JP5274906B2 - 三次元培養細胞外マトリックス構造形成モデル、それを利用した薬剤の細胞外マトリックス構造形成促進能を評価する方法及び皮膚構造形成の評価方法 - Google Patents
三次元培養細胞外マトリックス構造形成モデル、それを利用した薬剤の細胞外マトリックス構造形成促進能を評価する方法及び皮膚構造形成の評価方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5274906B2 JP5274906B2 JP2008160863A JP2008160863A JP5274906B2 JP 5274906 B2 JP5274906 B2 JP 5274906B2 JP 2008160863 A JP2008160863 A JP 2008160863A JP 2008160863 A JP2008160863 A JP 2008160863A JP 5274906 B2 JP5274906 B2 JP 5274906B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- extracellular matrix
- collagen
- light
- structure formation
- matrix structure
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Landscapes
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Cosmetics (AREA)
Description
本発明者は、汎用されるコラーゲンではなく、フィブリンを材料としてモデル(培養組織)を作製する方法を検討した。フィブリンは、血液凝固成分のひとつで、フィブリノーゲンがゲル化することによって生じる非常に細い線維である。フィブリンゲル内で線維芽細胞などの間葉系細胞を培養すると、細胞外マトリックス成分の産生が上昇することが分かっている(非特許文献1〜6)。実際、フィブリンゲル内で真皮線維芽細胞を培養すると、最も汎用されているウシ由来のコラーゲンゲル内で培養した時と比較して、真皮線維芽細胞自身が産生するコラーゲンやエラスチンの産生量が上昇した。さらに培養を続けると、フィブリンは分解され、真皮線維芽細胞が産生する細胞外マトリックスと置き換わり、細胞が産生したコラーゲンによる線維構造が観察された。コラーゲンの次に主要な成分であるエラスチンについても線維構造が観察された。特に、エラスチンは最も汎用されている培養方法(動物由来コラーゲンを培養支持体・担体とした三次元培養)では、in vitroで線維形成させること自体が難しい成分であったが、フィブリンを培養担体としたことで線維構造を形成させることができた。また、これらの自己マトリックスによる線維構造は、動物由来コラーゲンを培養支持体・担体とした三次元培養と比較すると明らかに生体に近い構造を形成していた。
[1]入射光として超短パルス光を照射しても、第2高調波発生光(SHG光)の発生が検出されない培養支持体・担体上に、細胞外マトリックスを産生する細胞を培養することを特徴とする、三次元培養細胞外マトリックス構造形成モデル。
[2]前記細胞外マトリックスを産生する細胞が線維芽細胞である、[1]の三次元培養細胞外マトリックス構造形成モデル。
[3]前記培養支持体・担体が、フィブリノーゲンをゲル化して作製したフィブリンである、[1]又は[2]の三次元培養細胞外マトリックス構造形成モデル。
[4]前記培養支持体・担体が、コラーゲン凝固沈殿より作られる構造体である、[1]又は[2]の三次元培養細胞外マトリックス構造形成モデル。
[5]前記構造体が、生体コラーゲンの規則正しく配向した線維束構造を持たない、アモルファスな集合体であることを特徴とするコラーゲン凝固沈殿より作られる紡績繊維である、[4]の三次元培養細胞外マトリックス構造形成モデル。
[6]前記紡績線維が、コラーゲン溶液を高塩濃度の溶液に押し出し、成形することで作製される、[5]の三次元培養細胞外マトリックス構造形成モデル。
[7]前記三次元培養細胞外マトリックス構造形成用モデルが、フィブリンを用いることによって生じるモデルの収縮を抑えるため、フィブリン以外の、入射光として超短パルス光を照射しても、第2高調波発生光(SHG光)の発生が検出されない培養支持体・担体を含有して、細胞外マトリックスを形成させるのに十分な空間を保持することを特徴とする、[3]〜[6]のいずれかの三次元培養細胞外マトリックス構造形成モデル。
[8][7]に規定するフィブリン以外の、入射光として超短パルス光を照射しても、第2高調波発生光(SHG光)の発生が検出されない培養支持体・担体が、第2高調波発生光(SHG光)の発生が検出されない生分解性高分子である、[7]の三次元培養細胞外マトリックス構造形成モデル。
[9][8]に規定する第2高調波発生光(SHG光)の発生が検出されない生分解性高分子が、コラーゲン凝固沈殿より作られる構造体である、[8]の三次元培養細胞外マトリックス構造形成。
[10][9]に規定する構造体が、生体コラーゲンの規則正しく配向した線維束構造を持たない、アモルファスな集合体であることを特徴とするコラーゲン凝固沈殿より作られる紡績繊維である、[9]の三次元培養細胞外マトリックス構造形成。
[11][10]に規定する紡績線維が、コラーゲン溶液を高塩濃度の溶液に押し出し、成形することで作製される、[10]の三次元培養細胞外マトリックス構造形成。
[12]薬剤の細胞外マトリックス構造形成促進能を評価する方法であって、
[1]〜[11]のいずれかの三次元培養細胞外マトリックス構造形成モデルに候補薬剤を適用して培養し、
当該三次元培養細胞外マトリックス構造形成モデルに入射光として超短パルス光を照射し、発生した第2高調波発生光(SHG光)を検出することにより、当該三次元培養細胞外マトリックス構造形成モデルのコラーゲン形成の度合いを評価し、
コラーゲン形成が促進されれば候補薬剤が細胞外マトリックス構造形成促進能を有すると評価する、ステップを含んでなる方法。
[13]皮膚構造形成の評価方法であって、
入射光として超短パルス光を照射しても、第2高調波発生光(SHG光)の発生が検出されない培養支持体・担体上に支持された、真皮線維芽細胞を含有するフィブリンゲルからなる皮膚培養物を、その培養の際、入射光として超短パルス光を照射し、発生した第2高調波発生光(SHG光)を検出することにより、当該皮膚構造形成を、コラーゲン形成の度合いを指標に評価する方法。
[14]前記培養支持体・担体が、コラーゲン凝固沈殿より作られる構造体である、[13]の方法。
[15]前記構造体が、生体コラーゲンのような規則正しく配向した線維束構造を持たない、アモルファスな集合体であることを特徴とするコラーゲン凝固沈殿より作られる紡績繊維である、[14]の方法。
[16]前記紡績線維が、コラーゲン溶液を高塩濃度の溶液に押し出し、成形することで作製される、[15]の方法。
本発明において、上記培養支持体・担体としては、繊維芽細胞により消化され、かつ入射光として超短パルス光を照射しても、第2高調波発生光(SHG光)の発生が検出されない高分子からなるものであれば特に制限されるものではないが、好ましいのはコラーゲン凝固沈殿より作られるコラーゲン紡績繊維である。ポリ乳酸やポリグリコール酸などの生分解性合成高分子なども三次元培養モデルの培養支持体・担体としてよく用いられているが、これらの高分子も非線形の誘電的な応答機能を持つためSHG光を発する性質を有する(非特許文献8)。従って、このようなSHG光を発する分子は、細胞が形成したコラーゲンのSHG光と重なるため、明確に区別することはできない。
SHG光とは、ピークパワーの高い超短パルス光が非中心対象性物質に照射されることによって発生する二次の非線形光学応答であり、通常の反射や散乱等の線形光学応答では、周波数(ω)が変化しないのに対して、SHG光は、周波数が入射光の2倍(2ω)となることが知られている。
ヒト線維芽細胞は新生児包皮より単離し、10%胎児牛血清 (FBS)含有Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)で培養した。トリプシン-エチレンジアミン四酢酸(EDTA)処理によって接着細胞を浮遊させ、遠心分離によって細胞を集め、ろ過して均一な細胞懸濁液を得た。カルビオケム社より購入したヒト血清由来フィブリノーゲン(Fibrinogen,Plasminogen-Depleted)をDMEMに溶解し、フィブリノーゲン溶液を作製した。細胞懸濁液とフィブリノーゲン溶液を混合して、細胞密度2.5×105cells/mL、フィブリノーゲン 2.5mg/mLの懸濁液を調整した。この懸濁液にヒト血清由来トロンビン(Thrombin, Human Plasma)溶液0.1U/mLを添加して、ゲル化する前にコラーゲン凝固沈殿より作られるコラーゲン紡績繊維に添加して、コラーゲン紡績繊維を含有するフィブリンゲルを作製した。ゲル化した後、糖結合アスコルビン酸(2-O-a-D-glucopyranosyl-L-ascorbic acid)250μMを含む10%FBS DMEMで2〜3日毎培地交換を行った。
薬剤を含む培地と、薬剤を含まない培地で培養を行い、適時、無菌状態のままSHG光の観察を行い、経時的な変化を観察した。
図2は抗老化薬剤として知られるシカクマメエキスを上記フィブリンゲルに添加した場合の、真皮繊維芽細胞の自己コラーゲン線維構造形成に与える影響を観察した結果である。シカクマメエキスは、シカクマメ(学名:Psophocarpus tetragonolobus)、マメ科(Leguminosae)、シカクマメ 属(Psophocarpus)の種子を、慣用の方法により90%エタノールで抽出して調製したものである。エキス無添加の場合に比べ、抗老化薬剤シカクマメエキスを添加した場合では、真皮繊維芽細胞におけるコラーゲン線維構造形成促進効果が観察された。従って、本技術は、in vitroにおいて、生体で見られるような細胞外マトリックス構造形成能を評価することを可能にする。
Claims (16)
- 入射光として超短パルス光を照射しても、第2高調波発生光(SHG光)の発生が検出されない培養支持体・担体上に、細胞外マトリックスを産生する細胞を培養することを特徴とする、三次元培養細胞外マトリックス構造形成モデル。
- 前記細胞外マトリックスを産生する細胞が線維芽細胞である、請求項1記載の三次元培養細胞外マトリックス構造形成モデル。
- 前記培養支持体・担体が、フィブリノーゲンをゲル化して作製したフィブリンである、請求項1又は2記載の三次元培養細胞外マトリックス構造形成モデル。
- 前記培養支持体・担体が、コラーゲン凝固沈殿より作られる構造体である、請求項1又は2記載の三次元培養細胞外マトリックス構造形成モデル。
- 前記構造体が、生体コラーゲンの規則正しく配向した線維束構造を持たない、アモルファスな集合体であることを特徴とするコラーゲン凝固沈殿より作られる紡績繊維である、請求項4記載の三次元培養細胞外マトリックス構造形成モデル。
- 前記紡績線維が、コラーゲン溶液を高塩濃度の溶液に押し出し、成形することで作製される、請求項5記載の三次元培養細胞外マトリックス構造形成モデル。
- 前記三次元培養細胞外マトリックス構造形成用モデルが、フィブリンを用いることによって生じるモデルの収縮を抑えるため、フィブリン以外の、入射光として超短パルス光を照射しても、第2高調波発生光(SHG光)の発生が検出されない培養支持体・担体を含有して、細胞外マトリックスを形成させるのに十分な空間を保持することを特徴とする、請求項3〜6のいずれか1項に記載の三次元培養細胞外マトリックス構造形成モデル。
- 請求項7に規定するフィブリン以外の、入射光として超短パルス光を照射しても、第2高調波発生光(SHG光)の発生が検出されない培養支持体・担体が、第2高調波発生光(SHG光)の発生が検出されない生分解性高分子である、請求項7記載の三次元培養細胞外マトリックス構造形成モデル。
- 請求項8に規定する第2高調波発生光(SHG光)の発生が検出されない生分解性高分子が、コラーゲン凝固沈殿より作られる構造体である、請求項8記載の三次元培養細胞外マトリックス構造形成モデル。
- 請求項9に規定する構造体が、生体コラーゲンの規則正しく配向した線維束構造を持たない、アモルファスな集合体であることを特徴とするコラーゲン凝固沈殿より作られる紡績繊維である、請求項9記載の三次元培養細胞外マトリックス構造形成モデル。
- 請求項10に規定する紡績線維が、コラーゲン溶液を高塩濃度の溶液に押し出し、成形することで作製される、請求項10記載の三次元培養細胞外マトリックス構造形成モデル。
- 薬剤の細胞外マトリックス構造形成促進能を評価する方法であって、
請求項1〜11のいずれか1項に記載の三次元培養細胞外マトリックス構造形成モデルに候補薬剤を適用して培養し、
当該三次元培養細胞外マトリックス構造形成モデルに入射光として超短パルス光を照射し、発生した第2高調波発生光(SHG光)を検出することにより、当該三次元培養細胞外マトリックス構造形成モデルのコラーゲン形成の度合いを評価し、
コラーゲン形成が促進されれば候補薬剤が細胞外マトリックス構造形成促進能を有すると評価する、ステップを含んでなる方法。 - 皮膚構造形成の評価方法であって、
入射光として超短パルス光を照射しても、第2高調波発生光(SHG光)の発生が検出されない培養支持体・担体上に支持された、真皮線維芽細胞を含有するフィブリンゲルからなる皮膚培養物を、その培養の際、入射光として超短パルス光を照射し、発生した第2高調波発生光(SHG光)を検出することにより、当該皮膚構造形成を、コラーゲン形成の度合いを指標に評価する方法。 - 前記培養支持体・担体が、コラーゲン凝固沈殿より作られるコラーゲン構造体である、請求項13記載の方法。
- 前記構造体が、生体コラーゲンのような規則正しく配向した線維束構造を持たない、アモルファスな集合体であることを特徴とするコラーゲン凝固沈殿より作られる紡績繊維である、請求項14記載の方法。
- 前記紡績線維が、コラーゲン溶液を高塩濃度の溶液に押し出し、成形することで作製される、請求項15記載の方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2008160863A JP5274906B2 (ja) | 2008-06-19 | 2008-06-19 | 三次元培養細胞外マトリックス構造形成モデル、それを利用した薬剤の細胞外マトリックス構造形成促進能を評価する方法及び皮膚構造形成の評価方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2008160863A JP5274906B2 (ja) | 2008-06-19 | 2008-06-19 | 三次元培養細胞外マトリックス構造形成モデル、それを利用した薬剤の細胞外マトリックス構造形成促進能を評価する方法及び皮膚構造形成の評価方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2010000026A JP2010000026A (ja) | 2010-01-07 |
JP5274906B2 true JP5274906B2 (ja) | 2013-08-28 |
Family
ID=41582272
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2008160863A Active JP5274906B2 (ja) | 2008-06-19 | 2008-06-19 | 三次元培養細胞外マトリックス構造形成モデル、それを利用した薬剤の細胞外マトリックス構造形成促進能を評価する方法及び皮膚構造形成の評価方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP5274906B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR101739330B1 (ko) * | 2010-10-29 | 2017-05-24 | (주)아모레퍼시픽 | 진피 모사체를 이용한 피부 탄력 증진력 평가법 |
EP3967750A4 (en) * | 2019-04-01 | 2023-01-04 | Toppan Inc. | THREE-DIMENSIONAL TISSUE CONSTRUCT AND METHOD OF MAKING THEREOF AND METHOD OF MAKING A CELLULATED COMPOSITION |
CN113677700A (zh) * | 2019-04-01 | 2021-11-19 | 凸版印刷株式会社 | 细胞结构体及细胞结构体的制造方法 |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2007049990A (ja) * | 2005-07-19 | 2007-03-01 | Osaka Univ | 培養組織試料の評価方法およびそれを用いた培養組織の製造方法 |
-
2008
- 2008-06-19 JP JP2008160863A patent/JP5274906B2/ja active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2010000026A (ja) | 2010-01-07 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Chen et al. | Injectable self-crosslinking HA-SH/Col I blend hydrogels for in vitro construction of engineered cartilage | |
CN102905710B (zh) | 来自脐带胶质的新生物材料 | |
CN102066558B (zh) | 胞外基质组合物 | |
CN106075598A (zh) | 一种光交联丝胶蛋白水凝胶及其制备方法和应用 | |
Lin et al. | In vitro and in vivo evaluation of the developed PLGA/HAp/Zein scaffolds for bone-cartilage interface regeneration | |
Majima et al. | Chitosan-based hyaluronan hybrid polymer fibre scaffold for ligament and tendon tissue engineering | |
US20230043132A1 (en) | 3d printing bio gel and method of use | |
Deng et al. | Peptide-decorated nanofibrous niche augments in vitro directed osteogenic conversion of human pluripotent stem cells | |
DE112007001197T5 (de) | Dreidimensionale gereinigte Kollagenmatrices | |
Brackmann et al. | Visualization of the cellulose biosynthesis and cell integration into cellulose scaffolds | |
CN107921070A (zh) | 胎盘源基质、其制备方法和其用途 | |
Li et al. | 3D bioprinting of heterogeneous tissue-engineered skin containing human dermal fibroblasts and keratinocytes | |
AU2006247228B2 (en) | Engineered extracellular matrices control stem cell behavior | |
Naderi et al. | Three-dimensional scaffold from decellularized human gingiva for cell cultures: glycoconjugates and cell behavior | |
Phang et al. | Advancements in extracellular matrix-based biomaterials and biofabrication of 3D organotypic skin models | |
Zeng et al. | Bacterial nanocellulose-reinforced gelatin methacryloyl hydrogel enhances biomechanical property and glycosaminoglycan content of 3D-bioprinted cartilage | |
Zhang et al. | Effect of different additives on the mechanical properties of gelatin methacryloyl hydrogel: a meta-analysis | |
CN106492281A (zh) | 一种生物相容性骨移植物及其制备方法 | |
JP5274906B2 (ja) | 三次元培養細胞外マトリックス構造形成モデル、それを利用した薬剤の細胞外マトリックス構造形成促進能を評価する方法及び皮膚構造形成の評価方法 | |
Zuniga et al. | Collagen/kerateine multi-protein hydrogels as a thermally stable extracellular matrix for 3D in vitro models | |
JP2019001774A (ja) | ゼラチン誘導体、架橋ゼラチンハイドロゲル及びその多孔体、ならびに、それらの製造方法 | |
Cao et al. | Exploring the match between the degradation of the ECM-based composites and tissue remodeling in a full-thickness abdominal wall defect model | |
Guan et al. | Dual-bionic regenerative microenvironment for peripheral nerve repair | |
Wang et al. | Silk fibroin hydrogel membranes prepared by a sequential cross-linking strategy for guided bone regeneration | |
CN104491927A (zh) | 一种脱细胞舌基质材料及其制备方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20110609 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20130205 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20130408 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20130507 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20130515 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Ref document number: 5274906 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |