JPWO2013099273A1 - 骨軟骨再生のためのスキャフォールドフリー自己組織化三次元人工組織と人工骨複合体 - Google Patents

骨軟骨再生のためのスキャフォールドフリー自己組織化三次元人工組織と人工骨複合体 Download PDF

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Abstract

【課題】骨軟骨損傷の改良された治療方法の提供。【解決手段】骨軟骨欠損に関連する疾患、障害または状態を治療または予防するための、三次元人工組織と人工骨とを含む複合組織であって、この三次元人工組織は、実質的に、細胞および該細胞に由来する細胞外マトリクスから構成され、該細胞外マトリクスは、フィブロネクチン、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩおよびビトロネクチンを含み、該細胞外マトリクスが該組織中に分散して配置されたものである複合組織。

Description

本発明は、再生医療の分野に関する。より詳細には、移植後も機能する人工組織を含む複合組織ならびにその製造法およびその利用法に関する。本発明の複合組織は、生物学的結合能を有し、骨軟骨の損傷の治療において顕著な効果を奏する。
近年、骨・軟骨損傷等に対し、遺伝子工学、細胞組織工学、再生医学等を駆使した再生型治療が新しい治療法として注目され、先端医療の最重要かつ最難関な研究テーマの一つとして、世界的に多くの研究者が精力的に取り組んでいる。
推定される再生（組織工学）医療関連の市場は、新エネルギー・産業技術総合開発機構の資料では世界で約４８兆円、日本国内が約５兆円、組織工学関連製品のみに限っても世界で約１０兆円とされており、この分野の次世代の新産業としての世界の期待は大きい。
本発明者らも、筋骨格組織および循環器組織領域において再生型治療の開発に取り組み、細胞移植と増殖因子との併用法、組織工学による組織移植再生法を報告してきた。しかし、このような細胞移植や組織移植による再生医療を行うためには、自己由来の細胞源の確保が急務かつ最重要である。筋骨格系組織の細胞には自己修復力の高いものが多く、幹細胞としての機能を有する細胞の存在が報告されてきている。
変形性関節症（ＯＡ）は、関節痛、関節の変形および機能不全を引き起こす一般的な病気であり、世界中で数億人に広まっている［非特許文献１］。ＯＡ治療の臨床上の選択肢には、関節の破壊の程度によって、全関節置換術、骨切り術および骨軟骨移植などが存在する。加えて、組織工学および再生医療によるアプローチが最近検討されている。
軟骨下骨の損傷をともなう骨軟骨病巣の修復のためには、軟骨下骨を安定化させ、そして、軟骨および軟骨下骨の層ごとの回復を促進することが重要である［非特許文献２〜非特許文献３］。これらの構造を層ごとに再生するための戦略として、二相性または三相性の構造物が開発されている［非特許文献４〜非特許文献１２］。これらの構造物は、インビトロおよびインビボでの良好な骨軟骨修復に寄与すると報告されているが、スキャフォールドまたはプラスミドの使用に起因して、これらの材料の長期の安全性にともなういくつかの問題が依然として存在している。それゆえ、臨床応用のためには、このような潜在的な問題を克服し得るハイブリッド材料が必要とされている。二相性移植片の別の問題として、隣接する軟骨との確実な生物学的癒合および骨軟骨境界部の再生は、治療成果を決定付ける重要な要因となり得る。
ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）およびβ−リン酸三石灰（β−ＴＣＰ）といった人工骨は、骨折または骨腫瘍の切除後の骨欠損の処置に、臨床上広く使用されている［非特許文献１３〜非特許文献１５］。本発明者らはこれまでに、軟骨下骨を修復するための、新規な十分に相互連結したヒドロキシアパタイト（ＨＡ）人工骨の有用性を報告した［非特許文献１６］。さらに、本発明者らは、滑膜由来の同種異系間葉幹細胞（ＭＳＣ）とこれらの細胞によって合成される細胞外マトリクス（ＥＣＭ）とから成るスキャフォールド非依存性三次元人工組織（ＴＥＣ）を開発し［非特許文献１７］、得られたＴＥＣについて、大型動物での研究における軟骨修復に対する有用性を実証した［非特許文献１８〜非特許文献１９］。
骨格筋（非特許文献２０）、脂肪（非特許文献２１）、臍帯血（非特許文献２２）、腱（非特許文献２３）、骨髄（非特許文献２４）、滑膜（非特許文献２５）などに由来する細胞が、未分化で多様な細胞へ分化する能力を有することが明らかとなってきた。
従来、これまで組織修復、再生をめざした細胞治療を行う場合、細胞の集積の維持、細胞増殖、分化機能の安定化、さらには治療部位にかかる力学的ストレスからの保護などのために大多数の研究では生体スキャフォールド（Ｓｃａｆｆｏｌｄ）が使用されてきた。しかしスキャフォールドの多くは生物（動物）材料、生体高分子材料等を含有し、それらの材料の使用が生体に及ぼす安全性は長期にわたっては予測しきれない問題があった。
基盤材料を用いない細胞移植方法としては、非特許文献２７などにおいて報告されるように、岡野らのグループによる温度感受性培養皿を利用した細胞シート工学技術が代表的であり、独創的技術として国際的評価を得ている。しかし、この細胞シート技術を使用する場合、単独のシートでは脆弱であることが多く、移植等の外科的操作に耐えうる強度を得るためにはシートを重ね合わせる操作等の工夫が必要であった。
このようなナノバイオインターフェース技術では、温度応答性ポリマー（ＰＩＰＡＡｍ）を、細胞培養用のシャーレ等プラスチック成型体に固定すると、ポリマー表面は３１℃を境に親水性⇔疎水性に可逆的に変化する。つまり３１℃以上ではシャーレ表面は疎水性なので、細胞などが付着できる状態になる。この状態では、細胞は細胞外マトリックス（例えば、接着因子（“のり”のような機能を持ったタンパク質））を繰り出し、シャーレ表面に接着し、増殖させることができる（非特許文献２６〜２８）。
しかし、３１℃以下ではシャーレ表面は親水性に変化するので、それまで付着していた細胞は、接着因子を保持したまま非常に剥がれやすくなる。これはそれまで吸着していたシャーレの表面それ自体が、３１℃以下では無くなってしまうからである。
このように温度応答性ポリマーを固定化したシャーレ（例えば、商品名：ＵｐＣｅｌｌおよびＲｅｐＣｅｌｌ）を用いて細胞培養・剥離を行っても、細胞外マトリクスなどが三次元レベルで適切に配置されず、真の意味での移植可能な人工組織は生産されてこなかった（非特許文献２６〜２８）。従来のシートの調製方法では、あまり大型のものができないこと、三次元方向にわたり生物学的結合を持った人工組織はできないことなどの欠点があり、しかもシート調製が終わった後に培養基材からはがすとぼろぼろになるなどの欠点があった。したがって、移植手術に耐え得る、実際の手術に使用可能な、培養によって生産され得る人工組織を提供することができない。また、従来の技術によって調製された人工組織は、組織培養の後培養基材からの単離が困難であり、大型の組織片を作製することが実質上不可能であった。従って、従来の組織シートのような人工組織は、サイズ、構造、機械的強度などの面で医療用途における使用に耐えないという問題点があった。従来技術によって調製された人工組織は、調製自体が困難であることから、供給数が限定されているという問題点があった。
さらに、特許文献１および特許文献２では、アルギン酸ゲルを用いて半透膜上で細胞を培養することが報告されているが、この組織は、細胞外マトリクスとの一体性が悪く、スキャフォールドフリーではなく、自己組織化が行われておらず、自己支持性もなく、分化誘導能がなくなっており、三次元化という意味で形態学的な可塑性が減失しており、従って、細胞移植をするという意味でも好ましい組織とはいえない。
そこで、本発明者らの一部は、移植医療で、副作用の問題から重要視されていたスキャフォールドを使用しない技術を開発し、特許出願をした（特許文献３）。
特許文献４は、骨補填材として従来のリン酸カルシウム関連のものを開示する。
本発明者らの一部はさらに、細胞組織体−ハイドロキシアパタイト複合体の安全な調製法を出願した（特許文献５）。
国際公開００／５１５２７号パンフレット 国際公開０３／０２４４６３号パンフレット 特許第４５２２９９４号 特開２００１−１３７３２８公報 特開２００８−１２６００５公報
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本発明は、細胞外マトリクス産生促進因子を含む培地での培養という特定の培養条件によって細胞を培養することによって組織化が進展し、培養皿から剥離し易くなるという性質をもつ人工組織を、人工骨等の他の人工組織と複合化させたものが、特に、骨軟骨疾患等において顕著な治療成績を上げることを見出し、本発明のこの領域での用途を提供する。また、本発明は、骨軟骨疾患において、好ましい複合組織の態様を見出し、その知見に基づき新規素材を提供する。
本発明によって提供される人工組織を含む複合組織は、例えば、スキャフォールドを必要とせず、自己支持性を有し、三次元化が容易であり、形態可塑性もあり、周囲との生物学的接着能に優れ、分化誘導能を有するなどの性質を持つことによって置換療法においておよび損傷部位を被覆する治療法において有効である。本発明によれば、損傷部位の癒合が良好であるなど、治療成績も極めて良好である。
本発明の複合組織は多様な形状へ構築させることが可能であり、しかも十分な強度を有するために移植などの外科的操作も容易で、本発明では、例えば、１０６〜１０８個と多量の細胞を、組織移植の要領で容易に確実に局所へ供給することが可能である。またマトリックス内には、コラーゲン（例えば、Ｉ型、ＩＩＩ型）、フィブロネクチン、ビトロネクチン等の細胞接着因子が豊富に存在する。特に、この細胞接着因子は、このマトリックスを通じて一体化している。
従って本発明の複合組織は、移植周囲との生物学的接着性に非常に優れており、複合体および移植先の組織は、きわめて短時間で生物学的に癒合する。さらにこの複合組織は培養条件を変化させることにより骨や軟骨組織への誘導が可能である。このような複合組織は安全でかつ効率の良い、細胞治療システムにおいて有用である。
本発明が達成したものとして、このような複合組織を用いた関節組織再生技術の臨床応用がある。本発明は、特にこれまでに治療が困難であった骨膜および骨皮質が共に欠損した部位の骨再生、そして軟骨下骨に達しない部分層軟骨損傷、および無血管野あるいは血行不良部位の半月、腱、靭帯、椎間板、心筋などの損傷の治療法の開発が可能になった。
理想的な骨軟骨修復のためには、軟骨下骨および軟骨の層ごとの「復元」＝回復（ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ）を促進することが重要である。本発明者らの一部はこれまでに、軟骨下骨を修復するための、新規な十分に相互連結したヒドロキシアパタイト（ＨＡ）人工骨の実現可能性を報告した（Ｔａｍａｉ Ｎ， ｅｔ ａｌ Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｃａｒｔｉｌａｇｅ ２００５ １３（５）：４０５−４１７．）。さらに、本発明者らは、関節軟骨を修復するための、滑膜の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）に由来するスキャフォールド非依存性三次元人工組織（本明細書において、単に「三次元人工組織」「人工組織」ということがある。本明細書において、三次元人工組織はｔｉｓｓｕｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ＝ＴＥＣと表記することがあるが、いずれも同じ意味で使用される。）を開発した。本発明により、ウサギ骨軟骨欠損モデルを用いて、骨軟骨欠損を修復するための、ＴＥＣおよびＨＡ等の人工骨等を含む複合組織（本明細書では「ハイブリッド移植片」ともいうが、いずれも同じ意味で用いられる。）の実現が可能となった。
１つの実施形態では、本発明者らは、麻酔下で、骨格が成熟したウサギの大腿骨顆間部に骨軟骨欠損を作製した。滑膜ＭＳＣ由来するＴＥＣとＨＡとの複合体（ハイブリッド）形成は、移植直前に接着剤を用いることなく行い、続いて、この二相性の移植片を、縫合することなく欠損内に移植した。対照群ではＨＡを移植した。本発明者らはまた、生体力学的試験のための対照群として、未処置の正常な膝を準備した。移植を施した欠損部を、手術から１、２および６ヵ月後に形態学的に評価した。さらに、手術から６ヶ月後に生体力学的解析を行った。
ＴＥＣはＨＡブロック上に直ちに結合して、外科的移植に十分耐えうる強度を持つ複合体を生じた。この複合組織（ハイブリッド材料）で処置した骨軟骨欠損は、ＨＡ単独の場合と比較して、隣接する軟骨との良好な生物学的癒合とともに軟骨下骨および軟骨のより早期からの修復の応答を示した。加えて、この複合組織（ハイブリッド材料）で処置した骨軟骨組織が修復されると、正常な骨軟骨組織に等しい剛性が回復した。
本発明者らは、本発明の複合組織（ハイブリッド移植片）が骨軟骨修復を組織学的にも生体力学的にも顕著に改善することを実証した。特に、軟骨下骨の早期からの修復、ならびに、隣接する宿主組織への確実かつ良好な組織の生物学的癒合は、長期にわたる耐久性を保証し得る。ＴＥＣはスキャフォールド非依存性であるため、動物または化学物質由来の物質を含まず、そしてさらに、ＨＡは、臨床上広く使用されている。それゆえ、本発明者らによるハイブリッド材料は、骨軟骨損傷の効率的かつ安全な修復に適している。
ＴＥＣの特筆すべき点は、ＴＥＣは外来性スキャフォールドなしで開発できるので、ＴＥＣの移植は、スキャフォールド内に含まれる人工物または外因性の生体物質によって誘発される潜在的な副作用の危険性が最小限となることである。さらに、ＴＥＣの重要な生物学的特徴は、その組織接着性である。この特性は、人工骨に対するＴＥＣの急速かつ確実な接着に寄与する。それゆえ、ＴＥＣと人工骨から成るハイブリッド移植片は、急速かつ容易に作製され得、そして、臨床的に関係する骨軟骨病巣の修復に適している可能性がある。
本発明は、１つの実施形態でウサギ骨軟骨欠損モデルを用いて、ＴＥＣおよび人工骨のハイブリッド移植片の有効性を検討することによって、その効果を確認した。
従って、本発明は、以下を提供する。
（１）骨軟骨欠損に関連する疾患、障害または状態を治療または予防するための、三次元人工組織と人工骨とを含む複合組織。
（２）前記三次元人工組織は、実質的に、細胞および該細胞に由来する細胞外マトリクスから構成され、該細胞外マトリクスは、フィブロネクチン、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩおよびビトロネクチンを含み、該細胞外マトリクスが該組織中に分散して配置されたものであり、該細胞外マトリクスと該細胞とは、一緒になって三次元構造を形成するように生物学的に癒合しており、移植したときに周囲と生物学的に癒合する能力を有し、自己支持力を提供するのに十分な強度を有する、（１）に記載の複合組織。
（３）前記三次元人工組織は、実質的に、筋芽細胞、間葉系幹細胞、脂肪細胞、滑膜細胞、および骨髄細胞からなる群より選択される細胞および該細胞に由来する細胞外マトリクスから構成され、該細胞外マトリクスは、コラーゲンＩおよび／またはコラーゲンＩＩＩを含み、該コラーゲンＩおよび／またはコラーゲンＩＩＩは、コラーゲンＩＩよりも多く、該細胞外マトリクスが該組織中に分散して配置されたものである、（１）または（２）に記載の複合組織。
（４）前記人工骨は、前記骨軟骨欠損における骨部の欠損の深さよりも小さなサイズである、（１）〜（３）のいずれか１項に記載の複合組織。
（５）前記人工骨と前記三次元人工組織との深さの合計は、前記骨軟骨欠損の深さと略同じである、（１）〜（４）のいずれか１項に記載の複合組織。
（６）前記人工骨は、前記骨軟骨欠損における骨部の欠損の深さよりも小さなサイズであり、かつ、前記人工骨と前記三次元人工組織との深さの合計は、前記骨軟骨欠損の深さと略同じである、（１）〜（５）のいずれか１項に記載の複合組織。
（７）前記人工骨は、前記骨軟骨欠損における骨部の欠損の深さよりも約１ｍｍ以上小さいサイズである、（１）〜（６）のいずれか１項に記載の複合組織。
（８）前記人工骨は、前記骨軟骨欠損における骨部の欠損の深さよりも軟骨の厚みの２倍以下小さいサイズである、（１）〜（７）のいずれか１項に記載の複合組織。
（９）前記人工骨は、前記骨軟骨欠損における骨部の欠損の深さよりも約１ｍｍ以上小かつ軟骨の厚みの２倍以下小さいサイズである、（１）〜（８）のいずれか１項に記載の複合組織。
（１０）前記三次元人工組織と前記人工骨とは二相で存在する、（１）〜（９）のいずれか１項に記載の複合組織。
（１１）前記三次元人工組織と前記人工骨とは互いに接着した状態にある、（１）〜（１０）のいずれか１項に記載の複合組織。
（１２）前記骨軟骨欠損は哺乳動物におけるものである、（１）〜（１１）のいずれか１項に記載の複合組織。
（１３）前記人工骨は、ヒドロキシアパタイトおよびβ−リン酸三カルシウムからなる群より選択される材料で構成される、（１）〜（１２）のいずれか１項に記載の複合組織。（１４）前記疾患、障害または状態は、変形性関節症、骨軟骨損傷、骨軟骨病変、骨壊死、関節リウマチ、骨腫瘍およびその類似疾患からなる群より選択される、（１）〜（１３）のいずれか１項に記載の複合組織。
（１５）骨軟骨欠損に関連する疾患、障害または状態を治療または予防するためのキットであって、三次元人工組織と人工骨とを備えるキット。
（１５Ａ）（１）〜（１３）のいずれか１項または複数項に記載の特徴をさらに備える（１５のキット。
（１６）骨軟骨欠損に関連する疾患、障害または状態を治療または予防するためのキットであって、三次元人工組織の生産のための細胞培養組成物と人工骨とを備えるキット。
（１６Ａ）（１）〜（１３）のいずれか１項または複数項に記載の特徴をさらに備える（１６）のキット。
（１７）（１）に記載の複合組織を生産するための方法であって、前記三次元人工組織と前記人工骨とを、該三次元人工組織と該人工骨とが接触する状態に配置する工程を包含する、方法。
（１７Ａ）（１）〜（１３）のいずれか１項または複数項に記載の特徴をさらに備える（１７の方法。
（１８）三次元人工組織と人工骨とを含む、軟骨を再生するための複合組織。
（１９）三次元人工組織と人工骨とを含む、骨軟骨系を再生するための複合組織。
（２０）三次元人工組織と人工骨とを含む、軟骨下骨を再生するための複合組織。
（２１）前記軟骨は、再生後に既存の軟骨と癒合する、（１８）または（１９）に記載の複合組織。
あるいは、本発明は、以下を提供する。
（Ａ１）骨軟骨欠損に関連する疾患、障害または状態を治療または予防するための、三次元人工組織と人工骨とを含む複合組織であって、該人工骨は、該骨軟骨欠損における骨部の欠損の深さよりも小さなサイズである、複合組織。
（Ａ２）前記人工骨の長さと前記三次元人工組織の長さの合計は、前記骨軟骨欠損の深さと略同じである、（Ａ１）に記載の複合組織。
（Ａ３）前記人工骨は、前記骨軟骨欠損における骨部の欠損の深さよりも約１ｍｍ以上小さいサイズである、（Ａ１）または（Ａ２）に記載の複合組織。
（Ａ４）前記人工骨は、前記骨軟骨欠損における骨部の欠損の深さよりも軟骨の厚みの２倍以下小さいサイズである、（Ａ１）〜（Ａ３）のいずれか１項に記載の複合組織。
（Ａ５）前記人工骨は、前記骨軟骨欠損における骨部の欠損の深さよりも約１ｍｍ以上小かつ軟骨の厚みの２倍以下小さいサイズである、（Ａ１）〜（Ａ４）のいずれか１項に記載の複合組織。
（Ａ６）前記人工骨は、前記骨軟骨欠損における骨部の欠損の深さよりも約２ｍｍ以上〜約４ｍｍ小さいサイズである、（Ａ１）〜（Ａ５）のいずれか１項に記載の複合組織。
（Ａ６Ａ）前記人工骨は、前記骨軟骨欠損における骨部の欠損の深さよりも約２ｍｍ以上〜約３ｍｍ小さいサイズである、（Ａ１）〜（Ａ５）のいずれか１項に記載の複合組織。
（Ａ６Ｂ）前記人工骨は、前記骨軟骨欠損における骨部の欠損の深さよりも約３ｍｍ以上〜約４ｍｍ小さいサイズである、（Ａ１）〜（Ａ５）のいずれか１項に記載の複合組織。
（Ａ６Ｃ）前記人工骨は、前記骨軟骨欠損における骨部の欠損の深さよりも約３ｍｍ小さいサイズである、（Ａ１）〜（Ａ５）のいずれか１項に記載の複合組織。
（Ａ７）前記三次元人工組織と前記人工骨とは二相で存在するか、または前記三次元人工組織と前記人工骨とは互いに接着した状態にある、（Ａ１）〜（Ａ６）のいずれか１項に記載の複合組織。
（Ａ８）前記骨軟骨欠損は哺乳動物におけるものである、（Ａ１）〜（Ａ７）のいずれか１項に記載の複合組織。
（Ａ９）前記人工骨は、ヒドロキシアパタイトおよびβ−リン酸三カルシウムからなる群より選択される材料で構成される、（Ａ１）〜（Ａ８）のいずれか１項に記載の複合組織。
（Ａ１０）前記疾患、障害または状態は、変形性関節症、骨軟骨損傷、骨軟骨病変、骨壊死、関節リウマチ、骨腫瘍およびその類似疾患からなる群より選択される、（Ａ１）〜（Ａ９）のいずれか１項に記載の複合組織。
（Ａ１１）骨軟骨欠損に関連する疾患、障害または状態を治療または予防するための、三次元人工組織と人工骨とを備えるキットであって、該人工骨は、該骨軟骨欠損における骨部の欠損の深さよりも小さなサイズである、キット。
（Ａ１２）骨軟骨欠損に関連する疾患、障害または状態を治療または予防するためのキットであって、三次元人工組織の生産のための細胞培養組成物と人工骨とを備える、該人工骨は、該骨軟骨欠損における骨部の欠損の深さよりも小さなサイズである、キット。
（Ａ１３）（Ａ１）〜（Ａ１０）のいずれか１項に記載の複合組織を生産するための方法であって、前記三次元人工組織と前記人工骨とを、該三次元人工組織と該人工骨とが接触する状態に配置する工程を包含する、方法であって、該人工骨は、前記骨軟骨欠損における骨部の欠損の深さよりも小さなサイズである、方法。
（Ａ１４）前記三次元人工組織は、実質的に、細胞および該細胞に由来する細胞外マトリクスから構成され、該細胞外マトリクスは、フィブロネクチン、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩおよびビトロネクチンを含み、該細胞外マトリクスが該組織中に分散して配置されたものであり、該細胞外マトリクスと該細胞とは、一緒になって三次元構造を形成するように生物学的に癒合しており、移植したときに周囲と生物学的に癒合する能力を有し、自己支持力を提供するのに十分な強度を有する、（Ａ１）〜（Ａ１０）のいずれか１項に記載の複合組織。
（Ａ１５）前記三次元人工組織は、実質的に、筋芽細胞、間葉系幹細胞、脂肪細胞、滑膜細胞、および骨髄細胞からなる群より選択される細胞および該細胞に由来する細胞外マトリクスから構成され、該細胞外マトリクスは、コラーゲンＩおよび／またはコラーゲンＩＩＩを含み、該コラーゲンＩおよび／またはコラーゲンＩＩＩは、コラーゲンＩＩよりも多く、該細胞外マトリクスが該組織中に分散して配置されたものである、（Ａ１）〜（Ａ１０）または（Ａ１４）のいずれか１項に記載の複合組織。
（Ａ１６）（Ａ１）〜（Ａ１０）、（Ａ１４）または（Ａ１５）のいずれかまたは複数項に記載のさらなる特徴を備える、（Ａ１２）に記載のキット。
（Ａ１７）（Ａ１）〜（Ａ１０）、（Ａ１４）または（Ａ１５）のいずれかまたは複数項に記載のさらなる特徴を備える、（Ａ１３）に記載の方法。
本発明は、上記特徴がさらに任意の組み合わせで用いられるものを包含することが理解される。以下に、本発明の好ましい実施形態を示すが、当業者は本発明の説明および当該分野における周知慣用技術からその実施形態などを適宜実施することができ、本発明が奏する作用および効果を容易に理解することが認識されるべきである。
本発明は、スキャフォールド（スキャフォールド、基盤材料）フリーの人工組織と他の人工組織（例えば人工骨）との複合組織を提供する。このようなスキャフォールドフリーの人工組織を含む複合組織を提供することによって、移植後の経過に優れた治療法および治療剤が提供される。本発明はまた、スキャフォールドフリーの人工組織を含む複合組織という点において、生物製剤における長期にわたる規制の問題の一つである、スキャフォールド自体の混入に起因する問題を一挙に解決する。また、スキャフォールドがないにもかかわらず、治療効果は従来のものに比べても遜色ないどころか、より良好である。理論に束縛されることを望まないが、このスキャフォールドフリーの人工組織と、すでに骨再生インプラントとして有用性、安全性が証明されている人工骨が証明されている複合組織を用いる場合でも、軟骨再生における人工組織の使用の有用性はそのまま引き継がれるといえ、これも従来の人工組織、複合組織等に比べて有利な点といえる。
このほか、スキャフォールドを用いた場合に、スキャフォールド内の移植細胞の配向性、細胞間接着性の問題、スキャフォールド自体の生体における変化（炎症惹起）およびスキャフォールドのレシピエント組織への生着性などの問題を解決することができる。同様に、本発明において、人工骨としては、好ましくは実際の骨の成分が使用され、生物製剤や合成ポリマーを使用しないという点で、すでに骨再生インプラントとして有用性、安全性が証明されている人工骨が証明されている複合組織を用いる場合でも、軟骨再生における人工組織の使用の有用性はそのまま引き継がれるといえ、これも従来の人工組織、複合組織等に比べて有利な点といえる。
本発明の複合組織はまた、自己組織化しており、内部において生物学的結合が行われているという点で、従来の細胞治療とも一線を画すことができる。
本発明の複合組織はまた、三次元形態を容易に形成することができ、所望の形態に容易に設計することができることから、その汎用性に留意されるべきである。
本発明の複合組織は、周囲の組織、細胞などのレシピエント組織との生物学的結合を有することから、術後の定着がよく、細胞が局所に確実に供給 されるなどの優れた効果が
奏される。本発明の効果としては、このような生物学的結合性の良好さから、他の人工組織などと複合組織を形成することによって複雑な治療を行うことができる点にもある。
本発明の別の効果は、複合組織として提供した後、分化誘導をかけることができるという点にある。あるいは、人工組織および／または複合体として提供する前に、分化誘導をかけて、そのような人工組織および／または複合体を形成することができる点にもある。
本発明の他の効果は、細胞移植という観点から、従来の細胞のみの移植、シートを用いた移植など、三次元人工組織のみを利用した場合、あるいは人工組織（人工骨等）のみを移植した場合と比べて、三次元レベルでの組織置換が可能、被覆することによる総合的な細胞供給などの効果が奏される点にある。
本発明によって、生物学的結合能を有し、移植可能な人工組織を含む複合組織が提供される。このような組織は、上記特徴および効果を有することによって、従来人工物での移植処置が考えられなかった部位の処置が可能になった。本発明の人工組織を含む複合組織は、組織内およびレシピエント組織との間で生物学的結合を有しており、実際に移植治療において機能する。このような人工組織を含む複合組織は、従来技術では提供されるものではなく、初めて提供されるものである。本発明の複合組織は、移植時の周囲の組織、細胞などと生物学的に結合する能力を十分に有し（好ましくは細胞外マトリクスによる）、従って、術後の経過に優れる。このような三次元レベルで瀰漫性に生物学的結合能を有する人工組織は、従来存在しておらず、従って、本発明は、従来の人工組織では達成できなかった治療効果を奏することになる。
さらに、本発明により、疾患部分を充填し、置換させること、および／または疾患部位を被覆することによって治療効果をもたらす医療処置が可能となった。
また、本発明は、他の人工組織（例えば、ハイドロキシアパタイトでできた人工骨、微線維性コラーゲン医療材料など）とともに用いることにより、他の人工組織と生物学的に結合することによって、従来では達成できなかった治療成績の向上（例えば、人工組織の定着の向上）が得られた。特に、本発明の好ましい実施形態での他の人工組織との特定形態（特に、骨軟骨欠損における骨部の欠損の深さよりも小さなサイズであるという形態）での組合せを用いることによって、術後の成績が格段に向上し、生物学的癒合状態が飛躍的に向上し、損傷痕がほとんどない治療を行なうことができることが明らかになった。
本発明の複合組織に使用される人工組織は、組織全体にフィブロネクチン、ビトロネクチンなどの細胞外マトリクスまたは細胞接着因子が微慢性に分布し、一方細胞シート工学では培養細胞のシャーレへの接着面に細胞接着因子は局在している。そして最たる違いは細胞シート工学ではシートの主体は細胞であり、シートは接着因子のノリを底面に付けた細胞の塊に近いものであるが、本発明者らの人工組織は文字通り細胞外マトリックスが細胞を包んだ「組織」であるという点が従来のものとは顕著に異なるといえる。
スキャフォールド（基盤）材料を用いない細胞移植方法としては、東京女子医大のグループによる温度感受性培養皿を利用した細胞シート工学技術が代表的であり、独創的技術として国際的評価を得ている。しかし、この細胞シート技術を使用する場合、単独のシートでは脆弱であることが多く、移植等の外科的操作に耐えうる強度を得るためにはシートを重ね合わせる操作等の工夫が必要であった。本発明はこのような問題を解決した。また、理論に束縛されることは望まないが、人工組織は三次元的に厚み、幅などを自在に調節でき軟骨をはじめとする単一の組織再生が効率よく可能であるが、骨・軟骨の複合体などの複合組織の再生を人工組織のみで行うのは細胞数の確保の面で効率がよくないという事実があった。今回の複合組織化により効率よく再生が可能となった。
本研究で開発する細胞・マトリックス複合体は細胞シート技術とは異なり、温度感受性培養皿を必要とせず、また細胞・マトリックスを重層化させることが容易 であることが特徴である。げっ歯類のストローマ細胞などのいわゆるフィーダー細胞の使用無しに10層以上に重層した複合体を３週間程度で作成できる技術は世界的に見当たらない。また、滑膜細胞のマトリックス産生条件を調節させることにより、特殊な器具を必要とすることなく複合体の把持、移動といった外科的操作が可能となる強度を保持する複合体の作成も可能であり、本発明は、世界的に見ても、細胞移植を確実にかつ安全に行うための独創的で画期的な手法となるという点でも効果を有するといえる。本発明で使用される人工組織は三次元的に厚み、幅などを自在に調節でき、軟骨をはじめとする単一の組織再生が効率よく可能であるが、骨・軟骨の複合体など複合組織の再生を人工組織のみで行うのは効率がよくないという事実があった。今回の複合組織化により効率よく再生が可能となった。
図１ａは、ＴＥＣおよび人工骨から成るハイブリッド移植片を示す。図１ｂは、ウサギの大腿骨窩部における骨軟骨欠損を示す。図１ｃは、対照群およびＴＥＣ群における移植材料の概略図を示す。 図２は、軟骨下骨および軟骨の修復の定量化を示す。（ａ）骨形成率は、修復後の骨組織の長さを人工骨の長さで割って計算し、結果をパーセンテージとして表した。（ｂ）軟骨形成率もまた、同じ方法で計算した。 図３ａ〜ｂは、（ａ）人工骨のみ、または（ｂ）ハイブリッド移植片で処置した外科手術から１ヶ月後の、修復された組織の肉眼像を示す。図３ｃ〜ｄは、（ｃ）人工骨のみ、または（ｄ）ハイブリッド移植片で処置した、修復後の組織のＨ＆Ｅ染色を示す。ハイブリッド移植片で処置した骨軟骨欠損は、厚みのある線維様の組織で修復された。バー＝１ｍｍ。 図４ａ〜ｂは、（ａ）人工骨のみ、または（ｂ）ハイブリッド移植片で処置した外科手術から２ヶ月後の、修復された組織の肉眼像を示す。図４ｃ〜ｆは、（ｃ、ｄ）人工骨のみ、または（ｅ、ｆ）ハイブリッド移植片で処置した、修復後の組織のＨ＆Ｅ染色およびトルイジンブルー染色を示す。バー＝１ｍｍ。 図４ｇ〜ｊは、修復された組織の辺縁（ｇ、ｉ）および中心（ｈ、ｊ）領域の低倍率像を示す。バー＝１００μｍ。ハイブリッド移植片で処置した欠損は、骨軟骨組織で修復され、隣接する受容組織への良好な組織の一体化を示した。 図４ｋ〜ｌは、修復された組織の中心領域の高倍率像を示す。バー＝２０μｍ。ハイブリッド移植片で処置した細胞の形態は、小腔内に丸い形状の細胞を示した。 図５ａ〜ｂは、（ａ）人工骨のみ、または（ｂ）ハイブリッド移植片で処置した外科手術から６ヶ月後の、修復された組織の肉眼像を示す。図５ｃ〜ｆは、（ｃ、ｄ）人工骨のみ、または（ｅ、ｆ）ハイブリッド移植片で処置した、修復後の組織のＨ＆Ｅ染色およびトルイジンブルー染色を示す。バー＝１ｍｍ。 図５ｇ〜ｊは、修復された組織の辺縁（ｇ、ｉ、矢印）および中心（ｈ、ｊ）領域の低倍率像を示す。バー＝１００μｍ。ハイブリッド移植片で処置した修復後の組織は、隣接する宿主組織への良好な組織の生物学的癒合を維持していたが、人工骨のみのものは、乏しい生物学的癒合を示した。 図５ｋ〜ｌは、修復された組織の中心領域の高倍率像を示す。バー＝２０μｍ。ハイブリッド移植片で処置した細胞の形態は、小腔内に丸い形状の細胞を示したが、人工骨のみのものは、小腔内に細胞のクラスターを示した。 図６ａは、外科手術から１ヶ月後、２ヵ月後および６ヵ月後の、対照群およびＴＥＣ群における軟骨修復における組織学的スコアを示す［それぞれ、Ｎ＝４、Ｎ＝６］。＊：ｐ＜０．０５；＊＊：ｐ＜０．０１。特筆すべきことに、本発明を用いた場合の軟骨修復において外科手術後６ヶ月まで、対照群のものよりも有意に高かった。 図６ａは、外科手術から１ヶ月後、２ヵ月後および６ヵ月後の、対照群およびＴＥＣ群における軟骨下骨修復における組織学的スコアを示す［それぞれ、Ｎ＝４、Ｎ＝６］。＊：ｐ＜０．０５；＊＊：ｐ＜０．０１。特筆すべきことに、本発明を用いた場合の軟骨修復において外科手術後６ヶ月まで、対照群のものよりも有意に高かった。 図７ａは、外科手術から１ヶ月後の、対照群およびＴＥＣ群における骨および軟骨の形成を示す［それぞれ、Ｎ＝４、Ｎ＝６］。 図７ｂは、外科手術から２ヶ月後の、対照群およびＴＥＣ群における骨および軟骨の形成を示す［それぞれ、Ｎ＝４、Ｎ＝７］。＊；ｐ＜０．０５。ＴＥＣ群の軟骨形成は、外科手術後２ヶ月の時点で、対照群のものよりも有意に高かった。 図７ｃは、外科手術から６ヶ月後の、対照群およびＴＥＣ群における骨および軟骨の形成を示す［それぞれ、Ｎ＝５、Ｎ＝５］。 図７ｄは、骨および軟骨の形成率は、有意に相関していた（Ｎ＝３１、ｒ＝０．８８７２、ｐ＜０．００１）。 図８ａは、未処置の正常組織（Ｎ＝５）、対照群（Ｎ＝５）およびＴＥＣ群（Ｎ＝５）における修復された骨軟骨組織の剛性を示す。ハイブリッド移植片で処置した修復後の骨軟骨組織は、正常な骨軟骨組織と等しい剛性を回復した。 図８ｂ〜ｄは、未処置の正常組織（ｂ）、対照群（ｃ）およびＴＥＣ群（ｄ）における修復された組織の表面のデジタル画像を示す。 図８ｅは、図８ｂ〜ｄのデジタル画像から計算した表面の粗さを示し、未処置の正常組織群（Ｎ＝５）、対照群（Ｎ＝５）およびＴＥＣ群（Ｎ＝３）の間で、有意差はなかった。 図９は実施例２の結果を示す図（トルイジンブルー染色）である。左には対照群を示し、右には本発明のＴＥＣ複合組織を用いた結果を示す。下側には、上側の四角部分の拡大図を示す。対照群ではネオボーンと同様、術後６ヶ月では隣接正常軟骨との生物学的癒合は不良である。また軟骨の被薄化が進行している。一方、ハイブリッド群の隣接正常軟骨との生物学的癒合は良好である。 図１０は実施例７で行ったウサギＥＳ細胞から間葉様系幹細胞とも呼ばれる間葉系幹細胞を誘導し、これを用いて三次元人工組織を作製したものを用いた場合でも本発明の効果が得られることを示す。左は、骨軟骨欠損の状態を示し、右は、本発明のウサギＥＳ細胞から間葉様系幹細胞とも呼ばれる間葉系幹細胞で作製したＴＥＣとβＴＣＰとの複合組織での術後１ヶ月での治癒状況を示す。内部細胞塊を採取してフィーダー細胞（ＭＥＦ）上で培養してＥＳＣｓを誘導した。次に胚様体（ＥＢ）を作成した後、酸素分圧制御下の平面培養でＭＳＣｓ（ＥＳ−ＭＳＣｓ）へ分化誘導したものを使用したところ、ウサギ膝関節にφ５ｍｍ×高さ６ｍｍの骨軟骨欠損にＥＳ−ＭＳＣｓで作製したＴＥＣとφ５ｍｍ×高さ４ｍｍ人工骨を一体化したインプラントを移植した。欠損のみの膝に比してＴＥＣ・人工骨ハイブリッドインプラントの治療により明らかな軟骨修復を認めた。 図１１は、３次元人工組織（ＴＥＣ）／人工骨複合体の移植１ヶ月後の様子を示す（実施例５）。左は、表層部から２．０ｍｍのもの、真ん中は表層部から３．０ｍｍのもの、右は表祖部から４ｍｍのものを示す。上段は、上段はヘマトキシリン・エオジン染色で軟骨下骨部分の修復を示し、下段はトルイジンブルー染色で軟骨部分の修復を示す。示されるように、複合体の移植深度によって再生は異なる浅いと軟骨下骨の修復が早いが軟骨修復が乏しい。深いと軟骨修復は良好であるが軟骨下骨の修復が遷延する。
以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞等の修飾辞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
(用語の定義）
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。
（再生医療）
本明細書において使用される「再生」（regeneration）とは，個体の組織の一部が失われた際に残った組織が増殖して復元される現象をいう。動物種間または同一個体における組織種に応じて、再生のその程度および様式は変動する。ヒト組織の多くはその再生能が限られており、大きく失われると完全再生は望めない。大きな傷害では、失われた組織とは異なる増殖力の強い組織が増殖し，不完全に組織が再生され機能が回復できない状態で終わる不完全再生が起こり得る。この場合には，生体内吸収性材料からなる構造物を用いて、組織欠損部への増殖力の強い組織の侵入を阻止することで本来の組織が増殖できる空間を確保し，さらに細胞増殖因子を補充することで本来の組織の再生能力を高める再生医療が行われている。この例として、軟骨、骨、心臓および末梢神経の再生医療がある。軟骨、神経細胞および心筋は再生能力がないかまたは著しく低いとこれまでは考えられてきた。これらの組織へ分化し得る能力および自己増殖能を併せ持った組織幹細胞（体性幹細胞）の存在が報告され、一部は実用化されつつあり、組織幹細胞を用いる再生医療への期待が高まっている。胚性幹細胞（ＥＳ細胞）はすべての組織に分化する能力をもった細胞である。誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞は、胚または胎児を介しないで生産することができる幹細胞であって、すべての組織に分化する能力をもった細胞である。体性幹細胞は、ＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞等の全能性の細胞から作製することもできる（文献として、de Peppo et al.,TISSUE ENGINEERING:Part A,2010;16;3413-3426;Toh et al.,Stem Cell Rev.and Rep.,2011;7:544-559;Varga et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.,2011;doi:10.1016/j.bbrc.2011.09.089;Barbet et al.,Stem Cells International,2011,doi:10.4061/2011/368192;Sanchez et al.,STEM CELLS,2011;29:251-262;Simpson et al.,Biotechnol.Bioeng.,2011;doi:10.1002/bit.23301;Jung et al.,STEM CELLS,2011;doi:10.1002/stem.727を参照のこと）。
本明細書において使用される「細胞」は、当該分野において用いられる最も広義の意味と同様に定義され、多細胞生物の組織の構成単位であって、外界を隔離する膜構造に包まれ、内部に自己再生能を備え、遺伝情報およびその発現機構を有する生命体をいう。本発明の方法においては、どのような細胞でも対象とされ得る。本発明で使用される「細胞」の数は、光学顕微鏡を通じて計数することができる。光学顕微鏡を通じて計数する場合は、核の数を数えることにより計数を行う。例えば、当該組織を組織切片スライスとし、ヘマトキシリン−エオシン（ＨＥ）染色を行うことにより細胞外マトリクス（例えば、エラスチンまたはコラーゲン）および細胞に由来する核を色素によって染め分ける。この組織切片を光学顕微鏡にて検鏡し、特定の面積（例えば、２００μｍ×２００μｍ）あたりの核の数を細胞数と見積って計数することができる。本明細書において使用される細胞は、天然に存在する細胞であっても、人工的に改変された細胞（例えば、融合細胞、遺伝子改変細胞）であってもよい。細胞の供給源としては、例えば、単一の細胞培養物であり得、あるいは、正常に成長したトランスジェニック動物の胚、血液、または体組織、または正常に成長した細胞株由来の細胞のような細胞混合物が挙げられるがそれらに限定されない。細胞としては、例えば、初代培養の細胞が用いられ得るが、継代培養した細胞もまた使用され得る。本明細書において、細胞密度は、単位面積（例えば、ｃｍ２）あたりの細胞数で表すことができる。
本明細書において「幹細胞」とは、自己複製能を有し、多分化能（「ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ」）を有する（すなわち多能性（の））細胞をいう。幹細胞は通常、組織が傷害を受けたときにその組織を再生することができる。本明細書では幹細胞は、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞または組織幹細胞（組織性幹細胞、組織特異的幹細胞または体性幹細胞ともいう）であり得るがそれらに限定されない。また、上述の能力を有している限り、人工的に作製した細胞もまた、幹細胞であり得る。ＥＳ細胞とは初期胚に由来する多能性幹細胞または全能性幹細胞をいう。ＥＳ細胞は、１９８１年に初めて樹立され、１９８９年以降ノックアウトマウス作製にも応用されている。１９９８年にはヒトＥＳ細胞が樹立されており、再生医学にも利用されつつある。組織幹細胞は、ＥＳ細胞とは異なり、分化の方向が限定されている細胞であり、組織中の特定の位置に存在し、未分化な細胞内構造をしている。従って、組織幹細胞は多能性のレベルが低い。組織幹細胞は、核／細胞質比が高く、細胞内小器官が乏しい。組織幹細胞は、概して、多分化能を有し、細胞周期が遅く、個体の一生以上に増殖能を維持する。本明細書において使用される場合は、幹細胞は好ましくはＥＳ細胞であり得るが、状況に応じて組織幹細胞も使用され得る。ｉＰＳ細胞もまた、最近注目されている。皮膚細胞等からいわゆる山中因子等を用いて（初期化）誘導することにより作製することができる。ｉＰＳ細胞から、間葉様系幹細胞とも称される間葉系幹細胞への誘導は、Ｊｕｎｇ ｅｔ ａｌ，ＳＴＥＭ ＣＥＬＬＳ，２０１１；ｄｏｉ：１０．１００２／ｓｔｅｍ．７２７を参照して実施することができる。また、ＥＳ細胞から、間葉様系幹細胞とも称される間葉系幹細胞への誘導は、例えば、de Peppo et al.,TISSUE ENGINEERING:Part A,2010;16;3413-3426;Toh et al.,Stem Cell Rev.and Rep.,2011;7:544-559;Varga et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.,2011;doi:10.1016/j.bbrc.2011.09.089;Barbet et al.,Stem Cells International,2011,doi:10.4061/2011/368192;Sanchez et al.,STEM CELLS,2011;29:251-262;Simpson et al.,Biotechnol.Bioeng.,2011;doi:10.1002/bit.23301を参照することができる。
歴史的には、由来する部位により分類すると、組織幹細胞は、例えば、皮膚系、消化器系、骨髄系、神経系などに分けられる。皮膚系の組織幹細胞としては、表皮幹細胞、毛嚢幹細胞などが挙げられる。消化器系の組織幹細胞としては、膵（共通）幹細胞、肝幹細胞などが挙げられる。骨髄系の組織幹細胞としては、造血幹細胞、間葉系幹細胞（例えば、脂肪由来、骨髄由来）などが挙げられる。神経系の組織幹細胞としては、神経幹細胞、網膜幹細胞などが挙げられる。これらの組織幹細胞はＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞等から分化させることによって生産することができるようになったことから、このような由来による分類は、最近では、その幹細胞が持つ分化能を指標に再定義されており、本明細書では、それぞれが持つ分化能を指標に、由来がＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞等であっても、特定の組織幹細胞（例えば、間葉系幹細胞）と同様の分化能を有するのであれば、本発明の目的と達成することができることから、同じものと理解されるべきである。
本明細書において「体細胞」とは、卵子、精子などの生殖細胞以外の細胞であり、そのＤＮＡを次世代に直接引き渡さない全ての細胞をいう。体細胞は通常、多能性が限定されているかまたは消失している。本明細書において使用される体細胞は、天然に存在するものであってもよく、遺伝子改変されたものであってもよい。
細胞は、由来により、外胚葉、中胚葉および内胚葉に由来する幹細胞に分類され得る。外胚葉由来の細胞は、主に脳に存在し、神経幹細胞などが含まれる。中胚葉由来の細胞は、主に骨髄に存在し、血管幹細胞、造血幹細胞および間葉系幹細胞などが含まれる。内胚葉由来の細胞は主に臓器に存在し、肝幹細胞、膵幹細胞などが含まれる。本明細書では、体細胞はどのような間葉由来でもよい。好ましくは、体細胞は、間葉系の細胞が使用され得、より好ましくは間葉系幹細胞を含む細胞が用いられる。このような間葉系幹細胞は、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞等のより未分化な幹細胞から作製することもできる。したがって、本明細書で用いられる場合、「間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ；ＭＳＣ）」は、間葉系に属する細胞への分化能をもつ体性幹細胞をいい、その分化能には、骨、軟骨、血管、心筋等の間葉系の組織への分化が含まれ、これらの組織の再構築などの再生医療に応用されうる。代表的には、間葉に由来する体性幹細胞（例えば、骨髄間質細胞に含まれる骨髄間葉系幹細胞、滑膜細胞に含まれる間葉系幹細胞）が含まれるがこれに限定されない。
本明細書において「間葉系幹細胞」とは、間葉に見出される幹細胞をいう。ここで、間葉とは、多細胞動物の発生各期に認められる、上皮組織間の間隙をうめる星状または不規則な突起をもつ遊離細胞の集団と，それに伴う細胞間質によって形成される組織をいう。間葉系幹細胞は、増殖能と、骨細胞、軟骨細胞、筋肉細胞、ストローマ細胞、腱細胞、脂肪細胞への分化能を有する。間葉系幹細胞は、患者から採取した骨髄細胞等を培養または増殖、軟骨細胞あるいは骨芽細胞に分化させるために使用され、または歯槽骨、関節症等の骨、軟骨、関節などの再建材料として使用されており、その需要は大きい。従って、本発明の間葉系幹細胞または分化した間葉系幹細胞を含む複合組織は、これらの用途において構造体が必要である場合に特に有用である。
本発明の複合組織を構成する三次元構造体に含まれる細胞としては、例えば、上述の外胚葉、中胚葉および内胚葉に由来する分化細胞または幹細胞が使用され得る。このような細胞としては、例えば、間葉系の細胞が挙げられる。ある実施形態では、このような細胞として、筋芽細胞（例えば、骨格筋芽細胞など）、線維芽細胞、滑膜細胞などが使用され得る。このような細胞としては、幹細胞および分化細胞を含む、分離した細胞をそのまま利用したり、分化細胞をそのまま利用したり、幹細胞をそのまま利用することもできるが、幹細胞から所望される方向に分化させた細胞を使用することができる。
本明細書において「単離された」とは、通常の環境において天然に付随する物質が少なくとも低減されていること、好ましくは実質的に含まないことをいう。従って、単離された細胞、組織などとは、天然の環境において付随する他の物質（たとえば、他の細胞、タンパク質、核酸など）を実質的に含まない細胞をいう。組織についていう場合、単離された組織とは、その組織以外の物質（例えば、人工組織または複合体の場合は、その人工組織を作製するに際して使用された物質、スキャフォールド、シート、コーティングなど）が実質的に含まれていない状態の組織をいう。本明細書において、単離されたとは、好ましくは、スキャフォールドが含まれていないこと（すなわち、スキャフォールドフリー）をいう。従って、単離された状態では、培地など本発明の人工組織または複合体を生産する際に使用される成分は入っていてもよいことが理解される。核酸またはポリペプチドについていう場合、「単離された」とは、たとえば、組換えＤＮＡ技術により作製された場合には細胞物質または培養培地を実質的に含まず、化学合成された場合には前駆体化学物質またはその他の化学物質を実質的に含まない、核酸またはポリペプチドを指す。単離された核酸は、好ましくは、その核酸が由来する生物において天然に該核酸に隣接している（ｆｌａｎｋｉｎｇ）配列（即ち、該核酸の５’末端および３’末端に位置する配列）を含まない。
本明細書において「スキャフォールドフリー（スキャフォールドフリー、基盤材料なし；ｓｃａｆｆｏｌｄ−ｆｒｅｅ）」とは、人工組織を生産するときに従来使用されている材料（基盤材料＝スキャフォールド）を実質的に含まないことをいう。そのようなスキャフォールドの材料としては、例えば、化学高分子化合物、セラミック、あるいは多糖類、コラーゲン、ゼラチン、ヒアルロン酸などの生物製剤などを挙げることができるがそれらに限定されない。スキャフォールドとは、実質的に固形であり、細胞または組織を支持することができる強度を含む材料をいう。
本明細書において、「樹立された」または「確立された」細胞とは、特定の性質（例えば、多分化能）を維持し、かつ、細胞が培養条件下で安定に増殖し続けるようになった状態をいう。したがって、樹立された幹細胞は、多分化能を維持する。
本明細書において、「非胚性」とは、初期胚に直接由来しないことをいう。従って、初期胚以外の身体部分に由来する細胞がこれに該当するが、胚性幹細胞に改変（例えば、遺伝的改変、融合など）を加えて得られる細胞もまた、非胚性細胞の範囲内にある。
本明細書において「分化（した）細胞」とは、機能および形態が特殊化した細胞（例えば、筋細胞、神経細胞など）をいい、幹細胞とは異なり、多能性はないか、またはほとんどない。分化した細胞としては、例えば、表皮細胞、膵実質細胞、膵管細胞、肝細胞、血液細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、骨芽細胞、骨格筋芽細胞、神経細胞、血管内皮細胞、色素細胞、平滑筋細胞、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞などが挙げられる。
本明細書において「組織」（ｔｉｓｓｕｅ）とは、細胞生物において、同一の機能・形態をもつ細胞集団をいう。多細胞生物では、通常それを構成する細胞が分化し、機能が専能化し、分業化がおこる。従って細胞の単なる集合体であり得ず，ある機能と構造を備えた有機的細胞集団，社会的細胞集団としての組織が構成されることになる。組織としては、外皮組織、結合組織、筋組織、神経組織などが挙げられるがそれらに限定されない。本発明の組織は、生物のどの臓器または器官由来の組織でもよい。本発明の好ましい実施形態では、本発明が対象とする組織としては、骨、軟骨、腱、靭帯、半月、椎間板、骨膜、硬膜などの組織が挙げられるがそれらに限定されない。
本明細書において「細胞シート」とは、単層の細胞から構成される構造体をいう。このような細胞シートは、少なくとも二次元の方向に生物学的結合を有する。生物学的結合を有するシートは、製造された後、単独で扱われる場合でも、細胞相互の結合が実質的に破壊されないことが特徴である。そのような生物学的結合には、細胞外マトリクスを介した細胞間の結合が含まれる。このような細胞シートは、部分的に２、３層構造を含むものであってもよい。
本明細書において「人工組織」とは、天然の状態とは異なる組織をいう。本明細書において、代表的には、人工組織は、細胞培養によって調製される。生物の中に存在する形態の組織をそのまま取り出してきたものは本明細書では人工組織とはいわない。従って、人工組織は、生体に由来する物質および生体に由来しない物質を含み得る。本発明の人工組織は、通常細胞および／または生体物質で構成されるが、それ以外の物質を含んでいてもよい。より好ましくは、本発明の人工組織は、実質的に細胞および／または生体物質のみで構成される。このような生体物質は、好ましくはその組織を構成する細胞に由来する物質（例えば、細胞外マトリクスなど）であることが好ましい。
本明細書において「移植可能な人工組織」とは、人工組織のうちで、実際の臨床において移植することができ、移植後も少なくとも一定期間移植された部位において組織としての役割を果たすことができる人工組織をいう。移植可能な人工組織は通常、十分な生体適合性、十分な生体定着性などを有する。
移植可能な人工組織において十分な強度は、移植を目的とする部分に依存して変動するが、当業者は適宜、その強度を設定することができる。この強度は、自己支持性に十分な強度があり、移植される環境に応じて設定することができる。そのような強度は、後述の応力、歪み特性を測定したり、クリープ特性インデンテーション試験を行うことによって測定され得る。強度はまた、最大荷重を観察することによって評価され得る。
移植可能な人工組織において十分な大きさは、移植を目的とする部分に依存して変動するが、当業者は適宜、その大きさを設定することができる。この大きさは、移植される環境に応じて設定することができる。
しかし、移植される場合は少なくとも一定の大きさを有することが好ましく、そのような大きさは、通常、面積について少なくとも１ｃｍ２であり、好ましくは少なくとも２ｃｍ２であり、より好ましくは少なくとも３ｃｍ２である。さらに好ましくは少なくとも４ｃｍ２であり、少なくとも５ｃｍ２であり、少なくとも６ｃｍ２であり、少なくとも７ｃｍ２であり、少なくとも８ｃｍ２であり、少なくとも９ｃｍ２であり、少なくとも１０ｃｍ２であり、少なくとも１５ｃｍ２であり、あるいは少なくとも２０ｃｍ２であり得るが、それらに限定されず、面積は、用途に応じて１ｃｍ２以下または２０ｃｍ２以上であり得る。本発明の本質は、どのような大きさ（面積、容積）のものでも作製することができる点にあり、サイズに限定されないことが理解される。
容積で表す場合は、上記大きさは、少なくとも２ｍｍ３であり得、少なくとも４０ｍｍ３であり得るがそれに限定されず、２ｍｍ３以下であっても、４０ｍｍ３以上であってもよいことが理解される。
移植可能な人工組織において十分な厚みは、移植を目的とする部分に依存して変動するが、当業者は適宜、その厚みを設定することができる。この厚みは、移植される環境に応じて設定することができる。５ｍｍを超えてもよい。例えば、骨、軟骨、靭帯、腱などに適用される場合、通常、少なくとも約１ｍｍであり得、例えば、少なくとも約２ｍｍ、より好ましくは少なくとも約３ｍｍ、少なくとも約４ｍｍ、さらに好ましくは約５ｍｍおよびそれ以上でも、約１ｍｍ未満であってもよい。本発明の本質は、どのような厚さの組織または複合体でも作製することができる点にあり、サイズに限定されないことが理解される。
移植可能な人工組織において十分な生体適合性は、移植を目的とする部分に依存して変動するが、当業者は適宜、その生体適合性の程度を設定することができる。通常、所望される生体適合性としては、例えば、炎症などを起こさず、免疫反応を起こさずに、周囲組織と生物学的結合を行うことなどが挙げられるが、それらに限定されない。場合によって、例えば、角膜などでは、免疫反応を起こしにくいことから、他の臓器において免疫反応を起こす可能性がある場合でも、本発明の目的では生体適合性を有するとすることができる。生体適合性のパラメータとしては、例えば、細胞外マトリクスの存否、免疫反応の存否、炎症の程度などが挙げられるがそれらに限定されない。そのような生体適合性は、移植後における移植部位での適合性を見ること（例えば、移植された人工組織が破壊されていないことを確認する）によって判定することができる（ヒト移植臓器拒絶反応の病理組織診断基準鑑別診断と生検標本の取り扱い（図譜）腎臓移植、肝臓移植および心臓移植日本移植学会日本病理学会編、金原出版株式会社（１９９８）を参照）。この文献によれば、Ｇｒａｄｅ０、１Ａ、１Ｂ、２、３Ａ、３Ｂ、４に分けられ、Ｇｒａｄｅ０（ｎｏ ａｃｕｔｅ ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ）は、生検標本に急性拒絶反応、心筋細胞障害などを示す所見がない状態である。Ｇｒａｄｅ１Ａ（focal, mild acute rejection）は、局所的、血管周囲または間質に大型リンパ球が浸潤しているが、心筋細胞傷害は無い状態である。この所見は、１つまたは複数の生検標本で認められる。Ｇｒａｄｅ１Ｂ（diffuse, mild acute rejection）は、血管周囲、間質またはその両方に大型リンパ球がよりびまん性に浸潤しているが、心筋細胞傷害は無い状態である。Ｇｒａｄｅ２（focal, moderate acute rejection）は、明瞭に周囲と境界された炎症細胞浸潤巣がただ一箇所で見出されるような状態である。炎症細胞は、大型の活性化されたリンパ球からなり、好酸球をまじえることもある。心筋構築の改変を伴った心筋細胞傷害が病変内に認められる。Ｇｒａｄｅ３Ａ（multifocal, moderate acute rejection）は、大型の活性化したリンパ球からなる炎症細胞浸潤巣が多発性に形成され、好酸球をまじえることもある状態である。これらの多発性の炎症性の炎症細胞浸潤巣の２箇所以上が心筋細胞傷害を伴っている。ときに、心内膜への粗な炎症細胞浸潤を伴っている。この浸潤巣は生検標本のひとつまたは複数の標本で認められる。Ｇｒａｄｅ３Ｂ（multifocal, borderline severe acute rejection）は、３Ａで見られた炎症細胞浸潤巣がより融合性またはびまん性となり、より多くの生検標本で認められる状態である。大型リンパ球および好酸球、ときに好中球を交える炎症細胞浸潤とともに、心筋細胞傷害がある。出血はない。Ｇｒａｄｅ４（severe acute rejection）は、活性化したリンパ球、好酸球、好中球を含む多彩な炎症細胞浸潤がびまん性に認められる。心筋細胞傷害と心筋細胞壊死とは常に存在する。浮腫、出血、血管炎も通常認められる。「Ｑｕｉｌｔｙ」効果とは異なる心内膜への炎症細胞浸潤が通常認められる。かなりの期間、免疫抑制剤で強力に治療されている場合には、細胞浸潤よりも浮腫と出血とが顕著となり得る。
移植可能な人工組織において十分な生体定着性は、移植を目的とする部分に依存して変動するが、当業者は適宜、その生体定着性の程度を設定することができ る。生体適合性のパラメータとしては、例えば、移植された人工組織と移植された部位との生物学的結合性などが挙げられるがそれらに限定されない。そのような生体定着性は、移植後における移植部位での生物学的結合の存在によって判定することができる。本明細書において好ましい生体定着性とは、移植された人工組織が移植された部位と同じ機能を発揮するように配置されていることが挙げられる。
本明細書において「自己支持性」とは、組織（例えば、人工組織）の少なくとも１点が空間上に固定されるときに、その人工組織が実質的に破壊されない特性をいう。本明細書において、自己支持性は、０．５〜３．０ｍｍの太さの先端を有するピンセットで組織（例えば、人工組織）をつまみあげた（好ましくは、１〜２ｍｍの太さの先端を有するピンセット、１ｍｍの太さの先端を有するピンセットで組織をつまむ；ここで、ピンセットは、先曲がりであることが好ましい）ときに、実質的に破壊されないことによって観察される。そのようなピンセットは、市販されており、例えば、夏目製作所などから入手可能である。ここで採用される、つまみ上げる力は、通常、医療従事者が組織をハンドリングする際に掛ける力に匹敵する。従って、自己支持性は、手でつまみあげたときに破壊されないという特長によっても表現することが可能である。そのようなピンセットとしては、例えば、先曲がり先細無鈎ピンセット（例えば、夏目製作所から販売される番号Ａ−１１（先端は１．０ｍｍの太さ）、Ａ−１２−２（先端は０．５ｍｍの太さ）などを挙げることができるがそれらに限定されない。先曲がりのほうが人工組織を摘み上げやすいが、先曲がりであることに限定されない。
例えば、関節における処置を行う場合、置換が主に行われるが、そのような場合に使用される本発明の人工組織は、強度として、上記最低限の自己支持性を有するだけで十分であり、その後は、含まれる細胞が罹患部の細胞に置換され、マトリックスを形成することにより力学的強度を増し、治癒が進む。また、本発明は、人工関節とともに使用され得ることが理解される。
本発明では、自己支持性は、実際に人工組織を作製したときの支持性を評価することも重要である。本発明の人工組織を作製する際、容器中に細胞のシートが作製され、そのシートを容器より剥離する際に従来の技術では、シートが破壊されていた（自己支持性がない）。従って、従来技術では、移植可能な人工組織は実質的に作製できず、特に、大型の人工組織が必要な局面では、従来技術は役に立たなかったといえる。本発明の技術を用いれば、人工組織を作製する際に、剥離の前の単層のシートの状態において、容器から分離する時点ですでに十分耐え得る強度、すなわち、自己支持性を有することから、本発明の人工組織は、実質的に任意の局面に応用可能であることが理解される。ここで、単層とは、部分的に２〜３層構造を有し得る層を含むことをいうことが理解される。また、通常、人工組織の作製および剥離後は、その人工組織の強度および自己支持性は、上昇することが本発明において観察されたことから、本発明においては、自己支持性は、作製時における評価が一つの重要な局面であり得ることが理解される。本発明では、当然、移植局面での強度も重要であることから、作製後ある程度時間が経過した後の自己支持性を評価することも重要であり得る。従って、このような関係式をもとに、当業者は、使用される時期を見越して逆算して、出荷の時の強度、タイミングを設定することができることが理解される。
本明細書において「膜状組織」とは、「平面状組織」ともいい、膜状の組織をいう。膜状組織には、骨膜、心膜、硬膜、角膜などの器官の組織が挙げられる。
本明細書において「臓器」と「器官」（ｏｒｇａｎ）とは、互換的に用いられ、生物個体のある機能が個体内の特定の部分に局在して営まれ，かつその部分が形 態的に独立性をもっている構造体をいう。一般に多細胞生物（例えば、動物、植物）では器官は特定の空間的配置をもついくつかの組織からなり、組織は多数の細胞からなる。そのような臓器または器官としては、皮膚、血管、角膜、腎臓、心臓、肝臓、臍帯、腸、神経、肺、胎盤、膵臓、脳、関節、骨、軟骨、四肢末梢、網膜などが挙げられるがそれらに限定されない。このような臓器または器官はまた、表皮系、膵実質系、膵管系、肝系、血液系、心筋系、骨格筋系、骨芽系、骨格筋芽系、神経系、血管内皮系、色素系、平滑筋系、脂肪系、骨系、軟骨系などの器官または臓器が挙げられるがそれらに限定されない。
１つの実施形態では、本発明が対象とする器官は、椎間板、軟骨、関節、骨、半月、滑膜、靭帯、腱などが挙げられるがそれらに限定されない。別の好ましい実施形態では、本発明が対象とする器官は、骨軟骨などが挙げられるがそれらに限定されない。
本明細書において、ある部分（例えば損傷部位）の周囲に複合組織などを、「巻く」とは、その複合組織などを、その部分を被覆するように（すなわち、損傷などがかくれるように）配置することをいい、その部分を「被覆するように配置」すると交換可能に用いられる。ある部分を被覆するように配置したかどうかは、その部分と配置された人工組織または三次元構造体などとの間の空間的配置を確認することによって判定することができる。好ましい実施形態では、巻く工程によって、ある部位にはその人工組織などが一回転するように巻き付けられることができる。
本明細書において「置換する」とは、病変部（生体の部位）を置換する、病変部にもともとある細胞などが、本発明の人工組織または複合体によって供給される細胞などによって置き換えられることをいう。置換が適切な疾患としては、例えば、断裂している箇所などが挙げられるがそれらに限定されない。置換するとは、別の表現では、「充填」するともいえる。
本明細書において、「人工組織」または「複合組織」とある「部分」とが「生物学的に結合するに十分な時間」は、その部分と人工組織との組み合わせによって変動するが、当業者であれば、その組み合わせに応じて適宜容易に決定することができる。このような時間としては、例えば、術後１週間、２週間、１カ月、２カ月、３カ月、６カ月、１年などが挙げられるがそれらに限定されない。本発明では、人工組織は、好ましくは実質的に細胞およびそれに由来する物質のみを含むことから、特に術後に摘出する物質が必要であるというわけではないので、この十分な時間の下限は特に重要ではない。従って、この場合、長ければ長いほど好ましいといえるが、実質的には極端に長い場合は、実質的に補強が完了したといえる。
本明細書において「免疫反応」とは、移植片と宿主との間の免疫寛容の失調による反応をいい、例えば、超急性拒絶反応（移植後数分以内）（β−Ｇａｌなどの抗体による免疫反応）、急性拒絶反応（移植後約７〜２１日の細胞性免疫による反応）、慢性拒絶反応（３カ月以降の細胞性免疫による拒絶反応）などが挙げられる。
本明細書において免疫反応を惹起するかどうかは、ＨＥ染色などを含む染色、免疫染色、組織切片の検鏡によって、移植組織中への細胞（免疫系）浸潤について、その種、数などの病理組織学的検討を行うことにより判定することができる。
本明細書において「石灰化」とは、生物体で石灰質が沈着することをいう。
本明細書において生体内で「石灰化する」かどうかは、アリザリンレッド染色、カルシウム濃度を測定することによって判定することができ、移植組織を取り出し、酸処理などにより組織切片を溶解させ、その溶液を原子吸光度などの微量元素定量装置により測定し、定量することができる。
本明細書において「生体内」または「インビボ」（ｉｎ ｖｉｖｏ）とは、生体の内部をいう。特定の文脈において、「生体内」は、目的とする組織または器官が配置されるべき位置をいう。
本明細書において「インビトロ」（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）とは、種々の研究目的のために生体の一部分が「生体外に」（例えば、試験管内に）摘出または遊離されている状態をいう。インビボと対照をなす用語である。
本明細書において「エキソビボ」（ｅｘ ｖｉｖｏ）とは、遺伝子導入を行うための標的細胞を被験体より抽出し、インビトロで治療遺伝子を導入した後に、再び同一被験体に戻す場合、一連の動作をエキソビボという。
本明細書において「細胞に由来する物質」とは、細胞を起源とする物質すべてをいい、細胞を構成する物質の他、細胞が分泌する物質。代謝した物質などが含まれるがそれらに限定されない。代表的な細胞に由来する物質としては、細胞外マトリクス、ホルモン、サイトカインなどが挙げられるがそれらに限定されない。細胞に由来する物質は、通常、その細胞およびその細胞の宿主に対して有害な影響をもたらさないことから、そのような物質は三次元人工組織などに含まれていても通常悪影響を有しない。
本明細書において「細胞外マトリクス」（ＥＣＭ）とは「細胞外基質」とも呼ばれ、上皮細胞、非上皮細胞を問わず体細胞（ｓｏｍａｔｉｃ ｃｅｌｌ）の間に存在する物質をいう。細胞外マトリクスは、通常細胞が産生し、従って生体物質の一つである。細胞外マトリクスは、組織の支持だけでなく、すべての体細胞の生存に必要な内部環境の構成に関与する。細胞外マトリクスは一般に、結合組織細胞から産生されるが、一部は上皮細胞や内皮細胞のような基底膜を保有する細胞自身からも分泌される。線維成分とその間を満たす基質とに大別され、線維成分としては膠原線維および弾性線維がある。基質の基本構成成分はグリコサミノグリカン（酸性ムコ多糖）であり、その大部分は非コラーゲン性タンパクと結合してプロテオグリカン（酸性ムコ多糖−タンパク複合体）の高分子を形成する。このほかに、基底膜のラミニン、弾性線維周囲のミクロフィブリル（ｍｉｃｒｏｆｉｂｒｉｌ）、線維、細胞表面のフィブロネクチンなどの糖タンパクも基質に含まれる。特殊に分化した組織でも基本構造は同一で、例えば硝子軟骨では軟骨芽細胞によって特徴的に大量のプロテオグリカンを含む軟骨基質が産生され、骨では骨芽細胞によって石灰沈着が起こる骨基質が産生される。ここで、代表的な細胞外マトリクスとしては、例えば、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩ、コラーゲンＶ、エラスチン、ビトロネクチン、フィブロネクチン、ラミニン、トロンボスポンディン、プロテオグリカン類（例えば、デコリン、バイグリカン、フィブロモジュリン、ルミカン、ヒアルロン酸、アグリカンなど）などを挙げることができるがそれらに限定されず、細胞接着を担う細胞外マトリクスであれば、種々のものが本発明において利用され得る。
本発明の１つの実施形態では、本発明の複合組織に含まれる三次元人工組織などが含む細胞外マトリクス（たとえば、エラスチン、コラーゲン（例えば、Ｉ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型など）、ラミニンなど）は、移植が企図される器官の部位における細胞外マトリクスの組成に類似することが有利であり得る。本発明において、細胞外マトリクスは、細胞接着分子を包含する。本明細書において「細胞接着分子」（Ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）または「接着分子」とは、互換可能に使用され、２つ以上の細胞の互いの接近（細胞接着）または基質と細胞との間の接着を媒介する分子をいう。一般には、細胞と細胞の接着（細胞間接着）に関する分子（ｃｅｌｌ−ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）と，細胞と細胞外マトリックスとの接着（細胞−基質接着）に関与する分子（ｃｅｌｌ−ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）に分けられる。本発明の三次元人工組織は、通常、このような細胞接着分子を含む。従って、本明細書において細胞接着分子は、細胞−基質接着の際の基質側のタンパク質を包含するが、本明細書では、細胞側のタンパク質（例えば、インテグリンなど）も包含され、タンパク質以外の分子であっても、細胞接着を媒介する限り、本明細書における細胞接着分子または細胞接着分子の概念に入る。
本発明において１つの特徴としては、本発明の複合組織に含まれる人工組織が、細胞およびその細胞自体が精製する（自己由来の）細胞外マトリクスを含むことである。従って、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩ、コラーゲンＶ、エラスチン、ビトロネクチン、フィブロネクチン、ラミニン、トロンボスポンディン、プロテオグリカン類（例えば、デコリン、バイグリカン、フィブロモジュリン、ルミカン、ヒアルロン酸、アグリカンなど）などが配合された複雑な組成を有することが特徴である。このような細胞由来成分が配合された人工組織は従来提供されていない。このような配合を有する人工組織は、人工材料を使用した場合は実質的に不可能に近く、このような配合をしていること（特に、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩなど）の配合自体がネイティブな配合であるといえる。
より好ましくは、細胞外マトリクスは、コラーゲン（Ｉ型、ＩＩＩ型など）、ビトロネクチンおよびフィブロネクチンをすべて含む。特に、ビトロネクチンおよび／またはフィブロネクチンが配合された人工組織はこれまで提供されておらず、従って、その点でもすでに、本発明の人工組織または複合体は新規なものであることが理解される。
本明細書において、細胞外マトリクスが「配置される」とは、本発明の人工組織に関して言及するとき、その人工組織中に細胞外マトリクスが存在することをいう。そのような配置は、目的とする細胞外マトリクスを免疫染色などによって染色して、可視化することによって観察することができることが理解される。
本明細書において、細胞外マトリクスが「分散して」「配置される」とは、局在化しないで存在することをいう。そのような細胞外マトリクスの分散は、任意の２つの１ｃｍ２のセクションにおける分布密度を比較したときに、通常約１：１０〜１０：１、代表的には約１：３〜３：１の範囲内の比率に収まる分散をいい、好ましくは、任意の２つの１ｃｍ２のセクションにおける分布密度を比較したときに、約１：２〜２：１の範囲内の比率に収まる分散をいう。より好ましくは、どのセクションにおいてもほぼ同等の比率に収まることが有利であるがそれに限定されない。局所化されず、分散して細胞外マトリクスが表面に存在することによって、本発明の人工組織は、周囲に対して満遍なく生物学的結合能を有し、従って、移植後の経過に優れるという効果を奏する。
細胞間接着に関しては、カドヘリン、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する多くの分子（ＮＣＡＭ、Ｌ１、ＩＣＡＭ、ファシクリンＩＩ、ＩＩＩなど）、セレクチンなどが知られており、それぞれ独特な分子反応により細胞膜を結合させることも知られている。従って、１つの実施形態では、本発明の三次元人工組織などは、このようなカドヘリン、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する分子などの組成もまた、移植が意図される部位と同程度の組成であることが好ましい。
このように多種多様な分子が細胞接着に関与しており、それぞれの機能は異なっていることから、当業者は、目的に応じて、適宜本発明のにおいて使用される三次元人工組織に含まれるべき分子を選択することができる。細胞接着に関する技術は、上述のもののほかの知見も周知であり、例えば、細胞外マトリックス−臨床への応用―メディカルレビュー社に記載されている。
ある分子が細胞接着分子であるかどうかは、生化学的定量（ＳＤＳ−ＰＡＧ法、標識コラーゲン法）、免疫学的定量（酵素抗体法、蛍光抗体法、免疫組織学的検討）、ＰＣＲ法、ハイブリダイゼイション法などのようなアッセイにおいて陽性となることを決定することにより判定することができる。このような細胞接着分子としては、コラーゲン、インテグリン、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、フィブリノゲン、免疫グロブリンスーパーファミリー（例えば、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８、ＩＣＭ１、ＩＣＡＭ２、ＶＣＡＭ１）、セレクチン、カドヘリンなどが挙げられるがそれに限定されない。このような細胞接着分子の多くは、細胞への接着と同時に細胞間相互作用による細胞活性化の補助シグナルを細胞内に伝達する。従って、本発明の組織片において用いられる接着因子としては、そのような細胞活性化の補助シグナルを細胞内に伝達するものが好ましい。細胞活性化により、組織片としてある組織または臓器における損傷部位に適用された後に、そこに集合した細胞および／または組織もしくは臓器にある細胞の増殖を促すことができるからである。そのような補助シグナルを細胞内に伝達することができるかどうかは、生化学的定量（ＳＤＳ−ＰＡＧ法、標識コラーゲン法）、免疫学的定量（酵素抗体法、蛍光抗体法、免疫組織学的検討）、ＰＣＲ法、ハイブリダイゼイション法というアッセイにおいて陽性となることを決定することにより判定することができる。
細胞接着分子としては、例えば、組織固着性の細胞系に広く知られる細胞接着分子としてカドヘリンがあり、カドヘリンは、本発明の好ましい実施形態において使用することができる。一方，非固着性の血液・免疫系の細胞では，細胞接着分子としては、例えば、免疫グロブリンスーパーファミリー分子（ＬＦＡ−３、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ２、ＶＣＡＭ１など）；インテグリンファミリー分子（ＬＦＡ−１、Ｍａｃ−１、ｇｐＩＩｂＩＩＩａ、ｐ１５０、９５、ＶＬＡ１、ＶＬＡ２、ＶＬＡ３、ＶＬＡ４、ＶＬＡ５、ＶＬＡ６など）；セレクチンファミリー分子（Ｌ−セレクチン，Ｅ−セレクチン，Ｐ−セレクチンなど）などが挙げられるがそれらに限定されない。従って、そのような分子は、血液・免疫系の組織または臓器を処置するための特に有用であり得る。
細胞接着分子は、非固着性の細胞が特定の組織で働くためにはその組織への接着が必要となる。その場合，恒常的に発現するセレクチン分子などによる一次接着、それに続いて活性化されるインテグリン分子などの二次接着によって細胞間の接着は段階的に強くなると考えられている。従って、本発明において用いられる細胞接着分子としては、そのような一次接着を媒介する因子、二次接着を媒介する因子、またはその両方が一緒に使用され得る。
本明細書において「アクチン調節物質」とは、細胞内のアクチンに対して直接的または間接的に相互作用して、アクチンの形態または状態を変化させる機能を有する物質をいう。アクチンへの作用に応じて、アクチン脱重合促進因子とアクチン重合促進因子とに分類されることが理解される。そのような物質としては、例えば、アクチン脱重合促進因子として、Ｓｌｉｎｇｓｈｏｔ、コフィリン、ＣＡＰ（シクラーゼ関連タンパク質）、ＡＩＰ１（ａｃｔｉｎ−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ １）、ＡＤＦ（ａｃｔｉｎ ｄｅｐｏｌｙｍｅｒｉｚｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）、デストリン、デパクチン、アクトフォリン、サイトカラシンおよびＮＧＦ（ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）を挙げることができ、例えば、アクチン重合促進因子として、ＲｈｏＡ、ｍＤｉ、プロフィリン、Ｒａｃ１、ＩＲＳｐ５３、ＷＡＶＥ２、ＲＯＣＫ、ＬＩＭキナーゼ、コフィリン、ｃｄｃ４２、Ｎ−ＷＡＳＰ、Ａｒｐ２／３、Ｄｒｆ３、Ｍｅｎａ，ＬＰＡ（ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ ａｃｉｄ）、インスリン、ＰＤＧＦａ、ＰＤＧＦｂ、ケモカインおよびＴＧＦ−βなどを挙げることができるがそれらに限定されないことが理解される。そのようなアクチン調節物質には、以下のようなアッセイによって同定される物質が含まれる。本明細書において、アクチンへの相互作用の評価は、アクチン染色試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ−Ｘ ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ）などによりアクチンを可視化した後、顕鏡し、アクチン凝集や細胞伸展を観察することによってアクチンの凝集、再構成および／または細胞伸展速度の向上という現象が確認されることによって判定される。これらの判定は、定量的または定性的に行われ得る。このようなアクチン調節物質は、人工組織の分離を促進または重層化の促進をさせるために本発明において利用される。本発明において用いられるアクチン調節物質が生体に由来する場合、その由来は何でもよく、例えば、ヒト、マウス、ウシなどの哺乳動物種があげられる。
上記のようなアクチン重合に関与する因子は、例えば、Ｒｈｏ関連でアクチンの重合制御であり、以下が挙げられる（例えば、「細胞骨格・運動がわかる」（編集／三木裕明）羊土社を参照のこと）。
アクチン重合（Takenaka T et al. J.Cell Sci., 114:1801-1809, 2001を参照のこと）
ＲｈｏＡ→ｍＤｉ→プロフィリン⇒アクチン重合
ＲｈｏＡ→ＲＯＣＫ／Ｒｈｏ→ＬＩＭキナーゼ→コフィリンをリン酸化（抑制）⇒アクチン重合
Ｒａｃ１→ＩＲＳｐ５３→ＷＡＶＥ２→プロフィリン、Ａｒｐ２／３⇒アクチン重合
ｃｄｃ４２→Ｎ−ＷＡＳＰ→プロフィリン、Ａｒｐ２／３⇒アクチン重合
ｃｄｃ４２→Ｄｒｆ３→ＩＲＳｐ５３→Ｍｅｎａ⇒アクチン重合
（以上において、→はリン酸化などのシグナル伝達経路を示す。）
本発明では、このような経路に関与する任意の因子を使用することができる。
アクチン脱重合
Ｓｌｉｎｇｓｈｏｔ→コフィリンの脱リン酸化（活性化）⇒アクチン脱重合
コフィリンのＬＩＭキナーゼ活性によるリン酸化とＳｌｉｎｇｓｈｏｔによる脱リン酸化のバランスでアクチンの脱重合を制御している。コフィリンを活性化させる他の因子としては、ＣＡＰ（ｃｙｃｌａｓｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎ）およびＡＩＰＩ（ａｃｔｉｎ−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ１）が同定されており、これらは、任意のものを使用することができることが理解される。
ＬＰＡ（リゾフォスファチジン酸）は、どのような鎖長のものでも使用することができる。
ケモカインとしては、任意のものを使用することができるが、好ましくは、インターロイキン８、ＭＩＰ−１、ＳＤＦ−１などを挙げることができる。
ＴＧＦ−βとしては、任意のものを使用することができるが、好ましくは、ＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β３を使用することができる。ＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β３は、細胞外マトリクス産生促進作用も有することから、本発明においては、留意して使用することができる。
本明細書において「組織強度」とは、組織または器官の機能を示すパラメータをいい、その組織または器官の物理的強度である。組織強度は一般に、引っ張り強さ（例えば、破断強度、剛性率、ヤング率など）を測定することによって判定することができる。そのような一般的な引っ張り試験は周知である。一般的な引っ張り試験によって得られたデータの解析により、破断強度、剛性率、ヤング率などの種々のデータを得ることができ、そのような値もまた、本明細書において組織強度の指標として用いることができる。本明細書では、通常、臨床適用することができる程度の組織強度を有することが必要とされる。
本明細書において、本発明のにおいて使用される三次元人工組織などが有する引っ張り強さは、応力・歪み特性を測定することによって測定することができる。手短に述べると、試料に荷重を加え、例えば、１ｃｈは歪み、２ｃｈは荷重の各々のＡＤ変換器（例えば、ＥＬＫ−５０００）に入力して、応力および歪みの特性を測定することによって引っ張り強さを決定することができる。引っ張り強さはまた、クリープ特性を試験することによっても達成することができる。クリープ特性インデンテーション試験とは、一定の荷重を加えた状態で時間とともにどのように伸びていくかを調べる試験である。微小な素材、薄い素材などのインデンテーション試験は、先端の半径０．１〜１μｍ程度の、例えば、三角錐の圧子を用いて実験を行う。まず、試験片に対して圧子を押し込み、付加を与える。そして、試験片に数十ｎｍから数μｍ程度押し込んだところで、圧子を戻し除荷する。この曲線から得られた負荷荷重と押し込み深さの挙動とによって硬さ、ヤング率などを求めることができる。
本発明の人工組織は、引っ張り強度は弱くてもいい。引っ張り強度は、細胞・細胞外マトリクス比率におけるマトリクス比率を上げる強くなり、細胞比率を上げると弱くなる。本発明は、必要に応じて強度も自由に調整できることが特徴の一つである。移植される組織に対して相対的に近似して強くも弱くもできることが特徴である。従って、そのような任意の場所に応じて目的と設定することができることが理解される。
本明細書において「生理活性物質」（ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）とは、細胞または組織に作用する物質をいう。生理活性物質には、サイトカインおよび増殖因子が含まれる。生理活性物質は、天然に存在するものであっても、合成されたものでもよい。好ましくは、生理活性物質は、細胞が産生するものまたはそれと同様の作用を有するものである。本明細書では、生理活性物質はタンパク質形態または核酸形態あるいは他の形態であり得るが、実際に作用する時点においては、サイトカインは通常はタンパク質形態を意味する。本発明において、生理活性物質は、本発明の人工組織の移植の際に、定着を促進するためなどに使用され得る。
本明細書において使用される「サイトカイン」は、当該分野において用いられる最も広義の意味と同様に定義され、細胞から産生され同じまたは異なる細胞に作用する生理活性物質をいう。サイトカインは、一般にタンパク質またはポリペプチドであり、免疫応答の制禦作用、内分泌系の調節、神経系の調節、抗腫瘍作用、抗ウイルス作用、細胞増殖の調節作用、細胞分化の調節作用などを有する。本明細書では、サイトカインはタンパク質形態または核酸形態あるいは他の形態であり得るが、実際に作用する時点においては、サイトカインは通常はタンパク質形態を意味する。
本明細書において用いられる「増殖因子」または「細胞増殖因子」とは、本明細書では互換的に用いられ、細胞の増殖を促進または制御する物質をいう。増殖因子は、成長因子または発育因子ともいわれる。増殖因子は、細胞培養または組織培養において、培地に添加されて血清高分子物質の作用を代替し得る。多くの増殖因子は、細胞の増殖以外に、分化状態の制御因子としても機能することが判明している。
サイトカインには、代表的には、インターロイキン類、ケモカイン類、コロニー刺激因子のような造血因子、腫瘍壊死因子、インターフェロン類が含まれる。増殖因子としては、代表的には、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦａ、ＰＤＧＦｂ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、肝実質細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）のような増殖活性を有するものが挙げられる。
サイトカインおよび増殖因子などの生理活性物質は一般に、機能重複現象（ｒｅｄｕｎｄａｎｃｙ）があることから、他の名称および機能で知られるサイトカイ ンまたは増殖因子であっても、本発明に使用される生理活性物質の活性を有する限り、本発明において使用され得る。また、サイトカインまたは増殖因子は、本明細書における好ましい活性を有してさえいれば、本発明の治療法または医薬の好ましい実施形態において使用することができる。
従って、１つの実施形態において、本発明は、このようなサイトカインまたは増殖因子（例えば、ＢＭＰ−２など）を、移植部位（例えば、軟骨損傷部位）に本発明の人工組織または三次元構造体と同時に投与することによって、人工組織または三次元構造体の定着および移植部位の機能向上が見られることが明らかにされ、そのような併用療法を提供する。
本明細書において「分化」とは、細胞、組織または器官のような生物の部分の状態の発達過程であって、特徴のある組織または器官を形成する過程をいう。「分化」は、主に発生学（ｅｍｂｒｙｏｌｏｇｙ）、発生生物学（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｂｉｏｌｏｇｙ）などにおいて使用されている。１個の細胞からなる受精卵が分裂を行い成体になるまで、生物は種々の組織および器官を形成する。分裂前または分裂が十分でない場合のような生物の発生初期は、一つ一つの細胞や細胞群が何ら形態的または機能的特徴を示さず区別することが困難である。このような状態を「未分化」であるという。「分化」は、器官のレベルでも生じ、器官を構成する細胞がいろいろの違った特徴的な細胞または細胞群へと発達する。これも器官形成における器官内での分化という。従って、本発明において使用される三次元人工組織は、分化した状態の細胞を含む組織を用いてもよい。
本発明の複合組織において使用される三次元人工組織または複合組織を作製する場合、分化が必要な場合は、組織化を始める前に分化させてもよく、組織化の後に分化させても良い。
本明細書において「分化因子」とは、「分化促進因子」ともいい、分化細胞への分化を促進することが知られている因子（例えば、化学物質、温度など）であれば、どのような因子であってもよい。そのような因子としては、例えば、種々の環境要因を挙げることができ、そのような因子としては、例えば、温度、湿度、ｐＨ、塩濃度、栄養、金属、ガス、有機溶媒、圧力、化学物質（例えば、ステロイド、抗生物質など）などまたはそれらの任意の組み合わせが挙げられるがそれらに限定されない。代表的な分化因子としては、細胞生理活性物質が挙げられるがそれらに限定されない。そのような因子のうち代表的なものとしては、ＤＮＡ脱メチル化剤（５−アザシチジンなど）、ヒストン脱アセチル化剤（トリコスタチンなど）、核内レセプターリガンド（例えば、レチノイン酸（ＡＴＲＡ）、ビタミンＤ３、Ｔ３など）、細胞増殖因子（アクチビン、ＩＧＦ−１、ＦＧＦ，ＰＤＧＦａ、ＰＤＧＦｂ、ＴＧＦ−β、ＢＭＰ２／４など）、サイトカイン（ＬＩＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−６など）、ヘキサメチレンビスアセトアミド、ジメチルアセトアミド、ジブチルｃＡＭＰ、ジメチオルスルホキシド、ヨードデオキシウリジン、ヒドロキシル尿素、シトシンアラビノシド、マイトマイシンＣ、酪酸ナトリウム、アフィディコリン、フルオロデオキシウリジン、ポリブレン、セレンなどが挙げられるがそれらに限定されない。
具体的な分化因子としては、以下が挙げられる。これらの分化因子は、単独でまたは組み合わせて用いられ得る。
１）滑膜細胞：ＦＧＦ、ＴＧＦ−β（特にＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β３）
２）骨芽細胞：ＢＭＰ（特に、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−７）、ＦＧＦ
３）軟骨芽細胞：ＦＧＦ、ＴＧＦ−β（特にＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β３）、ＢＭＰ（特に、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−７）、ＴＮＦ−α、ＩＧＦ
４）脂肪細胞：インスリン、ＩＧＦ、ＬＩＦ
５）筋肉細胞：ＬＩＦ、ＴＮＦ−α、ＦＧＦ。
本明細書において「骨分化」とは、任意の細胞を骨に分化させることをいう。そのような骨分化は、デキサメタゾン、βグリセロホスフェートおよびアスコルビン酸２リン酸の存在下で促進されることが知られる。骨形成因子（ＢＭＰ、（特に、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−７））、を付加してもよい。骨形成が促進されるからである。
本明細書において「軟骨分化」とは、任意の細胞を軟骨に分化させることをいう。そのような軟骨分化は、ピルビン酸、デキサメタゾン、アスコルビン酸２リン 酸、インスリン、トランスフェリンおよび亜セレン酸の存在下で促進されることが知られる。骨形成因子（ＢＭＰ（特に、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−７））、ＴＧＦ−β（特にＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β３）、ＦＧＦ、ＴＮＦ−αなどを付加してもよい。軟骨形成が促進されるからである。
本明細書において「脂肪分化」とは、任意の細胞を脂肪に分化させることをいう。そのような脂肪分化は、インスリン、ＩＧＦ、ＬＩＦおよびアスコルビン酸２リン酸の存在下で促進されることが知られる。
本明細書において「移植片」、「グラフト」および「組織グラフト」は、交換可能に用いられ、身体の特定部位に挿入されるべき同種または異種の組織または細 胞群であって、身体への挿入後その一部となるものをいう。従って、本発明において使用される三次元人工組織は、移植片として用いることができる。移植片としては、例えば、臓器または臓器の一部、硬膜、関節膜、骨片、軟骨片、角膜骨片、歯などが挙げられるがそれらに限定されない。従って、移植片には、ある部分の欠損部に差し込んで欠損を補うために用いられるものすべてが包含される。移植片としては、そのドナー（ｄｏｎｏｒ）の種類によって、自己（自家）移植片（ａｕｔｏｇｒａｆｔ）、同種移植片（同種異系移植片）（ａｌｌｏｇｒａｆｔ）、異種移植片が挙げられるがそれらに限定されない。
本明細書において自己移植片（組織、細胞、臓器など）または自家移植片（組織、細胞、臓器など）とは、ある個体についていうとき、その個体に由来する移植 片（組織、細胞、臓器など）をいう。本明細書において「自己移植片（組織、細胞、臓器など）」というときは、広義には遺伝的に同じ他個体（例えば一卵性双生児）からの移植片（組織、細胞、臓器など）をも含み得る。本明細書では、このような自己との表現は、被験体に由来すると交換可能に使用される。従って、本明細書では、ある被験体に由来しないとの表現は、自己ではない（すなわち、非自己）と同一の意味を有する。
本明細書において「同種移植片（同種異系移植片）（組織、細胞、臓器など）」とは、同種であっても遺伝的には異なる他個体から移植される移植片（組織、細胞、臓器など）をいう。遺伝的に異なることから、同種異系移植片（組織、細胞、臓器など）は、移植された個体（レシピエント）において免疫反応を惹起し得る。そのような移植片（組織、細胞、臓器など）の例としては、親由来の移植片（組織、細胞、臓器など）などが挙げられるがそれらに限定されない。本発明の人工組織は、同種異系移植片でも使用可能であり、良好な治療成績が立証されているという意味で注目されるべきである。
本明細書において「異種移植片（組織、細胞、臓器など）」とは、異種個体から移植される移植片（組織、細胞、臓器など）をいう。従って、例えば、ヒトがレシピエントである場合、ブタからの移植片（組織、細胞、臓器など）は異種移植片（組織、細胞、臓器など）という。
本明細書において「レシピエント」（受容者）とは、移植片（組織、細胞、臓器など）または移植体（組織、細胞、臓器など）を受け取る個体といい、「宿主」とも呼ばれる。これに対し、移植片（組織、細胞、臓器など）または移植体（組織、細胞、臓器など）を提供する個体は、「ドナー」（供与者）という。
本発明の複合組織の作製では、どのような細胞に由来する人工組織でも使用することができる。なぜなら、本発明の方法により形成された複合組織において使用される人工組織（例えば、膜状組織、器官など）は、治療目的に損傷のない程度の組織損傷率を保持しつつ（すなわち、低く保ちながら）、目的の機能を発揮することができるからである。従って、従来そのままの組織または臓器自体を移植物として使用するしかなかった状況にあった。このような状況において、細胞から三次元的に結合した組織を形成することができたことによって、そのような三次元的な人工組織を用いることが可能になり、従来よりも治療成績が顕著の上昇したことは、従来技術では達成することができなかった本発明の格別の効果の一つといえる。
本明細書において「被験体」とは、本発明の処置が適用される生物をいい、「患者」ともいわれる。患者または被験体は好ましくは、ヒトであり得る。
本発明の複合組織に含まれる細胞は、同系由来（自己（自家）由来）でも、同種異系由来（他個体（他家）由来）でも、異種由来でもよい。拒絶反応が考えられることから、自己由来の細胞が好ましいが、拒絶反応が問題でない場合同種異系由来であってもよい。また、拒絶反応を起こすものも必要に応じて拒絶反応を解消する処置を行うことにより利用することができる。拒絶反応を回避する手順は当該分野において公知であり、例えば、新外科学体系、第１２巻、臓器移植（心臓移植・肺移植技術的，倫理的整備から実施に向けて）（改訂第３版）、中山書店に記載されている。そのような方法としては、例えば、免疫抑制剤、ステロイド剤の使用などの方法が挙げられる。拒絶反応を予防する免疫抑制剤は、現在、「シクロスポリン」（サンディミュン／ネオーラル）、「タクロリムス」（プログラフ）、「アザチオプリン」（イムラン）、「ステロイドホルモン」（プレドニン、メチルプレドニン）、「Ｔ細胞抗体」（ＯＫＴ３、ＡＴＧなど）があり、予防的免疫抑制療法として世界の多くの施設で行われている方法は、「シクロスポリン、アザチオプリン、ステロイドホルモン」の３剤併用である。免疫抑制剤は、本発明の医薬と同時期に投与されることが望ましいが、必ずしも必要ではない。従って、免疫抑制効果が達成される限り免疫抑制剤は本発明の再生・治療方法の前または後にも投与され得る。
本発明が対象とする被験体と、複合組織との組合せとしては、例えば、脳外科手術時の硬膜移植、関節損傷または変性、軟骨損傷または変性、骨壊死、半月損傷または変性、椎間板変性、靭帯損傷または変性、骨折、骨欠損を有する患者への関節、軟骨、骨の移植などが挙げられるがそられに限定されない。
本発明が対象とする組織は、生物のどの臓器または器官でもよく、また、本発明が対象とする組織は、どのような種類の動物由来であってもよい。本発明が対象とする生物としては、脊椎動物が挙げられる。好ましくは、本発明が対象とする生物は、哺乳動物（例えば、霊長類、齧歯類など）である。より好ましくは、本発明が対象とする生物は、霊長類である。最も好ましくは、本発明はヒトを対象とする。
本明細書において「可撓性」の人工組織とは、外的環境からの物理的刺激（例えば、圧力）などに対して、抵抗性を有することをいう。可撓性を有する人工組織は、移植される部位が、自律的にまたは他からの影響で運動したり変形したりする場合に好ましい。
本明細書において「伸縮性」を有する人工組織とは、外的環境からの伸縮性の刺激（例えば、拍動）に対して抵抗性を有する性質をいう。伸縮性を有する人工組織は、移植される部位が伸縮性の刺激を伴う場合好ましい。そのような伸縮性の刺激を伴う部位としては、例えば、筋肉、関節、軟骨、腱などが挙げられるがそれらに限定されない。
本明細書中で使用される場合、用語「部分」とは、任意の身体中の部分、組織、細胞、器官を指す。そのような部分、組織、細胞、器官としては、骨格筋芽細胞、線維芽細胞、滑膜細胞、幹細胞によって治療され得る部分が挙げられるが、それらに限定されない。特異的なマーカーであれば、核酸分子（ｍＲＮＡの発現）、タンパク質、細胞外マトリクス、特定の表現型、細胞の形状などどのようなパラメータでも使用することができる。従って、本明細書において具体的に記載されていないマーカーであっても、その部分由来であることを示すことができるマーカーであれば、どのようなマーカーを利用して、本発明の人工組織を判定してもよい。このような部分の代表例としては、例えば、間葉系幹細胞またはそれに由来する細胞を含む部分、組織、器官、筋芽細胞（例えば、骨格筋芽細胞）、線維芽細胞、滑膜細胞などが挙げられるがそれらに限定されない。
軟骨組織などを見る場合、以下のようなマーカーを指標にすることができる。
Ｓｏｘ９とは、（ヒト：アクセッション番号 ＮＭ＿０００３４６）であり、軟骨細胞に特異的なマーカ−である。このマーカーは主にｍＲＮＡの存在を見ることによって確認することができる（Kulyk WM, Franklin JL, Hoffman LM. Sox9 expression during chondrogenesis in micromass cultures of embryonic limb mesenchyme. Exp Cell Res. 2000 Mar15;255(2):327-32.）。
Ｃｏｌ ２Ａ１ とは、（ヒト：アクセッション番号 ＮＭ＿００１８４４）であり、軟骨細胞に特異的なマーカ−である。このマーカーは主にｍＲＮＡの存在を見ることによって確認することができる（Kulyk WM, Franklin JL, Hoffman LM. Sox9 expression during chondrogenesis in micromass cultures of embryonic limb mesenchyme. Exp Cell Res. 2000 Mar15;255(2):327-32.）。
アグリカン（Ａｇｇｒｅｃａｎ）とは、（ヒト：アクセッション番号 ＮＭ＿００１１３５）であり、軟骨細胞に特異的なマーカ−である。このマーカーは主にｍＲＮＡの存在を見ることによって確認することができる（Kulyk WM, Franklin JL, Hoffman LM. Sox9 expression during chondrogenesis in micromass cultures of embryonic limb mesenchyme. Exp CellRes. 2000 Mar 15;255(2):327-32.）。
骨シアロタンパク質（Ｂｏｎｅ ｓｉａｌｏｐｒｏｔｅｉｎ）とは、（ヒト：アクセッション番号ＮＭ＿００４９６７）であり、骨芽細胞に特異的なマーカ−である。このマーカーは主にｍＲＮＡの存在を見ることによって確認することができる（Haase HR, Ivanovski S, Waters MJ, Bartold PM. Growth hormone regulates osteogenic marker mRNA expression in human periodontal fibroblasts and alveolar bone-derived cells. J Periodontal Res. 2003 Aug;38(4):366-74.）。
オステオカルシン（Ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ）とは、（ヒト：アクセッション番号 ＮＭ１９９１７３）であり、骨芽細胞に特異的なマーカ−である。このマーカーは主にｍＲＮＡの存在を見ることによって確認することができる（Haase HR, Ivanovski S, Waters MJ, Bartold PM. Growth hormone regulates osteogenic marker mRNA expression in human periodontal fibroblasts and alveolar bone-derived cells. J Periodontal Res. 2003 Aug;38(4):366-74.）。
ＧＤＦ５とは、（ヒト：アクセッション番号 ＮＭ＿０００５５７）であり、靱帯細胞に特異的なマーカ−である。このマーカーは主にｍＲＮＡの存在を見ることによって確認することができる（Wolfman NM, Hattersley G, Cox K, Celeste AJ, Nelson R, Yamaji N,Dube JL, DiBlasio-Smith E, Nove J, Song JJ, Wozney JM, Rosen V. Ectopic induction of tendon and ligament in rats by growth and differentiation factors5, 6, and 7, members of the TGF-beta gene family. J Clin Invest. 1997 Jul15;100(2):321-30.）。
Ｓｉｘ１とは、（ヒト：アクセッション番号 ＮＭ＿００５９８２）であり、靱帯細胞に特異的なマーカ−である（Dreyer SD, Naruse T, Morello R, Zabel B, Winterpacht A, Johnson RL, Lee B, Oberg KC.Lmx1b expression during joint and tendon formation: localization and evaluation of potential downstream targets. Gene Expr Patterns. 2004 Jul;4(4):397-405.）。このマーカーは主にｍＲＮＡの存在を見ることによって確認することができる。
スクレラキシス（Ｓｃｌｅｒａｘｉｓ）とは、（ヒト：アクセッション番号ＢＫ０００２８０）であり、靱帯細胞に特異的なマーカ−である（BrentAE, Schweitzer R, Tabin CJ. A somitic compartment of tendon progenitors. Cell.2003 Apr 18;113(2):235-48.）。このマーカーは主にｍＲＮＡの存在を見ることによって確認することができる。
ＣＤ５６とは、（ヒト：アクセッション番号Ｕ６３０４１；配列番号７および８）であり、筋芽細胞に特異的なマーカーである。このマーカーは、主にｍＲＮＡの存在を見ることによって確認することができる。
ＭｙｏＤとは、（ヒト：アクセッション番号Ｘ５６６７７；配列番号９および１０）であり、筋芽細胞に特異的なマーカーである。このマーカーは、主にｍＲＮＡの存在を見ることによって確認することができる。
Ｍｙｆ５とは、（ヒト：アクセッション番号ＮＭ＿００５５９３；配列番号１１および１２）であり、筋芽細胞に特異的なマーカーである。このマーカーは、主にｍＲＮＡの存在を見ることによって確認することができる。
ｍｙｏｇｅｎｉｎ（ヒト：アクセッション番号ＢＴ００７２３３；配列番号１３および１４）とは、であり、筋芽細胞に特異的なマーカーである。このマーカーは、主にｍＲＮＡの存在を見ることによって確認することができる。
他の実施形態では、他の組織に特異的な別のマーカーを利用することができる。そのようなマーカーとしては、例えば、胚性幹細胞についてはＯｃｔ−３／４、 ＳＳＥＡ−１、Ｒｅｘ−１、Ｏｔｘ２などが挙げられ；内皮細胞についてはＶＥ−カドヘリン、Ｆｌｋ−１、Ｔｉｅ−１、ＰＥＣＡＭ１、ｖＷＦ、ｃ−ｋｉｔ、 ＣＤ３４、Ｔｈｙ１、Ｓｃａ−１などが挙げられ；骨格筋について上述のもののほか骨格筋αアクチンなどが挙げられ；神経細胞についてＮｅｓｔｉｎ、Ｇｌｕ レセプター、ＮＭＤＡレセプター、ＧＦＡＰ、ニューレグリン−１などが挙げられ；造血細胞系についてｃ−ｋｉｔ、ＣＤ３４、Ｔｈｙ１、Ｓｃａ−１、 ＧＡＴＡ−１、ＧＡＴＡ−２、ＦＯＧなどが挙げられる。
本明細書中で使用される場合、用語「由来する」とは、ある種の細胞が、その細胞が元々存在していた細胞塊、組織、器官などから分離、単離、または抽出されたこと、あるいはその細胞を、幹細胞から誘導されたことを意味する。
本明細書中で使用される場合、用語「三次元人工組織」とは、本発明の複合組織において含まれる人工組織であって、実質的に、細胞および該細胞に由来する細胞外マトリクスから構成されるものをいう。この三次元人工組織は、通常、三次元構造体を構成する。本明細書において「三次元構造体」とは、マトリクスが三次元配向され細胞が三次元に配列しており、細胞間の結合および配向を保持している細胞を含む、三次元方向に広がる物体を指す。該細胞外マトリクスは、フィブロネクチン、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩおよびビトロネクチンを含み、該細胞外マトリクスが該組織中に分散して配置されたものであり、該細胞外マトリクスと該細胞とは、一緒になって三次元構造を形成するように一体化（生物学的に結合または癒合）しており、移植したときに周囲と一体化（生物学的に結合または癒合）する能力を有し、自己支持力を提供するのに十分な強度を有するものである。
本明細書において「人工骨」とは、骨の欠損部分を補う人工的な素材で構成された医療デバイスをいい、通常人体との親和性が高い材料で構成され、好ましくは、実際の骨の成分が使用される。そのような材料としては、代表的には、ヒドロキシアパタイトおよびα−リン酸三カルシウムあるいはβ−リン酸三カルシウムなどのセラミックス、バイオガラス（ケイ素）、カーボン・アルミナ・ジルコニアなどのバイオセラミック、チタンやタングステンなどの金属、サンゴ素材など人体との親和性が高い材料からなる群より選択される材料で構成される。
本明細書において「複合組織」とは、三次元人工組織と、人工骨等の他の人工組織との複合体化した組織をいう。本明細書では、「ハイブリッド移植片」と称することがあるが、これは「複合組織」と同じ意味で使用される。従って、そのような複合組織は、複数の組織（骨軟骨等）治療に用いることが可能である。たとえば、そのような複合組織は、軟骨および骨の両方の治療に使用することが可能である。本発明の複合組織は、好ましくは、移植可能な（三次元）人工組織と、他の人工組織と、生物学的に結合される。このような結合は、２つの組織を接触させて必要に応じて培養することによって作製することができる。このような生物学的結合は、細胞外マトリクスを介する。三次元人工組織は。マトリクスが三次元配向され細胞が三次元に配列しており、細胞間の結合および配向を保持している細胞を含む、三次元方向に広がる物体を指す。
本明細書において「生物学的癒合」または「生物学的結合」（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）とは、生物学的存在（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｅｎｔｉｔｙ）相互の関係に言及する場合、２つの生物学的存在の間に生物学的になんらかの相互作用があることをいう（なお、英文ではｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎおよびｕｎｉｏｎは交換可能に使用されることが理解される。）。骨、軟骨等の身体組織については、生物学的癒合または生物学的結合は、癒合または結合後の状態から「一体化」と称することがあるが、これも本明細書では同じ意味で用いられる。そのような相互作用としては、例えば、生体分子（例えば、細胞外マトリクス）を介した相互作用、情報伝達を介した相互作用、電気的相互作用（電気信号の同期などの電気的結合）が挙げられるがそれらに限定されない。生物学的結合には、人工組織内部の生物学的結合と、ある人工組織が、周囲（たとえば、移植後の周囲組織、周囲細胞など）と有する生物学的結合とがある。相互作用を確認する場合は、その相互作用の特性によって適切なアッセイ方法を用いる。例えば、生体分子を介した物理的相互作用を確認する場合は、三次元人工組織などの強度（例えば、引っ張り試験）を確認する。情報伝達を介した場合は、シグナル伝達がなされるかどうかを、遺伝子発現などを介して確認する。あるいは、電気的な相互作用の場合は、三次元人工組織などにおける電位の状況を測定し、一定の波をもって電位が伝播しているかどうかを見ることによって確認することができる。本発明において、通常生物学的結合は、三次元すべての方向に生物学的結合を有する。好ましくは、三次元すべての方向にほぼ均等に生物学的結合を有することが有利であることがあるが、別の実施形態では、二次元方向にほぼ均等に生物学的結合を有するが、第三の方向にはすこし弱い生物学的結合を有する三次元人工組織なども使用され得る。あるいは、細胞外マトリクスを介した生物学的結合の場合は、細胞外マトリクスを染色してその染色度を観察することもできる。インビボで生物学的結合を観察する方法としては、軟骨を用いた結合実験がある。この実験では、軟骨の表面を切除しコンドロイチナーゼＡＢＣ（ＨｕｎｚｉｋｅｒＥＢｅｔａｌ．，Ｊ Ｂｏｎｅ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇ Ａｍ．１９９６ Ｍａｙ；７８（５）： ７２１−３３）で消化して、目的とする組織をその切除された表面に移植して７日程度培養して、その後の結合を組織学的に観察する。このような軟骨を用いた実験によって、周囲の細胞および／または細胞外マトリクスとの接着能を測定することができることが理解される。
本発明の複合組織などは、医薬品として提供され得るが、あるいは、医療機器、動物薬、医薬部外品、水産薬および化粧品等として、公知の調製法により提供され得る。
従って、本発明が対象とする動物は、臓器または器官を有するものであれば、どの生物（例えば、動物（たとえば、脊椎動物））でもよい。好ましくは、脊椎動物（たとえば、哺乳動物など）であり、より好ましくは、哺乳動物（例えば、単孔類、有袋類、貧歯類、皮翼類、翼手類、食肉類、食虫類、長鼻類、奇蹄類、偶蹄類、管歯類、有鱗類、海牛類、クジラ目、霊長類、齧歯類、ウサギ目など）であり得る。例示的な被験体としては、例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌなどの動物が挙げられるがそれらに限定されない。さらに好ましくは、霊長類（たとえば、チンパンジー、ニホンザル、ヒト）が用いられる。最も好ましくはヒトが対象とされ得る。移植治療において限界があるからである。
本発明が医薬として使用される場合、本発明の医薬は、薬学的に受容可能なキャリアなどをさらに含み得る。本発明の医薬に含まれる薬学的に受容可能なキャリアとしては、当該分野において公知の任意の物質が挙げられる。
そのような適切な処方材料または薬学的に受容可能なキャリアとしては、抗酸化剤、保存剤、着色料、風味料、および希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィ ラー、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクル、希釈剤、賦形剤および／または薬学的アジュバントが挙げられるがそれらに限定されない。
本発明の処置方法において使用される医薬（複合組織、併用される医薬化合物など）の量は、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、組織の形態または種類などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。本発明の処置方法を被験体（または患者）に対して施す頻度もまた、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、および治療経過などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。頻度としては、1回の治療で治癒することも多いことから1回でありうる。もちろん、経過を見ながら2回以上の治療を施すことも考慮されうる。
本明細書中、「投与する」とは、本発明の複合組織などまたはそれを含む医薬を、単独で、または他の治療剤と組み合わせて投与することを意味する。本発明の複合組織は、以下のような治療部位（例えば、骨軟骨欠損など）への導入方法，導入形態および導入量が使用され得る。すなわち、本発明の複合組織の投与方法としては、例えば変形性関節症の障害部位への直接挿入等の方法があげられる。組み合わせは、例えば、混合物として同時に、別々であるが同時にもしくは並行して；または逐次的にかのいずれかで投与され得る。これは、組み合わされた薬剤が、治療混合物としてともに投与される提示を含み、そして組み合わせた薬剤が、別々であるが同時に（例えば、複合組織などが直接手術によって提供され、他の薬剤が静脈注射によって与えられる場合）投与される手順もまた含む。「組み合わせ」投与は、第１に与えられ、続いて第２に与えられる化合物または薬剤のうちの１つを別々に投与することをさらに含む。
本明細書において「補強」とは、意図される生体の部分の機能を改善させることをいう。
本明細書において「指示書」は、複合組織、試薬等の取り扱い、使用方法、調合方法、人工組織の作成方法、収縮方法など、本発明の医薬などを投与する方法または診断する方法などを医師、患者など投与を行う人、診断する人（患者本人であり得る）に対して記載したものである。この指示書は、本発明の診断薬、医薬などを投与する手順を指示する文言が記載されている。この指示書は、本発明が実施される国の監督官庁（例えば、日本であれば厚生労働省、米国であれば食品医薬品局（ＦＤＡ）など）が規定した様式に従って作成され、その監督官庁により承認を受けた旨が明記される。指示書は、いわゆる添付文書（ｐａｃｋａｇｅ ｉｎｓｅｒｔ）であり、通常は紙媒体で提供されるが、それに限定されず、例えば、電子媒体（例えば、インターネットで提供されるホームページ（ウェブサイト）、電子メール）のような形態でも提供され得る。
本明細書において「細胞外マトリクス産生促進因子」とは、細胞の細胞外マトリクスの産生を促進する任意の因子をいう。本発明において、細胞外マトリクス産生促進因子を細胞シートに添加すると、その細胞シートを培養容器からの剥離が促進される環境を提供し、そのようなシートが三次元方向に生物学的結合する。ここで、生物学的結合は、組織中の細胞と細胞外マトリクスとの結合および細胞外マトリクス同士の結合を含む。ここで、自己収縮によりさらに三次元化が促進される。そのような因子としては、代表的には、細胞外マトリクスの分泌を促進するような因子（例えば、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β３など）が挙げられる。本発明において、代表的な細胞外マトリクス産生促進因子としては、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β３、アスコルビン酸、アスコルビン酸２リン酸またはその誘導体あるいはその塩が挙げられる。好ましくは、このような細胞外マトリクス産生促進因子は、適用が意図される部分の細胞外マトリクスの組成成分および／またはその量に類似するように細胞外マトリクスの分泌を促す成分（単数または複数）であることが好ましい。そのような細胞外マトリクス産生促進因子が複数の成分を含む場合は、そのような複数成分は、適用が意図される部分の細胞外マトリクスの組成成分および／またはその量に類似するように組成され得る。
本明細書において「アスコルビン酸またはその誘導体」には、アスコルビン酸およびその類似体（例えば、アスコルビン酸２リン酸など）、およびその塩（例え ば、ナトリウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩など）が含まれる。アスコルビン酸は、Ｌ体であることが好ましいがそれに限定されない。
(発明を実施するための好ましい形態）
以下に本発明の好ましい形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本発明のよりよい理解のために提供されるものであり、本発明の範囲は以下の記載に限定 されるべきでないことが理解される。従って、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本発明の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。
（複合組織）
１つの局面において、本発明は、骨軟骨欠損に関連する疾患、障害または状態を治療または予防するための、三次元人工組織と人工骨とを含む複合組織を提供する。本発明の複合組織は、骨軟骨欠損に関連する疾患、障害または状態を従来の技術では不可能であったレベルで治癒させることに成功した。したがって、本発明は治療成績の飛躍的向上という点で顕著な効果を奏する。
１つの実施形態では、本発明において用いられる三次元人工組織は、通常、実質的に、細胞および該細胞に由来する細胞外マトリクスから構成される。好ましくは、本発明において用いられる三次元人工組織は、実質的に細胞または該細胞に由来する物質から構成される。実質的に細胞および細胞に由来する物質（例えば、細胞外マトリクス）のみから構成されることによって、生体適合性および生体定着性を上げることができる。ここで、「実質的に・・・構成される」とは、細胞とその細胞に由来する物質とを含み、他に有害な影響（ここでは、主に、移植への悪影響）を与えない限り、他の物質を含んでいてもいいと定義され、本明細書においてはそのように理解されるべきである。そのような有害な影響を与えない物質は、当業者に公知であるか、または簡単な試験を行うことによって確認することができる。代表的には、厚生労働省（またはＰＭＤＡ）、ＦＤＡなどにおいて認可されている任意の添加成分、細胞培養に伴う成分などを挙げることができるがそれらに限定されない。ここで、細胞に由来する物質は、代表的に細胞外マトリクスを含む。特に、本発明において用いられる三次元人工組織では、細胞と細胞外マトリクスが適切な割合で含まれていることが好ましい。そのような適切な割合とは、例えば、細胞と細胞外マトリクスとの比が１：３〜２０：１の範囲、細胞と細胞外マトリクスの比率によって組織の強度が調節されるので、細胞移植の用途および移植先での力学環境に応じて細胞と細胞外マトリクスとの比を調節して使用することができる。好ましい比率は、目的とする処置によって変動するが、そのような変動は、当業者には自明であり、目的とする臓器における細胞および細胞外マトリクスの比率を調査することによって、推定することができる。
好ましい実施形態では、本発明において使用される三次元人工組織に含まれるこの細胞外マトリクスは、フィブロネクチン、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩおよびビトロネクチンを含む。好ましくは、このような種々の細胞外マトリクスは、列挙したものすべて含まれていることが好ましい。それらは一体化して混合されていることが有利である。別の好ましい実施形態では該細胞外マトリクスが該組織中に分散して配置されたものである。あるいは、これらは、全体にわたって細胞外マトリクスが散在していることが好ましい。このような分布は移植された場合に環境との適合性および親和性を向上させるという点で格別な効果を奏する。好ましい実施形態において、本発明において用いられる三次元人工組織に分散して配置される細胞外マトリクスは、任意の２つの１ｃｍ２のセクションにおける分布密度を比較したときに、約１：３〜３：１の範囲内の比率に収まることが好ましい。分布密度の測定は、当該分野において公知の任意の手法を用いることができ、例えば、免疫染色などを挙げることができる。好ましい実施形態において、本発明において用いられる三次元人工組織において使用される細胞外マトリクスは、任意の２つの１ｃｍ２のセクションにおける分布密度を比較したときに、約１：２〜２：１、さらに好ましくは約１．５：１〜１．５：１の範囲内の比率に収まる。細胞外マトリクスの配置の分散は、均等に分散されていることが有利である。従って、好ましくは、ほぼ均一に分散されていてもよいが、それに限定されない。本発明において用いられる三次元人工組織では、特に、コラーゲン（Ｉ、ＩＩＩ型）をはじめ、ビトロネクチン、フィブロネクチンなどが含まれていることにより、基質への細胞接着、細胞伸展、および細胞走化性を促進する、細胞間マトリクスの接着も促進されるという特徴を有することで知られている。１つの実施形態において、本発明において用いられる三次元人工組織において配置される細胞外マトリクスは、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩ、ビトロネクチン、フィブロネクチンなどを含み得る。しかし、コラーゲン（Ｉ、ＩＩＩ型）、ビトロネクチン、フィブロネクチンなどが一体化されて含まれているような人工組織はこれまで提供されていなかった。理論に束縛されることを希望しないが、コラーゲン（Ｉ、ＩＩＩ型）、ビトロネクチン、フィブロネクチンなどは、周囲との生物学的結合能を発揮するのに役割を果たしていると考えられる。従って、好ましい実施形態では、本発明において用いられる三次元人工組織においてビトロネクチンが分散して表面に配置されていることが有利である。移植後の接着、定着、安定性が格段に異なると考えられるからである。
フィブロネクチンもまた、本発明において用いられる三次元人工組織において配置されることが好ましい。フィブロネクチンは、細胞接着，細胞の形の制御，細胞移動を調節する役割を有することが知られている。しかし、フィブロネクチンが発現しているような人工組織はこれまで提供されていなかった。理論に束縛されることを希望しないが、フィブロネクチンもまた周囲との生物学的結合能を発揮するのに役割を果たしていると考えられる。従って、好ましい実施形態では、本発明において用いられる三次元人工組織においてフィブロネクチンもまた分散して表面に配置されていることが有利である。移植後の接着、定着、安定性が格段に異なると考えられるからである。
本発明において用いられる三次元人工組織は、コラーゲン（Ｉ、ＩＩＩなど）、ビトロネクチン、フィブロネクチンなど細胞外マトリクスなどの接着因子を豊富に含むために、周囲の組織に生着する。それにより、移植細胞を移植部位に安定して生着させることができる。これまでの細胞移植では、スキャフォールドなしでの細胞移植はもちろんのこと、追加の安定化処置（例えば、パッチの縫い付け、スキャフォールの使用など）を用いた細胞移植においても、細胞の安定した移植先での生着は、従来困難であったが、本発明を用いれば、安定化させることが容易になった。細胞のみの場合は、他の組織による補強、スキャフォールド自身の固定などが必要であったが、本発明の三次元人工組織を含む複合組織を用いれば、そのような必要なしに、三次元人工組織の中に含まれている多分化能を有し得る細胞を別途の固定なしに安定して移植部にとどめさせることができる。
別の好ましい実施形態では、該細胞外マトリクスと該細胞とは、一緒になって三次元構造を形成するように一体化している。別の好ましい実施形態では、移植したときに周囲と一体化する能力を有し、自己支持力を提供するのに十分な強度を有する。好ましくは、使用されうる三次元人工組織は、実質的に、筋芽細胞、間葉系幹細胞、脂肪細胞、滑膜細胞、および骨髄細胞からなる群より選択される細胞および該細胞に由来する細胞外マトリクスから構成され、該細胞外マトリクスは、コラーゲンＩおよび／またはコラーゲンＩＩＩを含み、該コラーゲンＩおよび／またはコラーゲンＩＩＩは、コラーゲンＩＩよりも多く、該細胞外マトリクスが該組織中に分散して配置されたものである。このような三次元人工組織は、移植可能であり、臨床適用することができる組織強度を有するものであり、スキャフォールドフリーであることも特徴の一つである。本発明において間葉系幹細胞が使用される場合、使用されうる間葉系幹細胞は、実際の組織から取得したものでもよく、より未分化の幹細胞、例えば、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞から分化させたものを用いてもよい。
別の実施形態において、本発明において用いられる三次元人工組織は、異種細胞、同種異系細胞、同系細胞または自家細胞を用いることができる。本発明では、同種異系細胞であっても、特に、間葉系細胞を用いた場合、免疫拒絶などの有害な副反応がほとんど生じないことが分かった。従って、本発明は、エキソビボのような治療の他、免疫拒絶抑制剤などを使用せずに、他人の細胞を用いて人工組織を生産して利用するという治療法に途を啓くことになる。
１つの好ましい実施形態において、本発明において用いられる三次元人工組織が含む細胞は、幹細胞であっても分化細胞であっても両方を含んでいてもよい。好ましい実施形態では、本発明において用いられる三次元人工組織が含む細胞は、間葉系細胞である。理論に束縛されないが、間葉系細胞が好ましいのは、間葉系細胞自体が骨など臓器と適合性が優れているからであり、種々の組織または臓器などへ分化する能力を有し得るからである。そのような間葉系細胞は、間葉系幹細胞であっても間葉系の分化細胞であってもよい。間葉系の特徴を有する他の系由来の細胞または未分化（ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞）に由来するものであってもよい。
本発明において使用される間葉系細胞としては、例えば、骨髄、脂肪細胞、滑膜細胞、筋芽細胞、骨格筋細胞、などが挙げられるがそれらに限定されない。本明細書において使用される間葉系幹細胞としては、例えば、脂肪組織由来の幹細胞、骨髄由来の幹細胞、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞から分化させた幹細胞などを用いることができる。
好ましい実施形態において、本発明において用いられる三次元人工組織において使用される細胞は、本発明の複合組織が適用される被験体に由来する細胞であることが有利である。このような場合、本明細書において使用される細胞は自己細胞ともいわれるが、自己細胞を用いることによって、免疫拒絶反応を防ぐかまたは低減することができる。あるいは、別の実施形態では、本発明において用いられる三次元人工組織において使用される細胞は、本発明の複合組織が適用される被験体に由来しない細胞であってもよい。この場合、好ましくは、免疫拒絶反応を防ぐ手段が講じられることが好ましい。
好ましい実施形態において、本発明において用いられる三次元人工組織は、臨床適用することができる組織強度を有する。臨床適用することができる組織強度は、適用が意図される部位に応じて変動する。そのような強度は、当業者が本明細書の開示を参照して、当該分野における周知技術を参酌することによって決定することができる。本発明において用いられる三次元人工組織は、引っ張り強度は弱くてもいい。そのような引っ張り強度は、細胞・細胞外マトリクス比率におけるマトリクス濃度をあげると強くなり、細胞比率を上げると弱くなる。本発明は、必要に応じて強度も自由に調整できることが特徴の一つである。移植される組織に対して相対的に近似して強くも弱くもできることが特徴である。従って、そのような任意の場所に応じて目的と設定することができることが理解される。
別の実施形態において、本発明において用いられる三次元人工組織の強度は、自己支持性を有するに十分であることが好ましい。従来の人工組織は、作製後、自己支持性を有していなかった。従って、本発明の技術以外の人工組織を移動させると、少なくとも一部が損傷していた。しかし、本発明の技術を用いた場合、自己支持性を有する人工組織が提供された。そのような自己支持性は、０．５〜３ｍｍの先端（好ましくは、１〜２ｍｍの太さの先端、さらに好ましくは１ｍｍの太さの先端）を有するピンセットで組織をつまみあげたときに、実質的に破壊されないことが好ましい。ここで、実質的に破壊されないとは、目視によって確認することができるが、上記条件にてつまみ上げた後に、例えば、水漏れ試験を行ったときに、水が漏れないことなどによって確認することができる。あるいは、上述のような自己支持性は、ピンセットではなく、手でつまみあげたときに破壊されないことによっても確認することができる。特定の実施形態において、臨床適用が意図される部分としては、骨、関節、軟骨、半月、腱、靭帯などが挙げられるがそれらに限定されない。本発明の人工組織に含まれる細胞の由来は、臨床適用される用途に影響されないことが特徴である。また、欠損部分が軟骨部分の場合、人工組織が該関節内組織の欠損部に移植された後人工的に固定することなく（例えば、２、３分後）、該人工組織が残存していることによって、接着性を検定することができる。
本発明で用いられる三次元人工組織は、移植可能な人工組織である。これまでも細胞培養によって人工組織を作製することが試みられているが、いずれも、大きさ、強度、培養容器からの剥離のときの物理的損傷などによって移植に適した人工組織とはなっていなかった。本発明は、本明細書において別の箇所において詳述するように細胞外マトリクス産生促進因子の存在下で細胞を培養することによって、大きさ、強度などの点で問題が無く、剥離させるときに特に困難を伴わない組織培養方法を利用する。本発明で用いられる三次元人工組織では、本明細書において別の箇所において詳述するような組織培養法を利用することによって、移植可能な人工組織として提供される。本発明で用いられる三次元人工組織は、細胞と、該細胞に由来する成分とを含む複合体を提供する。ここで、好ましくは、この複合体は、実質的に細胞と該細胞に由来する成分からなることが理解される。ここで、本発明の複合体は、生体の部分を補強、修復または再生するために提供される。本明細書において、「複合体」とは、細胞と、他の成分とが何らかの相互作用によって、複合体化したものを指す。従って、本発明の複合体は、人工組織様の外観を呈することが多く、その意味で、人工組織と指すものが重複することが理解される。なお、この「複合体」はそれ自体が人工組織であり、「複合組織」とは異なることに留意すべきである。「複合体」は本発明の「複合組織」の一成分でありうる。
別の実施形態において、本発明において用いられる三次元人工組織は、単離されていることが好ましい。単離とは、この場合、培養に用いたスキャフォールド、支持体、培養液などから分離されていることを意味し、複合組織に用いられる人工骨以外のものからの分離を意味することに留意すべきである。スキャフォールドなどの物質が実質的に存在しないことによって、本発明において用いられる三次元人工組織は、移植後の免疫拒絶反応、炎症反応などの有害反応を抑えることができる。本発明の複合組織、したがって含まれる三次元人工組織の底面積は、例えば、１ｃｍ２〜２０ｃｍ２であり得るが、それに限定されず、１ｃｍ２以下でもよく、２０ｃｍ２以上でもいい。本発明の本質は、どのような大きさ（面積、容積）のものでも作製することができる点にあり、サイズに限定されないことが理解される。
好ましい実施形態において、本発明において用いられる三次元人工組織は、肉厚である。肉厚とは、通常移植対象の部位を充填するのに十分な強度を有する程度の厚みをいう。そのような厚みは、例えば、少なくとも約５０μｍ以上であり、より好ましくは、少なくとも約１００μｍ以上であり、少なくとも約２００μｍ以上であり、少なくとも約３００μｍ以上であり、さらに好ましくは少なくとも約４００μｍ以上であり、あるいは少なくとも約５００μｍまたは約１ｍｍであることがさらに好ましい。場合によっては、３ｍｍ以上および５ｍｍ以上の厚さのものも作製できることが理解される。あるいは、このような厚さは、１ｍｍ未満であってもよい。本発明の本質は、どのような厚さの組織または複合体でも作製することができる点にあり、サイズに限定されないことが理解される。
本発明で用いられる三次元人工組織では、スキャフォールドフリーの人工組織を提供することによって、移植後の経過に優れた治療法および治療剤が提供される。本発明はまた、本発明で用いられる三次元人工組織においてスキャフォールドフリーの人工組織を利用するという点により、生物製剤における長期にわたる規制の問題の一つである、スキャフォールド自体の混入に起因する問題を一挙に解決する。また、スキャフォールドがないにもかかわらず、治療効果は従来のものに比べても遜色ないどころか、より良好である。このほか、スキャフォールドを用いた場合に、スキャフォールド内の移植細胞の配向性、細胞間接着性の問題、スキャフォールド自体の生体における変化（炎症惹起）およびスキャフォールドのレシピエント組織への生着性などの問題を解決することができる。特に、本発明において、人工骨としては、好ましくは実際の骨の成分が使用され、生物製剤や合成ポリマーを使用しないという点で、すでに骨再生インプラントとして有用性、安全性が証明されている人工骨が証明されている複合組織を用いる場合でも、軟骨再生における人工組織の使用の有用性はそのまま引き継がれるといえ、これも従来の人工組織、複合組織等に比べて有利な点といえる。本発明で用いられる三次元人工組織はまた、自己組織化しており、内部において生物学的結合が行われているという点で、従来の細胞治療を利用した方法とも一線を画すことができる。本発明で用いられる三次元人工組織はまた、三次元形態を容易に形成することができ、所望の形態に容易に設計することができることから、その汎用性に留意されるべきである。また、従来人工物での移植処置が考えられなかった部位の処置が可能になった。本発明の人工組織は、組織内および環境との間で生物学的結合を有しており、実際に移植治療において機能する。本発明の複合組織は、移植後の周囲の組織、細胞などと生物学的に結合する能力を有し（好ましくは細胞外マトリクスによる）、従って、術後の経過に優れる。したがって、本発明の複合組織により、疾患部分を充填し、置換させること、および／または疾患部位を被覆することによって治療効果をもたらす医療処置が可能である。
本発明で用いられる三次元人工組織は、周囲の組織、細胞などの移植後環境との生物学的結合を有することから、術後の定着がよい、細胞が良好に供給されるなどの優れた効果が奏される。本発明の効果としては、このような生物学的結合性の良好さから、他の人工組織などと複合組織を形成することによって複雑な治療を行うことができる点にもある。本発明で用いられる三次元人工組織に伴う別の効果は、三次元人工組織として提供した後、分化誘導をかけることができるという点にある。あるいは、三次元人工組織として提供する前に、分化誘導をかけて、そのような三次元人工組織を形成することができる点にもある。本発明で用いられる三次元人工組織に伴う他の効果は、細胞移植という観点から、従来の細胞のみの移植、シートを用いた移植などと比べて、置換性がよい、被覆することによる総合的な細胞供給などの効果が奏される点にある。本発明で用いられる三次元人工組織により、本発明の複合組織では、生物学的結合能を有し、移植可能な人工組織が提供される。このような組織は、上記特徴および効果を有することによって、従来人工物での移植処置が考えられなかった部位の処置が可能になった。本発明で用いられる三次元人工組織は、組織内および他の組織との間での生物学的結合を有しており、実際に移植治療において機能する。このような人工組織は、従来技術では提供されるものではなく、初めて提供されるものである。本発明で用いられる三次元人工組織は、移植後の周囲の組織、細胞などと生物学的に結合する能力を有し（好ましくは細胞外マトリクスによる）、従って、術後の経過に優れる。このような生物学的結合能を有する人工組織は、本発明で用いる方法以外に存在しておらず、従って、本発明は、この方法以外の方法では人工組織では達成できなかった治療効果を奏することになる。本発明の複合組織により、疾患部分を充填し、置換させること、および／または疾患部位を被覆することによって治療効果をもたらす医療処置が可能である。
好ましい実施形態では、本発明で使用される三次元人工組織は、三次元方向に生物学的に結合されており、人工骨との結合においては接着状態にあり、事実上密着しているといえる。ここで、生物学的結合は、本明細書において他の場所において説明されており、例えば、細胞外マトリクスによる物理的結合、電気的結合などが挙げられるがそれらに限定されない。特に、組織内の細胞外マトリクスが生物学的に結合されていることが重要である。そのような生物学的に結合された状態の人工組織は、本発明が利用する方法以外のほうほうでは提供されていない。さらに、周囲との生物学的結合能を有する好ましい実施形態では、移植後も生体の一部を構成することができる人工組織を含む複合組織を提供するという点で、顕著な効果を奏する人工組織であるといえる。本発明は、一旦凍らせて、細胞を死滅させたような真の意味での細胞が含まれていない人工組織を含む複合組織を提供することができる。このような場合でも、周囲との接着性を有するという点は依然としてユニークである。
本発明で用いられる三次元人工組織は、組織全体にフィブロネクチン、ビトロネクチンなどの細胞外マトリクスまたは細胞接着因子が分布し、一方細胞シート工学では培養細胞のシャーレへの接着面に細胞接着因子は局在している。そして最たる違いは細胞シート工学ではシートの主体は細胞であり、シートは接着因子のノリを底面に付けた細胞の塊といえるが、本発明者らの人工組織は文字通り細胞外マトリックスが細胞を包んだ「組織」であるという点が従来のものとは顕著に異なるといえる。本発明は、人工骨等の他の人工組織の定着の向上を達成する。
１つの実施形態において、本発明において用いられる三次元人工組織は、通常の人工組織とは、細胞を含むという点で異なるということができる。特に、細胞密度が、例えば、最大５×１０６／ｃｍ２までも含めることができるという点でその高密度性が留意されるべきである。組織として移植するというよりは、細胞を移植するのに適しているという点で注目されるべきである。
スキャフォールド（基盤）材料を用いない細胞移植方法としては、非特許文献２７に記載される温度感受性培養皿を利用した細胞シート工学技術が代表的であり、独創的技術として国際的評価を得ている。しかし、この細胞シート技術を使用する場合、単独のシートでは脆弱であることが多く、移植等の外科的操作に耐えうる強度を得るためにはシートを重ね合わせる操作等の工夫が必要であった。さらに、その術後の経過を見ても癒合状態が悪く、完治とはいえない部分があった。本発明の複合組織はこのような問題を解決した。
本発明で用いられる三次元人工組織は細胞シート技術とは異なり、温度感受性培養皿を必要とせず、また細胞・マトリックスを重層化させることが容易であることが特徴である。げっ歯類のストローマ細胞などのいわゆるフィーダー細胞の使用無しに１０層以上に重層した複合体を３週間程度で作成できる技術は他に見当たらない。また、滑膜細胞等の材料細胞のマトリックス産生条件を調節させることにより、特殊な器具を必要とすることなく複合体の把持、移動といった外科的操作が可能となる強度を保持する複合組織の作成も可能であり、本発明の複合組織は、臨機応変のテイラーメイドの治療が可能になったという点でも画期的である。
本発明は、ウサギの外科手術から１ヶ月で回復が見られ（骨および軟骨の形成が見られ）ており、２ヶ月で相当程度の修復が見られていることから、従来の治療法では達成できなかった早期で、かつより完全な治癒が達成できている。すなわち、その特徴的効果としては、「癒合」（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）、および治癒の速さ（２ヶ月でのデータ）が従来よりも優れている。なお、ウサギモデルでは、６ヶ月ほど経つと自然治癒も見られるが、６ヶ月のレベルでも治癒レベルおよび癒合等の治癒の質でも顕著な相違があったことから、従来の治療法では達成できなかった早期で、かつより完全な治癒が達成できているといえる。なお、ウサギで実証されていることから、当該ウサギがヒト等の他の動物についての確立したモデルであり、ヒトについては、骨軟骨欠損治療における確立されたモデルであるウサギでの実証例であるので、「哺乳動物」一般においても同様の効果があると当業者は理解することができる。このような動物モデルについては以下の文献を参考とすることができ、当該分野における技術常識を構成している：
＜動物モデルの慣用技術文献例＞
・F. Berenbaum, The OARSI histopathology initiative - the tasks and limitations, Osteoarthritis and Cartilage 18 (2010) S1
・Trattnig S, Winalski CS, Marlovits S, Jurvelin JS, Welsch GH, Potter HG. Magnetic resonance imaging of cartilage repair: a review. Cartilage. 2011;2:5-26.
・Mithoefer K, Saris DBF, Farr J, Kon E, Zaslav K, Cole B, Ranstam J, Yao J, Shive MS, Brittberg M. Guidelines for the design and conduct of clinical studies in knee articular cartilage repair: International Cartilage Repair Society recommendations based on current scientific evidence and standards of clinical care. Cartilage. 2011;2: 100-121.
・Roos EM, Engelhart L, Ranstam J, Anderson AF, Irrgang JJ, Marx R, Tegner Y, Davis AM. Patient-reported outcome instruments for use in patients with articular cartilage defects. Cartilage. 2011;2:122-136.
・Hurtig M, Buschmann MD, Fortier L, Hoemann CD, Hunziker EB, Jurvelin JS, Mainil-Varlet P, McIlwraith W, Sah RL, Whiteside RA. Preclinical studies for cartilage repair: recommendations from the International Cartilage Repair Society. Cartilage. 2011;2:137-153.
・Hoemann CD, Kandel R, Roberts S, Saris D, Creemers L, Manil-Varlet P, Methot S, Hollander A, Buschmann MD. Recommended guidelines for histological endpoints for cartilage repair studies in animal models and clinical trials. Cartilage. 2011;2:154-173.
・C. Wayne McIlwraith and David D. Frisbie, Microfracture : Basic Science Studies in the Horse, Cartilage 2010 1: 87-95
・F. Berenbaum, The OARSI histopathology initiative - the tasks and limitations Osteoarthritis and Cartilage 18 (2010) S1
・T. Aigner, J.L. Cook, N. Gerwin x, S.S. Glasson k, S. Laverty, C.B. Little, W. McIlwraith, V.B. Kraus, Histopathology atlas of animal model systems e overview of guiding principles Osteoarthritis and Cartilage 18 (2010) S2-S6
・K.P.H. Pritzker, T. Aigner, Terminology of osteoarthritis cartilage and bone histopathology - a proposal for a consensus Osteoarthritis and Cartilage 18 (2010) S7-S9
・R. Poole, S. Blake, M. Buschmann, S. Goldring, S. Laverty S. Lockwood, J. Matyas, J. McDougall, K. Pritzker, K. Rudolphi, W. van den Berg, T. Yaksh, Recommendations for the use of preclinical models in the study and treatment of osteoarthritis, Osteoarthritis and Cartilage 18 (2010) S10-S16
・S.S. Glasson, M.G. Chambers, W.B. Van Den Berg, C.B. Little, The OARSI histopathology initiative e recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the mouse, Osteoarthritis and Cartilage 18 (2010) S17-S23
・N. Gerwin, A.M. Bendele, S. Glasson, C.S. Carlson, The OARSI histopathology initiative - recommendations for histological
assessments of osteoarthritis in the rat, Osteoarthritis and Cartilage 18 (2010) S24-S34
・V.B. Kraus, J.L. Huebner, J. DeGroot, A. Bendele, The OARSI histopathology initiative - recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the guinea pig, Osteoarthritis and Cartilage 18 (2010) S35-S52
・S. Laverty, C.A. Girard, J.M. Williams, E.B. Hunziker, K.P.H. Pritzker, The OARSI histopathology initiative - recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the rabbit, Osteoarthritis and Cartilage 18 (2010) S53-S65
・J.L. Cook, K. Kuroki, D. Visco, J.-P. Pelletier, L. Schulz, F.P.J.G Lafeber, The OARSI histopathology initiative - recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the dog, Osteoarthritis and Cartilage 18 (2010) S66-S79
・C.B. Little, M.M. Smith, M.A. Cake, R.A. Read, M.J. Murphy, F.P. Barry, The OARSI histopathology initiative - recommendations for histological assessments of osteoarthritis in sheep and goats, Osteoarthritis and Cartilage 18 (2010) S80-S92
・C.W. McIlwraith, D.D. Frisbie, C.E. Kawcak, C.J. Fuller, M. Hurtig, A. Cruz, The OARSI histopathology initiative - recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the horse, Osteoarthritis and Cartilage 18 (2010) S93-S105
・P.C Pastoureau, E.B Hunziker, J.-P. Pelletier, Cartilage, bone and synovial histomorphometry in animal models of osteoarthritis, Osteoarthritis and Cartilage 18 (2010) S106-S112
・N. Schmitz, S. Laverty, V.B. Kraus, T. Aigner, Basic methods in histopathology of joint tissues, Osteoarthritis and Cartilage 18 (2010) S113-S116
・G.L. Pearce, D.D. Frisbie, Statistical evaluation of biomedical studies, Osteoarthritis and Cartilage 18 (2010) S117-S122。
好ましい実施形態では、本発明で用いられる三次元人工組織は、周囲との生物学的結合能（integration capability）を有する。ここで、周囲とは、代表的には、移植される環境をいい、例えば、組織、細胞などを挙げることができる。周囲の組織、細胞などの生物学的結合能は、例えば、顕微鏡写真、物理的試験、生物学的マーカーの染色などによって確認することができる。従来の人工組織は、移植された環境にある組織などの親和性は少なく、生物学的結合能が発揮できるなどとは想定すらされていなかった。むしろ、従来の人工組織は、生体の持つ再生能力に依拠し、自己細胞などが集積し、再生するまでの橋渡しの役割を果たしており、従って、恒久的な使用は意図されていなかった。従って、本発明の複合組織は、真の意味で移植治療を構成することができると解釈されるべきである。従って、本発明において言及される生物学的結合能は、周囲の細胞および／または細胞外マトリクスとの接着能を含むことが好ましい。そのような接着能は、組織片（例えば、軟骨片）とのインビトロ培養アッセイによって測定することができる。そして、本発明の複合組織を用いることによって、生物学的結合能が十分に発揮され、治療効果も従来達成できなかったレベルで良好な癒合状態を達成したことも実証されている。好ましい実施形態において、本発明の人工組織または複合体は、三次元方向すべてに生物学的結合がある。従来の方法で調製された人工組織は、二次元方向には生物学的結合がある程度見られるものがあったが、三次元方向にあった組織は調製されていない。従って、本発明で用いられる三次元人工組織は、このように三次元方向すべての生物学的結合を有することによって、どのような用途においても実質的に移植可能という性質がもたらされる。本発明において指標となる生物学的結合としては、細胞外マトリクスの相互結合、電気的結合、細胞間情報伝達の存在が挙げられるがそれらに限定されない。細胞外マトリクスの相互作用は細胞間の接着を顕微鏡で適宜染色して観察することができる。電気的結合は、電位を測定することによって観察することができる。
１つの実施形態では、本発明の複合組織において使用されうる人工骨は、ヒドロキシアパタイトおよびβ−リン酸三カルシウムからなる群より選択される材料で構成されうる。
好ましい実施形態では、本発明の複合組織に含まれる人工骨は、骨軟骨欠損における骨部の欠損の深さよりも小さなサイズであることが好ましい。理論に束縛されることを望まないが、このサイズによって欠損部分に軟骨が形成される余地が生じ、骨軟骨の生物学的結合ないし生物学的癒合がスムーズに行われることが見いだされたことから、治療成績の向上にはこのような欠損の深さとの関係でサイズを特定することが好ましくあり得ると考えられる。代表的な例でいうと、ウサギ等の小形動物において骨軟骨欠損が約６ｍｍであった場合は、軟骨部分がおよそ３００μ〜４００μｍ程度であることから、人工骨を４ｍｍほどの深さにし三次元人工組織（ＴＥＣ）を０．５〜２ｍｍ程度にすれば、この条件が満たされることになる。軟骨の厚さは動物によって異なり、ヒトでは、部位に応じて変動し１ｍｍ〜５ｍｍ程度といわれていることから、軟骨部分が約３ｍｍの場合、骨軟骨欠損部の深さ（ｍｍ）から約３ｍｍより深く、例えば、４ｍｍ程度の三次元人工組織（ＴＥＣ）を、欠損部の深さから約４ｍｍ減じた長さを持つ人工骨に加えることによって複合組織を生産することができる。あるいは、別の実施形態としては、軟骨の厚みに拠らず、一定の深さで移植することもできる。１つの実施形態では、前記人工骨は、前記骨軟骨欠損における骨部の欠損の深さよりも約１ｍｍ以上小さいサイズである。別の実施形態では、前記人工骨は、前記骨軟骨欠損における骨部の欠損の深さよりも軟骨の厚みの２倍以下小さいサイズである。さらに別の実施形態では、前記人工骨は、前記骨軟骨欠損における骨部の欠損の深さよりも約１ｍｍ以上小かつ軟骨の厚みの２倍以下小さいサイズである。したがって、たとえば、ヒトではＴＥＣ／人工骨複合体の境界面は移植した際にｎａｔｉｖｅの骨軟骨境界からさらに１〜６ｍｍの深い位置とするのが好ましい。好ましくは、前記人工骨は、前記骨軟骨欠損における骨部の欠損の深さよりも約２ｍｍ〜約４ｍｍ小さいものが有利である。２ｍｍ程度と浅いと軟骨下骨の修復が早いが軟骨修復が乏しい。４ｍｍ程度と深いと軟骨修復は良好であるが軟骨下骨の修復が遷延する。したがって、症例にもよるが、１つの実施形態では、軟骨表層より３ｍｍ程度が好ましいということができる。例えば、軟骨部分はヒトの場合１〜５ｍｍ、代表的には３ｍｍであることから、この代表的な場合、人工骨が骨軟骨境界部からの深さでいうと、最小限としては約１ｍｍ程度が好ましいことから、下限として約１ｍｍ、上限としては軟骨部分の２倍である約６ｍｍの深さを用いることが好ましい。この場合、骨部分の欠損を約１０ｍｍと想定した場合、人工骨の部分は、約９ｍｍ〜約４ｍｍのものを使用することになる。したがって、この実施形態では、動物によって隣接する軟骨の厚みがほぼ一定であることから、対象となる動物に応じて、骨部の深さから複合組織を適切にサイジングすることができる。軟骨の厚みは、例えば、ヒトでは、関節軟骨の厚さは約１ｍｍ位から、最大の膝蓋軟骨で約５ｍｍにもなり、部位によって変動することが知られており、部位に応じて決定することができる。ヒト、ウサギ以外についても当該分野において公知であり、＜動物モデルの慣用技術文献例＞に記載された文献および他の周知文献等を参考にして軟骨厚みを決定することができ、その厚みに応じて本発明の複合組織を構成することができる。
さらに好ましい実施形態では、前記人工骨と前記三次元人工組織との深さの合計は、前記骨軟骨欠損の深さと略同じであることが好ましく、この合計の深さ（長さ）は、誤差が許容され得、例えば、約１ｍｍ程度の誤差がでも略同じとみなすことができるが、骨軟骨欠損の深さより長くない（例えば、人工骨と三次元人工組織との深さの合計が骨軟骨欠損の深さと同じ〜約１ｍｍ短い）ことが好ましい。理論に束縛されることを望まないが、このサイズによって欠損部分に軟骨が形成される余地が生じ、骨軟骨の生物学的結合または生物学的癒合がスムーズに行われることが見いだされたことから、治療成績の向上にはこのような欠損の深さとの関係でサイズを特定することが好ましくあり得ると考えられる。あるいは、より好ましくは、前記人工骨は、前記骨軟骨欠損における骨部の欠損の深さよりも小さなサイズであり、かつ、前記人工骨と前記三次元人工組織との深さの合計は、前記骨軟骨欠損の深さと略同じであることが好ましい。この両方の特徴が組み合わされることによって、双方の利点が活かされるからである。
好ましい実施形態では、本発明の複合組織では三次元人工組織と人工骨とは二相（biphasic）で存在する。すなわち、これらの２つの成分は、好ましい実施形態では本発明の複合組織において、混合されず、実質的に別々の構成要素として存在することが好ましい。したがって、本明細書では、「二相」（biphasic）との用語は、２成分以上の成分が混合されず、実質的に別々の構成要素として存在することをいう。理論に束縛されることを望まないが、これにより、三次元人工組織においては軟骨下骨の形成が促されることが実証されているからである。
１つの実施形態では、前記三次元人工組織と前記人工骨とは互いに接着した状態にある。本発明で用いられる三次元人工組織は、人工骨（たとえば、リン酸カルシウム、ヒドロキシアパタイトベース等のものを含む）等の他の人工組織と接着または密着することができ、複合組織として一体化した形態で提供されうる。このようにして、本発明の複合組織は、移植後の治療成績の向上に役立つ特徴を備えていることが理解される。
本発明の複合組織は、骨軟骨欠損は、骨軟骨を組織内に有する任意の動物において使用されうることが理解される。１つの実施形態では、そのような動物は、哺乳動物が例示される。特に、ヒトを含む霊長類等の骨軟骨欠損は完治が困難であったことから、本発明は、完治またはそれに近い状態を達成するという点において顕著な効果を奏するということができる点が注目されるべきである。
本発明において使用される人工骨は、骨の代替物として知られるものであれば、どのようなものを用いてもよく、例えば、身体の骨と親和性がよい材料、例えば、人工骨としては、ヒドロキシアパタイト、β−リン酸三カルシウム、ケイ素、カーボン、アルミナ、ジルコニアなどのバイオセラミック、チタン、タングステンなどの金属，サンゴ素材等の材料で構成されるものが使用される。そのようなものの代表例としては、多孔質β−リン酸三カルシウム（β−ＴＣＰ）（オリンパス等）、ハイドロキシアパタイト人工骨補填材であるＮＥＯＢＯＮＥ（登録商標）（ＭＭＴ株式会社）、アパセラム、スーパーポア、セルヤード、バイオペックス−Ｒ、ボーンタイト、ボーンフィル（いずれもＨＯＹＡ・ペンタックス）等を挙げることができるがそれに限定されない。
本発明の治療または予防が対象とする疾患、障害または状態は、骨軟骨の障害に関連するもののであればどれでも対象とされうることが理解される。そのような疾患、障害または状態としては、特に、骨軟骨の変性、壊死、損傷などを伴う任意の疾患を挙げることができ、変形性関節症、骨軟骨損傷、骨壊死、骨軟骨損傷、難治性骨折、骨腫瘍およびその類似疾患（骨嚢腫など）、骨軟骨病変、骨壊死、関節リウマチ、軟骨損傷（軟骨全層損傷、軟骨部分損傷、骨軟骨損傷等）、半月損傷、靭帯損傷、靭帯修復（陳旧性、変性断裂、再建手術の際の生物学的補強など）が必要な状態、腱損傷、腱（アキレス腱を含む）修復（陳旧性、変性断裂、再建手術の際の生物学的補強など）が必要な状態、腱（アキレス腱を含む）修復（陳旧性、変性断裂、再建手術の際の生物学的補強など）が必要な状態、軟骨変性、半月変性、椎間板変性、靭帯変性または腱変性、骨折遷延治癒；偽関節；骨格筋修復・再生など、およびこのほか組織に傷害がある任意の疾患を挙げることができ、あるいは、人骨関節などの体内挿入物と骨との癒合不全部等を挙げることができるがそれらに限定されない。
本明細書において「予防」（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓまたはｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）とは、ある疾患または障害について、そのような状態が引き起こされる前に、そのような状態が起こらないようにするか、そのような状態を低減した状態で生じさせるかまたはその状態が起こることを遅延させるように処置することをいう。
本明細書において「治療」とは、ある疾患または障害について、そのような状態になった場合に、そのような疾患または障害の悪化を防止、好ましくは、現状維持、より好ましくは、軽減、さらに好ましくは消長させることをいう。本明細書では「根治的治療」とは、病的過程の根源または原因の根絶を伴う治療をいう。従って、根治的治療がなされる場合は、原則として、その疾患の再発はなくなる。
本明細書において「予後」とは、予後の処置ともいい、ある疾患または障害について、治療後の状態を診断または処置することをいう。
本発明の複合組織は、医薬として提供されていてもよい。あるいは、本発明の複合組織は、医師などが医療現場で調製してもよく、または、医師が細胞を調製した後、その細胞を第三者が培養して三次元人工組織として調製し、さらに人工骨と接着させてから手術に用いてもよい。この場合、細胞の培養は、医師でなくても、細胞培養の当業者であれば実施することができる。従って、当業者であれば、本明細書における開示を読めば、細胞の種類および目的とする移植部位に応じて、培養条件を決定することができる。
別の観点では本発明は、スキャフォールドフリーの三次元人工組織を含む複合組織を提供する。このようなスキャフォールドフリーの人工組織を含む複合組織を提供することによって、移植後の経過に優れた治療法および治療剤が提供される。
別の観点では本発明はまた、スキャフォールドフリーの人工組織を含む複合組織という点により、生物製剤における長期にわたる規制の問題の一つである、スキャフォールド自体の混入に起因する問題を一挙に解決する。また、スキャフォールドがないにもかかわらず、治療効果は従来のものに比べても遜色ないどころか、より良好である。スキャフォールドを用いた場合に、スキャフォールド内の移植細胞の配向性、細胞間接着性の問題、スキャフォールド自体の生体における変化（炎症惹起）およびスキャフォールドのレシピエント組織への生着性などの問題を解決することができる。本発明で使用される三次元人工組織はまた、自己組織化しており、内部において生物学的結合が行われているという点で、従来の細胞治療とも一線を画すことができる。本発明で使用される三次元人工組織はまた、三次元形態を容易に形成することができ、所望の形態に容易に設計することができることから、その汎用性に留意されるべきである。本発明で使用される三次元人工組織は、周囲の組織、細胞などの移植後環境との生物学的結合を有することから、術後の定着がよい、細胞が確実に供給されるなどの優れた効果が奏される。本発明を用いれば、このような生物学的結合性の良好さから、人工骨等の他の人工組織などと複合組織を形成する際に接着性が極めて良好であり、本発明の複合組織を用いれば複雑な治療を行うことも可能である。本発明の複合組織の別の効果は、本発明の複合組織として提供した後、分化誘導をかけることができるという点にある。あるいは、本発明の複合組織として提供する前に、分化誘導をかけて、そのような本発明の複合組織を形成することができる。本発明では、細胞移植という観点から、従来の細胞のみの移植、シートを用いた移植などと比べて、置換性がよい、被覆することによる総合的な細胞供給などの効果が奏される。
本発明において用いられる三次元人工組織は、培養時にディスパーゼ、トリプシン等で代表されるタンパク質分解酵素による損傷を受けていない。この三次元人工組織は、細胞−細胞間、細胞−細胞外マトリクス間、および細胞外マトリクス−細胞外マトリクス間のタンパク質による結合が保持された強度ある細胞塊として回収することができ、三次元構造体としての細胞−細胞外マトリックス複合体としての機能を何ら損なうことなく保有している。トリプシン等の通常のタンパク質分解酵素を使用した場合、細胞−細胞間のおよび細胞−細胞外マトリックス間の結合は殆ど保持されておらず、従って細胞は個々に分かれた状態となって剥離される。その中でタンパク質分解酵素であるディスパーゼに関しては、細胞、基材間の基底膜様タンパク質を殆ど破壊してしまい、得られる人工組織は強度の弱いものである。
本発明の複合組織では、軟骨修復に関する組織学的スコアおよび軟骨下骨に関する組織学的スコア（例えば、「骨層再建に関するＯ’Ｄｒｉｓｃｏｌｌスコア」、「表面」、「マトリクス」、「軟骨下骨の露出」、「軟骨下骨の整列」、「骨の生物学的癒合」（「一体化」ともいう、「欠損領域内への骨の浸入」、「軟骨の鉱化」および「細胞の形態」（細胞の分布、細胞集団の生存率））が従来達成できなかったレベルで達成されている（いずれも、Ｏ’Ｄｒｉｓｃｏｌｌ ＳＷ，Ｋｅｅｌｅｙ ＦＷ，Ｓａｌｔｅｒ ＲＢ．、Ｊ Ｂｏｎｅ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇ Ａｍ １９８８；７０：５９５−６０６；Ｍｒｏｓｅｋ ＥＨ，Ｓｃｈａｇｅｍａｎｎ ＪＣ，Ｃｈｕｎｇ ＨＷ，Ｆｉｔｚｓｉｍｍｏｎｓ ＪＳ，Ｙａｓｚｅｍｓｋｉ ＭＪ，Ｍａｒｄｏｎｅｓ ＲＭ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｏｒｔｈｏｐ Ｒｅｓ ２０１０；２８：１４１−１４８；Ｏｌｉｖｏｓ−Ｍｅｚａ Ａ，Ｆｉｔｚｓｉｍｍｏｎｓ ＪＳ，Ｃａｓｐｅｒ ＭＥ，Ｃｈｅｎ Ｑ，Ａｎ ＫＮ，Ｒｕｅｓｉｎｋ ＴＪ，ｅｔ ａｌ．，Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｃａｒｔｉｌａｇｅ ２０１０；１８：１１８３−１１９１、実施例等を参照）。検討することができる項目は、以下のとおりでありうる。これらの項目について、従来の技術と比べて改善するかどうかを確認することができる。
軟骨層に関するＯ’Ｄｒｉｓｃｏｌｌスコア
細胞形態
マトリックス
組織の染色性
表層の連続性
組織の連続性
修復組織の厚さ
宿主組織との癒合
細胞密度、生存率
軟骨細胞クラスタリングの割合
宿主組織の変成。
骨層再建に関するＯ’Ｄｒｉｓｃｏｌｌスコア：
表面
マトリクス
軟骨下骨の露出
軟骨下骨の整列
骨の生物学的癒合（一体化）
欠損領域内への骨の浸入
軟骨の石灰化（タイドマークの形成）
細胞の形態
細胞の分布
細胞集団の生存率
軟骨下骨の露出。
＜治療用途複合組織の製造方法＞
１つの局面において、本発明は、本発明の複合組織を生産するための方法であって、前記三次元人工組織と前記人工骨とを、該三次元人工組織と該人工骨とが接触する状態に配置する工程を包含する、方法を提供する。本発明の方法では、人工組織は人工骨の上に置くと即座に接着して離れなくなるという点で、従来の複合組織のような面倒な工程が不要であるという点でも有利である。三次元人工組織および人工骨としては、本明細書において（複合組織）および下記（三次元人工組織の生産）、（治療用途複合組織の製造キット）等に記載されている任意の形態を用いることができることが理解される。骨軟骨欠損に関連する疾患、障害または状態および治療または予防についても、（複合組織）に記載されている任意の形態を用いることができることが理解される。
（三次元人工組織の生産）
本発明において用いられる三次元人工組織を製造する場合、本発明の複合組織の使用目的に合わせて培養時間を設定すればよい。培養した三次元人工組織を支持体材料から剥離回収するには、培養された細胞シートまたは三次元人工組織を単独で、若しくは高分子膜に密着させて剥離することができる。なお、三次元人工組織を剥離することは細胞を培養していた培養液において行うことも、その他の等張液において行うことも可能であり、目的に合わせて選択することができる。また、単層の細胞シートを作製する場合は、必要に応じ細胞シートまたは三次元人工組織を密着させる際に使用する高分子膜としては、例えば、親水化処理が施されたポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）、ポリプロピレン、ポリエチレン、セルロースおよびその誘導体、キチン、キトサン、コラーゲン、和紙等の紙類、ウレタン、スパンデックス等のネット状・スリキネット状高分子材料を挙げることができる。ここで、ネット状、ストッキネット状高分子材料であれば本発明の複合組織は自由度が増し、収縮弛緩機能を更に増大させることができる。本発明における三次元構造体の製法は特に限定されるものではないが、例えば、上記した高分子膜に密着した培養細胞シートを利用することで製造することができる。実質的に細胞および該細胞に由来する細胞外マトリクスから構成される人工組織は、他の方法では製造することができず、この点でも、本発明は、顕著な特徴を有する複合組織を提供するといえる。
好ましい実施形態では、本発明において用いられる三次元人工組織において使用される細胞外マトリクスを本発明において用いられる三次元人工組織に配置することは、本発明で利用される具体的な生産方法によって、容易に達成されることが理解されるが、作製方法としてはそれに限定されないことが理解される。
本発明において用いられる三次元人工組織を製造する場合、三次元人工組織を高収率で剥離、回収する目的で、細胞培養支持体を軽くたたいたり、ゆらしたりする方法、さらにはピペットを用いて培地を撹拌する方法等を単独で、あるいは併用して用いてもよい。加えて、必要に応じて三次元人工組織は、培養容器の底面の変形、等張液等で洗浄して剥離回収してもよい。基材から剥離された三次元人工組織は、特定方向に引き伸ばすことで、さらに配向された三次元人工組織となる。その引き伸ばす方法は、何ら制約されるものではないが、テンシロンなどの引っ張り装置を用いる方法、あるいは、単純にピンセットで引っ張る方法等が挙げられる。配向させることで、三次元人工組織自身の動きに方向性を持たせることができ、このことは、例えば、特定の臓器の動きに合わせて、三次元人工組織を重ね合わせることを可能とするため、三次元人工組織を臓器に適用する場合に効率が良い。
本発明において用いられる三次元人工組織を製造する方法は、特許第４５２２９９４号に開示された方法を適宜参酌することができる。以下に詳述するが、本発明においては、下記技術以外の技術も利用可能であり、また、特許第４５２２９９４号に記載された事項は必要に応じてその全体が本明細書において参考として援用されることが理解される。
本発明で使用される（三次元）人工組織は、以下のようにして生産することができる。この生産法は、概して、Ａ）細胞を提供する工程；Ｂ）該細胞を、細胞外マトリクス産生促進因子を含む細胞培養液を収容する、所望の人工組織のサイズを収容するに十分な底面積を有する容器に配置する工程；およびＣ）該容器中の該細胞を、該所望の大きさのサイズを有する人工組織を形成するに十分な時間培養する工程、を包含する。
ここで用いられる細胞は、どのような細胞であってもよい。細胞を提供する方法は、当該分野において周知であり、例えば、組織を摘出してその組織から細胞を分離する方法、あるいは、血液細胞などを含む体液から細胞を分離する方法、あるいは、細胞株を人工培養によって調製する方法などが挙げられるがそれらに限定されない。本明細書において使用される細胞は任意の幹細胞または分化細胞であり得るが、特に、筋芽細胞、間葉系幹細胞、脂肪細胞、滑膜細胞、骨髄細胞などを用いることができる。本明細書において使用される間葉系幹細胞としては、例えば、脂肪組織由来の幹細胞、骨髄由来の幹細胞、ＥＳ細胞から分化させた細胞、ｉＰＳから分化させた細胞等などを用いることができる。
本発明で利用される三次元人工組織の生産法では、細胞外マトリクス産生促進因子を含む細胞培養液が使用される。このような細胞外マトリクス産生促進因子としては、例えば、アスコルビン酸またはその誘導体などが挙げられ、例えば、アスコルビン酸２リン酸、Ｌ−アスコルビン酸などが挙げられるがそれらに限定されない。
本発明で利用される生産法において使用される細胞培養液は、目的とする細胞が増殖する限りどのような培地であってもよいが、例えば、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、Ｆ１２、ＤＭＥ、ＲＰＭＩ１６４０、ＭＣＤＢ１０４、１９９、ＭＣＤＢ１５３、Ｌ１５、ＳｋＢＭ、Ｂａｓａｌ培地などを適宜グルコース、ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）またはヒト血清、抗生物質（ペニシリン、ストレプトマイシンなど）を加えたものが使用され得る。
本発明で利用される生産法においてにおいて使用される容器は、所望の人工組織のサイズを収容するに十分な底面積を有する限り、当該分野において通常使用されるような容器を用いることができ、例えば、シャーレ、フラスコ、型容器など、好ましくは底面積が広い（例えば、１ｃｍ２以上）容器が使用され得る。その容器の材質もまた、どのような材料を利用してもよく、ガラス、プラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリカーボネートなど）、シリコーンなどが用いられ得るがそれらに限定されない。
好ましい実施形態では、本発明で利用される生産法では、さらに、生産された（三次元）人工組織を分離する工程を包含し得る。本明細書において「分離する」とは、本発明の人工組織が容器中で形成された後、その容器からその人工組織を分離することをいう。分離は、例えば、物理的手段（例えば、培地のピペッティングなど）、化学的手段（物質の添加）などによって達成することができる。本発明では、タンパク質分解酵素処理などの積極的に人工組織に対して侵襲を与えずに、人工組織の周囲に物理的手段または化学的手段によって刺激を与えることによって人工組織を分離することができるという点でそうではない方法では達成できなかった簡便さおよびそれによってもたらされる人工組織の傷のなさなどの移植片としての性能の高さという効果を奏することに留意すべきである。
好ましい実施形態では、本発明で利用される生産法は、人工組織化された細胞を分離する工程、をさらに包含する。ここで、より好ましい実施形態では、この分離する工程は、人工組織を収縮させる刺激を加えることができる。物理的な刺激（例えば、ピペッティング）を含む。このような物理的刺激は、作製された人工組織に直接作用しないことが本発明において好ましい特徴である。このように人工組織に直接作用させないことによって、人工組織の損傷を抑えることができるからである。あるいは、分離する工程は、アクチン調節物質の添加のような化学的手段を含む。このようなアクチン調節物質は、アクチン脱重合促進因子およびアクチン重合促進因 子からなる群より選択される化学物質を含む。例えば、アクチン脱重合促進因子は、Ｓｌｉｎｇｓｈｏｔ、コフィリン、ＣＡＰ（シクラーゼ関連タンパク質）、 ＡＩＰ１（ａｃｔｉｎ−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ １）、ＡＤＦ（ａｃｔｉｎ ｄｅｐｏｌｙｍｅｒｉｚｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）、デストリン、デパクチン、アクトフォリン、サイトカラシンおよびＮＧＦ（ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）などを挙げることができる。他方、アクチン重合促進因子は、ＲｈｏＡ、ｍＤｉ、プロフィリン、Ｒａｃ１、ＩＲＳｐ５３、ＷＡＶＥ２、 ＲＯＣＫ、ＬＩＭキナーゼ、コフィリン、ｃｄｃ４２、Ｎ−ＷＡＳＰ、Ａｒｐ２／３、Ｄｒｆ３、Ｍｅｎａ，ＬＰＡ（ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ ａｃｉｄ）、インスリン、ＰＤＧＦａ、ＰＤＧＦｂ、ケモカインおよびＴＧＦ−βなどを挙げることができる。理論に束縛されることを望まないが、これらのアクチン調節物質は、アクト−ミオシン系の細胞骨格の収縮または弛緩を引き起こし、それにより、細胞自体の収縮または伸縮を調節することになり、結果として、容器の底面から、三次元人工組織自体が分離することを促進または遅延する作用になると考えられる。
別の実施形態において、本発明で利用される生産法では、単層培養された細胞から作製されることが特徴の一つである。単層培養するにもかかわらず、結果として、種々の厚みを持つ人工組織を構築することができるようになったということは、従来の例えば、温度応答性シートなどを用いた場合に複数のシートを重ね合わせないと厚い組織が構成できなかったということに対して顕著な効果であるといえる。フィーダー細胞が不要で、十層以上の細胞の重層化が可能な三次元化の方法は、これ以外の方法では実現できない。スキャフォールドを用いない細胞移植方法としては、非特許文献２７による温度感受性培養皿を利用した細胞シート工学技術が代表的であり、独創的技術として国際的評価を得ている。しかし、この細胞シート技術を使用する場合、単独のシートでは脆弱であることが多く、移植等の外科的操作に耐えうる強度を得るためにはシートを重ね合わせる操作等の工夫が必要であった。
本発明の複合組織で使用される三次元人工組織は細胞・マトリックス複合体といえ、細胞シート技術とは異なり、温度感受性培養皿を必要とせず、また細胞・マトリックスを重層化させることが容易であることが特徴である。げっ歯類のストローマ細胞などのいわゆるフィーダー細胞の使用無しに１０層以上に重層した複合体を３週間程度で作成できる技術はこの方法以外には見当たらない。また、滑膜細胞等の材料細胞のマトリックス産生条件を調節させることにより、特殊な器具を必要とすることなく複合体の把持、移動といった外科 的操作が可能となる強度を保持する複合体の作成も可能であり、本法は、細胞移植を確実にかつ安全に行うための独創的で画期的な手法であり得る。
好ましい実施形態では、本発明で利用される生産法に用いられる細胞外マトリクス産生促進因子は、アスコルビン酸２リン酸を含む（Ｈａｔａ Ｒ， Ｓｅｎｏｏ Ｈ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １９８９； １３８（１）：８−１６参照）。本発明では、アスコルビン酸２リン酸を一定量以上加えることによって、細胞外マトリクスの生産が促進され、その結果、得られる三次元人工組織が硬化され、剥離しやすくなる。この後、剥離の刺激を与えることによって自己収縮が行われる。このようなアスコルビン酸を加えて培養した後、組織が硬化し、剥離しやすくなる性質を獲得することは、Ｈａｔａらの報告には記載されていない。理論に束縛されないが、一つの顕著な相違点と して、Ｈａｔａらは、使用した細胞密度が顕著に異なるという点にある。また、Ｈａｔａらは、硬化効果を示唆すらしておらず、このような硬化および収縮効 果、および剥離しやすくなるという効果は、この方法以外にはなく、本発明の複合組織で用いられる人工組織は、従来製造されてきたものとは硬化、収縮、剥離 などの手順を経て生産されている点で、少なくとも全く異なるものであるということができる。培養物を剥がしたときに収縮し、三次元化、重層化などが促進されたということは驚くべき効果である。そのようなことは、この方法以外では報告されていない。
好ましい実施形態では、本発明で利用される生産法において使用されるアスコルビン酸２リン酸は、通常少なくとも約０．０１ｍＭで存在し、好ましくは少なくとも約０．０５ｍＭで存在し、さらに好ましくは少なくとも約０．１ｍＭで存在する。より好ましくは少なくとも約０．２ｍＭの濃度で存在することが好ましい。さらに好ましくは、約０．５ｍＭの濃度、さらにより好ましくは１．０ｍＭの濃度で存在することが好ましい。ここでは、約０．１ｍＭ以上であればどのような濃度でも用いることができるが、好ましくは、約１０ｍＭ以下であることが所望され得る局面も存在し得る。ある好ましい実施形態では、本発明で利用される生産法において使用される細胞外マトリクス産生促進因子は、アスコルビン酸２リン酸またはその塩およびＬ−アスコルビンまたはその塩を含む。
好ましい実施形態では、本発明で利用される生産法では、培養した工程に続き、Ｄ）人工組織を剥離させ自己収縮させる工程、をさらに含む。剥離は、物理的な刺激（例えば、容器の角に棒などで物理的刺激（ずり応力印加、ピペッティング、容器の変形など）を与えるなど）を行うことによって促進することができる。自己収縮は、このような剥離の後、物理的刺激が与えられる場合、自然に起こる。化学的刺激の場合は、自己収縮および剥離が並行して生じる。自己収縮により、特に第三次元方向（シート上の組織に関する場合、二次元方向と鉛直な方向）の生物学的結合が促進される。このようにして製造されることから、本発明の人工組織は、三次元構造体という形態をとるといえる。本発明で利用される生産法では、十分な時間とは、目的とする人工組織の用途によって変動するが、好ましくは少なくとも３日間を意味する（例示的な期間としては、３〜７日間を挙げることができる）。
別の実施形態において、本発明で利用される生産法は、人工組織を分化させる工程、をさらに含み得る。分化させることによって、所望の組織により近い形態を採らせることができるからである。そのような分化としては、例えば、軟骨分化、骨分化を挙げることができるがそれらに限定されない。好ましい実施形態では、骨分化は、デキサメタゾン、βグリセロホスフェートおよびアスコルビン酸２リン酸を含む培地中で行われ得る。より好ましくは、骨形成タンパク質（ＢＭＰ類）を加える。このようなＢＭＰ２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−７は、骨の形成をより促進するからである。
別の実施形態において、本発明で利用される生産法は、人工組織を分化させる工程であって、分化としては、例えば、軟骨分化を行う形態が挙げられる。好ましい実施形態では、軟骨分化は、ピルビン酸、デキサメタゾン、アスコルビン酸２リン酸、インスリン、トランスフェリンおよび亜セレン酸を含む培地中で行われ得る。より好ましくは、骨形成タンパク質（ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−７、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β３）を加える。このようなＢＭＰは、軟骨の形成をより促進するからである。
本発明で利用される生産法において留意されるべき点として、骨および軟骨などの種々の分化細胞への分化能を有する組織を製造できることがある。軟骨組織への分化は、これまで他のスキャフォールドフリーの人工組織では困難であった。ある程度の大きさが必要な場合は、この方法以外の方法では、スキャフォールドと共培養し、三次元化させて、軟骨分化培地を入れることが必要であった。従来では、スキャフォールドフリーで軟骨分化させることは困難であった。本発明においては、人工組織中の軟骨分化も可能である。これは本発明で利用する方法以外の方法では実証されていない結果であって、本発明の特徴的な効果の一つである。組織再生を目指す細胞治療においてスキャフォールドなしに有効かつ安全に、十分な大きさの組織を用いて治療を行う方法は困難であった。本発明は、この意味では、顕著な効果を達成するといえる。特に、軟骨など、従来では不可能であった、分化細胞でも自在に操れるようになったという点でその意義は深い。本発明の方法以外の方法では、例えば、ペレット状に細胞を集めて、その細胞塊を分化させて２ｍｍ３程度のものを作ることはできていたが、このような大きさを超える場合は、スキャフォールドを使用せざるを得ない。
本発明で利用される生産法に含まれる分化工程は、前記細胞の提供の前または後に行われ得る。
本発明で利用される生産法において使用される細胞は、初代培養のものを使用することができるが、それに限定されず、継代した細胞（例えば、３代以上）を用いることもできる。好ましくは、継代した細胞を用いる場合、細胞は、４継代以上の細胞を用いることが好ましく、より好ましくは、５継代以上の細胞を用い、さらに好ましくは、６継代以上の細胞を用いることが有利である。細胞密度の上限が、継代数を一定程度上げるに従って上がっていくことから、より密な人工組織を作製することができると考えられるからであるが、それに限定されず、むしろ、一定範囲の継代数（例えば、３代〜８代）が適切であるようである。
本発明で利用される生産法では、細胞は、好ましくは、５．０×１０４／ｃｍ２以上の細胞密度で提供されるがそれに限定されない。細胞密度を十分上げることによって、より強度の高い人工組織を提供することができるからである。ただし、下限は、これよりも低くあり得ることが理解される。当業者は、本明細書の記載に基づき、そのような下限を規定することができることが理解される。
１つの実施形態において、本発明で利用される生産法において使用され得る細胞としては、例えば、筋芽細胞、滑膜細胞、脂肪細胞、間葉系幹細胞（例えば、脂肪組織または骨髄由来、あるいはＥＳ細胞由来またはｉＰＳ細胞由来）を用いることができるが、それらに限定されない。このような細胞は、例えば、骨、軟骨、腱、靭帯、関節、半月などに適用可能である。
別の局面において、本発明で利用される三次元人工組織の生産では、所望の厚さを有する三次元人工組織を生産するための方法を利用することができる。この方法は、Ａ）細胞を提供する工程；Ｂ）該細胞を、細胞外マトリクス産生促進因子（例えば、アスコルビン酸類、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β３など）を含む細胞培養液を収容する、所望の三次元人工組織のサイズを収容するに十分な底面積を有する容器に配置する工程；Ｃ）該容器中の該細胞を、細胞外マトリクス産生促進因子を含む細胞培養液とともに、該所望の大きさのサイズを有する三次元人工組織を形成するに十分な時間培養して、細胞を三次元人工組織とする工程；およびＤ）物理的刺激または化学的刺激により、該三次元人工組織の厚さを調節して所望の厚さにする工程、を包含する。ここで、細胞の提供、細胞の配置、刺激および人工組織または複合体とする工程は、（複合組織）または本節等の本明細書において詳細に説明されており、任意の実施形態を採ることができることが理解される。
次に、使用される物理的または化学的な刺激としては、例えば、ピペッティング、アクチン調節物質の使用などを挙げることができるがそれらに限定されない。好ましくは、ピペッティングであり得る。ピペッティングは、操作が容易であり、有害物質を使用しないからである。あるいは、使用される化学的刺激としては、アクチン脱重合促進因子およびアクチン重合促進因子などを挙げることができる。そのようなアクチン脱重合促進因子は、ＡＤＦ（ａｃｔｉｎ ｄｅｐｏｌｙｍｅｒｉｚｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）、デストリン、デパクチン、アクトフォリン、サイトカラシンおよびＮＧＦ（ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）などを挙げることができる。あるいは、アクチン重合促進因子としては、ＬＰＡ（ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ ａｃｉｄ）、インスリン、ＰＤＧＦａ、ＰＤＧＦｂ、ケモカインおよびＴＧＦβなどを挙げることができる。そのようなアクチンの重合または脱重合は、アクチンへの作用を見ることによって、観察することができ、任意の物質について、そのような作用を検定することが可能である。本発明の人工組織を生産する際に、所望の厚さを達成するために、そのように検定されて同定された物質を用いてもよいことが理解される。例えば、本発明において、所望の厚さの調整は、アクチン脱重合促進因子とアクチン重合促進因子との比率を調節することによって達成される。
（治療用途複合組織の製造キット）
１つの局面において、本発明は、骨軟骨欠損に関連する疾患、障害または状態を治療または予防するためのキットであって、三次元人工組織と人工骨とを備えるキットを提供する。三次元人工組織および人工骨としては、（複合組織）（三次元人工組織の生産）に記載されている任意の形態を用いることができることが理解される。骨軟骨欠損に関連する疾患、障害または状態および治療または予防についても、（複合組織）に記載されている任意の形態を用いることができることが理解される。
別の局面では、本発明のキットは、三次元人工組織自体の代わりに、細胞から三次元人工組織を生産するための細胞培養組成物を含んでいてもよい。すなわち、本発明は、骨軟骨欠損に関連する疾患、障害または状態を治療または予防するためのキットであって、三次元人工組織の生産のための細胞培養組成物と人工骨とを備えるキット。細胞培養組成物を用いて三次元人工組織を作製し、これに人工骨を接着させることが本発明のキットにより実施することができるからである。この細胞培養組成物は、細胞を維持または増殖させるための成分（例えば、市販される培地など）；および細胞外マトリクス産生促進因子を含む。このような細胞外マトリクス産生促進因子に関する説明は、上述の生産法において詳述した。従って、この細胞外マトリクス産生促進因子は、アスコルビン酸またはその誘導体（例えば、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β３、アスコルビン酸１リン酸またはその塩、アスコルビン酸２リン酸またはその塩、Ｌ−アスコルビン酸またはその塩など）を含む。ここで、本発明の培養組成物において含まれるアスコルビン酸２リン酸またはその塩は、少なくとも０．１ｍＭで存在するか、あるいは濃縮培養組成物の場合は、調製時に少なくとも０．１ｍＭとなるように含まれている。あるいは、アスコルビン酸類は、０．１ｍＭ以上であれば、ほとんど効果は変わらないようである。０．１ｍＭであれば十分であるといえる。ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β３であれば、１ｎｇ／ｍｌ以上、代表的には、１０ｎｇ／ｍｌの量が十分であり得る。本発明は、このような細胞外マトリクス産生促進因子を備える、三次元人工組織生産のための組成物を提供し得る。
本発明で使用される細胞培養組成物に用いられる細胞外マトリクス産生促進因子は、アスコルビン酸２リン酸を含む（Ｈａｔａ Ｒ， Ｓｅｎｏｏ Ｈ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １９８９； １３８（１）：８−１６参照）。本発明では、アスコルビン酸２リン酸を一定量以上加えることによって、細胞外マトリクスの生産が促進され、その結果、得られる人工組織または複合体が硬化され、剥離しやすくなる。この後、剥離の刺激を与えることによって自己収縮が行われる。しかも、このようなアスコルビン酸を加えて培養した後、組織が硬化し、剥離しやすくなる性質を獲得することは、Ｈａｔａらの報告には記載されていない。理論に束縛されないが、一つの顕著な相違点として、Ｈａｔａらは、使用した細胞密度が顕著に異なるという点にある。また、Ｈａｔａらは、硬化効果を示唆すらしておらず、このような硬化および収縮効果、および剥離しやすくなるという効果に関していうと、本発明のキットによって生産される人工組織は、従来製造されてきたものとは硬化、収縮、剥離などの手順を経て生産されている点で、少なくとも全く異なるものであるということができる。
好ましい実施形態では、本発明のキットにおいて使用されるアスコルビン酸２リン酸は、通常少なくとも０．０１ｍＭ約１ｍｍで存在し、好ましくは少なくとも０．０５ｍＭで存在し、さらに好ましくは少なくとも０．１ｍＭで存在する。より好ましくは少なくとも０．２ｍＭの濃度で、さらに好ましくは少なくとも０．５ｍＭの濃度で存在することが好ましい。さらに好ましくは最低限度の濃度は、１．０ｍＭであり得る。
細胞密度については、特に限定されないが、１つの実施形態において、細胞は、１ｃｍ２あたり、５×１０４細胞〜５×１０６細胞で配置される。この条件は、例えば、筋芽細胞に適用され得る。この場合、細胞外マトリクス産生促進因子は、アスコルビン酸類として、少なくとも０．１ｍＭ提供されることが好ましい。厚い人工組織が作成可能であるからである。この場合、濃度を増やすと、細胞外マトリクスで密な人工組織が形成される。少ない場合は、細胞外マトリクス量が減少するが、自己支持性は保たれる。
（軟骨・骨軟骨等再生用途）
別の局面において、本発明は、三次元人工組織と人工骨とを含む、軟骨を再生するための複合組織を提供する。三次元人工組織および人工骨としては、（複合組織）（三次元人工組織の生産）に記載されている任意の形態を用いることができることが理解される。軟骨の再生についても、必要に応じて、（複合組織）に記載されている任意の形態を用いることができることが理解される。
軟骨の再生については、人工組織単独で有効に治療可能という点が、従来の治療法では達成できなかった格別の効果であるといえる。
別の局面において、本発明は、三次元人工組織と人工骨とを含む、骨軟骨系を再生するための複合組織を提供する。三次元人工組織および人工骨としては、（複合組織）（三次元人工組織の生産）に記載されている任意の形態を用いることができることが理解される。骨軟骨系の再生についても、必要に応じて、（複合組織）に記載されている任意の形態を用いることができることが理解される。
骨軟骨系の再生については、複合体の移植が人工組織単独に比して優れることが顕著な点としてあげることができる。また、骨軟骨の境界面より少し下がったところまでに人工骨をとどめることが好ましい。理論に束縛されることを望まないが、なぜなら、このようなサイズのものを用いることによって、人工骨表面と骨軟骨の境界面の間の空間に軟骨下骨の再生が促進され、軟骨部分の生物学的癒合において顕著な治療成績をあげることができることが見出されたからである。
別の局面において、本発明は、三次元人工組織と人工骨とを含む、軟骨下骨を再生するための複合組織を提供する。三次元人工組織および人工骨としては、（複合組織）（三次元人工組織の生産）に記載されている任意の形態を用いることができることが理解される。軟骨下骨の再生についても、必要に応じて、（複合組織）に記載されている任意の形態を用いることができることが理解される。
好ましくは、本発明の軟骨または骨軟骨系の再生において、前記軟骨は、再生後に既存の軟骨と癒合することが特徴である。従来の人工骨のみの治療では、再生後に軟骨との癒合は生じておらず、実質的には異なる組織片（骨片または軟骨片）の集合という形態で再生していたことから、本発明は、欠損前の状態に実質的に回復可能な再生を行なうことができるという点で顕著である。
軟骨下骨の再生について関していうと、人工骨移植により、その直上で軟骨下骨が効率よく形成され、それに引き続き人工組織内の未分化な細胞の軟骨分化が促進されることにも留意されるべきである。理論に束縛されることを望まないが、軟骨化骨の形成と人工組織内の軟骨組織形成の程度は有意に相関することが知られることから、この点は重要な点の一つである。
（複合組織を用いた治療法）
別の局面において、本発明は、骨軟骨欠損に関連する疾患、障害または状態に関して治療または予防するための方法を提供する。この方法は、Ａ）本発明の複合組織を、該欠損を置換するようにおよび／または被覆するように配置する工程；およびＢ）該人工組織または複合体と該部分とが生物学的に結合するに十分な時間保持する工程、を包含する。本発明で用いられる「複合組織」は、本明細書における（複合組織）（三次元人工組織の生産）等において記載される任意の形態を利用することができることが理解される。また、骨軟骨欠損に関連する疾患、障害または状態についても、本明細書における（複合組織）等において記載される任意の形態を利用することができることが理解される。ここで、ある部分を置換するように配置するとは、代表的には、罹患部を必要に応じて掻爬（ｄｅｂｒｉｄｅｍｅｎｔ、ｃｕｒｅｔａｇｅ）し、罹患部に本発明の複合組織を配置して、置換が促進されるように静置することをいう。このような置換は、細胞の充填を目的としており、当該分野において公知の技術を組み合わせて用いることができる。ここで、ある部分を被覆するように配置することは、当該分野において周知技術を用いて行うことができる。ここで、十分な時間は、その部分と人工組織との組み合わせによって変動するが、当業者であれば、その組み合わせに応じて適宜容易に決定することができる。このような時間としては、例えば、術後１週間、２週間、１カ月、２カ月、３カ月、６カ月、１年などが挙げられるがそれらに限定されない。本発明では、人工組織は、好ましくは実質的に細
胞およびそれに由来する物質のみを含むことから、特に術後に摘出する物質が必要であるというわけではないので、この十分な時間の下限は特に重要ではない。従って、この場合、長ければ長いほど好ましいといえるが、実質的には極端に長い場合は、実質的に補強が完了したといえ、特に限定する必要はない。本発明の人工組織はまた、自己支持性を有することから、ハンドリングが楽で、実際の処置時に破壊されず、手術も容易であるという特徴も有する。
あるいは、上記部分は、骨または軟骨を含み得る。そのような例としては、半月、靭帯、腱などを挙げることができるがそれに限定されない。本発明の方法は、骨、軟骨、靭帯、腱または半月の疾患、障害または状態を処置、予防または強化するために利用され得る。
別の好ましい実施形態では、本発明の補強方法では、本発明の複合組織において言及される生物学的結合（例えば、細胞外マトリクスの相互結合、電気的結合、細胞間の情報伝達など）を含む。この生物学的結合は、三次元方向すべてにおいて有されていることが好ましい。
別の好ましい実施形態において、本発明の方法は、細胞外マトリクス産生促進因子の存在下で細胞を培養して本発明の複合組織を形成する工程をさらに包含する。このような細胞外マトリクス産生促進因子の存在下での培養を包含する方法の移植・再生技術は、従来提供されていなかった方法であり、このような方法によって、従来治療が不可能とされていた疾患（例えば、軟骨損傷、難治性骨折など）を治療することができるようになった。
好ましい実施形態において、本発明の方法において、本発明の複合組織において使用される細胞は、移植が意図される動物に由来する細胞（すなわち、自己細胞）である。自己細胞の使用により、免疫拒絶反応などの有害な副作用を回避することができる。
本発明の治療方法が対象とするものは、例えば、軟骨全層損傷；軟骨部分損傷；骨軟骨損傷；骨壊死；変形性関節症；半月損傷；靭帯修復（陳旧性、変性断裂、再建手術の際の生物学的補強など）腱（アキレス腱を含む）修復（陳旧性、変性断裂、再建手術の際の生物学的補強など）；腱板修復（特に、陳旧性、変性断裂など）；骨折遷延治癒；偽関節；人工関節等生体内移植物と骨との癒合不全、骨格筋修復・再生などを行うことができる。
一部の臓器について、特定の疾患、障害および状態は、骨軟骨欠損に起因する疾患等について、その治療について根本的な治療が困難といわれるものがある。しかし、本発明の上述のような効果によって、従来では不可能とされていた処置が可能となり、根本的な治療にも応用することができることが明らかとなった。したがって、本発明は、従来の医薬で達成不可能であった有用性を有するといえる。
本発明の方法による状態の改善は、処置されるべき部分の機能に応じて判定することができる。例えば、骨の場合、その強度を測定したり、ＭＲＩにより骨髄および ／または骨質の評価を行うことによって状態の改善を判定することができる。軟骨・半月であれば、関節鏡検査により関節表面を観察することができる。さらに、関節鏡視下にて生体力学検査を行うことによって状態の改善を判定することができる。また、ＭＲＩによって修復状態を確認することによって状態の改善を判定することも可能である。靭帯に関しては、関節制動性検査により動揺性が存在するかどうかを確認することによって判定することができる。また、ＭＲＩによって組織の連続性を確認することによって状態の改善を判定することができる。いずれの組織の場合も、組織生検を行い組織学的評価を行うことによって状態が改善したかどうかを確認することができる。
好ましい実施形態において、この処置は、骨、軟骨、靭帯、腱または半月の疾患、障害または状態を処置、予防または強化するものである。好ましくは、 この複合組織は、自己支持性を有する。これらの複合組織としては、当業者は、本明細書において、上述した任意の形態およびその改変体を用いることができる。
（併用療法）
別の局面において、本発明は、ＢＭＰ（例えば、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−７など）、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β３、ＨＧＦ、ＦＧＦ、ＩＧＦなどのようなサイトカインと本発明の複合組織とを併用することによる再生療法を提供する。使用される複合組織等は本明細書中（複合組織）の節等に記載される任意の形態を利用することができることが理解される。
本発明で使用されるサイトカインは、いくつかすでに市販されているが（例えば、ＢＭＰ（山之内製薬）、ｂＦＧＦ２（科研製薬）、ＴＧＦ−β１（研究用とし てＲ＆Ｄ）、ＩＧＦ（藤沢薬品）、ＨＧＦ−１０１（東洋紡（株））等）、医薬として使用できる程度に精製されたものであれば、種々の方法で調製されたものを用いることができる。あるサイトカインを産生する初代培養細胞や株化細胞を培養し、培養上清等から分離、精製して該あるサイトカインを得ることもできる。或いは、遺伝子工学的手法によりそのサイトカインをコードする遺伝子を適切なベクターに組み込み、これを適当な宿主に挿入して挿入して形質転換し、こ の形質転換体の培養上清から目的とする組み換えサイトカインを得ることができる（例えば、Ｎａｔｕｒｅ、３４２、４４０（１９８９）、特開平 ５−１１１３８３号公報、Ｂｉｏｃｈｅｍ−Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、，１６３；９６７（１９８９）等を参照）。上記の宿主細胞は特に限定されず、従来から遺伝子工学的手法で用いられている各種の宿主細胞、例えば大腸菌、酵母または動物細胞などを用いることができる。このようにして得られたサイトカインは、天然型サイトカインと実質的に同じ作用を有する限り、そのアミノ酸配列中の１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失および／または付加されていてもよい。患者への導入方法としては、例えば、本発明においてサイトカインの導入方法として、安全かつ効率の良い遺伝子導入法であるセンダイ・ウイル ス（ＨＶＪ）リポソーム法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、３０、１４４０−１４４８（１９９３）、実験医学、１２、１８２２一１８２６（１９９４））、電気的遺伝子導入法、ショットガン方式遺伝子導入法、超音波を用いる遺伝子導入法等があげられる。別の好ましい実施形態では、上記サイトカインは、タンパク質形態として投与されることができる。
以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、以下の実施例は、例示の目的のみに提供される。従って、本発明の範囲は、実施例のみに限定されるものではなく、特許請求の範囲によってのみ限定される。
本実施例において、本研究における全ての手順は、ヘルシンキ宣言に従った。また、適用される場合、動物の取り扱いは、大阪大学において規定される基準を遵守して実験を行った。
（製造例１：滑膜細胞を用いた三次元人工組織の作製）
本実施例では、種々の滑膜細胞を用いて三次元人工組織を作製した。以下に説明する。
＜細胞の準備＞
ブタ（ＬＷＤ三元交配種、細胞採取時には２〜３月齢のものを使用）膝関節より滑膜細胞を採取し、コラゲナーゼ処理後、１０％ウシ胎児血清＋Ｈｉｇｈ Ｇｌｕｃｏｓｅ−ＤＭＥＭ培地（ウシ胎児血清はＨｙＣｌｏｎｅから入手可能、ＤＭＥＭはＧＩＢＣＯから入手したものを使用）にて培養および継代を行った。継代数について、滑膜細胞においては１０継代にても多分化能を有するという報告もあることから、本製造例においては最大１０継代まで使用したが、用途に応じてそれ以上の継代細胞も用いることが理解される。実際に人体に移植する場合には自家移植であるが、十分な細胞数の確保しつつ、感染等の危険性を軽減するために培養期間の短縮する必要がある。
これらを考慮して、種々の継代細胞を用いた。実際に行った細胞は、初代培養細胞、１継代、２継代、３継代、４継代、５継代、６継代、８継代、１０継代のものを実験した。これらを用いて、人工組織を用いた。
＜人工組織の作製＞
３５ｍｍ皿、６０ｍｍ皿、１００ｍｍ皿、１５０ｍｍ皿、５００ｍｍ皿、６穴培養皿、１２穴培養皿、２４穴培養皿（安藤先生の論文の実験データが基本になっていると思いますが、可能な限り加えました）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、セルカルチャー皿・マルチウェルセルカルチャープレートの上に４．０ｘ１０5個/ｍｍ２の滑膜細胞を０．１〜０．２ｍｌ／ｃｍ２の１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ培地にまきこんで培養した。その際にアスコルビン酸を添加した。皿、アスコルビン酸および細胞の濃度は、以下のとおりである。・皿：ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、細胞培養皿・マルチウェル細胞培養プレート
・アスコルビン酸２リン酸：０ｍＭ、０．１ｍＭ、０．５ｍＭ、１ｍＭ、２ｍＭ、および５ｍＭ
・細胞数：５×１０４細胞／ｃｍ２、１×１０５細胞／ｃｍ２、２．５×１０５細胞／ｃｍ２、４．０×１０５細胞／ｃｍ２、５×１０５細胞／ｃｍ２、７．５×１０５細胞／ｃｍ２、１×１０６細胞／ｃｍ２、５×１０６細胞／ｃｍ２、および１×１０７細胞／ｃｍ２。
予定培養期間まで、２回／週で培地交換を行った。培養期間に達したら、皿周囲を全周性に１００μｌのピペットマンでピペッティングを行いながら、細胞シートと皿を分離した。分離できたら皿を軽く揺することにより細胞シートを可能な限り平坦にした。その後培地を１ｍｌ追加し、細胞シートを完全に浮遊させ、２時間放置することにより細胞シートが収縮をおこし、３次元化することにより人工組織を作製した。
（ヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色）
細胞における支持体の定着・消長を観察するために、ＨＥ染色を行った。その手順は以下のとおりである。必要に応じて脱パラフィン（例えば、純エタノールにて）、水洗を行い、オムニのヘマトキシリンでサンプルを１０分浸した。その後流水水洗し、アンモニア水で色出しを３０秒間行った。その後、流水水洗を５分行い、塩酸エオジン１０倍希釈液で２分間染色し、脱水し、透徹し、封入する。
（各種細胞外マトリクス）
１）凍結ストックから、５μｍ厚の切片を作製する。
２）−２０℃で５−１０分間にわたり、アセトン中でこの切片を固定する（パラフィンブロックは、パラフィン除去し再水和する必要がある）
３）内因性ペルオキシド活性は、メタノール中０．３％Ｈ２Ｏ２中で２０分間室温でブロックする（１ｍｌ ３０％Ｈ２Ｏ２＋９９ｍｌメタノール）
４）ＰＢＳで洗浄する（３×５分）。
５）モノクローナル一次抗体（各種細胞外マトリクスに対するマウスまたはウサギ抗体）（１μｌ抗体＋２００μｌＰＢＳ／スライド）と４℃で湿式チャンバー内で一晩インキュベートする。
６）翌日ＰＢＳで洗浄する（３×５分）。
７）抗マウスおよび抗ウサギのｎｏ．１ビオチン化結合を、３０分−１時間室温で適用する（３滴を直接スライドにたらす）。
８）ＰＢＳで洗浄する（３×５分）。
９）ストレプトアビジンＨＲＰ ｎｏ．２を、ＬＳＡＢについてたらし１０１５分間浸す。
１０）ＰＢＳで洗浄する（３×５分）。
１１）ＤＡＢをたらす（５ｍｌ ＤＡＢ＋５μｌ Ｈ２Ｏ２）。
１２）茶っぽい色を顕微鏡で観察する。
１３）水中に５分ほど浸す。
１４）ＨＥを３０秒−１分間浸す。
１５）数回洗浄する。
１６）イオン交換水で１回洗浄する。
１７）８０％エタノールで１分洗浄する。
１８）９０％エタノールで１分洗浄する。
１９）１００％エタノールで１分洗浄する（３回）。
２０）キシレンで３回×１分間洗浄する。その後カバースリップをかける。
２１）発色を見る。
その結果、細胞外マトリックス産生促進因子としてアスコルビン酸２リン酸を添加した場合、細胞の重層化はわずかに認められるのみである。他方、シート状のこの細胞を培養底面より剥離させ自己収縮させることにより、左に示されるように、重層化が進展し三次元化が促進されることが観察された。滑膜細胞を用いた場合でも、孔のない大きな組織が作製された。この組織は、厚みがあり、細胞外マトリクスに富む組織であった。また、アスコルビン酸２リン酸が０ｍＭ、０．１ｍＭ、１ｍＭおよび５ｍＭの場合の人工組織を観察すると、０．１ｍＭ以上添加した場合、細胞外マトリックスの形成が促進したことが分かる。培養日数が、３日、７日、１４日および２１日の人工組織を観察するち、培養３日ですでに、剥離が可能になる程度に組織が強固になることが分かる。培養日数が増すと、細胞外マトリクス密度は変動し、増加していく。
これらが、培養皿底面より剥離し自己収縮をさせた人工組織であった。人工組織はシート状で作製され、皿から剥離した後に放置すると、自己収縮を起こし、三次元化が進む。組織所見により、細胞が幾層にもわたり点在して重層化しているのがわかる。
次に細胞外マトリクスを含む種々のマーカーを染色した。
細胞外マトリクス染色の結果をみると、種々の細胞外マトリクス（コラーゲンＩ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、フィブロネクチン、ビトロネクチンなど）が存在したことがわかる。免疫染色で、コラーゲンIおよびIIIは強く染色されたが、コラーゲンIIの染色は一部に限局していた。強拡でみると、コラーゲンは、核から少し離れた部位で染色されており、細胞外マトリックスであることが確認できる。一方、細胞接着因子として重要とされているフィブロネクチン、ビトロネクチンは、強拡でみると、コラーゲンとは異なり、核に密接する領域にも染色されており、細胞周囲にも存在することが確認できる。
また、人工組織の作製には、３〜８継代が好ましいようであるが、どのような継代でも使用可能なようである。
対比例として、正常組織およびコラーゲンスポンジ（ＣＭＩ，Ａｍｇｅｎ、ＵＳＡ）での染色例を示す。正常組織（正常滑膜組織、腱組織、軟骨組織、皮膚および半月組織）および対比例として用いた市販のコラーゲンスポンジの染色例を比較すると、従来の人工組織は、フィブロネクチンおよびビトロネクチンでは染色されない。このことから、本発明の人工組織は、従来の人工組織とは異なり、また、既存のコラーゲンスキャフォールドでは、フィブロネクチンおよびビトロネクチンの接着因子は含まれておらず、その意味でも、本発明の組織の独創性が明らかになる。どの細胞外マトリクスでも染色されない。正常組織と本製造例の人工組織とを比べると、人工組織の癒合の様子が自然に近いことが確認される。
なお、本発明の人工組織は、水分除去のための濾紙に接触させたところ、濾紙に接着し、手で剥離することが困難であった。
さらに、コラーゲンの濃度を見るために、コラーゲン含有量測定を行った。その結果、ヒドロキシプロリンの量から、０．１ｍＭ以上のアスコルビン酸２リン酸を加えたときに、コラーゲンの生産が有意に促進されることが明らかになった。産生量は、培養期間にほぼ比例していた。
（製造例２：脂肪由来組織の細胞を用いて三次元人工組織の作製）
次に、脂肪組織由来の細胞を用いて人工組織を作製した。
Ａ）細胞は、以下のようにして採取した。
１）膝関節の脂肪パッド（ｆａｔーｐａｄ）より検体を採取した。
２）この検体をＰＢＳを用いて洗浄した。
３）この検体をできるだけ細かく鋏で切り刻んだ。
４）コラゲナーゼ（０．１％）１０ｍｌを加え、３７℃水浴にて1時間振盪した。
５）ＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ補充）を同量加えて、７０μｌのフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅなどから入手可能）に通した。
６）フィルターを通った細胞およびフィルターに残った残渣を１０％ ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ５ｍｌに入れて２５ｃｍ２フラスコ（Ｆａｌｃｏｎなどから入手可能）において培養した。
７）フラスコの底面に張り付いた細胞（間葉系幹細胞を含む）を取り出して以下の人工組織作製に供した。
Ｂ）人工組織の作製法
次に、この脂肪由来の細胞を用いて人工組織を作製した。アスコルビン酸２リン酸は、０ｍＭ（なし）、０．１ｍＭ、０．５ｍＭ、１．０ｍＭ、５．０ｍＭの条件を用いた。作製は、上記滑膜細胞を作製した方法（製造例１に記載される）に準じて行った。初期の播種条件としては、５×１０４細胞／ｃｍ２を用いた。培養日数は１４日間を採用した。脂肪組織由来の細胞からも人工組織は作成され、滑膜細胞由来人工組織と同様にフィブロネクチンおよびビトロネクチンが豊富に存在していた。またコラーゲンI,IIIについても同
様豊富に発現していた。
アスコルビン酸２リン酸 ０ｍＭ：接線係数（ヤング率）０．２８
アスコルビン酸２リン酸 １．０ｍＭ：接線係数（ヤング率）１．３３。
Ｃ）移植実験
次に、この人工組織を用いて以下の実施例に記載される複合組織を生産することができる。その結果、脂肪細胞が、滑膜細胞由来の三次元人工組織でできた複合組織と同様に、修復機能を有することがわかる。
Ｄ）脂肪からの人工組織の骨軟骨への分化誘導
本実施例で作製した骨または軟骨の人工組織を、軟骨または骨に分化誘導させたることができる。人工組織は骨分化誘導培地にてアルザリンレッド陽性反応を呈することを確認することによって、骨分化が確認された。軟骨分化誘導実験で人工組織は軟骨分化誘導培地＋BMP-2の刺激によりアルシアンブルー陽性の軟骨様組織へと分化することが確認され
た。脂肪由来人工組織も滑膜細胞由来人工組織と同様に骨・軟骨への分化能を保持していることは確認されている（特許４５２２９９４号参照）。
（製造例３：ヒト滑膜細胞での製造例）
次に、半月板損傷患者からの滑膜細胞採取、さらに人工組織の作製が可能であるかどうかを本例において確認する。
（滑膜細胞の採取）
ヒト患者であって、画像により軟骨損傷または半月板損傷と診断された患者の精査として、腰椎麻酔または全身麻酔下において、関節鏡検査を施行する。その際に、数十ｍｇ滑膜を採取する。採取した滑膜を５０ｍｌの遠心管（Ｆａｌｃｏｎ社製）に移し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて洗浄し、その後、１０ｃｍ径の培養皿（Ｆａｌｃｏｎ社製）に移し、滅菌した鋏刀を用いて細かく切断する。切断物を、さらに、０．１％コラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ社製）１０ｍｌを加えて、３７℃恒温槽中で１時間３０分振盪する。溶解液に予め採取しておいた自己血清またはウシ血清（ＦＢＳ）を含む培地（ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ社製）を１０ｍｌ加えて、コラゲナーゼを不活化し、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、細胞を沈降させる。その後、血清入り培地５ｍｌを再度加え、７０μｌフィルター（Ｆａｌｃｏｎ社製）に通し、２５ｃｍ２フラスコ（Ｆａｌｃｏｎ社製）に移して３７℃に保温したＣＯ２インキュベータ内において培養する。
（滑膜細胞の継代培養）
初期培養において、１週間に２回培地交換を行い、コンフルエントの状態になれば、細胞継代を行う。初期継代として、培地を吸引した後、ＰＢＳを用いて洗浄し、トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ社製）を加えて、５分間放置する。その後、血清入り培地を加え、溶解物を５０ｍｌ遠心分離管（Ｆａｌｃｏｎ社製）に移し、１５００ｒｐｍ×５分間遠心分離後、沈澱に血清入り培地１５ｍｌを加え、１５０ｃｍ２培養皿（Ｆａｌｃｏｎ社製）に細胞を播く。以後の継代は、１：３の細胞比となるよう継代を施行し、４〜５継代となるまで同様の操作を行う。
（人工組織の作製）
４〜５継代の滑膜細胞をトリプシン・ＥＤＴＡによって処理し、滑膜細胞４．０×１０６個を０．２ｍＭアスコルビン酸２リン酸含有血清入り培地２ｍｌに溶解し、３５ｍｌ培養皿（Ｆａｌｃｏｎ社製）にて３７℃に保温したＣＯ２インキュベータにて７日間培養する。これにより、培養細胞−細胞外マトリクス複合体が形成される。この複合体は、移植手術予定の２時間以上前に周囲をピペッティングすることによって機械的に培養皿から剥離させる。剥離後は、培養細胞−細胞外マトリクス複合体は拘縮し、直径約１５ｍｍ、厚さ約０．１ｍｍの三次元組織となる。
（製造例４：ヒト脂肪細胞からの人工組織の作製）
局所麻酔により、ヒト患者の採取予定部（例えば、膝関節周囲）に小切開を加え、脂肪細胞数十ｍｇを採取する。採取した脂肪細胞は、上記製造例、たとえば滑膜細胞と同様の処理を行うことによって、三次元の人工組織を作製することができる。
（製造例５：人工組織作成時の分化時期の検討：ヒトの場合）
次に、脂肪組織由来の細胞を用いて人工組織を作製した。
Ａ）細胞は、以下のようにして採取した。
１）膝関節の脂肪パッド（ｆａｔーｐａｄ）より検体を採取した。
２）この検体をＰＢＳを用いて洗浄した。
３）この検体をできるだけ細かく鋏で切り刻んだ。
４）コラゲナーゼ（０．１％）１０ｍｌを加え、３７℃水浴にて1時間振盪した。
５）ＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ補充）を同量加えて、７０μｌのフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅなどから入手可能）に通した。
６）フィルターを通った細胞およびフィルターに残った残渣を１０％ ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ５ｍｌに入れて２５ｃｍ２フラスコ（Ｆａｌｃｏｎなどから入手可能）において培養した。
７）フラスコの底面に張り付いた細胞（間葉系幹細胞を含む）を取り出して以下の人工組織作製に供した。
Ｂ）人工組織の作製法
次に、この脂肪由来の細胞を用いて人工組織を作製した。アスコルビン酸２リン酸は、０ｍＭ（なし）、０．１ｍＭ、０．５ｍＭ、１．０ｍＭ、５．０ｍＭの条件を用いた。作製は、上記滑膜細胞を作製した方法（実施例１に記載される）に準じて行った。初期の播種条件としては、５×１０４細胞／ｃｍ２を用いた。
この細胞を用いて、種々の条件を用いて分化時期の重要性について検討した。
その結果、脂肪細胞由来のものであっても、同様に、分化時期は、本発明の人工組織に対して特に影響しないことが明らかになった（特許４５２２９９４号参照）。
（製造例６：筋芽細胞による三次元人工組織作製）
次に、筋芽細胞を用いた場合の、アスコルビン酸またはその誘導体による人工組織作製への影響を検討した。人工組織生産は、製造例１に準じた。
筋芽細胞を十分量増殖させた後、５×１０６の細胞数を、培養した。培養には、ＳｋＢＭ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ（Ｃａｍｂｒｅｘ））という培地を使用した。次に、アスコルビン酸２リン酸（０．５ｍＭ）、アスコルビン酸１リン酸マグネシウム塩（０．１ｍＭ）、Ｌ−アスコルビン酸Ｎａ（０．１ｍＭ）を投与し、培養開始４日後に脱着させた。対照として、アスコルビン酸類を添加しない培養系で培養した人工組織を作製した。
（結果）
アスコルビン酸類を添加した場合は、無添加の培養系での人工組織よりも、脱着が格段に容易となっており、しかも、無添加の培養系では、数ｍｍ程度の大きさまでしか培養されず、それを超えると、割れ目などが入り、成長しなかった。しかも、はがすことが実質的に困難であり、移植可能な人工組織を提供できなかった。これに対し、本発明のアスコルビン酸類を添加した培地で培養した人工組織は、移植可能な程度の大きさに成長し、容易に人工組織を単離することができた。生物学的結合を見たところ、細胞外マトリクスによる相互作用がかなり進んでいることが判明した。
このように、本発明に用いる三次元人工組織は、種々の細胞を用いて製造することができた。
（実施例１）
（滑膜組織の採取と細胞の単離）
全ての動物実験は、大阪大学医学部動物実験施設による承認を得た。ウサギの滑膜を、死後１２時間以内に骨格が成熟した（２４週齢）ウサギの膝関節から無菌的に採取した。細胞単離のプロトコールは、ヒト滑膜由来のＭＳＣの単離について以前に報告したものと本質的に同じである［Ａｎｄｏ Ｗ，Ｔａｔｅｉｓｈｉ Ｋ，Ｋａｔａｋａｉ Ｄ，Ｈａｒｔ ＤＡ，Ｈｉｇｕｃｈｉ Ｃ，Ｎａｋａｔａ Ｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ Ｐａｒｔ Ａ ２００８；１４：２０４１−２０４９］。簡単に述べると、滑膜標本をリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）でリンスし、細かく切り刻み、そして、３７℃にて２時間、０．４％コラゲナーゼＸＩ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）で処理した。１０％胎仔ウシ血清（ＦＢＳ；ＨｙＣｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ，ＵＳＡ）と１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を添加した高グルコースダルベッコ改変イーグル培地（ＨＧ−ＤＭＥＭ；Ｗａｋｏ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）を含有する増殖培地でコラゲナーゼを中和した後、遠心分離により細胞を回収し、ＰＢＳで洗浄し、増殖培地中に再懸濁し、そして、培養皿にプレートした。ウサギ間葉系幹細胞の特性は、形態、増殖特性および（骨系統、軟骨系統および脂肪系統への）多能性分化能の点で、ヒト滑膜由来ＭＳＣと同様であった［Ando W,Tateishi K,Katakai D,Hart DA,Higuchi C,Nakata K,et al.,Tissue Eng Part A 2008;14:2041-2049;Tateishi K,Higuchi C,Ando W,Nakata K,Hashimoto J,Hart DA,et al.,Osteoarthritis Cartilage 2007;15:709-718］。細胞増殖のために、これらの細胞を、５％ ＣＯ２の加湿雰囲気下、３７℃にて、増殖培地中で増殖させた。培地は、週に１回交換した。初代培養の７〜１０日後、細胞がコンフルエンスに達すると、これらを、ＰＢＳで２回洗浄し、トリプシン−ＥＤＴＡ（０．２５％トリプシンおよび１ｍＭ ＥＤＴＡ：Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いた処理によって回収し、そして、細胞濃度が１：３となるよう希釈して再度プレーティングした。培養細胞がほぼコンフルエンスに達すると、同様に１：３希釈して、細胞の継代を継続した。本願では継代３〜７回の細胞を使用した。
（三次元人工組織（ＴＥＣ）の作製）
滑膜ＭＳＣを、以前の研究からの最適濃度である、０．２ｍＭのアスコルベート−２−リン酸（Ａｓｃ−２Ｐ）を含有する増殖培地中４．０×１０５細胞／ｃｍ２の密度にて、６ウェルプレート（９．６ｃｍ２）上にプレートした［Ando W,Tateishi K,Katakai D,Hart DA,Higuchi C,Nakata K,et al.,Tissue Eng Part A 2008;14:2041-2049;Ando W,Tateishi K,Hart DA,Katakai D,Tanaka Y,Nakata K,et al.,Biomaterials 2007;28:5462-5470;Shimomura K,Ando W,Tateishi K,Nansai R,Fujie H,Hart DA,et al.,Biomaterials 2010;31:8004-8011］。１日以内に細胞はコンフルエントになった。さらに７〜１４日間培養を継続した後、培養細胞とこれらの細胞によって合成されたＥＣＭとの複合体を、軽いピペッティングを用いてせん断応力を加えることによって、下層から剥離させた。この剥離した単層の複合体を懸濁液中に維持させ、自己組織収縮によって三次元構造を形成させた。この組織を、スキャフォールド非依存性（スキャフォールドフリーとも呼ぶ）三次元ＴＥＣと呼んだ。
（ＴＥＣおよび人工骨から成る複合組織（ハイブリッド移植片）の作製）
相互連結した多孔構造をもつ合成ＨＡ［直径５ｍｍ、高さ４ｍｍ（ＮＥＯＢＯＮＥ（登録商標）；ＭＭＴ Ｃｏ．Ｌｔｄ．，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）］を人工骨として使用した。ＴＥＣを、移植手術の直前に培養皿から剥離し、そして、接着剤を用いることなく、人工骨に結合させて、骨軟骨ハイブリッドを作製した（図１ａ）。ＴＥＣは一度人工骨に結合すると、この結合は、強固に結合するため分離するのが困難となる。
（骨軟骨欠損へのハイブリッド移植片の移植）
４１匹の骨格が成熟したニュージーランド白ウサギ（２４週齢以上）を、ケージ内に維持し、自由に食餌および水を与えた。ウサギに、１ｍｌのペントバルビタール［５０ｍｇ／ｍｌ（ネンブタール（登録商標）；Ｄａｉｎｉｐｐｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．Ｌｔｄ．，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）］の静脈内注射および１ｍｌのキシラジン塩酸塩［２５ｍｇ／ｍｌ（Ｓｅｒａｃｔａｌ（登録商標）；Ｂａｙｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）］により麻酔をかけた。剃毛、消毒を行い、滅菌した布で覆った後、右膝に、真っ直ぐな３ｃｍ長の内側傍膝蓋骨切開を作製し、膝蓋骨を外方に動かし、そして、大腿骨窩部を露出させた。右遠位大腿の大腿骨窩部に直径５ｍｍ、深さ６ｍｍの全厚関節骨軟骨欠損を機械的に作製した（図１ｂ）。ＴＥＣおよび人工骨のハイブリッド形成は、移植の直前に行い、そして、二相性の移植片を、２３匹のウサギの右膝の欠損内に移植した（ＴＥＣ群）。対照群では、１８匹のウサギの右膝の欠損に人工骨のみを移植した（図１ｃ〜ｄ）。動物は全て７日間右下肢をギプス固定した。その後、外科手術から１ヶ月後、２ヶ月後および６ヶ月後に麻酔下で安楽死させた。移植部位（ＴＥＣ群について１８標本および対照群について１３標本）を固定して、後のパラフィン切片作製および組織学的解析のために使用した。他の移植部位（ＴＥＣ群について５標本および対照群について５標本）を、生体力学的試験に供した。本発明者らはまた、生体力学的試験のために未処置の正常対照として５匹のウサギの左膝を準備した。
（修復された組織の組織学的評価）
組織学的評価のために、組織を１０％中性緩衝化ホルマリンで固定し、Ｋ−ＣＸ（Ｆａｌｍａ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）で脱灰し、パラフィン中に包埋して、４ｍｍの切片を作製した。切片をヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）およびトルイジンブルーで染色した。
１ヶ月、２ヶ月および６ヶ月の時点で、軟骨および軟骨下骨部分についての修復後組織の組織学を、改良型「Ｏ’Ｄｒｉｓｃｏｌｌスコア」によって評価した［O’Driscoll SW,Keeley FW,Salter RB.、J Bone Joint Surg Am 1988;70:595-606;Mrosek EH,Schagemann JC,Chung HW,Fitzsimmons JS,Yaszemski MJ,Mardones RM,et al.,J Orthop Res 2010;28:141-148;Olivos-Meza A,Fitzsimmons JS,Casper ME,Chen Q,An KN,Ruesink TJ,et al.,Osteoarthritis Cartilage 2010;18:1183-1191］。改良型では、基準分類「トルイジンブルー染色」を「サフラニンO染色」に変更した。さらに、軟骨下骨の修復については、新たな基準分類「細胞の形態」および「軟骨下骨の露出」を設けた。「細胞の形態」について、正常な軟骨下修復はスコア２、軟骨様組織が混じって修復された組織はスコア１、そして、線維性組織が混じって修復された組織はスコア０である。「軟骨下骨の露出」については、軟骨下骨の露出なしがスコア２、修復された組織と隣接する軟骨との間の境界の片側における軟骨下骨の露出がスコア１、そして、両側における軟骨下骨の露出がスコア０である。修復組織を２ｍｍ幅ごとに３つの部分に分割した。これらは、中央領域および両境界領域とした。これらの各々の領域を、改良型Ｏ’Ｄｒｉｓｃｏｌｌスコアで評価した。これらの３つのスコアを平均したものを「総合評価」とした。さらに、中央領域のスコアを「中央領域」として評価し、両境界領域の平均スコアを「境界領域」として評価した。基準分類「隣接軟骨への結合」「隣接軟骨の変性からの事由」,「軟骨下骨の露出」については、「総合評価」のみで評価した。
軟骨下骨および軟骨の修復の程度を定量するために、１ヶ月、２ヶ月および６ヶ月の時点で、修復された組織の骨および軟骨形成率を計算した。骨の形成率に関して、修復された骨組織の長さを、人工骨の長さで割り、結果はパーセンテージとして表した（図２ａ）。軟骨の形成率も同じ方法で計算した（図２ｂ）。さらに、骨形成率と軟骨形成率の間の相関を計算した。
（生化学試験）
直径４ｍｍ、深さ５ｍｍの円柱形状の標本を、ＴＥＣ群および対照群の移植部位から摘出した。同様に、未処置の正常膝の大腿骨顆間中央部からも円柱形状の標本を摘出した。ＡＦＭ（Ｎａｎｏｓｃｏｐｅ ＩＩＩａ，Ｖｅｅｃｏ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｓａｎｔａ Ｂａｒｂａｒａ，ＣＡ，ＵＳＡ）およびシリコンプローブ（ばね定数：０．０６Ｎ／ｍ，ＤＮＰ−Ｓ，Ｖｅｅｃｏ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｓａｎｔａ Ｂａｒｂａｒａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いた。各標本をＡＦＭのサンプルステージにマウントし、室温にて生理食塩水溶液中に浸し、これらの標本に対して微小圧縮試験を実施した。さらに３０μｍ×３０μｍのスキャン領域において接触モードで標本の表面像を取得した後、５．１２μｍ／秒の押込速度にて、標本に対して０．３Ｈｚのスキャン速度の微小圧縮試験をおこなった。
（統計的解析）
統計的解析は、分散分析（ＡＮＯＶＡ）で行い、その後、組織学スコア総合の術後変化および生体工学試験について、事後比較検定を行った（図６ａ，図６ｂ，図８ａ，図８ｅ）。参照群とＴＥＣ群との間の他の実験パラメータの比較は、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定により分析した（図７ａ〜７ｃ，表１および２）。骨および軟骨の形成の相関は、Ｓｐｅａｒｍａｎ順位相関係数により計算した（図７ｄ）。結果は、平均±ＳＤ（標準偏差）で表す。データは、ＪＭＰ９（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， Ｃａｒｙ， ＮＣ， ＵＳＡ）で分析した。統計学的有意はｐ＜０．０５で設定して判断した。
（結果）
（ＴＥＣの人工骨との複合組織（ハイブリッド）形成）
ＴＥＣは人工骨ブロック上に直ちに結合して、外科的移植に十分な強度を持つ複合体を生じた。
（修復された組織の肉眼評価）
外科手術の１ヶ月後、ＴＥＣ群では、欠損は部分的または完全に修復された組織で覆われたが、対照群の被験体全てにおいて人工骨が露出されていた（図３ａ〜ｂ）。外科手術の２ヵ月後、対照群およびＴＥＣ群の両方において、欠損は修復された組織で覆われた（図４ａ〜ｂ）。外科手術の６ヵ月後、両方の群で、欠損は引き続き修復された組織で覆われており、明らかな変形性関節症による変化は認められなかった（図５ａ〜ｂ）。
（修復された組織の組織学的評価）
外科手術の１ヵ月後、ＴＥＣ群では、欠損は、厚みのある線維様の組織で修復され、そして、修復された組織は、隣接する宿主組織に対する良好な生物学的癒合を示した（図３ｃ）。逆に、対照群では、人工骨は、組織が修復されず、露出されたままであった（図３ｄ）。外科手術の２ヵ月後、ＴＥＣ群の修復された組織は、大部分において骨形成を示し、そして、修復された骨の周辺では軟骨の形成が進行していた（図４ｃ〜ｄ）。対照群では、欠損は、線維様の組織で修復された（図４ｅ〜ｆ）。より高倍率の像は、ＴＥＣ群において、隣接する宿主組織に対する良好な組織の生物学的癒合が得られ、修復された組織が、硝子様軟骨を示している（図４ｉ、ｊおよびｌ）。一方で、対照群の欠損は、軟骨下骨の修復の遅延と、その後の、隣接する宿主組織に対する乏しい生物学的癒合を伴う不完全な骨軟骨修復を示した（図４ｇ、ｈおよびｋ）。外科手術の６ヵ月後、ＴＥＣ群の修復された組織は、完全に骨軟骨組織で修復されたが、修復された組織の一部は、軟骨下骨の増殖（軟骨の菲薄化）を示した（図５ｅ〜ｆ）。対照群でも、ある程度の骨軟骨修復は認められたが、修復された組織は、隣接する軟骨に対する乏しい生物学的癒合と、軟骨下骨領域における線維性組織および軟骨様組織が混じった不十分な骨軟骨修復を示した（図５ｃ、ｄ、矢印）。より高倍率の像は、ＴＥＣ群において、隣接する宿主組織に対する良好な組織の生物学的癒合が維持され、修復された組織が硝子様軟骨を示したことを示している（図５ｉ、ｊおよびｌ）。逆に、対照群では、修復された組織は、宿主組織に対する乏しい組織の生物学的癒合と、細胞のクラスタリングを伴う線維軟骨様組織を示した。これらの結果は、対照群における修復された組織が、変形性関節症の進行において観察されたことを示している（図５ｇ、ｈおよびｋ）。
（軟骨修復に関する組織学的スコア）
ＴＥＣ群における軟骨修復の総合組織学スコアは、１ヶ月の時点よりも術後２ヶ月で有意に増加した（１９．１６±２．３３に対して１４．２２±２．０２，ｐ＝０．００３６））。ついで、総合組織学スコアは、６ヶ月までにプラトーに達した。参照群でも、総合組織学スコアはまた、１ヶ月の時点よりも術後２ヶ月の時点で、有意に増加した（１３．６７±２．１０に対して５．３４±２．５９，ｐ＝０．０２５７）。しかし、６ヶ月での総合組織学スコアは２ヶ月のスコアに比べて減少傾向にあった。ただし、２ヶ月の時点と６ヶ月の時点との間ではなんら有意な相違は検出されなかった（１３．６７±２．１０ ｖｅｒｓｕｓ ９．５６±５．１７，ｐ＝０．２７７１）（図６ａ）。
ＴＥＣ群における軟骨修復についての総合組織学スコアは、ＴＥＣ群において、参照群と比較して有意に高かった（１ヶ月では、１４．２２±２．０２に対して５．３４±２．５９，ｐ＝０．０１０３；２ヶ月では１９．１６±２．３３に対して１３．６７±２．１０，ｐ＝０．０１７９；６ヶ月では１７．８に対して１０．５，ｐ＝０．０４６５）。術後２ヶ月では、総合スコアは、参照群と比較してＴＥＣ群において高かったが、有意な相違ではなかった（１９．０３±２．１５ に対して９．５６±５．１７，ｐ＝０．０１１９）（図６ａ）。
基準分類「細胞の形態」および「トルイジンブルー染色」について、ＴＥＣ群では、参照群に比べて、術後６ヶ月まで有意に高かった。この結果は、本発明の複合組織（ハイブリッド移植片）での軟骨修復が加速されたことを示す。基準分類「隣接軟骨への結合」については、ＴＥＣ群での組織学スコアが、参照群に比べて、術後１ヶ月、２ヶ月および６ヶ月の時点で、有意に高かった。加えて、基準分類「構造一体性（Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）」については、特に下位分類の「境界領域」について、ＴＥＣ群では、参照群に比べて、６ヶ月の重点で有意に高かった。これらの結果は、ＴＥＣの接着性が隣接宿主組織への良好な生物学的癒合に寄与することを示す。基準分類「軟骨細胞クラスタリング」および「隣接軟骨の変性」では、６ヶ月の時点で参照群よりも有意に低かった。なお、これらの結果は、変形性関節症における早期の段階に観察される修復組織の変性を示すものである（表１）。
（表１：軟骨修復の組織学評価）
修復組織を辺縁部、中央、反対の辺縁部の３つに分けスコアリングした。総合スコア（Overall）は３つの平均で算出、Borderは両辺縁部の平均で算出した。各スコアの詳細は「参考資料」（表１A)を参照。
（軟骨下骨修復の組織学スコア）
TEC群における軟骨下骨修復についての総合組織学スコアは、術後１ヶ月よりも術後２ヶ月において有意に増加した(9.07±1.84 に対して1.67±0.57,p<0.0001)。ついで、総合組織学スコアは、６ヶ月までにプラトーに達した。参照群では、総合組織学スコアは、時間の経過と共に増加し（時間依存性）、１ヶ月と６ヶ月との間で有意性が見られた(1.00±1.15に対してp=0.0156)（図６ｂ）。
術後１ヶ月で、軟骨下骨修復は、TEC群でも参照群でも見られなかった。したがって、基準分類「軟骨下骨の露出」以外のすべての分類は０であった。軟骨下骨についての総合組織学スコアは、術後２ヶ月の時点でTEC群において、参照群よりも有意に高かった(9.07±1.84に対して4.92±1.91,p=0.0140)。術後６ヶ月の時点において、総合スコアは、TEC群において参照群より高かったが、有意差は見られなかった（9.54±1.26に対して6.47±3.20,p=0.0937）（図６ｂ）。
基準分類「軟骨下骨の整列」「骨の一体化」「損傷領域への骨浸潤」および「細胞の形態」では、術後２ヶ月においてTEC群と参照群との間で有意差が存在していた。これらの結果は、本発明の複合組織（ハイブリッド移植片）が、軟骨下骨修復を早期から促進したことを示す。術後６ヶ月の時点で、基準分類「タイドマークの連続性」は、TEC群において、参照群よりも有意に高かった。これらの結果は、本発明の複合組織が軟骨下骨の成熟を促進に寄与していることを示す。しかし、「タイドマークの連続性」以外の基準分類は、TEC群と参照群との間で有意差はなかった。これらの結果は、軟骨下骨修復が参照群でも何らかの形で生じていることを示す。基準分類「軟骨下骨の露出」については、スコアは、術後６ヶ月において２ヶ月後に画して、参照群では悪化していた。これらの結果は、人工骨単独では、長期の抵抗性に寄与していなかったことを示す（表２）。
（表２：軟骨下骨修復についての組織学評価）
各スコアの詳細は「参考資料」（表２A)を参照。
再生軟骨下骨の露出の有無→再生組織の変性を反映した。
（骨および軟骨の形成率とその相関）
ＴＥＣ群における骨形成率は対照群におけるものよりも高かったが、外科手術から１ヵ月後、２ヵ月後および６ヵ月後で両群間に有意差はなかった（それぞれ、１３．３±１４．５対０；ｐ＝０．０５４７、８２．０±２１．４対３７．０±３１．３；ｐ＝０．０５６５、９１．１±１９．８対８２．３±３１．４；ｐ＝０．５７７５）（図７ａ〜ｃ）。ＴＥＣ群における軟骨形成率は、外科手術から２ヵ月後に、対照群におけるものよりも有意に高かった（９３．２±１０．３対５６．４±３８．６；ｐ＝０．０２０３）が、外科手術から１ヵ月後および６ヵ月後で両群間に有意差はなかった（それぞれ、１４．３±２１．７対０；ｐ＝０．１１５５および９１．０±１４．３対７３．６±４３．０；ｐ＝０．５７７５）（図７ａ〜ｃ）。全ての被験体（Ｎ＝３１）における骨および軟骨の形成率は、有意に相関していた（ｒ＝０．８８７２、ｐ＜０．００１）（図７ｄ）。
（機械的特性）
本発明の複合組織（ハイブリッド移植片；ＴＥＣ）を移植した骨軟骨組織は、正常な骨軟骨組織に等しい剛性を獲得した（２３．２±１２．５対１６．８±１０．０ｍＮ／ｍ、ｐ＝０．３４７２）。しかしながら、ＴＥＣ群と対照群との間で有意差は検出されなかった（１６．８±１０．０対１１．４±８．８ｍＮ／ｍ、ｐ＝０．４６４７）（図８ａ）。表面のデジタル画像は、ＴＥＣ群および未処置の正常組織群共に修復された組織が平滑な表面を示していた。しかしながら、対照群でも同様に平滑な表面を示していた（図８ｂ〜ｄ）。デジタル画像から算出した表面の粗さは、未処置の正常組織群、対照群およびＴＥＣ群の間で、有意差を示さなかった（図８ｅ）。
（考察）
変形性関節症は、軟骨の損傷だけでなく、軟骨下骨の損傷も伴う。それゆえ、軟骨および軟骨下骨の層ごとの帯状の回復を促進することが重要であり、最近、多くの研究が、二相性または三相性の移植片を用いたこれらの２種類の構造の再生を標的としている［Hung CT,Lima EG,Mauck RL,Takai E,LeRoux MA,Lu HH,et al.,J Biomech 2003;36:1853-1864;Marquass B,Somerson JS,Hepp P,Aigner T,Schwan S,Bader A,et al.,J Orthop Res 2010;28:1586-1599;Oliveira JM,Rodrigues MT,Silva SS,Malafaya PB,Gomes ME,Viegas CA,et al.,Biomaterials 2006;27:6123-6137;Sherwood JK,Riley SL,Palazzolo R,Brown SC,Monkhouse DC,Coates M,et al.,Biomaterials 2002;23:4739-4751;Ahn JH,Lee TH,Oh JS,Kim SY,Kim HJ,Park IK,et al.,Tissue Eng Part A 2009;15:2595-2604;Alhadlaq A,Mao JJ.、J Bone Joint Surg Am 2005;87:936-944;Gao J,Dennis JE,Solchaga LA,Goldberg VM,Caplan AI.、Tissue Eng 2002;8:827-837;Kandel RA,Grynpas M,Pilliar R,Lee J,Wang J,Waldman S,et al.,Biomaterials 2006;27:4120-4131;Chen J,Chen H,Li P,Diao H,Zhu S,Dong L,et al.,Biomaterials 2011;32:4793-4805］。二相性構造物の軟骨層のを形成する材料に関して、アガロース、ヒドロゲル、ヒアルロナンまたはキトサン製の材料がスキャフォールドとして開発されてきた。これらのスキャフォールドは、自己由来軟骨移植において実験的および臨床的に使用されており、良好な臨床的結果を示すことが証明されている［Kon E,Gobbi A,Filardo G,Delcogliano M,Zaffagnini S,Marcacci M.、Am J Sports Med 2009;37:33-41;Basad E,Ishaque B,Bachmann G,Sturz H,Steinmeyer J.、Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc 2010;18:519-527］。しかしながら、スキャフォールドは、一般に、合成ポリマーまたは生体材料を含んでおり、これらの材料の長期の安全性にともなういくつかの問題が依然として存在している。他方、スキャフォールドフリーであるため、本発明で用いられるＴＥＣは、動物由来の物質も化学物質も含んでおらず、加えて、ＨＡまたはβ−ＴＣＰが、二相性構造物の軟骨下骨層を形成する材料として使用されている。これらの材料は、骨折または骨腫瘍の切除に起因した骨の損失を補充するために臨床上広く使用されている［Tamai N,Myoui A,Hirao M,Kaito T,Ochi T,Tanaka J,et al.,Osteoarthritis Cartilage 2005;13:405-417;Tamai N,Myoui A,Kudawara I,Ueda T,Yoshikawa H.、J Orthop Sci 2010;15:560-568;Shen C,Ma J,Chen XD,Dai LY.、Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc 2009;17:1406-1411］。まとめると、ＴＥＣはスキャフォールド非依存性であるため、動物または化学物質由来の物質を含まず、また、ＨＡは、臨床上広く使用されている。それゆえ、本発明の複合組織（ハイブリッド材料）は、有効性および安全性をもって、骨軟骨損傷を修復するために適している可能性がある。
特筆すべきことに、ＴＥＣおよび人工骨で構成される複合組織（ハイブリッド材料）は、対照群と比較して、少なくとも外科手術から６ヵ月後まで良好な骨軟骨の修復を促進した。加えて、ＴＥＣ群では、隣接する宿主組織への良好な生物学的癒合を伴う修復組織は、外科手術から６ヵ月後まで維持された。一方、６ヶ月の時点で対照群でみられた隣接する宿主組織への乏しい生物学的癒合および細胞のクラスタリングの増加が、移植後の長期間にわたる軟骨の変成・破壊につながり得ること、およびこれらの異常な細胞が修復組織と隣接する正常な軟骨との間の裂け目の周囲の境界領域で特に観察されていることを考慮すると、ＴＥＣは良好な生物学的癒合および長期にわたる耐久性をともなった骨軟骨修復に貢献し得る。何故ならTECは、豊富なフィブロネクチンおよびビトロネクチンを有するため接着能力に優れ、さらに、移植周囲組織への成熟を促すパラクリン作用を有するためである。
さらに、本発明の複合組織（ハイブリッド材料）は、軟骨下骨修復、特に術後の早期段階での修復にも貢献している。骨軟骨修復にとって、軟骨下骨を安定化することが重要である。［Gomoll AH,Madry H,Knutsen G,van Dijk N,Seil R,Brittberg M,et al.,Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc 2010;18:434-447;Kon E,Delcogliano M,Filardo G,Busacca M,Di Martino A,Marcacci M.、Am J Sports Med 2011;39:1180-1190］、何故なら軟骨下骨の損傷が存在すると、軟骨細胞移植の治療成績の低下が認められたからである。［Ｍｉｎａｓ Ｔ，Ｇｏｍｏｌｌ ＡＨ，Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇｅｒ Ｒ，Ｒｏｙｃｅ ＲＯ，Ｂｒｙａｎｔ Ｔ．、Ａｍ Ｊ Ｓｐｏｒｔｓ Ｍｅｄ ２００９；３７：９０２−９０８］。他方で、本発明者らは、これまでに、軟骨下骨を修復するための、ＨＡベースの人工骨の有用性について報告した［Tamai N,Myoui A,Hirao M,Kaito T,Ochi T,Tanaka J,et al.,Osteoarthritis Cartilage 2005;13:405-417］。加えて、本発明者らは、本発明の複合組織（ハイブリッド移植片）を用いた外科手術から６ヵ月後まで、軟骨下骨の修復の進行と、隣接する宿主組織に対する確実かつ良好な組織の生物学的癒合が維持されることを示した。これらの結果は、本発明において用いられる三次元人工組織が、何らかの生体活性パラクリン効果を通じて、隣接する骨髄細胞からの骨新生を促進することを示す。さらに、本発明の複合組織（ハイブリッド移植片）が、長期の耐久性を保証し得、そしてさらに、臨床状況における、術後の早い段階での早期からのリハビリテーションプログラムの導入において有用となり得ることを示している。
骨および軟骨の形成率は、本発明者らのモデルにおいて有意に相関していた。これらの結果は、軟骨および軟骨下骨の修復プロセスを解明するのに有用であり得る。これらの結果から、本発明者らは、以下を想定している。修復された新しい骨の周囲に軟骨様細胞がみられることより、まず、移植されたＴＥＣあるいはネイティブな骨髄に由来するＭＳＣの軟骨分化が促進され、次いで、軟骨内骨化によって骨形成が促進されると考えられる。しかしながら、一部の例で、線維性組織または軟骨様組織が軟骨下組織領域に残存していた。これらの所見は、対照群よりもＴＥＣ群において観察される頻度が少なく、ＴＥＣは、骨修復のために適した環境を提供していると考えられる。その理由として、ＴＥＣは、隣接する宿主組織に容易に接着できるために関節滲出液の浸潤を防止できることが考えられる。
技術的局面については、本発明者らは、隣接する天然の軟骨の下で、関節表面から２ｍｍの深さで人工骨を移植した。理論に束縛されることを望まないが、本発明者らは、移植した複合組織の適切な深さおよび移植部位の適切な強度が間葉系幹細胞の補充に寄与しうるものであると考えられる。適切な深さについては、当業者は、本明細書の記載を参考に適宜設定することができるものであることが理解される。
ハイブリッド移植片で処置した修復後の骨軟骨組織は、正常な骨軟骨組織に等しい剛性を回復した。さらにデジタル画像から計算した表面の粗さは、未処置の正常組織群とＴＥＣ群の間で、有意差を示さなかった。しかしながら、剛性と表面の粗さはまた、対照群とＴＥＣ群の間でも有意差がなかった。本願では、生体力学的試験の結果は軟骨層の表面のみを表しており、骨軟骨組織全体を評価した場合には、対照群とＴＥＣ群の間に有意差を認める可能性が考えられる。
本願の潜在的な制約として、本発明者らは、ブタ、ヤギおよびヒツジといった大型動物モデルを使用しなかったことである。しかしながら、本発明者らは、本発明のハイブリッド移植片が、明白に、良好な組織の生物学的癒合をともなって骨軟骨の修復を促進し、そして良好な品質の修復組織および良好な組織の生物学的癒合を手術後６ヶ月まで維持したことを実証している。したがって、大型動物モデルにおいて本発明のハイブリッド移植片を用いた場合にも同じ結果が期待される。別の問題として、外科手術から６ヵ月後に、両群とも一部の症例において軟骨下骨の過剰増殖（軟骨の菲薄化）または軟骨下骨の露出が観察された。これらの現象は、ＭＳＣを用いたウサギ骨軟骨欠損モデルにおいて以前にも報告されており［Wakitani S,Goto T,Pineda SJ,Young RG,Mansour JM,Caplan AI,et al.,J Bone Joint Surg Am 1994;76:579-592］、軟骨内骨化の加速または移植したＭＳＣの劣化によって引き起こされた可能性がある［Chen H,Chevrier A,Hoemann CD,Sun J,Ouyang W,Buschmann MD.、Am J Sports Med 2011;Bedi A,Feeley BT,Williams RJ,3rd.、J Bone Joint Surg Am 2010;92:994-1009;Vasara AI,Hyttinen MM,Lammi MJ,Lammi PE,Langsjo TK,Lindahl A,et al.,Calcif Tissue Int 2004;74:107-114］。それゆえ、耐久性の改善および良好な品質のためには、軟骨内骨化に対向して増殖因子のカクテルを用いて永久不変の軟骨を維持する［Liu G,Kawaguchi H,Ogasawara T,Asawa Y,Kishimoto J,Takahashi T,et al.,J Biol Chem 2007;282:20407-20415］か、または、強い軟骨形成能力を持つＭＳＣを選択し、使用することが理想的である。
（結論）
まとめると、本発明者らは、ＴＥＣおよび人工骨から作製した複合組織（ハイブリッド移植片）が骨軟骨修復を組織学的にも生体力学的にも顕著に改善することを実証した。特に、軟骨下骨修復の進行、ならびに、隣接する宿主組織への確実かつ良好な組織の生物学的癒合は、長期にわたる耐久性を保証し得る。ＴＥＣはスキャフォールド非依存性であるため、動物または化学物質由来の物質を含まず、そしてさらに、ＨＡは、臨床上広く使用されている。それゆえ、本発明者らによるハイブリッド材料は、骨軟骨損傷の効率的かつ安全な修復に適している。
（実施例２：多孔性β−リン酸三カルシウムを用いた複合組織の例）
実施例１と同様の製造法を用いて、同様の複合組織を製造し、その治療効果を確認した。実施例１におけるＮＥＯＢＯＮＥＴＭを多孔性β−リン酸三カルシウム（オスフェリオン、オリンパス）に代えて実施した。
（滑膜組織の採取と細胞の単離）
全ての動物実験は、大阪大学医学部動物実験施設による承認を得た。ウサギの滑膜を、死後１２時間以内に骨格が成熟した（２４週齢）ウサギの膝関節から無菌的に採取した。細胞単離のプロトコールは、ヒト滑膜由来のＭＳＣの単離について以前に使用したものと本質的に同じである［Ando W,Tateishi K,Katakai D,Hart DA,Higuchi C,Nakata K,et al.,Tissue Eng Part A 2008;14:2041-2049］。簡単に述べると、滑膜標本をリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）でリンスし、綿密に切り刻み、そして、３７℃にて２時間、０．４％コラゲナーゼＸＩ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）で消化した。１０％胎仔ウシ血清（ＦＢＳ；ＨｙＣｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ，ＵＳＡ）と１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を補充した高グルコースダルベッコ改変イーグル培地（ＨＧ−ＤＭＥＭ；Ｗａｋｏ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）を含有する増殖培地でコラゲナーゼを中和した後、遠心分離により細胞を回収し、ＰＢＳで洗浄し、増殖培地中に再懸濁し、そして、培養皿にプレートした。ウサギ細胞の特性は、形態、増殖特性および（骨形成系統、軟骨形成系統および脂肪細胞化系統への）多能性分化能の点で、ヒト滑膜由来ＭＳＣと同様であった［Ando W,Tateishi K,Katakai D,Hart DA,Higuchi C,Nakata K,et al.,Tissue Eng Part A 2008;14:2041-2049;Tateishi K,Higuchi C,Ando W,Nakata K,Hashimoto J,Hart DA,et al.,Osteoarthritis Cartilage 2007;15:709-718］。細胞増殖のために、これらの細胞を、５％ ＣＯ２の加湿雰囲気下、３７℃にて、増殖培地中で増殖させた。培地は、週に１回交換した。初代培養の７〜１０日後、細胞がコンフルエンスに達すると、これらを、ＰＢＳで２回洗浄し、トリプシン−ＥＤＴＡ（０．２５％トリプシンおよび１ｍＭ ＥＤＴＡ：Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いた処理によって回収し、そして、最初のサブカルチャーのために１：３希釈して再度プレーティングした。培養物がほぼコンフルエンスに達すると、１：３希釈して、細胞の継代を同じ方法で継続した。本願では継代３〜７回の細胞を使用した。
（三次元人工組織（ＴＥＣ）の作製）
滑膜ＭＳＣを、以前の研究からの最適濃度である、０．２ｍＭのアスコルベート−２−リン酸（Ａｓｃ−２Ｐ）を含有する増殖培地中４．０×１０５細胞／ｃｍ２の密度にて、６ウェルプレート（９．６ｃｍ２）上にプレートした［Ando W,Tateishi K,Katakai D,Hart DA,Higuchi C,Nakata K,et al.,Tissue Eng Part A 2008;14:2041-2049;Ando W,Tateishi K,Hart DA,Katakai D,Tanaka Y,Nakata K,et al.,Biomaterials 2007;28:5462-5470;Shimomura K,Ando W,Tateishi K,Nansai R,Fujie H,Hart DA,et al.,Biomaterials 2010;31:8004-8011］。１日以内に細胞はコンフルエントになった。さらに７〜１４日間培養を継続した後、培養細胞とこれらの細胞によって合成されたＥＣＭとの複合体を、軽いピペッティングを用いてせん断応力を加えることによって、下層から剥離した。この剥離した単層の複合体を懸濁液中に維持して、能動的な組織収縮によって三次元構造を形成させた。この組織を、スキャフォールド非依存性三次元ＴＥＣと呼んだ。
（ＴＥＣおよび人工骨から成る複合組織（ハイブリッド移植片）の作製）
十分に相互連結した多孔性β−リン酸三カルシウム（オスフェリオン、オリンパス）［直径５ｍｍ、高さ４ｍｍ］を人工骨として調製した。ＴＥＣを、移植手術の直前に培養皿から剥離し、そして、接着剤を用いることなく、人工骨に結合させて、骨軟骨ハイブリッドを作製した（図１ａ）。ＴＥＣは一度人工骨に結合すると、この結合は、強固に結合するため分離するのが困難である。
（骨軟骨欠損へのハイブリッド移植片の移植）
８匹の骨格が成熟したニュージーランド白ウサギ（２４週齢以上）を、ケージ内に維持し、自由に食餌および水を与えた。ウサギに、１ｍｌのペントバルビタール［５０ｍｇ／ｍｌ（ネンブタール（登録商標）；Ｄａｉｎｉｐｐｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．Ｌｔｄ．，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）］の静脈内注射および１ｍｌのキシラジン塩酸塩［２５ｍｇ／ｍｌ（Ｓｅｒａｃｔａｌ（登録商標）；Ｂａｙｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）］により麻酔をかけた。剃毛、消毒を行い、滅菌した布で覆った後、右膝に、真っ直ぐな３ｃｍ長の内側傍膝蓋骨切開を作製し、膝蓋骨を外方に動かし、そして、大腿骨窩部を露出させた。右遠位大腿の大腿骨窩部に直径５ｍｍ、深さ６ｍｍの全厚関節骨軟骨欠損を機械的に作製した。ＴＥＣおよび人工骨のハイブリッド形成は、移植の直前に行い、そして、二相性の移植片を、４匹のウサギの右膝の欠損内に移植した（ＴＥＣ群）。対照群では、4匹のウサギの右膝の欠損に人工骨のみを移植した。動物は全て７日間右下肢をギプス固定した。その後、外科手術から６ヶ月後に麻酔下で安楽死させた。移植部位を固定して、後のパラフィン切片作製および組織学的解析のために使用した。
（修復された組織の組織学的評価）
組織学的評価のために、組織を１０％中性緩衝化ホルマリンで固定し、Ｋ−ＣＸ（Ｆａｌｍａ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）で脱灰し、パラフィン中に包埋して、４ｍｍの切片を作製した。切片をヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）およびトルイジンブルーで染色した。
（結果）
外科手術の６ヵ月後、ＴＥＣ群の修復された組織は、完全に骨軟骨組織で修復された。対照群でも、ある程度の骨軟骨修復は認められたが、修復された組織は、隣接する軟骨に対する乏しい生物学的癒合と、軟骨下骨領域における線維性組織および軟骨様組織が混じった不十分な骨軟骨修復を示した（図９参照）。
（実施例３：間葉様系幹細胞の別の例での実験）
実施例３では、実施例１で用いた細胞以外の細胞、例えば、製造例１〜６に記載の方法を用いて三次元人工組織を作製し、これを用いて実施例１または２と同様の方法で複合組織を生産し、実施例１または２と同様の方法で骨軟骨損傷の効率的かつ安全な修復の実験を行なうことができる。
（実施例４：仮想実施例としてのブタ・ラット・ヒトでの実施例）
製造例１〜６、実施例１または２において、ウサギの人工組織に代えて、ブタ・ラット・ヒトの複合組織を作製し、実施例１および２と同様の組織評価、生体力学的評価を行う。
（実施例５：サイズ（深さ）を変更したときの実験）
実施例１または２と同様のプロトコールに従い、必要に応じて製造例１〜６の手順を参照し、人工骨の深さを以下のようにし、（３）〜（５）についてそれぞれの修復能を比較した。（１）人工骨の位置を軟骨表層と同じ、（２）軟骨下骨（骨軟骨境界部）と同じ深さ、（３）軟骨表層より約２．０ｍｍ深くする、（４）軟骨表層より約３．０ｍｍ深くする、（５）軟骨表層より約４ｍｍ深くする。（１）については、人工骨が軟骨修復を物理的に阻害することが自明と考えれるため省いた。（２）については、土台となる軟骨下骨の修復を妨げると予想されるため省いた。作製した複合組織について、実施例１および２と同様の組織評価、生体力学的評価を行った。（３）〜（５）の場合を図１１に示す。図１１に示されるように、複合体の移植深度によって再生は異なることが明らかになった。約２ｍｍ程度と浅いと軟骨下骨の修復が早いが軟骨修復が乏しい。約４ｍｍ程度と深いと軟骨修復は良好であるが軟骨下骨の修復が遷延する。したがって、症例にもよるが、軟骨表層より約１ｍｍ〜６ｍｍで使用することが可能であり、軟骨表層より約２〜４ｍｍがより好ましく、軟骨表層より約３ｍｍ程度がさらに好ましいということができる。
（実施例６：ｉＰＳ細胞から誘導した間葉様系幹細胞の別の例での実験）
本実施例では、ｉＰＳ細胞から間葉様系幹細胞とも呼ばれる間葉系幹細胞を誘導し、これを用いて三次元人工組織を作製した後、実施例１と同様の方法で複合組織を生産し、実施例１と同様の方法で骨軟骨損傷の効率的かつ安全な修復の実験を行なうことができることを確認する。
ｉＰＳ細胞から間葉様系幹細胞への誘導は、Ｊｕｎｇ ｅｔ ａｌ，ＳＴＥＭ ＣＥＬＬＳ，２０１１；ｄｏｉ：１０．１００２／ｓｔｅｍ．７２７を参照して実施することができる。
（実施例７：ＥＳ細胞での実施）
本実施例では、ウサギＥＳ細胞から間葉様系幹細胞とも呼ばれる間葉系幹細胞を誘導し、これを用いて三次元人工組織を作製した後、実施例１と同様の方法で複合組織を生産し、実施例１と同様の方法で骨軟骨損傷の効率的かつ安全な修復の実験を行なうことができることを確認した。実施に当たっては、大阪大学動物実験施設の承認、遺伝子組み換え実験の承認を得てから実験を行った。
ＥＳ細胞から、間葉様系幹細胞とも称される間葉系幹細胞への誘導は、例えば、de Peppo et al.,TISSUE ENGINEERING:Part A,2010;16;3413-3426;Toh et al.,Stem Cell Rev.and Rep.,2011;7:544-559;Varga et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.,2011;doi:10.1016/j.bbrc.2011.09.089;Barbet et al.,Stem Cells International,2011,doi:10.4061/2011/368192;Sanchez et al.,STEM CELLS,2011;29:251-262;Simpson et al.,Biotechnol.Bioeng.,2011;doi:10.1002/bit.23301を参照することができる。
（胚性幹細胞（ＥＳＣｓ）より誘導した間葉系幹細胞（ＭＳＣｓ）の分化誘導）
内部細胞塊を採取してフィーダー細胞（ＭＥＦ）上で培養してＥＳＣｓを誘導した。次に胚様体（ＥＢ）を作成した後、酸素分圧制御下の平面培養でＭＳＣｓ（ＥＳ−ＭＳＣｓ）へ分化誘導した。
（ＴＥＣおよびＴＥＣ・人工骨ハイブリッドインプラントの作成）
４×１０５個／ｃｍ２で播種したＥＳ−ＭＳＣｓをアスコルビン酸２リン酸入りの培養液（ＨＧ−ＤＭＥＭ）で２週間培養した。ずり応力で底面より剥離して３次元化してＴＥＣを作製した。さらに任意の形状の人工骨上にＴＥＣを載せてその粘着性により一体化させ、ＴＥＣ・人工骨ハイブリッドインプラントを作製した。
（ウサギ骨軟骨欠損部の軟骨修復）
ウサギ膝関節にφ５ｍｍ×高さ６ｍｍの骨軟骨欠損にＥＳ−ＭＳＣｓで作製したＴＥＣとφ５ｍｍ×高さ４ｍｍ人工骨を一体化したインプラントを移植した。術後１ヶ月で欠損のみの膝に比してＴＥＣ・人工骨ハイブリッドインプラントの治療により明らかな軟骨修復を認めた（図１０）。
（実施例８：癒合に関する比較実験（複合組織での癒合とＢＭＰでの癒合との比較可能なデータ））
非特許文献１６（Tamai N,Myoui A,Hirao M,Kaito T,Ochi T,Tanaka J,et al.,Osteoarthritis Cartilage 2005;13:405-417）の手順に従って、ＢＭＰを用いた癒合と、本発明の複合組織での癒合との結果を比較する。実施例１等に基づき、本発明の複合組織での癒合を調べると、すでに述べたように、生物学的癒合が良好であるのに対して、ＢＭＰを用いた場合は、非特許文献１６において記載されているように、良好な生物学的癒合は認められず、本発明の効果の顕著性が骨形成因子等のサイトカインを用いた場合に比較した場合でも確認される。
以上のように、本発明の好ましい実施形態および実施例を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。本発明は、２０１１年１２月２８日に出願された日本国出願特願２０１１−２８９６６２号に対して優先権を主張するものであり、その内容は適切にその全体が参考として本明細書において援用される。
本発明は、従来治療が困難であった疾患の根本的な治療方法、技術、医薬、医療デバイスを提供するという有用性を有する。特に、天然に近い状態への回復を促進するという意味において、画期的な治療および予防を提供し、そのために使用される医薬、細胞、組織、組成物、システム、キットなどの提供において本発明は有用であることが理解される。
本発明がターゲットとする骨・軟骨を中心とした関節組織修復・再生のニーズであるが、骨再生のターゲットとなる骨折患者数は年間数十万人にのぼり、また軟骨再生治療の主要なターゲットとなる変形性関節症の潜在患者数は３０００万人とも言われており、潜在するマーケットは巨大であり、周辺産業における有用性は高い。骨・軟骨を中心とした関節組織を対象とした再生医療研究は世界で激烈な競争が開始されているが、本発明の人工組織は、患者などの生体より採取した細胞から作成される、安全でかつ独創的なマテリアルであり、副作用などの点からも有用性は高い。

Claims (15)

  1. 骨軟骨欠損に関連する疾患、障害または状態を治療または予防するための、三次元人工組織と人工骨とを含む複合組織であって、該人工骨は、該骨軟骨欠損における骨部の欠損の深さよりも小さなサイズである、複合組織。
  2. 前記人工骨の長さと前記三次元人工組織の長さの合計は、前記骨軟骨欠損の深さと略同じである、請求項１に記載の複合組織。
  3. 前記人工骨は、前記骨軟骨欠損における骨部の欠損の深さよりも約１ｍｍ以上小さいサイズである、請求項１に記載の複合組織。
  4. 前記人工骨は、前記骨軟骨欠損における骨部の欠損の深さよりも軟骨の厚みの２倍以下小さいサイズである、請求項１に記載の複合組織。
  5. 前記人工骨は、前記骨軟骨欠損における骨部の欠損の深さよりも約１ｍｍ以上小かつ軟骨の厚みの２倍以下小さいサイズである、請求項１に記載の複合組織。
  6. 前記人工骨は、前記骨軟骨欠損における骨部の欠損の深さよりも約２ｍｍ以上〜約４ｍｍ小さいサイズである、請求項１に記載の複合組織。
  7. 前記三次元人工組織と前記人工骨とは二相で存在するか、または前記三次元人工組織と前記人工骨とは互いに接着した状態にある、請求項１に記載の複合組織。
  8. 前記骨軟骨欠損は哺乳動物におけるものである、請求項１に記載の複合組織。
  9. 前記人工骨は、ヒドロキシアパタイトおよびβ−リン酸三カルシウムからなる群より選択される材料で構成される、請求項１に記載の複合組織。
  10. 前記疾患、障害または状態は、変形性関節症、骨軟骨損傷、骨軟骨病変、骨壊死、関節リウマチ、骨腫瘍およびその類似疾患からなる群より選択される、請求項１に記載の複合組織。
  11. 骨軟骨欠損に関連する疾患、障害または状態を治療または予防するための、三次元人工組織と人工骨とを備えるキットであって、該人工骨は、該骨軟骨欠損における骨部の欠損の深さよりも小さなサイズである、キット。
  12. 骨軟骨欠損に関連する疾患、障害または状態を治療または予防するためのキットであって、三次元人工組織の生産のための細胞培養組成物と人工骨とを備える、該人工骨は、該骨軟骨欠損における骨部の欠損の深さよりも小さなサイズである、キット。
  13. 請求項１に記載の複合組織を生産するための方法であって、前記三次元人工組織と前記人工骨とを、該三次元人工組織と該人工骨とが接触する状態に配置する工程を包含する、方法であって、該人工骨は、前記骨軟骨欠損における骨部の欠損の深さよりも小さなサイズである、方法。
  14. 前記三次元人工組織は、実質的に、細胞および該細胞に由来する細胞外マトリクスから構成され、該細胞外マトリクスは、フィブロネクチン、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩおよびビトロネクチンを含み、該細胞外マトリクスが該組織中に分散して配置されたものであり、該細胞外マトリクスと該細胞とは、一緒になって三次元構造を形成するように生物学的に癒合しており、移植したときに周囲と生物学的に癒合する能力を有し、自己支持力を提供するのに十分な強度を有する、請求項１に記載の複合組織。
  15. 前記三次元人工組織は、実質的に、筋芽細胞、間葉系幹細胞、脂肪細胞、滑膜細胞、および骨髄細胞からなる群より選択される細胞および該細胞に由来する細胞外マトリクスから構成され、該細胞外マトリクスは、コラーゲンＩおよび／またはコラーゲンＩＩＩを含み、該コラーゲンＩおよび／またはコラーゲンＩＩＩは、コラーゲンＩＩよりも多く、該細胞外マトリクスが該組織中に分散して配置されたものである、請求項１に記載の複合組織。
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