WO2012015055A1 - コラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末およびそれらの製造方法 - Google Patents

コラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末およびそれらの製造方法 Download PDF

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啓友 田中
小倉　孝之
俊治 服部
剛一 松田
善勝 小林
章司 大井
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株式会社ニッピ
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Definitions

  • the present invention relates to a collagen powder and / or a collagen derivative obtained by dispersing a crude collagen precipitate consisting of a collagen precipitate and / or a collagen derivative precipitate having an average particle size of 1 to 1,000 ⁇ m in a hydrophilic organic solvent and then drying it.
  • the present invention relates to powders and methods for producing them.
  • Collagen has a structure in which three polypeptide chains are spirally wound, and a plurality of collagen molecules of about 300 nm are associated with each other shifted by 67 nm to form long collagen fibers.
  • Collagen is a major protein that forms raw hides, tendons, bones, etc. of fish, pigs, cattle, etc., but most of them are insoluble in water.
  • Collagen is insoluble but is a biological component and has excellent safety, and has high homologies between animals, and therefore has the advantage of not causing an immune reaction. For this reason, application to the fields of foods, pharmaceuticals, and cosmetics has been studied, and various solubilization methods and utilization methods of solubilized collagen have been developed.
  • As a solubilized collagen a small amount of soluble collagen contained in animal skin, bones and other raw materials is extracted with dilute acid, solubilized by adding an enzyme such as protease (Patent Document 1), and alkali is added. And solubilized (Patent Document 2).
  • Patent Document 3 Collagen water-insoluble aggregates having an isoelectric point in the pH range used in cosmetic formulations have been considered unsuitable as cosmetic raw materials for reasons such as being milky white and non-uniform, but pH 5.5-8. It has been found that the heat denaturation temperature of an aggregate obtained by adjusting an aqueous solution of collagen having an isoelectric point of 5 to a pH near the isoelectric point is remarkably high, and such an aggregate is used as a cosmetic raw material. That's it.
  • Undenatured collagen solution may be denatured even at room temperature, and storage requires temperature control such as refrigeration.
  • temperature control such as refrigeration.
  • Patent Document 4 A collagen solution is ejected from a nozzle into a volatile hydrophilic organic solvent medium to form a thread or film, and the filament is dried, and then dried into a granular or powdered collagen that is shredded or crushed. Is doing it. It is described that the collagen concentration of the collagen solution discharged into the hydrophilic organic solvent medium is preferably 3 to 10% by mass and the discharge speed from the nozzle is 1 to 30 m / min.
  • Patent Document 5 There is also a dried product of collagen derivatives derived from fish skin (Patent Document 5).
  • a collagen derivative such as acylated collagen is prepared as collagen.
  • Example 2 the fish skin was treated with an organic solvent and centrifuged, and then collagen was solubilized with acidic acetic acid. A collagen precipitate was obtained by salting out, and this was freeze-dried to obtain a dried collagen product. It has gained.
  • Example 4 the fish skin was treated with an organic solvent and centrifuged, and sodium hydroxide was added to the precipitate and stirred overnight.
  • collagen was extracted by adding an aqueous citric acid solution to the precipitate. Then, sodium citrate is added to precipitate collagen, sodium hydroxide solution is added to the collagen precipitate to adjust to pH 10, and succinic anhydride is allowed to act to obtain succinylated collagen, which is then made acidic with hydrochloric acid. Thus, succinylated collagen is precipitated, and the resulting precipitate is freeze-dried to obtain a dried collagen product.
  • Collagen has a different isoelectric point depending on the treatment method.
  • Collagen solubilized under acidic conditions has an isoelectric point of pH 7 to 9.5, so that it has poor solubility at pH 5 or higher and precipitate aggregation occurs.
  • Patent Document 6 there is also a method for improving water solubility by esterifying collagen.
  • Patent Document 6 an esterification reaction of collagen is previously performed in the state of animal tissue, and then an extraction operation of esterified collagen is performed. Thereby, it is said that esterified collagen can be produced at a low cost by a simple process.
  • Unmodified collagen that maintains a triple helix structure is a compound that is highly moisturized and has excellent adhesion to human skin epidermis cells, and therefore is required to be formulated into cosmetics and developed for medical use.
  • collagen dissolved in a solution has a low heat denaturation temperature and is denatured even at room temperature, and requires refrigerated storage. That is, a collagen cosmetic compounded in a state in which collagen having a triple helical structure is dissolved needs to be stored in a refrigerator or the like in order to prevent collagen denaturation, and is not easy to use.
  • collagen is a compound that is inherently excellent in moisture retention.
  • Comparative Example 1 of Patent Document 6 above an attempt was made to wash the collagen precipitate obtained by salting out atelocollagen with ethanol, but it was removed because the collagen fibers contained water containing salt. It states that it was not possible.
  • the drying of collagen requires techniques such as freeze drying and spray drying, which complicates the manufacturing process and apparatus. Therefore, there is a demand for a method for easily preparing a collagen powder without requiring a complicated process.
  • native collagen has activities such as excellent adhesion during cell culture. For this reason, even if it is collagen powder, when this is melt
  • a solution containing a target component is supplied from the top of a tower through a pressure nozzle and heat is blown to granulate.
  • collagen is easily heat-denatured and granulates by such a method. It is also difficult. Therefore, there is a demand for a method for producing an unmodified collagen powder that has a simple production process, low production energy, and can form a triple helical structure when dissolved.
  • soluble collagen in the first place has an isoelectric point that depends on the extraction method, and soluble collagen has a low solubility at the isoelectric point. For this reason, it is difficult to dissolve dry collagen using neutral lotion or the like. Accordingly, when used as a cosmetic product, a collagen powder that dissolves quickly at a pH of 5.5 to 8.5, which is a general cosmetic product, is desired.
  • an object of the present invention is to provide fine collagen powder and / or collagen derivative powder.
  • Another object of the present invention is to provide a method for producing an unmodified collagen powder and / or collagen derivative powder, which can be easily prepared.
  • a crude collagen precipitate comprising a collagen precipitate of 1 to 1,000 ⁇ m can be obtained, and it is efficient to adjust the concentration of the crude collagen precipitate to 12 to 50% by mass and disperse it in a hydrophilic organic solvent.
  • the collagen precipitate can be dehydrated and the solid matter can be collected, and it can be made into collagen powder by air drying, and dehydration and drying can be efficiently performed by using a coarse collagen precipitate with a short diameter, As a result, it is possible to produce a short-diameter collagen powder, the collagen powder obtained by the above method is excellent in heat resistance without being denatured even at a high temperature of 110 ° C. When solutions found to exhibit triple helix structure collagen solution, and completed the present invention.
  • a crude collagen precipitate containing 12 to 50% by mass of a collagen precipitate and / or a collagen derivative precipitate having an average particle diameter of 1 to 1,000 ⁇ m is dispersed in a hydrophilic organic solvent to separate a solid matter. It is intended to provide collagen powder and / or collagen derivative powder obtained by taking and drying.
  • the present invention provides a solution containing collagen and / or a collagen derivative by isoelectric point precipitation at pH 3.5 to 10 while controlling the association of collagen and / or collagen derivative, and having an average particle size of 1 to 1,000 ⁇ m.
  • a crude collagen precipitate containing 12-50% by mass by adjusting the concentration of the collagen precipitate and / or collagen derivative precipitate contained in the isoelectric point precipitate.
  • the present invention provides a method for producing collagen powder and / or collagen derivative powder, which comprises dispersing a collagen precipitate in a hydrophilic organic solvent, separating a solid, and drying.
  • the present invention also provides isoelectric point precipitation of a solution containing collagen and / or a collagen derivative at pH 3.5 to 10 and crushing the precipitate to obtain an average particle size of 1 to 1,000 ⁇ m. And adjusting the concentration of the collagen precipitate and / or collagen derivative precipitate contained in the isoelectric point precipitate to obtain a crude collagen precipitate containing 12 to 50% by mass, and the crude collagen precipitate is hydrophilic.
  • a method for producing a collagen powder and / or a collagen derivative powder characterized by being dispersed in an organic solvent, separating a solid, and drying.
  • the present invention also provides a salted-out product having an average particle size of 1 to 1,000 ⁇ m by salting out a solution containing collagen and / or a collagen derivative while controlling the association of collagen and / or collagen derivative,
  • concentration of the collagen precipitate and / or collagen derivative precipitate contained in the salted-out product is adjusted to 12 to 50% by mass to obtain a crude collagen precipitate, and the crude collagen precipitate is dispersed in a hydrophilic organic solvent to obtain a solid
  • An object of the present invention is to provide a method for producing a collagen powder and / or a collagen derivative powder, wherein the product is separated and dried.
  • a solution containing collagen and / or a collagen derivative is salted out, and the salted-out product is crushed to obtain a salted-out product having an average particle size of 1 to 1,000 ⁇ m.
  • the concentration of the collagen precipitate and / or collagen derivative precipitate contained is adjusted to 12 to 50% by mass to obtain a crude collagen precipitate, the crude collagen precipitate is dispersed in a hydrophilic organic solvent, and a solid is separated.
  • the present invention provides a method for producing collagen powder and / or collagen derivative powder, characterized by drying.
  • the present invention also provides a method for producing the collagen powder and / or collagen derivative powder, wherein the hydrophilic organic solvent is alcohol, ketone, ether, or a mixture thereof.
  • the collagen and / or collagen derivative when the collagen and / or collagen derivative is associated with the collagen and / or collagen derivative solution to form a collagen precipitate and / or collagen derivative precipitate, the collagen and / or collagen derivative solution is used.
  • Collagen and / or collagen derivative is precipitated by salting out by adding salt while stirring, or by adjusting said collagen and / or collagen derivative solution to pH 3.5-10 and stirring Is allowed to adjust the particle size of the collagen precipitate and / or collagen derivative precipitate.
  • the collagen powder and / or collagen derivative powder obtained by the production method of the present invention is excellent in thermal stability and storage stability.
  • the collagen powder and / or collagen derivative powder solution is excellent in moisture retention of the skin and the like because the collagen and / or collagen derivative forms a triple helical structure.
  • the collagen powder and / or collagen derivative powder of the present invention is superior in transport efficiency compared to these solutions, and can reduce storage and transport costs. Furthermore, since a solution of collagen or the like has a high viscosity, adhesion to the container, remaining, loss or the like occurs during transfer from the container. However, collagen powder can avoid these problems and perform a simple operation.
  • the concentration of the collagen precipitate and / or the collagen derivative precipitate of the crude collagen precipitate is 12 to 50% by mass, and therefore, dehydration with a hydrophilic organic solvent is easy. It can be dried and is very easy to manufacture.
  • FIG. 1 is a view showing a phase contrast microscopic image of a collagen precipitate prepared in Example 1.
  • FIG. 2 is an electron microscopic image of collagen powder prepared in Example 1.
  • FIG. 2 It is a figure which shows the result of the differential scanning calorimeter (DSC) of the collagen powder prepared in Example 1.
  • DSC differential scanning calorimeter
  • FIG. 2 is a graph of particle size distribution of collagen powder obtained in Example 1.
  • FIG. 2 is a diagram showing an electron microscopic image of collagen powder whose particle size distribution was measured in Example 1.
  • FIG. FIG. 4 is an electron micrograph of collagen powder prepared in Example 4. It is a figure which shows the circular dichroism of the collagen solution which melt
  • FIG. 1 It is a figure which shows the phase-contrast microscope image of the collagen deposit prepared in the comparative example 3. It is a figure of the particle size distribution of the collagen powder obtained in Comparative Example 4.
  • the comparative example 4 it is a figure which shows the electron microscope image of the collagen powder formed by drying using a spray dryer. It is the figure which calculated the initial dissolution speed
  • FIG. It is a figure which shows the electron microscope image of the collagen sponge obtained in the comparative example 5. It is a figure which shows the electron microscope image of the collagen fiber obtained by the comparative example 6.
  • a crude collagen precipitate containing 12 to 50% by mass of a collagen precipitate and / or a collagen derivative precipitate having an average particle diameter of 1 to 1,000 ⁇ m is dispersed in a hydrophilic organic solvent, and a solid matter is dispersed. It is a collagen powder and / or collagen derivative powder obtained by separating and drying.
  • a solution containing collagen and / or a collagen derivative is subjected to isoelectric precipitation at pH 3.5 to 10 while controlling the association of collagen and / or collagen derivative, or the like.
  • the electric point precipitate is crushed to obtain an isoelectric point precipitate having an average particle diameter of 1 to 1,000 ⁇ m, and the concentration of the collagen precipitate and / or collagen derivative precipitate contained in the isoelectric point precipitate is adjusted.
  • a collagen powder and / or a collagen derivative characterized in that a crude collagen precipitate containing 12 to 50% by mass is dispersed, the crude collagen precipitate is dispersed in a hydrophilic organic solvent, a solid is separated, and dried. It is a manufacturing method of powder.
  • a solution containing collagen and / or a collagen derivative is salted out while controlling the association of collagen and / or collagen derivative, or the salted-out product is crushed to obtain an average particle.
  • a method for producing a collagen powder and / or a collagen derivative powder characterized by dispersing a crude collagen precipitate in a hydrophilic organic solvent, separating a solid, and drying.
  • Collagen and / or Collagen Derivative are a kind of protein and is a general term for three polypeptide chains wound in a spiral.
  • types I to XXIX are known, but any collagen may be used as the collagen used in the present invention.
  • Most of the collagen contained in the living body is insoluble in water.
  • collagen contained in raw materials such as animal skin and bone is solubilized by adding an enzyme such as protease, and alkali is added.
  • the solubilized product is called “solubilized collagen”.
  • raw materials such as animal skin and bone contain slightly soluble collagen that is soluble in a neutral salt solution or an acidic solution.
  • the collagen used in the present invention is soluble in an aqueous solution, it may be a solubilized insoluble collagen, or may be a soluble collagen originally contained.
  • the description will be given using “solubilized collagen” prepared from insoluble collagen present in large amounts in the living body as a raw material, but “collagen” in the present invention includes “soluble collagen” and “solubilized”. Both “collagen” are included.
  • the “collagen fiber” means a plurality of “collagen molecules” associated with each other. The collagen molecules correspond to the solubilized collagen and soluble collagen. When the solubilized collagen solution is isoelectrically precipitated or salted out, collagen molecules associate with each other, and collagen fibers can be separated as a precipitate.
  • Collagen fibers may precipitate as large aggregates by associating a plurality of collagen fibers during precipitation. Therefore, in the present invention, “association” includes both binding of collagen molecules and binding of collagen fibers. Further, “collagen precipitate” means collagen precipitated as a solid from a collagen solution, and “collagen powder” means “powdered solid matter of collagen precipitate”.
  • the “collagen” used in the present invention includes, for example, those in which asparagine residues, glutamine residues and the like have been changed to aspartic acid residues and glutamic acid residues by alkali deamidation by alkali treatment. That is, the isoelectric point is adjusted to be acidic or neutral by changing the amide group contained in the collagen molecule to a carboxyl group and making the effective charge of the collagen negative.
  • amino acid which comprises collagen may be modified in this way.
  • the “collagen derivative” in the present invention means one obtained by modifying the amino acid constituting the collagen with another functional group.
  • examples include acylated collagen and esterified collagen.
  • the collagen derivative may be an acylated collagen or an esterified collagen prepared in advance, or an esterified or acylated collagen during salting out or isoelectric precipitation.
  • the isoelectric point Prior to the step of extracting solubilized collagen or soluble collagen from the collagen-containing tissue, the isoelectric point may be adjusted by acylating the collagen, and the insoluble contained in the collagen-containing tissue in advance is used as a method for producing esterified collagen.
  • Collagen may be esterified, and then the esterified collagen may be collected by isoelectric precipitation.
  • the acylated collagen and esterified collagen include the following.
  • acylated collagen examples include succinylated collagen, phthalated collagen, and maleylated collagen.
  • succinylated collagen, phthalated collagen, maleylated collagen prepared by adjusting an atelocollagen solution extracted by enzyme treatment to pH 9-12 and then adding an acid anhydride such as succinic acid, phthalic anhydride, maleic anhydride, etc.
  • acid anhydride such as succinic acid, phthalic anhydride, maleic anhydride, etc.
  • acylated collagen examples include succinylated collagen, phthalated collagen, and maleylated collagen.
  • esterified collagen in addition to esterified solubilized collagen, esterified collagen that has been solubilized by enzymatic reaction after insoluble collagen has been esterified can be used.
  • secondary alcohols and tertiary alcohols may be used in addition to primary alcohols.
  • monohydric alcohols include methanol, ethanol, 1-propanol, 2-propanol, 1-butanol, dl-2-butanol, tert-butanol, 1-pentanol, dl-2-pentanol, and 3-pentanol.
  • dihydric alcohol examples include ethylene glycol, diethylene glycol, triethylene glycol, tetraethylene glycol, polyethylene glycol (MW 200 to 20000), propylene glycol, 1,3-propanediol, dipropylene glycol, glycerin, 1 , 2-butanediol, 1,3-butanediol, 1,4-butanediol, 2,3-butanediol, 1,5-pentanediol, 2,4-pentanediol, 1,6-hexanediol, 2, There is 5-hexanediol.
  • Other polyhydric alcohols include glycerin and various sugar alcohols.
  • the collagen derivative and collagen used in the present invention have a triple helical structure in the solution.
  • Crude collagen precipitate The crude collagen precipitate used in the present invention is “a crude collagen precipitate containing 12 to 50% by mass of a collagen precipitate and / or a collagen derivative precipitate having an average particle diameter of 1 to 1,000 ⁇ m. It is.
  • solubilized collagen can be prepared by enzymatic treatment or alkali treatment of such insoluble collagen.
  • solubilized collagen is prepared in an aqueous solution and purified by salting out or isoelectric precipitation to form a solid precipitate.
  • the collagen precipitate thus obtained is used. This is because such collagen precipitates and collagen powders obtained from these precipitates become collagen solutions having a triple helix structure when dissolved again in the solution.
  • the average particle size of the collagen precipitate and / or collagen derivative precipitate contained in the crude collagen precipitate is limited to 1 to 1,000 ⁇ m because the collagen precipitate can be efficiently dehydrated with a hydrophilic organic solvent and air-dried. This is because it has been found that the powder obtained can be made into a fine collagen powder. For this reason, in this invention, the method of controlling the average particle diameter of a collagen precipitate to the short diameter side was also discovered. That is, when the solubilized collagen solution is subjected to isoelectric precipitation or salting out, collagen molecules associate with each other to form collagen fibers, and further, collagen fibers associate with each other to form aggregates. 2,000 ⁇ m or more.
  • the average particle size of the resulting collagen precipitate can be controlled to 1 to 1,000 ⁇ m, and finally the average A collagen powder having a particle size of 1 to 1,000 ⁇ m can be obtained.
  • the average particle diameter of the crude collagen precipitate used in the present invention is 1 to 1,000 ⁇ m, more preferably 5 to 900 ⁇ m, particularly preferably 10 to 750 ⁇ m, and further preferably 30 to 500 ⁇ m. If the average particle size exceeds 1,000 ⁇ m, powdering may be difficult.
  • the major axis of the collagen molecule is 300 nm, and when the collagen molecules do not associate with each other, the collagen particle diameter is 300 nm. However, as will be described later, it has been found that such SLS fibers formed by binding a plurality of collagen molecules of 300 nm in parallel form aggregates by associating the SLS fibers with each other.
  • the average particle diameter of the coarse collagen precipitate in this application is a value observed with a phase contrast microscope.
  • the major axis of the phase contrast microscope image is used as the particle diameter of the crude collagen precipitate, and the average particle diameter is obtained by averaging the particle diameters of all the crude collagen precipitates included in the ten visual fields.
  • the solution in which the solubilized collagen or collagen derivative is dissolved is subjected to physical treatment or chemical treatment. It can be adjusted by physically crushing the precipitate that has been treated or formed.
  • (I-1) Physical treatment
  • a physical treatment method for example, salting out a solution dissolving collagen or a collagen derivative while stirring, or isoelectric focusing at pH 3.5 to 10 while stirring the solution.
  • Agitation suppresses the association of collagen molecules to form collagen fibers having a short fiber length, and further suppresses the formation of aggregates due to the association of a plurality of collagen fibers.
  • a collagen precipitate having a short particle diameter can be precipitated by crushing the generated precipitate.
  • the degree of stirring can be appropriately selected depending on the concentration of collagen or collagen derivative in the solution, the stirring method, the shape and size of the stirring container, and the like.
  • association inhibitors include sugars such as glucose, sucrose, xylose, galactose, fructose, glycerin.
  • ATP adenosine triphosphate
  • ATP adenosine triphosphate
  • ATP is added to a collagen solution under acidic conditions, and the basic sites of the collagen molecule are cross-linked with the phosphate group of ATP.
  • ATP crosslinks a plurality of collagen molecules in parallel, and generates SLS (Segment-long-spacing) fibers in which the basic sites of the collagen molecules are cross-linked with the phosphate groups of ATP.
  • SLS fibers having an average particle diameter of 300 nm are formed by connecting 300 nm collagen molecules in parallel.
  • a plurality of SLS fibers associate to form an aggregate and precipitate.
  • the SLS fiber contains ATP as a crosslinking agent in addition to collagen, but can be pulverized while containing ATP in the same manner as other collagens and collagen derivatives. Alternatively, ATP may be removed after obtaining a precipitate of SLS fibers and then powdered.
  • the concentration of the collagen precipitate and / or collagen derivative precipitate having an average particle diameter of 1 to 1,000 ⁇ m in the crude collagen precipitate is 12 to 50% by mass, more preferably 15 to 40% by mass, particularly Preferably, it is 20 to 35% by mass. If it is less than 12% by mass, the water content of the crude collagen precipitate is too high, so that the dehydration efficiency by the hydrophilic organic solvent is poor, and when dried, it may become a film without becoming a fine and porous collagen powder. On the other hand, it is not easy to prepare a crude collagen precipitate of 50% by mass or more, and it may not be uniformly dispersed in a hydrophilic organic solvent.
  • the main component other than the collagen precipitate and / or collagen derivative precipitate contained in the crude collagen precipitate is an aqueous solution constituting the collagen solution and collagen derivative solution before precipitation.
  • a crude collagen precipitate obtained by isoelectric point precipitation or salting out can be used as a raw material. Since salting out is also performed in the step of preparing the isoelectric point precipitate, a method for preparing the crude collagen precipitate will be described below in the case of preparing the isoelectric point precipitate. In the present invention, any of collagen types I to XXIX can be used, but the case where type I collagen is extracted from a living body will be described below.
  • the collagen used in the present invention can be collected from the skin of animals such as cows, pigs, birds and fish and other tissues containing collagen.
  • collagen is contained in a large amount in connective tissues of animals, but when extracted by heat treatment, the collagen is thermally denatured and the specific triple helix structure is broken, resulting in a gelatin state.
  • collagen that can form a triple helical structure is used.
  • Examples of such collagen extraction methods include solubilization methods using alkali treatment, acid treatment, and enzyme treatment using animal bones and skins as materials.
  • collagen extraction materials include dermis and tendons of cows, pigs, chickens, ostriches, horses, fishes and the like. It is preferable to use a tissue of a young animal such as a fetus because the yield is improved.
  • Insoluble collagen was suspended in a solubilized aqueous solution mixed to a final concentration of 3% by mass sodium hydroxide and 1.9% (v / w) monomethylamine to a final collagen concentration of 4.5% by mass, and 18 ° C. Solubilization treatment is performed for 3 weeks.
  • salt such as sodium chloride is added to salt out to a final concentration of 5% by mass, the salted out precipitate is redissolved in an aqueous solution prepared acidic with hydrochloric acid, etc., and cloth, filter paper, metal mesh
  • a crude collagen precipitate having an isoelectric point of 4.5 can be obtained by purifying the solution by filtration with a solution such as sodium hydroxide and adjusting the collagen solution to pH 4.5 with sodium hydroxide.
  • the average particle size can be adjusted to 1 to 1,000 ⁇ m by performing isoelectric precipitation or salting out at pH 4.5 while stirring the collagen solution.
  • the method for controlling the average particle size is the same for (iii-2), (iii-3), and (iii-4).
  • Insoluble collagen obtained by pulverizing the dermis layer of cattle skin with meat grinding etc. and thoroughly washing after degreasing can be used as a raw material. Insoluble collagen is suspended in distilled water to a final collagen concentration of 1% by mass, and then adjusted to pH 3.0 by adding hydrochloric acid. One-hundredth amount of acidic protease is added to the collagen weight, and solubilization treatment is performed at 25 ° C. for 72 hours.
  • hydrochloric acid is added to stop the reaction, sodium chloride is added to salt out to a final concentration of 5% by mass, and the precipitate is recovered by centrifugation.
  • the recovered salting-out precipitate is dispersed in distilled water having a volume of 2% by mass of collagen, and hydrochloric acid is added to adjust the pH to 3.0 to dissolve it uniformly to obtain a collagen solution.
  • the collagen solution is filtered with a cloth and filter paper, and then adjusted with sodium hydroxide so as to have a desired isoelectric point pH, whereby a crude collagen precipitate having an isoelectric point of 4.5 to 9.0 is obtained. Obtainable.
  • the recovered salting-out precipitate is dispersed in distilled water having a volume of 2% by mass of collagen, and hydrochloric acid is added to adjust the pH to 3.0, which is uniformly dissolved to obtain a collagen solution.
  • this collagen solution is filtered with a cloth and filter paper, and then adjusted to have a desired isoelectric point pH with sodium hydroxide, whereby a crude collagen precipitate having an isoelectric point of 4.5 to 9.0 is obtained. Obtainable.
  • Isoelectric point The isoelectric point of collagen and collagen derivatives can be adjusted by a solubilization method and others.
  • the isoelectric point precipitate collagen and / or collagen derivatives obtained by adjusting the collagen and / or collagen derivative solution to pH 3.5 to 10 are targeted.
  • isoelectric point is meant the pH of a solution in which collagen and / or collagen derivatives exhibit minimal solubility in an aqueous solution containing collagen and / or collagen derivatives.
  • the isoelectric point of collagen is pH 4.3 to 9.3, but a precipitate can be formed even in a solution of less than pH 4.3 or more than pH 9.3.
  • the collagen and / or collagen derivative solution is adjusted to pH 3
  • the collagen and / or collagen derivative obtained by adjusting to 5 to 10 was used as an isoelectric point precipitate. More preferably, it is an isoelectric precipitate having a pH of 4.0 to 9.0, particularly preferably pH 4.5 to 9.0. Depending on the application, an isoelectric precipitate having a pH of 3.5 to 8.0, a pH of 3.5 to 7.0, a pH of 3.5 to 6.0, or a pH of 4.5 to 5.0 may be used. .
  • the collagen powder of the present invention is considered to be excellent in solubility because it has almost the same specific surface area as fine particles even if the average particle size is large, and neutrality that is inherently poor in solubility. Excellent solubility even in solution.
  • the crude collagen precipitate recovered by adjusting the collagen and / or collagen derivative-containing solution to pH 4.5 has an isoelectric point of pH 4.5, and the collagen and / or collagen derivative-containing aqueous solution is adjusted to pH 9.0.
  • the isoelectric point of the crude collagen precipitate recovered in this way is pH 9.0.
  • the “crude collagen precipitate” dispersed in the hydrophilic organic solvent is not limited to a crude collagen precipitate having an isoelectric point of pH 4.5 or a crude collagen precipitate having an isoelectric point of pH 9.0.
  • a mixture of a crude collagen precipitate having an isoelectric point of pH 4.5 and a crude collagen precipitate having an isoelectric point of pH 9.0 can also be used.
  • the concentration of the collagen precipitate and / or collagen derivative precipitate contained in the crude collagen precipitate is not limited to the isoelectric point, and the collagen precipitate and / or collagen derivative precipitate is hydrophilic, This is because a fine collagen powder and / or collagen derivative powder can be produced by uniformly dispersing in an organic solvent.
  • hydrophilic organic solvent for dispersing the crude collagen precipitate described above is not particularly limited as long as it is a carbon-containing solvent miscible with water.
  • hydrophilic organic solvent for dispersing the crude collagen precipitate described above is not particularly limited as long as it is a carbon-containing solvent miscible with water.
  • alcohol, ketone, ether, ester, Examples include polar aprotic solvents.
  • Examples of the alcohol include monohydric alcohols having 1 to 6 carbon atoms such as methanol, ethanol, isopropanol, and t-butanol, and polyhydric alcohols such as ethylene glycol and propylene glycol.
  • Examples of the ketone include acetone and methyl ethyl ketone.
  • Examples of ethers include glycol ethers such as diethyl ether, methyl ethyl ether, ethylene glycol monomethyl ether and diethylene glycol monobutyl ether, and cyclic ethers such as tetrahydrofuran and dioxane.
  • examples of the ester include ethyl acetate and ethyl lactate
  • examples of the polar aprotic solvent include dimethyl sulfoxide (DMSO), dimethylformamide (DMF), and pyridine.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • DMF dimethylformamide
  • pyridine aprotic solvent
  • preferred are those miscible with water at an arbitrary ratio, for example, acetone, methanol, ethanol, isopropanol, acetonitrile, tetrahydrofuran, dimethyl sulfoxide, dimethylformamide and the like.
  • ethanol, acetone, diethyl ether, or a mixed solution thereof can be preferably used.
  • the amount used can be appropriately selected depending on the hydrophilic organic solvent.
  • ethanol when ethanol is used, ethanol is used in an amount of 3 to 2000 parts by weight, preferably 5 to 5 parts per 1 part by weight of the crude collagen precipitate. It is preferable to add 1000 parts by mass, more preferably 10 to 100 parts by mass, particularly preferably 10 to 30 parts by mass.
  • Collagen powder and collagen derivative powder The collagen powder and / or collagen derivative powder of the present invention is obtained by dispersing the crude collagen precipitate in a hydrophilic organic solvent, separating a solid, and drying. A collagen powder or a collagen derivative powder obtained by dehydrating a crude collagen precipitate with a hydrophilic organic solvent and drying the obtained solid.
  • the crude collagen precipitate is adjusted to a specific isoelectric point by isoelectric precipitation. Since this isoelectric point does not change by dehydration with a hydrophilic organic solvent or subsequent drying, the isoelectric point of the collagen powder or collagen derivative powder of the present invention depends on the isoelectric point at the time of isoelectric point precipitation. .
  • a crude collagen precipitate with an isoelectric point of pH 4.5 is used, it becomes a collagen powder and / or collagen derivative powder with an isoelectric point of pH 4.5, and a crude collagen precipitate with an isoelectric point of pH 9.0 is used. In this case, collagen powder and / or collagen derivative powder having an isoelectric point of pH 9.0 is obtained.
  • collagen powder and / or collagen derivative having an isoelectric point of pH 4.5 to 9.0 it becomes powder.
  • the collagen powder and / or collagen derivative powder of the present invention has an isoelectric point of pH 3.5 to 8.0, more preferably isoelectric point pH 3.5 to 7.0, particularly isoelectric point pH 3.5 to 6.
  • the initial dissolution rate of the pH 6.5 solution of 5 mg of the powder is 0.2 mg / min or more, more preferably 0.3 mg / min or more, and particularly preferably 0.5 mg / min or more.
  • “dissolution initial rate” is measured by the method shown in the examples described later.
  • the average particle size of the collagen powder and collagen derivative powder of the present invention is not limited, but by using a crude collagen precipitate or the like having an average particle size of 1 to 1,000 ⁇ m, the average particle size finally becomes 8 to 1,
  • the average particle diameter of the collagen powder and the collagen derivative powder is also a value measured by an electron microscope, as in the case of the coarse collagen precipitate described above. As described above, it is usually 2000 ⁇ m or more due to the association, and less than 5 ⁇ m according to the spray drying.
  • the collagen powder and collagen derivative powder of the present invention have an average particle size of 8 to 1,000 ⁇ m, scattering can be prevented and fluidity can be secured. In addition, as shown in the examples described later, if the average particle size of the collagen powder is less than 5 ⁇ m, it may form lumps in the solution and lower the solubility. Excellent solubility. In the collagen powder and collagen derivative powder of the present invention, since the crude collagen precipitate is dispersed in a hydrophilic organic solvent, the collagen is finely dispersed in the solvent, the resulting precipitate becomes porous, and the specific surface area is increased. It has been found.
  • the specific surface area of the collagen powder and collagen derivative powder of the present invention is 0.5 m 2 / g or more, preferably 0.8 to 30 m 2 / g, more preferably 1.0 to 25 m 2 / g, particularly preferably. It is 1.2 to 20 m 2 / g, more preferably 1.5 to 20 m 2 / g. Such specific surface area ensures hydrophilicity and solubility.
  • the average particle size of the collagen precipitate and / or collagen derivative precipitate is controlled to 1 to 1,000 ⁇ m, and the concentration of the collagen precipitate and collagen derivative precipitate contained in the crude collagen precipitate is 12 to Since it was controlled to 50% by mass, it could be dehydrated in the form of powder even when dehydrated with a hydrophilic organic solvent, and the collected solid matter became collagen powder and / or collagen derivative powder by air drying.
  • the collagen precipitate before being dispersed in the hydrophilic organic solvent has an average particle size of 1 to 1,000 ⁇ m, it is found that when it is air-dried, it becomes a collagen powder having an average particle size of 8 to 1,000 ⁇ m. did. This is considered to be because the association and aggregation of collagen are avoided in the dispersion into the hydrophilic organic solvent and the drying step.
  • the collagen derivative powder or the collagen powder may be further finely processed.
  • the collagen powder and / or collagen derivative powder of the present invention is dried without undergoing a heating step, when it is dissolved, it becomes a triple helical collagen.
  • the collagen powder and collagen derivative powder of the present invention are excellent in heat resistance, and therefore do not need to be refrigerated like conventional collagen solutions.
  • the aggregates and collagen fibers dissolve as original collagen molecules and collagen derivative molecules. Therefore, when this solution is subjected to isoelectric point precipitation or salting out by a conventional method, a collagen precipitate or a collagen derivative precipitate having an average particle diameter larger than 1,000 ⁇ m, that is, a conventional collagen precipitate of about 2,000 ⁇ m is formed. be able to.
  • the collagen powder and collagen derivative powder of the present invention can be suitably used for medical applications and cosmetic applications.
  • cosmetic applications include lotion, milky lotion, beauty essence, general cream, cleansing facial cleanser, pack, shave cream, sunscreen cream, sunscreen lotion, sunscreen lotion, cosmetic soap, foundation, funny, lipstick , Lip balm, shampoo, rinse and the like.
  • DDS Drug Delivery System
  • ES cells ES cells
  • iPS cells culture substrates of various cells such as ES cells and iPS cells
  • hemostatic agents such as ES cells and iPS cells
  • wound wound treatment agents bone fillers, and the like.
  • Can do DDS (Drug Delivery System) carriers used in regenerative medicine, culture substrates of various cells such as ES cells and iPS cells, hemostatic agents, wound wound treatment agents, bone fillers, and the like. Can do.
  • the collagen powder and / or collagen derivative powder of the present invention is prepared by isoelectrically treating a solution containing collagen and / or collagen derivative at pH 3.5 to 10 while controlling the association of collagen and / or collagen derivative.
  • an isoelectric point precipitate having an average particle diameter of 1 to 1,000 ⁇ m is obtained, and the concentration of collagen precipitate and / or collagen derivative precipitate contained in the isoelectric point precipitate is adjusted to 12 to 50
  • a crude collagen precipitate containing mass% can be produced by dispersing the crude collagen precipitate in a hydrophilic organic solvent, separating a solid, and drying.
  • salting out is performed by changing to an isoelectric point precipitate to obtain a salted-out precipitate having an average particle size of 1 to 1,000 ⁇ m, and the concentration of the collagen precipitate and / or collagen derivative precipitate contained in the salted-out precipitate is adjusted.
  • the crude collagen precipitate can be prepared by adjusting to 12 to 50% by mass, and the crude collagen precipitate can be dispersed in a hydrophilic organic solvent, and the solid matter can be collected and dried.
  • the precipitate may be crushed with a mortar mill or the like together with the solution. Since it is in solution, the precipitate can be crushed without heating, aggregates can be separated, and the particle size of the precipitate can be reduced.
  • the degree of stirring and crushing can be appropriately selected depending on the concentration of collagen or collagen derivative in the solution, the stirring method, the shape and size of the stirring container, etc., but as described above, when using a homogenizer, the rotational speed 1,000 to 20,000 rpm and the stirring time can be appropriately selected according to the number of rotations and the like, and are 1 minute to 5 hours.
  • the rotational speed 1,000 to 20,000 rpm and the stirring time can be appropriately selected according to the number of rotations and the like, and are 1 minute to 5 hours.
  • a collagen precipitate or collagen derivative precipitate having a desired average particle diameter can be obtained.
  • the collagen precipitate and the collagen derivative precipitate are crushed in the collagen solution as described above. This is because the step of separating the precipitate from the solution is unnecessary and the crushing efficiency is excellent.
  • the above-described association inhibitor may be added as a method for suppressing the association of collagen molecules.
  • an association inhibitor such as adenosine triphosphate (ATP) is added to the collagen solution under acidic conditions.
  • ATP adenosine triphosphate
  • 300 nm SLS fibers are generated, and an aggregate formed by associating a plurality of SLS fibers can be obtained as a precipitate.
  • the collagen solution may be agitated to physically suppress association. Aggregation of SLS fibers can be crushed by stirring, and the particle diameter of the precipitate can be adjusted to a shorter diameter.
  • an isoelectric point precipitate having a concentration of collagen precipitate and / or collagen derivative precipitate of 12 to 50% by mass is used as the crude collagen precipitate.
  • concentration of the collagen precipitate and / or collagen derivative precipitate contained was less than 12% by mass, the isoelectric point collected by centrifugation or filtration was adjusted again to the same pH as the isoelectric point precipitation. It can be washed with water for desalting, centrifuged again, filtered, etc. and used as a crude collagen precipitate.
  • the crude collagen precipitate thus obtained is dispersed in the hydrophilic organic solvent. This is for dehydrating the crude collagen composition.
  • the temperature of the hydrophilic organic solvent used is preferably 15 ° C. or lower. This is to maintain the triple helix structure without denaturing the solubilized collagen or collagen derivative.
  • the amount of the hydrophilic organic solvent used with respect to the crude collagen precipitate can be appropriately selected depending on the hydrophilic organic solvent to be used. For example, when ethanol is used, 1 part by mass of the crude collagen precipitate is used. It is preferable to add 3 to 2000 parts by mass of ethanol, preferably 5 to 1000 parts by mass, more preferably 10 to 100 parts by mass, and particularly preferably 10 to 30 parts by mass.
  • the concentration of the hydrophilic organic solvent is preferably 75% by mass or more, more preferably 90% by mass or more, more preferably 95% by mass or more. is there.
  • the concentration of the hydrophilic organic solvent in the collagen dispersion liquid in which the crude collagen precipitate is dispersed in the hydrophilic organic solvent is less than 75% by mass, the collagen recovered from the hydrophilic organic solvent absorbs moisture, so that it is dried for a long time. Since time is required and the collagen molecules are closely adhered to each other during drying, there may be cases where fine and porous collagen powder and / or collagen derivative powder are not obtained.
  • the crude collagen precipitate may be stirred after being dispersed in a hydrophilic organic solvent.
  • the rotational speed is 1,000 to 20,000 rpm, more preferably 2,000 to 13,000 rpm, particularly preferably 2,500 to 10,000 rpm, and particularly preferably 3,000 to 5, Stir at 000 rpm.
  • the stirring time can be appropriately selected depending on the number of rotations, and is 1 minute to 5 hours, more preferably 1 minute to 3 hours, particularly preferably 3 minutes to 1 hour, and further preferably 5 minutes to 30 minutes. is there.
  • the said stirring conditions are illustrations and it changes with the stirring methods of a stirring apparatus. It can be appropriately selected according to the actual degree of dispersion.
  • the solid can be dried to obtain a collagen powder and / or a collagen derivative powder.
  • the present invention is characterized in that the solid matter can be dried by air drying at room temperature. However, you may dry by other methods, such as using a dryer. At that time, the temperature is preferably less than 15 ° C.
  • Collagen precipitates and collagen derivative precipitates constituting the crude collagen precipitate have an average particle diameter of 1 to 1,000 ⁇ m, which is shorter than conventional ones, and therefore have a large surface area per unit mass and can be easily dehydrated with a hydrophilic organic solvent.
  • the concentration of the collagen precipitate and / or collagen derivative precipitate contained in the crude collagen precipitate is 12 to 50% by mass, so that the amount of water contained in the hydrophilic organic solvent is reduced and drying by air drying is performed. It is considered that the powdering of collagen precipitates and collagen derivative precipitates has become possible.
  • heat treatment can be avoided, and heat denaturation of the collagen powder and / or collagen derivative powder can be prevented. Thereby, the solution of collagen powder and / or collagen derivative powder exhibits a triple helical structure.
  • the collagen powder and / or collagen derivative powder thus obtained may be further crushed with a mill or the like to adjust the particle size.
  • collagen purification methods include a salting-out method in which salts are added to an acidic collagen solution for precipitation, an organic solvent precipitation method in which an organic solvent is added, and an isoelectric precipitation method in which an acid or alkali is added. It has been. However, there have been only examples in which collagen is pulverized by adding a hydrophilic organic solvent to an isoelectric precipitate or salted-out product of a collagen solution having an isoelectric point of pH 3.5 to 10. This is because collagen is inherently highly hydrophilic and contains a large amount of water in the isoelectric precipitate, so that it is common to form a solid by freeze drying or spray drying.
  • collagen powder can be obtained by air drying.
  • collagen solution is precipitated by pouring a solution having a collagen concentration of 0.1 to 10% by mass into a hydrophilic organic solvent through a nozzle discharge hole, pores are formed on the surface of the resulting collagen fiber. It becomes a film with a smooth surface.
  • Example 1 The dermis layer of pork skin was pulverized with minced meat and the like, and insoluble collagen washed thoroughly after degreasing was used as a raw material. Insoluble collagen prepared to a final collagen concentration of 4.5% by mass was suspended in a solubilized aqueous solution mixed to a final concentration of 3% by mass sodium hydroxide and 1.9% (v / w) monomethylamine. The solubilization treatment was performed at 3 ° C. for 3 weeks. Sodium chloride was added to the alkali-solubilized collagen solution obtained as described above so as to have a final concentration of 5% by mass for salting out, and the precipitate was collected by centrifugation.
  • the recovered salting-out precipitate was dispersed in a distilled water having a collagen concentration of 3% by mass, adjusted to pH 3.0 by adding hydrochloric acid, and uniformly dissolved.
  • the pH is adjusted to 4.5 with sodium hydroxide, and a flow rate of 500 ml / min, a rotation speed of 1,500 rpm, and a clearance with a mascolloider (stone mill grinder: manufactured by Masuko Sangyo Co., Ltd.)
  • the collagen was isoelectrically precipitated while stirring at 50 ⁇ m.
  • the average particle size of the collagen precipitate contained in the obtained precipitate was 141 ⁇ m.
  • the obtained collagen powder was observed with an electron microscope image. The results are shown in FIG.
  • the average particle size of the powdered collagen was 158 mm, and was found to be a porous powder.
  • the dissolution initial velocity was measured using the solution B. Since collagen is highly hydrophilic and the difference between dissolution and swelling is unclear, the initial dissolution rate was measured as follows. Measurement of initial dissolution rate Mix in a cylindrical tube with an inner diameter of 10 mm, a length of 40 mm, and a volume of 2 ml with 5 ml of the sample together with 1 ml of the solution B in Table 1, and mix by inverting at 180 ° C. 20 times per minute. It was. The solution B and the operation were performed at a temperature of 20 ° C.
  • FIG. 12 shows the change over time in the collagen concentration of the supernatant in the measurement of the dissolution initial rate.
  • Example 2 A collagen powder was obtained in the same manner as in Example 1 except that the hydrophilic organic solvent for dispersing the crude collagen precipitate was changed to acetone. Using 5 mg of the obtained collagen powder, the same operation as in Example 1 was performed to evaluate the solubility. Table 1 shows the summary of Example 2, Table 5 shows the solubility, and Table 6 shows the results of the initial dissolution rate. By adding the dissolving solution, the collagen powder quickly dissolved to become a transparent collagen solution.
  • Example 3 A collagen powder was obtained in the same manner as in Example 1 except that the hydrophilic organic solvent for dispersing the crude collagen precipitate was changed to diethyl ether. Using 5 mg of the obtained collagen powder, the same operation as in Example 1 was performed to evaluate the solubility. Table 1 shows the outline of Example 3, Table 5 shows the solubility, and Table 6 shows the results of the initial dissolution rate. By adding the dissolving solution, the collagen powder quickly dissolved to become a transparent collagen solution.
  • Example 4 The dermis layer of cowhide was pulverized with minced meat, etc., and insoluble collagen washed thoroughly after degreasing was used as a raw material. Insoluble collagen was suspended in distilled water to a final collagen concentration of 2% by mass, and adjusted to pH 3.0 by adding hydrochloric acid. One-hundredth amount of acidic protease was added to the collagen weight, and solubilization treatment was performed at 25 ° C. for 72 hours. After the enzyme reaction was stopped, sodium chloride was added to the enzyme-solubilized collagen solution obtained as described above so as to have a final concentration of 5% by mass for salting out, and the precipitate was collected by centrifugation.
  • the recovered salting out precipitate was dispersed in distilled water having a volume of collagen concentration of 1% by mass, adjusted to pH 3.0 by adding hydrochloric acid, and uniformly dissolved.
  • the pH is adjusted to 9.0 with sodium hydroxide, and collagen is isoelectrically precipitated while stirring with a mass collider at a flow rate of 500 ml / min, a rotation speed of 1,500 rpm, and a clearance of 50 ⁇ m. I let you.
  • the average particle size of the collagen precipitate contained in the obtained precipitate was 131 ⁇ m.
  • the precipitate was recovered by centrifugation at 17,500 rpm for 20 minutes, washed again with distilled water adjusted to pH 9.0, desalted, and centrifuged 10 times to recover as a crude collagen precipitate.
  • the collagen concentration of the crude collagen precipitate was 23% by mass.
  • 50 g of the obtained crude collagen precipitate is put into 950 g of ethanol at a temperature of 20 ° C., dispersed for 30 minutes using a homogenizer, the dispersion is filtered to separate solid collagen, and air-dried at room temperature. A powder was obtained.
  • the obtained collagen powder was observed with an electron microscope image. The results are shown in FIG.
  • the average particle size of the powdered collagen was 333 ⁇ m, and was found to be a porous powder.
  • Example 2 Using 5 mg of the obtained collagen powder, the same operation as in Example 1 was performed to evaluate the solubility. Table 1 shows the outline of Example 4, Table 5 shows the solubility, and Table 6 shows the results of the initial dissolution rate.
  • Example 5 Sodium chloride was added to the enzyme-solubilized collagen solution obtained in Example 4 so that the final concentration was 5% by mass, and the collagen was stirred with a mass collider at a flow rate of 500 ml / min, a rotation speed of 1,500 rpm, and a clearance of 50 ⁇ m. Salting out was performed, and the precipitate was recovered by centrifugation at 17,500 rpm for 20 minutes, and the centrifugation was performed 10 times to obtain a crude collagen precipitate. The average particle size of the collagen precipitate contained in the obtained precipitate was 142 ⁇ m. The collagen concentration of this crude collagen precipitate was 38% by mass.
  • Example 6 Adenosine triphosphate disodium (ATP 2Na) was added to the enzyme-solubilized collagen solution obtained in Example 4 with stirring to a final concentration of 0.22% by mass and allowed to stand on ice for 1 hour. The generated SLS fibers were collected by centrifugation. The average particle size of the collagen precipitate contained in the obtained precipitate was 13.4 ⁇ m. The collagen concentration of this crude collagen precipitate was 12% by mass. Next, 80 mg of the obtained crude collagen precipitate was put into 20 g of ethanol at a temperature of 20 ° C., dispersed for 30 minutes using a homogenizer, the dispersion was filtered to collect solid collagen, and then air-dried at room temperature. A powder was obtained. Table 1 shows the properties of the coarse collagen precipitate, the isoelectric point, the possibility of pulverization, and the like.
  • Example 7 Sodium hydroxide was added to the alkali-solubilized collagen solution obtained in Example 1 to adjust to pH 4.5, and the mixture was allowed to stand to cause isoelectric point precipitation of collagen. Thereafter, the isoelectric point precipitate was crushed with a mass collider under the conditions of a flow rate of 500 ml / min, a rotational speed of 1,500 rpm, and a clearance of 50 ⁇ m. The average particle size of the collagen precipitate contained in the obtained precipitate was 724 ⁇ m. The precipitate was collected by centrifugation, washed again with distilled water adjusted to pH 4.5, desalted, and centrifuged 10 times to collect it as a crude collagen precipitate.
  • the collagen concentration of this crude collagen precipitate was 27% by mass.
  • 50 g of the obtained crude collagen precipitate is put into 950 g of ethanol at a temperature of 20 ° C., dispersed for 30 minutes using a homogenizer, the dispersion is filtered to separate solid collagen, and air-dried at room temperature. A powder was obtained.
  • the same operation as in Example 1 was performed to evaluate the solubility.
  • Table 1 shows the properties of the coarse collagen precipitate, the isoelectric point, the possibility of pulverization
  • Table 5 shows the solubility
  • Table 6 shows the results of the initial dissolution rate.
  • FIG. 12 shows the change over time in the collagen concentration of the supernatant in the measurement of the dissolution initial rate.
  • Example 8 Sodium hydroxide was added to the alkali-solubilized collagen solution obtained in Example 1 to adjust to pH 4.5, and the mixture was allowed to stand to cause isoelectric point precipitation of collagen. Thereafter, the isoelectric point precipitate was crushed three times with a mass collider under the conditions of a flow rate of 500 ml / min, a rotation speed of 1,500 rpm, and a clearance of 50 ⁇ m. The average particle size of the collagen precipitate contained in the obtained precipitate was 335 ⁇ m. The precipitate was collected by centrifugation, washed again with distilled water adjusted to pH 4.5, desalted, and centrifuged 10 times to collect it as a crude collagen precipitate.
  • the collagen concentration of this crude collagen precipitate was 28% by mass.
  • 50 g of the obtained crude collagen precipitate is put into 950 g of ethanol at a temperature of 20 ° C., dispersed for 30 minutes using a homogenizer, the dispersion is filtered to separate solid collagen, and air-dried at room temperature. A powder was obtained.
  • the same operation as in Example 1 was performed to evaluate the solubility.
  • Table 1 shows the properties of the coarse collagen precipitate, the isoelectric point, the possibility of pulverization, Table 5 shows the solubility, and Table 6 shows the results of the initial dissolution rate.
  • Example 9 The alkali-solubilized collagen isoelectric precipitate (isoelectric point pH 4.5) obtained in Example 1 was dispersed in methanol, and hydrochloric acid was added to a final concentration of 0.1M. The esterification reaction was carried out with stirring at room temperature for 3 hours, the pH was neutralized with a sodium hydroxide solution to stop the reaction, and collagen was precipitated. The precipitate was collected by centrifugation and then redissolved in 10 mM acetic acid to obtain methyl esterified collagen. The isoelectric point of methyl esterified collagen was pH 7.9.
  • Sodium chloride is added to the methyl esterified collagen solution to a final concentration of 5% by mass, salted out with stirring by a homogenizer, and the precipitate is recovered by centrifugation at 17,500 rpm for 20 minutes.
  • the crude collagen precipitate was obtained.
  • the average particle size of the collagen precipitate contained in the obtained precipitate was 244 ⁇ m, and the collagen concentration was 29 mass%.
  • 0.5 g of the obtained crude collagen precipitate was put into 9.5 g of ethanol at a temperature of 20 ° C., dispersed for 30 minutes using a homogenizer, the dispersion was filtered to separate solid collagen, and air-dried at room temperature. To obtain a collagen powder.
  • Table 1 shows the properties of the coarse collagen precipitate, the isoelectric point, the possibility of pulverization, and the like.
  • Example 10 Sodium hydroxide solution was added to the enzyme-solubilized collagen solution (isoelectric point pH 9.0) obtained in Example 4 to adjust the pH to 8-9, and collagen was isoelectrically precipitated. Succinic anhydride was added to this isoelectric precipitation solution so as to have a final concentration of 0.5 mM, and an acylation reaction was carried out for 1 hour with stirring at room temperature. After the reaction, hydrochloric acid was added to acidify the solution, and sodium chloride was added to stop the reaction to a final concentration of 5% by mass, and succinylated collagen was precipitated.
  • succinylated collagen was redissolved in 10 mM acetic acid to obtain succinylated collagen.
  • the isoelectric point of succinylated collagen was 5.4.
  • Sodium chloride is added to the succinylated collagen solution to a final concentration of 5% by mass, and salted out with stirring by a homogenizer.
  • the precipitate is recovered by centrifugation at 17,500 rpm for 20 minutes, and the above centrifugation is repeated 10 times. And a crude collagen precipitate was obtained.
  • the average particle size of the collagen precipitate contained in the obtained precipitate was 167 ⁇ m, and the collagen concentration was 42 mass%.
  • Example 11 The enzyme-solubilized collagen solution (isoelectric point 9.0) obtained in Example 4 was adjusted to a collagen concentration of 0.75 mg / ml by adding 5-fold concentration of PBS ( ⁇ ) at 37 ° C. Collagen regenerated fibers were formed with stirring overnight. The regenerated fiber dispersion was crushed with a homogenizer to prepare a fine regenerated fiber dispersion. From this regenerated fiber dispersion, the precipitate was recovered by centrifugation at 17,500 rpm for 20 minutes, and the centrifugation was repeated 10 times to obtain a crude collagen precipitate. The average particle diameter of the collagen precipitate contained in the obtained precipitate was 213 ⁇ m. The collagen concentration of this crude collagen precipitate was 30% by mass.
  • Example 1 50 g of the alkali-solubilized collagen solution obtained in Example 1 (final concentration: 1% by mass) was added to 950 g of ethanol at a temperature of 20 ° C. and dispersed for 30 minutes using a homogenizer, and the dispersion was filtered. However, the filtered collagen dispersion became a film and did not become a powder. Table 1 shows the properties of the coarse collagen precipitate, the isoelectric point, the possibility of pulverization, and the like.
  • Example 2 (Comparative Example 2) Sodium hydroxide was added to the alkali-solubilized collagen solution obtained in Example 1 to adjust to pH 4.5, and the mixture was stirred with a mascolloider at a flow rate of 500 ml / min, a rotation speed of 1,500 rpm, and a clearance of 50 ⁇ m. The collagen was then isoelectrically precipitated. The average particle size of the collagen precipitate contained in the obtained precipitate was 141 ⁇ m. Subsequently, the precipitate was recovered by centrifugation at 17,500 rpm for 20 minutes, washed again with distilled water adjusted to pH 4.5, desalted, and recovered as a crude collagen precipitate. The collagen concentration of the crude collagen precipitate was 10% by mass.
  • Example 3 (Comparative Example 3) (1) Sodium hydroxide was added to the alkali-solubilized collagen solution obtained in Example 1 to adjust the pH to 4.5, and the mixture was allowed to stand to cause isoelectric point precipitation of collagen. The average particle size of the collagen precipitate contained in the obtained precipitate was 1,858 ⁇ m. The precipitate was recovered by centrifugation, washed again with distilled water adjusted to pH 4.5, desalted, and centrifuged 10 times to recover as a crude collagen precipitate. The collagen concentration of this crude collagen precipitate was 33% by mass.
  • FIG. 9 shows a phase contrast microscopic image of the obtained collagen precipitate.
  • Example 2 After 50 g of the obtained crude collagen precipitate was put into 950 g of ethanol at a temperature of 20 ° C., dispersed using a homogenizer for 30 minutes, and the dispersion was filtered. However, the filtered collagen dispersion became a film and did not become a powder.
  • Example 2 Using 5 mg of the obtained collagen solid, the same operation as in Example 1 was performed to evaluate the solubility. Table 1 shows the outline of Comparative Example 3, Table 5 shows the solubility, and Table 6 shows the results of the initial dissolution rate. Further, FIG. 12 shows the change over time in the collagen concentration of the supernatant in the measurement of the dissolution initial rate.
  • Example 4 The isoelectric point precipitate of alkali-solubilized collagen obtained in Example 1 was dispersed in distilled water to a final concentration of 3%, and homogenized for 30 minutes so as to obtain a uniform dispersion. Using a spray dryer, this dispersion was spray dried by adjusting the hot air temperature so that the inlet temperature was 120 ° C. and the outlet temperature was 60 ° C. to obtain collagen powder. Table 1 shows an outline of Comparative Example 4, and Table 4 shows solubility results. The collagen powder obtained by spray drying dissolved only about 20% even after 20 hours.
  • Example 1 Since the collagen precipitate as the raw material is the same as in Example 1, the difference in solubility from Example 1 is not due to the difference in collagen molecules, but due to the difference in shape depending on the treatment process.
  • the spray-dried product became lumpy because the collagen powder was fine, and only the surface of the dam was translucent and dissolved.
  • the average particle diameter of collagen particles is as small as 4.60 ⁇ m and the surface thereof is relatively smooth, so that the solution does not easily penetrate into the inside of the dust, which is considered to be the reason why the solubility is poor.
  • none of the Examples 1 to 4 and Examples 7 to 10 formed lumps.
  • Example 5 The crude collagen precipitate obtained in Example 1 was redissolved in hydrochloric acid so as to have a final concentration of 1% by mass, and then neutralized with sodium hydroxide to obtain an alkali-solubilized collagen solution having a pH of 7.5. It was. This solution was freeze-dried to produce a collagen sponge.
  • FIG. 13 shows an electron microscope image of the collagen sponge.
  • Table 1 shows an outline of Comparative Example 5
  • Table 5 shows the solubility
  • Table 6 shows the results of the initial dissolution rate.
  • FIG. 12 shows the change over time in the collagen concentration of the supernatant in the measurement of the dissolution initial rate.
  • Example 6 The crude collagen precipitate obtained in Example 1 was redissolved in hydrochloric acid so as to have a final concentration of 1% by mass, and then neutralized with sodium hydroxide to obtain an alkali-solubilized collagen solution having a pH of 7.5. It was. This solution was discharged into ethanol using a 27 gauge injection needle, and then air-dried to prepare collagen fibers.
  • FIG. 14 shows an electron microscope image of the collagen fiber.
  • the present invention is based on Japanese Patent Applications 2010-172698 and 2010-172699 filed on July 30, 2010.
  • the specification, claims, and entire drawings of Japanese Patent Applications Nos. 2010-172698 and 2010-172699 are incorporated herein by reference.
  • fine collagen powder and / or collagen derivative powder can be produced by a simple operation.
  • the obtained collagen powder and the like are excellent in thermal stability, and the solution can form a triple helical structure and is useful.

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Abstract

　平均粒子径１～１，０００μｍのコラーゲン沈殿物および／またはコラーゲン誘導体沈殿物を１２～５０質量％含有する粗コラーゲン沈殿物を親水性有機溶媒に分散させ、固形物を分取し、乾燥すること特徴とする。親水性有機溶媒に分散させることで沈殿物を脱水できるため、得られる前記固形物は風乾によって乾燥することができる。しかも、比表面積が拡大するため、得られるコラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末は、溶解性に優れ、かつ平均粒子径が８～１，０００μｍであるため取り扱い性にも優れる。

Description

コラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末およびそれらの製造方法
　本発明は、コラーゲン沈殿物および／またはコラーゲン誘導体沈殿物からなる平均粒子径１～１，０００μｍの粗コラーゲン沈殿物を親水性有機溶媒に分散させた後に乾燥してなるコラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末、およびこれらの製造方法に関する。
　コラーゲンは、３本のポリペプチド鎖が螺旋を巻いた構造を有し、約３００ｎｍの複数のコラーゲン分子が６７ｎｍずつずれて会合し、長いコラーゲン線維を形成する。コラーゲンは、魚や豚、牛などの生皮、腱、骨などを形成する主要タンパク質であるが、生体内に含まれる大部分は水に不溶性である。
　コラーゲンは不溶性ではあるが生体成分であり安全性に優れ、動物間で相同性が高いため免疫反応を起こしにくいなどの利点を有する。このため、食品、医薬品、化粧品分野への応用が検討され、種々の可溶化法や可溶化コラーゲンの利用法が開発されている。可溶化コラーゲンとして、動物の皮や骨等の原料に含まれるわずかな可溶性コラーゲンを希酸により抽出したもののほか、プロテアーゼなどの酵素を添加して可溶化したもの(特許文献１)、アルカリを添加して可溶化したもの(特許文献２)等がある。
　一方、水溶性コラーゲンは、含水分量が多い透明に溶液化された状態では熱変性温度が低いため、熱変性温度を向上させたコラーゲンもある(特許文献３)。化粧品の処方に用いられるｐＨ範囲に等電点を有するコラーゲンの水不溶性の会合体は、乳白色かつ不均一となるなどの理由から化粧品原料として不向きと考えられていたが、ｐＨ５．５～８．５の等電点を有するコラーゲンの水溶液を、その等電点付近のｐＨに調整して得られる会合体の熱変性温度が顕著に高いことを見出し、このような会合体を化粧品原料として使用するというものである。実施例では、等電点がｐＨ約７．０のコラーゲン溶液に終濃度５質量％となるように塩化ナトリウムを加えて塩析させ、得られたコラーゲン沈殿物を塩酸で溶解し、その後に水酸化ナトリウムで中和することで会合体の分散物を得ている。未変性のコラーゲンは、特有の三重螺旋構造を持った棒状の分子であるがその水溶液は耐熱性が低く、熱処理によって容易にコラーゲンの螺旋構造が破壊される。上記特許文献３では、得られた未変性コラーゲンを使用してヒト皮膚表皮細胞の接着性を評価し、ゼラチンでは３０分培養後の接着性は全くなく、３時間培養で若干の接着性が観察される程度であるが、未変性コラーゲンを使用する場合には、３０分間の培養で顕著な接着性が観察されることが示されている。
　未変性のコラーゲン溶液は、常温でも変性する可能性があり、保管に関しては冷蔵などの温度管理が必要である。このようなコラーゲンの保存性に鑑みて、乾燥コラーゲンを使用する方法がある(特許文献４)。揮発性の親水性有機溶媒媒質中にコラーゲン溶液をノズルより吐出させて糸状または膜状物を生成させ、この糸状物などを乾燥し、細断または粉砕する粒状または粉状のコラーゲン乾燥物を製造方法している。前記親水性有機溶媒媒質中に吐出するコラーゲン溶液のコラーゲン濃度は３～１０質量％、ノズルからの吐出速度は１～３０ｍ／ｍｉｎが好適である旨が記載されている。
　また、魚皮由来のコラーゲン誘導体の乾燥物もある(特許文献５)。魚由来のコラーゲンの臭気を低減するため、有機溶媒処理および遠心分離処理を組み合わせる点に特徴があり、更にコラーゲンとしてアシル化コラーゲンなどのコラーゲン誘導体を調製している。実施例２では、魚皮に有機溶媒処理および遠心分離処理を行った後に酢酸酸性にてコラーゲンを可溶化し、塩析にてコラーゲン沈殿物を得て、これを凍結乾燥してコラーゲン乾燥物を得ている。また、実施例４では、魚皮に有機溶媒処理および遠心分離処理を行い、沈殿物に水酸化ナトリウムを添加して一晩撹拌し、遠心分離後、沈殿にクエン酸水溶液を加えてコラーゲンを抽出し、クエン酸ナトリウムを添加してコラーゲンを沈殿させ、このコラーゲン沈殿物に水酸化ナトリウム溶液を添加してｐＨ１０に調整し、無水コハク酸を作用させてサクシニル化コラーゲンを得て、次いで塩酸酸性にしてサクシニル化コラーゲンを沈殿させ、得られた沈殿を凍結乾燥し、コラーゲン乾燥物を得ている。
　また、コラーゲンは処理方法によって等電点が異なり、酸性条件下で可溶化したコラーゲンは等電点がｐＨ７～９．５に存在するため、ｐＨ５以上では溶解性が悪く、沈殿凝集が生じる点に鑑み、コラーゲンをエステル化して水溶性を向上させる方法もある(特許文献６)。特許文献６では、予め動物組織の状態でコラーゲンのエステル化反応を行い、ついでエステル化コラーゲンの抽出操作を行うものである。これにより、簡便な工程で安価にエステル化コラーゲンが製造できるという。
特公昭４４－１１７５号公報 特公昭４６－１５０３３号公報 特開２０００－１２８７６４号公報 特開平６－２２８５０５号公報 特開２０００－２５６３９８号公報 特開平８－２７１９２号公報
　三重螺旋構造を維持する未変性のコラーゲンは保湿性に優れ、かつヒト皮膚表皮細胞への接着性に優れるため、化粧品への配合や医療用の用途開発が希求される化合物である。しかしながら、溶液に溶解したコラーゲンは、熱変性温度が低く常温でも変性し、冷蔵保存が要求される。すなわち、三重螺旋構造を維持したコラーゲンが溶解された状態で配合されるコラーゲン化粧品は、コラーゲンの変性を防止するため冷蔵庫などに保管する必要があり、使用が簡便でない。また、コラーゲンは等電点で容易に析出するため、細菌感染などで溶解液のｐＨが変動すると溶液が白濁し、または析出による目詰まりなどが発生しやすい。したがって、溶解時に三重螺旋構造を構成しうる未変性のコラーゲン粉末の製造方法が望まれる。
　一方、コラーゲンはわずかの水分によって膨潤するため、粉末の製造は容易でない。上記特許文献４記載の方法では、乾燥コラーゲンを得るために、可溶化コラーゲン溶液を有機溶媒中に吐出して繊維化しているが、繊維化は操作が極めて複雑である。また、特許文献５は、コラーゲンを凍結乾燥してコラーゲン乾燥物を得ているが、処理時間が長くおよび必要な乾燥エネルギーが多大になる。
　更に、コラーゲンは本来保湿性に優れる化合物である。上記特許文献６の比較例１に示すように、アテロコラーゲンを塩析したコラーゲンの沈殿物をエタノールで洗浄することを試みたが、コラーゲン線維の中に食塩を含んだ水を抱き込んでいるため除去できなかった、と記載している。このように、コラーゲンの乾燥には、凍結乾燥や噴霧乾燥などの技術を必要とし、製造工程や装置が複雑となる。したがって、複雑な工程を必要とせず、簡便にコラーゲン粉末を調製する方法が望まれる。
　一方、未変性コラーゲンは、上記特許文献３に示すように、細胞培養時の接着性に優れるなどの活性を有する。このため、コラーゲン粉末であっても、これを溶解した際には三重螺旋構造を維持する必要がある。例えば、加圧ノズルを介して塔頂から目的成分を含有うる溶液を供給し、熱を送風して造粒する方法などがあるが、コラーゲンは熱変性しやすく、このような方法で造粒することも困難である。したがって、製造工程が簡易であり、製造エネルギーが低く、溶解時に三重螺旋構造を構成しうる未変性のコラーゲン粉末の製造方法が望まれる。
　更に、そもそも可溶性コラーゲンは抽出方法に依存する等電点を有し、可溶性コラーゲンは等電点で溶解性が低い。このため、中性の化粧水などを使用して乾燥コラーゲンを溶解することは困難である。したがって化粧品用途として用いる場合、一般の化粧品のｐＨである５．５～８．５で速やかに溶解するコラーゲン粉末が望まれる。
　コラーゲンを粉末化する要請は、天然のコラーゲンのみならず、コラーゲン誘導体でも同様である。
　上記現状に鑑み、本発明は、微細なコラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末を提供する事を目的とするものである。
　また、本発明は、簡便に調製できる、未変性のコラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末の製造方法を提供する事を目的とするものである。
　本発明者らは、コラーゲン溶液を等電点沈殿させると、溶液中でコラーゲンが会合して沈殿するが、コラーゲン溶液を撹拌しつつ等電点沈殿させると、通常よりも短径の平均粒子径１～１，０００μｍのコラーゲン沈殿物からなる粗コラーゲン沈殿物を得ることができること、前記粗コラーゲン沈殿物の濃度を１２～５０質量％に調整し、これを親水性有機溶媒に分散させると効率的にコラーゲン沈殿物を脱水して固形物を分取することができ、風乾によってコラーゲン粉末となること、短径の粗コラーゲン沈殿物を使用することで脱水および乾燥を効率的に行うことができ、その結果、短径のコラーゲン粉末を製造しうること、上記方法で得られたコラーゲン粉末は１１０℃と高温でも変性することなく耐熱性に優れること、この粉末を溶解すると、コラーゲンが溶液中で三重螺旋構造を呈することを見出し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は、平均粒子径１～１，０００μｍのコラーゲン沈殿物および／またはコラーゲン誘導体沈殿物を１２～５０質量％含有する粗コラーゲン沈殿物を親水性有機溶媒に分散させ、固形物を分取し、乾燥してなるコラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末を提供するものである。
　さらに、本発明は、コラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体を含有する溶液を、コラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体の会合を制御しつつｐＨ３．５～１０で等電点沈澱させて平均粒子径１～１，０００μｍの等電点沈殿物を得て、前記等電点沈殿物に含まれるコラーゲン沈殿物および／またはコラーゲン誘導体沈殿物の濃度を調整して１２～５０質量％含有する粗コラーゲン沈殿物とし、前記粗コラーゲン沈殿物を親水性有機溶媒に分散させ、固形物を分取し、乾燥することを特徴とする、コラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末の製造方法を提供するものである。
　また、本発明は、コラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体を含有する溶液を、ｐＨ３．５～１０で等電点沈澱させ、前記沈殿を破砕して平均粒子径１～１，０００μｍの等電点沈殿物を得て、前記等電点沈殿物に含まれるコラーゲン沈殿物および／またはコラーゲン誘導体沈殿物の濃度を調整して１２～５０質量％含有する粗コラーゲン沈殿物とし、前記粗コラーゲン沈殿物を親水性有機溶媒に分散させ、固形物を分取し、乾燥することを特徴とする、コラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末の製造方法を提供するものである。
　また、本発明は、コラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体を含有する溶液を、コラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体の会合を制御しつつ塩析して平均粒子径１～１，０００μｍの塩析物を得て、前記塩析物に含まれるコラーゲン沈殿物および／またはコラーゲン誘導体沈殿物の濃度を１２～５０質量％に調整して粗コラーゲン沈殿物とし、前記粗コラーゲン沈殿物を親水性有機溶媒に分散させ、固形物を分取し、乾燥することを特徴とする、コラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末の製造方法を提供するものである。
　また、本発明は、コラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体を含有する溶液を塩析し、前記塩析物を破砕して平均粒子径１～１，０００μｍの塩析物を得て、前記塩析物に含まれるコラーゲン沈殿物および／またはコラーゲン誘導体沈殿物の濃度を１２～５０質量％に調整して粗コラーゲン沈殿物とし、前記粗コラーゲン沈殿物を親水性有機溶媒に分散させ、固形物を分取し、乾燥することを特徴とする、コラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末の製造方法を提供するものである。
　また、本発明は、前記親水性有機溶媒が、アルコール、ケトン、エーテルおよびこれらの混合液である、上記コラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末の製造方法を提供するものである。
　また、本発明では、コラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体溶液から、前記コラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体を会合させてコラーゲン沈殿物および／またはコラーゲン誘導体沈殿物を形成する際に、前記コラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体溶液を撹拌しつつ塩類を添加してコラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体を塩析により沈殿させ、または前記コラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体溶液をｐＨ３．５～１０に調整して撹拌しつつコラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体を等電点沈殿させることで、コラーゲン沈殿物および／またはコラーゲン誘導体沈殿物の粒子径を調整することができる。
　本発明の製造方法で得られるコラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末は、熱安定性、保存性に優れる。しかも、コラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末の溶解液は、コラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体が三重螺旋構造を構成するため、皮膚などの保湿性に優れる。
　本発明のコラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末は、これらの溶液に比較して輸送効率に優れ、保管や輸送費を軽減することができる。更に、コラーゲンなどの溶液は粘度が高いため容器からの移し替えの際に容器への付着、残存、ロスなどを生じるが、コラーゲン粉末はこれらを回避し、簡便な操作を行うことができる。
　本発明のコラーゲン粉末の製造方法は、粗コラーゲン沈殿物のコラーゲン沈殿物および／またはコラーゲン誘導体沈殿物の濃度が１２～５０質量％であるため、親水性有機溶媒による脱水が容易であり、風乾によって乾燥することができ、製造が極めて簡便である。
実施例１で調製したコラーゲン沈殿物の位相差顕微鏡像を示す図である。 実施例１で調製したコラーゲン粉末の電子顕微鏡像を示す図である。 実施例１で調製した、コラーゲン粉末の示差走査熱量計（ＤＳＣ）の結果を示す図である。 実施例１における、粉末コラーゲンを再溶解したコラーゲン溶液の円二色性を示す図である。 実施例１で得たコラーゲン粉末の粒度分布の図である。 実施例１において粒度分布を測定したコラーゲン粉末の電子顕微鏡像を示す図である。 実施例４で調製した、コラーゲン粉末の電子顕微鏡像を示す図である。 実施例４における、粉末コラーゲンを再溶解したコラーゲン溶液の円二色性を示す図である。 比較例３で調製したコラーゲン沈殿物の位相差顕微鏡像を示す図である。 比較例４で得たコラーゲン粉末の粒度分布の図である。 比較例４において、噴霧乾燥機を使用して乾燥してなるコラーゲン粉末の電子顕微鏡像を示す図である。 実施例１、実施例７における粉末コラーゲンおよび比較例３、比較例５のコラーゲンの溶解初速度を算出した図である。 比較例５で得たコラーゲンスポンジの電子顕微鏡像を示す図である。 比較例６で得たコラーゲン繊維の電子顕微鏡像を示す図である。
　本発明の第一は、平均粒子径１～１，０００μｍのコラーゲン沈殿物および／またはコラーゲン誘導体沈殿物を１２～５０質量％含有する粗コラーゲン沈殿物を親水性有機溶媒に分散させ、固形物を分取し、乾燥してなるコラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末である。
　また、本発明の第二、第三は、コラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体を含有する溶液を、コラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体の会合を制御しつつｐＨ３．５～１０で等電点沈澱させ、または等電点沈澱物を破砕して平均粒子径１～１，０００μｍの等電点沈殿物を得て、前記等電点沈殿物に含まれるコラーゲン沈殿物および／またはコラーゲン誘導体沈殿物の濃度を調整して１２～５０質量％含有する粗コラーゲン沈殿物とし、前記粗コラーゲン沈殿物を親水性有機溶媒に分散させ、固形物を分取し、乾燥することを特徴とする、コラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末の製造方法である。
　また、本発明の第四、第五は、コラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体を含有する溶液を、コラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体の会合を制御しつつ塩析し、または塩析物を破砕して平均粒子径１～１，０００μｍの塩析物を得て、前記塩析物に含まれるコラーゲン沈殿物および／またはコラーゲン誘導体沈殿物の濃度を１２～５０質量％に調整して粗コラーゲン沈殿物とし、前記粗コラーゲン沈殿物を親水性有機溶媒に分散させ、固形物を分取し、乾燥することを特徴とする、コラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末の製造方法である。以下、本発明を詳細に説明する。
　（１）コラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体
　本願明細書において、「コラーゲン」とは、タンパク質の一種で、３本のポリペプチド鎖が螺旋を巻いたものの総称である。従来からＩ～ＸＸＩＸ型が知られているが、本発明で使用するコラーゲンとしてはいずれであってもよく、新たに見出されるコラーゲンであってもよい。生体内に含まれるコラーゲンの大部分は水に不溶性であり、本発明では、動物の皮や骨等の原料に含まれるコラーゲンをプロテアーゼなどの酵素を添加して可溶化したもの、アルカリを添加して可溶化したものを「可溶化コラーゲン」と称する。なお、生体内には、動物の皮や骨等の原料には、わずかに中性塩溶液や酸性溶液に溶ける可溶性コラーゲンも含まれている。本発明で使用するコラーゲンは、水溶液に溶解するものであれば、不溶性コラーゲンを可溶化したものであってもよく、本来含まれる可溶性コラーゲンであってもよい。なお、本願明細書では生体内に大量に存在する不溶性コラーゲンを原料として調製される「可溶化コラーゲン」を用いて説明するが、本願発明における「コラーゲン」には、「可溶性コラーゲン」と「可溶化コラーゲン」との双方が含まれる。また、「コラーゲン線維」とは、複数の「コラーゲン分子」どうしが会合したものを意味する。コラーゲン分子としては、前記可溶化コラーゲンや可溶性コラーゲンが相当する。可溶化コラーゲン溶液を等電点沈殿し、または塩析するとコラーゲン分子どうしが会合し、コラーゲン線維を沈殿物として分取することができる。コラーゲン線維は、沈殿の際に複数のコラーゲン線維が会合して大きな凝集体として沈殿する場合がある。従って、本発明において「会合」とは、コラーゲン分子どうしの結合とコラーゲン線維どうしの結合の双方を含むものとする。また、「コラーゲン沈殿物」とは、コラーゲン溶液から固体で析出したコラーゲンを意味し、「コラーゲン粉末」とは、「コラーゲン沈殿物の粉状固形物」を意味する。
　なお、「可溶化コラーゲン」や「可溶性コラーゲン」は、化学的処理の際に構成アミノ酸が修飾される。従って、本発明で使用する「コラーゲン」としては、例えば、アルカリ処理によってアスパラギン残基やグルタミン残基などがアルカリによる脱アミド反応によっておのおのアスパラギン酸残基およびグルタミン酸残基に変化したものを含む。すなわち、コラーゲン分子に含まれるアミド基をカルボキシル基に変え、コラーゲンの実効電荷を負にすることで等電点が酸性あるいは中性へと調整される。例えば、アルカリ可溶化コラーゲンは、アスパラギン残基およびグルタミン残基がアルカリによる脱アミド反応によっておのおのアスパラギン酸残基およびグルタミン酸残基に変化され、等電点がｐＨ４．５～６．０と酸性へと変化している。本発明では、このようにコラーゲンを構成するアミノ酸が修飾されたものであってもよい。
　更に、本発明における「コラーゲン誘導体」とは、前記コラーゲンを構成するアミノ酸に他の官能基を修飾したものを意味する。例えば、アシル化コラーゲンやエステル化コラーゲンなどがある。なお、コラーゲン誘導体としては、予め調製されたアシル化コラーゲンやエステル化コラーゲンのほか、塩析や等電点沈殿の際にエステル化され、またはアシル化されたコラーゲンであってもよい。コラーゲン含有組織から可溶化コラーゲンや可溶性コラーゲンを抽出する工程に先立ち、コラーゲンをアシル化して等電点を調整する場合があり、また、エステル化コラーゲンの製造方法として、予めコラーゲン含有組織に含まれる不溶性コラーゲンをエステル化し、ついでエステル化コラーゲンを等電点沈殿して分取する場合がある。なお、アシル化コラーゲンやエステル化コラーゲンとしては、以下のものがある。
　（ｉ）アシル化コラーゲン
　アシル化コラーゲンとしては、サクシニル化コラーゲン、フタル化コラーゲン、マレイル化コラーゲンなどがある。例えば、酵素処理によって抽出したアテロコラーゲン溶液をｐＨ９～１２に調整し、その後、コハク酸、無水フタル酸、無水マレイン酸などの酸無水物を添加してなるサクシニル化コラーゲン、フタル化コラーゲン、マレイル化コラーゲンなどのアシル化コラーゲンなどがある。
　（ｉｉ）エステル化コラーゲン
　エステル化コラーゲンとしては、可溶化コラーゲンをエステル化したもののほか、不溶性コラーゲンをエステル化した後に酵素反応などで可溶化されたエステル化コラーゲンなどがある。
　コラーゲンに作用させてエステル化コラーゲンを得るためのアルコール類としては、１級アルコールのほか、２級アルコール、３級アルコールであってもよい。また、１価アルコールに限定されず、２価アルコールや３価アルコール、その他の多価アルコールであってもよい。
　例えば、１価アルコールとしては、メタノール、エタノール、１－プロパノール、２－プロパノール、１－ブタノール、ｄｌ－２－ブタノール、ｔｅｒｔ－ブタノール、１－ペンタノール、ｄｌ－２－ペンタノール、３－ペンタノール、１－ヘキサノール、ｄｌ－２－ヘキサノール、ｄｌ－３－ヘキサノール、１－ヘプタノール、２－ヘプタノール、３－ヘプタノール、１－オクタノール、ｄｌ－２－オクタノール、３－オクタノール、１－ノナノール、２－ノナノール、３－ノナノール、４－ノナノール、５－ノナノール、デカノール、１－ウンデカノール、２－ウンデカノール、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノエチルエーテル、エチレングリコールモノブチルエーテル、エチレングリコールモノフェニルエーテルなどが挙げられる。
　また、２価アルコールとしては、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、テトラエチレングリコール、ポリエチレングリコール（Ｍ．Ｗ．２００～２００００）、プロピレングリコール、１，３－プロパンジオール、ジプロピレングリコール、グリセリン、１，２－ブタンジオール、１，３－ブタンジオール、１，４－ブタンジオール、２，３－ブタンジオール、１，５－ペンタンジオール、２，４－ペンタンジオール、１，６－ヘキサンジオール，２，５－ヘキサンジオールがある。その他の多価アルコールとして、グリセリン、各種の糖アルコールなどがある。
　本発明で使用するコラーゲン誘導体およびコラーゲンは、溶解液中で三重螺旋構造を有している。
　（２）粗コラーゲン沈殿物
　本発明で使用する粗コラーゲン沈殿物は、「平均粒子径１～１，０００μｍのコラーゲン沈殿物および／またはコラーゲン誘導体沈殿物を１２～５０質量％含有する粗コラーゲン沈殿物」である。
　前記したようにコラーゲンは生体内で不溶性であり、このような不溶性コラーゲンを酵素処理やアルカリ処理して可溶化コラーゲンを調製することができる。このような可溶化コラーゲンは水溶液で調製され、塩析や等電点沈殿によって精製されて固形の沈殿物となる。本発明では、このようにして得たコラーゲンの沈殿物を使用する。このようなコラーゲンの沈殿物やこれらから得られるコラーゲン粉末は、再度溶液に溶解すると、三重螺旋構造を有するコラーゲン溶液となるからである。
　また、粗コラーゲン沈殿物に含まれるコラーゲン沈殿物および／またはコラーゲン誘導体沈殿物の平均粒子径を１～１，０００μｍに限定したのは、コラーゲン沈殿物が親水性有機溶媒によって効率よく脱水でき、風乾によって粉末化でき、得られる粉末も微細なコラーゲン粉末となることが判明したからである。このため、本発明では、コラーゲン沈殿物の平均粒子径を短径側に制御する方法も見出した。すなわち、可溶化コラーゲン溶液を等電点沈殿や塩析するとコラーゲン分子どうしが会合してコラーゲン線維となり、更にコラーゲン線維が会合して凝集体となるため、一般には、沈殿物の平均粒子径は約２，０００μｍまたはそれ以上となる。しかしながら、コラーゲン溶液を撹拌しつつコラーゲンの会合を制御しつつコラーゲン沈殿物を生成することで、得られるコラーゲン沈殿物の平均粒子径を１～１，０００μｍに制御することができ、最終的に平均粒子径が１～１，０００μｍのコラーゲン粉末を得ることができる。
　（ｉ）平均粒子径
　本発明で使用する粗コラーゲン沈殿物の平均粒子径は、１～１，０００μｍ、より好ましくは５～９００μｍ、特に好ましくは１０～７５０μｍ、更に好ましくは３０～５００μｍである。平均粒子径が１，０００μｍを超えると粉末化が困難となる場合がある。なお、コラーゲン分子の長径は３００ｎｍであり、コラーゲン分子どうしの会合が生じない場合には、コラーゲンの粒子径は３００ｎｍとなる。しかしながら、後記するように、このような３００ｎｍのコラーゲン分子が平行に複数結合してなるＳＬＳ線維は、ＳＬＳ線維が相互に会合して凝集体を形成し、沈殿物となることが判明した。このようなＳＬＳ線維の沈殿物では３個以上のＳＬＳ線維が会合していると想定して１μｍを下限とした。なお、本願における粗コラーゲン沈殿物の平均粒子径は、位相差顕微鏡で観察した値である。本願発明では、位相差顕微鏡像の長径をもって粗コラーゲン沈殿物の粒子径とし、十視野に含まれる全ての粗コラーゲン沈殿物の粒子径を平均し、平均粒子径とした。
　粗コラーゲン沈殿物を調製する際に、構成するコラーゲン沈殿物やコラーゲン誘導体沈殿物の粒子径を短径に制御するには、可溶化コラーゲンやコラーゲン誘導体を溶解する溶液を、物理的処理や化学的処理し、または生成した沈殿物を物理的に破砕することで調整することができる。
　（ｉ－１）物理的処理
　物理的処理方法としては、例えば、コラーゲンやコラーゲン誘導体を溶解する溶液を撹拌しつつ塩析させ、または溶液を撹拌しつつｐＨ３．５～１０で等電点沈殿させる方法がある。撹拌によってコラーゲン分子どうしの会合が抑制され線維長の短いコラーゲン線維となり、更に複数のコラーゲン線維の会合による凝集体の生成を抑制することができる。更には、生成した沈殿物を破砕することで、粒子径の短いコラーゲン沈殿物を沈殿させることができる。撹拌の程度は、溶液のコラーゲンやコラーゲン誘導体の濃度、撹拌方法、撹拌容器の形状やサイズなどによって適宜選択することができる。また、コラーゲン線維の会合による凝集体の生成を抑制し、または生成する沈殿物の破砕を効率的に行うため、撹拌と破砕機構を有する装置を使用してもよい。
　（ｉ－２)化学的処理
　また、化学的処理方法としては、コラーゲン分子同士の会合を阻止する会合阻止剤を添加する方法がある。このような会合阻止剤としては、グルコース、スクロース、キシロース、ガラクトース、フルクトース、グリセリンなどの糖類がある。また、コラーゲン分子の束状集合体を形成させるＡＴＰがある。例えばコラーゲン溶液に酸性条件下でアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を加え、コラーゲン分子の塩基性部位同士をＡＴＰのリン酸基で架橋させる。ＡＴＰによって複数のコラーゲン分子が平行に架橋し、コラーゲン分子の塩基性部位同士がＡＴＰのリン酸基で架橋されたＳＬＳ（Segment-long-spacing）線維が生成される。すなわち、前記した疎水性相互作用によるコラーゲン分子どうしの会合に優先して、ＡＴＰによるコラーゲン分子の架橋が生じるため、３００ｎｍのコラーゲン分子が平行に連結された、平均粒子径３００ｎｍのＳＬＳ線維となる。なお、複数のＳＬＳ線維が会合して凝集体を形成し、沈殿する。ＳＬＳ線維には、コラーゲンのほかにＡＴＰが架橋剤として含まれるが、他のコラーゲンやコラーゲン誘導体と同様にＡＴＰを含んだまま粉末化することができる。また、ＳＬＳ線維の沈殿物を得た後にＡＴＰを除去し、その後に粉末化してもよい。
　（ｉｉ）コラーゲン濃度
　粗コラーゲン沈殿物における前記平均粒子径１～１，０００μｍのコラーゲン沈殿物および／またはコラーゲン誘導体沈殿物の濃度は、１２～５０質量％、より好ましくは１５～４０質量％、特に好ましくは２０～３５質量％である。１２質量％を下回ると、粗コラーゲン沈殿物の含水率が高すぎるため親水性有機溶媒による脱水効率が悪く、乾燥すると微細かつ多孔質のコラーゲン粉末とならずにフィルム状になる場合がある。一方、５０質量％以上の粗コラーゲン沈殿物を調製することは容易でなく、また、親水性有機溶媒に均一に分散できない場合がある。なお、粗コラーゲン沈殿物に含まれるコラーゲン沈殿物および／またはコラーゲン誘導体沈殿物以外の主成分は、沈殿前のコラーゲン溶液やコラーゲン誘導体溶液を構成する水溶液である。
　（ｉｉｉ）粗コラーゲン沈殿物の調製方法
　本発明では、等電点沈殿や塩析で得た粗コラーゲン沈殿物を原料として用いることができる。等電点沈殿物の調製工程において塩析も行われるため、以下、等電点沈澱物を調製する場合で粗コラーゲン沈殿物の調製方法を説明する。また、本発明では、Ｉ～ＸＸＩＸ型のいずれのコラーゲンも使用可能であるが、生体からＩ型コラーゲンを抽出する場合で以下に説明する。
　本発明で使用するコラーゲンは、ウシ、ブタ、鳥、魚などの動物の皮膚やその他のコラーゲンを含む組織から採取することができる。一般に、コラーゲンは、動物の結合組織に多く含まれるが、熱処理によって抽出するとコラーゲンが熱変性して特有の三重螺旋構造が壊され、ゼラチン状態となる。本発明では、三重螺旋構造を構成しうるコラーゲンを使用する。このようなコラーゲンの抽出法として、動物の骨、皮などを材料として、アルカリ処理や酸処理、酵素処理による可溶化法等がある。好ましくは、コラーゲンの抽出原料として、ウシ、ブタ、ニワトリ、ダチョウ、ウマ、魚類等の真皮や腱がある。胎児由来などの若い動物の組織を使用すると収率が向上するため好ましい。
　（ｉｉｉ－１）等電点ｐＨ４．５の粗コラーゲン沈殿物
　例えば、原料となる不溶性コラーゲンとして、石灰漬け後の床皮を洗浄し、ハムスライサーで約１０ｃｍ角に細切、ミンチ後さらに機械的にすり潰したものを、アセトン、エーテルなどの有機溶剤あるいは脂肪分解酵素使用して脱脂後、十分に洗浄したものを使用することができる。
　終濃度３質量％水酸化ナトリウム、１．９％（ｖ／ｗ）モノメチルアミンとなるよう混合した可溶化水溶液に、コラーゲン終濃度４．５質量％となるように不溶性コラーゲンを懸濁し、１８℃、３週間可溶化処理を行う。可溶化反応停止後、終濃度５質量％となるよう塩化ナトリウム等の塩を加えて塩析し、塩酸等で酸性に調製した水溶液に塩析沈澱を再溶解し、および布、ろ紙、金属メッシュ等で濾過して精製し、このコラーゲン溶液を水酸化ナトリウムでｐＨ４．５となるよう調整すれば、等電点４．５の粗コラーゲン沈殿物を得ることができる。
　なお、平均粒子径は、上記コラーゲン溶液を撹拌しつつｐＨ４．５の等電点沈殿や塩析を行うことで１～１，０００μｍに調整することができる。このような平均粒子径の制御方法は、（ｉｉｉ－２）、（ｉｉｉ－３）、（ｉｉｉ－４）でも同様である。
　（ｉｉｉ－２）等電点ｐＨ９．０の粗コラーゲン沈殿物
　牛皮の真皮層を肉挽き等で細砕し、脱脂後十分に洗浄した不溶性コラーゲンを原料とすることができる。不溶性コラーゲンをコラーゲン終濃度１質量％となるよう蒸留水に懸濁後、塩酸を加えてｐＨ３．０に調整する。コラーゲン重量に対し百分の一量の酸性プロテアーゼを加え２５℃、７２時間可溶化処理を行う。酵素反応停止後、上記のようにして得た酵素可溶化コラーゲン液に、終濃度５質量％となるよう塩化ナトリウムを加えて塩析させ、遠心分離により沈澱を回収する。回収した塩析沈澱を、コラーゲン濃度２質量％となる容量の蒸留水に分散させ、塩酸を加えてｐＨ３．０に調整して均一に溶解し、コラーゲン溶液を得る。次に、このコラーゲン溶液を布および濾紙で濾過した後、水酸化ナトリウムでｐＨ９．０となるよう調整すれば、等電点９．０の粗コラーゲン沈殿物を得ることができる。
　（ｉｉｉ－３）等電点ｐＨ４．５～９．０の粗コラーゲン沈殿物
　不溶性コラーゲンや（ｉｉｉ－２）記載の前記酵素可溶化コラーゲンを終濃度３質量％水酸化ナトリウム、１．９％（ｖ／ｗ）モノメチルアミン水溶液に懸濁し、所望の時間アルカリ処理を行うことで沈殿物を得ることができる。例えば、酵素可溶化コラーゲンを原料とする場合、４時間のアルカリ処理で等電点が７．８へと低下し、１日のアルカリ処理により等電点が５．６にまで低下する。所望の等電点となった時に、塩酸を加えて反応を停止し、終濃度５質量％となるよう塩化ナトリウムを加えて塩析させ、遠心分離により沈澱を回収する。回収した塩析沈殿物を、コラーゲン濃度２質量％となる容量の蒸留水に分散させ、塩酸を加えてｐＨ３．０に調整して均一に溶解し、コラーゲン溶液を得る。次に、このコラーゲン溶液を、布および濾紙で濾過した後、水酸化ナトリウムで所望の等電点のｐＨとなるよう調整すれば、等電点４．５～９．０の粗コラーゲン沈殿物を得ることができる。
　（ｉｉｉ－４）コラーゲン誘導体からなる粗コラーゲン沈殿物
　不溶性コラーゲンや（ｉｉｉ－２）記載の酵素可溶化コラーゲン、または（ｉｉｉ－１）記載のアルカリ可溶化コラーゲンをアシル化あるいはエステル化して、等電点ｐＨ４．５～９．０のコラーゲン誘導体を得ることができる。なお、コラーゲン分子中のカルボキシル基を、カルボン酸クロライドに誘導し、前記アルコール類の水酸基と酸クロライドの脱塩酸反応によってもエステル化を行うこともできる。
　例えば、等電点９．０の酵素可溶化コラーゲンをアシル化した場合、コラーゲンのアミノ基が修飾されて等電点が酸性側へとシフトする。また、等電点４．５のアルカリ可溶化コラーゲンをエステル化した場合、コラーゲンのカルボキシル基が修飾されて等電点が塩基性側へシフトする。所望の等電点となった時に、終濃度５質量％となるよう塩化ナトリウムを加えて塩析させ、遠心分離により沈澱を回収する。回収した塩析沈澱を、コラーゲン濃度２質量％となる容量の蒸留水に分散させ、塩酸を加えてｐＨ３．０に調整して均一に溶解し、コラーゲン溶液を得る。次に、このコラーゲン溶液を布および濾紙で濾過した後、水酸化ナトリウムで所望の等電点のｐＨとなるよう調整することで、等電点４．５～９．０の粗コラーゲン沈殿物を得ることができる。
　(ｉｖ)等電点
　コラーゲンやコラーゲン誘導体の等電点は、可溶化方法やその他によって調整することができる。本発明では、等電点沈殿物としては、前記コラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体溶液をｐＨ３．５～１０に調整して得たコラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体を対象とする。等電点とは、コラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体を含有する水溶液でコラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体が最小の溶解度を示す溶液のｐＨを意味する。一般に、コラーゲンの等電点は、ｐＨ４．３～９．３であるが、ｐＨ４．３未満やｐＨ９．３超の溶液でも沈殿物が形成されうるため、前記コラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体溶液をｐＨ３．５～１０に調整して得たコラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体を等電点沈殿物とした。より好ましくは、ｐＨ４．０～９．０、特に好ましくはｐＨ４．５～９．０の等電点沈殿物である。また、用途に応じて、ｐＨ３．５～８．０、ｐＨ３．５～７．０、ｐＨ３．５～６．０やｐＨ４．５～５．０の等電点沈殿物を使用することもできる。後記する実施例に示すように、本発明のコラーゲン粉末は、平均粒子径が大きくても微細粒子とほぼ同じ比表面積を有するため、溶解性に優れると考えられ、本来、溶解性に劣る中性溶液でも溶解性に優れる。
　なお、コラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体含有溶液をｐＨ４．５に調整して回収した粗コラーゲン沈殿物は等電点がｐＨ４．５であり、コラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体含有水溶液をｐＨ９．０に調整して回収した粗コラーゲン沈殿物の等電点はｐＨ９．０となる。
　本願発明において、親水性有機溶媒に分散させる「粗コラーゲン沈殿物」としては、等電点がｐＨ４．５の粗コラーゲン沈殿物や、等電点がｐＨ９．０の粗コラーゲン沈殿物に限定されず、用途によっては、等電点がｐＨ４．５の粗コラーゲン沈殿物と等電点がｐＨ９．０の粗コラーゲン沈殿物の混合物などを使用することもできる。等電点に限定されず、粗コラーゲン沈殿物に含まれる前記コラーゲン沈殿物および／またはコラーゲン誘導体沈殿物の濃度が１２～５０質量％であれば、コラーゲン沈殿物および／またはコラーゲン誘導体沈殿物を親水性有機溶媒中に均一に分散させて、微細なコラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末を製造することができるからである。
　（２）親水性有機溶媒
　前記した粗コラーゲン沈殿物を分散させる親水性有機溶媒としては、水と混和しうる炭素含有溶媒であればよく、特に制限されず、例えばアルコール、ケトン、エーテル、エステル、極性非プロトン性溶媒などが挙げられる。
　アルコールとしては、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｔ‐ブタノール等の炭素数１～６の一価アルコールやエチレングリコール、プロピレングリコール等の多価アルコールなどがある。ケトンとしてはアセトン、メチルエチルケトンなどがある。また、エーテルとしてはジエチルエーテル、メチルエチルエーテル、エチレングリコールモノメチルエーテル、ジエチレングリコールモノブチルエーテル等のグリコールエーテルや、テトラヒドロフラン、ジオキサン等の環状エーテルなどがある。更に、エステルとしては酢酸エチル、乳酸エチルなどがあり、極性非プロトン性溶媒としてはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ピリジンなどがある。中でも好ましくは水と任意の割合で混和しうるもの、例えばアセトン、メタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドなどが挙げられる。中でも、エタノール、アセトン、ジエチルエーテルまたはこれらの混合液を好適に使用することができる。
　使用量は、親水性有機溶媒によって適宜選択することができるが、例えば、エタノールを使用する場合は、前記粗コラーゲン沈殿物１質量部に対して、エタノールを３～２０００質量部、好ましくは５～１０００質量部、より好ましくは１０～１００質量部、特に好ましくは１０～３０質量部添加することが好ましい。
　（３）コラーゲン粉末およびコラーゲン誘導体粉末
　本発明のコラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末は、前記粗コラーゲン沈殿物を親水性有機溶媒に分散させ、固形物を分取し、乾燥して得られる。親水性有機溶媒によって粗コラーゲン沈殿物を脱水し、得られた固形物を乾燥してなるコラーゲン粉末やコラーゲン誘導体粉末である。
　前記粗コラーゲン沈殿物は、等電点沈殿によって固有の等電点に調整されている。この等電点は、親水性有機溶媒での脱水やその後の乾燥によって変化しないため、本発明のコラーゲン粉末やコラーゲン誘導体粉末の等電点は、等電点沈殿の際の等電点に依存する。等電点がｐＨ４．５の粗コラーゲン沈殿物を使用した場合には、等電点ｐＨ４．５のコラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末となり、等電点がｐＨ９．０の粗コラーゲン沈殿物を使用した場合は、等電点がｐＨ９．０のコラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末となる。更に、例えば、等電点がｐＨ４．５～９．０のコラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体の混合物を使用した場合には、等電点がｐＨ４．５～９．０のコラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末となる。
　本発明のコラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末は、等電点がｐＨ３．５～８．０、より好ましくは等電点ｐＨ３．５～７．０、特には等電点ｐＨ３．５～６．０の場合は、当該粉末５ｍｇのｐＨ６．５溶液の溶解初速度が０．２ｍｇ／分以上、より好ましくは０．３ｍｇ／分以上、特に好ましくは０．５ｍｇ／分以上である。なお、本発明において「溶解初速度」は、後記する実施例に示す方法で測定したものである。
　従来の等電点ｐＨ３．５～８．０のコラーゲンは、中性溶液での溶解性が十分でないため、一旦、その等電点より酸性側の溶液に溶解し、次いでアルカリを添加してｐＨ５．５～８．５に調整する必要があった。本発明では、例えば等電点がｐＨ４．５のコラーゲン粉末の場合、ｐＨ５．５～８．５の溶解液に速やかに溶解するためより酸性の強い酸に溶解する必要がなく、従って、その後のアルカリの添加も不要である。溶解操作が簡便であるばかりでなく酸とアルカリとによる塩類の形成を回避することができる。また、アルカリに溶解する必要がないため、コラーゲンのペプチド化を回避することができ、三重螺旋構造の含有率の高いコラーゲン溶液を製造することができる。
　本発明のコラーゲン粉末およびコラーゲン誘導体粉末の平均粒子径に限定はないが、平均粒子径１～１，０００μｍの粗コラーゲン沈殿物等を使用することで、最終的に平均粒子径が８～１，０００μｍ、好ましくは１０～１０００μｍ、より好ましくは３０～９５０μｍ、更に好ましくは３０～９００μｍ、特に好ましくは３０～８００μｍのコラーゲン粉末やコラーゲン誘導体粉末である。なお、本願明細書において、コラーゲン粉末やコラーゲン誘導体粉末の平均粒子径も、前記した粗コラーゲン沈殿物と同様に、電子顕微鏡によって測定した値である。上記したように、会合により通常は２０００μｍ以上となり、噴霧乾燥によれば５μｍ未満となる。本発明のコラーゲン粉末およびコラーゲン誘導体粉末は、平均粒子径が８～１，０００μｍであるから、飛散を防止できかつ流動性を確保することができる。しかも、後記する実施例に示すように、コラーゲン粉末の平均粒子径が５μｍ未満であると溶解液中でダマを形成し溶解性を低下させる場合があるが、上記範囲であればダマの形成がなく溶解性に優れる。
　また、本発明のコラーゲン粉末およびコラーゲン誘導体粉末は、粗コラーゲン沈殿物を親水性有機溶媒で分散したため、溶媒中にコラーゲンが微細に分散し、得られる沈殿物が多孔質となり、比表面積が拡大することが判明した。本発明のコラーゲン粉末およびコラーゲン誘導体粉末の比表面積は、０．５ｍ２／ｇ以上、好ましくは０．８～３０ｍ２／ｇ、より好ましくは以上、１．０～２５ｍ２／ｇ、特に好ましくは１．２～２０ｍ２／ｇ、更に好ましくは１．５～２０ｍ２／ｇである。このような比表面積によって、親水性、溶解性が確保される。
　コラーゲン沈殿物を親水性有機溶媒に分散させても、コラーゲン濃度が低い場合には親水性有機溶媒による脱水が困難で、沈殿物がペレット状に固化し、粉末状の乾燥物を得ることができなかった。また、コラーゲン沈殿物やコラーゲン誘導体沈殿物の平均粒子径が、従来の２，０００μｍの場合は、粉末化が困難であった。しかしながら、本発明では、コラーゲン沈殿物および／またはコラーゲン誘導体沈殿物の平均粒子径を１～１，０００μｍに制御し、粗コラーゲン沈殿物に含まれるコラーゲン沈殿物やコラーゲン誘導体沈殿物の濃度を１２～５０質量％に制御したため、親水性有機溶媒による脱水の際にも粉末状で脱水でき、分取した固形物は風乾によってコラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末となった。しかも、親水性有機溶媒に分散させる前のコラーゲン沈殿物は、平均粒子径が１～１，０００μｍであるため、これを風乾すると平均粒子径が８～１，０００μｍのコラーゲン粉末となることが判明した。これは、上記した親水性有機溶媒への分散や乾燥工程において、コラーゲンの会合や凝集が回避されているためと考えられる。なお、本発明では、上記コラーゲン誘導体粉末やコラーゲン粉末を更に微細に加工するなどの処理を行ってもよい。
　本発明のコラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末は、加熱工程を経ることなく乾燥されているため、これを溶解すると三重螺旋構造のコラーゲンとなる。また、本発明のコラーゲン粉末やコラーゲン誘導体粉末は耐熱性に優れ、従って、従来のコラーゲン溶液のように冷蔵保存する必要がない。
　なお、本発明のコラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末を溶解すると、前記凝集体やコラーゲン線維は、元のコラーゲン分子やコラーゲン誘導体分子となって溶解する。従って、この溶液を従来の方法で等電点沈殿させ、または塩析させると、平均粒子径が１，０００μｍより大きい、すなわち従来の約２，０００μｍのコラーゲン沈殿物やコラーゲン誘導体沈殿物を生成することができる。
　（４）用途
　本発明のコラーゲン粉末やコラーゲン誘導体粉末は、医療用途や化粧用用途などに好適に使用することできる。例えば、化粧用用途としては、化粧水、乳液、美容液、一般クリーム、クレンジングなどの洗顔料、パック、ひげそり用クリーム、日焼け止めクリーム、日焼け止めローション、日焼けローション、化粧石鹸、ファンデーション、おしろい、口紅、リップクリーム、シャンプー、リンスなどを例示することができる。
　また、医療用途としては、再生医療に用いられるＤＤＳ（Ｄｒｕｇ　Ｄｅｌｉｖｅｒｙ　Ｓｙｓｔｅｍ）の担体、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞など各種細胞の培養基材、止血剤、褥創治療剤、骨充填剤などを例示することができる。
　（５）製造方法
　本発明のコラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末は、コラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体を含有する溶液を、コラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体の会合を制御しつつｐＨ３．５～１０で等電点沈澱して平均粒子径１～１，０００μｍの等電点沈殿物を得て、前記等電点沈殿物に含まれるコラーゲン沈殿物および／またはコラーゲン誘導体沈殿物の濃度を調整して１２～５０質量％含有する粗コラーゲン沈殿物とし、前記粗コラーゲン沈殿物を親水性有機溶媒に分散させ、固形物を分取し、乾燥することで製造することができる。
　また、等電点沈殿物に変えて塩析して平均粒子径１～１，０００μｍの塩析物を得て、前記塩析物に含まれるコラーゲン沈殿物および／またはコラーゲン誘導体沈殿物の濃度を１２～５０質量％に調整して粗コラーゲン沈殿物とし、前記粗コラーゲン沈殿物を親水性有機溶媒に分散させ、固形物を分取し、乾燥して製造することもできる。
　（ｉ）粗コラーゲン沈殿物の生成
　コラーゲン溶液を等電点沈殿させ、または塩析させると、一般には、平均粒子径が約２，０００μｍのコラーゲン沈殿物となって沈殿する。しかしながら、前記したようにコラーゲン分子の会合を抑制し、または物理的に粉砕して平均粒子径が１～１，０００μｍのコラーゲン沈殿物および／またはコラーゲン誘導体沈殿物からなる粗コラーゲン沈殿物を調製することができる。
　なお、平均粒子径が１～１，０００μｍのコラーゲン沈殿物を得るためにコラーゲン溶液を撹拌する場合には、コラーゲン沈殿物が生成する前とコラーゲン沈殿物が生成した後の双方を撹拌することが好ましい。コラーゲン沈殿物の生成前には、コラーゲン分子の会合を阻止して線維長の短いコラーゲン線維を生成させることができ、かつコラーゲン沈殿物の生成後には、コラーゲン線維の会合を阻止し凝集体の生成を抑制することができる。なお、前記したマスコロイダーなどの石臼式磨砕機を使用する場合は、撹拌と同時に沈殿物の破砕が行われるため、好ましい。コラーゲン溶液から生成した沈殿物を破砕して粒子径を小さくすることができるからである。更に、塩析または等電点沈殿による沈殿物を得た後に、溶液ごと石臼式磨砕機などで前記沈殿物を破砕してもよい。溶液中であるから、沈殿物を加熱することなく破砕することができ、凝集体の会合を分離し、沈殿物の粒子径を小さくすることができる。
　撹拌や破砕の程度としては、溶液のコラーゲンやコラーゲン誘導体の濃度、撹拌方法、撹拌容器の形状やサイズなどによって適宜選択することができるが、前記したように、ホモジナイザーを使用する場合には回転数１，０００～２０，０００ｒｐｍ、撹拌時間は、回転数などに応じて適宜選択することができ、１分～５時間である。実際の粒子径を測定し、撹拌強度を変化させることで所望の平均粒子径のコラーゲン沈殿物やコラーゲン誘導体沈殿物を得ることができる。なお、本発明では、コラーゲン沈殿物やコラーゲン誘導体沈殿物の破砕は、上記したようにコラーゲン溶液中で行う。沈殿物を溶液から分離する工程が不用であり、かつ破砕効率に優れるからである。
　なお、本発明では、コラーゲン分子の会合を抑制する方法として前記した会合阻止剤を添加してもよく、例えば、コラーゲン溶液に酸性条件下でアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）などの会合阻止剤を加えると、ＡＴＰの添加によって、３００ｎｍのＳＬＳ線維が生成され、複数のＳＬＳ線維が会合してなる凝集体を沈殿物として得ることができる。本発明では、会合阻止剤の添加と共に、コラーゲン溶液を撹拌して物理的に会合を抑制してもよい。撹拌によりＳＬＳ線維の凝集体を破砕し、沈殿物の粒子径をより短径に調整することができる。
　本発明では、コラーゲン沈殿物および／またはコラーゲン誘導体沈殿物の濃度が１２～５０質量％の等電点沈殿物を粗コラーゲン沈殿物として使用する。含まれるコラーゲン沈殿物および／またはコラーゲン誘導体沈殿物の濃度が１２質量％に満たない場合には、遠心分離やろ過などによって回収した等電点沈殿物を再度等電点沈殿と同じｐＨに調整した水で洗浄して脱塩し、再度遠心分離やろ過などを行い粗コラーゲン沈殿物として使用することができる。
　同様に塩析によって沈殿物を生成した場合には、再び塩析と同じ塩濃度の水で洗浄した後に、再度遠心分離やろ過などを行い粗コラーゲン沈殿物として使用することができる。なお、等電点沈殿物や塩析物の単回の遠心分離やろ過などによって上記濃度になった場合には、このような遠心分離やろ過が、同時に濃度調整工程となっており、特段の濃度調整工程を行う必要はない。
　（ｉｉ）親水性有機溶媒への分散
　本発明では、このようにして得られた粗コラーゲン沈殿物を前記親水性有機溶媒に分散させる。これによって粗コラーゲン組成物を脱水するためである。使用する親水性有機溶媒の温度は、１５℃以下であることが好ましい。可溶化コラーゲンやコラーゲン誘導体を変性させず、三重螺旋構造を維持するためである。
　粗コラーゲン沈殿物に対する前記親水性有機溶媒の使用量は、使用する親水性有機溶媒によって適宜選択することができるが、例えば、エタノールを使用する場合は、前記粗コラーゲン沈殿物１質量部に対して、エタノールを３～２０００質量部、好ましくは５～１０００質量部、より好ましくは１０～１００質量部、特に好ましくは１０～３０質量部添加することが好ましい。
　なお、粗コラーゲン沈殿物を分散させた親水性有機溶媒において、前記親水性有機溶媒の濃度は７５質量％以上であることが好ましく、より好ましくは９０質量％以上、より好ましくは９５質量％以上である。粗コラーゲン沈殿物を親水性有機溶媒に分散させたコラーゲン分散液における親水性有機溶媒の濃度が７５質量％を下回ると、親水性有機溶媒から回収したコラーゲンが吸湿しているため、長時間の乾燥時間を必要とし、かつ乾燥中にコラーゲン分子が相互に密着するため、微細かつ多孔質のコラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末とならない場合がある。
　粗コラーゲン沈殿物は、親水性有機溶媒に分散した後にこれを撹拌してもよい。例えば、ホモジナイザーを使用する場合には回転数１，０００～２０，０００ｒｐｍ、より好ましくは２，０００～１３，０００ｒｐｍ、特に好ましくは２，５００～１０，０００ｒｐｍ、特に好ましくは３，０００～５，０００ｒｐｍで撹拌する。撹拌時間は、回転数などに応じて適宜選択することができ、１分～５時間、より好ましくは１分～３時間、特に好ましくは３分～１時間、更に好ましくは５分～３０分である。なお、上記撹拌条件は、例示であり、撹拌装置の撹拌方法によって異なる。実際の分散の程度に応じて適宜、選択することができる。なお、撹拌により熱が発生するため、冷却しながら撹拌することが好ましい。
　（ｉｉｉ）固形物の分取
　親水性有機溶媒に分散させた粗コラーゲン沈殿物は、溶媒中で沈殿する。本発明では、この沈殿物を分取するため、親水性有機溶媒分散液を濾過し、または遠心分離などの分離手段によってコラーゲン沈殿物を分取する。
　このような親水性有機溶媒による分散および分取は、１回で十分であるが、２～３回など複数回行ってもよい。
　（ｉｖ）乾燥
　本発明では、前記固形物を乾燥し、コラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末を得ることができる。本発明では、室温で風乾することで前記固形物を乾燥しうる点に特徴がある。ただし、乾燥機を用いるなど他の方法で乾燥してもよい。その際、温度は１５℃未満とすることが好ましい。
　前記粗コラーゲン沈殿物を構成するコラーゲン沈殿物やコラーゲン誘導体沈殿物は、平均粒子径が１～１，０００μｍと従来よりも短いため、単位質量あたりの表面積が広く、親水性有機溶媒による脱水が容易であること、粗コラーゲン沈殿物に含まれるコラーゲン沈殿物および／またはコラーゲン誘導体沈殿物の濃度が、１２～５０質量％であるため、親水性有機溶媒に含まれる水分量を低減させ、風乾による乾燥によってコラーゲン沈殿物やコラーゲン誘導体沈殿物の粉末化を可能にしたと考えられる。しかも、風乾により乾燥できるため、加熱処理を回避し、コラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末の熱変性を防止することができる。これにより、コラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末の溶液は、三重螺旋構造を呈する。なお、本発明では、このようにして得られたコラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末を、さらにミルなどで破砕して粒子径を調整してもよい。
　従来から、コラーゲンの精製方法としては、酸性のコラーゲン溶液に塩類を添加して沈殿させる塩析方法、有機溶媒を添加する有機溶媒沈殿法、酸もしくはアルカリを添加する等電点沈殿法などが知られている。しかしながら、等電点がｐＨ３．５～１０のコラーゲン溶液の等電点沈殿物や塩析物に親水性有機溶媒を添加してコラーゲンを粉末化した例は存在しかなった。コラーゲンは本来親水性が高く等電点沈殿物にも多量の水が存在するため、凍結乾燥や噴霧乾燥などによって固形物とすることが一般的だからである。むしろ、前記特許公報６の比較例１では、アテロコラーゲンを塩析したコラーゲンの沈殿物をエタノールで洗浄することを試みているが、コラーゲン繊維の中に食塩を含んだ水を抱き込んでいるため脱水ができなかったと記載している。しかしながら、本発明では、等電点沈殿物や塩析物に含まれるコラーゲン沈殿物やコラーゲン誘導体沈殿物を、平均粒子径が１～１，０００μｍに制御することで、親水性有機溶媒への分散を容易におこなうことができ、粗コラーゲン沈殿物の前記コラーゲン沈殿物の濃度を１２～５０質量％に制限することで親水性有機溶媒による脱水を効率的に行うことができ、このため、親水性有機溶媒から分取した固形分の含水率を極めて低く調整でき、これらを室温で乾燥することで微細なコラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末を調製することができたのである。
　なお、コラーゲン溶液を長時間かけて室温で乾燥させるとコラーゲンの乾燥物を得ることができるが、容器の壁などにコラーゲンやコラーゲン誘導体が付着し、フィルム状や板状またはブロック状になる。本発明の特徴は、風乾によりコラーゲン粉末を得られる点にある。また、コラーゲン濃度が０．１～１０質量％である溶解液をノズルの吐出孔を経て親水性有機溶媒に投入してコラーゲン繊維を沈殿させると、得られるコラーゲン繊維の表面には多孔が形成されず表面が平滑なフィルム状になる。
　次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は何ら本発明を制限するものではない。
　（実施例１）
　（１）豚皮の真皮層を肉挽き等で細砕し、脱脂後十分に洗浄した不溶性コラーゲンを原料とした。終濃度３質量％水酸化ナトリウム、１．９％（ｖ／ｗ）モノメチルアミンとなるよう混合した可溶化水溶液に、コラーゲン終濃度４．５質量％となるよう調製した不溶性コラーゲンを懸濁し、１８℃、３週間可溶化処理を行った。上記のようにして得たアルカリ可溶化コラーゲン液に、終濃度５質量％となるよう塩化ナトリウムを加えて塩析させ、遠心分離により沈澱を回収した。回収した塩析沈澱を、コラーゲン濃度３質量％となる容量の蒸留水に分散させ、塩酸を加えてｐＨ３．０に調整して均一に溶解した。次に布および濾紙で濾過した後、水酸化ナトリウムでｐＨ４．５となるよう調整し、マスコロイダー（石臼式磨砕機：増幸産業社製）にて流速５００ｍｌ／ｍｉｎ、回転数１，５００ｒｐｍ、クリアランス５０μｍで撹拌しながらコラーゲンを等電点沈澱させた。得られた沈殿物に含まれるコラーゲン沈殿物の平均粒子径は、１４１μｍであった。次いで、１７，５００ｒｐｍ、２０分の遠心分離により沈澱を回収し、再びｐＨ４．５に調整した蒸留水で洗浄して脱塩し、上記遠心分離を１０回行い、粗コラーゲン沈殿物として回収した。この粗コラーゲン沈殿物のコラーゲン濃度は３０質量％であった。得られたコラーゲン沈殿物の位相差顕微鏡像を図１に示す。
　次いで、得られた粗コラーゲン沈殿物５０ｇを温度２０℃のエタノール９５０ｇに投入し、ホモジナイザーを用いて３０分間分散させ、分散液を濾過して固形コラーゲンを分取し、室温で風乾することによりコラーゲン粉末を得た。表１にコラーゲンの性状、等電点、粉末化の可否などを示す。
　（２）得られたコラーゲン粉末を電子顕微鏡像により観察した。結果を図２に示す。粉末コラーゲンの平均粒子径は１５８mｍで、多孔質な粉体であることが判明した。
　（３）得られたコラーゲン粉末の変性温度を示差走査熱量計（ＤＳＣ）で測定した。結果を図３および表２に示す。対照として実施例１で得たアルカリ可溶化コラーゲン溶液の結果も示す。粉末コラーゲンでは１１２℃に大きな熱量変化のピークが確認された。
　（４）得られたコラーゲン粉末５ｍｇを１０ｍＭ酢酸１ｍｌに再溶解し、５ｍＭ酢酸で終濃度０．１ｍｇ／ｍｌに調製したコラーゲン溶液の円二色性（ＣＤ）を２０℃で測定した。結果を図４に示す。対照として実施例１で得たアルカリ可溶化コラーゲン溶液（未変性コラーゲン）および前記アルカリ可溶化コラーゲン溶液を温度１００℃で３分間熱変性させたアルカリ可溶化コラーゲン溶液（変性コラーゲン）の結果も示す。再溶解したコラーゲン溶液（本発明のコラーゲン粉末）は、未変性コラーゲンのカーブと略一致し、２０℃において三重らせん構造を維持していることが明らかとなった。
　（５）上記（１）で調製した固形コラーゲンを、中央化工機株式会社製、製振動乾燥機ＶＵ－４５を使用し、真空度４０Ｔｏｒｒ乾燥温度４０℃で４時間乾燥し、コラーゲン粉末を得た。このコラーゲン粉末について、４連式比表面積・細孔分布測定装置（Ｑｕａｎｔａｃｈｒｏｍｅ製、商品名「ＮＯＶＡ－４２００ｅ型」）を用い、ＢＥＴ１点法にて比表面積を測定した。結果を表３に示す。
　（６）上記（５）で調製したコラーゲン粉末について、レーザー回折・散乱法にて粒度分布を測定した。測定は、（株式会社セイシン企業製、商品名「ＬＭＳ－２０００ｅ」）を用いた。このコラーゲン粉末の平均粒子径を表３に、粒度分布を図５に、コラーゲン粉末の電子顕微鏡像を図６に示す。
　（７）　得られたコラーゲン粉末５ｍｇを表４に示す組成の溶解基準液、溶解液Ａ、溶解液Ｂ、溶解液Ｃ、溶解液Ｄそれぞれ１ｍｌに添加して溶解性を評価した。
　（８）　また、溶解液Ｂを用いて溶解初速度を測定した。コラーゲンは親水性が高く、溶解と膨潤との相違が不明確であるため、溶解初速度の測定は以下に従った。
　溶解初速度の測定
　内径１０ｍｍ、長さ４０ｍｍ、容量２ｍｌの円筒形チューブに、サンプル５ｍｇを表１の溶解液Ｂ　１ｍｌと共に混合して密栓し、１分間に２０回の１８０℃の転倒混和を行った。なお、溶解液Ｂおよび操作は、温度２０℃にて行った。混和後、２分、４分、６分、８分、１０分、１５分、２０分、３０分にその一部をサンプリングし、５，０００ｒｐｍで遠心した上澄み液をＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、ゲルをＣＢＢで染色した。脱色後、コラーゲンのバンドの濃度を画像解析ソフト（ＮＩＨ　ｉｍａｇｅ）を用いて定量し上澄み液のコラーゲン濃度を算出した。ついで、経過時間とコラーゲン濃度との関係から、溶解初速度を算出した。なお、溶解初速度は、混和０時から１０分以内の直線性のある時間で算出した。
　表５に溶解性、表６に溶解初速度の結果を示す。なお、表５において、◎は４５分未満に溶解した場合、○は４５分以上９０分未満内に溶解した場合、△は９０分以上１８０分未満内で溶解した場合、×は１８０分以内には溶解しない場合を示す。
　また、図１２に溶解初速度の測定における、上記上澄みのコラーゲン濃度の経時変化を示す。
　（実施例２）
　粗コラーゲン沈殿物を分散させる親水性有機溶媒をアセトンに変更した以外は実施例１と同様に操作してコラーゲン粉末を得た。得られたコラーゲン粉末５ｍｇを使用し、実施例１と同様に操作し、溶解性を評価した。表１に実施例２の概要、表５に溶解性、表６に溶解初速度の結果を示す。溶解液の添加により、コラーゲン粉末は速やかに溶解し、透明のコラーゲン溶液となった。
　（実施例３）
　粗コラーゲン沈殿物を分散させる親水性有機溶媒をジエチルエーテルに変更した以外は実施例１と同様に操作してコラーゲン粉末を得た。得られたコラーゲン粉末５ｍｇを使用し、実施例１と同様に操作し、溶解性を評価した。表１に実施例３の概要、表５に溶解性、表６に溶解初速度の結果を示す。溶解液の添加により、コラーゲン粉末は速やかに溶解し、透明のコラーゲン溶液となった。
　（実施例４）
　（１）牛皮の真皮層を肉挽き等で細砕し、脱脂後十分に洗浄した不溶性コラーゲンを原料とした。不溶性コラーゲンをコラーゲン終濃度２質量％となるよう蒸留水に懸濁後、塩酸を加えてｐＨ３．０に調整した。コラーゲン重量に対し百分の一量の酸性プロテアーゼを加え２５℃、７２時間可溶化処理を行った。酵素反応停止後、上記のようにして得た酵素可溶化コラーゲン液に、終濃度５質量％となるよう塩化ナトリウムを加えて塩析させ、遠心分離により沈澱を回収した。回収した塩析沈澱を、コラーゲン濃度１質量％となる容量の蒸留水に分散させ、塩酸を加えてｐＨ３．０に調整して均一に溶解した。次に布および濾紙で濾過した後、水酸化ナトリウムでｐＨ９．０となるよう調整し、マスコロイダーにて流速５００ｍｌ／ｍｉｎ、回転数１，５００ｒｐｍ、クリアランス５０μｍで撹拌しながらコラーゲンを等電点沈澱させた。得られた沈殿物に含まれるコラーゲン沈殿物の平均粒子径は、１３１μｍであった。次いで、１７，５００ｒｐｍ、２０分の遠心分離により沈澱を回収後、再びｐＨ９．０に調整した蒸留水で洗浄して脱塩し、上記遠心分離を１０回行い、粗コラーゲン沈殿物として回収した。この粗コラーゲン沈殿物のコラーゲン濃度は２３質量％であった。
　次いで、得られた粗コラーゲン沈殿物５０ｇを温度２０℃のエタノール９５０ｇに投入し、ホモジナイザーを用いて３０分間分散させ、分散液を濾過して固形コラーゲンを分取し、室温で風乾することによりコラーゲン粉末を得た。
　（２）得られたコラーゲン粉末を電子顕微鏡像により観察した。結果を図７に示す。粉末コラーゲンの平均粒子径は３３３μｍで、多孔質な粉体であることが判明した。
　（３）得られたコラーゲン粉末の変性温度を示差走査熱量計（ＤＳＣ）で測定した。結果を表２に示す。粉末コラーゲンでは１１３℃に大きな熱量変化のピークが確認された。
　（４）得られたコラーゲン粉末５ｍｇを１０ｍＭ酢酸１ｍｌに再溶解し、５ｍＭ酢酸で終濃度０．１ｍｇ／ｍｌに調製したコラーゲン溶液の円二色性（ＣＤ）を２０℃で測定した。結果を図８に示す。再溶解したコラーゲン溶液（本発明のコラーゲン粉末）は、三重らせん構造特有の２２１ｎｍのピークが確認され、２０℃において三重らせん構造を維持していることが明らかとなった。
　（５）得られたコラーゲン粉末５ｍｇを使用し、実施例１と同様に操作し、溶解性を評価した。表１に実施例４の概要、表５に溶解性、表６に溶解初速度の結果を示す。
　（実施例５）
　実施例４で得られた酵素可溶化コラーゲン液に、終濃度５質量％となるよう塩化ナトリウムを加えてマスコロイダーにて流速５００ｍｌ／ｍｉｎ、回転数１，５００ｒｐｍ、クリアランス５０μｍで撹拌しながらコラーゲンを塩析させ、１７，５００ｒｐｍ、２０分の遠心分離により沈澱を回収し、上記遠心分離を１０回行い、粗コラーゲン沈殿物を得た。得られた沈殿物に含まれるコラーゲン沈殿物の平均粒子径は、１４２μｍであった。この粗コラーゲン沈殿物のコラーゲン濃度は３８質量％であった。
　次いで、得られた粗コラーゲン沈殿物５０ｇを温度２０℃のエタノール９５０ｇに投入し、ホモジナイザーを用いて３０分間分散させ、分散液を濾過して固形コラーゲンを分取し、室温で風乾することによりコラーゲン粉末を得た。表１に粗コラーゲン沈殿物の性状、等電点、粉末化の可否などを示す。
　（実施例６）
　実施例４で得られた酵素可溶化コラーゲン液に、終濃度０．２２質量％となるようアデノシン三リン酸２ナトリウム（ＡＴＰ　２Ｎａ）を撹拌しながら加え、氷上で一時間静置させた。生成したＳＬＳ線維を遠心分離により回収した。得られた沈殿物に含まれるコラーゲン沈殿物の平均粒子径は、１３．４μｍであった。この粗コラーゲン沈殿物のコラーゲン濃度は１２質量％であった。
　次いで、得られた粗コラーゲン沈殿物８０ｍｇを温度２０℃のエタノール２０ｇに投入し、ホモジナイザーを用いて３０分間分散させ、分散液を濾過して固形コラーゲンを分取し、室温で風乾することによりコラーゲン粉末を得た。表１に粗コラーゲン沈殿物の性状、等電点、粉末化の可否などを示す。
　（実施例７）
　実施例１で得られたアルカリ可溶化コラーゲン液に、水酸化ナトリウムを添加してｐＨ４．５となるよう調製し、静置することによりコラーゲンを等電点沈澱させた。その後、マスコロイダーにて流速５００ｍｌ／ｍｉｎ、回転数１，５００ｒｐｍ、クリアランス５０μｍの条件で等電点沈澱を破砕した。得られた沈殿物に含まれるコラーゲン沈殿物の平均粒子径は７２４μｍであった。遠心分離により沈澱を回収後、再びｐＨ４．５に調製した蒸留水で洗浄して脱塩し、上記遠心分離を１０回行い、粗コラーゲン沈殿物として回収した。この粗コラーゲン沈殿物のコラーゲン濃度は２７質量％であった。
　次いで、得られた粗コラーゲン沈殿物５０ｇを温度２０℃のエタノール９５０ｇに投入し、ホモジナイザーを用いて３０分間分散させ、分散液を濾過して固形コラーゲンを分取し、室温で風乾することによりコラーゲン粉末を得た。
　得られたコラーゲン粉末５ｍｇを使用し、実施例１と同様に操作し、溶解性を評価した。表１に粗コラーゲン沈殿物の性状、等電点、粉末化の可否などを示し、表５に溶解性、表６に溶解初速度の結果を示す。また、図１２に溶解初速度の測定における、上記上澄みのコラーゲン濃度の経時変化を示す。
　（実施例８）
　実施例１で得られたアルカリ可溶化コラーゲン液に、水酸化ナトリウムを添加してｐＨ４．５となるよう調製し、静置することによりコラーゲンを等電点沈澱させた。その後、マスコロイダーにて流速５００ｍｌ／ｍｉｎ、回転数１，５００ｒｐｍ、クリアランス５０μｍの条件で、３回等電点沈澱を破砕した。得られた沈殿物に含まれるコラーゲン沈殿物の平均粒子径は３３５μｍであった。遠心分離により沈澱を回収後、再びｐＨ４．５に調製した蒸留水で洗浄して脱塩し、上記遠心分離を１０回行い、粗コラーゲン沈殿物として回収した。この粗コラーゲン沈殿物のコラーゲン濃度は２８質量％であった。
　次いで、得られた粗コラーゲン沈殿物５０ｇを温度２０℃のエタノール９５０ｇに投入し、ホモジナイザーを用いて３０分間分散させ、分散液を濾過して固形コラーゲンを分取し、室温で風乾することによりコラーゲン粉末を得た。
　得られたコラーゲン粉末５ｍｇを使用し、実施例１と同様に操作し、溶解性を評価した。表１に粗コラーゲン沈殿物の性状、等電点、粉末化の可否などを示し、表５に溶解性、表６に溶解初速度の結果を示す。
　（実施例９）
　実施例１で得られたアルカリ可溶化コラーゲンの等電点沈殿物（等電点ｐＨ４．５）をメタノール中に分散し、終濃度０．１Ｍとなるように塩酸を加えた。室温で３時間撹拌しながらエステル化反応を行い、水酸化ナトリウム溶液でｐＨを中性にして反応を停止させると共にコラーゲンを沈澱させた。沈殿物を遠心して分取した後、１０ｍＭの酢酸に再溶解し、メチルエステル化コラーゲンを得た。メチルエステル化コラーゲンの等電点はｐＨ７．９であった。
　メチルエステル化コラーゲン溶液に、終濃度５質量％となるように塩化ナトリウムを加えてホモジナイザーで撹拌しながら塩析し、１７，５００ｒｐｍ、２０分の遠心分離により沈澱を回収し、上記遠心分離を１０回行い、粗コラーゲン沈殿物を得た。得られた沈殿物に含まれるコラーゲン沈殿物の平均粒子径は２４４μｍであり、コラーゲン濃度は２９質量％であった。
　次いで、得られた粗コラーゲン沈殿物０．５ｇを温度２０℃のエタノール９．５ｇに投入し、ホモジナイザーを用いて３０分間分散させ、分散液を濾過して固形コラーゲンを分取し、室温で風乾してコラーゲン粉末を得た。表１に粗コラーゲン沈殿物の性状、等電点、粉末化の可否などを示す。
　（実施例１０）
　実施例４で得られた酵素可溶化コラーゲン液（等電点ｐＨ９．０）に水酸化ナトリウム溶液を加えてｐＨ８～９に調整し、コラーゲンを等電点沈澱させた。この等電点沈澱分散液に終濃度０．５ｍＭとなるように無水コハク酸を加え、室温で撹拌しながら１時間アシル化反応を行った。反応後、塩酸を加えて溶液を酸性にし、終濃度５質量％となるように塩化ナトリウムを加えて反応を停止させると共にサクシニル化コラーゲンを沈澱させた。沈殿物を遠心して分取した後、サクシニル化コラーゲンを１０ｍＭの酢酸に再溶解し、サクシニル化コラーゲンを得た。サクシニル化コラーゲンの等電点は５．４であった。
　サクシニル化コラーゲン液に、終濃度５質量％となるように塩化ナトリウムを加えてホモジナイザーで撹拌しながら塩析させ、１７，５００ｒｐｍ、２０分の遠心分離により沈澱を回収し、上記遠心分離を１０回行い、粗コラーゲン沈殿物を得た。得られた沈殿物に含まれるコラーゲン沈殿物の平均粒子径は、１６７μｍであり、コラーゲン濃度は４２質量％であった。
　次いで、得られた粗コラーゲン沈殿物０．５ｇを温度２０℃のエタノール９．５ｇに投入し、ホモジナイザーを用いて３０分間分散させ、分散液を濾過して固形コラーゲンを分取し、室温で風乾することによりコラーゲン粉末を得た。表１に粗コラーゲン沈殿物の性状、等電点、粉末化の可否などを示す。
　（実施例１１）
　実施例４で得られた酵素可溶化コラーゲン液（等電点９．０）に５倍濃度のＰＢＳ（－）を加えて、コラーゲン濃度０．７５ｍｇ／ｍｌとなるように調整し、３７℃で一晩撹拌しながらコラーゲン再生線維を形成させた。この再生線維分散液をホモジナイザーで破砕し、微細な再生線維分散液を調製した。この再生線維分散液を、１７，５００ｒｐｍ、２０分の遠心分離により沈澱を回収し、上記遠心分離を１０回行い、粗コラーゲン沈殿物を得た。得られた沈殿物に含まれるコラーゲン沈殿物の平均粒子径は、２１３μｍであった。この粗コラーゲン沈殿物のコラーゲン濃度は３０質量％であった。
　次いで、得られた粗コラーゲン沈殿物０．５ｇを温度２０℃のエタノール９．５ｇに投入し、ホモジナイザーを用いて３０分間分散させ、分散液を濾過して固形コラーゲンを分取し、室温で風乾することによりコラーゲン粉末を得た。表１に粗コラーゲン沈殿物の性状、等電点、粉末化の可否などを示す。
　（比較例１）
　実施例１で得られたアルカリ可溶化コラーゲン溶液（終濃度１質量％）５０ｇを温度２０℃のエタノール９５０ｇに投入し、ホモジナイザーを用いて３０分間分散させ、分散液を濾過した。しかし、濾過したコラーゲン分散物はフィルム状となり、粉末にはならなかった。表１に粗コラーゲン沈殿物の性状、等電点、粉末化の可否などを示す。
　（比較例２）
　実施例１で得られたアルカリ可溶化コラーゲン液に、水酸化ナトリウムを添加してｐＨ４．５となるよう調整し、マスコロイダーにて流速５００ｍｌ／ｍｉｎ、回転数１，５００ｒｐｍ、クリアランス５０μｍで撹拌しながらコラーゲンを等電点沈澱させた。得られた沈殿物に含まれるコラーゲン沈殿物の平均粒子径は、１４１μｍであった。次いで、１７，５００ｒｐｍ、２０分の遠心分離により沈澱を回収後、再びｐＨ４．５に調整した蒸留水で洗浄して脱塩し、粗コラーゲン沈殿物として回収した。この粗コラーゲン沈殿物のコラーゲン濃度は１０質量％であった。
　次いで、得られた粗コラーゲン沈殿物５０ｇを温度２０℃のエタノール９５０ｇに投入し、ホモジナイザーを用いて３０分間分散させ、分散液を濾過した。しかし、濾過したコラーゲン分散物はフィルム状となり、粉末にはならなかった。表１に粗コラーゲン沈殿物の性状、等電点、粉末化の可否などを示す。
　（比較例３）
　（１）　実施例１で得られたアルカリ可溶化コラーゲン液に、水酸化ナトリウムを添加してｐＨ４．５となるよう調整し、静置することによりコラーゲンを等電点沈澱させた。得られた沈殿物に含まれるコラーゲン沈殿物の平均粒子径は、１，８５８μｍであった。遠心分離により沈澱を回収後、再びｐＨ４．５に調整した蒸留水で洗浄して脱塩し、上記遠心分離を１０回行い、粗コラーゲン沈殿物として回収した。この粗コラーゲン沈殿物のコラーゲン濃度は３３質量％であった。得られたコラーゲン沈殿物の位相差顕微鏡像を図９に示す。
　次いで、得られた粗コラーゲン沈殿物５０ｇを温度２０℃のエタノール９５０ｇに投入し、ホモジナイザーを用いて３０分間分散させ、分散液を濾過した。しかし、濾過したコラーゲン分散物はフィルム状となり、粉末にはならなかった。
　（２）　得られたコラーゲン固形物５ｍｇを使用し、実施例１と同様に操作し、溶解性を評価した。表１に、比較例３の概要を示し、表５に溶解性、表６に溶解初速度の結果を示す。また、図１２に溶解初速度の測定における、上記上澄みのコラーゲン濃度の経時変化を示す。
　（比較例４）
　（１）実施例１で得たアルカリ可溶化コラーゲンの等電点沈殿物を終濃度３％となるように蒸留水に分散し、均一な分散液となるように３０分間ホモジナイズした。この分散液を、噴霧乾燥機を使用して、入口温度１２０℃、出口温度６０℃になるように熱風温度を調整してスプレードライし、コラーゲン粉末を得た。表１に比較例４の概要を示し、表４に溶解性の結果を示す。
　噴霧乾燥して得たコラーゲン粉末は２０時間後にも約２０％程度しか溶解しなかった。原料のコラーゲン沈殿物は実施例１と同じものであるため、実施例１との溶解性の差は、コラーゲン分子の相違ではなく処理工程に依存した形状の相違によるものである。溶け残りを観察すると、噴霧乾燥品はコラーゲン粉末が微細であるためダマ状になり、ダマの表面のみ半透明で溶解していた。噴霧乾燥ではコラーゲン粒子の平均粒子径が４．６０μｍと小さく、かつその表面が比較的滑らかであるため溶解液がダマの内部まで浸透しにくく、これが溶解性に劣る理由と考えられる。これに対し、実施例１～４、実施例７～１０はいずれもダマを形成することは無かった。
　（２）上記（１）で調製したコラーゲン粉末について、実施例１と同様にして、ＢＥＴ１点法にて比表面積を、レーザー回折・散乱法にて粒度分布を測定した。比表面積および平均粒子径を表３に、粒度分布を図１０に、コラーゲン粉末の電子顕微鏡像を図１１に示す。
　（比較例５）
　（１）　実施例１で得られた粗コラーゲン沈殿物を終濃度１質量％となるように塩酸に再溶解し、その後水酸化ナトリウムで中和してｐＨ７．５のアルカリ可溶化コラーゲン溶液を得た。この溶液を凍結乾燥し、コラーゲンスポンジを作製した。図１３に、コラーゲンスポンジの電子顕微鏡像を示す。
　（２）　得られたコラーゲンスポンジ５ｍｇを使用し、実施例１と同様に操作し、溶解性を評価した。表１に、比較例５の概要を示し、表５に溶解性、表６に溶解初速度の結果を示す。また、図１２に溶解初速度の測定における、上記上澄みのコラーゲン濃度の経時変化を示す。
　　（比較例６）
　（１）　実施例１で得られた粗コラーゲン沈殿物を終濃度１質量％となるように塩酸に再溶解し、その後水酸化ナトリウムで中和してｐＨ７．５のアルカリ可溶化コラーゲン溶液を得た。この溶液を２７ゲージの注射針を用いてエタノール中に吐出し、その後風乾することによりコラーゲン繊維を作製した。図１４に、コラーゲン繊維の電子顕微鏡像を示す。
　（２）　得られたコラーゲン繊維５ｍｇを使用し、実施例１と同様に操作し、溶解性を評価した。表１に、比較例６の概要を示し、表５に溶解性、表６に溶解初速度の結果を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　本発明は、２０１０年７月３０日に出願された日本国特許出願２０１０－１７２６９８号および２０１０－１７２６９９号に基づく。本明細書中に日本国特許出願２０１０－１７２６９８号および２０１０－１７２６９９号の明細書、特許請求の範囲、図面全体を参照として取り込むものとする。
　本発明によれば、簡便な操作で微細なコラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末を製造することができる。しかも、得られたコラーゲン粉末等は熱安定性に優れており、溶解液では三重螺旋構造を形成することができ、有用である。

Claims (9)

  1. 　平均粒子径１～１，０００μｍのコラーゲン沈殿物および／またはコラーゲン誘導体沈殿物を１２～５０質量％含有する粗コラーゲン沈殿物を親水性有機溶媒に分散させ、固形物を分取し、乾燥してなるコラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末。
  2. 　前記粗コラーゲン沈殿物は、コラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体のｐＨ３．５～１０での等電点沈澱物、または塩析物であること特徴とする、請求項１記載のコラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末。
  3. 　前記粗コラーゲン沈殿物の等電点はｐＨ３．５～８．０であり、
    　当該粉末５ｍｇのｐＨ６．５溶液の溶解初速度が０．２ｍｇ／分以上であることを特徴とする、請求項１記載のコラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末。
  4. 　コラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体を含有する溶液を、コラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体の会合を制御しつつｐＨ３．５～１０で等電点沈澱させて平均粒子径１～１，０００μｍの等電点沈殿物を得て、
    　前記等電点沈殿物に含まれるコラーゲン沈殿物および／またはコラーゲン誘導体沈殿物の濃度を調整して１２～５０質量％含有する粗コラーゲン沈殿物とし、
    　前記粗コラーゲン沈殿物を親水性有機溶媒に分散させ、固形物を分取し、乾燥することを特徴とする、コラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末の製造方法。
  5. 　前記コラーゲンの会合の制御は、前記コラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体を含有する溶液を撹拌することである、請求項４記載のコラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末の製造方法。
  6. 　コラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体を含有する溶液を、ｐＨ３．５～１０で等電点沈澱させ、前記沈殿を破砕して平均粒子径１～１，０００μｍの等電点沈殿物を得て、
    　前記等電点沈殿物に含まれるコラーゲン沈殿物および／またはコラーゲン誘導体沈殿物の濃度を調整して１２～５０質量％含有する粗コラーゲン沈殿物とし、
    　前記粗コラーゲン沈殿物を親水性有機溶媒に分散させ、固形物を分取し、乾燥することを特徴とする、コラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末の製造方法。
  7. 　コラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体を含有する溶液を、コラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体の会合を制御しつつ塩析して平均粒子径１～１，０００μｍの塩析物を得て、
    　前記塩析物に含まれるコラーゲン沈殿物および／またはコラーゲン誘導体沈殿物の濃度を１２～５０質量％に調整して粗コラーゲン沈殿物とし、
    　前記粗コラーゲン沈殿物を親水性有機溶媒に分散させ、固形物を分取し、乾燥することを特徴とする、コラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末の製造方法。
  8. 　コラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体を含有する溶液を塩析し、前記塩析物を破砕して平均粒子径１～１，０００μｍの塩析物を得て、
    　前記塩析物に含まれるコラーゲン沈殿物および／またはコラーゲン誘導体沈殿物の濃度を１２～５０質量％に調整して粗コラーゲン沈殿物とし、
    　前記粗コラーゲン沈殿物を親水性有機溶媒に分散させ、固形物を分取し、乾燥することを特徴とする、コラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末の製造方法。
  9. 　前記親水性有機溶媒が、アルコール、ケトン、エーテルおよびこれらの混合液である、請求項４～８のいずれかに記載のコラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末の製造方法。
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