WO2023286611A1 - 断片化細胞外マトリックス成分の製造方法 - Google Patents

断片化細胞外マトリックス成分の製造方法 Download PDF

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WO2023286611A1
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extracellular matrix
fragmented
collagen
solution
component
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あすか 山田
史朗 北野
典弥 松▲崎▼
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凸版印刷株式会社
国立大学法人大阪大学
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/50—Proteins
    • C12N2533/54—Collagen; Gelatin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/90—Substrates of biological origin, e.g. extracellular matrix, decellularised tissue

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing fragmented extracellular matrix components.
  • the present invention also relates to fragmented extracellular matrix components and methods of producing cell constructs using the same.
  • a technique for producing a cell structure that mimics a living tissue in vitro.
  • a cell culture method for obtaining a cell structure culturing cells in the presence of an extracellular matrix component such as collagen is generally performed.
  • Patent Document 1 discloses a three-dimensional tissue forming agent containing fragmented collagen, wherein the average length of the fragmented collagen is 100 nm to 200 ⁇ m and the average diameter of the fragmented collagen is 50 nm to 30 ⁇ m. , discloses a three-dimensional tissue forming agent.
  • fragmented extracellular matrix components were obtained by dispersing extracellular matrix components such as freeze-dried collagen in a buffer solution and then homogenizing with a homogenizer or the like.
  • extracellular matrix component such as collagen partially dissolves in the buffer solution during preparation just before use, resulting in a decrease in yield.
  • the present invention provides a method for producing a fragmented extracellular matrix component that can obtain a fragmented extracellular matrix component that is excellent in redispersibility even when stored in a dry state and that yields a higher yield than conventional methods. With the goal.
  • Another object of the present invention is to provide a fragmented extracellular matrix component that exhibits excellent redispersibility even when stored in a dry state, and to provide a method for producing a cell structure using the fragmented extracellular matrix component.
  • a method for producing a fragmented extracellular matrix component comprising: a step of neutralizing the solution in which the extracellular matrix components are dissolved; After the neutralization step, the solvent is removed by freeze-drying to obtain a mass containing extracellular matrix components; dispersing the lumps in a solution containing a polar organic solvent to fragment the extracellular matrix components in the solution to obtain a liquid containing the fragmented extracellular matrix components; and removing a liquid component from the liquid containing the fragmented extracellular matrix component.
  • a section sample is prepared, and a rectangular region with a long side of 1820 ⁇ m and a short side of 1365 ⁇ m is observed with a microscope.
  • the present invention it is possible to obtain a fragmented extracellular matrix component with excellent redispersibility even when stored in a dry state, and to provide a method for producing a fragmented extracellular matrix component with an improved yield compared to conventional methods. can do.
  • the present invention also provides a fragmented extracellular matrix component that exhibits excellent redispersibility even when stored in a dry state, and a method for producing a cell structure using the fragmented extracellular matrix component. can be done.
  • FIG. 3 is an optical micrograph of fragmented collagen resuspended in ultrapure water.
  • FIG. 1(A) shows the fragmented collagen obtained in Production Example 1.
  • FIG. 1(B) shows the fragmented collagen obtained in Comparative Production Example 1.
  • FIG. 1 is a CD spectrum of fragmented collagen obtained in Production Example 1.
  • FIG. Fig. 3 is a photograph of fragmented collagen stained with hematoxylin and eosin (HE).
  • 3(A) and (C) are photographs of the fragmented collagen obtained in Comparative Production Example 1 taken at magnifications of 10 and 40, respectively.
  • 3(B) and (D) are photographs of the fragmented collagen obtained in Production Example 1 taken at magnifications of 10 and 40, respectively.
  • FIG. 3 is an optical micrograph of fragmented collagen resuspended in ultrapure water.
  • FIG. 5(A) shows the fragmented collagen obtained in Production Example 1.
  • FIG. 5(B) shows the fragmented collagen obtained in Production Example 2-3.
  • FIG. 5(C) shows the fragmented collagen obtained in Production Example 2-1.
  • FIG. 3 is a CD spectrum of fragmented collagen obtained in Production Example 2-3.
  • FIG. Fig. 3 is an optical micrograph of fragmented collagen resuspended in ultrapure water.
  • FIG. 7(A) shows the fragmented collagen obtained in Production Example 3-1.
  • FIG. 7(B) shows the fragmented collagen obtained in Production Example 3-2.
  • FIG. 7(C) shows the fragmented collagen obtained in Production Example 3-3.
  • FIGS. 8(A) and (C) are photographs of collagen after neutralization and gelation, taken at magnifications of 500 and 2000, respectively.
  • FIGS. 8(B) and (D) are photographs of neutralized collagen taken at magnifications of 500 and 2000, respectively. It is a photograph of a gelled collagen solution.
  • 10A and 10B are photographs of cell structures stained with hematoxylin and eosin (HE) (FIGS. 10A and 10C) or immunostained with CD31 (FIG. 10B).
  • 10(A) and (B) are cell structures produced using the fragmented collagen obtained in Production Example 1.
  • FIG. 10(C) shows a cell structure produced using the fragmented collagen obtained in Comparative Production Example 1.
  • FIG. It is a photograph of fragmented collagen dispersed by a pipetting operation. 1 is a phase-contrast micrograph of redispersed fragmented collagen.
  • Fig. 3 shows CD spectra of gelatin, raw material collagen (Native Collagen), and fragmented collagen obtained by the method of Production Example 5-4.
  • Fig. 10 is a photograph showing a section image of a cell structure prepared using fragmented collagen, stained with hematoxylin and eosin (HE) and CD31.
  • 1 is a phase-contrast photomicrograph showing evaluation results of the influence of the presence or absence of ultrasonic defibration on fragmented collagen.
  • Fig. 10 is a photograph showing a section image of a cell structure showing the evaluation result of the influence of the presence or absence of ultrasonic fibrillation on fragmented collagen.
  • 1 is a micrograph showing observation results of fragmented collagen produced using acetone, acetonitrile, and diethyl ether as polar organic solvents. It is a graph which shows a hydrophobicity evaluation result.
  • the method for producing a fragmented extracellular matrix component includes a step of neutralizing a solution in which the extracellular matrix component is dissolved (neutralization step), and after the neutralization step, the solvent is removed by freeze-drying. to obtain a mass containing extracellular matrix components (solvent removal step); dispersing the mass in a solution containing a polar organic solvent to fragment the extracellular matrix components in the solution; It comprises a step of obtaining a liquid containing the component (fragmentation step) and a step of removing the liquid component from the liquid containing the fragmented extracellular matrix component (drying step).
  • a step of gelling the neutralized solution after the neutralization step and before the solvent removal step may be further provided.
  • the liquid component in the liquid obtained in the fragmentation step is diluted with water. It may further comprise a step of substituting (substitution step).
  • the liquid containing the fragmented extracellular matrix component is subjected to ultrasonic crushing treatment.
  • a step of performing (ultrasonic crushing step) may be further provided.
  • the method for producing a fragmented extracellular matrix component according to the present embodiment may further include a step of dispersing the solid matter obtained in the drying step in an aqueous medium (washing step) in addition to the steps described above.
  • the neutralization step is a step of neutralizing the solution in which the extracellular matrix components are dissolved. Since the structure of the extracellular matrix is changed by neutralization, it is possible to obtain a fragmented extracellular matrix component that is excellent in redispersibility even when stored in a dry state by carrying out in conjunction with the subsequent steps. become.
  • extracellular matrix component refers to an aggregate of extracellular matrix molecules formed by multiple extracellular matrix molecules (also simply referred to as "extracellular matrix”).
  • Extracellular matrix means a substance that exists outside cells in an organism. Any substance can be used as the extracellular matrix as long as it does not adversely affect the growth of cells and the formation of cell aggregates.
  • Specific examples of extracellular matrices include, but are not limited to, collagen, elastin, proteoglycan, fibronectin, hyaluronic acid, laminin, vitronectin, tenascin, entactin and fibrillin.
  • the extracellular matrix component may contain one type of extracellular matrix alone, or may contain two or more types in combination.
  • the extracellular matrix may be a modification or variant of the above-mentioned extracellular matrix, or a polypeptide such as a chemically synthesized peptide, as long as it does not adversely affect cell growth and cell aggregate formation.
  • the extracellular matrix may have repeating sequences represented by Gly-XY, characteristic of collagen.
  • Gly represents a glycine residue
  • X and Y each independently represent any amino acid residue.
  • a plurality of Gly-XY may be the same or different.
  • the proportion of the sequence represented by Gly-XY in the total amino acid sequence may be 80% or more, preferably 95% or more.
  • the extracellular matrix may be a polypeptide having an RGD sequence.
  • the RGD sequence refers to a sequence represented by Arg-Gly-Asp (arginine residue-glycine residue-aspartic acid residue). Having an RGD sequence further promotes cell adhesion, making it more suitable as a scaffold material for cell culture, for example.
  • Extracellular matrices containing a sequence represented by Gly-XY and an RGD sequence include collagen, fibronectin, vitronectin, laminin, cadherin and the like.
  • Collagen includes, for example, fibrous collagen and non-fibrous collagen.
  • Fibrous collagen means collagen that is the main component of collagen fibers, and specific examples thereof include type I collagen, type II collagen, and type III collagen.
  • Non-fibrillar collagens include, for example, type IV collagen.
  • Proteoglycans include, but are not limited to, chondroitin sulfate proteoglycans, heparan sulfate proteoglycans, keratan sulfate proteoglycans, and dermatan sulfate proteoglycans.
  • the extracellular matrix component may contain at least one selected from the group consisting of collagen, laminin and fibronectin, and preferably contains collagen.
  • the collagen is preferably fibrillar collagen, more preferably type I collagen.
  • Commercially available collagen may be used as the fibrous collagen, and a specific example thereof is porcine skin-derived type I collagen manufactured by Nippon Ham Co., Ltd.
  • the extracellular matrix component may be an animal-derived extracellular matrix component.
  • animal species from which extracellular matrix components are derived include, but are not limited to, humans, pigs, and bovines.
  • As the extracellular matrix component a component derived from one kind of animal may be used, or a combination of components derived from a plurality of kinds of animals may be used.
  • the solvent for the solution in which the extracellular matrix components are dissolved is not particularly limited as long as it can dissolve the extracellular matrix components.
  • Specific examples of solvents include water and buffers (eg, phosphate-buffered saline (PBS), Tris-HCl buffer (Tris-HCl)).
  • the concentration of the extracellular matrix component in the solution in which the extracellular matrix component is dissolved is not particularly limited, but may be, for example, 1 mg/mL or more and 50 mg/mL or less.
  • the neutralization step can be carried out, for example, by adding an alkaline solution to the solution in which the extracellular matrix components are dissolved.
  • the alkaline solution is not particularly limited, for example, a solution obtained by dissolving an alkali metal hydroxide, an alkaline earth metal hydroxide, or the like in water can be preferably used. More specific examples of the alkaline solution include potassium hydroxide (KOH) aqueous solution, sodium hydroxide (NaOH) aqueous solution, and the like.
  • the neutralization step can be performed, for example, by adding an acidic solution to the solution in which the extracellular matrix components are dissolved.
  • the acidic solution is not particularly limited, and examples thereof include hydrochloric acid solution, sulfuric acid solution, acetic acid solution, carbonate solution and the like.
  • the pH of the solution after neutralization may be, for example, within the range of 6 or more and 8 or less, preferably 6.5 or more and 7.5 or less, and 6.9 or more and 7.5. It is more preferably within the range of 1 or less, and further preferably within the range of 6.95 or more and 7.05 or less.
  • the gelation step is the step of gelling the neutralized solution after the neutralization step and before the solvent removal step.
  • the gelation step may be performed as necessary.
  • the gelation step can be performed, for example, by heating the neutralized solution to gel it.
  • the temperature and heating time during heating can be appropriately set according to the type, concentration, etc. of the extracellular matrix component. Three hours can be exemplified.
  • the gelation step it is possible to confirm whether the solution is uniformly neutralized in the neutralization step by visually determining whether the formed gel is uniform.
  • the mass containing extracellular matrix components obtained in the solvent removal step becomes a porous body, and fragmentation in the fragmentation step can be performed more efficiently.
  • the solvent removal step is a step of removing the solvent by freeze-drying after the neutralization step (after the gelation step when the gelation step is included) to obtain a mass containing extracellular matrix components.
  • the solution after neutralization or the freeze-drying treatment of the gel after gelation can be carried out according to a conventional method.
  • the solvent removal step removes the solvent to obtain a mass (solid) containing extracellular matrix components.
  • the removal of the solvent does not mean that no solvent is attached to the mass (solid) containing the extracellular matrix component. It means that the solvent is not attached to the extent possible.
  • the fragmentation step is a step of dispersing the aggregates obtained in the solvent removal step in a solution containing a polar organic solvent, fragmenting the extracellular matrix components in the solution, and obtaining a liquid containing the fragmented extracellular matrix components.
  • Fragmentation in a solution containing a polar organic solvent yields a fragmented extracellular matrix component that exhibits excellent redispersibility even when stored in a dry state, and suppresses the dissolution of the extracellular matrix component into the solution.
  • the yield is further improved compared to the conventional method.
  • the polar organic solvent is not particularly limited as long as it is an organic solvent having polarity, and examples thereof include alcohols such as methanol, ethanol, n-propanol and isopropanol, acetone, acetonitrile and diethyl ether.
  • the concentration of the polar organic solvent in the solution containing the polar organic solvent is not particularly limited, it should be 20 v/v% or more and 100 v/v% or less from the viewpoint that the above effects can be exhibited more remarkably. is preferred.
  • the concentration of the polar organic solvent in the solution containing the polar organic solvent may be, for example, 20 v/v% or more and 50 v/v% or less, may be 20 v/v% or more and 40 v/v% or less, and may be 20 v/v % or more and 30 v/v % or less.
  • the concentration of the polar organic solvent in the solution containing the polar organic solvent is, for example, 50 v/v% or more and 100 v/v% or less, 50 v/v% or more and 90 v/v% or less, or 50 v/v% or more and 80 v/v% or less. 60 v/v% or more and 100 v/v% or less, 60 v/v% or more and 90 v/v% or less, or 60 v/v% or more and 80 v/v% or less.
  • fragmentation means reducing aggregates of extracellular matrix molecules to a smaller size. Fragmentation may be performed under conditions that cleave bonds within extracellular matrix molecules, or under conditions that do not cleave bonds within extracellular matrix molecules. Extracellular matrices that have been fragmented by the application of physical force usually do not change their molecular structure (the molecular structure is maintained) unlike enzymatic treatment. Fragmented extracellular matrix components may contain defibrated extracellular matrix components (fibrillated extracellular matrix components), which are components obtained by defibrating the above-described extracellular matrix components by applying physical force. . Defibrillation is one mode of fragmentation, and is performed under conditions that do not break bonds within extracellular matrix molecules, for example.
  • the fragmentation step includes dispersing the mass obtained in the solvent removal step in a solution containing a polar organic solvent, and extracting the extracellular matrix component in the solution. It may be configured as a step of defibrating to obtain a liquid containing fibrillated extracellular matrix components (fibrillation step).
  • the method for fragmenting extracellular matrix components is not particularly limited, and may be fragmented by applying physical force.
  • a homogenizer such as an ultrasonic homogenizer, a stirring homogenizer, and a high-pressure homogenizer may be used to fragment the extracellular matrix components by applying physical force. good. It is also possible to obtain millimeter-sized or nanometer-sized fragmented extracellular matrix components by adjusting the homogenization time, number of times, and the like.
  • More specific conditions for fragmenting the extracellular matrix components include, for example, using a homogenizer (manufactured by AS ONE, VH-10) and treating at 20,000 rpm to 30,000 rpm for 3 to 10 minutes, or Conditions under which a corresponding physical force can be applied can be mentioned.
  • the fragmented extracellular matrix component may at least partially contain a defibrated extracellular matrix component. Moreover, the fragmented extracellular matrix component may consist of only the defibrated extracellular matrix component. That is, the fragmented extracellular matrix component may be a defibrated extracellular matrix component.
  • the defibrated extracellular matrix component preferably contains fibrillated collagen (fibrillated collagen).
  • the defibrillated collagen preferably maintains the triple helical structure derived from collagen.
  • the defibrated collagen may partially maintain the triple helical structure derived from collagen.
  • the shape of the fragmented extracellular matrix component includes, for example, a fibrous shape.
  • the fibrous shape means a shape composed of filamentous extracellular matrix components, or a shape composed of filamentous extracellular matrix components crosslinked between molecules. At least some of the fragmented extracellular matrix components may be fibrous.
  • Fibrous extracellular matrix components include thin filaments (fibrils) formed by aggregation of a plurality of filamentous extracellular matrix molecules, filaments formed by further aggregation of fine fibrils, and these filaments. Including defibrated ones. The RGD sequence is preserved without disruption in fibrous extracellular matrix components.
  • the average length of the fragmented extracellular matrix component may be 100 nm or more and 400 ⁇ m or less, and may be 100 nm or more and 200 ⁇ m or less. In one embodiment, the average length of the fragmented extracellular matrix component may be 5 ⁇ m or more and 400 ⁇ m or less, 10 ⁇ m or more and 400 ⁇ m or less, 22 ⁇ m or more and 400 ⁇ m or less, or 100 ⁇ m or more and 400 ⁇ m or less. good. In other embodiments, the average length of the fragmented extracellular matrix components may be 100 ⁇ m or less, 50 ⁇ m or less, 30 ⁇ m or less, 15 ⁇ m or less, 10 ⁇ m or less.
  • the average diameter of the fragmented extracellular matrix components may be 10 nm or more and 10 ⁇ m or less, 20 nm or more and 8 ⁇ m or less, 30 nm or more and 6 ⁇ m or less, or 50 nm or more and 4 ⁇ m or less.
  • the average length and average diameter of the fragmented extracellular matrix components can be determined by measuring individual fragmented extracellular matrix components with an optical microscope and analyzing the images.
  • average length means the average length of the measured sample in the longitudinal direction
  • average diameter means the average length of the measured sample in the direction orthogonal to the longitudinal direction. means.
  • the liquid contains, in addition to the fragmented extracellular matrix component, a solution containing a polar organic solvent, or the like.
  • the replacement step is a step of replacing the liquid component in the liquid obtained in the fragmentation step with water after the fragmentation step and before the drying step.
  • the fragmented extracellular matrix component obtained through the drying process can be rapidly redispersed.
  • Examples of water include tap water, distilled water, and ultrapure water.
  • the method for replacing the liquid component in the liquid obtained in the fragmentation step with water is not particularly limited, and a normal method for solvent replacement can be used.
  • a method of replacing with water the liquid obtained in the fragmentation step is centrifuged to precipitate the fragmented extracellular matrix components in the liquid, then the liquid component is removed, and then the fragmented extracellular matrix is removed.
  • a method of adding water to the matrix component is included. Note that replacing the liquid component with water does not mean that all the liquid components present in the liquid are replaced with water, but means that the main solvent in the liquid is replaced with water. A small amount of liquid components other than water may remain.
  • the liquid obtained through the replacement process contains water in addition to the fragmented extracellular matrix components.
  • the ultrasonic crushing step is a step of subjecting the liquid obtained in the fragmentation step to ultrasonic crushing treatment.
  • the ultrasonic crushing step may be performed as necessary. Through the ultrasonication process, it is possible to obtain a fragmented extracellular matrix component that is dispersed more uniformly and is less likely to aggregate when used for organization.
  • Ultrasonic crushing treatment can crush the fragmented extracellular matrix components while cooling, and thus has the advantage that the possibility of thermal denaturation of the fragmented extracellular matrix components is low and large-scale equipment is not required.
  • the ultrasonic crushing process can be performed using an ultrasonic crusher.
  • an ultrasonic crusher for example, a fully automatic ultrasonic crusher such as BIORUPTORII manufactured by BM Kiki Co., Ltd. can be used.
  • the ultrasonic crushing treatment may be carried out by repeatedly irradiating the liquid obtained in the fragmentation step with ultrasonic waves and cooling the liquid.
  • the ultrasonic crushing treatment may be carried out, for example, by repeating ultrasonic irradiation for 10 to 30 seconds and cooling for 20 to 40 seconds at an ultrasonic frequency of 20 kHz 50 to 150 times.
  • the fragmented extracellular matrix components may dissolve. Therefore, in order to obtain finely fragmented extracellular matrix components by ultrasonication, for example, the fragmented extracellular matrix components or their precursors are subjected to thermal cross-linking treatment to prevent dissolution during ultrasonication. I needed it.
  • the fragmented extracellular matrix component may be denatured by the thermal cross-linking treatment, and the tissue obtained using the denatured fragmented extracellular matrix component may differ greatly from the living tissue. Fragmented extracellular matrix components obtained by fragmentation in a solution containing a polar organic solvent do not dissolve easily even when the liquid components are replaced with water.
  • the resulting fragmented extracellular matrix components can be subjected to ultrasonic disruption without treatment that can denature the fragmented extracellular matrix components, thereby dispersing them more uniformly and improving their organization. Fragmented extracellular matrix components that are less likely to aggregate when used can be obtained.
  • the drying step is a step of removing liquid components from the liquid containing the fragmented extracellular matrix components obtained in the fragmentation step.
  • Removal of liquid components can be carried out, for example, by air drying, freeze drying, reduced pressure drying, reduced pressure freeze drying, and the like. Removal of liquid components may be performed by air-drying or freeze-drying processes. It is preferable to remove the liquid component by air-drying, because fragmented extracellular matrix components with excellent redispersibility can be easily obtained even when stored in a dry state.
  • the drying process removes the liquid component to obtain a solid containing dried fractionated extracellular matrix components.
  • the removal of the liquid component does not mean that no liquid component adheres to the solid material containing the dried fractionated extracellular matrix component, and the general drying method described above does not mean that no liquid component adheres to the solid material. , means that the liquid component is not adhered to the extent that common sense can be reached.
  • the washing step is a step of dispersing the solid matter obtained in the drying step in an aqueous medium.
  • the washing step may be performed as necessary.
  • the washing step removes unnecessary components (for example, salts) from the solid containing the fragmented extracellular matrix components, thereby obtaining fragmented extracellular matrix components of higher purity.
  • the aqueous medium used in the washing step is preferably capable of dispersing the fragmented extracellular matrix components and dissolving the unnecessary components described above.
  • aqueous media include water, phosphate buffered saline (PBS), Tris buffer (Tris), and the like.
  • a dried fragmented extracellular matrix component can be obtained at a higher yield than the conventional method.
  • the resulting dried fragmented extracellular matrix components are excellent in redispersibility, and can be easily redispersed, for example, by adding an arbitrary solvent and performing a pipetting operation.
  • a method for producing a fragmented extracellular matrix component comprises a neutralization step, a solvent removal step, a fragmentation step, a replacement step, and a drying step, wherein the drying step is obtained by the replacement step.
  • the method may be a step of removing a liquid component from the obtained liquid by a freeze-drying treatment.
  • the dried fragmented extracellular matrix component obtained by the method further comprising the replacement step can be redispersed more rapidly. For example, in a method that does not include each of the above steps, it may take about 3 to 5 minutes to redisperse by adding a solvent and performing a pipetting operation.
  • the dried fragmented extracellular matrix component obtained by the method comprising the neutralization step, the solvent removal step, the fragmentation step, the replacement step, and the drying step can be dried in a shorter time (e.g., about 1 minute) to allow redispersion.
  • the fragmented extracellular matrix component of one embodiment obtained by a method comprising the neutralization step, the solvent removal step, the fragmentation step, the replacement step, and the drying step is more rapidly Possible reasons for redistribution are as follows. Since conventional fragmented extracellular matrix components are highly hydrophilic even after they are defibrated once, the fragmented extracellular matrix components become entangled again in the freeze-drying stage. On the other hand, the fragmented extracellular matrix components according to the above embodiment have a high degree of hydrophobicity, and re-entanglement of the fragmented extracellular matrix components with each other via water is suppressed. Freeze-drying is possible. As a result, the fragmented extracellular matrix components are thought to be able to redisperse more rapidly.
  • fragmented extracellular matrix component acquires hydrophobicity in the process of substituting the fragmented extracellular matrix component with water and then freeze-drying.
  • the reason why the fragmented extracellular matrix component can be redispersed more rapidly is not limited to the above.
  • the dried fragmented extracellular matrix component according to the present embodiment can typically be obtained by the method for producing the fragmented extracellular matrix component according to the present embodiment described above.
  • the dried fragmented extracellular matrix component according to the present embodiment may be a laminate of fibrous extracellular matrix components having an average diameter of 0.08 ⁇ m or more and 2.0 ⁇ m or less. By having such a structure, it becomes excellent in redispersibility.
  • the average diameter is preferably 0.1 ⁇ m or more and 1.5 ⁇ m or less, more preferably 0.3 ⁇ m or more and 1.0 ⁇ m or less, and even more preferably 0.5 ⁇ m or more and 0.7 ⁇ m or less.
  • the dried fragmented extracellular matrix component according to the present embodiment is obtained by preparing a section sample and observing a rectangular area of the section sample with a long side of 1820 ⁇ m and a short side of 1365 ⁇ m with a microscope.
  • the area of the region where the outer matrix component exists may be 40% or more and 100% or less of the area of the observed image. By having such a structure, it becomes excellent in redispersibility.
  • the above ratio may be 40% or more and 95% or less, 40% or more and 90% or less, 40% or more and 85% or less, 40% or more and 80% or less, or 40% or more and 75% or less, 45% or more and 100% or less, 45% to 95%, 45% to 90%, 45% to 85%, 45% to 80%, or 45% to 75%, 50% to 100%, 50% or more 95% or less, 50% or more and 90% or less, 50% or more and 85% or less, 50% or more and 80% or less, or 50% or more and 75% or less, 55% or more and 100% or less, 55% or more and 95% or less , 55% to 90%, 55% to 85%, 55% to 80%, or 55% to 75%, 60% to 100%, 60% to 95%, 60% 60% to 85%, 60% to 80%, or 60% to 75%, 65% to 100%, 65% to 95%, 65% to 90% 65% or more and 85% or less, 65% or more and 80% or less, or 65% or more and 75% or less.
  • the fragmented extracellular matrix component according to this embodiment has a peak within a wavelength range of 400 nm or more and 550 nm or less in fluorescence intensity measurement using 1,8-anilinonaphthalenesulfonic acid (ANS).
  • the fragmented extracellular matrix component can be suitably produced by the method for producing a fragmented extracellular matrix component according to the present embodiment described above.
  • the fragmented extracellular matrix component according to this embodiment may have a peak in the wavelength range of 420 nm or more and 500 nm or less or 425 nm or more and 475 nm in fluorescence intensity measurement using ANS.
  • ANS is a hydrophobic probe.
  • fluorescence intensity measurement using ANS shows a peak within the wavelength range of 400 nm or more and 550 nm or less, it can be determined that the fragmented extracellular matrix component has hydrophobicity.
  • the fragmented extracellular matrix component to be measured is added to phosphate-buffered saline (1 ⁇ PBS) at a concentration of 5 mg/mL.
  • the solution containing the fragmented extracellular matrix components is stored in a refrigerator for 4 days to dissolve the fragmented extracellular matrix. Let this be a fragmented extracellular matrix solution.
  • Magnesium(II) 8-anilino-1-naphthalenesulfonate (ANS-8-Mg) is dissolved in phosphate buffered saline (1 ⁇ PBS) to a concentration of 20 ⁇ M. This is called an ANS-Mg aqueous solution.
  • Fluorescence intensity measurement is performed under the conditions shown below.
  • Measuring instrument spectrophotometer (for example, NanoDrop TM 3300 fluorophotometer (manufactured by ThermoFischer Scientific)) Excitation wavelength: 380 nm Measurement wavelength: 400-750nm
  • the fragmented extracellular matrix component according to the present embodiment has a peak in the wavelength range of 400 nm or more and 550 nm or less in fluorescence intensity measurement using 1,8-anilinonaphthalenesulfonic acid (ANS), so it can be rapidly reproduced. Dispersion is possible.
  • the fluorescence intensity of the fragmented extracellular matrix component measured using ANS may be twice or more the fluorescence intensity of the extracellular matrix component before fragmentation measured using ANS.
  • the fluorescence intensity of the extracellular matrix component before fragmentation measured using ANS is the extracellular matrix component before fragmentation (raw material of the fragmented extracellular matrix) instead of the fragmented extracellular matrix component. Fluorescence intensity is measured in the same manner, except that the extracellular matrix component with
  • the method for producing a cell structure according to the present embodiment includes a step of mixing the fragmented extracellular matrix components obtained by the method for producing a fragmented extracellular matrix according to the present embodiment with cells (mixing step); and a step of incubating the mixture obtained in the step of performing (incubating step).
  • cell structure refers to an aggregate of cells (massive cell population) in which cells are three-dimensionally arranged via an extracellular matrix component, and is artificially produced by cell culture. means the aggregate that is created.
  • the shape of the cell structure is not particularly limited. , a substantially rectangular parallelepiped shape, and the like.
  • the cell structure may be aggregated in a state of adhering to the support, or may be aggregated in a state of not adhering to the support.
  • the mixing step is a step of mixing the fragmented extracellular matrix component obtained by the method for producing a fragmented extracellular matrix according to the present embodiment with cells.
  • Cells are not particularly limited, but may be, for example, cells derived from mammals such as humans, monkeys, dogs, cats, rabbits, pigs, cows, mice, and rats.
  • the site of cell origin is not particularly limited, and may be somatic cells derived from bones, muscles, internal organs, nerves, brains, bones, skin, blood, or the like, or germ cells.
  • the cells may be stem cells, or cultured cells such as primary cultured cells, subcultured cells and cell line cells.
  • the mixing step includes a method of mixing an aqueous medium containing fragmented extracellular matrix components and an aqueous medium containing cells, a method of adding and mixing cells to an aqueous medium containing fragmented extracellular matrix components, A method of adding an aqueous medium containing fragmented extracellular matrix components to a culture medium containing cells and mixing them, and a method of adding fragmented extracellular matrix components and cells to a previously prepared aqueous medium and mixing them. Examples include, but are not limited to.
  • the concentration of the fragmented extracellular matrix component in the mixing step can be appropriately determined according to the shape and thickness of the target cell structure, the size of the incubator, and the like.
  • the concentration of the fragmented extracellular matrix component in the aqueous medium in the mixing step may be 0.1-90% by mass, or 1-30% by mass.
  • the amount of the fragmented extracellular matrix component in the mixing step is, for example, 0.1 to 100 mg, 0.5 to 50 mg, 0.8 to 25 mg, 1.0 to 1.0 mg for 1.0 ⁇ 10 6 cells. 10 mg, 1.0-5.0 mg, 1.0-2.0 mg, or 1.0-1.8 mg, 0.7 mg or more, 1.1 mg or more, 1.2 mg or more, 1.3 mg or more Or it may be 1.4 mg or more, and may be 7.0 mg or less, 3.0 mg or less, 2.3 mg or less, 1.8 mg or less, 1.7 mg or less, 1.6 mg or less, or 1.5 mg or less.
  • the mass ratio between the fragmented extracellular matrix components and the cells is preferably 1/1 to 1000/1, more preferably 9/1 to 900/1. is more preferable, and 10/1 to 500/1 is even more preferable.
  • the incubation step is a step of incubating the mixture obtained in the mixing step.
  • the incubating step can also be regarded as a step of culturing the cells in the presence of the fragmented extracellular matrix component.
  • the method of culturing cells in the presence of fragmented extracellular matrix components is not particularly limited, and a suitable culture method can be used according to the type of cells to be cultured.
  • the culture temperature may be 20°C to 40°C, or 30°C to 37°C.
  • the pH of the medium may be 6-8, or 7.2-7.4.
  • the culture time may be 1 day to 2 weeks, or 1 week to 2 weeks.
  • the incubator (support) used in the incubation step is not particularly limited, and may be, for example, a well insert, a low-adhesion plate, or a plate having a U-shaped or V-shaped bottom surface.
  • the cells may be cultured while adhered to the support, the cells may be cultured without adhering to the support, or the cells may be separated from the support during the culture and cultured.
  • the base has a U-shaped or V-shaped bottom shape that inhibits the adhesion of the cells to the support. It is preferable to use a plate or a low adsorption plate.
  • the medium used in the incubation process is not particularly limited, and a suitable medium can be selected according to the type of cells to be cultured.
  • the medium include Eagle's MEM medium, DMEM, Modified Eagle medium (MEM), Minimum Essential medium, RPMI, and GlutaMax medium.
  • the medium may be a serum-supplemented medium or a serum-free medium.
  • the medium may be a mixed medium in which two types of medium are mixed.
  • the cell density in the medium in the incubation step can be appropriately determined according to the shape and thickness of the target cell structure, the size of the incubator, and the like.
  • the cell density in the medium in the incubation step may be 1-10 8 cells/mL, or 10 3 -10 7 cells/mL.
  • the cell density in the medium in the incubation step may be the same as the cell density in the aqueous medium in the mixing step.
  • ⁇ Test Example 1> Production of Fragmented Collagen] 10 ⁇ PBS (manufactured by Nacalai Tesque Co., Ltd.) and 0.05N NaOH aqueous solution were mixed in equal amounts to prepare a neutralization solution. On ice, 4.25 mL of the neutralizing solution is added at once to 17 mL of the collagen solution (pig skin-derived collagen I solution, manufactured by Nippi Co., Ltd., PSC-1-200-100), and pipetted quickly using a pipette. This neutralized the collagen solution. The pH of the collagen solution after neutralization was 7. The neutralized collagen solution was incubated at 37° C. for 2 hours to gel.
  • the collagen solution pig skin-derived collagen I solution, manufactured by Nippi Co., Ltd., PSC-1-200-100
  • the solvent was removed by freeze-drying to obtain a dry collagen solid (mass containing collagen). All the resulting dry solids were transferred to a 15 mL centrifuge tube, and 10 mL of absolute ethanol was added to disperse them, then using a homogenizer (manufactured by AS ONE, VH-10), homogenization was performed at 30,000 rpm for 6 minutes to obtain collagen. was fragmented (fibrillated). Subsequently, the fragmented collagen was sedimented by centrifugation (10,000 rpm, 3 minutes), and the supernatant ethanol (liquid component) was removed. The precipitated fragmented collagen was dried at room temperature for 3 days, or dried under reduced pressure with a vacuum pump for 2 hours to further remove ethanol (liquid component) to obtain fragmented collagen (fibrillated collagen).
  • FIG. 1 is an optical micrograph of fragmented collagen resuspended in ultrapure water.
  • FIG. 1(A) shows the fragmented collagen obtained in Production Example 1.
  • FIG. 1(B) shows the fragmented collagen obtained in Comparative Production Example 1.
  • FIG. The fragmented collagen obtained by the production method according to the present invention (Production Example 1) could be redispersed by pipetting (see FIG. 1(A)).
  • the fragmented collagen obtained by the conventional production method (Comparative Production Example 1) could not be redispersed by pipetting, and it was confirmed that aggregates of collagen fibers remained (see FIG. 1(B)). .
  • a part of the dried body was scraped off with a cutter, and 50 mM acetic acid was added so that the concentration of the dried body was 1 mg/mL and dissolved overnight at 4°C.
  • the resulting solution was diluted 200-fold with 50 mM acetic acid to obtain a solution with a dry matter concentration of 50 ⁇ g/mL.
  • the resulting solution was transferred to a quartz cuvette (optical path length 1 mm), and the CD spectrum (wavelength range: 200 to 250 nm) was measured using a circular dichroism spectrometer (manufactured by JASCO Corporation, J-725). bottom.
  • FIG. 2 is the CD spectrum of the fragmented collagen obtained in Production Example 1.
  • FIG. 2 also shows the CD spectrum of the collagen itself (Native collagen) and the CD spectrum of the collagen freeze-dried after gelation in Production Example 1 (freeze-dried collagen after gelation).
  • a peak derived from the triple helical structure unique to collagen is observed in the 220-225 nm region.
  • the fragmented collagen obtained in Production Example 1 has a lower peak height than the peaks of the native collagen and the freeze-dried collagen after gelation, which are standard products, but is derived from the triple helical structure peculiar to collagen. A peak was observed. That is, it was revealed that the fragmented collagen obtained in Production Example 1 retained the triple helical structure peculiar to collagen and was not denatured.
  • Fig. 3 is a photograph of fragmented collagen stained with hematoxylin and eosin (HE).
  • 3(A) and (C) are photographs of the fragmented collagen obtained in Comparative Production Example 1 taken at magnifications of 10 and 40, respectively.
  • 3(B) and (D) are photographs of the fragmented collagen obtained in Production Example 1 taken at magnifications of 10 and 40, respectively. While the fragmented collagen obtained in Comparative Production Example 1 forms a ribbon-like network structure (FIGS. 3A and 3C), the fragmented collagen obtained in Production Example 1 has interfiber It had a structure in which the voids were small and fine filamentous fibers were twisted together (FIGS. 3(B) and (D)).
  • FIG. 3(A) Photo taken at 10x magnification of the section sample of Comparative Production Example 1.
  • the area of the observation image is 1820 ⁇ m (long side) ⁇ 1365 ⁇ m (short side).
  • FIG. 3(B) A photograph of the section sample of Production Example 1 taken at a magnification of 10 times.
  • the area of the observation image is 1820 ⁇ m (long side) ⁇ 1365 ⁇ m (short side).
  • the cell As a result of calculating the area ratio (%) of the region where the outer matrix component is present, it is 39.0 ⁇ 0.5% in FIG. In Example 1), it was 72.3 ⁇ 3.5%.
  • the structures of the fragmented collagen (dry body) obtained in Production Example 1 and the fragmented collagen (dry body) obtained in Comparative Production Example 1 were further imaged and observed with a scanning electron microscope (SEM). evaluated.
  • SEM scanning electron microscope
  • a portion of the dried body was thinly scraped off with a scalpel and attached to a stage for an electron microscope using a carbon tape.
  • an osmium coater manufactured by Vacuum Device Co., Ltd., HPC-1SW
  • Plasma irradiation was repeated three times.
  • the resulting sample was imaged at 5.0 V and 10 ⁇ A using a scanning electron microscope (manufactured by JEOL Ltd., JSM-6701R).
  • Fig. 4 is a photograph of fragmented collagen taken with a scanning electron microscope.
  • 4(A) and (B) are photographs of the fragmented collagen obtained in Comparative Production Example 1 taken at magnifications of 2000 and 3300, respectively.
  • 4(C) and (D) are photographs of the fragmented collagen obtained in Production Example 1 taken at magnifications of 2000 and 3300, respectively.
  • the fragmented collagen obtained in Comparative Production Example 1 had a structure in which collagen fibers were laminated in a belt shape (FIGS. 4(A) and (B)).
  • the fragmented collagen obtained in Production Example 1 it was confirmed that fine fibers overlapped.
  • the average fiber diameter calculated from the captured images was 10.6 ⁇ m for the fragmented collagen obtained in Comparative Production Example 1 and 0.6 ⁇ m for the fragmented collagen obtained in Production Example 1.
  • Table 1 summarizes the yields of the fragmented collagen obtained in Production Example 1, Production Examples 2-1 to 2-3, and Comparative Production Example 1.
  • the yield referred to here is the ratio (%) of the weight of the obtained fragmented collagen (dry body) to the weight of the collagen used for fragmentation.
  • FIG. 5 is an optical micrograph of fragmented collagen resuspended in ultrapure water.
  • FIG. 5(A) shows the fragmented collagen obtained in Production Example 1.
  • FIG. 5(B) shows the fragmented collagen obtained in Production Example 2-3.
  • FIG. 5(C) shows the fragmented collagen obtained in Production Example 2-1. Although not shown, similar results were obtained with the fragmented collagen obtained in Production Example 2-2.
  • FIG. 6 shows the CD spectrum of the fragmented collagen obtained in Production Example 2-3.
  • FIG. 6 also shows the CD spectrum of gelatin (having no triple helix structure) and the CD spectrum of collagen itself (Native collagen). Although not shown, similar results were obtained for the fragmented collagen obtained in Production Examples 2-1 and 2-2.
  • FIG. 7 is an optical micrograph of fragmented collagen resuspended in ultrapure water.
  • FIG. 7(A) shows the fragmented collagen obtained in Production Example 3-1.
  • FIG. 7(B) shows the fragmented collagen obtained in Production Example 3-2.
  • FIG. 7(C) shows the fragmented collagen obtained in Production Example 3-3.
  • the structure of collagen after neutralization and collagen after neutralization-gelation was evaluated by imaging and observing with a scanning electron microscope (SEM).
  • SEM scanning electron microscope
  • FIG. 8 is a photograph taken with a scanning electron microscope of collagen after neutralization and after neutralization-gelation.
  • FIGS. 8(A) and (C) are photographs of collagen after neutralization and gelation, taken at magnifications of 500 and 2000, respectively.
  • FIGS. 8(B) and (D) are photographs of neutralized collagen taken at magnifications of 500 and 2000, respectively. No significant difference was observed in the structures of collagen after neutralization and collagen after neutralization-gelation. It is thought that neutralization of the collagen solution changes the structure of the collagen molecules, thereby exhibiting the effect of the present invention that the redispersibility is excellent.
  • NHDF Human normal skin fibroblasts
  • HAVEC human umbilical vein endothelial cells
  • the inserts were transferred to a 6-well culture plate and mixed with EGM (registered trademark)-2MV Bullet Kit (registered trademark) (CC-3202, manufactured by Lonza Co., Ltd.) and DMEM medium containing 10% serum at a ratio of 1:1. Cultured for 7 days. After culturing, the cells were fixed overnight at room temperature with 4% paraformaldehyde/phosphate buffer, and after embedding in paraffin, sliced specimens were HE-stained and CD31-stained. For the fragmented collagen (dried body) obtained in Comparative Production Example 1, a cell structure was prepared by the same procedure as described above, and HE-stained.
  • FIG. 10 is a photograph of a cell structure stained with hematoxylin and eosin (HE) (FIGS. 10 (A) and (C)) or immunostained with CD31 (FIG. 10 (B)).
  • 10(A) and (B) are cell structures produced using the fragmented collagen obtained in Production Example 1.
  • FIG. 10(C) shows a cell structure produced using the fragmented collagen obtained in Comparative Production Example 1.
  • FIG. 10 As shown in FIG. 10, the cell structure produced using the fragmented collagen obtained in Production Example 1 was produced using the fragmented collagen obtained in Comparative Production Example 1, although some collagen aggregation was observed. Almost the same tissue as the cell structure (conventional method) was constructed (FIGS. 10(A) and (C)).
  • the cell structure prepared using the fragmented collagen obtained in Production Example 1 showed no noticeable cell death, and CD31 staining revealed that blood vessels with a tubular structure were also constructed. (Fig. 10(B)).
  • Production Example 5-1 A neutralizing solution was prepared by mixing equal parts of 10 ⁇ PBS and 0.05N NaOH. To 17 mL of collagen solution on ice, 4.25 mL of neutralizing solution was added all at once and the collagen solution was harmonized by pipetting quickly with a pipette. The neutralized collagen solution was incubated at 37°C for 2 hours to gel. The resulting gel was frozen in liquid nitrogen and then freeze-dried for at least 48 hours to obtain a dry collagen solid (mass containing collagen) subjected to a freeze-drying treatment after gelation.
  • Reference example 3 10 ⁇ PBS (manufactured by Nacalai Tesque Co., Ltd.) and 0.05N NaOH aqueous solution were mixed in equal amounts to prepare a neutralization solution.
  • the neutralizing solution is added at once to 17 mL of the collagen solution (pig skin-derived collagen I solution, manufactured by Nippi Co., Ltd., PSC-1-200-100), and pipetted quickly using a pipette. This neutralized the collagen solution.
  • the pH of the collagen solution after neutralization was 7.
  • the neutralized collagen solution was incubated at 37° C. for 2 hours to gel. After freezing the resulting gel in liquid nitrogen, the solvent was removed by freeze-drying to obtain a dry collagen solid (mass containing collagen).
  • the cell-containing solution was dispensed into 24-well inserts (Corning/#3470) in prescribed amounts, and the plate was centrifuged at 1,100 xg for 15 minutes.
  • the inserts were transferred to a 6-well culture plate and the cells were cultured for 7 days in a 1:1 mixture of EGM TM -2MV BulletKit TM and DMEM with 10% serum.
  • the tissue body obtained by the culture was fixed overnight at room temperature with 4% paraformaldehyde/phosphate buffer, and after embedding in paraffin, a sliced specimen was stained with hematoxylin/eosin (HE staining).
  • FIG. 12 is a photograph of the fragmented collagen of Production Example 5-4 taken with a phase-contrast microscope. Fragmentation (microfiber formation) of collagen was also confirmed from the phase-contrast micrograph (Fig. 12).
  • fragmented collagen In the production of fragmented collagen, after fragmenting collagen in a solution containing ethanol, freeze-drying is performed without replacing the liquid component with ultrapure water to obtain fragmented collagen (Reference Example 3 ), the dried fragmented collagen is hard and requires pipetting for about 5 minutes to redisperse it.In addition, when the ethanol concentration of the solution when fragmenting collagen increases, drying is required to obtain a dried fragment. There was a drawback that the time was very long (about two weeks). On the other hand, the method of obtaining fragmented collagen by fragmenting collagen in a solution containing ethanol, replacing the liquid component with ultrapure water, and then subjecting it to freeze-drying does not have such drawbacks.
  • FIG. 13 shows measurement results of CD spectra of gelatin, raw material collagen (non-fragmented collagen, Native Collagen), and fragmented collagen of Production Example 5-4.
  • FIG. 14 shows measurement results of CD spectra of gelatin, raw material collagen (Native Collagen), and fragmented collagen of Production Example and Comparative Production Example.
  • FIG. 15 shows the fragmented collagen obtained by the method of Production Example 5-1 (Example) or the fragmented collagen obtained by the method of Reference Example 3 (Reference Example), and stained with hematoxylin and eosin (HE). , or CD31 immunostained cell structures.
  • the fragmented collagen of Production Example was organized without dissolving even when replaced with a medium in which cells were suspended.
  • the fragmented collagen of Production Example 5-5 which was fibrillated using a homogenizer in ethanol, has the property that it does not dissolve easily even if the liquid component is replaced with ultrapure water after fragmentation. Further defibration by sound waves could be performed.
  • FIG. 16 shows a micrograph of the fragmented collagen of Production Example 5-5. As shown in FIG. 16, the fibers are disentangled before being ultrasonically crushed, but the individual fibers themselves are entangled. It was confirmed that the fibers after ultrasonic crushing were dispersed one by one in the liquid, although there was not much difference in length between them.
  • FIG. 17 is a photograph of a cell structure produced using the fragmented collagen of Production Example 5-5 and stained with hematoxylin and eosin (HE) or immunostained with CD31. Before sonication, collagen clumps can be seen (circles) and the distribution of cells is uneven, but after sonication, no collagen clumps can be seen, and the cells are evenly distributed. state was shown.
  • HE hematoxylin and eosin
  • Fig. 18 shows photographs of collagen defibrated using various polar organic solvents. Fiber formation was possible even when a polar organic solvent other than ethanol was used.
  • ANS-8 Mg magnesium (II) 8-anilino-1-naphthalenesulfonate) (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd., product code: A5353) was dissolved in 1 ⁇ PBS to 20 ⁇ M, and the ANS-Mg aqueous solution was prepared. prepared. 200 ⁇ L of the ANS-Mg aqueous solution was added to 500 ⁇ L of the collagen solution, and the mixture was allowed to react at room temperature (25° C.) with the light shielded for one hour. Using the resulting reaction solution, the spectrum of the sample was measured with a spectrophotometer (Nanodrop 3300/ThermoFischer scientific) at a wavelength of 380 nm.
  • FIG. 19 shows the measurement results of the spectrum.
  • “New Method CMF” indicates the measurement results when using the fragmented collagen of Production Example 5-4
  • “Normal CMF” indicates the measurement results when using the fragmented collagen of Reference Example 3.
  • “Native collagen” indicates the measurement results when a lyophilized solution of collagen was used.

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Abstract

本発明の一側面は、断片化細胞外マトリックス成分の製造方法であって、細胞外マトリックス成分が溶解した溶液を中和する工程と、中和する工程の後、凍結乾燥処理により溶媒を除去して、細胞外マトリックス成分を含む塊を得る工程と、塊を極性有機溶媒を含む溶液中に分散させ、当該溶液中で細胞外マトリックス成分を断片化し、断片化細胞外マトリックス成分を含む液体を得る工程と、断片化細胞外マトリックス成分を含む液体から液体成分を除去する工程と、を備える、製造方法に関する。

Description

断片化細胞外マトリックス成分の製造方法
　本発明は、断片化細胞外マトリックス成分の製造方法に関する。本発明はまた、断片化細胞外マトリックス成分、及びそれを用いた細胞構造体の製造方法にも関する。
　生体外で生体組織を模した細胞構造体を作製する技術が知られている。細胞構造体を得る際の細胞培養手法として、コラーゲン等の細胞外マトリックス成分の存在下で細胞を培養することが一般的に行われている。
　また、コラーゲン等の細胞外マトリックス成分の濃度を生体組織に近い濃度にまで高めた細胞構造体を得ることができる手法として、断片化細胞外マトリックス成分を使用する方法が知られている。例えば、特許文献１には、断片化コラーゲンを含む、三次元組織体の形成剤であって、断片化コラーゲンの平均長が１００ｎｍ～２００μｍであり、断片化コラーゲンの平均径が５０ｎｍ～３０μｍである、三次元組織体の形成剤が開示されている。
国際公開第２０１８／１４３２８６号
　従来の断片化細胞外マトリックス成分は、凍結乾燥したコラーゲン等の細胞外マトリックス成分を緩衝液に分散させ、次いでホモジナイザー等でホモジナイズすることで得ていた。一方、得られた断片化細胞外マトリックス成分を保存のため再度凍結乾燥等により乾燥すると、水溶液中に容易に再分散できなくなるという問題があった。このため、従来は、断片化細胞外マトリックス成分を用時調製する必要があった。また、用時調製の際、緩衝液中にコラーゲン等の細胞外マトリックス成分が一部溶解することで、収率が低下するという問題もあった。
　本発明は、乾燥状態で保存しても再分散性に優れる断片化細胞外マトリックス成分を得ることができると共に、従来よりも収率が向上した断片化細胞外マトリックス成分の製造方法を提供することを目的とする。本発明はまた、乾燥状態で保存しても再分散性に優れる断片化細胞外マトリックス成分を提供すること、当該断片化細胞外マトリックス成分を用いた細胞構造体の製造方法を提供することも目的とする。
　本発明は、例えば、以下の各発明に関する。
［１］断片化細胞外マトリックス成分の製造方法であって、
　細胞外マトリックス成分が溶解した溶液を中和する工程と、
　上記中和する工程の後、凍結乾燥処理により溶媒を除去して、細胞外マトリックス成分を含む塊を得る工程と、
　上記塊を極性有機溶媒を含む溶液中に分散させ、当該溶液中で細胞外マトリックス成分を断片化し、断片化細胞外マトリックス成分を含む液体を得る工程と、
　上記断片化細胞外マトリックス成分を含む液体から液体成分を除去する工程と、を備える、製造方法。
［２］上記液体を得る工程の後、かつ上記液体成分を除去する工程の前に、上記液体を得る工程で得られた上記液体中の液体成分を水に置換する工程を更に備え、上記液体成分を除去する工程において、前記断片化細胞外マトリックス成分を含む液体から凍結乾燥処理により液体成分を除去する、［１］に記載の製造方法。
［３］上記水に置換する工程の後、かつ上記液体成分を除去する工程の前に、上記断片化細胞外マトリックス成分を含む液体に超音波破砕処理を行う工程を更に備える、［２］に記載の製造方法
［４］上記中和する工程の後、かつ上記塊を得る工程の前に、中和した上記溶液をゲル化する工程を更に備える、［１］～［３］のいずれかに記載の製造方法。
［５］上記塊が多孔質体である、［４］に記載の製造方法。
［６］上記断片化することが、細胞外マトリックス成分を解繊することを含む、［１］～［５］のいずれかに記載の製造方法。
［７］上記極性有機溶媒を含む溶液中の上記極性溶媒の濃度が、２０ｖ／ｖ％以上１００ｖ／ｖ％以下である、［１］～［６］のいずれかに記載の製造方法。
［８］上記極性有機溶媒がエタノールを含む、［１］～［７］のいずれかに記載の製造方法。
［９］上記液体成分を除去する工程で得られた固形物を水性媒体に分散させる工程を更に備える、［１］～［８］のいずれかに記載の製造方法。
［１０］上記細胞外マトリックス成分がコラーゲンである、［１］～［９］のいずれかに記載の製造方法。
［１１］上記断片化細胞外マトリックス成分がコラーゲンに特有の三重らせん構造を有する、［１０］に記載の製造方法。
［１２］［１］～［１１］のいずれかに記載の製造方法により得られた断片化細胞外マトリックス成分と、細胞を混合する工程と、
　上記混合する工程で得られた混合物をインキュベートする工程と、
　を含む、細胞構造体の製造方法。
［１３］平均径が０．０８μｍ以上２．０μｍ以下である繊維状の細胞外マトリックス成分が積層されている、断片化細胞外マトリックス成分の乾燥体。
［１４］切片標本を作製し、上記切片標本の長辺１８２０μｍかつ短辺１３６５μｍの長方形領域を顕微鏡によって観察して取得される観察画像において、細胞外マトリックス成分が存在する領域の面積が、上記観察画像の面積に対して４０％以上１００％以下である、［１３］に記載の断片化細胞外マトリックス成分の乾燥体。
［１５］上記断片化細胞外マトリックス成分が断片化コラーゲンである、［１３］又は［１４］に記載の断片化細胞外マトリックス成分の乾燥体。
［１６］
　１，８－アニリノナフタレンスルホン酸（ＡＮＳ）を使用した蛍光強度測定で、波長４００ｎｍ以上５５０ｎｍ以下の範囲内にピークを有する、断片化細胞外マトリックス成分。
　本発明によれば、乾燥状態で保存しても再分散性に優れる断片化細胞外マトリックス成分を得ることができると共に、従来よりも収率が向上した断片化細胞外マトリックス成分の製造方法を提供することができる。本発明によればまた、乾燥状態で保存しても再分散性に優れる断片化細胞外マトリックス成分を提供すること、当該断片化細胞外マトリックス成分を用いた細胞構造体の製造方法を提供することができる。
超純水に再懸濁させた断片化コラーゲンの光学顕微鏡写真である。図１（Ａ）は、製造例１で得た断片化コラーゲンである。図１（Ｂ）は、比較製造例１で得た断片化コラーゲンである。 製造例１で得た断片化コラーゲンのＣＤスペクトルである。 ヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色した断片化コラーゲンの写真である。図３（Ａ）及び（Ｃ）は、比較製造例１で得た断片化コラーゲンをそれぞれ１０倍及び４０倍の倍率で撮像した写真である。図３（Ｂ）及び（Ｄ）は、製造例１で得た断片化コラーゲンをそれぞれ１０倍及び４０倍の倍率で撮像した写真である。 断片化コラーゲンの走査型電子顕微鏡で撮像した写真である。図４（Ａ）及び（Ｂ）は、比較製造例１で得た断片化コラーゲンをそれぞれ２０００倍及び３３００倍の倍率で撮像した写真である。図４（Ｃ）及び（Ｄ）は、製造例１で得た断片化コラーゲンをそれぞれ２０００倍及び３３００倍の倍率で撮像した写真である。 超純水に再懸濁させた断片化コラーゲンの光学顕微鏡写真である。図５（Ａ）は、製造例１で得た断片化コラーゲンである。図５（Ｂ）は、製造例２－３で得た断片化コラーゲンである。図５（Ｃ）は、製造例２－１で得た断片化コラーゲンである。 製造例２－３で得た断片化コラーゲンのＣＤスペクトルである。 超純水に再懸濁させた断片化コラーゲンの光学顕微鏡写真である。図７（Ａ）は、製造例３－１で得た断片化コラーゲンである。図７（Ｂ）は、製造例３－２で得た断片化コラーゲンである。図７（Ｃ）は、製造例３－３で得た断片化コラーゲンである。 中和後及び中和－ゲル化後のコラーゲンの走査型電子顕微鏡で撮像した写真である。図８（Ａ）及び（Ｃ）は、中和－ゲル化後のコラーゲンをそれぞれ５００倍及び２０００倍の倍率で撮像した写真である。図８（Ｂ）及び（Ｄ）は、中和後のコラーゲンをそれぞれ５００倍及び２０００倍の倍率で撮像した写真である。 ゲル化したコラーゲン溶液の写真である。 ヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色（図１０（Ａ）及び（Ｃ））、又はＣＤ３１による免疫染色（図１０（Ｂ））した細胞構造体の写真である。図１０（Ａ）及び（Ｂ）は、製造例１で得た断片化コラーゲンを使用して作製した細胞構造体である。図１０（Ｃ）は、比較製造例１で得た断片化コラーゲンを使用して作製した細胞構造体である。 ピペッティング操作により分散させた断片化コラーゲンの写真である。 再分散させた断片化コラーゲンの位相差顕微鏡写真である。 ゼラチン、原料のコラーゲン（Ｎａｔｉｖｅ　Ｃｏｌｌａｇｅｎ）及び製造例５－４の方法で得た断片化コラーゲンのＣＤスペクトルである。 ゼラチン、原料のコラーゲン（Ｎａｔｉｖｅ　Ｃｏｌｌａｇｅｎ）及び製造例５－１～５－５の方法で得た断片化コラーゲンのＣＤスペクトルである。 断片化コラーゲンを用いて作製された細胞構造体をヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色及びＣＤ３１染色した切片像を示す写真である。 超音波解繊の有無が断片化コラーゲンに及ぼす影響の評価結果を示す位相差顕微鏡写真である。 超音波解繊の有無が断片化コラーゲンに及ぼす影響の評価結果を示す細胞構造体の切片像を示す写真である。 極性有機溶媒として、アセトン、アセトニトリル及びジエチルエーテルを用いて作製した断片化コラーゲンの観察結果を示す顕微鏡写真である。 疎水性の評価結果を示すグラフである。
　以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。但し、本発明は、以下の実施形態に限定されるものではない。
〔断片化細胞外マトリックス成分の製造方法〕
　本実施形態に係る断片化細胞外マトリックス成分の製造方法は、細胞外マトリックス成分が溶解した溶液を中和する工程（中和工程）と、中和する工程の後、凍結乾燥処理により溶媒を除去して、細胞外マトリックス成分を含む塊を得る工程（溶媒除去工程）と、塊を極性有機溶媒を含む溶液中に分散させ、当該溶液中で細胞外マトリックス成分を断片化し、断片化細胞外マトリックス成分を含む液体を得る工程（断片化工程）と、断片化細胞外マトリックス成分を含む液体から液体成分を除去する工程（乾燥工程）と、を備える。
　本実施形態に係る断片化細胞外マトリックス成分の製造方法は、上述した各工程に加え、中和工程の後、かつ溶媒除去工程の前に、中和した溶液をゲル化する工程（ゲル化工程）を更に備えていてもよい。
　本実施形態に係る断片化細胞外マトリックス成分の製造方法は、上述した各工程に加え、断片化工程の後、かつ乾燥工程の前に、断片化工程で得られた液体中の液体成分を水に置換する工程（置換工程）を更に備えていてもよい。
　本実施形態に係る断片化細胞外マトリックス成分の製造方法は、上述した各工程に加え、置換工程の後、かつ乾燥工程の前に、断片化細胞外マトリックス成分を含む液体に超音波破砕処理を行う工程（超音波破砕工程）を更に備えていてもよい。
　本実施形態に係る断片化細胞外マトリックス成分の製造方法は、上述した各工程に加え、乾燥工程で得られた固形物を水性媒体に分散させる工程（洗浄工程）を更に備えていてもよい。
（中和工程）
　中和工程は、細胞外マトリックス成分が溶解した溶液を中和する工程である。中和することにより、細胞外マトリックスの構造が変化するため、後の工程と併せて実施することで、乾燥状態で保存しても再分散性に優れる断片化細胞外マトリックス成分を得ることができるようになる。
　本明細書において「細胞外マトリックス成分」とは、複数の細胞外マトリックス分子（単に「細胞外マトリックス」ともいう。）によって形成されている細胞外マトリックス分子の集合体である。細胞外マトリックスとは、生物において細胞の外に存在する物質を意味する。細胞外マトリックスとしては、細胞の生育及び細胞集合体の形成に悪影響を及ぼさない限り、任意の物質を用いることができる。細胞外マトリックスの具体例としては、コラーゲン、エラスチン、プロテオグリカン、フィブロネクチン、ヒアルロン酸、ラミニン、ビトロネクチン、テネイシン、エンタクチン及びフィブリリン等が挙げられるが、これらに限定されない。細胞外マトリックス成分は、細胞外マトリックスを１種単独で含んでいてもよく、２種以上を組み合わせて含んでいてもよい。
　細胞外マトリックスは、細胞の生育及び細胞集合体の形成に悪影響を及ぼさない限り、上述の細胞外マトリックスの改変体及びバリアントであってもよく、化学合成ペプチド等のポリペプチドであってもよい。細胞外マトリックスは、コラーゲンに特徴的なＧｌｙ－Ｘ－Ｙで表される配列の繰り返しを有するものであってよい。ここで、Ｇｌｙはグリシン残基を表し、Ｘ及びＹはそれぞれ独立に任意のアミノ酸残基を表す。複数のＧｌｙ－Ｘ－Ｙは、それぞれ同一であっても異なっていてもよい。Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙで示される配列の繰り返しを有することによって、分子鎖の配置への束縛が少なくなるため、例えば、細胞培養の際の足場材料としての機能がより一層優れたものとなる。Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙで示される配列の繰り返しを有する細胞外マトリックスにおいて、Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙで示される配列の割合は、全アミノ酸配列のうち、８０％以上であってよく、好ましくは９５％以上である。また、細胞外マトリックスは、ＲＧＤ配列を有するポリペプチドであってもよい。ＲＧＤ配列とは、Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ（アルギニン残基－グリシン残基－アスパラギン酸残基）で表される配列をいう。ＲＧＤ配列を有することによって、細胞接着がより一層促進されるため、例えば、細胞培養の際の足場材料としてより一層好適なものとなる。Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙで表される配列と、ＲＧＤ配列とを含む細胞外マトリックスとしては、コラーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、カドヘリン等が挙げられる。
　コラーゲンとしては、例えば、繊維性コラーゲン及び非繊維性コラーゲンが挙げられる。繊維性コラーゲンとは、コラーゲン繊維の主成分となるコラーゲンを意味し、具体的には、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン等が挙げられる。非繊維性コラーゲンとしては、例えば、ＩＶ型コラーゲンが挙げられる。
　プロテオグリカンとして、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、ケラタン硫酸プロテオグリカン、デルマタン硫酸プロテオグリカンが挙げられるが、これらに限定されない。
　細胞外マトリックス成分は、コラーゲン、ラミニン及びフィブロネクチンからなる群より選択される少なくとも１種を含んでいてよく、コラーゲンを含むことが好ましい。コラーゲンは好ましくは繊維性コラーゲンであり、より好ましくはＩ型コラーゲンである。繊維性コラーゲンは、市販されているコラーゲンを用いてもよく、その具体例としては、日本ハム株式会社製のブタ皮膚由来Ｉ型コラーゲンが挙げられる。
　細胞外マトリックス成分は、動物由来の細胞外マトリックス成分であってよい。細胞外マトリックス成分の由来となる動物種として、例えば、ヒト、ブタ、ウシ等が挙げられるが、これらに限定されない。細胞外マトリックス成分は、一種類の動物に由来する成分を用いてもよいし、複数種の動物に由来する成分を併用して用いてもよい。
　細胞外マトリックス成分が溶解した溶液の溶媒としては、細胞外マトリックス成分を溶解可能であれば特に制限されない。溶媒の具体例としては、例えば、水、緩衝液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、トリス塩酸緩衝液（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ））が挙げられる。
　細胞外マトリックス成分が溶解した溶液中の細胞外マトリックス成分の濃度は、特に制限されるものではないが、例えば、１ｍｇ／ｍＬ以上５０ｍｇ／ｍＬ以下であってよい。
　細胞外マトリックス成分が溶解した溶液は通常酸性であるため、中和工程は、例えば、細胞外マトリックス成分が溶解した溶液にアルカリ性の溶液を加えることで実施することができる。アルカリ性の溶液に特に制限はないが、例えば、アルカリ金属の水酸化物、アルカリ土類金属の水酸化物等を水に溶解させた溶液を好適に用いることができる。アルカリ性の溶液として、より具体的には、例えば、水酸化カリウム（ＫＯＨ）水溶液、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）水溶液等が挙げられる。
　細胞外マトリックス成分が溶解した溶液がアルカリ性の場合、中和工程は、例えば、細胞外マトリックス成分が溶解した溶液に酸性の溶液を加えることで実施することができる。酸性の溶液に特に制限はないが、例えば、塩酸溶液、硫酸溶液、酢酸溶液、炭酸溶液等が挙げられる。
　中和は、細胞外マトリックスの構造変化が生じるように実施すればよく、中和後の溶液のｐＨが７になるように実施する必要はない。中和後の溶液のｐＨは、具体的には例えば、６以上８以下の範囲内であってよく、６．５以上７．５以下の範囲内であることが好ましく、６．９以上７．１以下の範囲内であることがより好ましく、６．９５以上７．０５以下の範囲内であることが更に好ましい。
（ゲル化工程）
　ゲル化工程は、中和工程の後、かつ溶媒除去工程の前に、中和した溶液をゲル化する工程である。ゲル化工程は、必要に応じて実施すればよい。
　ゲル化工程は、例えば、中和した溶液を加温することでゲル化することにより実施することができる。加温する際の温度及び加温時間は、細胞外マトリックス成分の種類、濃度等に応じて適宜設定することができるが、例えば、加温する際の温度２５～４５℃、加温時間１～３時間を例示することができる。
　ゲル化工程を実施することで、形成されたゲルが一様であるか否かを目視判定することにより、中和工程で溶液が一様に中和されたか否かを確認することができる。また、ゲル化工程を実施することで、溶媒除去工程で得られる細胞外マトリックス成分を含む塊が多孔質体となり、断片化工程における断片化をより効率よく実施することができる。
（溶媒除去工程）
　溶媒除去工程は、中和工程の後（ゲル化工程を含む場合は、ゲル化工程の後）、凍結乾燥処理により溶媒を除去して、細胞外マトリックス成分を含む塊を得る工程である。
　中和後の溶液、又はゲル化後のゲルの凍結乾燥処理は、常法に従って実施することができる。溶媒除去工程により、溶媒が除去され、細胞外マトリックス成分を含む塊（固体）が得られる。なお、溶媒が除去されるとは、細胞外マトリックス成分を含む塊（固体）に一切の溶媒が付着していないことを意味するものではなく、一般的な凍結乾燥処理により、常識的に達することができる程度に溶媒が付着していないことを意味する。
（断片化工程）
　断片化工程は、溶媒除去工程で得られた塊を極性有機溶媒を含む溶液中に分散させ、当該溶液中で細胞外マトリックス成分を断片化し、断片化細胞外マトリックス成分を含む液体を得る工程である。
　極性有機溶媒を含む溶液中で断片化することで、乾燥状態で保存しても再分散性に優れる断片化細胞外マトリックス成分が得られると共に、細胞外マトリックス成分が溶液に溶解することを抑制することができ、従来法と比べて収率がより向上する。
　更に、極性有機溶媒を含む溶液中で断片化することで、その後の工程で液体成分を水に置換しても容易に溶解しない断片化細胞外マトリックス成分を得ることができる。
　極性有機溶媒は、極性を有する有機溶媒であれば特に制限されず、例えば、メタノール、エタノール、ｎ－プロパノール、イソプロパノール等のアルコール、アセトン、アセトニトリル及びジエチルエーテル等が挙げられる。
　極性有機溶媒を含む溶液中の極性有機溶媒の濃度としては、特に制限されるものではないが、上述した効果をより顕著に発揮できる観点から、２０ｖ／ｖ％以上１００ｖ／ｖ％以下であることが好ましい。極性有機溶媒を含む溶液中の極性有機溶媒の濃度は、例えば、２０ｖ／ｖ％以上５０ｖ／ｖ％以下であってよく、２０ｖ／ｖ％以上４０ｖ／ｖ％以下であってよく、２０ｖ／ｖ％以上３０ｖ／ｖ％以下であってよい。極性有機溶媒を含む溶液中の極性有機溶媒の濃度は、例えば、５０ｖ／ｖ％以上１００ｖ／ｖ％以下、５０ｖ／ｖ％以上９０ｖ／ｖ％以下、又は５０ｖ／ｖ％以上８０ｖ／ｖ％以下であってよく、６０ｖ／ｖ％以上１００ｖ／ｖ％以下、６０ｖ／ｖ％以上９０ｖ／ｖ％以下、又は６０ｖ／ｖ％以上８０ｖ／ｖ％以下であってよい。
　本明細書において、「断片化」とは、細胞外マトリックス分子の集合体をより小さなサイズにすることを意味する。断片化は、細胞外マトリックス分子内の結合を切断する条件で行われてもよいし、細胞外マトリックス分子内の結合を切断しない条件で行われてもよい。物理的な力の印加によって断片化された細胞外マトリックスは、酵素処理とは異なり、通常、分子構造は断片化する前とは変化しない（分子構造は維持されている）。断片化細胞外マトリックス成分は、上述の細胞外マトリックス成分を物理的な力の印加により解繊した成分である、解繊された細胞外マトリックス成分（解繊細胞外マトリックス成分）を含んでいてよい。解繊は、断片化の一態様であり、例えば、細胞外マトリックス分子内の結合を切断しない条件で行われるものである。
　本実施形態に係る断片化細胞外マトリックス成分の製造方法において、断片化工程は、溶媒除去工程で得られた塊を極性有機溶媒を含む溶液中に分散させ、当該溶液中で細胞外マトリックス成分を解繊し、解繊細胞外マトリックス成分を含む液体を得る工程（解繊工程）として構成されていてもよい。
　細胞外マトリックス成分を断片化する方法としては、特に制限はなく、物理的な力の印加によって断片化してよい。細胞外マトリックス成分を断片化する方法としては、例えば、超音波式ホモジナイザー、撹拌式ホモジナイザー、及び高圧式ホモジナイザー等のホモジナイザーを用いて、物理的な力の印加によって細胞外マトリックス成分を断片化してもよい。ホモジナイズする時間、回数等を調整することでミリメートルサイズ、ナノメートルサイズの断片化細胞外マトリックス成分を得ることも可能である。
　細胞外マトリックス成分を断片化するためのより具体的な条件として、例えば、ホモジナイザー（アズワン社製，ＶＨ－１０）を使用し、２０，０００ｒｐｍ～３０，０００ｒｐｍで３～１０分間処理する条件、又はこれに相当する物理的な力を印可できる条件を挙げることができる。
　断片化細胞外マトリックス成分は、解繊された細胞外マトリックス成分を少なくとも一部に含んでいてよい。また、断片化細胞外マトリックス成分は、解繊された細胞外マトリックス成分のみからなっていてもよい。すなわち、断片化細胞外マトリックス成分は、解繊された細胞外マトリックス成分であってよい。解繊された細胞外マトリックス成分は、解繊されたコラーゲン（解繊コラーゲン）を含むことが好ましい。解繊コラーゲンは、コラーゲンに由来する三重らせん構造を維持していることが好ましい。解繊コラーゲンは、コラーゲンに由来する三重らせん構造を部分的に維持しているものであってよい。
　断片化細胞外マトリックス成分の形状としては、例えば、繊維状が挙げられる。繊維状とは、糸状の細胞外マトリックス成分で構成される形状、又は糸状の細胞外マトリックス成分が分子間で架橋して構成される形状を意味する。断片化細胞外マトリックス成分の少なくとも一部は、繊維状であってよい。繊維状の細胞外マトリックス成分には、複数の糸状細胞外マトリックス分子が集合して形成された細い糸状物（細繊維）、細繊維が更に集合して形成される糸状物、これらの糸状物を解繊したもの等が含まれる。繊維状の細胞外マトリックス成分ではＲＧＤ配列が破壊されることなく保存されている。
　断片化細胞外マトリックス成分の平均長は、１００ｎｍ以上４００μｍ以下であってよく、１００ｎｍ以上２００μｍ以下であってよい。一実施形態において、断片化細胞外マトリックス成分の平均長は、５μｍ以上４００μｍ以下であってよく、１０μｍ以上４００μｍ以下であってよく、２２μｍ以上４００μｍ以下であってよく、１００μｍ以上４００μｍ以下であってよい。他の実施形態において、断片化細胞外マトリックス成分の平均長は、１００μｍ以下であってよく、５０μｍ以下であってよく、３０μｍ以下であってよく、１５μｍ以下であってよく、１０μｍ以下であってよく、１μｍ以下であってよく、１００ｎｍ以上であってよい。断片化細胞外マトリックス成分全体のうち、大部分の断片化細胞外マトリックス成分の平均長が上記数値範囲内であることが好ましい。具体的には、断片化細胞外マトリックス成分全体のうち９５％の断片化細胞外マトリックス成分の平均長が上記数値範囲内であることが好ましい。
　断片化細胞外マトリックス成分の平均径は、１０ｎｍ以上１０μｍ以下であってよく、２０ｎｍ以上８μｍ以下であってよく、３０ｎｍ以上６μｍ以下であってよく、５０ｎｍ以上４μｍ以下であってよい。
　断片化細胞外マトリックス成分の平均長及び平均径は、光学顕微鏡によって個々の断片化細胞外マトリックス成分を測定し、画像解析することによって求めることが可能である。本明細書において、「平均長」は、測定した試料の長手方向の長さの平均値を意味し、「平均径」は、測定した試料の長手方向に直交する方向の長さの平均値を意味する。
　断片化工程を経ることで、断片化細胞外マトリックス成分を含む液体を得ることができる。当該液体は、断片化細胞外マトリックス成分に加え、極性有機溶媒を含む溶液等を含むものである。
（置換工程）
　置換工程は、断片化工程の後、かつ乾燥工程の前に、断片化工程で得られた液体中の液体成分を水に置換する工程である。
　乾燥工程の前に、断片化工程で得られた液体中の液体成分を水に置換することで、乾燥工程を経て得られる断片化細胞外マトリックス成分が迅速に再分散可能になる。
　水としては、水道水、蒸留水、超純水等が挙げられる。
　断片化工程で得られた液体中の液体成分を水に置換する方法としては、特に制限はなく、溶媒置換の際に実施される通常の方法を用いることができる。例えば、水に置換する方法として、断片化工程で得られた液体を遠心処理し、当該液体中の断片化細胞外マトリックス成分を沈降させた後に、液体成分を除去し、次いで、断片化細胞外マトリックス成分に水を加える方法が挙げられる。なお、液体成分を水に置換するとは、液体中に存在する液体成分すべてが水に置換することを意味するものではなく、液体中の主な溶媒が水に代わることを意味し、置換後に、水以外の液体成分が微量残存していてもよい。
　置換工程を経ることで得られる液体は、断片化細胞外マトリックス成分に加え、水を含むものである。
（超音波破砕工程）
　超音波破砕工程は、断片化工程で得られた液体に超音波破砕処理を行う工程である。超音波破砕工程は、必要に応じて実施すればよい。超音波破砕工程を経ることで、より均一に分散され、組織化に用いる際により凝集が起こりにくい断片化細胞外マトリックス成分を得ることができる。超音波破砕処理には、冷却しながら断片化細胞外マトリックス成分を破砕できるため、断片化細胞外マトリックス成分が熱変性する可能性が低い、及び、大規模な設備が必要ないという利点がある。
　超音波破砕工程は、超音波破砕機を用いて実施することができる。超音波破砕機としては、例えば、ビーエム機器株式会社製ＢＩＯＲＵＰＴＯＲＩＩ等の全自動超音波破砕機を用いることができる。
　超音波破砕処理は、断片化工程で得られた液体に対する超音波の照射と、当該液体の冷却とを繰り返すことによって実施してよい。超音波破砕処理は、例えば、超音波周波数２０ｋＨｚの条件で、１０～３０秒間の超音波照射と、２０～４０秒間の冷却とを５０～１５０回繰り返すことによって実施してよい。
　極性有機溶媒を含む溶液中で断片化することを含まない従来法では、冷却しながら、超音波破砕処理を行うと、断片化細胞外マトリックス成分が溶解してしまうことがある。そのため、超音波破砕処理によって微細な断片化細胞外マトリックス成分を得るためには、例えば、断片化細胞外マトリックス成分又はその前駆体に対して熱架橋処理を行い、超音波破砕中における溶解を防ぐ必要があった。しかし、熱架橋処理によって断片化細胞外マトリックス成分は変性する可能性があり、変性した断片化細胞外マトリックス成分を用いて得られる組織は生体組織と大きく異なる場合がある。極性有機溶媒を含む溶液中で断片化することで得られる断片化細胞外マトリックス成分は、液体成分を水に置換しても容易に溶解しないものであるため、上記断片化工程及び上記置換工程を経て得られる断片化細胞外マトリックス成分は、断片化細胞外マトリックス成分が変性し得る処理を行うことなく、超音波破砕処理を実施することができ、これによって、より均一に分散され、組織化に用いる際により凝集が起こりにくい断片化細胞外マトリックス成分を得ることができる。
（乾燥工程）
　乾燥工程は、断片化工程で得られた断片化細胞外マトリックス成分を含む液体から液体成分を除去する工程である。
　液体成分の除去は、例えば、風乾、凍結乾燥処理、減圧乾燥処理、減圧凍結乾燥処理等により実施することができる。液体成分の除去は、風乾又は凍結乾燥処理により実施されてよい。乾燥状態で保存しても再分散性に優れる断片化細胞外マトリックス成分を得やすくなることから、液体成分の除去は、風乾により実施することが好ましい。
　乾燥工程により、液体成分が除去され、断片化細胞外マトリックス成分の乾燥体を含む固形物が得られる。なお、液体成分が除去されるとは、断片化細胞外マトリックス成分の乾燥体を含む固形物に一切の液体成分が付着していないことを意味するものではなく、上述の一般的な乾燥手法により、常識的に達することができる程度に液体成分が付着していないことを意味する。
（洗浄工程）
　洗浄工程は、乾燥工程で得られた固形物を水性媒体に分散させる工程である。洗浄工程は、必要に応じて実施すればよい。洗浄工程により、断片化細胞外マトリックス成分を含む固形物から不要な成分（例えば、塩等）が除去され、より純度の高い断片化細胞外マトリクス成分を得ることができる。
　洗浄工程で用いられる水性媒体は、断片化細胞外マトリックス成分を分散させることができ、かつ上述の不要な成分を溶解可能なものが好ましい。水性媒体の具体例としては、例えば、水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）及びトリス緩衝液（Ｔｒｉｓ）等が挙げられる。
　本実施形態に係る断片化細胞外マトリックス成分の製造方法により、従来法よりも高い収率で、断片化細胞外マトリックス成分の乾燥体が得られる。得られた断片化細胞外マトリックス成分の乾燥体は、再分散性に優れており、例えば、任意の溶媒を加えてピペッティング操作を行うことにより容易に再分散させることができる。
　一実施形態に係る断片化細胞外マトリックス成分の製造方法は、中和工程と、溶媒除去工程と、断片化工程と、置換工程と、乾燥工程とを備え、乾燥工程が、置換工程で得られた液体から凍結乾燥処理により液体成分を除去する工程である方法であってよい。上記置換工程を更に含む方法により得られる断片化細胞外マトリックス成分の乾燥体は、より迅速に再分散させることができる。例えば、上記各工程とを含まない方法では、溶媒を加えてピペッティング操作を行うことによって再分散させる際に３～５分間程度要することがある。上記中和工程と、上記溶媒除去工程と、上記断片化工程と、上記置換工程と、上記乾燥工程とを含む方法により得られる断片化細胞外マトリックス成分の乾燥体は、より短い時間（例えば、約１分間）で再分散させることが可能になる。
　上記中和工程と、上記溶媒除去工程と、上記断片化工程と、上記置換工程と、上記乾燥工程とを含む方法を含む方法により得られる一実施形態の断片化細胞外マトリックス成分がより迅速に再分散可能である理由として、次に示す理由が考えられる。従来の断片化細胞外マトリックス成分は一度解繊しても親水性が高いため、凍結乾燥の段階で再度断片化細胞外マトリックス成分同士が絡み合ってしまう。一方、上記実施形態に係る断片化細胞外マトリックス成分は、疎水度が高く、断片化細胞外マトリックス成分同士が水を介して再度絡み合うことが抑制されていることから、分散しやすい状態のままで凍結乾燥させることが可能になっている。この結果として、当該断片化細胞外マトリックス成分はより迅速に再分散可能になっていると考えられる。当該断片化細胞外マトリックス成分は、断片化細胞外マトリックス成分を水で置換し、その後、凍結乾燥処理を行う過程で疎水性を獲得していると考えられる。但し、当該断片化細胞外マトリックス成分がより迅速に再分散可能である理由は、上述したものに限られない。
〔断片化細胞外マトリックス成分の乾燥体〕
　本実施形態に係る断片化細胞外マトリックス成分の乾燥体は、典型的には、上述した本実施形態に係る断片化細胞外マトリックス成分の製造方法により得ることができるものである。
　本実施形態に係る断片化細胞外マトリックス成分の乾燥体は、平均径が０．０８μｍ以上２．０μｍ以下である繊維状の細胞外マトリックス成分が積層されているものであってよい。このような構成を有していることによって、再分散性に優れたものとなる。平均径は、０．１μｍ以上１．５μｍ以下であることが好ましく、０．３μｍ以上１．０μｍ以下であることがより好ましく、０．５μｍ以上０．７μｍ以下であることが更に好ましい。
　本実施形態に係る断片化細胞外マトリックス成分の乾燥体は、切片標本を作製し、当該切片標本の長辺１８２０μｍかつ短辺１３６５μｍの長方形領域を顕微鏡によって観察して取得される観察画像において、細胞外マトリックス成分が存在する領域の面積が、観察画像の面積に対して４０％以上１００％以下であるものであってよい。このような構成を有していることによって、再分散性に優れたものとなる。上記割合は、４０％以上９５％以下、４０％以上９０％以下、４０％以上８５％以下、４０％以上８０％以下又は４０％以上７５％以下であってよく、４５％以上１００％以下、４５％以上９５％以下、４５％以上９０％以下、４５％以上８５％以下、４５％以上８０％以下、又は４５％以上７５％以下であってよく、５０％以上１００％以下、５０％以上９５％以下、５０％以上９０％以下、５０％以上８５％以下、５０％以上８０％以下、又は５０％以上７５％以下であってよく、５５％以上１００％以下、５５％以上９５％以下、５５％以上９０％以下、５５％以上８５％以下、５５％以上８０％以下、又は５５％以上７５％以下であってよく、６０％以上１００％以下、６０％以上９５％以下、６０％以上９０％以下、６０％以上８５％以下、６０％以上８０％以下、又は６０％以上７５％以下であってよく、６５％以上１００％以下、６５％以上９５％以下、６５％以上９０％以下、６５％以上８５％以下、６５％以上８０％以下、又は６５％以上７５％以下であってよい。
　本実施形態に係る断片化細胞外マトリックス成分は、１，８－アニリノナフタレンスルホン酸（ＡＮＳ）を使用した蛍光強度測定で、波長４００ｎｍ以上５５０ｎｍ以下の範囲内にピークを有する。当該断片化細胞外マトリックス成分は、上述した本実施形態に係る断片化細胞外マトリックス成分の製造方法によって好適に製造することができる。本実施形態に係る断片化細胞外マトリックス成分は、ＡＮＳを使用した蛍光強度測定で、波長４２０ｎｍ以上５００ｎｍ以下又は４２５ｎｍ以上４７５ｎｍの範囲内にピークを有していてよい。
　ＡＮＳは、疎水性プローブである。ＡＮＳを使用した蛍光強度測定によって、波長４００ｎｍ以上５５０ｎｍ以下の範囲内にピークを有する場合、断片化細胞外マトリックス成分が疎水性を有していると判断することができる。
　蛍光強度の測定試料は次に示す方法によって調製する。測定対象の断片化細胞外マトリックス成分を５ｍｇ／ｍＬの濃度になるようにリン酸緩衝生理食塩水（１×ＰＢＳ）に添加する。断片化細胞外マトリックス成分を添加した溶液を４日間冷蔵庫内で保存して、断片化細胞外マトリックスを溶解させる。これを断片化細胞外マトリックス溶液とする。８－アニリノ－１－ナフタレンスルホン酸マグネシウム（ＩＩ）（ＡＮＳ－８－Ｍｇ）を２０μＭの濃度になるようにリン酸緩衝生理食塩水（１×ＰＢＳ）に溶解する。これをＡＮＳ－Ｍｇ水溶液とする。断片化細胞外マトリックス溶液５００μＬにＡＮＳ－Ｍｇ水溶液２００μＬを加え、室温（２５℃）で遮光して一時間反応させる。得られた反応液を測定試料とする。
　蛍光強度測定は以下に示す条件で実施される。
　測定機器：分光光度計（例えば、ＮａｎｏＤｒｏｐTM　３３００　蛍光光度計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ　ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製））
　励起波長：３８０ｎｍ
　測定波長：４００～７５０ｎｍ
　本実施形態に係る断片化細胞外マトリックス成分は、１，８－アニリノナフタレンスルホン酸（ＡＮＳ）を使用した蛍光強度測定で、波長４００ｎｍ以上５５０ｎｍ以下の範囲内にピークを有するため、迅速な再分散が可能である。
　ＡＮＳを使用して測定される断片化細胞外マトリックス成分の蛍光強度は、ＡＮＳを使用して測定される断片化前の細胞外マトリックス成分の蛍光強度の２倍以上であってよい。
　ここで、ＡＮＳを使用して測定される断片化前の細胞外マトリックス成分の蛍光強度は、断片化細胞外マトリックス成分に代えて、断片化前の細胞外マトリックス成分（断片化細胞外マトリックスの原料とした細胞外マトリックス成分）を用いること以外は、同様にして測定される蛍光強度である。
〔細胞構造体の製造方法〕
　本実施形態に係る細胞構造体の製造方法は、本実施形態に係る断片化細胞外マトリックスの製造方法により得られた断片化細胞外マトリックス成分と、細胞を混合する工程（混合工程）と、混合する工程で得られた混合物をインキュベートする工程（インキュベート工程）と、を含む。
　本明細書において、「細胞構造体」とは、細胞外マトリックス成分を介して細胞が三次元的に配置されている細胞の集合体（塊状の細胞集団）であって、細胞培養によって人工的に作られる集合体を意味する。細胞構造体の形状は特に制限はなく、例えば、シート状、球体状、略球体状、楕円体状、略楕円体状、半球状、略半球状、半円状、略半円状、直方体状、略直方体状等が挙げられる。細胞構造体は、支持体と接着した状態で塊状に集合したものであってもよく、支持体と接着していない状態で塊状に集合したものであってもよい。
（混合工程）
　混合工程は、本実施形態に係る断片化細胞外マトリックスの製造方法により得られた断片化細胞外マトリックス成分と、細胞を混合する工程である。
　細胞は、特に限定されないが、例えば、ヒト、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、ブタ、ウシ、マウス、ラット等の哺乳類動物に由来する細胞であってよい。細胞の由来部位も特に限定されず、骨、筋肉、内臓、神経、脳、骨、皮膚、血液等に由来する体細胞であってもよく、生殖細胞であってもよい。さらに、細胞は、幹細胞であってもよく、また、初代培養細胞、継代培養細胞及び細胞株細胞等の培養細胞であってもよい。
　断片化細胞外マトリックス成分は、水性媒体に分散させることにより、水性媒体中で細胞と接触しやすくなり、細胞構造体の形成を促進し得る。
　混合工程では、水性媒体中において、断片化細胞外マトリックス成分と細胞とを混合して接触させる。混合工程としては、断片化細胞外マトリックス成分を含有する水性媒体と細胞を含有する水性媒体とを混合する方法、断片化細胞外マトリックス成分を含有する水性媒体に細胞を添加して混合する方法、細胞を含む培養液に断片化細胞外マトリックス成分を含有する水性媒体を加えて混合する方法、予め用意した水性媒体に、断片化細胞外マトリックス成分及び細胞をそれぞれ加えて混合する方法等の方法が挙げられるが、これらに限られるものではない。
　混合工程における断片化細胞外マトリックス成分の濃度は、目的とする細胞構造体の形状、厚さ、培養器のサイズ等に応じて適宜決定できる。例えば、混合工程における水性媒体中の断片化細胞外マトリックス成分の濃度は、０．１～９０質量％であってもよく、１～３０質量％であってもよい。
　混合工程における断片化細胞外マトリックス成分の量は、例えば、１．０×１０６個の細胞に対して、０．１～１００ｍｇ、０．５～５０ｍｇ、０．８～２５ｍｇ、１．０～１０ｍｇ、１．０～５．０ｍｇ、１．０～２．０ｍｇ、又は１．０～１．８ｍｇであってよく、０．７ｍｇ以上、１．１ｍｇ以上、１．２ｍｇ以上、１．３ｍｇ以上又は１．４ｍｇ以上であってよく、７．０ｍｇ以下、３．０ｍｇ以下、２．３ｍｇ以下、１．８ｍｇ以下、１．７ｍｇ以下、１．６ｍｇ以下又は１．５ｍｇ以下であってもよい。
　混合工程において、断片化細胞外マトリックス成分と細胞との質量比（断片化細胞外マトリックス成分／細胞）は、１／１～１０００／１であることが好ましく、９／１～９００／１であることがより好ましく、１０／１～５００／１であることがさらに好ましい。
（インキュベート工程）
　インキュベート工程は、混合工程で得られた混合物をインキュベートする工程である。インキュベート工程は、断片化細胞外マトリックス成分の存在下で細胞を培養する工程と捉えることもできる。
　断片化細胞外マトリックス成分の存在下で細胞を培養する方法は、特に制限はなく、培養する細胞の種類に応じて好適な培養方法で行うことができる。例えば、培養温度は２０℃～４０℃であってもよく、３０℃～３７℃であってもよい。培地のｐＨは、６～８であってもよく、７．２～７．４であってもよい。培養時間は、１日～２週間であってもよく、１週間～２週間であってもよい。
　インキュベート工程で用いられる培養器（支持体）は、特に制限されず、例えば、ウェルインサート、低接着プレート、Ｕ字やＶ字等の底面形状を有するプレートであってよい。細胞を支持体と接着させたまま培養してもよく、細胞を支持体と接着させずに培養してもよく、培養の途中で支持体から引き離して培養してもよい。細胞を支持体と接着させずに培養する場合や、培養の途中で支持体から引き離して培養する場合には、細胞の支持体への接着を阻害するＵ字やＶ字等の底面形状を有するプレートや、低吸着プレートを用いることが好ましい。
　インキュベート工程で用いられる培地は特に制限はなく、培養する細胞の種類に応じて好適な培地を選択できる。培地としては、例えば、Ｅａｇｌｅ’ｓ　ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ培地（ＭＥＭ）、Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ培地、ＲＰＭＩ、及びＧｌｕｔａＭａｘ培地等が挙げられる。培地は、血清を添加した培地であってもよいし、無血清培地であってもよい。培地は、二種類の培地を混合した混合培地であってもよい。
　インキュベート工程における培地中の細胞密度は、目的とする細胞構造体の形状、厚さ、培養器のサイズ等に応じて適宜決定できる。例えば、インキュベート工程における培地中の細胞密度は、１～１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬであってよく、１０３～１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬであってよい。また、インキュベート工程における培地中の細胞密度は、混合工程における水性媒体中の細胞密度と同じであってもよい。
　以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明する。但し、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
＜試験例１＞
〔製造例１：断片化コラーゲンの製造〕
　１０×ＰＢＳ（ナカライテスク株式会社製）と０．０５Ｎ　ＮａＯＨ水溶液を等量ずつ混合し、中和用溶液を調製した。氷上で、１７ｍＬのコラーゲン溶液（ブタ皮膚由来コラーゲンＩ溶液，株式会社ニッピ製，ＰＳＣ－１－２００－１００）に４．２５ｍＬの中和用溶液を一気に添加し、ピペットを用いて素早くピペッティングすることでコラーゲン溶液を中和した。中和後のコラーゲン溶液のｐＨは７であった。中和後のコラーゲン溶液を３７℃で２時間インキュベートし、ゲル化した。得られたゲルを液体窒素で凍結させた後、凍結乾燥により溶媒を除去して、コラーゲンの乾燥固体（コラーゲンを含む塊）を得た。得られた乾燥固体全てを１５ｍＬ遠沈管に移し、１０ｍＬの無水エタノールを加えて分散させた後、ホモジナイザー（アズワン社製，ＶＨ－１０）を使用し、３０，０００ｒｐｍで６分間ホモジナイズして、コラーゲンを断片化（解繊）した。次いで、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ，３分間）して断片化コラーゲンを沈降させ、上澄みのエタノール（液体成分）を除去した。沈降した断片化コラーゲンを室温にて３日間乾燥、又は真空ポンプで２時間減圧乾燥させて、エタノール（液体成分）を更に除去し、断片化コラーゲン（解繊コラーゲン）を得た。
〔比較製造例１：従来法による断片化コラーゲンの製造〕
　１７ｍＬのコラーゲン溶液（ブタ皮膚由来コラーゲンＩ溶液，株式会社ニッピ製，ＰＳＣ－１－２００－１００）を凍結乾燥し、コラーゲンの乾燥体を得た。得られた乾燥体５０ｍｇに１０×ＰＢＳを加えて分散させた後、ホモジナイザー（アズワン社製，ＶＨ－１０）を使用し、３０，０００ｒｐｍで６分間ホモジナイズして、コラーゲンを断片化（解繊）した。次いで、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ，３分間）して断片化コラーゲンを沈降させ、上澄み（液体成分）を除去した。沈降した断片化コラーゲンを凍結乾燥し、断片化コラーゲン（解繊コラーゲン）を得た。
〔再分散性の評価〕
　製造例１で得た断片化コラーゲン（乾燥体）、及び比較製造例１で得た断片化コラーゲン（乾燥体）それぞれの再分散性を評価した。まず、乾燥体それぞれに５ｍＬの１×ＰＢＳ（ナカライテスク株式会社製，１４２４９２４）（３７℃）を加え、ピペッティングにて塊を崩しながら溶液中に再分散させた。次いで、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ，３分間）してＰＢＳを除去した後、超純水５ｍＬに再懸濁させた。
　図１は、超純水に再懸濁させた断片化コラーゲンの光学顕微鏡写真である。図１（Ａ）は、製造例１で得た断片化コラーゲンである。図１（Ｂ）は、比較製造例１で得た断片化コラーゲンである。本発明に係る製造方法で得た断片化コラーゲン（製造例１）は、ピペッティングにて再分散が可能だった（図１（Ａ）参照）。一方、従来の製造方法で得た断片化コラーゲン（比較製造例１）は、ピペッティングでは再分散できず、コラーゲン繊維の凝集塊が残っているのが確認された（図１（Ｂ）参照）。
〔断片化コラーゲンの三次元構造の評価〕
　製造例１で得た断片化コラーゲン（乾燥体）のＣＤスペクトルの測定を実施し、三次元構造を評価した。
　まず、乾燥体の一部をカッターで削り取り、乾燥体の濃度が１ｍｇ／ｍＬとなるように５０ｍＭ酢酸を加えて４℃で一晩溶解させた。得られた溶液を５０ｍＭ酢酸で２００倍に希釈し、乾燥体の濃度が５０μｇ／ｍＬの溶液を得た。次いで、得られた溶液を石英キュベット（光路長１ｍｍ）に移し、円二色性分散計（日本分光株式会社製，Ｊ－７２５）を使用してＣＤスペクトル（波長範囲：２００～２５０ｎｍ）を測定した。
　図２は、製造例１で得た断片化コラーゲンのＣＤスペクトルである。図２には、コラーゲンそのもの（Ｎａｔｉｖｅコラーゲン）のＣＤスペクトル、及び製造例１でゲル化後凍結乾燥したコラーゲン（ゲル化後凍結乾燥コラーゲン）のＣＤスペクトルも併せて示す。ＣＤスペクトルでは、コラーゲンに特有の三重らせん構造に由来するピークが２２０～２２５ｎｍ領域に観察される。図２に示すとおり、製造例１で得た断片化コラーゲンは、標準品であるＮａｔｉｖｅコラーゲン及びゲル化後凍結乾燥コラーゲンのピークよりもピーク高さが低いものの、コラーゲンに特有の三重らせん構造に由来するピークが観察された。すなわち、製造例１で得た断片化コラーゲンは、コラーゲンに特有の三重らせん構造を保持しており、変性していないことが明らかとなった。
〔断片化コラーゲンの構造評価〕
　製造例１で得た断片化コラーゲン（乾燥体）、及び比較製造例１で得た断片化コラーゲン（乾燥体）の構造を、ヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色により評価した。ＨＥ染色は、それぞれの乾燥体から作製した切片標本に対して常法に従って実施した。
　図３は、ヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色した断片化コラーゲンの写真である。図３（Ａ）及び（Ｃ）は、比較製造例１で得た断片化コラーゲンをそれぞれ１０倍及び４０倍の倍率で撮像した写真である。図３（Ｂ）及び（Ｄ）は、製造例１で得た断片化コラーゲンをそれぞれ１０倍及び４０倍の倍率で撮像した写真である。比較製造例１で得た断片化コラーゲンは、リボン状の網目構造を形成しているのに対し（図３（Ａ）及び（Ｃ））、製造例１で得た断片化コラーゲンは、繊維間の空隙が小さく、細い糸状の繊維が撚り合わさっている構造となっていた（図３（Ｂ）及び（Ｄ））。
　図３（Ａ）（比較製造例１の切片標本の１０倍の倍率で撮像した写真。観察画像の面積は、１８２０μｍ（長辺）×１３６５μｍ（短辺）である。）及び図３（Ｂ）（製造例１の切片標本の１０倍の倍率で撮像した写真。観察画像の面積は、１８２０μｍ（長辺）×１３６５μｍ（短辺）である。）から、観察画像の面積全体に対して、細胞外マトリックス成分が存在する領域の面積の割合（％）を算出した結果、図３（Ａ）（比較製造例１）では、３９．０±０．５％であり、図３（Ｂ）（製造例１）では、７２．３±３．５％であった。
　次いで、製造例１で得た断片化コラーゲン（乾燥体）、及び比較製造例１で得た断片化コラーゲン（乾燥体）の構造を、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で撮像及び観察することで更に評価した。まず、乾燥体の一部をそれぞれメスで薄く削り取り、電子顕微鏡用のステージにカーボンテープを用いて貼り付けた。次いで、オスミウムコーター（株式会社真空デバイス製，ＨＰＣ－１ＳＷ）を使用して、３０秒間真空中でプラズマ照射してサンプルに酸化オスミウムをコーティングした。プラズマ照射は３回繰り返した。走査型電子顕微鏡（日本電子株式会社製，ＪＳＭ－６７０１Ｒ）使用して５．０Ｖ、１０μＡで得られたサンプルを撮像した。
　図４は、断片化コラーゲンの走査型電子顕微鏡で撮像した写真である。図４（Ａ）及び（Ｂ）は、比較製造例１で得た断片化コラーゲンをそれぞれ２０００倍及び３３００倍の倍率で撮像した写真である。図４（Ｃ）及び（Ｄ）は、製造例１で得た断片化コラーゲンをそれぞれ２０００倍及び３３００倍の倍率で撮像した写真である。ＨＥ染色と同様に、比較製造例１で得た断片化コラーゲンは、コラーゲン繊維が帯状に積層されている構造が見られた（図４（Ａ）及び（Ｂ））。一方、製造例１で得た断片化コラーゲンは、細い繊維が重なり合っている様子が確認された。撮像した画像から算出した平均繊維径は、比較製造例１で得た断片化コラーゲンが１０．６μｍであり、製造例１で得た断片化コラーゲンが０．６μｍであった。
〔製造例２：断片化コラーゲンの製造及び評価〕
　コラーゲンを断片化する際の溶液を無水エタノールから２０ｖ／ｖ％エタノール水溶液（エタノール：水＝２０：８０）（製造例２－１）、５０ｖ／ｖ％エタノール水溶液（エタノール：水＝５０：５０）（製造例２－２）、又は７０ｖ／ｖ％エタノール水溶液（エタノール：水＝７０：３０）（製造例２－３）に代えたこと以外は、製造例１と同様の手順で断片化コラーゲンを製造した。
　製造例１、製造例２－１～２－３及び比較製造例１で得られた断片化コラーゲンの収率を表１にまとめた。ここでいう収率は、断片化に使用したコラーゲンの重量に対して、得られた断片化コラーゲン（乾燥体）の重量の割合（％）である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　極性有機溶媒（エタノール）を含む溶液でコラーゲンを断片化した製造例２－１～２－３及び製造例１では、水系の溶媒のみを使用した比較製造例１と比べて、収率が向上していた。製造例２－２（５０ｖ／ｖ％エタノールを使用）で収率が下がっているのは、中和により生じた塩に起因する塩濃度がコラーゲンを溶解しやすい濃度範囲に重なったためであると推察される。
　製造例１に記載した手順と同様にして、再分散性の評価を行ったところ、製造例２－１～２－３で得た断片化コラーゲンは、いずれもピペッティングにて再分散が可能だった。図５は、超純水に再懸濁させた断片化コラーゲンの光学顕微鏡写真である。図５（Ａ）は、製造例１で得た断片化コラーゲンである。図５（Ｂ）は、製造例２－３で得た断片化コラーゲンである。図５（Ｃ）は、製造例２－１で得た断片化コラーゲンである。なお、図示していないが、製造例２－２で得た断片化コラーゲンも同様の結果であった。
　また、製造例１に記載した手順と同様にして、断片化コラーゲンの三次元構造の評価を行った。製造例２－１～２－３で得た断片化コラーゲンのＣＤスペクトルにおいて、いずれもコラーゲンに特有の三重らせん構造に由来するピークが２２０～２２５ｎｍ領域に観察された。すなわち、製造例２－１～２－３で得た断片化コラーゲンは、コラーゲンに特有の三重らせん構造を保持しており、変性していないことが明らかとなった。一例として、図６に製造例２－３で得た断片化コラーゲンのＣＤスペクトルを示す。図６には、ゼラチン（三重らせん構造を有しない）のＣＤスペクトル、及びコラーゲンそのもの（Ｎａｔｉｖｅコラーゲン）のＣＤスペクトルも併せて示す。なお、図示していないが、製造例２－１及び２－２で得た断片化コラーゲンも同様の結果であった。
〔製造例３：断片化コラーゲンの製造及び評価〕
　１０×ＰＢＳ（ナカライテスク株式会社製）と０．０５Ｎ　ＮａＯＨ水溶液を等量ずつ混合し、中和用溶液を調製した。氷上で、１７ｍＬのコラーゲン溶液（ブタ皮膚由来コラーゲンＩ溶液，株式会社ニッピ製，ＰＳＣ－１－２００－１００）に４．２５ｍＬの中和用溶液を一気に添加し、ピペットを用いて素早くピペッティングすることでコラーゲン溶液を中和した。中和後のコラーゲン溶液のｐＨは７であった。中和後のコラーゲン溶液を３７℃で２時間インキュベートし、ゲル化した。得られたゲルを液体窒素で凍結させた後、凍結乾燥により溶媒を除去して、コラーゲンの乾燥固体（コラーゲンを含む塊）を得た。得られた乾燥固体全てを１５ｍＬ遠沈管に移し、１５ｍＬのアセトニトリル（製造例３－１）、アセトン（製造例３－２）、又はジエチルエーテル（製造例３－３）を加えて分散させた後、ホモジナイザー（アズワン社製，ＶＨ－１０）を使用し、３０，０００ｒｐｍで６分間ホモジナイズして、コラーゲンを断片化（解繊）した。次いで、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ，３分間）して断片化コラーゲンを沈降させ、上澄み（液体成分）を除去した。沈降した断片化コラーゲンを室温にて風乾し、製造例３－１～３－３の断片化コラーゲン（解繊コラーゲン）を得た。
　製造例３－１～３－３で得た断片化コラーゲン（乾燥体）それぞれの再分散性を評価した。乾燥体それぞれに５ｍＬの超純水を加え、ピペッティングにて塊を崩しながら溶液中に再分散させた。次いで、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ，３分間）して超純水を除去した後、再度超純水５ｍＬに懸濁させた。製造例３－１～３－３で得た断片化コラーゲンは、いずれもピペッティングにて再分散が可能だった。図７は、超純水に再懸濁させた断片化コラーゲンの光学顕微鏡写真である。図７（Ａ）は、製造例３－１で得た断片化コラーゲンである。図７（Ｂ）は、製造例３－２で得た断片化コラーゲンである。図７（Ｃ）は、製造例３－３で得た断片化コラーゲンである。
〔参考例１：中和後及びゲル化後のコラーゲンの観察〕
　１０×ＰＢＳ（ナカライテスク株式会社製）と０．０５Ｎ　ＮａＯＨ水溶液を等量ずつ混合し、中和用溶液を調製した。氷上で、１７ｍＬのコラーゲン溶液（ブタ皮膚由来コラーゲンＩ溶液，株式会社ニッピ製，ＰＳＣ－１－２００－１００）に４．２５ｍＬの中和用溶液を一気に添加し、ピペットを用いて素早くピペッティングすることでコラーゲン溶液を中和した。中和後のコラーゲン溶液のｐＨは７であった。これを凍結乾燥して中和後のコラーゲンとした。また、中和後のコラーゲン溶液を３７℃で２時間インキュベートしてゲル化し、このゲルを凍結乾燥して中和－ゲル化後のコラーゲンとした。
　中和後のコラーゲン、及び中和－ゲル化後のコラーゲンの構造を、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で撮像及び観察することで評価した。撮像の手順は製造例１と同様である。
　図８は、中和後及び中和－ゲル化後のコラーゲンの走査型電子顕微鏡で撮像した写真である。図８（Ａ）及び（Ｃ）は、中和－ゲル化後のコラーゲンをそれぞれ５００倍及び２０００倍の倍率で撮像した写真である。図８（Ｂ）及び（Ｄ）は、中和後のコラーゲンをそれぞれ５００倍及び２０００倍の倍率で撮像した写真である。中和後のコラーゲン、及び中和－ゲル化後のコラーゲンの構造に大きな差は確認できなかった。コラーゲン溶液を中和することでコラーゲン分子の構造が変化することにより、再分散性に優れるという本発明による効果が奏されると考えられる。
〔参考例２：ゲル化するｐＨ範囲の検討〕
　１０×ＰＢＳ（ナカライテスク株式会社製）と０．０５Ｎ　ＮａＯＨ水溶液を等量ずつ混合し、中和用溶液を調製した。氷上で、５ｍＭ酢酸に溶解させたコラーゲン溶液５００μＬに中和用溶液０．７ｍＬ、１．２５ｍＬ又は１．７ｍＬを一気に添加し、ピペットを用いて素早くピペッティングすることで中和した。中和後のコラーゲン溶液のｐＨは、それぞれ６、７又は８であった。中和後のコラーゲン溶液を３７℃で３０分間インキュベートしたところ、いずれのコラーゲン溶液もゲル化したことが確認された。図９は、ゲル化したコラーゲン溶液の写真である。
〔製造例４：細胞構造体の製造〕
　製造例１及び比較製造例１で得た断片化コラーゲンを使用し、細胞構造体の製造を行った。
　製造例１で得た断片化コラーゲン（乾燥体）全量に５ｍＬの１×ＰＢＳ（ナカライテスク株式会社製，１４２４９２４）（３７℃）を加え、ピペッティングにて塊を崩しながら溶液中に再分散させた。次いで、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ，３分間）してＰＢＳを除去した後、５ｍＬの１０％血清（インビトロジェン株式会社製，１０２７０－１０６）入りＤＭＥＭ培地（ナカライテスク株式会社製，８４５８１６）で懸濁した。懸濁液１ｍＬを１．５ｍＬマイクロチューブに移した。当該マイクロチューブに、０．０２５％トリプシン（０．０１％ＥＤＴＡ）（富士フィルム和光純薬株式会社製，２０７－１９１８３）で剥離させたヒト正常皮膚繊維芽細胞（ＮＨＤＦ）（ロンザ株式会社製，ＣＣ－２５０９）２．０×１０６細胞、及びヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）（ロンザ株式会社製，Ｃ２５１７Ａ）１．０×１０６細胞を分注し、１０，０００ｒｐｍで１分間遠心した。これを２４ウェルインサート（コーニング株式会社製，＃３４７０）に規定量ずつ分注し、１，１００×ｇで１５分間プレート遠心した。次いで、６ウェルカルチャープレートにインサートを移して、ＥＧＭ（登録商標）－２ＭＶ　ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ（登録商標）（ロンザ株式会社製，ＣＣ－３２０２）と１０％血清入りＤＭＥＭ培地を１：１で混合した培地で７日間培養した。培養後、４％パラホルムアルデヒド・りん酸緩衝液にて室温で一晩固定し、パラフィン包埋後薄切標本をＨＥ染色及びＣＤ３１染色した。比較製造例１で得た断片化コラーゲン（乾燥体）についても、上記と同様の手順で細胞構造体を作製し、ＨＥ染色した。
　図１０は、ヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色（図１０（Ａ）及び（Ｃ））、又はＣＤ３１による免疫染色（図１０（Ｂ））した細胞構造体の写真である。図１０（Ａ）及び（Ｂ）は、製造例１で得た断片化コラーゲンを使用して作製した細胞構造体である。図１０（Ｃ）は、比較製造例１で得た断片化コラーゲンを使用して作製した細胞構造体である。図１０に示すとおり、製造例１で得た断片化コラーゲンを使用して作製した細胞構造体は、若干コラーゲンの凝集が見られるものの、比較製造例１で得た断片化コラーゲンを使用して作製した細胞構造体（従来法）とほぼ同等の組織が構築できた（図１０（Ａ）及び（Ｃ））。また、製造例１で得た断片化コラーゲンを使用して作製した細胞構造体は、目立った細胞死も見られず、ＣＤ３１染色によって管腔構造のある血管も構築できていることが明らかとなった（図１０（Ｂ））。
＜試験例２＞
〔材料〕
　コラーゲンとして、ブタ皮膚製コラーゲンI溶液（ＮＩＰＰＩ／ＰＳＣ－１－２００－１００）を使用した
　細胞として、表２に記載の細胞を使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　試薬として、表３に記載のものを使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
〔実験手順：断片化コラーゲンの調製〕
製造例５－１
　１０×ＰＢＳと０．０５Ｎ　ＮａＯＨを等量ずつ混合して、中和用溶液を調製した。氷上で１７ｍＬのコラーゲン溶液に、４．２５ｍＬの中和用溶液を一気に添加し、ピペットを用いて素早くピペッティングすることでコラーゲン溶液を調和した。中和後のコラーゲン溶液を３７°Ｃにて２時間インキュベートし、ゲル化した。得られたゲルを液体窒素にて凍結させた後、最低４８時間凍結乾燥し、ゲル化後に凍結乾燥処理を実施したコラーゲンの乾燥固体（コラーゲンを含む塊）を得た。
　得られた乾燥固体すべてを１５ｍＬ遠沈管に移し、１５ｍＬの無水エタノール（エタノール：水＝１００：０）を加え、コラーゲンを分散させた後、パワー６のホモジェナイザーで６分間ホモジェナイズしてコラーゲンを断片化（解繊）した。次いで、１０，０００ｒｐｍにて３分間遠心分離して、断片化コラーゲンを沈降させ、上澄みの液体成分を除去した。沈降した断片化コラーゲンに超純水１５ｍＬを加え、断片化コラーゲン及び超純水を含む液体を得た。ピペッティングにより断片化コラーゲンが分散した状態で当該液体を液体窒素を用いて凍結させて、その後最低４８時間凍結乾燥した。これによって、乾燥固体として、製造例５－１の断片化コラーゲンを得た。
製造例５－２、５－３及び５－４
　コラーゲンを断片化する際の溶液に、２０ｖ／ｖ％エタノール水溶液（エタノール：水＝２０：８０）（製造例５－２）、５０ｖ／ｖ％エタノール水溶液（エタノール：水＝５０：５０）（製造例５－３）、又は７０ｖ／ｖ％エタノール水溶液（エタノール：水＝７０：３０）（製造例５－４）を用いたこと以外は製造例５－１と同様にして、それぞれ製造例５－２、５－３及び５－４の断片化コラーゲンを得た。
比較製造例５－１
　コラーゲンを断片化する際の溶液に、水（エタノール：水＝０：１００）を用いたこと以外は、製造例５－１と同様にして、比較製造例５－１の断片化コラーゲンを得た。
参考例３
　１０×ＰＢＳ（ナカライテスク株式会社製）と０．０５Ｎ　ＮａＯＨ水溶液を等量ずつ混合し、中和用溶液を調製した。氷上で、１７ｍＬのコラーゲン溶液（ブタ皮膚由来コラーゲンＩ溶液，株式会社ニッピ製，ＰＳＣ－１－２００－１００）に４．２５ｍＬの中和用溶液を一気に添加し、ピペットを用いて素早くピペッティングすることでコラーゲン溶液を中和した。中和後のコラーゲン溶液のｐＨは７であった。中和後のコラーゲン溶液を３７℃で２時間インキュベートし、ゲル化した。得られたゲルを液体窒素で凍結させた後、凍結乾燥により溶媒を除去して、コラーゲンの乾燥固体（コラーゲンを含む塊）を得た。得られた乾燥固体全てを１５ｍＬ遠沈管に移し、１０ｍＬの７０ｖ／ｖ％エタノール水溶液（エタノール：水＝７０：３０）を加えて分散させた後、ホモジナイザー（アズワン社製，ＶＨ－１０）を使用し、３０，０００ｒｐｍで６分間ホモジナイズして、コラーゲンを断片化（解繊）した。次いで、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ，３分間）して断片化コラーゲンを沈降させ、上澄みのエタノール（液体成分）を除去した。沈降した断片化コラーゲンを室温にて３日間乾燥、又は真空ポンプで２時間減圧乾燥させて、エタノール（液体成分）を更に除去し、参考例３の断片化コラーゲン（解繊コラーゲン）を得た。
〔製造例５－５：超音波破砕による更に微細な断片化コラーゲンの作製〕
　コラーゲンを断片化する際の溶液に、７０ｖ／ｖ％エタノール水溶液（エタノール：水＝７０：３０）を用いたこと以外は製造例５－１と同様にして、断片化コラーゲン及び超純水を含む液体を得た。断片化コラーゲンを超純水中に懸濁させた状態で、全自動超音波破砕機（ＢＩＯＲＵＰＴＥＲＩＩ／ビーエム機器）を用いて、２０秒間の超音波照射と、３０秒間の冷却とを９９回繰り返し、断片化コラーゲンに対して超音波破砕処理を行った。超音波破砕処理後の断片化コラーゲンを純水に分散させた状態で、凍結乾燥し、乾燥固体として、製造例５－５の断片化コラーゲンを得た。
〔細胞構造体（三次元細胞組織）の製造〕
　細胞構造体の構築には、製造例５－４の断片化コラーゲン、参考例３の断片化コラーゲン及び製造例５－５の断片化コラーゲンそれぞれを用いた。
　断片化コラーゲンの乾燥固体８ｍｇをマイクロチューブに計り取り、５００μＬの超純水にてピペッティングして、断片化コラーゲンを分散させ、断片化コラーゲン分散液を得た。断片化コラーゲン分散液を１００００ｒｐｍにて１分遠心分離し、断片化コラーゲンを沈降させ、上清の液体成分を除去し、０．０２５％トリプシン及び０．０１％ＥＤＴＡで剥離させたＮＨＤＦ２．０×１０６個、ＨＵＶＥＣ１．０×１０６個を完全培地で懸濁したものを分注し、次いで、１０，０００ｒｐｍで１分間遠心することによって、細胞含有液を得た。細胞含有液を２４ウェルインサート（Ｃｏｒｎｉｎｇ／＃３４７０）に規定量ずつ分注し、１，１００×ｇで１５分間プレート遠心を行った。６ウェルカルチャープレートにインサートを移して、ＥＧＭTM－２ＭＶ　ＢｕｌｌｅｔＫｉｔTMと１０％血清入りＤＭＥＭを１：１で混合した培地で、細胞を７日間培養した。培養により得られた組織体を４％パラホルムアルデヒド・りん酸緩衝液にて室温で一晩固定し、パラフィン包埋後薄切標本をヘマトキシリン・エオジン染色（ＨＥ染色）した。
〔ＣＤスペクトルの測定〕
　断片化コラーゲンの乾燥固体の一部をそれぞれカッターで削り取り、１ｍｇ／ｍＬになるように５０ｍＭ酢酸を加えて４℃で一晩溶解させ、断片化コラーゲン溶液を調製した。断片化コラーゲン溶液を、コラーゲン濃度が５０μｇ／ｍＬになるように５０ｍＭ酢酸で２００倍に希釈し、測定用溶液を得た。光路長１ｍｍの石英キュベットに、測定用溶液を移し、円二色性分散計（ＪＡＳＣＯ／Ｊ－７２５）を用いて２００ｎｍ～２５０ｎｍでのＣＤスペクトルを測定した
〔断片化コラーゲンの評価〕
　図１１は、コラーゲンを断片化する際の溶液に、７０ｖ／ｖ％エタノール水溶液（エタノール：水＝７０：３０）を用いて製造した製造例５－４の断片化コラーゲンの再分散性の評価結果を示す写真である。製造例５－４の断片化コラーゲンは、３７℃の超純水で１分ほどピペッティングするとほぼ完全に分散しきる様子が確認された（図１１）。図１２は、製造例５－４の断片化コラーゲンを位相差顕微鏡で撮像した写真である。位相差顕微鏡写真からもコラーゲンが断片化（マイクロファイバー化）していることが確認された（図１２）。
　断片化コラーゲンを製造する際に、コラーゲンをエタノールを含む溶液中で断片化した後に、超純水で液体成分を置換することなく、凍結乾燥処理を行って断片化コラーゲンを得る方法（参考例３）では、断片化コラーゲンの乾燥体が固く、再分散するのに５分ほどピペッティングを要する、また、コラーゲンを断片化する際の溶液のエタノール濃度が高くなると乾燥体を得るために乾燥に要する時間が非常に長くなる（２週間程度）という欠点があった。一方、コラーゲンをエタノールを含む溶液中で断片化した後に、超純水で液体成分を置換して、その後凍結乾燥処理を行って断片化コラーゲンを得る方法では、このような欠点はなかった。
〔断片化コラーゲンの変性についての評価〕
　図１３は、ゼラチン、原料のコラーゲン（非断片化コラーゲン、Ｎａｔｉｖｅ　Ｃｏｌｌａｇｅｎ）及び製造例５－４の断片化コラーゲンのＣＤスペクトルの測定結果を示す。
　図１３のとおり、原料のコラーゲンから若干のピーク値の減少が見られたものの、２２０ｎｍ付近の三重らせん特有のピークは確認されたため、断片化コラーゲンは変性していないことが明らかとなった。
　図１４は、ゼラチン、原料のコラーゲン（Ｎａｔｉｖｅ　Ｃｏｌｌａｇｅｎ）、並びに、製造例及び比較製造例の断片化コラーゲンのＣＤスペクトルの測定結果を示す。
　図１４に示すとおり、いずれの条件においても変性は確認されなかった。図１４のとおり、エタノール水溶液中のエタノール濃度が２０ｖ／ｖ％及び５０ｖ／ｖ％である場合、エタノール水溶液中のエタノール濃度が０ｖ／ｖ％、７０ｖ／ｖ％及び１００ｖ／ｖ％である場合と比較すると、ピークが減少していた。ＣＤスペクトルの測定では、Ｎａｔｉｖｅのコラーゲンは溶液状態のコラーゲンを用い、断片化コラーゲンは、乾燥体を溶解させたものを用いている。乾燥状態のコラーゲンは吸湿しやすく、測定している間にも重量が変化していく現象がみられるため、始めから溶液状態のものと比較すると測定に使用した溶液の濃度がある程度下振れしている可能性がある。しかし、製造例と比較製造例との間には測定条件に差がないため、各製造例及び比較製造例におけるピーク量の差は実際にサンプル内の三重らせん構造の量の差を示していると示唆される。エタノール自体はタンパク質を変性、凝集させる作用があるがこれは水素結合で成り立っているタンパク質の三次元構造をエタノールが変化させることによるもので、エタノールが具体的にどれほどの水素結合を変化させているのかはタンパク質の種類、分子間又は分子中の水素結合の数等によって変化する。ピークが低かった条件（エタノール濃度２０ｖ／ｖ％、５０ｖ／ｖ％）は、その他の条件と比較すると、解繊時の水分がより多い条件となる。よってコラーゲン中により多くの水素結合が形成されていたと考えられ、エタノール濃度の高い条件、もしくは全く含まない条件と比較するとエタノールによって変化した構造の度合いが大きかったものと考察した。
　コラーゲンを断片化する際の溶液がエタノールを含まない場合、コラーゲンを断片化する際の溶液中のエタノール濃度が低い場合（２０ｖ／ｖ％）、又はコラーゲンを断片化する際の溶液中のエタノール濃度が高い場合（７０ｖ／ｖ％、１００ｖ／ｖ％）において、得られる断片化コラーゲンの収率が変化するかについて評価した。結果を表４に示す。収率は、断片化に使用したコラーゲンの重量Ｖ０、及び、得られた断片化コラーゲン（乾燥体）の重量Ｖ１を測定し、次の式（１）に従って算出した。
収率（％）＝Ｖ１／Ｖ０×１００　　　（１）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表４のとおり、コラーゲンを断片化する際の溶液がエタノールを含まない場合と比べて、コラーゲンを断片化する際の溶液中のエタノール濃度が低い場合（２０ｖ／ｖ％）、及びコラーゲンを断片化する際の溶液中のエタノール濃度が高い場合（７０ｖ／ｖ％、１００ｖ／ｖ％）では、収率が向上した。
〔細胞構造体の評価〕
　図１５は、製造例５－１の方法で得た断片化コラーゲン（実施例）又は参考例３の方法で得た断片化コラーゲン（参考例）を用いて作製され、ヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色、又はＣＤ３１による免疫染色した細胞構造体を示す写真である。製造例の断片化コラーゲンは細胞が懸濁された培地に置き換えても溶解することなく組織化した。
　得られた組織のＨＥ染色像を見ても製造例５－１の方法で得た断片化コラーゲンと参考例３の方法で得た断片化コラーゲンとの間に大きな形態差は確認されなかった。更にＣＤ３１染色にて管腔構造のある血管網の存在も確認されたため、製造例の断片化コラーゲンを用いた場合でも得られる三次元組織像に相違点は無いことが示された。
〔断片化コラーゲンの超音波破砕〕
　解繊時有機溶媒を使用しない従来法では冷却しながら超音波破砕（超音波解繊）すると、コラ―ゲンが解繊中に溶解してしまうため、超音波破砕によってより微細な断片化コラーゲンを得るためには、熱架橋処理によって溶解を防ぐ必要があった。しかし、熱架橋処理によってコラーゲンが変性する場合があるため、熱架橋処理された断片化コラーゲンを用いて得られる組織は、熱架橋処理を行わずに作製された組織とは大きく異なるという欠点があった。エタノール中でホモジェナイザーを用いて解繊した製造例５－５の断片化コラーゲンは、断片化後に、液体成分を超純水に置換しても容易に溶解しないという性質があるため、そのまま超音波による更なる解繊を行うことができた。
　図１６は、製造例５－５の断片化コラーゲンの顕微鏡写真を示す。図１６のとおり、超音波破砕する前のファイバーは解繊されてはいるが、一本一本のファイバー自体は絡み合っている。超音波破砕した後のファイバーは、長さは前のものと大きな差はないが、一本一本が分かれて液中に分散しているのが確認された。
　図１７は、製造例５－５の断片化コラーゲンを用いて作製され、ヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色、又はＣＤ３１による免疫染色した細胞構造体の写真である。超音波破砕前はコラーゲンの固まっている部分が見られ（丸部）、細胞の分布に偏りが見られるが、超音波破砕後はコラーゲンの塊は見られず、細胞が均一に分布している様子が示された。
〔エタノール以外の親水性有機溶媒を用いて作製した断片化コラーゲンの評価〕
　７０ｖ／ｖ％エタノール水溶液に代えて、アセトン、アセトニトリル又はジエチルエーテルを用いて、製造例５－６（アセトン）、製造例５－７（アセトニトリル）及び製造例５－８（ジエチルエーテル）の断片化コラーゲンを製造した。７０ｖ／ｖ％エタノール水溶液に代えて使用した極性有機溶媒の濃度は、１００ｖ／ｖ％であった。
　各種極性有機溶媒を用いて解繊したコラーゲンの写真を図１８に示す。エタノール以外の極性有機溶媒を用いた場合でも繊維形成が可能であった。
　７０ｖ／ｖ％エタノール水溶液以外の極性有機溶媒を用いた製造５－６～５－８でも、７０ｖ／ｖ％エタノール水溶液を用いた場合と同様に迅速な再分散性が確認された。
〔ＡＮＳ－８による疎水性評価〕
　製造例５－４の断片化コラーゲン、参考例３の断片化コラーゲン、及び、凍結乾燥した溶液のコラーゲンを１×ＰＢＳに５ｍｇ／ｍＬの濃度になるように添加し、４日間冷蔵庫にて溶解させて、各種コラーゲン溶液を用意した。
　ＡＮＳ－８　Ｍｇ（８－アニリノ－１－ナフタレンスルホン酸マグネシウム（ＩＩ））（東京化成工業株式会社、製品コード：Ａ５３５３）を２０μＭになるように１×ＰＢＳに溶解して、ＡＮＳ－Ｍｇ水溶液を用意した。コラーゲン溶液５００μＬにＡＮＳ－Ｍｇ水溶液を２００μＬ加え、室温（２５℃）で遮光して一時間反応させた。得られた反応液を用い、分光光度計（Ｎａｎｏｄｒｏｐ　３３００／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ　ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）３８０ｎｍの波長にてサンプルのスペクトルを測定した。
　スペクトルの測定結果を図１９に示す。図１９中、「Ｎｅｗ　Ｍｅｔｈｏｄ　ＣＭＦ」は製造例５－４の断片化コラーゲンを用いた場合の測定結果を示し、「Ｎｏｒｍａｌ　ＣＭＦ」は参考例３の断片化コラーゲンを用いた場合の測定結果を示し、「Ｎａｔｉｖｅ　ｃｏｌｌａｇｅｎ」は、凍結乾燥した溶液のコラーゲンを用いた場合の測定結果を示す。

 

Claims (16)

  1. 　断片化細胞外マトリックス成分の製造方法であって、
    　細胞外マトリックス成分が溶解した溶液を中和する工程と、
    　前記中和する工程の後、凍結乾燥処理により溶媒を除去して、細胞外マトリックス成分を含む塊を得る工程と、
    　前記塊を極性有機溶媒を含む溶液中に分散させ、当該溶液中で細胞外マトリックス成分を断片化し、断片化細胞外マトリックス成分を含む液体を得る工程と、
    　前記断片化細胞外マトリックス成分を含む液体から液体成分を除去する工程Ｂと、を備える、製造方法。
  2. 　前記液体を得る工程の後、かつ前記液体成分を除去する工程の前に、前記液体を得る工程で得られた前記液体中の液体成分を水に置換する工程を更に備え、
    　前記液体成分を除去する工程において、前記断片化細胞外マトリックス成分を含む液体から凍結乾燥処理により液体成分を除去する、請求項１に記載の製造方法。
  3. 　前記水に置換する工程の後、かつ前記液体成分を除去する工程の前に、前記断片化細胞外マトリックス成分を含む液体に超音波破砕処理を行う工程を更に備える、請求項２に記載の製造方法。
  4. 　前記中和する工程の後、かつ前記塊を得る工程の前に、中和した前記溶液をゲル化する工程を更に備える、請求項１～３のいずれか一項に記載の製造方法。
  5. 　前記塊が多孔質体である、請求項４に記載の製造方法。
  6. 　前記断片化することが、細胞外マトリックス成分を解繊することを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の製造方法。
  7. 　前記極性有機溶媒を含む溶液中の前記極性有機溶媒の濃度が、２０ｖ／ｖ％以上１００ｖ／ｖ％以下である、請求項１～６のいずれか一項に記載の製造方法。
  8. 　前記極性有機溶媒がエタノールを含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の製造方法。
  9. 　前記液体成分を除去する工程で得られた固形物を水性媒体に分散させる工程を更に備える、請求項１～８のいずれか一項に記載の製造方法。
  10. 　前記細胞外マトリックス成分がコラーゲンである、請求項１～９のいずれか一項に記載の製造方法。
  11. 　前記断片化細胞外マトリックス成分がコラーゲンに特有の三重らせん構造を有する、請求項１０に記載の製造方法。
  12. 　請求項１～１１のいずれか一項に記載の製造方法により得られた断片化細胞外マトリックス成分と、細胞を混合する工程と、
    　前記混合する工程で得られた混合物をインキュベートする工程と、
    　を含む、細胞構造体の製造方法。
  13. 　平均径が０．０８μｍ以上２．０μｍ以下である繊維状の細胞外マトリックス成分が積層されている、断片化細胞外マトリックス成分の乾燥体。
  14. 　切片標本を作製し、前記切片標本の長辺１８２０μｍかつ短辺１３６５μｍの長方形領域を顕微鏡によって観察して取得される観察画像において、細胞外マトリックス成分が存在する領域の面積が、前記観察画像の面積に対して４０％以上１００％以下である、請求項１３に記載の断片化細胞外マトリックス成分の乾燥体。
  15. 　前記断片化細胞外マトリックス成分が断片化コラーゲンである、請求項１３又は１４に記載の断片化細胞外マトリックス成分の乾燥体。
  16. 　１，８－アニリノナフタレンスルホン酸（ＡＮＳ）を使用した蛍光強度測定で、波長４００ｎｍ以上５５０ｎｍ以下の範囲内にピークを有する、断片化細胞外マトリックス成分。

     
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