発明者らは、発生の間に後の細胞アイデンティティを誘発することが公知の標準的なWNTシグナル伝達の活性化が、三叉神経系統へのパターニングに移行するのに十分でありうるか否かを試験した。プラコードを誘導するBMPパルスの後に、分化の初期段階の間にCHIR99021のさらなるパルスへ曝露すると、三叉神経プラコードを示すSIX1プラコード細胞のPAX3の発現を誘導することができる(図2J)。これらのデータは、最小限の培地条件下で、本発明者らが、in vivoでの細胞運命の選択およびin vitroでのプラコード誘導の間の領域特異化を厳密に再現することができることを示す。
神経堤の生成
本発明者らは、BMP4のショートパルス(1ng/ml)と組み合わせたWNTシグナル伝達の活性化によりほぼ均質なSOX10陽性NC集団を生成できることを観察した(図3Aおよび図11)。興味深いことに、このような低濃度のBMP4で、TFAP2Aは弱くしか誘導されず(図2F)、NCが、最初に、TFAP2Aを発現しないがまたは低レベルのTFAP2Aを発現する初期前駆細胞から生じる可能性があることを示唆する。しかし、WNTとBMPの両方を添加することは、TFAP2Aと同じく、非神経外胚葉の運命の別のマーカーであるDLX3も活性化するように相乗的に作用する(図3B)。さらに、NCの分化によって、それぞれ、Isl1およびMash1染色によりマークされる自律神経および感覚神経を生じうる(図3C)。ここで表されたデータは、BMPシグナル伝達の初期の、用量依存的誘導によって、以前に報告されたよりも高い効率および低い可変性を有するNCを含む非CNS外胚葉の運命の形成が可能となることを実証する。
本発明者らは、BMP4のショートパルス(1ng/ml)と組み合わせたWNTシグナル伝達の活性化によりほぼ均質なSOX10陽性NC集団を生成できることを観察した(図3Aおよび図11)。興味深いことに、このような低濃度のBMP4で、TFAP2Aは弱くしか誘導されず(図2F)、NCが、最初に、TFAP2Aを発現しないがまたは低レベルのTFAP2Aを発現する初期前駆細胞から生じる可能性があることを示唆する。しかし、WNTとBMPの両方を添加することは、TFAP2Aと同じく、非神経外胚葉の運命の別のマーカーであるDLX3も活性化するように相乗的に作用する(図3B)。さらに、NCの分化によって、それぞれ、Isl1およびMash1染色によりマークされる自律神経および感覚神経を生じうる(図3C)。ここで表されたデータは、BMPシグナル伝達の初期の、用量依存的誘導によって、以前に報告されたよりも高い効率および低い可変性を有するNCを含む非CNS外胚葉の運命の形成が可能となることを実証する。
外肺葉由来の精製された細胞型の発現分析
本発明者らは、外胚葉に特異的なレポーター株を生成したため、4つのヒト外胚葉系統すべての転写発現特性を決定しようとした。NNE系統を除いて、本発明者らは、それぞれのレポーター株(すべての株はWA-09hESCから誘導された)を使用してGFP陽性細胞を選別し、これらの精製細胞のRNAシークエンシングを実施した。不偏クラスタリングアルゴリズムにより、NEはhESCと接近してクラスター化する一方、NNEは他のすべての外胚葉系統から最も離れてクラスター化することが示された。興味深いことに、主成分分析に基づき、NCおよびCPは互いに接近してクラスター化し、これらの細胞が類似する転写プロファイルを有するが、それぞれ、SOX10およびSIX1の発現においては異なることが示唆された(図4AおよびB)。次いで、差次的に発現した遺伝子は、共有の、および特有の発現プロファイルを有するものへとグループ化される(図4C)。次いで、このような発現パターンを遺伝子オントロジー分析(Edgarら、201
3年)に供した(図4D)。細胞外マトリックス再編成に関連する遺伝子は、非CNSから誘導された細胞型のすべてにおいて非常に豊富に存在する。このことは、分化の間の初期BMPシグナルがECMを介して部分的に作用する可能性があり、またはECMに関連する転写物の豊富な細胞型を少なくとも誘導することを示す。逆に、NEに関連するオントロジーはシナプス伝達および神経系の発達に関与する。NCに特異的な個々のオントロジーは細胞接着およびカルシウム結合を誘導し、一方、CPはシナプス伝達およびイオン膜輸送に対して濃縮される。まとめると、4つの外胚葉系統に対する転写発現プロファイルは全体として異なっており、表された特異的系統のそれぞれに関連する捕捉機能である。
本発明者らは、外胚葉に特異的なレポーター株を生成したため、4つのヒト外胚葉系統すべての転写発現特性を決定しようとした。NNE系統を除いて、本発明者らは、それぞれのレポーター株(すべての株はWA-09hESCから誘導された)を使用してGFP陽性細胞を選別し、これらの精製細胞のRNAシークエンシングを実施した。不偏クラスタリングアルゴリズムにより、NEはhESCと接近してクラスター化する一方、NNEは他のすべての外胚葉系統から最も離れてクラスター化することが示された。興味深いことに、主成分分析に基づき、NCおよびCPは互いに接近してクラスター化し、これらの細胞が類似する転写プロファイルを有するが、それぞれ、SOX10およびSIX1の発現においては異なることが示唆された(図4AおよびB)。次いで、差次的に発現した遺伝子は、共有の、および特有の発現プロファイルを有するものへとグループ化される(図4C)。次いで、このような発現パターンを遺伝子オントロジー分析(Edgarら、201
3年)に供した(図4D)。細胞外マトリックス再編成に関連する遺伝子は、非CNSから誘導された細胞型のすべてにおいて非常に豊富に存在する。このことは、分化の間の初期BMPシグナルがECMを介して部分的に作用する可能性があり、またはECMに関連する転写物の豊富な細胞型を少なくとも誘導することを示す。逆に、NEに関連するオントロジーはシナプス伝達および神経系の発達に関与する。NCに特異的な個々のオントロジーは細胞接着およびカルシウム結合を誘導し、一方、CPはシナプス伝達およびイオン膜輸送に対して濃縮される。まとめると、4つの外胚葉系統に対する転写発現プロファイルは全体として異なっており、表された特異的系統のそれぞれに関連する捕捉機能である。
初期のヒト外胚葉系統のデータの不足を考慮に入れると、次に、本発明者らは、外胚葉系統のそれぞれに対するより特異的なマーカーを特定することができるか否かを調べた。外胚葉系統の中で顕著に差次的な発現を有するのと同様に、一意的に上方調節される遺伝を有する転写物をさらなる検証に供した。CNSと非CNSの運命間で共有される外肺葉分化の間に特異的に上方調節される遺伝子として、ANXA1、LGI1、NR2F2およびZNF503が挙げられる。さらに、CNS対非CNSを線引きする因子は、NEUROG1、HAND1、TFAP2AおよびTFAP2Bである(図4E)。NEにおいて、Sox1およびHes5などの因子は、CNSの細胞を排他的に特定するが、低レベルのPAX6転写物は、他の系統のすべてで見出すことができる(図4F)。興味深いことに、本発明者らは、NC系統に特異的な、性質不明のジンクフィンガータンパク質であるZNF229の高い発現を観察した。他の系統については、本発明者らは、それぞれ、プラコードおよびNNEで優先的に発現されるELAVL4およびSMYD1を特定した。この分析により、外肺葉形成の間に、主要な系統のそれぞれの特定について公知の遺伝子と新規遺伝子の両方のサブセットがもたらされる。
TFAP2Aの損失が非CNS誘導体の誘導に影響を及ぼす
ここで、4つの主要な外胚葉系統を誘導するために提示された新規条件は、堅固かつ効率的である。したがって、本発明者らは、外胚葉系統の特異化の間に重要な役割を果たすものを特定するための摂動研究を実施しようとした。非CNS運命に関与する本発明者らの研究の1つの最良の候補は、dSMADiの間に、初期に高度に発現されることから、TFAP2Aであった。非CNS系統がTFAP2Aの発現に依存するか否かを対象として、本発明者らはCRISPR/Cas9系を使用してTFAP2AノックアウトhESC株を生成した。2種のガイドRNAを使用して、フレームシフトの欠失を誘導し、陽性クローンをシークエンシングして、欠失の程度および性質を決定した(図12Aおよび12B)。TFAP2Aの発現の消失を高BMPの存在下で短い3日の誘導を使用して確認した(図5Aおよび12C)。TFAP2A対野生型hESCのさらなる比較研究により、CPまたはNNE条件下で、野生型では分化の6日目にE-カドヘリンの堅固な上方調節が示されたが、TFAP2Aノックアウト細胞では示されなかった(図5B)。これらのデータにより、TFAP2Aが、NCまたはCPの運命へのEMT様移行から細胞を保護する場合のあるE-カドヘリンの発現を促進することが示唆される。
ここで、4つの主要な外胚葉系統を誘導するために提示された新規条件は、堅固かつ効率的である。したがって、本発明者らは、外胚葉系統の特異化の間に重要な役割を果たすものを特定するための摂動研究を実施しようとした。非CNS運命に関与する本発明者らの研究の1つの最良の候補は、dSMADiの間に、初期に高度に発現されることから、TFAP2Aであった。非CNS系統がTFAP2Aの発現に依存するか否かを対象として、本発明者らはCRISPR/Cas9系を使用してTFAP2AノックアウトhESC株を生成した。2種のガイドRNAを使用して、フレームシフトの欠失を誘導し、陽性クローンをシークエンシングして、欠失の程度および性質を決定した(図12Aおよび12B)。TFAP2Aの発現の消失を高BMPの存在下で短い3日の誘導を使用して確認した(図5Aおよび12C)。TFAP2A対野生型hESCのさらなる比較研究により、CPまたはNNE条件下で、野生型では分化の6日目にE-カドヘリンの堅固な上方調節が示されたが、TFAP2Aノックアウト細胞では示されなかった(図5B)。これらのデータにより、TFAP2Aが、NCまたはCPの運命へのEMT様移行から細胞を保護する場合のあるE-カドヘリンの発現を促進することが示唆される。
E-カドヘリンのデータを考慮に入れて、本発明者らは、TFAP2Aノックアウト細胞は非CNS系統へ移行することができず、デフォルトでCNS NEとなると仮定した。この仮定と一致して、NEの誘導はTFAP2Aの損失に影響を与えなかった(図5C)。Sox1およびPax6などのCNSに豊富な転写因子は、他の系統からのわずかの夾雑物と共に豊富に存在した。さらに、NCおよびプラコードのプロトコルによって、TFAP2Aノックアウト対野生型細胞においてSOX1およびPAX6の発現のレベルが増加した(図5CおよびD)。しかし、予想外に、TFAP2A KO細胞のNCまたはCPへの誘導の間に、野生型と比較して数は少ないものの、それぞれ、SOX10およびSIX1陽性細胞が見出された。このことは、TFAP2Aの発現を消失させることは、非CNS細胞型を抑制するのに十分ではないことを示す。別の驚くべき結果は、TFAP2Aの破壊は、Smyd1などの他のNNE関連遺伝子の発現に影響を与えなかったことであった。これらのデータによって、NNEの形成は、単にTFAP2Aの発現によるものではないことが示唆される。事実、以前の研究により、TFAP2C(AP2α)の発現はNNEにおいて優勢であることが示されている(LiおよびCornell、2007年)。
ヒト外胚葉系統を誘導するための本発明者らの新規プラットホームは、in vivoでの発生プログラムを模倣する外胚葉系統の特異化の間のBMPシグナル伝達に対する重要な役割を実証した。さらに、本発明者らは、この系が、TFAP2Aなどの運命選択の決定に関与する規定の発生因子の役割を明らかにするために遺伝子操作されうるという概念実証を提示する。
プラコード形成を増強する因子についての小分子スクリーニング
化学的に規定された系に変換することによって、最も主要な外胚葉系統に対して優れた収率を有するモジュール分化プラットホームが得られる。しかし、CPの運命の誘導は比較的低いままであった(約40%)。CP誘導の効率をさらに増強し、HTSアッセイにおける本発明者らのプラットホームの適性を実証するために、本発明者らは、Six1::H2B-GFPレポーター株に関して、Library of Pharmacologically Active Compounds(LOPAC)を使用して小分子スクリーニングを実施した(図6A)。本発明者らは、対照の分化で観察されたレベルを超えてSix1の発現を増加させた3種の有効な候補を特定した。セロトニン受容体アゴニストであるBRL-5443;パルテノライド、NF-kBおよびSTATが媒介するコンフォメーション転写を阻害する能力を有する植物ホルモン;ならびにフェナントロリン、メタロプロテアーゼ阻害剤。主要なヒットのさらなる検証に関して、フェナントロリンがSix1を発現する細胞のパーセンテージを確実に増強することを確認した(図6C、13A、13B)。
化学的に規定された系に変換することによって、最も主要な外胚葉系統に対して優れた収率を有するモジュール分化プラットホームが得られる。しかし、CPの運命の誘導は比較的低いままであった(約40%)。CP誘導の効率をさらに増強し、HTSアッセイにおける本発明者らのプラットホームの適性を実証するために、本発明者らは、Six1::H2B-GFPレポーター株に関して、Library of Pharmacologically Active Compounds(LOPAC)を使用して小分子スクリーニングを実施した(図6A)。本発明者らは、対照の分化で観察されたレベルを超えてSix1の発現を増加させた3種の有効な候補を特定した。セロトニン受容体アゴニストであるBRL-5443;パルテノライド、NF-kBおよびSTATが媒介するコンフォメーション転写を阻害する能力を有する植物ホルモン;ならびにフェナントロリン、メタロプロテアーゼ阻害剤。主要なヒットのさらなる検証に関して、フェナントロリンがSix1を発現する細胞のパーセンテージを確実に増強することを確認した(図6C、13A、13B)。
化合物とCPの発生の間には明らかなリンクは存在しないが、次に、本発明者らは、フェナントロリンが、プラコードの運命を富化するのに具体的にどのように作用するかを決定した。CPへの分化は、Sox10、T、MyoDまたはSox17などの他の系統マーカーの発現を誘導することなく、対照に対してSix1の発現を5倍増加させることを示した(図6D)。次に、本発明者らは、フェナントロリンの添加が、相加的または選択的にCP誘導の効率を改善するか否かを評価した。興味深いことに、FGF2の非存在下でフェナントロリンを添加すると、Six1陽性細胞がほぼ4倍(18%に対して69%)増加する(図6E)。FGF2またはFGF2とフェナントロリンを添加した後、Six1陽性細胞の濃縮は、それぞれ、34%および46%まで低下した。これらの結果は、フェナントロリンが、化合物の存在下で生存することができない場合のある他の外胚葉系統を犠牲にして、Six1陽性CP細胞を選択的に豊富にする可能性があることを示唆する。結論として、小分子スクリーニングによって、好まれる系統へのhPSCの分化効率をさらに改善することができる新規因子を特定するための本発明者らの外胚葉系統プラットホームを使用する実行可能性が実証される。
NC、CPおよびNNEのモジュール生成に対する本発明者らの修正された手法は、用量依存的BMPシグナル伝達応答に依拠するが、NEの精製は、修正なしで両方の系において堅固であった(図7A)。BMPシグナル伝達の最初のパルスによって、非モジュールのKSRベースの分化条件と比較して、NCの生成、および程度は低いがCPの生成において、効率の増大および可変性の低減が可能となった(図7B対図1D)。
本発明者らの主な注目点は、KSRなどの培地に関連する因子によって引き起こされる可変性を排除する高度に堅固な、モジュールの外肺葉分化プラットホームを確立することであった。しかし、基質をコーティングすること、および細胞密度など可変性のさらなる可能性のある発生源が存在する。マトリゲルは、一般的に、基質のコーティングに使用され、数千ものタンパク質から構成されるが、本発明者らのこの研究で使用されるビトロネクチンは、単一の組換えタンパク質である。ビトロネクチンの代わりにマトリゲルを使用することが外胚葉系統の特異化の堅固さに負の影響を与えるか否かを決定するために、本発明者らは、本発明者らのビトロネクチンベースの標準プロトコルと比較して、11個のマトリゲルのバッチを試験した。驚くべきことに、2つを除くすべてのバッチが高度に堅固な誘導効率をもたらした(図14A)。外胚葉系統の選択に影響を与えることが公知の別の可能な因子は細胞密度である。すなわち、PAX6陽性NE対Sox10陽性NCの生成は、出発hPSC播種密度に依存することが示された(Chambersら、2009年)。本発明者らは、マトリゲル(図14B)とビトロネクチン(図14C)の両方を使用して、1cm2当たり50,000~300,000個の細胞を使用する分化を実施させ、細胞密度が細胞運命の決定に明確な役割を果たさないことを見出した。これらの追加データによって、4つの外胚葉系統を獲得する上で、基質のコーティングまたは細胞密度に対し最小限の依存度しか示さない堅固な本発明者らの分化プラットホームがさらに確認される。
考察
オンデマンドでhPSCから多数の特異的細胞型を誘導する目的は、適切な分化プラットホームの利用可能性に依存する。現在利用可能なプロトコルは、培地の組成および培養技術に多くの矛盾が生じやすい。ここで、本発明者らは、化学的に規定された系を使用して、4つの主要な外胚葉系統のすべてを誘導するストラテジーを提示する。in vivoでの発生の合図となる因子(cue)の適用により、分化の成功がおおいに増強され、本発明者らは、4つのシグナル伝達経路のモジュレーションが、初期の外胚葉系統の選択の十分な多様性を再現するのに十分であることを示す。CNS対非CNSの運命の線引きは、BMPによる用量依存的処置に依拠する。NC、CPおよびNNEなどの任意の特異的系統を促進する具体的なBMP濃度は非常に狭い。BMPは、NCを生成するWNTの活性化、CPを生成するFGFの活性化、およびNNEを生成するFGFの阻害と共同で作用することができるTFAP2Aを上方調節することにより、少なくとも部分的に作用する。本発明者らの結果により、最小限の培地系において、少量の小分子を使用するin
vivoでの発生を模倣することによって、外胚葉細胞の運命の決定を再現することができることが実証される。この外胚葉の分化のプラットホームは、非常に堅固であり、発生経路の遺伝学的解剖および小分子スクリーニングに適している。本研究によって、TFAP2Aの損失は、NEまたはNNEの形成に影響を与えないが、NCおよびCPの運命の誘導にはおおいに影響を及ぼすことも実証された。
オンデマンドでhPSCから多数の特異的細胞型を誘導する目的は、適切な分化プラットホームの利用可能性に依存する。現在利用可能なプロトコルは、培地の組成および培養技術に多くの矛盾が生じやすい。ここで、本発明者らは、化学的に規定された系を使用して、4つの主要な外胚葉系統のすべてを誘導するストラテジーを提示する。in vivoでの発生の合図となる因子(cue)の適用により、分化の成功がおおいに増強され、本発明者らは、4つのシグナル伝達経路のモジュレーションが、初期の外胚葉系統の選択の十分な多様性を再現するのに十分であることを示す。CNS対非CNSの運命の線引きは、BMPによる用量依存的処置に依拠する。NC、CPおよびNNEなどの任意の特異的系統を促進する具体的なBMP濃度は非常に狭い。BMPは、NCを生成するWNTの活性化、CPを生成するFGFの活性化、およびNNEを生成するFGFの阻害と共同で作用することができるTFAP2Aを上方調節することにより、少なくとも部分的に作用する。本発明者らの結果により、最小限の培地系において、少量の小分子を使用するin
vivoでの発生を模倣することによって、外胚葉細胞の運命の決定を再現することができることが実証される。この外胚葉の分化のプラットホームは、非常に堅固であり、発生経路の遺伝学的解剖および小分子スクリーニングに適している。本研究によって、TFAP2Aの損失は、NEまたはNNEの形成に影響を与えないが、NCおよびCPの運命の誘導にはおおいに影響を及ぼすことも実証された。
方法
hPSCの培養および分化
H9 ESC(WA09)および改変レポーター株(40~70継代)をマウスの胎仔線維芽細胞フィーダーのKnockout Serum Replacement(KSR)(Life Technologies)ベースの培地(DMEM-F12、20%のKSR、L-グルタミン酸および10ng/mlのFGF2)で培養した。KSR hPSCをビトロネクチンでコーティングしたE8培地(Life Technologies)に直接移し、分化が実施される4~5継代前の間適応させた。KSRベースの分化を以前に記載したように実施し、神経外胚葉および神経堤(Micaら、2013年)、ならびにプラコードおよび非神経外胚葉(Dincerら、2013年)の通りに実施した。
hPSCの培養および分化
H9 ESC(WA09)および改変レポーター株(40~70継代)をマウスの胎仔線維芽細胞フィーダーのKnockout Serum Replacement(KSR)(Life Technologies)ベースの培地(DMEM-F12、20%のKSR、L-グルタミン酸および10ng/mlのFGF2)で培養した。KSR hPSCをビトロネクチンでコーティングしたE8培地(Life Technologies)に直接移し、分化が実施される4~5継代前の間適応させた。KSRベースの分化を以前に記載したように実施し、神経外胚葉および神経堤(Micaら、2013年)、ならびにプラコードおよび非神経外胚葉(Dincerら、2013年)の通りに実施した。
E8から出発するすべての分化をEDTAを使用して単一の細胞に分離し、ROCK阻害剤(Tocris)を含むE8に高密度で再播種した。典型的には、マトリゲルをコーティングしたディッシュに1cm2当たり200,000個の細胞密度で細胞を播種した。E8からE6への切り替えによって分化が誘発された(すなわち、0日目)。神経外胚葉(NE)の形成は、10nMのSBおよび500nMのLDNを含むE6で12日目まで細胞を培養することによって生じた。はじめに、神経堤(NC)は、0日目~2日目まで、10nMのSB、600nMのCHIRおよび1ng/mlのBMP4で処理した。2日目に、細胞を、12日目まで、1.5uMのCHIRを含む10nMのSB中で維持した。はじめに、水晶体プラコードは、0日目~2日目まで、10nMのSBおよび5ng/mlのBMP4で処理した。2日目に、細胞を、12日目まで、100ng/mlのFGF2を含む10nMのSB中で維持した。はじめに、三叉神経プラコードは、0日目~2日目まで、10nMのSBおよび5ng/mlのBMP4で処理した。2日目に、CHIRを、4日目まで、SBおよびBMP4に添加した。最後に、非神経外胚葉(NNE)を、12日目まで、10nMのSB、10nMのSU5402および20ng/mlのBMP4で処理した。
Pax6およびSix1 H2B-GFPノックインレポーター株の生成
ドナープラスミドを構築し、Infusion Cloning System(Clontech)を使用してpUC19にクローニングした。TALEN配列をTAL Effector Nucleotide Targeterソフトウェア(Cermakら、2011年;Doyleら、2012年)を使用して予測した。
ドナープラスミドを構築し、Infusion Cloning System(Clontech)を使用してpUC19にクローニングした。TALEN配列をTAL Effector Nucleotide Targeterソフトウェア(Cermakら、2011年;Doyleら、2012年)を使用して予測した。
Pax6 TALENSおよびSix1 TALENS:。TALENをTALEN Toolbox(Addgene)(Sanjanaら、2012年)を使用して生成し、記載
されたように実施した。ドナープラスミド(20ug)およびTALEN対(それぞれ5ug)をH9 hESC(32~36継代)へヌクレオフェクトした(Lonza Kit V)。ヌクレオフェクトした細胞をKSR培地とROCK阻害剤中のMEFフィーダー層に播種した。48時間後、ピューロマイシン(1ug/ml)を添加し、陽性クローンを選択した。次いで、ピューロマイシン抵抗性コロニーを単離し、ゲノムDNAを抽出し、標的化をPCRを使用して確認した。さらに、検証には、誘導された分化とPax6抗体またはSix1抗体のいずれかで同時に標識するGFPが含まれた。
されたように実施した。ドナープラスミド(20ug)およびTALEN対(それぞれ5ug)をH9 hESC(32~36継代)へヌクレオフェクトした(Lonza Kit V)。ヌクレオフェクトした細胞をKSR培地とROCK阻害剤中のMEFフィーダー層に播種した。48時間後、ピューロマイシン(1ug/ml)を添加し、陽性クローンを選択した。次いで、ピューロマイシン抵抗性コロニーを単離し、ゲノムDNAを抽出し、標的化をPCRを使用して確認した。さらに、検証には、誘導された分化とPax6抗体またはSix1抗体のいずれかで同時に標識するGFPが含まれた。
RNAシークエンシングおよび分析
総RNA(Trizol)を少なくとも二連で分化の12日目にGFP選別細胞から(NE、NCおよびプラコード)またはバルクで(NNE)単離した。6千万の読み取りデータが生じ、Tophat v1.2(Trapnellら、2012年)を使用してアライニングした。次いで、HTseq(Andersら、2015年)を使用して読み取りデータをカウントし、差次的に発現した遺伝子をDESeq(AndersおよびHuber、2010年)を使
用して計算した。差次的に発現した群を、遺伝子オントロジーによる分類およびLifeMap Gene Analytics(Edgarら、2013年)を使用するシグナル伝
達経路濃縮について分析した。得られたRNAシークエンシングデータセットをGEOにアップロードする。
総RNA(Trizol)を少なくとも二連で分化の12日目にGFP選別細胞から(NE、NCおよびプラコード)またはバルクで(NNE)単離した。6千万の読み取りデータが生じ、Tophat v1.2(Trapnellら、2012年)を使用してアライニングした。次いで、HTseq(Andersら、2015年)を使用して読み取りデータをカウントし、差次的に発現した遺伝子をDESeq(AndersおよびHuber、2010年)を使
用して計算した。差次的に発現した群を、遺伝子オントロジーによる分類およびLifeMap Gene Analytics(Edgarら、2013年)を使用するシグナル伝
達経路濃縮について分析した。得られたRNAシークエンシングデータセットをGEOにアップロードする。
TFAP2Aノックアウト株の生成
CRISPR/Cas9系を使用してノックアウトhESC株を生成した。手短に述べると、2種のガイドRNAをCRISPR設計ツール(Congら、2013年)を使用して予測し、TOPO-Bluntベクター(Maliら、2013年)(Life Technologies)にクローニングした。Cas9-GFP(5ug)と両方のガイドRNA(それぞれ1ug)をH9 hESCへヌクレオフェクトし、ROCK阻害剤を含むKSR培地中マトリゲルをコーティングしたディッシュに再播種した。24時間後、細胞をGFRについて選別し、ROCK阻害剤を含むKSR培地中のMEFフィーダー層に播種した。次いで、コロニーを単離し、TFAP2Aの標的化領域をPCRによって増幅させ、TOPO TAベクターにクローニングし、フレームシフトの変異を特定するためにシークエンシングした。
CRISPR/Cas9系を使用してノックアウトhESC株を生成した。手短に述べると、2種のガイドRNAをCRISPR設計ツール(Congら、2013年)を使用して予測し、TOPO-Bluntベクター(Maliら、2013年)(Life Technologies)にクローニングした。Cas9-GFP(5ug)と両方のガイドRNA(それぞれ1ug)をH9 hESCへヌクレオフェクトし、ROCK阻害剤を含むKSR培地中マトリゲルをコーティングしたディッシュに再播種した。24時間後、細胞をGFRについて選別し、ROCK阻害剤を含むKSR培地中のMEFフィーダー層に播種した。次いで、コロニーを単離し、TFAP2Aの標的化領域をPCRによって増幅させ、TOPO TAベクターにクローニングし、フレームシフトの変異を特定するためにシークエンシングした。
参考文献
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disease-related pigmentation defects in hESCs and patient-specific iPSCs. Cell reports 3, 1140-1152.
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20.Schorle, H., Meier, P., Buchert, M., Jaenisch, R., and Mitchell, P.J. (1996). Transcription factor AP-2 essential for cranial closure and craniofacial development. Nature 381, 235-238.
21.Trapnell, C., Roberts, A., Goff, L., Pertea, G., Kim, D., Kelley,
D.R., Pimentel, H., Salzberg, S.L., Rinn, J.L., and Pachter, L. (2012). Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks. Nature protocols 7, 562-578.
22.Xie, W.F., Kondo, S., and Sandell, L.J. (1998). Regulation of the
mouse cartilage-derived retinoic acid-sensitive protein gene by the transcription factor AP-2. The Journal of biological chemistry 273, 5026-5032.
6.2 実施例2:ヒト多能性幹細胞からの様々なホルモン放出下垂体細胞の誘導
要約
ヒト多能性幹細胞(hPSC)は、再生医療において適用するための潜在的に制限されない細胞供給源を表す。ホルモン生成細胞は、細胞療法の適用に特に適している場合があり、下垂体機能障害の処置は有効な治療標的である場合がある。以前の研究により、in
vivoでの下垂体の発生に関与する発生の相互作用を模倣する3Dオルガノイド培養を使用するマウスのESCからの下垂体系統の誘導が実証された。
ヒト多能性幹細胞(hPSC)は、再生医療において適用するための潜在的に制限されない細胞供給源を表す。ホルモン生成細胞は、細胞療法の適用に特に適している場合があり、下垂体機能障害の処置は有効な治療標的である場合がある。以前の研究により、in
vivoでの下垂体の発生に関与する発生の相互作用を模倣する3Dオルガノイド培養を使用するマウスのESCからの下垂体系統の誘導が実証された。
本実施例では、細胞の製造に適する化学的に規定された単層培養条件を使用してhPSCから下垂体前葉系統を誘導するシンプルで効率の良いストラテジーが記載されている。本発明者らは、精製されたプラコード系統が、複雑な共培養条件の非存在下で、規定の合図となる因子を使用して下垂体の運命に誘導されうることを実証する。単一細胞の遺伝子発現分析を使用して、本発明者らは、80%を超える下垂体ホルモン発現細胞を有するhPSCから誘導された系統の多様性を規定する。最後に、本発明者らは、下垂体機能障害のマウスモデルへの移植後に、in vitroでのベースとなるホルモン放出と刺激に誘導されるホルモン放出およびin vivoでの生着およびホルモン放出について実証する。
ここで、本発明者らは、十分に規定したcGMPにより利用可能な単層培養条件下で、hPSC由来の下垂体前葉のホルモン産生細胞の効率的な誘導について報告する。さらに、本発明者らは、in vivoで達成することができる下垂体前葉のサブタイプの多様性を対象とする単一細胞のmRNA発現データを提示する。さらに、本発明者らは、生成された細胞が、適当な刺激に応答することによってin vitroで機能的であり、in vivoで下垂体機能低下症の動物モデルにおいてホルモンを分泌することを示す。本発明者らのデータによって、mESCを使用する以前の報告とは対照的に、下垂体細胞の運命が、腺の発生の複雑な3D編成を模倣することとは無関係に、かつ、下垂体前葉のアイデンティティを誘導すると考えられる視床下部細胞との直接の接触なしに、誘導されうることが示される。本発明者らは、精製したプラコード前駆体細胞に適当なシグナルを与えることによって、下垂体のアイデンティティを効率よく特定することができ、モルフォゲン勾配をさらに操作することによって、ホルモンの細胞型の相対的組成に制御された変更を与えることが可能となることを実証する。本発明者らは、下垂体機能低下症の細胞ベースの処置に対するさらなる開発に適切な様々なホルモン生成細胞型にアクセスする堅固な分化プラットホームを提供する。
結果
十分に規定した条件下でのhPSCからの頭蓋プラコードの誘導
本発明者らは、hPSCからの腺下垂体を含む頭蓋プラコードの生成について最近報告した(Dincerら、2013年)。しかし、本発明者らの以前のプロトコルは、下垂体系統の細胞を生成するために最適化されておらず、いくつかの不明確な試薬、例えば、ノックアウト血清代替物(KRS)、マトリゲルおよびマウスの胎仔線維芽細胞(iMEF)フィーダーを含有した。これらの構成成分は、所与の分化プロトコルの堅固さに対する可変性のかなりの発生源であり、ヒトへの移行に適する細胞療法の開発を複雑化している。さらに、PSCからの下垂体前葉系統の細胞の生成効率は、マウスとヒトの細胞の両方について公開されたすべての研究において低いものであった。最後に、マウスのESCにおける3D培養の研究によって示唆された誘導プロセスの間に、視床下部細胞との直接的相互作用が必要であるか否か(Sugaら、2011年)、または制限された数の規定のシグナルが下垂体の運命を誘発するのに十分であるか否かを、最終的に評価することが重要であった。
十分に規定した条件下でのhPSCからの頭蓋プラコードの誘導
本発明者らは、hPSCからの腺下垂体を含む頭蓋プラコードの生成について最近報告した(Dincerら、2013年)。しかし、本発明者らの以前のプロトコルは、下垂体系統の細胞を生成するために最適化されておらず、いくつかの不明確な試薬、例えば、ノックアウト血清代替物(KRS)、マトリゲルおよびマウスの胎仔線維芽細胞(iMEF)フィーダーを含有した。これらの構成成分は、所与の分化プロトコルの堅固さに対する可変性のかなりの発生源であり、ヒトへの移行に適する細胞療法の開発を複雑化している。さらに、PSCからの下垂体前葉系統の細胞の生成効率は、マウスとヒトの細胞の両方について公開されたすべての研究において低いものであった。最後に、マウスのESCにおける3D培養の研究によって示唆された誘導プロセスの間に、視床下部細胞との直接的相互作用が必要であるか否か(Sugaら、2011年)、または制限された数の規定のシグナルが下垂体の運命を誘発するのに十分であるか否かを、最終的に評価することが重要であった。
このプロトコルの最初のステップは、下垂体前葉系統を生成する能力のある初期頭蓋プラコード細胞の効率的な誘導である。本発明者らの新規な頭蓋プラコード誘導プロトコルは、無血清単層ベースの誘導条件に依拠し、十分に規定したcGMPにより利用可能な構成成分を使用する。プラコード誘導を誘発するために使用される特異的シグナルは、in
vivoでプラコード誘導を特定すると考えられる発生シグナルに基づく(図15A)。本発明者らは、中程度の濃度のBMP4への曝露が頭蓋プラコードの運命の効率的な誘導に必要とされることを観察している。さらに、FGFシグナルの非存在下で水晶体のデフォルトも報告するin vivoでのニワトリ胚の発生における研究(Baileyら、2006年)と一致する条件下で、水晶体は「デフォルト」プラコードの運命であると思われる(図22)。詳細的な一時的発現分析により、mRNAレベル(図15B)とタンパク質レベル(図15C)の両方で6日間の分化までに、多能性マーカーの急速な損失、ならびにSIX1、EYA1およびDLX3/5などの重要なプラコード遺伝子の堅固な誘導が明らかとなった。SOX10(神経堤)、SOX17(外胚葉)、T/Brachyury(中胚葉)またはMYOD(筋原性の系統)などの夾雑する細胞型の存在をマークする転写物は、これらの条件下では誘導されなかった(図15B)。本発明者らの以前の研究により、hPSCから誘導されるプラコード細胞の「デフォルト」アイデンティティとしてPAX3+三叉神経プラコードが報告された(Dincerら、2013年)。規定のプラコード誘導条件を使用する本発明者らのこのプロトコルは、PAX3発現よりPAX6を示す(図15C)。プラコード誘導およびPAX6発現の収率および選択性をさらに定量化するために、本発明者らは、SIX1::H2B-GFP(図25)、PAX6::H2B-GFP、SOX10-GFP(Chambersら、2012年;Micaら、2013年)に対するhESC遺伝的レポーター株を使用した。分化の6日目および11日目のフローサイトメトリーにより、夾雑するSOX10陽性神経堤細胞の非存在下で、PAX6陽性およびSIX1陽性の前頭蓋プラコードの堅固な誘導が確認された(図23)。
vivoでプラコード誘導を特定すると考えられる発生シグナルに基づく(図15A)。本発明者らは、中程度の濃度のBMP4への曝露が頭蓋プラコードの運命の効率的な誘導に必要とされることを観察している。さらに、FGFシグナルの非存在下で水晶体のデフォルトも報告するin vivoでのニワトリ胚の発生における研究(Baileyら、2006年)と一致する条件下で、水晶体は「デフォルト」プラコードの運命であると思われる(図22)。詳細的な一時的発現分析により、mRNAレベル(図15B)とタンパク質レベル(図15C)の両方で6日間の分化までに、多能性マーカーの急速な損失、ならびにSIX1、EYA1およびDLX3/5などの重要なプラコード遺伝子の堅固な誘導が明らかとなった。SOX10(神経堤)、SOX17(外胚葉)、T/Brachyury(中胚葉)またはMYOD(筋原性の系統)などの夾雑する細胞型の存在をマークする転写物は、これらの条件下では誘導されなかった(図15B)。本発明者らの以前の研究により、hPSCから誘導されるプラコード細胞の「デフォルト」アイデンティティとしてPAX3+三叉神経プラコードが報告された(Dincerら、2013年)。規定のプラコード誘導条件を使用する本発明者らのこのプロトコルは、PAX3発現よりPAX6を示す(図15C)。プラコード誘導およびPAX6発現の収率および選択性をさらに定量化するために、本発明者らは、SIX1::H2B-GFP(図25)、PAX6::H2B-GFP、SOX10-GFP(Chambersら、2012年;Micaら、2013年)に対するhESC遺伝的レポーター株を使用した。分化の6日目および11日目のフローサイトメトリーにより、夾雑するSOX10陽性神経堤細胞の非存在下で、PAX6陽性およびSIX1陽性の前頭蓋プラコードの堅固な誘導が確認された(図23)。
hPSCから誘導された頭蓋プラコードに由来する下垂体前葉のパターニング
下垂体の複雑な形態発生は、初期の胚段階の間に起こる(マウスで約E10)。腺の前葉および中葉は下垂体プラコードに対応する口側外胚葉から誘導されるが、後下垂体は神経外胚葉から発生する(図16A)。誘導のための組織の相互作用およびFGF、BMPおよびSHHを含む種々の規定のシグナル伝達経路は、in vivoでの嚢の陥入、適切な腺の発生およびホルモンサブタイプの特異化に重要であることが示された(図16A、上のパネル)(検討のため、(Zhuら、2007年)を参照のこと)。ここで、本発明
者らは、プラコードの運命へとhPSCの分化を方向付けるこれらの重要なシグナル伝達経路をモジュレートすることが、下垂体アイデンティティを誘発するのに十分であるか否かを評価した(図16A、下のパネル)。本発明者らのデータにより、SHH、FGF8およびFGF10に時間を決めて曝露することにより、PITX1/2、LHX3/4ならびにHESX1およびSIX6を含む下垂体前葉の発生に関連する遺伝子を堅固に誘導することが示される(図16B)。下垂体分化条件下での発現は、PITX1、LHX3、LHX4およびSIX6に対する抗体を使用するタンパク質レベルについても確認された(図16C)。
下垂体の複雑な形態発生は、初期の胚段階の間に起こる(マウスで約E10)。腺の前葉および中葉は下垂体プラコードに対応する口側外胚葉から誘導されるが、後下垂体は神経外胚葉から発生する(図16A)。誘導のための組織の相互作用およびFGF、BMPおよびSHHを含む種々の規定のシグナル伝達経路は、in vivoでの嚢の陥入、適切な腺の発生およびホルモンサブタイプの特異化に重要であることが示された(図16A、上のパネル)(検討のため、(Zhuら、2007年)を参照のこと)。ここで、本発明
者らは、プラコードの運命へとhPSCの分化を方向付けるこれらの重要なシグナル伝達経路をモジュレートすることが、下垂体アイデンティティを誘発するのに十分であるか否かを評価した(図16A、下のパネル)。本発明者らのデータにより、SHH、FGF8およびFGF10に時間を決めて曝露することにより、PITX1/2、LHX3/4ならびにHESX1およびSIX6を含む下垂体前葉の発生に関連する遺伝子を堅固に誘導することが示される(図16B)。下垂体分化条件下での発現は、PITX1、LHX3、LHX4およびSIX6に対する抗体を使用するタンパク質レベルについても確認された(図16C)。
本発明者らは、自らのcGMPにより利用可能なE8/E6ベースの誘導プロトコルを、自らが公開したKSRベースのプラコード誘導プロトコル(PIP)と比較した(Dincerら、2013年)。分化の効率に劇的な影響を及ぼすKSRのロット間の変動を補うために、本発明者らは、2つの異なる濃度のBMP阻害剤、LDN-193189を使用してPIPを実施した。15日間の分化後、SIX1などの頭蓋のプラコードのマーカーならびに頭蓋の下垂体マーカーであるPITX1、PITX2、LHX3、およびLHX4をプロービングするqRT-PCRを使用して細胞を分析した。さらに、神経外胚葉マーカーであるPAX6および非神経外胚葉転写因子であるTFAP2Aがこの分析に含まれた(図30A)。SIX1およびLHX3を染色する免疫蛍光法を使用して、細胞のアイデンティティをタンパク質レベルでさらに確認した(図30B)。これらの実験に使用されたKSRのロットは、SIX1およびTFAP2Aの低い発現ならびにPAX6の高い発現によって示されるように、下垂体またはプラコードのアイデンティティを有効に誘導することができなかった。LDN-193189の濃度を低下させることにより、完全にではないが部分的に、本発明者らの新たなE8/E6ベースのプロトコルと比較した効果を救うことができた。ここで提示したcGMPにより利用可能なプロトコルは、種々のhESCおよびhiPSC株にわたって確実かつ同等の効率で作用する(図31A~31C)。さらに、本発明者らは、組換えタンパク質であるSHHをパルモルファミンおよびSAGなどの小分子スムーズンドアゴニストで置きかえることができることを確認した(図31Dおよび31E)。しかし、堅固な下垂体前葉系統のマーカーの誘導にもかかわらず、本発明者らは、小分子ベース誘導条件を使用する場合に細胞死の増加を観察し、次の研究で組換えSHHを使用することとなった。
興味深いことに、hPSCから誘導された視床下部の原基(Maroofら、2013年;Merkleら、2015年)によって馴化した培地(図24)は、下垂体マーカーの発現を堅固に誘導するのに不十分であった(図16B)。具体的には、CMのみを使用する場合、LHX4ならびにHESX1およびSIX6の誘導の欠如が存在した。LHX4およびSIX6は、下垂体前駆体の増殖に関係し、このことは視床下部系統であるCMの存在下で生じた細胞の総数が低減したことを説明しうる。視床下部の原基と直接相互作用する組織が下垂体発生の間に必要とされる場合があるという証拠がマウスのESCにおいて存在する(Sugaら、2011年)。しかし、本発明者らのデータでは、規定の外部からの合図となる因子が下垂体プラコードのアイデンティティを誘導するのに十分である場合があることが示唆される。下垂体プラコードの誘導および分化の間の下垂体組織の役割をより直接的に評価するために、本発明者らは、SIX1::H2BGFPレポーター細胞株を使用した(図25)。デフォルト条件下で分化した初期のプラコード細胞を分化の6日目にSIX1::H2B-GFP発現について選別し、続いて、水晶体条件(デフォルト)、SHH、FGF8およびFGF10の存在下(下垂体条件)またはhPSCから誘導された視床下部神経外胚葉によって馴化した培地の存在下(図17A)のいずれかでさらに分化させた。遺伝子発現分析によって、いずれの視床下部系統の細胞も欠く、精製したSIX1::H2B-GFP+細胞においてでさえ、本発明者らが規定した誘導条件は、重要な下垂体マーカーのすべての発現を誘導するのに十分であることが明らかとなった。対照的に、視床下部のCMは、デフォルト水晶体条件下で観察されたレベルを上回るLHX4の発現を誘導することができなかった(図17B)。下垂体誘導は、前プラコード組織のパターニングを除外する標準プロトコルと比較して遅れて開始するため(6日目対4日目)、誘導、特にLHX4のレベルは、無選別細胞に関する本発明者らの標準の下垂体プラコード誘導プロトコルと比較して、SIX1::H2B-GFP精製細胞においてやや低いものであった。あるいは、選別プロセスは、誘導効率を低下させる場合もある。
異なる実験のセットにおいて、本発明者らは、hPSCから誘導された視床下部の原基と直接接触させて、6日目に選別したSIX1::H2B-GFP+細胞を共培養し、さらなる分化の9日目(15日目)に、計画プラコードマーカーであるSIX1および下垂体マーカーであるLHX3について細胞を染色した。さらなる対照として、本発明者らは、「デフォルト」の水晶体条件ならびに本発明者らの標準的下垂体条件および視床下部用に馴化した培地を含んだ(図17A)。水晶体条件によってレチノイド様クラスターが形成され、SIX1の発現が下方調節され始め、下垂体条件によってSIX1/LHX3のダブル陽性細胞が得られた。馴化した培地によってSIX1を維持することができ、一方、ごく弱いレベルのLHX3の発現を誘導した。共培養条件はSIX1発現を維持することができるが、LHX3の発現は観察されなかった(図17C)。これらの知見は、正しい外部からの発生のキュア(cure)は、視床下部系統の細胞からの、細胞接触により媒介されるシグナルの非存在下で、hPSCを下垂体系統細胞へと方向付けるのに十分であるという概念を支持するものである。本発明者らは、共培養条件をさらに最適化することにより、最終的に、下垂体系統の細胞が得られる場合があることについて除外できないが、規定の系統のhPSCから誘導された細胞に作用する規定のシグナルの使用は、より複雑な共培養ベースの系に本質的な可変性を低減する場合があり、続くトランスレーショナルな応用にとってより適切なプラットホームを提示する場合がある。
hPSCから誘導された腺下垂体細胞は機能的である
腺下垂体の主な機能は、ストレス応答(副腎皮質刺激ホルモン[ACTH])骨格成長(成長ホルモン[GH])、代謝(甲状腺刺激ホルモン[TSH])および生殖機能(プロラクチン[PRL]、および卵胞刺激ホルモン[FSH]、黄体形成ホルモン[LH])を含むヒトの身体における重要な事象を制御する6つの異なるホルモンを分泌することである。したがって、本発明者らは、30日間の分化後に、本発明者らの培養におけるホルモンのサブタイプの存在を評価した。本発明者らは、その培養において、ACTH、GH、PRLならびにFSHおよびLH発現細胞を検出することができた(図18A)。細胞培養上清のELISA測定によって、細胞が、ACTH、GHおよびFSHの分泌の基本的速度を示すことが確認された(図18B)。下垂体前葉におけるホルモンの放出は、種々の標的器官によって分泌される種々の因子から、および門脈を介して視床下部細胞によって放出される上流の因子からのいくつかのフィードバック機構によってしっかりと調節される。したがって、下垂体細胞の機能的応答は、これらの種々の調節刺激と密接にリンクする必要がある。分化30日目のhPSCから誘導された下垂体細胞は、CRF、ストレシンまたはウロコルチンによる刺激に応答して、ACTHの放出の誘導を示した。対照的に、グレリンやソマトクリニンなどの不適当な刺激への曝露はACTHの放出を誘発しなかった(図18C)。一方、CRFを除くソマトクリニンへの曝露は、GH放出において堅固な増加を誘発した(図18D)。最後に、本発明者らは、ナファレリンに曝露した際のFSHの誘導を示すことができた(図18E)。
腺下垂体の主な機能は、ストレス応答(副腎皮質刺激ホルモン[ACTH])骨格成長(成長ホルモン[GH])、代謝(甲状腺刺激ホルモン[TSH])および生殖機能(プロラクチン[PRL]、および卵胞刺激ホルモン[FSH]、黄体形成ホルモン[LH])を含むヒトの身体における重要な事象を制御する6つの異なるホルモンを分泌することである。したがって、本発明者らは、30日間の分化後に、本発明者らの培養におけるホルモンのサブタイプの存在を評価した。本発明者らは、その培養において、ACTH、GH、PRLならびにFSHおよびLH発現細胞を検出することができた(図18A)。細胞培養上清のELISA測定によって、細胞が、ACTH、GHおよびFSHの分泌の基本的速度を示すことが確認された(図18B)。下垂体前葉におけるホルモンの放出は、種々の標的器官によって分泌される種々の因子から、および門脈を介して視床下部細胞によって放出される上流の因子からのいくつかのフィードバック機構によってしっかりと調節される。したがって、下垂体細胞の機能的応答は、これらの種々の調節刺激と密接にリンクする必要がある。分化30日目のhPSCから誘導された下垂体細胞は、CRF、ストレシンまたはウロコルチンによる刺激に応答して、ACTHの放出の誘導を示した。対照的に、グレリンやソマトクリニンなどの不適当な刺激への曝露はACTHの放出を誘発しなかった(図18C)。一方、CRFを除くソマトクリニンへの曝露は、GH放出において堅固な増加を誘発した(図18D)。最後に、本発明者らは、ナファレリンに曝露した際のFSHの誘導を示すことができた(図18E)。
単一細胞の遺伝子発現分析は多様なホルモン系統を明らかにする
下垂体腺内での種々のホルモン前駆体系統の分化(Tabar、2011年)は、種々のパ
ターニング事象に関与するしっかりと調節された空間的および時間的プロセスである(図16A)。本発明者らのhPSCベースの培養系における前駆体の運命の多様性に対処するために、本発明者らは、Fluidigmプラットホームを使用する単一細胞のqRT-PCR実験を実施した。本発明者らは、多能性幹細胞から成熟ホルモン発現細胞への全下垂体発生にわたる34種の遺伝子についてプロービングした。本発明者らは、T(Brachyury)、MYODおよびSOX17などの有効な中胚葉または外胚葉の夾雑物についてアッセイするためのプライマーも含めた。分化30日目および60日目の主成分分析(PCA)により、ほとんどの細胞が明確な時間に依存する変化を示し、いくつかの細胞だけが、計画より前に移動するか(すなわち、30日目の細胞が60日目のプロファイルを示す)、または遅延する(すなわち、60日目の細胞が30日目の特性を保持する)ことが示された(図19A、B)。スクリープロット(図19B)により、データの変動のほとんどを説明するPCA成分が規定された。階層的クラスタリングによって、いくつかのより小さなサブクラスターと共に散在する2つの主要なクラスターにおいて生じる時間軸に非常に沿う細胞の分離が確認された(図19C)。
下垂体腺内での種々のホルモン前駆体系統の分化(Tabar、2011年)は、種々のパ
ターニング事象に関与するしっかりと調節された空間的および時間的プロセスである(図16A)。本発明者らのhPSCベースの培養系における前駆体の運命の多様性に対処するために、本発明者らは、Fluidigmプラットホームを使用する単一細胞のqRT-PCR実験を実施した。本発明者らは、多能性幹細胞から成熟ホルモン発現細胞への全下垂体発生にわたる34種の遺伝子についてプロービングした。本発明者らは、T(Brachyury)、MYODおよびSOX17などの有効な中胚葉または外胚葉の夾雑物についてアッセイするためのプライマーも含めた。分化30日目および60日目の主成分分析(PCA)により、ほとんどの細胞が明確な時間に依存する変化を示し、いくつかの細胞だけが、計画より前に移動するか(すなわち、30日目の細胞が60日目のプロファイルを示す)、または遅延する(すなわち、60日目の細胞が30日目の特性を保持する)ことが示された(図19A、B)。スクリープロット(図19B)により、データの変動のほとんどを説明するPCA成分が規定された。階層的クラスタリングによって、いくつかのより小さなサブクラスターと共に散在する2つの主要なクラスターにおいて生じる時間軸に非常に沿う細胞の分離が確認された(図19C)。
さらに、生のct値に基づくヒートマップが図32に提供されている。本発明者らは、前駆体マーカーであるHESX1、およびNEUROD1、副腎皮質刺激ホルモン分泌細胞で一過的に発現したより成熟したマーカーについての30日目の培養における免疫蛍光染色によって、本発明者らの単一細胞のデータをさらに検証した。分化の15日目の免疫蛍光分析は、NEUROD1の陰性対照として機能した(図33A)。本発明者らは、分化30日目の同一細胞中で、HESX1およびNEUROD1の同時標識化を確認した。しかし、HESX1発現のレベルは、15日目と比較して30日目において非常に低かった。
本発明者らの分析によって、30日目の培養物が、高いパーセンテージの下垂体様細胞を含有し、細胞の約70%が、下垂体マーカーであるPITX1およびLHX3を同時発現することが明らかとなった。このパーセンテージは60日目までにさらに上昇した。一方、30日目までに、本発明者らは、T、SOX17またはMYODを発現する4個の細胞(分析されたすべての細胞の約5%)を検出できるに過ぎず、低いパーセンテージの有効な夾雑物の存在を示唆する。ほとんどの細胞が、下垂体のPOMC系統の発生に対して重要であることが示されている転写因子であるTBX19(TPIT)を発現した(Lamoletら、2001年)。さらに、ほとんどの細胞(約84%)が頭蓋のプラコードのマー
カーであるSIX1を発現した。ほとんどのSIX1+細胞は、下垂体プラコードの運命に整合する、PAX6も発現した。しかし、本発明者らは、組み合わせて合計20%の細胞を表す小さなサブセットの細胞において、PAX2(上鰓の)、PAX3(三叉神経の)またはPAX8(耳の)を含む他のプラコードの運命の発現も観察した。
カーであるSIX1を発現した。ほとんどのSIX1+細胞は、下垂体プラコードの運命に整合する、PAX6も発現した。しかし、本発明者らは、組み合わせて合計20%の細胞を表す小さなサブセットの細胞において、PAX2(上鰓の)、PAX3(三叉神経の)またはPAX8(耳の)を含む他のプラコードの運命の発現も観察した。
下垂体前葉の最終的な機能単位は、特異的なホルモンを発現し、分泌する細胞である。本発明者らの単一細胞の分析により、分化の30日目に、およそ50%の細胞が少なくとも1種のホルモンmRNA種を発現することが示された。このパーセンテージは、60日目までに約80%まで上昇し、さらにin vitroでの成熟を示した(図19D)。発生中および成体のげっ歯類の下垂体の両方は、2種以上のホルモンを発現する細胞を含有することができることが報告されている(Nunezら、2003年;Villalobosら、20
04年)。実際に、本発明者らのhPSCから誘導された培養では、本発明者らは、分化の30日目までに細胞の10%において2種以上のホルモン転写物(「多量ホルモン」)の発現を検出することができた。分化の60日目までに、このパーセンテージは、全細胞集団の約30%まで増大した(図19D)。本発明者らは、60日目までに多量ホルモン細胞の大多数がPOMCおよびGHの両方(約10%)を発現することを見出した。3種以上の転写物を発現する細胞は、60日目までに検出されるのみで、通常はPOMCを含有した(図26)。
04年)。実際に、本発明者らのhPSCから誘導された培養では、本発明者らは、分化の30日目までに細胞の10%において2種以上のホルモン転写物(「多量ホルモン」)の発現を検出することができた。分化の60日目までに、このパーセンテージは、全細胞集団の約30%まで増大した(図19D)。本発明者らは、60日目までに多量ホルモン細胞の大多数がPOMCおよびGHの両方(約10%)を発現することを見出した。3種以上の転写物を発現する細胞は、60日目までに検出されるのみで、通常はPOMCを含有した(図26)。
分化の30日目にhPSCから誘導された下垂体細胞において発現される最も頻度の高いホルモン転写物はPOMC(全細胞の30%)であり、背下垂体の原基から出現すると考えられる。GHまたはTSHなどのより腹側の細胞型は、分化の30日目までに全細胞集団の低いパーセンテージ(約20%)しか構成しなかった。PRLは、さらに小さな細胞のサブセットにおいて発現された。最後に、2つの最も腹側の細胞型であるFSHおよびLHは、発生のごく後期にのみ出現し、30日目まで検出されなかった(図19E)。分化の60日目に、POMCおよびGH発現細胞の数は、それぞれ、55%および30%まで増加した。ほんの僅かの細胞だけが、分化の60日目にFSHおよびLHを発現した(図19E)。単一細胞のPCRに加えて、本発明者らは、市販のBD Lyoplateのスクリーニングキットを使用して培養の30日目の細胞表面マーカーの発現を特徴付けた(図34)。
モルフォゲンを使用するin vitroでの下垂体前葉細胞の背側-腹側パターニング
下垂体機能低下症は、非常に多様で複雑な疾患である。下垂体機能障害の原因に応じて、影響するホルモンの種類は様々となりうる。例えば、GH不足は、通常、先天性遺伝疾患を有する患者で観察される(van Gelderenおよびvan der Hoog、1981年)が、
後に放射線処置を受けた患者でも生じる場合がある(SklarおよびConstine、1995年)。対照的に、下垂体の自己免疫疾患である、リンパ球性下垂体炎は、主にACTHに影響を及ぼす(Rivera、2006年)。したがって、将来のhPSCから誘導された下垂体細胞の広範な適用のために、細胞代替療法が、所与の患者集団の特異的な需要に対してカスタマイズされる必要を有する場合がある。本発明者らの標準的条件により、背側のACTH+細胞が最も得られるため、本発明者らは、さらなるシグナルを使用して、より腹側の細胞型の生成を増強することができるか否かを調べた。
下垂体機能低下症は、非常に多様で複雑な疾患である。下垂体機能障害の原因に応じて、影響するホルモンの種類は様々となりうる。例えば、GH不足は、通常、先天性遺伝疾患を有する患者で観察される(van Gelderenおよびvan der Hoog、1981年)が、
後に放射線処置を受けた患者でも生じる場合がある(SklarおよびConstine、1995年)。対照的に、下垂体の自己免疫疾患である、リンパ球性下垂体炎は、主にACTHに影響を及ぼす(Rivera、2006年)。したがって、将来のhPSCから誘導された下垂体細胞の広範な適用のために、細胞代替療法が、所与の患者集団の特異的な需要に対してカスタマイズされる必要を有する場合がある。本発明者らの標準的条件により、背側のACTH+細胞が最も得られるため、本発明者らは、さらなるシグナルを使用して、より腹側の細胞型の生成を増強することができるか否かを調べた。
FGF8およびBMP2シグナル伝達の勾配が、マウスの下垂体の背側-腹側のパターニングに重要な役割を果たすことが示されている(Rosenfeldら、2000年)(図16
A)。したがって、本発明者らは、高濃度のFGF8(背側化する)またはBMP2(腹側化する)のいずれか、またはin vivoで生じるモルフォゲン勾配を模倣する中程度の濃度レベルで2種のパターニング因子の混合物で、下垂体系統の細胞を処理した。下垂体前駆体系統およびホルモンのサブタイプの重要な転写因子についての遺伝子発現研究により、ほとんどの腹側細胞型を生成するためのBMP2の必要性が確認された。FSHBおよびLHBは、BMP2の存在下で有意に上方調節されたが、FGF8はFSHBの収率に負の作用を発揮した(図20A)。
A)。したがって、本発明者らは、高濃度のFGF8(背側化する)またはBMP2(腹側化する)のいずれか、またはin vivoで生じるモルフォゲン勾配を模倣する中程度の濃度レベルで2種のパターニング因子の混合物で、下垂体系統の細胞を処理した。下垂体前駆体系統およびホルモンのサブタイプの重要な転写因子についての遺伝子発現研究により、ほとんどの腹側細胞型を生成するためのBMP2の必要性が確認された。FSHBおよびLHBは、BMP2の存在下で有意に上方調節されたが、FGF8はFSHBの収率に負の作用を発揮した(図20A)。
次に、本発明者らは、分析の解像度を上昇させるために単一細胞のqRT-PCR分析を実施した。FGF8、BMP2または両方の因子の組合せで処置した、60日目の単一細胞の教師なし階層的クラスタリングにより、3つの大きな細胞のクラスターが明らかとなった(図20B)。さらに、生のct値に基づくヒートマップが図32において提供される。3つの処置のそれぞれに対応する細胞が、クラスター毎に観察された。しかし、クラスター3の全細胞の49%がBMP2処理群に由来する一方、クラスター2の全細胞の56%はFGF8群から誘導された。クラスター1は、およそ等しい比率で、3つの処理のすべてに由来する細胞を表した。下垂体前葉ホルモンのそれぞれについて単一細胞の発現を分析することによって、本発明者らは、自らのhPSCベースの培養系におけるマウスのin vivo研究(Rosenfeldら、2000年)から予測される知見を確認することができた。高濃度のFGF8によって、高濃度のBMP2と比較して(それぞれ、75%対40%)、POMCを発現する細胞の数の増加が導かれた(図20C)。さらに、両方のシグナル伝達分子の中間の濃度によって、FGF8またはBMP2のいずれか単独と比較して、GHおよびTSHBを発現する細胞の増加を生じた(図20C)。最後に、高濃度のBMP2は、ACTH+背側細胞型の数を減少させるだけでなく、FSHBおよびLHBを発現する腹側細胞型の数を増加させる。
次に、本発明者らは、3つの培養条件下で(FGF8、FGF8/BMP2、BMP2:図20D)、4種の異なるホルモンについて染色する伝統的な免疫蛍光法を使用して、本発明者らの単一細胞のqRT-PCRデータを検証した。免疫細胞化学のデータの定量化により、FGF8処理した培養において、背側のACTH発現細胞への偏りが確認された。PRLおよびGHは、以下のFGF8/BMP2を用いる組合せ処理で観察された最も豊富なホルモンであり、一方、FSHは、BMP2で処理された培養において最も豊富な細胞型であった(図20E)。POMCは、ACTHの前駆体ポリペプチドであり、翻訳の間に44種のアミノ酸が除去され、最終的にホルモンACTHを生じる。
移植したヒトESCから誘導された下垂体前葉細胞は、下垂体機能低下症のin vivoモデルにおいて機能的である
in vivoで生存し、機能するhPSCから誘導された下垂体細胞の能力を評価するために、本発明者らは、30日目の細胞を下垂体切除したラットに移植した。傍咽頭方法を使用する下垂体(図21A)の外科手術による除去の後、ラットにおける下垂体機能低下症を、血中のACTHレベルを測定することによって確認した。下垂体切除に成功したラットを2つの実験群、マトリゲルのみの注射を受ける偽群(n=4)とhESCから誘導された下垂体細胞を含有するマトリゲルを受ける移植群(n=7)に分けた(30日目、BMP2処理を行わない標準条件)。2×106個の細胞を皮下に移植した後、処置群および対照群の両方について、移植後7週間、血流中の下垂体ホルモンレベルをモニタリングした(図21B~D)。移植の3週間後からスタートして、移植群のホルモンレベルは、1週間の時点で比較して増加し始め、一方偽群のレベルはほとんど変化しないままであった。ACTHレベルは、実験の7週間の期間、移植対対照群で一定の高いレベルのままであった(図21B)。損傷していない動物で観察されたACTHレベルと比較して、移植群は、ACTHレベルの約60%を回復した(データは示さず)。2種の他のホルモン、すなわち、GHおよびLHのレベルの増加は、より可変的で、試験した時点で全く有意ではなかった。しかし、本発明者らは、移植の3週間および7週間後のGHレベルでは有意な増加を検出することができた(図21C)。LHレベルの有意な増加は観察されなかった(図21D)。移植した動物のホルモンレベルを週齢の一致するインタクトなラットのレベルと比較し、ACTHについて約40%、GHについて約28%、およびPRLについて約20%であることが分かった(図35)。移植細胞の機能を評価する最終段階で、本発明者らは、ホルモン分泌によって影響を受けた下流因子の測定を実施した。ACTHの放出に際し、通常のHPA軸応答の一部として副腎により分泌されるグルココルチコイドの増加が存在する(WebsterおよびSternberg、2004年)。ヒトでは、ACTHは、コルチゾールの放出を誘発するが、げっ歯類の主なグルココルチコイドはコルチコステロンである(Wand、2008年)。したがって、本発明者らは、両方の実験群でコルチコステロンのレベルを測定した(図21E)。移植群では、移植の7週間後までに、統計的に有意な差を生じるコルチコステロンの一貫して高いレベルが示された。これらのデータにより、hPSCから誘導された細胞によって放出されたヒトのACTHは、宿主の副腎からのステロイドホルモンの放出を誘発することができることが示される。移植の7週間後に、動物を屠殺し、移植片を組織学的に分析した(図21F~G)。本発明者らは、移植片に関して6つの下垂体前葉ホルモンのそれぞれを発現する細胞を検出することができた(図21F)。これらのデータにより、in vivoでの細胞の生存が確認され、in vivoでのさらなる分化と細胞の成熟が示唆される。移植片の立体解析学的定量化によって、移植片当たり平均3.08×106±0.42×106(平均±SD;n=3)個のヒトの細胞が示され、免疫組織化学によりSIX1とヒトの核抗原(hNA)の同時発現により決定されるように、大多数(95%超)はプラコードのアイデンティティを有した。移植片におけるKi67陽性増殖細胞の比率は、hNA+集団の9.6%±0.6%(平均±SD;n=3)であった。移植片全体は、多能性関連表面マーカーであるSSEA-4およびTra1-60について陰性に染色された。腫瘍の徴候は、移植の7週間後まで検出されなかった。移植片の立体解析学的定量化により、動物当たり平均18212±2969個のACTH+細胞が示され(光学的細胞分画法)、81±10mm3の移植片体積を有した(Cavalieri estimator;平均±SD;n=3)。
in vivoで生存し、機能するhPSCから誘導された下垂体細胞の能力を評価するために、本発明者らは、30日目の細胞を下垂体切除したラットに移植した。傍咽頭方法を使用する下垂体(図21A)の外科手術による除去の後、ラットにおける下垂体機能低下症を、血中のACTHレベルを測定することによって確認した。下垂体切除に成功したラットを2つの実験群、マトリゲルのみの注射を受ける偽群(n=4)とhESCから誘導された下垂体細胞を含有するマトリゲルを受ける移植群(n=7)に分けた(30日目、BMP2処理を行わない標準条件)。2×106個の細胞を皮下に移植した後、処置群および対照群の両方について、移植後7週間、血流中の下垂体ホルモンレベルをモニタリングした(図21B~D)。移植の3週間後からスタートして、移植群のホルモンレベルは、1週間の時点で比較して増加し始め、一方偽群のレベルはほとんど変化しないままであった。ACTHレベルは、実験の7週間の期間、移植対対照群で一定の高いレベルのままであった(図21B)。損傷していない動物で観察されたACTHレベルと比較して、移植群は、ACTHレベルの約60%を回復した(データは示さず)。2種の他のホルモン、すなわち、GHおよびLHのレベルの増加は、より可変的で、試験した時点で全く有意ではなかった。しかし、本発明者らは、移植の3週間および7週間後のGHレベルでは有意な増加を検出することができた(図21C)。LHレベルの有意な増加は観察されなかった(図21D)。移植した動物のホルモンレベルを週齢の一致するインタクトなラットのレベルと比較し、ACTHについて約40%、GHについて約28%、およびPRLについて約20%であることが分かった(図35)。移植細胞の機能を評価する最終段階で、本発明者らは、ホルモン分泌によって影響を受けた下流因子の測定を実施した。ACTHの放出に際し、通常のHPA軸応答の一部として副腎により分泌されるグルココルチコイドの増加が存在する(WebsterおよびSternberg、2004年)。ヒトでは、ACTHは、コルチゾールの放出を誘発するが、げっ歯類の主なグルココルチコイドはコルチコステロンである(Wand、2008年)。したがって、本発明者らは、両方の実験群でコルチコステロンのレベルを測定した(図21E)。移植群では、移植の7週間後までに、統計的に有意な差を生じるコルチコステロンの一貫して高いレベルが示された。これらのデータにより、hPSCから誘導された細胞によって放出されたヒトのACTHは、宿主の副腎からのステロイドホルモンの放出を誘発することができることが示される。移植の7週間後に、動物を屠殺し、移植片を組織学的に分析した(図21F~G)。本発明者らは、移植片に関して6つの下垂体前葉ホルモンのそれぞれを発現する細胞を検出することができた(図21F)。これらのデータにより、in vivoでの細胞の生存が確認され、in vivoでのさらなる分化と細胞の成熟が示唆される。移植片の立体解析学的定量化によって、移植片当たり平均3.08×106±0.42×106(平均±SD;n=3)個のヒトの細胞が示され、免疫組織化学によりSIX1とヒトの核抗原(hNA)の同時発現により決定されるように、大多数(95%超)はプラコードのアイデンティティを有した。移植片におけるKi67陽性増殖細胞の比率は、hNA+集団の9.6%±0.6%(平均±SD;n=3)であった。移植片全体は、多能性関連表面マーカーであるSSEA-4およびTra1-60について陰性に染色された。腫瘍の徴候は、移植の7週間後まで検出されなかった。移植片の立体解析学的定量化により、動物当たり平均18212±2969個のACTH+細胞が示され(光学的細胞分画法)、81±10mm3の移植片体積を有した(Cavalieri estimator;平均±SD;n=3)。
方法
ESCおよび培養条件
ヒト多能性幹細胞H9(WA-09、XX、35~50継代)、MEL-1(XY、20~40継代)、HUES-6(XX、24~40継代)、hiPSC(胎仔の線維芽細胞株MRC5(ATCC CCL-171)から誘導した社内で生成したhiPSC(Chamberら、2009年)、XY、15~30継代)および改変レポーター細胞株(すべてH9バックグラウンド、40~75継代)をEssential8培地(E8)(Fisher Scientific)(Chenら、2011年)を使用するVTN-N(Fisher Scientific)で維持し、EDTAを使用して1週間に2回継代した(Chen、2008年)。細胞を1ヵ月に1回、マイコプラズマの夾雑について試験した。
ESCおよび培養条件
ヒト多能性幹細胞H9(WA-09、XX、35~50継代)、MEL-1(XY、20~40継代)、HUES-6(XX、24~40継代)、hiPSC(胎仔の線維芽細胞株MRC5(ATCC CCL-171)から誘導した社内で生成したhiPSC(Chamberら、2009年)、XY、15~30継代)および改変レポーター細胞株(すべてH9バックグラウンド、40~75継代)をEssential8培地(E8)(Fisher Scientific)(Chenら、2011年)を使用するVTN-N(Fisher Scientific)で維持し、EDTAを使用して1週間に2回継代した(Chen、2008年)。細胞を1ヵ月に1回、マイコプラズマの夾雑について試験した。
ESCの分化
神経外胚葉への分化を以前に記載したもの(Chambers 2009年)に若干の修正を加えて実施した。手短に述べると、細胞をE8+Y-27632(Tocris)中でVTN-Nでコーティングしたディッシュに1cm2当たり250000個の細胞で播種した。24時間後(0日目)、培地を10μMのSB431542(Tocris Biosciences)、500nMのLDN193189(Stem Cell Technologies)および1μMのXAV939(Tocris Biosciences)(5日目まで)を補充したEssential6(E6)(Chen)に交換した。5日目から、XAV939を培地から除去した。培地を11日目まで毎日交換した。
神経外胚葉への分化を以前に記載したもの(Chambers 2009年)に若干の修正を加えて実施した。手短に述べると、細胞をE8+Y-27632(Tocris)中でVTN-Nでコーティングしたディッシュに1cm2当たり250000個の細胞で播種した。24時間後(0日目)、培地を10μMのSB431542(Tocris Biosciences)、500nMのLDN193189(Stem Cell Technologies)および1μMのXAV939(Tocris Biosciences)(5日目まで)を補充したEssential6(E6)(Chen)に交換した。5日目から、XAV939を培地から除去した。培地を11日目まで毎日交換した。
視床下部外胚葉の分化を以前に記載したもの(Maroofら、2013年;Merkleら、2015年)に若干の修正を加えて実施した。手短に述べると、細胞をE8+Y-27632中でVTN-Nでコーティングしたディッシュに1cm2当たり250000個の細胞で播種した。24時間後(0日目)、培地を10μMのSB431542を2日間補充したE6に交換した。2日目から、E6培地に高濃度のSHH(1μg/ml)を11日目まで補充した。馴化培地の調製のために、細胞をE6のみで24時間培養した後に2回洗浄して誘導培地から潜在的なSHHを除去した。13日目にE6のみを細胞に添加し、24時間馴化した。これを使用する前に、馴化培地を滅菌濾過して、デブリおよび死細胞を除去した。
水晶体の分化について、細胞をE8+10μMのY-27632中でVTN-Nでコーティングしたディッシュに1cm2当たり250000個の細胞で播種した。24時間後(0日目)、培地を10μMのSB431542および5ng/mlのBMP4(R&D
Systems)を補充したE6に交換した。培地は毎日交換した。3日目に、BMP4を培地から除去し、細胞を15日目までE6+10μMのSB431542中で培養した。15日目から、細胞をE6のみで120日までの間維持した。30日目から、フィーディングの間、週に1回VTN-N(1:100)を培地に補充し、細胞がプレートから剥がれるのを防いだ。
Systems)を補充したE6に交換した。培地は毎日交換した。3日目に、BMP4を培地から除去し、細胞を15日目までE6+10μMのSB431542中で培養した。15日目から、細胞をE6のみで120日までの間維持した。30日目から、フィーディングの間、週に1回VTN-N(1:100)を培地に補充し、細胞がプレートから剥がれるのを防いだ。
下垂体の分化について、細胞をE8+10μMのY-27632中でVTN-Nでコーティングしたディッシュ(分化は、24ウェルプレートで最も進む)に1cm2当たり250000個の細胞で播種した。24時間後(0日目)、培地を10μMのSB431542および5ng/mlのBMP4(R&D Systems)を補充したE6に交換した。培地は毎日交換した。3日目に、BMP4を培地から除去し、細胞をE6+10μMのSB431542中で1日培養した。標準的な分化条件として、4日目に、10μMのSB431542、200ng/mlのSHH(R&D Systems、C25II)、100ng/mlのFGF8b(R&D Systems)および50ng/mlのFGF10(Peprotech Inc.)をE6に補充した。一部の実験では、SHHを1μMのパルモルファミン(Stemgent)または1μMのSAG(Stemcell Technologies)で置きかえた。ここから、培地の体積を倍にして、15日目まで細胞を1日おきにフィーディングした。分化の15日目に、BDFACS Aria III細胞選別機を使用してSIX1 H2B::GFP+細胞を選別した。次いで、精製した細胞を、ポリオルニチン/ラミニン/フィブロネクチンをコーティングしたプレートに10μMのY-27632、200ng/mlのSHH、100ng/mlのFGF8bおよび50ng/mlのFGF10を補充したE6に液滴として播種した(1滴10μl当たり50000個の細胞)。24時間後、30日目まで、培地をSHH、FGF8およびFGF10を含有するE6に交換した。培地は一日おきに交換した。一部の実験では、下垂体誘導を若干遅く開始するか(6日目)、または4日目か6日目のいずれかから視床下部外胚葉で馴化した培地中で細胞を分化させた。共培養実験では、SIX1 H2B::GFP陽性細胞を6日目に選別し、1cm2当たり50000個の細胞を、10μMのSB431542のみを補充したE6中の視床下部神経外胚葉細胞に直接播種した。
下垂体細胞の成熟およびサブタイプの特異化
標準的な(本文で別段言及していなければ)下垂体の成熟として、30日目の培地は、さらなる30日のために「E6のみ」に交換した。パターニング実験(本文で示した)として、高濃度のFGF8(100ng/ml、背方化)、高濃度のBMP2(20ng/ml、腹方化)または中間の濃度で両方(FGF8 50ng/ml、BMP2 10ng/ml)のいずれかをE6培地に補充した。
標準的な(本文で別段言及していなければ)下垂体の成熟として、30日目の培地は、さらなる30日のために「E6のみ」に交換した。パターニング実験(本文で示した)として、高濃度のFGF8(100ng/ml、背方化)、高濃度のBMP2(20ng/ml、腹方化)または中間の濃度で両方(FGF8 50ng/ml、BMP2 10ng/ml)のいずれかをE6培地に補充した。
RNA抽出および伝統的な定量的リアルタイムPCR
製造業者のプロトコルに従って、Phase-lockチューブ(5Prime)と組み合わせてTRIzol(Fisher Scientific)試薬を使用して、少なくとも3つの独立した実験から全RNAを抽出した。iScript(BioRad)を使用して、1μgの全RNAをcDNAに逆転写した。定量的RT PCRとして、本発明者らは、BioRadのCFX96 Thermal CyclerでQuantiTectプライマーアッセイ(Qiagen)と組み合わせたSSoFast EvaGreen Mix(BioRad)を使用した。すべての反応を製造業者のプロトコルに従って実行した。遺伝子発現をグリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)および対照の細胞型(図で示されている)に対して正規化した。結果は、ΔΔCt方法(LivakおよびSchmittgen、2001年)を使用して計算した。
製造業者のプロトコルに従って、Phase-lockチューブ(5Prime)と組み合わせてTRIzol(Fisher Scientific)試薬を使用して、少なくとも3つの独立した実験から全RNAを抽出した。iScript(BioRad)を使用して、1μgの全RNAをcDNAに逆転写した。定量的RT PCRとして、本発明者らは、BioRadのCFX96 Thermal CyclerでQuantiTectプライマーアッセイ(Qiagen)と組み合わせたSSoFast EvaGreen Mix(BioRad)を使用した。すべての反応を製造業者のプロトコルに従って実行した。遺伝子発現をグリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)および対照の細胞型(図で示されている)に対して正規化した。結果は、ΔΔCt方法(LivakおよびSchmittgen、2001年)を使用して計算した。
単一細胞の定量的RT-PCR
単一細胞のPCR分析として、Accutaseを使用して細胞を剥離させた。40μmの細胞ストレーナーを通して濾過した後、BDFACS Aria III機器でDAPI陰性細胞を選別し、実質的に細胞調製物からデブリと死細胞を一掃した。選別された細胞懸濁液を1ml当たり400000個の細胞の濃度まで調整した。製造業者のマニュアルに従ってFluidigm C1システムを使用して単一細胞を捕捉した。各C1チップ毎の捕捉率を標準組織培養明視野顕微鏡を使用して微視的に確認した。捕捉率は以下の通りであった:30日目:91%(87/96)60日目:94%(90/96)60日目 FGF8:93%(89/96)60日目 FGF8/BMP2:89%(85/96)60日目 BMP2:93%(89/96)。細胞を溶解し、RNAを抽出し、製造業者のプロトコルに従って、ウェットラボで試験したFluidigmのDELTAgeneアッセイと組み合わせてC1を使用してcDNAに転写した(図27)。ウェットラボで試験したDELTAgeneアッセイは、Fluidigmから直接購入した。得られたcDNAを1:5に希釈して、製造業者のマニュアル(「Fast Gene Expression
Analysis Using EvaGreen on the BioMark or BioMark HD System」)に従って、EvaGreen化学と組み合わせたFluidigm BioMarkシステムを使用して単一細胞のPCR増幅に供した。Fluidigmの96.96 Dynamic Arrayを使用してPCRを実行した。各プライマー対をチップ上に技術的に二連でランした。偽陰性の数を増加させることを対価として偽陽性の細胞(calls)を最小限
にするために、技術的プライマー反復間で一貫した増幅結果を生じる単一細胞のみを考慮した。全体の不一致率は低かった(プライマー対当たり3%超)。FluidigmのSINGuLAR Analysis Toolset for R(バージョン3.0.2(2013-09-25)「Frisbee Sailing」)と組み合わせてFluidigmのリアルタイムPCR分析ソフトウェアを使用して発現データを分析した。
単一細胞のPCR分析として、Accutaseを使用して細胞を剥離させた。40μmの細胞ストレーナーを通して濾過した後、BDFACS Aria III機器でDAPI陰性細胞を選別し、実質的に細胞調製物からデブリと死細胞を一掃した。選別された細胞懸濁液を1ml当たり400000個の細胞の濃度まで調整した。製造業者のマニュアルに従ってFluidigm C1システムを使用して単一細胞を捕捉した。各C1チップ毎の捕捉率を標準組織培養明視野顕微鏡を使用して微視的に確認した。捕捉率は以下の通りであった:30日目:91%(87/96)60日目:94%(90/96)60日目 FGF8:93%(89/96)60日目 FGF8/BMP2:89%(85/96)60日目 BMP2:93%(89/96)。細胞を溶解し、RNAを抽出し、製造業者のプロトコルに従って、ウェットラボで試験したFluidigmのDELTAgeneアッセイと組み合わせてC1を使用してcDNAに転写した(図27)。ウェットラボで試験したDELTAgeneアッセイは、Fluidigmから直接購入した。得られたcDNAを1:5に希釈して、製造業者のマニュアル(「Fast Gene Expression
Analysis Using EvaGreen on the BioMark or BioMark HD System」)に従って、EvaGreen化学と組み合わせたFluidigm BioMarkシステムを使用して単一細胞のPCR増幅に供した。Fluidigmの96.96 Dynamic Arrayを使用してPCRを実行した。各プライマー対をチップ上に技術的に二連でランした。偽陰性の数を増加させることを対価として偽陽性の細胞(calls)を最小限
にするために、技術的プライマー反復間で一貫した増幅結果を生じる単一細胞のみを考慮した。全体の不一致率は低かった(プライマー対当たり3%超)。FluidigmのSINGuLAR Analysis Toolset for R(バージョン3.0.2(2013-09-25)「Frisbee Sailing」)と組み合わせてFluidigmのリアルタイムPCR分析ソフトウェアを使用して発現データを分析した。
顕微鏡、抗体およびフローサイトメトリー
細胞を1回PBSで洗浄した後、細胞を4%(v/v)のパラホルムアルデヒドで20分間固定し、PBSで2回洗浄し、PBS中0.1%(v/v)のTriton X-100を使用して透過処理し、細胞をPBS中10%(v/v)のFCSを用いて室温で1~5時間ブロッキングした。細胞をPBS中2%のFCS(v/v)で希釈した一次抗体と一緒に、4℃で終夜インキュベートした。この研究で使用した一次抗体のリストを図28に提供する。一次抗体のインキュベーション後、細胞をPBSで2回洗浄し、その後、PBSで希釈した適当なAlexaFluorとコンジュゲートした二次抗体と一緒に、室温で1時間インキュベートした(1:1000;Molecular Fisher Scientific)。PBSで2回洗浄した後、核をDAPIを使用して染色した。さらに2回の洗浄ステップの後、HamamatsuのORCA CCDカメラを備えたOlympusのIX71倒立顕微鏡を使用して、細胞の蛍光画像を撮った。
細胞を1回PBSで洗浄した後、細胞を4%(v/v)のパラホルムアルデヒドで20分間固定し、PBSで2回洗浄し、PBS中0.1%(v/v)のTriton X-100を使用して透過処理し、細胞をPBS中10%(v/v)のFCSを用いて室温で1~5時間ブロッキングした。細胞をPBS中2%のFCS(v/v)で希釈した一次抗体と一緒に、4℃で終夜インキュベートした。この研究で使用した一次抗体のリストを図28に提供する。一次抗体のインキュベーション後、細胞をPBSで2回洗浄し、その後、PBSで希釈した適当なAlexaFluorとコンジュゲートした二次抗体と一緒に、室温で1時間インキュベートした(1:1000;Molecular Fisher Scientific)。PBSで2回洗浄した後、核をDAPIを使用して染色した。さらに2回の洗浄ステップの後、HamamatsuのORCA CCDカメラを備えたOlympusのIX71倒立顕微鏡を使用して、細胞の蛍光画像を撮った。
免疫組織化学分析では、動物をPBSと、次いで、4%のパラホルムアルデヒドで灌流した。マトリゲルプラグを4%のパラホルムアルデヒド中で後固定し、次に、30%のスクロースに浸漬した。免疫組織化学分析用に、マトリゲルプラグを30μmの凍結切片とした。切片をAntigen Retrieval Reagent-Universal溶液(R&D systems)で前処理した。切片をPBSで洗浄し、次いで、ブロッキング溶液(1%のBSA-0.3%のTriton-PBS)を用い、室温で1時間ブロッキングした。切片をhNA、Ki67、ACTH、GH、TSH、PRL、FSHおよびLHで染色し、次に、Alexa-568とコンジュゲートした二次抗体で染色した。Hamamatsuのカメラを備えたOlympusのBX51顕微鏡を使用して、画像を得た。光学的細胞分画プローブを使用して、マトリゲルプラグ全体におけるACTH細胞の数を立体解析学的に定量化し、Cavalieri estimator方法(Stereo Investigator Software、Microbrightfield Bioscience)を使用して、移植片の体積を分析した。
フローサイトメトリー分析では、細胞(異なるレポーター細胞株)をTrypLE(Fisher Scientific)を使用して細胞培養プラスチックから剥離した。PBSで1回洗浄した後、細胞をPBSおよびDAPI中2%のFCS、1mMのEDTAに懸濁させた。40μmの細胞ストレーナーを使用して細胞を濾過し、BD LSRFortessaのFlow Cytometerで分析した。単一の(ダブレットの除外)生存(DAPI-)細胞のみを分析した。データをFlowJo Version 9.7.6(FLOWJO LLC)を使用してさらに処理した。
細胞表面マーカーのスクリーニング
BD Lyoplate(商標)細胞表面マーカーのスクリーニングでは、30日目の細胞を、Accutaseを使用して、1cm2当たり100000個の細胞密度で96ウェルイメージングプレートに再播種した。4時間後、付着期の細胞をバイオイメージングのために使用者のマニュアルに従って染色した。細胞をOperetta High Content Imaging System(Perkin Elmer)で分析した。画像を処理し、Harmonyソフトウェアパッケージ(Perkin Elmer)を使用して分析した。
BD Lyoplate(商標)細胞表面マーカーのスクリーニングでは、30日目の細胞を、Accutaseを使用して、1cm2当たり100000個の細胞密度で96ウェルイメージングプレートに再播種した。4時間後、付着期の細胞をバイオイメージングのために使用者のマニュアルに従って染色した。細胞をOperetta High Content Imaging System(Perkin Elmer)で分析した。画像を処理し、Harmonyソフトウェアパッケージ(Perkin Elmer)を使用して分析した。
ホルモン放出の刺激
in vitroでホルモン放出を刺激するために、上述のように、細胞を24ウェルプレートで分化させた。分化の30日目に、細胞をPBSで1回洗浄し、溶媒または刺激物のいずれかを含有する250μlの新鮮な培地を各ウェルに添加した。12時間後に、上清を除去し、2000gで5分間遠心分離して、デブリをペレット化した。上清を新しい反応チューブに移し、急速冷凍して、ELISA測定まで-80℃で保存した。使用した刺激物は以下の通りであった:CRF(Tocris、1μM)、ストレシンI(Tocris、2μM)、グレリン(Tocris、1μM)、ソマトクリニン(Accurate Chemical、1μg/ml)、ナファレリン(Tocris、1μM)およびウロコルチン(Tocris、500nM)。
in vitroでホルモン放出を刺激するために、上述のように、細胞を24ウェルプレートで分化させた。分化の30日目に、細胞をPBSで1回洗浄し、溶媒または刺激物のいずれかを含有する250μlの新鮮な培地を各ウェルに添加した。12時間後に、上清を除去し、2000gで5分間遠心分離して、デブリをペレット化した。上清を新しい反応チューブに移し、急速冷凍して、ELISA測定まで-80℃で保存した。使用した刺激物は以下の通りであった:CRF(Tocris、1μM)、ストレシンI(Tocris、2μM)、グレリン(Tocris、1μM)、ソマトクリニン(Accurate Chemical、1μg/ml)、ナファレリン(Tocris、1μM)およびウロコルチン(Tocris、500nM)。
ELISA測定
細胞上清中または動物の血清中のホルモン濃度をELISA測定を使用して分析した。細胞培養物の上清中のホルモン濃度を、製造業者のマニュアルに従って伝統的な単一ホルモンELISAキットを使用して評価した。ACTH(Calbiotech、ラットとヒトのACTHを検出する)、hGH(R&D Systems、ヒトに特異的)、FSH(Calbiotech、FSH(lumELISA、ヒトに特異的)およびコルチコステロン(Abcam)。プレートをEnSpire Multimodeプレートリーダー(PerkinElmer)を使用して読み取った。in vivoでの試料のホルモン濃度を、伝統的なELISA(ACTHに対してのみ、1:2に希釈した血清)またはLuminex technology(Millipore)を使用する種特異的(ヒトまたはラット)Milliplex multiplex ELISAのいずれかを使用して分析した。磁気ビーズをベースとするサンドイッチイムノアッセイを製造業者のマニュアルに従って実施した。二連のウェルで25μlの希釈していない血清試料をLuminex FlexMap 3D(Luminex Corp、Austin、TX)によって分析した。サイトカインの濃度を5-p log分析を使用するLuminexのXponent 4.1およびEMD-MilliporeのMilliplex Analyst v5.1によって決定した。
細胞上清中または動物の血清中のホルモン濃度をELISA測定を使用して分析した。細胞培養物の上清中のホルモン濃度を、製造業者のマニュアルに従って伝統的な単一ホルモンELISAキットを使用して評価した。ACTH(Calbiotech、ラットとヒトのACTHを検出する)、hGH(R&D Systems、ヒトに特異的)、FSH(Calbiotech、FSH(lumELISA、ヒトに特異的)およびコルチコステロン(Abcam)。プレートをEnSpire Multimodeプレートリーダー(PerkinElmer)を使用して読み取った。in vivoでの試料のホルモン濃度を、伝統的なELISA(ACTHに対してのみ、1:2に希釈した血清)またはLuminex technology(Millipore)を使用する種特異的(ヒトまたはラット)Milliplex multiplex ELISAのいずれかを使用して分析した。磁気ビーズをベースとするサンドイッチイムノアッセイを製造業者のマニュアルに従って実施した。二連のウェルで25μlの希釈していない血清試料をLuminex FlexMap 3D(Luminex Corp、Austin、TX)によって分析した。サイトカインの濃度を5-p log分析を使用するLuminexのXponent 4.1およびEMD-MilliporeのMilliplex Analyst v5.1によって決定した。
細胞の下垂体切除したラットへの移植、試料の調製
オスの無胸腺ヌードラット(RNUラット Crl:NIH-Foxn1rnu、Charles River Laboratories)を8週齢で傍咽頭アプローチを使用して下垂体切除した。血漿のACTHを下垂体切除の1週間後に測定し、下垂体機能低下症を確認した。下垂体を切除したラットを2つの群に無作為化した:偽対照(n=4)、ヒトESから誘導した下垂体細胞を皮下移植した群(n=7)。シリンジ(1ml、BD biosciences)とマトリゲル(BD biosciences)を注射前に氷上で冷やし、注射前にマトリゲルがゲルを形成するのを防いだ。ラットの首の毛を剃り、ベタジンおよび70%のエタノールを用いて調製した。0.9mlのマトリゲルを2百万個のヒト下垂体細胞の懸濁液(100μlのessential E6培地中)と混合した。マトリゲルと細胞の混合物をラットの首の皮下組織に注射した。
オスの無胸腺ヌードラット(RNUラット Crl:NIH-Foxn1rnu、Charles River Laboratories)を8週齢で傍咽頭アプローチを使用して下垂体切除した。血漿のACTHを下垂体切除の1週間後に測定し、下垂体機能低下症を確認した。下垂体を切除したラットを2つの群に無作為化した:偽対照(n=4)、ヒトESから誘導した下垂体細胞を皮下移植した群(n=7)。シリンジ(1ml、BD biosciences)とマトリゲル(BD biosciences)を注射前に氷上で冷やし、注射前にマトリゲルがゲルを形成するのを防いだ。ラットの首の毛を剃り、ベタジンおよび70%のエタノールを用いて調製した。0.9mlのマトリゲルを2百万個のヒト下垂体細胞の懸濁液(100μlのessential E6培地中)と混合した。マトリゲルと細胞の混合物をラットの首の皮下組織に注射した。
午前8時に、イソフルラン麻酔下で、移植前、移植の1週間後、3週間後、5週間後および7週間後に、後眼窩採血により血液を採取した。血液をK2 EDTAで処理したBD Microtainer MAP(BD Biosciences)を用いて回収し、血漿を単離して、-80℃で保存した。
移植の7週間後、動物を麻酔し(Fatal Plus、60mg/kg)、0.1Mのリン酸緩衝食塩水(PBS、pH7.4)、次いで、4%のパラホルムアルデヒド(0.1MのPBS中、pH7.4)を心臓内に灌流した。マトリゲルプラグを切除して、4%のパラホルムアルデヒド中で6時間後固定し、次に、30%のスクロース中に4℃で24時間浸漬し、次いで、包埋する化合物中で凍結させた(OCT、Tissue-Tek、Sakura Finetek USA,Inc.)。マトリゲルプラグを免疫組織化学分析用に30μmの凍結切片とした。切片をACTH、GH、TSH、PRL、FSHおよびLH(ウサギのIgG、1:100、the National Hormone and Peptide Program)で、次に、Alexa 568とコンジュゲートしたヤギ抗ウサギ(life technologies)で染色した。HamamatsuのカメラおよびOlympusのBX51顕微鏡によって、画像を得た。光学的細胞分画プローブを使用して、マトリゲルプラグ全体におけるACTH細胞の数の立体解析学的定量化を行い、cavalieri estimator方法(Stereo Investigator Software、Microbrightfield Bioscience)を使用して、移植片の体積を分析した。
統計分析
データを、各図の凡例で示すように、試料の平均±SEMとして表す。平均は、個々の実験のデータ(対応する図の凡例で示した数)を表す。群間の差を、片側t検定またはボンフェローニの多重比較ポストホックテストを用いる一元ANOVAによって分析した。p<0.05=*、p<0.01=**、p<0.001=***、p<0.0001=****
データを、各図の凡例で示すように、試料の平均±SEMとして表す。平均は、個々の実験のデータ(対応する図の凡例で示した数)を表す。群間の差を、片側t検定またはボンフェローニの多重比較ポストホックテストを用いる一元ANOVAによって分析した。p<0.05=*、p<0.01=**、p<0.001=***、p<0.0001=****
参考文献
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6.3 実施例3:多能性幹細胞からの神経堤の誘導
多能性幹細胞をE8/E6培地で培養し、神経堤前駆細胞に分化させた。これらの神経堤前駆細胞の自発的分化により、MASH1発現でマークされる自律神経と、ISL1および/またはBRN3a発現でマークされる感覚神経の両方が生じた。
多能性幹細胞をE8/E6培地で培養し、神経堤前駆細胞に分化させた。これらの神経堤前駆細胞の自発的分化により、MASH1発現でマークされる自律神経と、ISL1および/またはBRN3a発現でマークされる感覚神経の両方が生じた。
多能性幹細胞を、実施例1で記載し、図29Aで示したように、E8/E6培地で分化させた。特に、多能性幹細胞をSB431542、BMP4およびCHIR99021を補充したE6培地で2日間分化させた(すなわち、0日目から2日目まで、E6培地で培養)。2日目に、培養培地からBMP4を除去し、細胞を、2日目から11日目まで培養するために、SB431542およびCHIR99021を補充したE6培地で培養した。11日目に、細胞を、CD49dおよびSox10を発現する細胞についてFACS選別し、神経堤分化培地でさらに培養した。15日目に培養からスフェロイドを選択し、再播種し、これを18日目に再度再播種した。25日目に、選別した神経堤細胞は、MASH1およびISL1を発現した(図29B)。
本開示の主題およびその利点について詳細に記載したが、添付の特許請求の範囲によって定義された発明の精神および範囲を逸脱せずに、種々の変化、置換および変更を本明細書において行うことができることを理解されたい。さらに、本出願の範囲は、本明細書に記載されている過程、機械、製造物、組成物、手段、方法およびステップの特定の実施形態に限定されることを意図するものではない。当業者が本開示の主題の開示から容易に理解するように、本明細書に記載されている対応する実施形態と実質的に同じ機能を実施し、または実質的に同じ結果を達成する既存のまたは後に開発される過程、機械、製造物、組成物、手段、方法またはステップを、本開示の主題に従って利用できる。したがって、添付の特許請求の範囲は、このような過程、機械、製造物、組成物、手段、方法、またはステップをその範囲内に含むことを意図する。
その開示が、参照によりすべての目的のために全体として本明細書に組み込まれる特許、特許出願、刊行物、製品の記載およびプロトコルがこの出願を通して引用されている。
Claims (1)
- 明細書に記載の発明。
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